MXPA06006747A

MXPA06006747A - Procesamiento de peptidos y proteinas.

Info

Publication number: MXPA06006747A
Application number: MXPA06006747A
Authority: MX
Inventors: Inga Sig Nielsen N Rby
Original assignee: Novo Nordisk As
Priority date: 2003-12-19
Filing date: 2004-12-20
Publication date: 2006-08-18
Also published as: WO2005059127A1; JP4870574B2; JP2007514423A; EP1697509A1; ATE506433T1; CA2549587A1; DE602004032379D1; EP1697509B1

Abstract

La invencion proporciona enzimas metionina aminopeptidasa novedosas y su uso.

Description

- - PROCESAMIENTO DE PEPTIDOS Y PROTEÍNAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con un método para procesar proteínas que contienen iniciador de etionina por la enzima metionina aminopeptidasa y mutantes de los mismos para proporcionar péptidos libres de iniciador de metionina.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La producción de péptidos por técnicas reco binantes utilizando sistemas de expresión procarióticos o eucarióticos en la herencia proporciona al péptido con un aminoácido metionina inicial. Este aminoácido puede no estar presente en la proteína de origen, es decir, la variante del péptido procesado para translocación. La obtención del péptido sin la metionina inicial por lo tanto requiere una etapa de procesamiento adicional. En la presente invención, la etapa se realiza por la enzima metionina aminopeptidasa la cual separa selectivamente la metionina iniciadora del péptido . Se conocen en la técnica metionina aminopeptidasas (Met-AP) , enzimas las cuales separan las metioni-nas de inicio, si la secuencia -peptídi-ca de inicio -es de cierto carácter predeterminado. La Met-AP de Escherichia coli natural separa selectivamente después de un residuo -Met • ef. 173265 iniciador si el residuo en la posición Pl" es Gly, Ala, Ser, Thr, Pro, Val o Cys . En la presente invención, la metionina aminopeptidasas se mejoran al introducir mutaciones en los sitios de unión de sustrato lo que resulta en metionina aminopeptidasas que separan la metionina sin importar la secuencia peptídica inicial (posición Pl ' ) .

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La invención proporciona metionina aminopeptidasas mutantes novedosas. La invención proporciona ADN aislado que codifica para dichas metionina aminopeptidasas. La invención proporciona células hospedadoras para producir dichas metionina aminopeptidasas . La invención proporciona el uso de la metionina aminopeptidasa mutante para procesamiento de péptidos con un aminoácido metionina iniciador dentro de un péptido libre de metionina. La invención también proporciona el procesamiento de péptidos específicos por metionina aminopeptidasas mutantes . La invención también proporciona un método para separar el material ini-cial que contiene metionina de un producto separado final.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 es un ejemplo de una distribución de construcción de expresión mutante de Met-AP de E. coli . La purificación indica la etiqueta para propósitos de purificación. Proteasa indica el sitio de separación de proteasa. La figura 2 es la expresión en, por ejemplo, E. coli de: (A) NTl-enterocinasa-Met-AP Y168A o (B) NTl-enterocinasa-Met-AP Y168G, M206N, Q233A como se indica. La figura 3 muestra la separación hexa-His-Xa-Met- AP (M206A, Q233A9 de Met-hIL-21. La figura 4 es el espectro de masas MALDI-TOF de la forma purificada de hexa-His-Xa-Met-PA M206A, Q233A. La figura 5 es un cromotograma de purificación de la separación de tres compuestos Met-IL-21, IL-21 y piroglutamina IL-21.

