PT1928910E

PT1928910E - Um método para produção em massa de uma região fc da imunoglobulina com deleção dos resíduos de metionina inicial

Info

Publication number: PT1928910E
Application number: PT67836205T
Authority: PT
Inventors: Gwan-Sun Lee; Dae Hae Song; Jin Sun Kim; Sung Youb Jung; Jin Hwan Shin; Se-Chang Kwon
Original assignee: Hanmi Science Co Ltd
Priority date: 2005-08-16
Filing date: 2006-08-16
Publication date: 2014-03-06
Also published as: AU2006280587A1; JP2014110816A; EP1928910A4; CN101258164B; ES2456672T3; US7968316B2; JP5846712B2; RU2008110050A; EP1928910A1; RU2428430C2; DK1928910T3; BRPI0614516A2; WO2007021129A1; AU2006280587B2; CA2619771A1; UA97628C2; EP1928910B1; JP2009513110A; MY149128A; US20080293106A1

Description

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DESCRIÇÃO

"UM MÉTODO PARA PRODUÇÃO EM MASSA DE UMA REGIÃO FC DA IMUNOGLOBULINA COM DELEÇÃO DOS RESÍDUOS DE METIONINA INICIAL"

Campo Técnico A presente invenção refere-se a um método para produção em grande escala de uma região Fc da imunoglobulina monomérica ou dimérica, livre de resíduos de metionina inicial. Técnica Anterior

Com os avanços na engenharia genética, foi desenvolvida e usada uma grande quantidade de fármacos proteicos. Entretanto, os fármacos proteicos, suscetíveis à desnaturação ou degradação proteolítica no corpo, são difíceis de serem mantidos em concentrações e títulos in vivo durante um longo período de tempo. 0 aperfeiçoamento na estabilidade proteica in vivo, que pode levar à manutenção de concentrações in vivo de fármacos proteicos em níveis adequados, é importante não apenas para elevar a eficácia da terapêutica, mas também para ajudar aos pacientes que precisam tomar injeções frequentes de seus fármacos proteicos, em termos de custo e conveniência.

Durante muito tempo, foram realizadas várias tentativas em melhorar a estabilidade in vivo dos fármacos proteicos, como, por exemplo, alterando-se a formulação das proteínas, combinando uma proteína com outra proteína, ou ligando, por meios químicos ou biológicos, um polímero adequado à superfície de uma proteína.

Um exemplo dessa técnica consiste em fazer uma proteína de fusão com o fragmento Fc da imunoglobulina. 0 fragmento Fc medeia funções efetoras, tal como citotoxicidade dependente de complemento (CDC) ou a citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC), bem 2 como a capacidade de ligação ao antigeno, que é uma função unicamente das imunoglobulinas. Além disso, o fragmento Fc contém uma sequência que participa na ligação ao recetor Fc neonatal (FcRii), que desempenha um papel na regulação dos niveis de IgG no soro, pois aumenta o transporte da IgG materna para os neonatos e a semivida da IgG (Ghetie and Ward, Immunology Today 18: 592-598, 1997), e a sequência regula a interação entre a proteína A e a proteína G. Mediante a fusão desse fragmento Fc com uma proteína terapêutica, realizaram-se diversos estudos para melhorar a estabilidade da proteína terapêutica.

Por exemplo, a Patente Coreana N° 249572 revela uma proteína de fusão que é preparada ligando uma região Fc de cadeia pesada da IgGl (Fc) na sua extremidade amino-terminal a uma extremidade carboxilo-terminal de uma proteína, tal como um recetor de IL4, um recetor de IL7, um recetor de G-CSF ou um recetor EPO, produzindo a proteína de fusão resultante em células de mamíferos. A Patente US N° 5.605.690 descreve uma proteína de fusão que compreende um recetor de fator de necrose tumoral, fusionado, na sua extremidade carboxilo-terminal, a um derivado da Fc da IgGl humana, a proteína de fusão sendo produzida em células animais. Além disso, Tanox Inc. divulgou, na Patente US N° 5.723.125 e 5.908.626, uma molécula híbrida compreendendo interferon alfa ou beta humano que é ligada, na sua extremidade carboxilo-terminal, à Fc da IgG4 humana nativa por meio de um péptido de ligação, e produzida em células animais. A Lexigen Inc., conforme descrito na Publicação Internacional do Pedido PCT N2 WO 00/69913, preparou um Fc de IgGl nativa, ligado, na sua extremidade carboxilo-terminal, à extremidade amino-terminal do interferão humano por recombinação genética sem o uso de um péptido de ligação, e produziu a proteína de fusão em células animais. A Publicação de Patente US N- 20030082679 revela uma proteína de fusão com uma semivida prolongada, que 3 compreende G-CSF humano ligado, na sua extremidade carboxilo-terminal, à extremidade amino-terminal da Fc da IgGl, e é produzida em células animais. A Publicação de Patente US N2 20010053539, Patente US N° 6.030.613, Publicação Internacional de Pedido PCT N° WO 99/02709 e WO 01/03737 e a Patente Européia N° 0464533B1 revela uma proteína de fusão de Fc com uma semivida em soro maior do que uma proteína nativa, que compreende uma Fc de IgGl ou derivado de Fc ligado, na sua extremidade amino-terminal, por meio de um péptido de ligação ou sem um péptido de ligação, à extremidade carboxilo-terminal da EPO humana, TPO, hormona do crescimento humano ou interferão beta humano, a proteína de fusão à Fc sendo produzida em células animais.

Essas proteínas de fusão ao Fc, conforme descrito acima, aumentam a semivida em soro das proteínas-alvo, mas envolvem problemas relacionados à mediação das funções efetoras pelo fragmento Fc (Patente US N° 5.349.053). Por meio das funções efetoras do fragmento Fc, elas ajustam complementos ou ligam-se a células expressando FcyRs, levando à lise das células específicas, e induzem a produção e segregação de várias citocinas que induzem a inflamação, acarretando inflamação indesejada. Além disso, a fusão cria uma nova sequência de aminoácidos em uma região de conexão entre o fragmento Fc e a proteína parceira, o que pode induzir possivelmente respostas imunológicas em caso de administração por período prolongado.

Sob esse aspeto, foram realizadas muitas tentativas em preparar uma imunoglobulina, ou fragmento de imunoglobulina, que possua uma grande semivida em soro, mas que seja deficiente em funções efetoras. Cole et al. relataram que, quando resíduos de aminoácidos da região CH2 nas posições 234, 235 e 237, conhecidos por terem um papel importante na ligação aos recetores de Fc, são substituídos 4 por alanina para, dessa forma, produzir um derivado de Fc com afinidade de ligação reduzida para recetores de Fc, a atividade de ADCC é inibida (Cole et al., J. Immunol. 159: 3613-3621, 1997). Entretanto, em todas essas variantes, o Fc pode ter imunogenicidade ou antigenicidade aumentada se comparado ao fragmento Fc humano nativo em razão da presença de aminoácidos inadequados, e pode perder funções desejadas do Fc.