DEFINICIONES Pl define el primer aminoácido N terminal para el sitio de reconocimiento para la enzima. Pl ' indica el aminoácido adyacente a Pl hacia la parte C terminal. Pl en la presente invención es metionina. En la presente invención, especificidad de sustrato significa selectividad hacia la posición Pl' - la cual es la posición justo C terminal respecto a la metionina. Met-AP de Escherichia coli natural presenta la especificidad de sustrato, que se separa selectivamente después de un residuo Met iniciador si el residuo en la posición Pl ' es Gly, Ala, Ser, Thr, Pro, Val o Cys. Los mutantes de la presente invención muestran una especificidad de sustrato extendida que significa que un aminoácido adicional puede ocupar la posición Pl' y aún así se observa separación de la metionina. En el contexto de la presente invención, variante significa una secuencia la cual ha mantenido la actividad cualitativa de la secuencia de origen, es decir, como metionina aminopeptidasa, pero en donde la secuencia difiere de la secuencia de origen por supresiones, inserciones, extensión o sustitución de uno o más aminoácidos de la secuencia de origen. En principio, las variantes también incluyen fragmentos de cualquier longitud con la condición de que se mantenga la actividad. En el contexto de la presente invención los derivados químicos de una proteína específica significa un derivado de la proteína natural, la cual no es una variante y la cual mantiene la actividad cualitativa de la secuencia de proteína de origen. El derivado químico incluye derivados tales como grupos PEG. Los términos péptido y proteínas se utiliza de manera intercambiable y no representan indicaciones o limitaciones respecto al tamaño o función de las secuencias.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La Met-AP de JE?. coli tiene un receptáculo que define sustrato (como parte del sitio activo) y que de manera esencial y muy probable, aunque no exclusiva, está definida por los aminoácidos Tyr 168, Met 206 y Gln 233. La mutación de estas posiciones extiende la especificidad del sustrato de las enzimas. Las aminopeptidasas novedosas de E. coli descritas en la presente invención extienden la aplicabilidad de las metionina aminopeptidasas para que sean útiles para eliminar la metionina inicial de casi cualquier tipo de proteína o péptido sin importar la secuencia de aminoácidos posterior a la metionina (posición Pl ' ) . Por lo tanto, la metionina iniciadora se puede separar de la totalidad de los péptidos o proteínas que contengan metionina iniciadora para producir péptidos o proteínas libres de metionina iniciadora. El gen para metionina aminopeptidasa de E. coli se clona y se han creado versiones mutantes utilizando mutagénesis dirigida al sitio. Los mutantes se expresan en E. coli y las enzimas resultantes se purifican por el sistema convencional de etiqueta His. La enzima también puede ser etiquetada, por ejemplo, por el sistema FLAG o se puede etiquetar y purificar por otras tecnologías como se describe en el documento WO 03042249. La actividad catalítica se determina utilizando hIL-21 que contiene Met iniciadora, como un sustrato.

En principio, la invención es aplicable de manera general a cualquier péptido. Se demuestra que la invención es útil para la separación de la metionina iniciadora para péptidos tales como hIL-21. El péptido hIL-21 es un sistema de modelo para la posición Pl ' que es Gln. Se describe IL-21 en el documento WO00/53761 y se describe que es eficaz en el tratamiento de cáncer e infección viral, entre otros. Se describe a IL-20 en el documento WO9927103. El término hGH se refiere a la hormona del crecimiento humana. Ambos son sistemas de modelo para otros aminoácidos en la posición Pl ' . En un aspecto, la invención proporciona variantes de aminopeptidasa de E. coli los cuales son mutados en el sitio activo que tienen especificidad de sustrato extendida de la posición Pl' en relación a las naturales. En un aspecto, la invención proporciona variantes de metionina aminopeptidasa de E. coli como se describe en lo anterior las cuales extienden la especificidad de sustrato en la posición Pl ' para incluir Asn, Leu, lie, Phe, His, Gln o Trp así como los aminoácidos permitidos en la posición Pl1 por las formas naturales. En un aspecto, la invención proporciona metionina aminopeptidasas de E. coli como se describe en lo anterior, en donde los residuos en las posiciones 168, 206 ó 233 se han enmendado en una secuencia diferente de Y168 y/o M206 y/o Q233.

En un aspecto, la invención proporciona metionina aminopeptidasas de E. coli como se describe en lo anterior que comprenden enmiendas del aminoácido en la posición 168. En un aspecto, la invención proporciona metionina aminopeptidasas de E. coli como se describe en lo anterior que comprenden la enmienda en la posición 206. En un aspecto, la invención proporciona metionina aminopeptidasas de E. . coli como se describe en lo anterior que comprenden la enmienda en la posición 233. En un aspecto, la invención proporciona metionina aminopeptidasas de E. coli como se describe en lo anterior que comprenden la enmienda en las posiciones 216 y 233. En un aspecto, la invención proporciona metionina aminopeptidasas de E. coli como se describe en lo anterior que comprenden las enmiendas en la posiciones 168 y 206. En un aspecto, la invención proporciona metionina aminopeptidasas de E. coli como se describe en lo anterior que comprenden las enmiendas en la posiciones 168 y 233. En un aspecto, la invención proporciona metionina aminopeptidasas de E. coli como se describe en lo anterior que comprenden las enmiendas en la posiciones 168, 20*6 y 233. En un aspecto, la invención proporciona metionina . aminopeptidasas de E. coli como se describe en lo anterior en donde las enmiendas comprenden intercambio de aminoácidos de tipo natural en Gly, Ala, Ser, Thr, Asn o Asp.