Dentre os métodos de eliminação ou redução de funções efetoras indesejadas, que mantêm altas concentrações em soro de uma imunoglobulina, um baseia-se na remoção de componentes de açúcares da imunoglobulina. Conforme descrito na Patente US N—5.585.097, um derivado de anticorpo aglicosilado, como um anticorpo anti-CD3, pode ser preparado substituindo um resíduo glicosilado do anticorpo, o resíduo de asparagina na posição 297 do domínio CH2, por outro aminoácido. Esse derivado de anticorpo aglicosilado exibe funções efetoras reduzidas, mas ainda mantém sua afinidade de ligação com o recetor FcRn, sem nenhuma alteração na meia-vida em soro. Entretanto, esse derivado também é problemático em termos de ser possivelmente reconhecido como um material estranho e ser rejeitado pelo sistema imunológico em virtude da produção de uma construção recombinante contendo uma sequência anormal. A Publicação de Patente US N° 20030073164 revela um método de produção de um derivado de Fc usando E. coli livre da capacidade de glicosilação a fim de preparar um anticorpo terapêutico deficiente em funções efetoras. A companhia americana Amgen Inc. descreveu, na Patente US N° 6.660.843 e na Publicação de Patente US N° 20040044188 e 20040053845, um derivado de Fc da IgGl humana contendo deleções de aminoácidos nos primeiros cinco resíduos de aminoácidos da região de dobradiça, que é fusionada à extremidade amino ou carboxilo-terminal de uma 5 proteína terapêutica ou uma proteína terapêutica imitada por um péptido, e sua produção usando um hospedeiro E. coli. Entretanto, essa proteína de fusão que não contém uma sequência de sinais é expressa como corpos de inclusão, e assim, deve ser submetida a um processo adicional de renovelamento. Esse processo de enovelamento de proteínas reduz a produção, e, principalmente em uma proteína presente como um homodímero ou um heterodímero, reduz notoriamente a produção de dimeros. Além disso, quando uma proteína que não contém uma sequência de sinais é expressa em E. coli, um resíduo de metionina é adicionado ao N-terminal do produto da expressão devido à característica do sistema de expressão de proteínas do E. coli. Os supracitados produtos de expressão da Amgen Inc. têm um resíduo de metionina N-terminal, que pode induzir respostas imunológicas na ocasião de administração repetida ou excessiva ao corpo. Além disso, tendo em vista que essas moléculas de fusão são expressas em uma forma de proteína de fusão no E. coli pela ligação de um gene que codifica uma proteína terapêutica com um gene Fc, é difícil expressá-las no E. coli, ou uma proteína terapêutica é difícil de ser produzida no E. coli caso sua expressão no E. coli em uma forma fusionada resulte em uma diminuição significativa ou na perda da atividade. Além disso, uma vez que a fusão das duas moléculas cria uma sequência de aminoácidos animal, de ocorrência não natural, na região de conexão entre duas proteínas, a proteína de fusão poderia ser possivelmente reconhecida como "não-própria" pelo sistema imunológico, com isso induzindo respostas imunológicas.

Para resolver esses problemas, os presentes inventores preparam previamente um fragmento Fc e um fármaco proteico como polipéptidos separados, usando, em vez de um método de fusão baseado em recombinação genética, os melhores sistemas de expressão, e ligando, de maneira covalente, os 6 dois polipéptidos um ao outro para usar o fragmento Fc como um veículo de fármacos. Neste caso, é possível preparar um conjugado de um fármaco de polipéptido glicosilado e um Fc aglicosilado, que não induz respostas imunológicas indesejadas, mas possui propriedades satisfatórias de atividade de fármaco fisiológico, duração e estabilidade in vi vo.

No caso acima, uma vez que é preferível que Fc esteja em uma forma aglicosilada, utiliza-se um sistema de expressão procariótica, tal como E. coli. Os métodos de produção de proteínas usando um sistema de expressão com E. coli apresentam muitas vantagens sobre os métodos convencionais que fazem uso de células animais, conforme mostrado a seguir. Um vetor de expressão de E. coli pode ser construído com facilidade, permitindo assim avaliar rapidamente a expressão de proteína. Graças a sua rápida velocidade de crescimento, o E. coli permite a produção em massa de uma proteína de interesse a baixo custo. Além disso, pode-se usar um processo de expressão relativamente simples. Logo, o E. coli é mais útil para produção comercial do que outras células hospedeiras. A maioria das regiões Fc está presente como corpos de inclusão quando ocorre a sobre-expressão em E. coli. Por esta razão, a indústria exige que as regiões Fc sejam expressas em forma solúvel em água no E. coli. A Patente Européia N° 0227110 revela a produção da região Fc da imunoglobulina G1 usando apenas o produto (o lisado celular) que é expresso em forma solúvel em água quando ocorre a superexpressão da região Fc da imunoglobulina G1. Entretanto, apenas a imunoglobulina expressa em forma solúvel em água tem um rendimento tão baixo quanto 15 mg/L, o que não tem valor em termos de utilidade industrial. O Pedido de Patente Coreano N° 0092783, superando o problema encontrado no estado da técnica, introduz uma nova técnica de expressar uma região Fc da imunoglobulina, não como 7 corpos de inclusão, mas em uma forma solúvel em água em E. coli por meio da fusão da sequência de nucleótidos, que corresponde à região Fc, a uma sequência de sinais de E. coli. Ao ocorrer a expressão em E. coli, a proteina de interesse está presente em forma solúvel, livre do péptido de sinal, com seu rendimento de produção aumentado tanto quanto 600 mg/L.

Voltando-se para a presente invenção, os presentes inventores, visando a aumentar o rendimento de produção a um nível adequado para industrialização, realizaram uma intensa e meticulosa pesquisa de um método de produção de regiões Fc da imunoglobulina aglicosilada ativa livres de resposta imunológica, e descobriam que quando uma sequência de nucleótidos codificando uma região Fc da imunoglobulina é expressa em uma forma fusionada no terminal N para uma região de dobradiça específica, a região Fc da imunoglobulina é expressa como corpos de inclusão, que são, finalmente, um dímero ou um monômero da região Fc da imunoglobulina livre de resíduos de metionina inicial por meio de processos de solubilização e renovelamento. O documento WO 01/18203 revela composições proteína de fusão de osteoprotegerina, métodos de preparação de tais composições e usos dos mesmos. O documento WO 2005/047334 revela um fragmento Fc de IgG, um vetor recombinante que expressam o fragmento Fc de IgG, um transformante transformado com o vetor recombinante e um método de preparar um fragmento Fc de IgG que compreende cultivar o transformante.

Revelação da Invenção A presente invenção fornece um método de produção de uma região Fc de imunoglobulina livre de um resíduo de metionina codificado por um codão de iniciação em grande escala, que compreende: preparar um vetor de expressão recombinante incluindo uma sequência de nucleótido que codifica uma região Fc de imunoglobulina recombinante composta de uma região Fc de imunoglobulina ligada a uma terminação N dos mesmos a uma região de dobradiça de imunoglobulina via uma ligação peptídica; transformar um E. coli com o vetor de expressão recombinante para criar um transformante; cultivar o transformante para expressar a região Fc de imunoglobulina como um corpo de inclusão; isolar e purificar a região Fc de imunoglobulina from o corpo de inclusão; e solubilizar e redobrar o fragmento Fc de imunoglobulina, em que dita região de dobradiça de imunoglobulina tem cisteina, serina ou prolina como o aminoácido inicial do N-terminal.