En un aspecto, la invención proporciona metionina aminopeptidasas de E. coli como se describe en lo anterior en donde las enmiendas comprenden Ala y/o Gly. En un aspecto, la invención proporciona metionina aminopeptidasas de E. coli como se describe en lo anterior en donde las enmiendas comprenden Ala. En un aspecto, la invención proporciona metionina aminopeptidasas de E. coli como se describe en lo anterior en donde la posición 168 es Ala. En un aspecto, la invención proporciona metionina aminopeptidasas de E. coli como se describe en lo anterior en donde la posición 206 es Ala. En un aspecto, la invención proporciona metionina aminopeptidasas de E. coli como se describe en lo anterior en donde la posición 233 es Ala. De esta manera, la invención proporciona la enzima metionina aminopeptidasa que tiene la siguiente secuencia (también descrita como SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 1) MAISIr TPEDIEKM VAGRLAAEVLEMIEPYVKPGVSTGELDRICNDYIVNEQHAVSACLGY HGYPKSVCISIN EWCHGIPDDAKLLKDGDIVNIDVTVIKDG FHGDTSK FIVGKPTIMGER LCRITQES YLALRMVKPGINLREIGAAIQKFVEAEGFSWREXa CGHGIGRGFHEEPQVLH YDSRETNWLKPGMTFTIEPXb VNAGKK€IRTMKDGWTVKTKDRSLSAXc YEH?WT DNGCEILTLRKD DTIPAIISHDE, en donde Xa, X„ y Xc son aminoácidos variables y en donde Xa, 5^ y Xc no son simultáneamente Tyr, Mefc y Gln, respectivamente . En un aspecto de la invención, una o más de Xa, I, y Xc se cambian del aminoácido natural a Gly, Ala, Ser, Thr, Asn o Asp. En un aspecto de la invención, Xa, Xb y Xc se cambian del aminoácido natural a Gly o Ala. En un aspecto de la invención, Xa, Xb y'Xc se cambian del aminoácido natural a Ala. De esta manera, la presente invención proporciona la sustitución Y168 a Ala (Y168A) (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 9) : MAISIKTPEDIEKMRVAGRLAAEVLEMIEPYVKPGVSTGELDRICNDYIVNEQHAVSACLGY HGYPKSVCISINEWCHGIPDDA LL DGDIVNIDVTVI DGFHGDTSKMFIVGKPpMGER LCRITQESLYLALRMVKPGINLREIGAAIQKFVEAEGFSVVREACGHGIGRGFHEEPQVLHY DSRETNVVLKPGMTFTIEPMVNAGKKEIRT KDGWTVKTKDRSLSAQYEH?WTDNGCEI LTLRKDDTIPAIISHDE y el ADN correspondiente que codifica para lo anterior, como la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO : 8 . De esta manera, la presente invención proporciona la sustitución Met 206 a Ala (M206A) (SECUENCIA DE.

IDENTIFICACIÓN NUMERO : 3 ) MAISIKTPEDIEKMRVAGRLAAEVLEMIEPYVKPGVSTGELDRICNDYIVNEQHAV SACLGYHGYPKSVCISINEWCHGIPDDAKLLKDGDIVWIDVTVIKDGFHGDTSKMFIVGKP TIMGERLCRITQESLYLALRMVKPGIN REIGAAIQKFVEAEGFSVVREXCGHGIGRGFHEE PQVLHYDSRETNWLKPGMTFTIEPAVNAGKKEIRTMKDGWTVKTKDRSLSAQYEHpWT DNGCEItTLRKDDTIPAIISHDE, la cual extiende la especificidad de sustrato de enzimas para permitir los siguientes aminoácidos : Asn, Leu, lie y Phe en la posición Pl ' . La presente invención también proporciona la sustitución de Gln233 a Ala fQ233A) (-SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO : 5 ) : MAISIKTPEDIEKMRVAGRLAAEVLEMIEPYVKPGVSTGELDRICNDYIVNEQHAV SACLGYHGYPKSVCISINEWCHGIPDDA LLKDGDIVNIDVTVIKDGFHGDTSKMFIVGKP TIMGERLCRITQESLYLALRMVKPGINLREIGAAIQKFVEAEGFSVVREXCGHGIGRGFHEE PQVLHYDSRETNWLKPGMtFTIEPAVNAGKKEIRTMKDGWTVKTKDRSLSAQYEHpWT DNGCEILTLRKDDTIPAIISHDE, o tanto Met 206 como Gln 233 en Ala (M206A Q233A) (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO : 7 ) : MAISIKTPEDIEKMRVAGRLAAEVLEMIEPYVKPGVSTGELDRICNDYIVNEQHAV- SACLGYHGYPKSVCISINEWCHGIPDDAKLLKDGDIVNIDVTVIKDGFHGDTSKMFIV- GKPTIMGERLCRITQESLYLALRMVKPGINLREIGAAIQKFVEAEGFSWREXCGHGIGRG- FHEEPQVLHYDSRETNWLKPGMTFTIEPAVNAGKKEIRTMKDGWTVKTKDRSLSAAYEHT IWTDNGCEILTLRKDDTIPAIISHDE, la cual ademas permite que sean los aminoácidos Pl ' His, Gln y Trp. En aspectos de la invención, la posición 168 está enmendada a Gly (Y168G) o Ala (Y168A) o Asn (Y168N) . Existen aspectos de la invención en donde el aminoácido 206 es una Ala (M206A) o una Gly (M206G) o Asn (M206N) y/o en donde el aminoácido 233 es una Ala (Q233A) o una Gly (Q233G) o Asn (G233N) . Los aspectos de la invención comprenden la combinación de dos o tres enmiendas, de acuerdo con lo siguiente - en donde la combinación natural de (Y168 M206 233Q) no está dentro de la invención.

En consecuencia, existen aspectos de la invención en donde la posición 206 y la posición 233 son ambas Ala (M206A Q233A) o Gly o Asn, o combinaciones de las mismas: (M206G Q233A) , (M206G Q233G) , (M206A Q233G) , (M206N Q233A) , (M206N Q233N) , (M206A Q233N) . Existen aspectos de la invención en donde la posición 168 se ha enmendado de acuerdo con lo siguiente: Existen aspectos de la invención en donde por lo menos una de las posiciones enmendadas se enmiendan en una Ala.

Existen aspectos de la invención en donde se encuentran los siguientes mutantes: (Y168G M206A) , (Y168G 206A 233A) , (Y168G M206N) , (Y168G M206N 233A) , (Y168A M206A 233A) , (Y168A M206A) , (Y168A M206N) , (Y168A M206N 233A) y (M206A Q233A) . De esta manera, la invención proporciona enzimas novedosas capaces de separar un péptido que contiene una metionina de inicio seguida por una Asn, Leu, lie, Phe, His, Gln o Trp en la posición Pl ' así como los aminoácidos permitidos por la aminopeptidasa de E. coli natural. La metionina aminopeptidasa de E. coli natural permite que Pl' sea cualquiera de los siguientes aminoácidos: Gly, Ala, Ser, Trp, Val o Cys. De esta manera, la invención también proporciona moléculas de ADN recombinantes que codifican para la secuencia anterior. Las secuencias de ADN se describen en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 2, 4 y 6. La invención también proporciona específicamente el ADN que codifica para las secuencias para los mutantes M206A, Q233A o M206A 233 anteriores. En la presente invención, las metionina aminopeptidasas mutantes se expresan en E. coli, pero en principio las células hospedadoras pueden ser de otro origen procarióticas o de origen eucariótico tal como Saccharo yces cerevisiae, Saccharomyces pombe, Pichia pastoris, etc., o, por ejemplo, células de mamífero.

De esta manera, la invención proporciona células hospedadoras transformadas por la molécula de ADN recombinante indicada en lo anterior. La separación de la metionina iniciadora por metionina aminopeptidasa se puede realizar in vitro después de la expresión de metionina aminopeptidasa y la purificación en células procarióticas o eucarióticas . Este procedimiento se ejemplifica en lo siguiente. De manera alternativa, la separación de la metionina iniciadora se puede llevar a cabo in vivo ya sea en células que expresen un plásmido dicistrónico o en células que coexpresen plásmidos que tengan la metionina aminopeptidasa y el péptido o proteína sustrato. El procesamiento in vivo con la metionina iniciadora también se puede llevar a cabo en células en donde los genes codifican para la metionina aminopeptidasa y el péptido o proteína que va a ser procesado se ha integrado al genoma. Se han realizado experimentos los cuales proporcionan un conjunto de condiciones óptimas para la reacción: La temperatura óptima para la reacción se determina que está entre 15 y 24°C Típicamente, la reacción posteriormente se realiza a 18°C. La concentración de ZnCl2 se determina que es óptima a aproximadamente 7.5 »M y se encontró que la concentración de NaCl es óptima a aproximadamente 100 mM y aceptable a menos de 130 M.