Breve Descrição dos Desenhos

Os referidos objetivos, aspectos e vantagens da presente invenção, e outros, serão compreendidos com mais clareza na descrição detalhada seguinte, considerada em combinação com os desenhos acompanhantes, nos quais: A FIG. 1 é uma fotografia de eletroforese em gel mostrando a formação de fragmentos monoméricos e diméricos da região Fc de corpos de inclusão expressos usando um vetor de expressão contendo um nucleótido que codifica uma região Fc da imunoglobulina IgG4 humana; A FIG. 2 ilustra os resultados da ELISA para a capacidade de ligação a Clq da região Fc da imunoglobulina IgG4 humana; A FIG. 3 ilustra os resultados da ELISA para a capacidade de ligação a FcyRI da região FC da imunoglobulina IgG humana r A FIG. 4 ilustra os resultados da ELISA para a capacidade de ligação a FcyRIII da região Fc da imunoglobulina IgG humana t A FIG. 5 ilustra os resultados da ELISA para a capacidade de ligação ao FcRnap2 da região Fc da imunoglobulina IgG humana; 9 A FIG. 6 ilustra os resultados das semividas em soro de um conjugado de EPO-PEG-Fc preparado usando uma região Fc da imunoglobulina IgG humana como um veiculo; A FIG. 7 é uma fotografia de um gel SDS- PAGE a 15 %, no qual, após serem misturadas com volumes iguais de um tampão de amostra de proteínas 2x, são realizadas partes das soluções fermentadas obtidas pelo crescimento dos transformantes microbianos do Exemplo 2 em fermentadores sob condição de expressão; A FIG. 8 é uma fotografia de um gel SDS- PAGE no qual as proteínas reenvelopadas dos corpos de inclusão expressos pelos transformantes do Exemplo 2 são separadas e visualizadas como bandas; A FIG. 9 é uma fotografia de um gel SDS- PAGE a 15 %, no qual, após serem misturadas com volumes iguais de um tampão de amostra de proteínas 2x, são realizadas partes das soluções fermentadas obtidas pelo crescimento dos transformantes microbianos do Exemplo 3 em fermentadores sob condição de expressão; e A FIG. 10 é uma fotografia de um gel SDS- PAGE a 15 % no qual, após serem misturados com um tampão de amostra de proteínas livre de agente redutor, como DTT ou beta-mercaptoetanol, são realizados os respetivos produtos expressos e purificados no Exemplo 3.

Melhor modo para levar a cabo a invenção

Em um aspeto, a presente invenção refere-se a um método de produção de uma região Fc de imunoglobulina livre de um resíduo de metionina codificado por um codão de iniciação em grande escala, que compreende: preparar um vetor de expressão recombinante incluindo uma sequência de nucleótido que codifica uma região Fc de imunoglobulina recombinante composta de uma região Fc de imunoglobulina ligada a uma terminação N dos mesmos to uma região de dobradiça de imunoglobulina via uma ligação peptídica; 10 transformar um E. coli com o vetor de expressão recombinante para criar um transformante; cultivar o transformante para expressar a região Fc de imunoglobulina como um corpo de inclusão; isolar e purificar a região Fc de imunoglobulina do corpo de inclusão; e solubilizar e redobrar o fragmento Fc de imunoglobulina, em que dita região de dobradiça de imunoglobulina tem cisteina, serina ou prolina como o aminoácido inicial da terminação N. A presente invenção refere-se a um método de produção em massa de uma região Fc da imunoglobulina útil como um veiculo para fármacos proteicos. Quando uma região Fc da imunoglobulina é fusionada no terminal N com uma região de dobradiça, a região Fc resultante recombinante da imunoglobulina Fc é encontrada expressa como um corpo de inclusão, que depois é solubilizada e reenovelada em um dímero ou monômero em uma forma ativa, livre do resíduo de metionina inicial codificado pelo codão de iniciação. A presente invenção é de grande importância em termos da descoberta de que, quando fusionada a uma região Fc da imunoglobulina, uma região de dobradiça desempenha um papel fundamental no processamento e reenovelamento da região Fc recombinante em uma sequência nativa livre do resíduo de metionina inicial codificado pelo codão de iniciação. A região de dobradiça capaz de permitir que uma região Fc da imunoglobulina seja produzida em massa em uma forma recombinante com ela pode ser um derivado de IgG, IgA, IgM, IgE ou IgD de humanos ou de outros animais, inclusive cabras, suínos, camundongos, coelhos, hamsters, ratos e porcos porquinhos-da-índia, tendo preferência pelos derivados de IgG, por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, ou IgG4 (SEQ. ID. 14 a 17). A região de dobradiça útil na presente invenção pode ser uma região de dobradiça inteira ou um fragmento dela. Prefere-se um fragmento da região de dobradiça contendo duas ou mais sequências consecutivas de 11 aminoácidos, que são mais preferíveis quando contendo pelo menos um resíduo de cisteína. São de uso prático na presente invenção os fragmentos da região de dobradiça derivados de IgG4 da SEQ. ID N° 17, que são representados pela SEQ. ID. N° 18, 19, 20 e 21. Quando são empregadas regiões de dobradiça de SEQ. ID N° 18, 19 e 20, a região Fc da imunoglobulina pode ser preparada em forma de dímero ou monômero. A região de dobradiça da SEQ. ID. N° 21 propicia a preparação eficaz de um monômero da região Fc da imunoglobulina. Em outras implementações da presente invenção, fragmentos representados pelas SEQ. ID. N° 48 a 55 da região de dobradiça, derivada da IgGl da SEQ. ID. N° 14, e representadas pelas SEQ. ID. N- 56 a 60, da região de dobradiça derivada de IgG2 da SEQ. ID. NQ 15, foram usados para produzir um dímero da região Fc da imunoglobulina. A região Fc da imunoglobulina capaz de ser produzida pela presente invenção pode ser uma forma nativa isolada de seres humanos ou de outros animais, inclusive, cabras, suínos, camundongos, coelhos, hamsters, ratos e porquinhos-da- índia, ou pode ser um recombinante ou derivado dela, obtido de células animais transformadas ou microorganismos. Pode-se dar preferência a uma região Fc da IgG, IgA, IgM, IgE e IgD de seres humanos, ou uma combinação ou híbrido delas. O termo "combinação", conforme usado neste documento, significa que os polipéptidos codificando fragmentos Fc da imunoglobulina de cadeia única da mesma origem são ligados a um único polipéptido de cadeia única de uma origem diferente para formar um dímero ou multimero. O termo "híbrido", conforme usado neste documento, significa que as sequências que codificam dois ou mais fragmentos Fc da imunoglobulina de diferentes origens estão presentes em um fragmento Fc de imunoglobulina de cadeia única. A imunoglobulina pode, de preferência, ser uma região Fc da IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4, ou uma combinação ou híbrido destas. As sequências de nucleótidos que codificam 12 regiões Fc da imunoglobulina humana e sequências de aminoácidos limitadas a estas, úteis, na presente invenção, podem ser as codificadas por sequências de nucleótidos dos bancos de dados GenBank e/ou EMBL. A região Fc da imunoglobulina produzida pela presente invenção inclui um derivado da sequência de aminoácidos. 0 termo "derivado da sequência de aminoácidos" se refere a uma sequência em que um ou mais resíduos de aminoácidos diferem- se de uma sequência de aminoácidos tipo selvagem, e podem acorrer naturalmente ou serem gerados por meios artificiais. A região Fc da imunoglobulina inclui derivados que resultam de uma deleção, uma inserção, uma substituição conservativa ou não conservativa, ou suas combinações. Uma inserção é normalmente ieita pela adição de uma sequência consecutiva de aminoácidos de cerca de 1 a 20 aminoácidos, ou pode ser feita com uma sequência mais longa. Uma deleção está geralmente na faixa de cerca de 1 a 30 resíduos de aminoácidos. Trocas de aminoácidos em proteínas e péptidos, que geralmente não alteram a atividade das proteínas ou péptidos, são conhecidos na técnica (H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, Nova Iorque, 1979). As trocas de ocorrência mais comum são: Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Tre/Ser, Ala/Gli, Ala/Tre, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gli, Thy/Fen, Ala/Pro, Lis/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu e Asp/Gli, em ambas as direções. Tais derivados podem ser preparados por meio de um método de síntese química de péptidos ou um método de recombinação baseado em sequência de ADN, ambos os quais são conhecidos na técnica (Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova Iorque, USA, 2a Ed., 1989).