Después de la separación de la metionina iniciadora del producto del material inicial se puede obtener aprovechando las diferentes propiedades biofísicas de los dos péptidos . En una modalidad de la invención, el péptido es hIL-21, el cual, después de la separación de la metionina inicial contiene un Gln en la parte N terminal. El tratamiento con Qcyclase forma una piroglutamina (pGlu) . Debido a la formación de amida cíclica, el cambio neto de los productos es negativo en relación al péptido que contiene metionina. La diferencia en carga altera las propiedades de elución en una columna de intercambio catiónico, debido a que el péptido que contiene metionina tiene una unión más fuerte a la resina catiónica. Además, en hIL-21 no ciclada, el residuo Gln en la posición N terminal tendrá la capacidad de formar un enlace de hidrógeno entre el oxígeno de amida de la cadena lateral y la amina de la estructura principal de la parte N terminal cargada y de esta manera enmascarará la carga en la parte N terminal. Met-hIL-21 no posee la capacidad para ocultar la carga similar y por lo tanto se unirá con mayor fuerza a la columna de intercambio catiónico en comparación con hIL-21. En una modalidad de la invención, se proporciona un método de separación de mezcla de proteínas entre proteínas idénticas comenzando con Met-Gln y 3ln, respectivamente.

En una modalidad específica de la invención se proporciona la separación de Met-hIL-21 y hIL-21. En otra modalidad específica de la invención se proporciona la separación de Met-hIL-21 y hIL-21 y mutantes de los mismos .

EJEMPLOS Se han creado diversas construcciones de expresión de Met-AP, como se indica en la figura 1. Se han agregado NT1 (HHHNSWDHDINR) o una etiqueta hexa-His a las diversas formas mutantes de Met-AP para propósitos de purificación. La etiqueta de purificación se puede separar utilizando factor Xa en algunas construcciones o enterocinasa en otras, o la etiqueta de purificación puede dejarse sobre la enzima. La expresión de ARNm está bajo el control del promotor T7 o el promotor tac. Las construcciones bajo el control del promotor T7 se expresan en BL21 (DE3) mientras que las construcciones bajo el control del promotor tac se expresan en BL21. La expresión se induce por adición de IPTG a 0.4 mM a 6 mi de cultivos que crecen hasta una de DO€00 de 0.4 en medio LB. Las células se cosechan por centrifugación después de 2.5 horas. La lisis de las células se realiza por ciclos múltiples de congelamiento-recalentamiento y las fracciones de proteína soluble o insoluble se separan por centrifugación. La proteína soluble o insoluble, antes o después de la inducción de expresión, que se origina de cantidades de células iguales (medida por DO600) se somete a SDS-PAGE y tinción subsecuente con azul coloidal (figura 2) . Se calculan los niveles de expresión de Met-AP a -250 mg/1 después de 2.5 h de inducción en 6 mi de cultivos . Células de E. coli cosechadas de 1 1 de cultivo que expresan hexa-His-Met-AP M206A, Q233A se lisan utilizando un disruptor de células y el lisado clarificado se aplica sobre una columna de superflujo Ni2+-NTA. La elución con un gradiente de imidazol libera la proteína de fusión Met-AP a aproximadamente 200 mM de imidazol. La enzima se purifica adicionalmente y se intercambia el amortiguador (en amortiguador de almacenamiento/separación) utilizando cromatografía por exclusión de tamaño. La enzima se analiza utilizando SDS-PAGE, MALDI-MS y secuenciado de la parte N terminal - verificando la masa molecular y la identidad de la enzima. De acuerdo con el procedimiento anterior se preparan mutantes de NTl-Enterocinasa-Met-AP. La expresión está bajo el control del promotor tac. La adición de IPTG a los cultivos induce de manera primaria la expresión soluble de las enzimas Met-AP. Se preparan los siguientes mutantes de acuerdo con lo anterior: (Y168G M206A) , (Y168G ,206A 233A) , (Y168G M206N) , (Y168G M206N 233A) , (Y168A M206A 233A) , (Y168A M206A) , (Y168A M206N) y (Y168A M206N 233A) .

Se purifica por afinidad hexa-His-Xa-MetAP Q233A utilizando el superflujo de Ni2+-NTA. El espectro de masas MALDI-TOF es de hexa-His-Xa-Met-AP M206A, Q233A muestra que se aislan las enzimas correctas. Una masa de 32038.90 corresponde a Met-hexa-His-Xa-Met-AP M206A, Q233A y una masa de 31942.10 corresponde a hexa-His-Xa-Met-AP M206A, Q233A lo que indica que hexa-His-Xa-Met-AP M206A, Q233A se procesa por WT Met-AP o hexa-His-Xa-Met-AP M206A, Q233A in vivo. Los resultados se presentan en la figura 4. La adición de hexa-His-Xa-Met-AP M206A, Q233A a Met-hIL-21 a pH 7, 18°C genera -65% de hIL-21 libre de Met. En 44 h se puede observar más de 90% de separación de Met-hIL-21 (figura 3) . Otro mutante preparado por este método es hexa-His-Xa-Met-AP Q233A. Separación de la Met iniciadora a partir de Met-IL21 por Met-AP (M206A, Q233A) Se utiliza Met-AP purificada (M206A, Q233A) para eliminar la metionina iniciadora de Met-IL21 purificada parcial o completamente. La separación se realiza en un amortiguador de reacción que típicamente consiste de los siguientes componentes: K2S04 2-100 mM, NaCl 2-500 mM, ZnC , 1-100 »M y amortiguador HEPES 2-30 mM, pH 6-8. La separación se lleva a cabo por espectroscopia MALDI-TOF. El tiempo de reacción es 2-66 horas. Utilizando esta condición se puede realizar la separación de metionina a partir de Met-IL21 por debajo de los límites de detección de Met-IL21. Separación de la Met iniciadora a partir de Met-IL21 por Met-AP (M206A) Se utiliza Met-AP purificada (M206A) para separar la metionina iniciadora de Met-IL21 purificada parcial o completamente. La separación se realiza en un amortiguador de reacción que típicamente consiste de los siguientes componentes: K^SO^ 2-100 mM, NaCl 2-500 mM, ZnCl2 1-100 -M y amortiguador HEPES 2-30 mM, pH 6-8. La separación se ensaya por espectroscopia MALDI-TOF. El tiempo de reacción es 2-66 horas. Utilizando esta condición se puede llevar a cabo la separación de metionina a partir de Met-IL21 por debajo de los límites de detección de Met-IL21. Influencia de la temperatura en la separación de Met iniciadora a partir de Met-IL21 por Met-AP (M206A, Q233A) . Utilizando las condiciones y el ensayo descrito en el ejemplo 1 se hace variar la temperatura entre 4, 15, 24 y 30°C, respectivamente, mientras los demás parámetros permanecen fijos. La temperatura óptima para la reacción se determina que está entre 15 y 24°C. Típicamente, la reacción se realiza posteriormente a 18°C. Influencia de la concentración de ZnCl. en la separación de la Met iniciadora de Met-IL21 por Met-AP (M206A, Q233A) . Utilizando las condiciones y el ensayo descrito en el ejemplo 1 se hace variar la concentración de ZnCl2 entre 7.5, 11 y 15 »M, respectivamente, mientras los demás parámetros permanecen fijos. La concentración óptima de ZnCl2 para la reacción se determina que es de 7.5 »M. Típicamente, la. reacción se realiza posteriormente a una concentración de ZnCl2 de 7.5 »M. Influencia de la concentración de NaCl en la separación de la Met iniciadora de Met-IL21 por Met-AP (M206A, Q233A) . Utilizando las condiciones y el ensayo descrito en el ejemplo 1 se hace variar la concentración de NaCl entre 80, 130 y 180 mM, respectivamente, mientras los demás parámetros permanecen fijos. La concentración máxima de NaCl tolerada para que se lleve a cabo la reacción se determina que es de 130 mM. Típicamente, la reacción se realiza posteriormente a NaCl 100 mM. Influencia de la adición de Q-ciclasa en la separación de la Met iniciadora de Met-IL21 por Met-AP (M206A, Q233A) y formación de piroglutamina Utilizando las condiciones como se describen en los ejemplos anteriores se determina el efecto de agregar Q-ciclasa a la mezcla de reacción. Se utiliza nuevamente MALDI-TOF para ensayar la separación de metionina y la conversión subsecuente de glutamina en la posición 1 en IL21 en piroglutamina. Se encontró que la adición de Q-ciclasa a la mezcla de reacción no perjudica la separación de la metionina iniciadora a partir de Met-IL21 y además la Q-ciclasa es completamente eficaz en convertir la glutamina en la posición 1 en IL21 en piroglutamina bajo las condiciones de reacción descritas en los ejemplos anteriores. Purificación y separación de Met-IL21, IL21 y piroglutamina IL-21 utilizando una columna Mono-S. Las diferentes propiedades biofísicas entre Met- IL21, IL21 y piroglutamina IL21 se pueden utilizar para propósitos de purificación/separación. La piroglutamina IL21 se deberá a la carencia de formación de amida ciclizada de la protonación normal de la parte N terminal . La diferencia de carga (-1) entre hIL-21 comenzando con piroglutamina y Met-IL21 se puede utilizar en una columna de intercambio de cationes que eluirá primero piroglutamina IL21 (debido a su carencia de una carga positiva) y posteriormente Met-IL21, la cual presentará una unión más fuerte a la resina catiónica. Además, en IL-21 no ciclizada, la glutamina colocada en la parte N terminal tendrá la capacidad de formar una unión de hidrógeno entre el oxígeno amida de cadena lateral y la amina de estructura principal de la parte N terminal cargada y de esta manera ocultará la carga en la parte N terminal. La Met-IL21 no poseerá la capacidad para un ocultamiento de caro/a similar y por lo tanto se unirá más fuertemente a la columna de intercambio catiónico en comparación con IL21. Se carga en una columna Mono-S una mezcla de Met-IL21, IL21 y piroglutamina IL21 que incluye NaCl 300 mM y amortiguada a pH 6.5. El amortiguador A consiste de NaCl 300 mM amortiguado a pH 6.5 y el amortiguador B es NaCl 1 M amortiguado a pH 6.5. Se aplica un gradiente lineal (realizado en un sistema A TA) de 0-20% de amortiguador B sobre 45 volúmenes de columna. Las fracciones se ensayan como se describe bajo el ejemplo de Q-ciclasa anterior. Utilizando el gradiente descrito antes, se obtiene una separación eficaz de Met-IL21, IL21.piroglutamina IL21 (Figura 5) . Met-hßH Se utiliza Met-AP purificada (M206A) para separar la metionina iniciadora de Met-hGH (hormona del crecimiento humana) purificada parcial o completamente, en donde Pl' es un residuo Phe. La separación se realiza en un amortiguador de reacción que típicamente consiste de los siguientes componentes: K2S04 2-100 mM, NaCl 2-500 mM, ZnCl2 1-100 «M y amortiguador HEPES 2-30 mM, pH 6-8. La separación se ensaya por espectroscopia MALDI-TOF. El tiempo de reacción es de 2-66 horas. Utilizando estas condiciones se demuestra la separación parcial o completa de metionina a partir de Met-hGH.