Além disso, a região Fc da imunoglobulina, se for desejado, pode ser modificada por fosforilação, sulfatização, acrilação, glicosilação, metilação, famesilação, acetilação, amidação, entre outros. O derivado de imunoglobulina produzido pela presente 13 invenção é, de preferência, um equivalente funcional em relação a sua forma natural, tendo assim uma atividade biológica similar, ou, se desejado, poderia ser produzido alterando-se a propriedade da forma natural. De preferência, os derivados da região Fc da imunoglobulina são proteínas que possuem estabilidade estrutural aumentada contra calor, pH, etc., ou solubilidade, ou que possuem características aperfeiçoadas em termos de formação de ligação de bissulfureto, compatibilidade com um hospedeiro de expressão, ligação ao complemento, ligação ao recetor Fc e citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) , contanto que os derivados produzidos não sejam tão diferentes das formas naturais dos humanos a ponto de induzir respostas imunológicas indesejadas em humanos e animais. Derivados preferidos são regiões Fc da IgGl que são alterados em tal resíduo específico de modo a terem afinidade reduzida por recetores Fc mediando a citoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). Um derivado produzido pode conter uma deleção ou uma substituição por outro aminoácido no residuo de leucina na posição 234 de uma sequência CH2 da IgGl (consulte a sequência do banco de dados Kobat para obter a numeração dos resíduos de aminoácidos). Mais preferivelmente, Leu234 é substituído por fenilalanina, um resíduo de aminoácido em uma posição correspondente em IgG4.

De acordo com a presente invenção, é preparada uma sequência de nucleótidos que codifica para uma região Fc da imunoglobulina recombinante na qual uma região Fc da imunoglobulina é fusionada a uma região de dobradiça da imunoglobulina. Conforme usado neste documento, o termo "região Fc da imunoglobulina recombinante" se refere a uma região Fc da imunoglobulina ligada, no terminal N, a uma região de dobradiça via uma ligação peptídica.

Dependendo da região Fc da imunoglobulina, a região de dobradiça a ser fusionada pode ser selecionada. De 14 preferência, é uma região de dobradiça de origem igual à da região Fc da imunoglobulina. Na prática real da presente invenção, foi preparada uma seguência de nucleótidos que codifica para uma região Fc da imunoglobulina recombinante, consistindo de uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ. ID N- 7, 9, 11 ou 13, na qual uma região Fc derivada de IgG4 é fusionada a uma região de dobradiça consistindo de uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ. ID N— 18, 19, 20 ou 21. As sequências de nucleótidos que codificam para as regiões Fc da imunoglobulina recombinante são representadas pelas SEQ. ID. N° 6, 8, 10 e 12, respetivamente.

Em outra implementação, foi preparada uma sequência de nucleótidos que codifica para uma região Fc da imunoglobulina recombinante que consiste de uma sequência de aminoácidos apresentada como na SEQ. ID. N° 25, 29, 31, 33, 35 ou 37, na qual uma região Fc derivada de IgGl é fusionada a uma região de dobradiça que consiste de uma sequência de aminoácidos apresentada como uma das SEQ. ID. Nos 49 e 51 a 55. As sequências de nucleótidos resultantes que codificam as regiões Fc da imunoglobulina recombinante são representadas pelas SEQ. ID. N° 24, 28, 30, 32, 34 e 36.

Em outra implementação, foi preparada uma sequência de nucleótidos que codifica para uma região Fc da imunoglobulina recombinante que consiste de uma sequência de aminoácidos apresentada como na SEQ. ID. N° 39, 41, 43, 45 ou 47, em que uma região Fc derivada de IgG2 é fusionada a uma região de dobradiça que consiste de uma sequência de aminoácidos apresentada como uma das SEQ. ID. N— 56 a 60. As sequências de nucleótidos resultantes que codificam as regiões Fc da imunoglobulina recombinante são representadas pelas SEQ. ID. N° 38, 40, 42, 44 e 46.

De acordo com a presente invenção, são proporcionados vetores de expressão recombinantes aos quais as sequências 15 de nucleótidos que codificam as regiões Fc da imunoglobulina recombinante são operativamente ligadas. 0 termo "vetor de expressão recombinante", conforme usado neste documento, que descreve um vetor capaz de expressar uma proteina-alvo em uma célula hospedeira adequada, refere-se a uma construção genética que compreende elementos reguladores essenciais aos quais um inserto gênico é operativamente ligado, de tal forma a ser expresso em uma célula hospedeira. 0 termo "operativamente ligado", conforme usado neste documento, refere-se a uma ligação funcional entre uma sequência de controlo de expressão de ácido nucleico e uma segunda codificação de sequência de ácido de nucleico para uma proteína-alvo, de tal forma a permitir funções gerais. A ligação operável com um vetor recombinante pode ser preparada usando uma técnica recombinante genética bem conhecida na técnica, e a clivagem e ligação do ADN em sítio específico podem ser realizadas usando enzimas conhecidas de forma geral na técnica. Um vetor de expressão adequado inclui elementos reguladores de expressão, tal como um promotor, um codão de iniciação, um codão de parada, um sinal de poliadenilação e uma sequência reforçadora. Os codões de iniciação e de parada são necessários para a funcionalidade em um indivíduo ao qual uma construção genética foi administrada, e devem estar em sintonia com a sequência de codificação. 0 promotor do vetor pode ser constitutivo ou induzivel. Além disso, os vetores de expressão incluem um marcador selecionável que permite a seleção de células hospedeiras contendo o vetor, e os vetores de expressão replicáveis incluem uma origem de replicação. Na prática da detalhada da presente invenção, os seguintes vetores de expressão recombinante são preparados: pmSCPFc, pmP-SCFc, pmCPSFc, pmCPFc, pMSCKFcl, pMCPAFcl, pMPKSFcl, pMCPPFcl, pMPPCFc, pMPCPFc, pmPPCG2Fc, pmPCPG2Fc, pmCPG2Fc, pmCCVG2Fc e pmCVE2Fc. 16

Os vetores de expressão recombinante que expressam as proteínas são transformados em células hospedeiras. A presente invenção utiliza células hospedeiras que são células procarióticas em que não ocorre a glicosilaçãoestas são preferentemente E. coli. Exemplos ilustrativos, não restritivos, de linhagens de E. coli incluem BL21 (DE3) , JM109, série DH, TOPIO e HB101. A linhagem mais preferível é a BL21 (DE3). Por carecer de um sistema para a glicosilação proteica, o E. coli pode ser usado como uma célula hospedeira em que uma região Fc da imunoglobulina é produzida na forma livre de componentes de açúcar presentes em um domínio CH2 de uma imunoglobulina nativa. Os componentes de açúcar do domínio CH2 da imunoglobulina não afetam a estabilidade estrutural das imunoglobulinas, mas fazem com que as imunoglobulinas mediem a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) ao ocorrer a associação com células expressando recetores de Fc e células imunológicas, a fim de segregar citocinas para induzir a inflamação. Além disso, os componentes de açúcar ligam-se à parte Clq do primeiro componente de complemento Cl, levando à fixação do complemento. Portanto, quando uma região Fc da imunoglobulina é produzida em uma forma aglicosilada e ligada a uma proteína terapêutica, a proteína terapêutica está presente no soro por um período de tempo prolongado sem as funções efetoras indesejáveis das imunoglobulinas. A transformação dos vetores de expressão recombinantes em células procarióticas pode ser obtida por qualquer método que permita que os ácidos nucleicos sejam introduzidos nas células, e, como conhecido na técnica, podem ser realizadas escolhendo técnicas convencionais adequadas, de acordo com as células hospedeiras. Esses métodos incluem, sem a isto se limitar: eletroporação, fusão de protoplastos, precipitação de fosfato de cálcio (CaPCM , precipitação de cloreto de cálcio (CaCl2) , 17 17 silício, e transformação e lipofectamina. invenção, os vetores introduzidos individualmente seguintes transformantes: BL21/pm PSCFc(HM11201), BL21/pmCPAF c(HM11205), BL21/pMCPAFcl(HM11209), BL21/pMCPPFcl(HM11211), BL21/pMPCPFcl (HM11213) , BL21/pmPCPG2Fc(HM11215), e BL21/pmCCVG2Fc(HM11217), agitação com fibra de carbeto de mediada por PEG, sulfato de dextrano

Na prática detalhada da presente de expressão recombinantes são em E. coli, gerando assim os BL21/ pm SCPFc(HM11200), BL21/pmCPSFc (HM11204) , BL21/pMSCDFcl(HM11207), BL21/pMPKSFcl(HM11210), BL21/pMPPCFcl(HM11212), BL21/pmPPCPG2Fc(HM11214) , BL21/pmCPG2Fc(HM11216) BL21/pmCVEG2Fc(HM11218).

Os transformantes que ancoram os vetores de expressão recombinantes neles são cultivados por meio de um método geral.

As condições da cultura podem ser ajustadas com facilidade pelos versados na técnica, de acordo com a linhagem bacteriana. Geralmente, o meio usado para a cultura deve conter todos os nutrientes essenciais para o crescimento e sobrevivência das células. 0 meio deve conter uma variedade de fontes de carbono, fontes de nitrogénio e microelementos. Exemplos de fontes de carbono disponíveis incluem glicose, sucrose, lactose, frutose, maltose, amido, hidratos de carbono como celulose, gorduras como óleo de soja, óleo de girassol, óleo de rícino e óleo de coco, ácidos graxos como ácido palmítico, ácido esteárico e ácido linoléico, álcoois como glicerol e etanol, e ácidos orgânicos como ácido acético. Essas fontes de carbono podem ser usadas separadamente ou em combinações de duas ou mais. Exemplos de fontes de nitrogénio disponíveis incluem fontes de nitrogénio orgânico, como peptona, extrato de levedura, extrato de carne, extrato de malte, água de maceração de milho (CSL) e soro de soja, e fontes de nitrogénio inorgânico como ureia, sulfato de amónio, cloreto de 18 amónio, fosfato de amónio, carbonato de amónio e nitrato de amónio. Essas fontes de nitrogénio podem ser usadas separadamente ou em combinações de duas ou mais. Uma fonte fosforosa pode ser incluída no meio, e inclui fosfato diidrogênio de potássio, fosfato hidrogénio de dipotássio, e sais contendo sódio correspondentes. Além disso, o meio pode conter um sal metálico, como sulfato de magnésio ou sulfato de ferro. 0 meio também pode incluir aminoácidos, vitaminas e precursores adequados. 0 pH da cultura pode ser ajustado pela adição de um composto à cultura, tal como hidróxido de amónio, hidróxido de potássio, amónia, ácido fosfórico e ácido sulfúrico, usando um método adequado. Além disso, durante a cultura, agentes antiespumantes, como ésteres de ácido graxo de poliglicol, podem ser usados para impedir a formação de bolhas. Para manter a cultura no estado desejado, introduz-se oxigénio ou gás contendo oxigénio (por exemplo, ar) na cultura. A temperatura da cultura varia geralmente de 20 °C a 45 °C, de preferência 25 °C a 45 °C. Além disso, um fermentador pode ser usado para produção de proteína em grande escala. A produção de proteínas usando um fermentador deve ser realizada levando em consideração vários fatores, inclusive a velocidade de crescimento das células hospedeiras e os níveis de expressão de proteínas. A expressão de proteína pode ser induzida pela adição, por exemplo, de IPTG ao meio sob condições adequadas de cultura.

Uma região Fc da imunoglobulina, superexpressa como corpos de inclusão, pode ser purificada por meio de uma técnica geral. As regiões Fc da imunoglobulina produzidas nos transformantes podem ser obtidas rompendo as células usando uma prensa francesa, um ultrasonicador, etc., coletando apenas os corpos de inclusão insolúveis em água contendo a região Fc da imunoglobulina por meio de centrifugação, solubilização e desnaturação da fração colhida com agentes de reenovelamento, tal como ureia, 19 guanidina, arginina, cisteína, beta-mercaptoetanol, etc. para seu reenovelamento, e purificando a proteina de fusão renovelada por meio de diálise, várias cromatografias, como cromatografia por filtração em gel, troca iónica e em coluna de fase inversa, e ultrafiltração, separadamente ou em combinação. Geralmente, esse processo de reenovelamento é muito complicado e é conhecido por produzir um rendimento de reenovelamento baixíssimo e assegura a proteina reenovelada apenas de atividade inferior à da proteina solúvel em água.