Met-hGH Se utiliza Met-AP purificada (M206A, Q233A) para separar la metionina iniciadora de Met-hGH (hormona del crecimiento humana) purificada parcial o completamente, en donde Pl1 es un residuo Phe. La separación se realiza en un amortiguador de reacción que típicamente consiste de los siguientes componentes: K2S04 2-100 mM, NaCl 2-500 mM, ZnCl2 1-100 »M y amortiguador HEPES 2-30 mM, pH 6-8. La separación se ensaya por espectroscopia MALDI-TOF. El tiempo de reacción es de 2-66 horas. Utilizando estas condiciones se obtiene la separación parcial o completa de metionina a partir de Met-hGH. Met-IL-20 Se utiliza Met-AP purificada (M206A) para separar la metionina iniciadora de Met-IL-20 purificada parcial o completamente, en donde Pl' es un residuo Leu. La separación se realiza en un amortiguador de reacción que típicamente consiste de los siguientes componentes: K2S04 2-100 mM, NaCl 2-500 mM, ZnCl2 1-100 «M y amortiguador HEPES 2-30 mM, pH 6-8. La separación se determina por espectroscopia MALDI-TOF. El tiempo de reacción es de 2-66 horas. Utilizando estas condiciones se demuestra la separación parcial o completa de metionina a partir de Met-IL-20. Met-IL-20 Se utiliza Met-AP purificada (M206A, Q233A) para separar la metionina iniciadora de Met-IL-20 purificada parcial o completamente, en donde Pl * 'es un residuo Leu. La separación se realiza en un amortiguador de reacción que típicamente consiste de los siguientes componentes: K2S04 2-100 mM, NaCl 2-500 mM, ZnCl2 1-100 »M y amortiguador HEPES 2-30 mM, pH 6-8. La separación se determina por espectroscopia MALDI-TOF. El tiempo de reacción es de 2-66 horas. Utilizando estas condiciones se demuestra la separación parcial o completa de metionina a partir de Met-IL-20. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Variantes de aminopeptidasa de E. coli, caracterizadas porque están mutadas en los receptáculos que definen el sustrato.

2. Variantes de aminopeptidasa de E. coli, caracterizadas porque se mutan en el sitio activo que tiene especificidad de sustrato extendida de la posición Pl ' en relación a la forma natural .

3. Las variantes de metionina aminopeptidasa de E. coli , de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizadas porque extienden la especificidad del sustrato en la posición Pl' para incluir Asn, Leu, lie, Phe, His, "Gln o Trp así como los aminoácidos permitidos en la posición Pl* por la forma natural.