Entretanto, o método da presente invenção pode superar os problemas mencionados acima e produzir uma região Fc da imunoglobulina ativa livre do resíduo de metionina inicial em grande escala. De modo geral, quando expressa e produzida em E. coli, uma proteína exógena tem um resíduo de metionina inicial codificado pelo codão de iniciação. A administração repetitiva ou excessiva do produto proteico contendo a metionina inicial a corpos humanos pode causar uma resposta imunológica suficiente para reduzir seu efeito terapêutico ou torná-lo tóxico. Entretanto, quando a região Fc da imunoglobulina recombinante produzida pela presente invenção é expressa em E. coli, verifica-se que o resíduo de metionina inicial é clivado pela aminopeptidase, uma enzima citoplásmica intrínseca, conforme medido pela análise de sequenciamento N-terminal (Adams et al., J. Mol. Biol. 33:571- 589, 1968, Takeda, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 60:1487-1494, 1968). A atividade de tais aminopeptidases é conhecida por depender da sequência e da estrutura da proteína dê interesse (Moerschell et al., J. Biol. Chem. 265:19638-19643, 1990, James et al., Protein Expression and Purification 41:45-52, 2005). Uma região de dobradiça, quando fusionada a uma região Fc da imunoglobulina, é afetada pela aminopeptidase, de modo que a metionina inicial seja processada a um grau que depende de sua sequência de aminoácidos. 20

Devido ao fato de as propriedades da região de dobradiça determinarem a modificação pós-translacional das proteases, a razão de dimeros para monômeros pode ser controlada de maneira eficaz selecionando regiões de dobradiça apropriadas. Além disso, quando os corpos de inclusão de reenovelados, a formação de dimeros precisos é impedida pelo descompasso das cisteinas nas ligações de bissulfureto. Entretanto, o método de acordo com a presente invenção garante a formação de ligações precisas de bissulfureto, desse modo levando à formação de dimeros ativos.

Além disso, a presente invenção pode produzir regiões Fc da imunoglobulina em uma escala maior do que os métodos convencionais. Por exemplo, uma região Fc da imunoglobulina é produzida, a um rendimento de 15 mg/L de acordo com o método da Patente Européia N-EP0227110, em que uma região Fc G1 é superexpressa e purificada apenas a partir de um lisado celular contendo sua forma solúvel em água, e a um rendimento de 50 a 600 mg/L de acordo com o método do Pedido de Patente Coreano N- 0092783, em que uma região Fc da imunoglobulina fusionada a uma sequência de sinais de E. coli é expressa em uma forma solúvel em água, mas não como um corpo de inclusão. Entretanto, a presente invenção pode produzir uma região Fc da imunoglobulina a um rendimento que chega a 3 a 6 g/L pela purificação de um corpo de inclusão de uma região Fc da imunoglobulina recombinante contendo uma região de dobradiça. Assim, o método da presente invenção assegura um sistema extremamente útil para produzir regiões Fc da imunoglobulina em escala industrial a um rendimento muito superior do que os métodos convencionais. A região Fc da imunoglobulina produzida em células procarióticas, como E. coli, de acordo com o presente método, não possui aplicações industriais especificamente limitadas. Um exemplo de aplicação é o uso como um veiculo 21 para a formação de um conjugado com um certo fármaco. A construção do conjugado gue compreende a região Fc da imunoglobulina para um fármaco não se limita a uma forma especifica. Por exemplo, a região Fc da imunoglobulina e o fármaco podem ser ligados um ao outro a variadas razões, e a ligação pode ser mediada, por exemplo, por meio de um ligante. 0 fármaco inclui polipéptidos, compostos, extratos e ácidos nucleicos. É preferível um fármaco de polipéptido (usado com um significado idêntico ao da palavra "proteína"). Exemplos do ligante úteis na presente invenção incluem ligantes não peptídicos, com preferência por um ligante não peptídico, e ainda mais preferência por um polímero não peptídico. Um exemplo preferido da cadeia pesada da imunoglobulina é o Fc.

Se a semivida em soro precisar ser aperfeiçoada, qualquer polipéptido fisiologicamente ativo pode ser usado, sem limitação específica, como uma proteína parceira da região Fc da imunoglobulina preparada de acordo com o presente método para formar um conjugado. Tais polipéptidos fisiologicamente ativos incluem os usados para o tratamento ou prevenção de doenças humanas, que incluem citocinas, interleucinas, proteínas de ligação à interleucina, enzimas, anticorpos, fatores de crescimento, fatores reguladores de transcrição, fatores de coagulação, vacinas, proteínas estruturais, proteínas ou recetores de ligantes, antígenos de superfície celular, antagonistas de recetores, e seus derivados e análogos.

Em detalhes, exemplos não restritivos do polipéptido fisiologicamente ativo incluem a hormona do crescimento humano, o hormônio de liberação do hormônio de crescimento, o péptido de liberação do hormônio de crescimento, interferons e recetores de interferon (por exemplo, interferon-α, - β e -γ, recetor de interferon tipo I solúvel em água, etc.), fatores estimulantes de colónias 22 (por exemplo, interleucina-1, -2, -3, -4, - 5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -14, -15, -16, -17, -18, -19, -20, -21, -22, -23, -24, -25, -26, -27, -28, -29, -30, etc.) e recetores de interleucina (por exemplo, recetor de IL-1, recetor de IL-4, etc.), enzimas (por exemplo, glicocerebrosidase, iduronato-2- sulfatase, alfa-galactosidade-A, agalsidade alfa e beta, alga-L-iduronidase, butirilcolinesterase, guitinase, glutamato decarboxilose, imiglucerase, lipase, uricase, fator ativador de plaguetas, acetilidrolase, endopeptidase neutra, mieloperoxidase, etc.), proteínas de ligação à interleucina e coticina (por exemplo, IL-18bp, proteína de ligação ao TNF, etc.), fator ativador de macrófagos, péptido de macrófago, fator de células B, fator de células T, proteína A, inibidor alergênico, glicoproteínas de necrose celular, imunotoxina, linfotoxina, fator de necrose tumoral, supressores tumorais, fator de crescimento da metástase, antitripsina alfa-1, albumina, alfa-lactalbulmina, apolipoproteína- E, eritropoietina, eritropoietina altamente glicosilada, angiopoietinas, hemoglobina, trombina, péptido ativador do recetor de trombina, trombomodulina, fator VII, fator Vila, fator VIII, fator IX e fator XIII, fator ativador de plasminogênio, péptido de ligação à fibrina, urocinase, estreptoquinase, hirudina, proteína C, proteína reativa C, inibidor de renina, inibidor de colagenase, superóxido dismutase, leptina, fator de crescimento derivado de plaquetas, fator de crescimento epitelial, fator de crescimento epidérmico, angioestatina, angiotensina, fator de crescimento ósseo, proteína estimuladora óssea, calcitonina, insulina, atriopeptina, fator de indução de cartilagem, elcatonina, fator ativador do tecido conjuntivo, inibidor da via do fator tecidual, hormônio estimulante folicular, hormona, luteinizante, hormona de liberação do hormona luteinizante, fatores de crescimento 23 nervoso (por exemplo, fator de crescimento nervoso, fator neurotrófico ciliar, fator de axogênese-1, péptido natriurético cerebral, fator neurotrófico, neuturina, etc.), hormona paratireóide, relaxina, secretina, somatomedina, fator de crescimento semelhante à insulina, hormona adrenocortical, glucagon, colecistoquinina, polipéptido pancreático, péptido de libertação de gastrina, fator de libertação de corticotropina, hormona estimuladora da tireoide, autotaxina, lactoferrina, recetores de mioestatina (por exemplo, TNFR(P75), TNFR(P55), recetor de IL-1, recetor de VEGF, recetor do fator de ativação de células B, etc), antagonistas de recetores (por exemplo, ILl-Ra, etc.), antigenos de superfície celular (por exemplo, (e.g., CD 2, 3, 4, 5, 7, lia, 11b, 18, 19, 20, 23, 25, 33, 38, 40, 45, 69, etc.), anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, fragmentos de anticorpos, por exemplo, (e.g., scFv, Fab, Fab', F(ab')2 e Fd) , e antigenos de vacina derivados de vírus. O polipéptido fisiologicamente ativo útil na presente invenção pode ser uma forma nativa, pode ser produzido por recombinação genética usando células procarióticas, tal como E. coli, ou células eucarióticas, como células de levedura, células de inseto e células animais, ou pode ser um derivado contendo uma ou mais mutações de aminoácidos, mas apresentando atividade biológica idêntica à da forma nativa.