4. Las metionina aminopeptidasas de E. coli de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizadas porque los residuos en las posiciones 168, 206 ó 233 se han enmendado en una secuencia diferente de Y168 y M206 y ^233.

5. Las metionina aminopeptidasas de E. coli de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizadas porque comprenden enmiendas del aminoácido en la posición 168.

6. Las metionina aminopeptidasas de E. coli de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizadas porque comprenden la enmienda en la posición 206.

7. Las metionina aminopeptidasas de E. coli de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizadas porque comprenden la enmienda en la posición 233.

8. Las metionina aminopeptidasas de ?. coli de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y 6 a 7, caracterizadas porque comprenden enmiendas en la posición 206 y 233.

9. Las metionina aminopeptidasas de E. coli de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizadas porque comprenden enmiendas en la posición 168 y 206.

10. Las metionina aminopeptidasas de E. coli de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y 7, caracterizadas porque comprenden enmiendas en la posición 168 y 233.

11. Las metionina aminopeptidasas de E. coli de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizadas porque comprenden enmiendas en las posiciones 168, 206 y 233.

12. Las metionina aminopeptidasas de E. coli de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizadas porque las enmiendas comprenden un intercambio de un aminoácido natural a Gly, Ala, Ser, Thr, Asn o Asp.

13. Las metionina aminopeptidasas de E. coli de conformidad con la reivindicación 12, caracterizadas porque las enmiendas comprenden Ala y/o Gly.

14. Las metionina aminopeptidasas de E. coli de conformidad con la reivindicación 13, caracterizadas porque las enmiendas comprenden Ala.

15. Las metionina aminopeptidasas de E. coli de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 14, caracterizadas porque la posición 168 es Ala.

16. Las metionina aminopeptidasas de E. coli de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 14, caracterizadas porque la posición 206 es Ala.

17. Las metionina aminopeptidasas de E. coli de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 14, caracterizadas porque la posición 233 es Ala.

18. Las metionina aminopeptidasas de E. coli de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 14, caracterizadas porque las posiciones 206 y 233 son ambas Ala. .

19. Una metionina aminopeptidasa de E. coli , caracterizada porque tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 3.

20. Una metionina aminopeptidasa de E. coli , caracterizada porque tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 5.

21. Una metionina aminopeptidasa de E. coli , caracterizada porque tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 7.

22. Una metionina aminopeptidasa de E. coli , caracterizada porque tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 9.

23. El uso de una aminopeptidasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 para separación de la metionina iniciadora de polipéptidos .

24. El uso de conformidad con la reivindicación 23, en donde el péptido es IL-21, mutantes, derivados químicos o especies homologas del mismo; o IL-20 o hGH.

25. El uso de conformidad con la reivindicación 24, en donde el péptido es IL-21 humana.

26. El uso de conformidad con la reivindicación 24, en donde el péptido son mutantes de IL-21 humana.

27. El uso de conformidad con la reivindicación 24, en donde el péptido son derivados químicos de IL-21 humana.

28. El uso de conformidad con la reivindicación 24, en donde el péptido son especies homologas de IL-21 human .

29. ADN aislado, caracterizado porque codifica para los péptidos de conformidad con las reivindicaciones 1 a 22.

30. El ADN aislado caracterizado porque codifica para el péptido de conformidad con la reivindicación 19, como se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 2.

31. El ADN aislado caracterizado porque codifica para el péptido de conformidad con la reivindicación 20, como se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 4.

32. El ADN aislado caracterizado porque codifica para el péptido de conformidad con la reivindicación 21, como se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 6.

33. El ADN aislado caracterizado porque codifica para el péptido de conformidad con la reivindicación 21, como se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 8.

34. Una célula hospedadora, caracterizada porque comprende cualquiera de las secuencias nucleotídicas de conformidad con las reivindicaciones 29-33.

35. La célula hospedadora, de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada porque comprende -también las secuencias nucleotídicas que codifican para el péptido que contiene Met.

36. La célula hospedadora, de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque las secuencias están en el mismo plásmido.

37. La célula hospedadora, de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque las secuencias están sobre plásmidos diferentes.

38. Un método para purificación de un péptido producto que tiene Gln en la parte N terminal del sustrato, el péptido contiene Met-Gln, caracterizado porque comprende la etapa de aplicar Qcyclase seguida por purificación utilizando la diferencia de carga de los compuestos.

39. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque comprende la purificación de una columna de intercambio catiónico.