Em uma forma de realização preferida da presente invenção, um fragmento da região Fc da imunoglobulina produzida usando o transformante HM 11201 foi ligado à eritropoietina humana (EPO) usando polietileno glicol, formando assim um conjugado de proteína da região Fc da imunoglobulina - EPO-PEG. Verificou-se que esse conjugado de proteína apresenta semivida em soro prolongada quando comparado não apenas ao EPO nativo, mas também ao Aranesp (Amgen), conhecido como um EPO de segunda geração com semivida em soro aperfeiçoada. Assim, a região Fc da 24 imunoglobulina livre do resíduo de metionina inicial, obtido a partir de corpos de inclusão usando uma região de dobradiça de acordo com a presente invenção, pode ser usada para aperfeiçoar a semivida em soro e a atividade fisiológica do polipéptido fisiologicamente ativo ligado a ela, sem nenhum risco de indução de resposta imunológica.

Será possível entender melhor a presente invenção por meio dos exemplos a seguir, apresentados apenas para ilustrar a presente invenção, sem ter a intenção de limitá-la . EXEMPLO 1: Construção do Vetor de Expressão da Região Fc da Imunoglobulina Humana IgG4, Expressão e Purificação da Região Fc da IgG4 e Análise da Sequência N-Terminal <1—1> Construção do vetor de expressão da região Fc da IgG4

Para clonar uma região Fc de cadeia pesada incluindo a região de dobradiça da imunoglobulina humana IgG4, A RT-PCR foi realizado com o ARN de células sanguíneas humanas servindo como modelo, como segue. Em primeiro lugar, o ARN foi isolado de cerca de 6 ml de sangue usando um kit de sangue de ARN Quiamp (Quiagen), efetuando-se a amplificação gênica usando o ARN total como modelo com o auxílio de um kit One-Step RT-PCR (Qiagen). Para amplificar genes contendo sequências N-terminais diferentes, foram usados pares de oligonucleótidos iniciadores representados pelas SEQ. ID. N° 1 e 2, 3 e 2, 4 e 2, e 5 e 2. Para facilitar o procedimento de clonagem gênica subsequente, um sítio de reconhecimento Nde 1 e o codão de iniciação ATG, necessários para a expressão de proteína, foram introduzidos em iniciadores 5' de SEQ. ID. N° 1, 3, 4 e 5, e um sítio de reconhecimento BamHI contendo um codão de parada nos iniciadores 3' de SEQ. ID. N° 2. Os produtos da região Fc amplificada foram digeridos com Nde I e Hind III, e inseridos em um pET22b (Novagen) tratado com a mesma enzima de restrição, obtendo assim os respetivos plasmídeos recombinantes. Esses plasmídeos foram projetados para terem 25 partes da sequência total de aminoácidos Glu-Ser-Lis-Tir-Gli-Pro-Pro-Cis-Pro-Ser-Cis-Pro [SEQ ID NO: 17] da região de dobradiça da IgG4, como segue. 0 plasmideo que continha um gene amplificado com as SEQ. ID. N- 1 e 2 foi chamado de pmSCPFc e foi ancorada a ele uma sequência ADN que codifica para uma sequência de aminoácidos N-terminal iniciando com Met-Ser-Cis- Pro (Met-[SEQ ID NO: 18]), que foi determinada, pelo sequenciamento de bases, como tendo o SEQ. ID. N° 6, que corresponde á sequência de aminoácidos do SEQ. ID. N° 7. 0 plasmideo que continha um gene amplificado com as SEQ. ID. N- 3 e 2 foi chamado de pmPSCFc e foi ancorada a ele uma sequência de ADN que codifica para uma sequência de aminoácidos N-terminal iniciando com Met-Pro-Ser-Cis-Pro (Met-[SEQ ID NO: 19] ), que foi determinada, pelo sequenciamento de bases, como tendo o SEQ. ID. N° 8, que corresponde à sequência de aminoácidos do SEQ. ID. N° 9. Um plasmideo que continha um gene amplificado com as SEQ. ID. N- 4 e 2 foi chamado de pmCPSFc e foi ancorada a ele uma sequência de ADN que codifica para uma sequência de aminoácidos N-terminal iniciando com Met-Cis-Pro-Ser-Cis-Pro (Met-[SEQ ID NO: 20] ), que foi determinada, pelo sequenciamento de bases, como tendo o SEQ. ID. N° 10, que corresponde à sequência de aminoácidos do SEQ. ID. N° 11. Um plasmideo que continha um gene amplificado com as SEQ. ID. N— 5 e 2 foi chamado de pmCPFc e foi ancorada a ele uma sequência de ADN que codifica para uma sequência de aminoácidos N-terminal iniciando com Met-Cis-Pro (Met-[SEQ ID NO: 21]), que foi determinada, pelo sequenciamento de bases, como tendo o SEQ. ID. N- 12 correspondendo à sequência de aminoácidos do SEQ. ID. N° 13.

Os vetores de expressão foram transformados em E. coli BL21 (DE3) para preparar transformantes, respetivamente designados por BL21/pmSCPFc(HM1 1200), BL21/pmPSCFc(HM1 1201), BL21/pmCPSFc(HM1 1204) e BL21/pmCPFc(HM1 1205). Os 26 transformantes BL21/pmSCPFc(HM1 1200) e BL21/pmPSCFc(HM1 1201) foram depositados no Centro Coreano de Cultura de Microorganismos (KCCM) no dia 20 de junho de 2005, com os N- de Acesso KCCM-10659P e KCCM- 10660P, respetivamente, e os transformantes BL21/pmCPSFc(HM1 1204) e BL21/pmCPFc(HM1 1205) no KCCM no dia 28 de julho de 2005 com os N° de Acesso KCCM- 10665P e KCCM-10666P, respetivamente. <l-2> Expressão e Purificação da Fc da IgG4

Como no caso da IgG4, os transformantes bacterianos preparados no Exemplo <1-1> foram inoculados nos respetivos fermentadores (Marubishi Company) e deixados crescer, seguido pela determinação quanto a se eles expressaram fragmentos da região Fc da imunoglobulina.

Em primeiro lugar, cada transformante foi cultivado em 100 ml do meio LB com agitação noturna, e inoculado em um fermentador para cultura em grande escala. O fermentador foi mantido a 28 °C ou 35 °C. Para impedir a conversão de um ambiente aeróbico para anaeróbico, as culturas foram aeradas com 20-vvm de ar e agitadas a 500 rpm. Para compensar os nutrientes insuficientes para o crescimento bacteriano durante a fermentação, as culturas foram suplementadas com glicose e extratos de levedura, de acordo com os estados de fermentação das bactérias. Quando as culturas atingiram um valor ODõoO de 80, um indutor, IPTG, foi adicionado às culturas para induzir a expressão de proteína. As culturas foram adicionalmente cultivadas durante 40 a 45 horas para aumentar o valor OD a 600 nm a 100 a 120. A expressão da Fc da imunoglobulina, a formação de corpos de inclusão e a formação de dímeros da Fc da Ig expressa nos transformantes de E. coli foram examinadas como segue. Para investigar a expressão intracelular geral das regiões Fc da imunoglobulina, partes das soluções fermentadas foram misturadas com volumes iguais de tampão de amostra proteica 2x e submetidas à eletroforese em um 27 gel SDS-PAGE a 15 % (Criterion Gel, Bio-Rad) . Como resultado, observou-se a superexpressão da Fc da imunoglobulina em todos os transformantes produzidos. Em seguida, as células foram rompidas usando um ultrasonicador (Misonix Company). 0 lisado celular assim obtido foi centrifugado para separar as substâncias solúveis em água das substâncias insolúveis em água. Verificou-se que a maioria das substâncias superexpressas existia como corpos de inclusão, conforme medido por eletroforese em SDS-PAGE a 15 %. Os corpos de inclusão foram submetidos ao seguinte processo de enovelamento com o objetivo de examinar a qual grau a Fc foi reenovelada e se, e a qual grau, as regiões Fc diméricas foram formadas. 10 g da solução fermentada foram submetidos à ultrasonicação em 100 mL de um tampão de lise (10 mM de Tris, PH 9,0, 1 mM de EDTA, 0,5 % deTriton X—100, 0,2 M de NaCl) para romper as células. A centrifugação a 10.000 rpm durante 20 minutos dividiu o lisado celular em uma fração solúvel em água e uma fração insolúvel em água como um corpo de inclusão. 2 g desse corpo de inclusão foram dissolvidos em uma mistura de 20 mL de 1 M de Tris (PH 9,0) e 20 mL de um tampão de solubilização (6 M de Guanidina, 50 mM de Tris) e deixados reagir enquanto foram moderadamente agitados a 4 °C durante 30 minutos. Seguindo o término da reação, a solução de corpos de inclusão foi misturada durante a noite, com 10 volumes de um tampão de reenovelamento (2 M ureia, 50 μΜ de Tris, 0,25 M de Arginina, 3 mM de cisteína, pH 9,0) com agitação moderada. A essa mistura, foi adicionado um tampão de amostra de proteínas livre de qualquer agente redutor, tal como DTT ou beta-mercaptoetanol, seguido pela eletroforese em SDS-PAGE a 15 % (Criterion Gel, Bio-Rad). As bandas de proteínas foram visualizadas com um corante, tal como Coomassie Briliant. A FIG. 1 é uma fotografia obtida de um gel no qual as proteínas reenoveladas a partir dos corpos de inclusão expressos pelo reformante HM11201 a 28 32 °C (pista 1) e a 28 °C (pista 2), por HM11200 a 28 °C (pista 3) e a 32 °C (pista 4), por HM11204 a 28 °C (pista 5) e a 32 °C (pista 6), e por HM11205 a 32 °C (pista 7) e a 28 °C (pista 8) foram corridas na presença de um campo elétrico, junto com uma proteína Fc, como controlo, purificado de E. coli de acordo com um método convencional (pista C) . Como visto na Fig. 1, uma parte significativa das proteínas totais é atribuída à proteína Fc, da qual grande parte existe em forma dimérica após ser reenovelada. Entretanto, as proteínas Fc diferem na razão de dímeros para monômeros de um transformante para outro, isto é, de acordo com a sequência de aminoácidos N-terminal expressa pelo transformante. Por exemplo, uma parte significativa das proteínas Fc de HM11201, que inicia com Met-Pro-Ser-Cis-Pro-CH2-CH3 (Met-[SEQ ID NO:191), existe na forma dimérica. Quase todas as proteínas Fc de HM11205, que iniciam com Met-Cis-Pro-CH2-CH3 (Met-[SEQ ID N0:21]), existem como monômeros, mas não existem em formas diméricas. Acredita-se que isso se deva ao fato de que a especificidade de processamento da aminopeptidasse nas células hospedeiras de E. coli varia dependendo da sequência N-terminal da Fc. <l-3> Análise da sequência N-terminal

Os fragmentos diméricos da região Fc reenovelados dos corpos de inclusão são diferentes na sequência de aminoácidos do tipo selvagem em razão da presença do resíduo de metionina inicial. Com o intuito de determinar se o resíduo de metionina é processado pelas proteases de E. coli, as sequências de aminoácidos N-terminais das proteínas foram analisadas pelo Basic Science Research Institute, Seoul, Coreia. As amostras usadas na análise de sequência de aminoácidos N- terminal foram preparadas como se segue.

Em primeiro lugar, uma membrana PVDF (Bio- Rad) foi imersa em metanol durante cerca de 2 a 3 segundos para 29 ativá-la, e foi umedecida suficientemente com um tampão de bloqueio (170 mM glicina, 25 mM Tris-HCl (pH 8.0), 20 SDS-page não reduzido, preparado no Exemplo <l-2>, f % metanol). As amostras de proteínas separadas em um geloram submetidas ao "blotting" em uma membrana PVDF durante cerca de uma hora usando um kit de blotting (Hoefer Semi-Dry Transfer unit, Amersham). As proteínas transferidas para a membrana PVDF foram coradas com um corante proteico, Coomassie Blue R-250 (Amnesco), durante um momento (3-4 segundos) e lavadas com uma solução descolorante (água: ácido acético: metanol = 5:1:4). Em seguida, os fragmentos de membrana contendo proteínas foram cortados com tesouras e submetidos à análise de sequência N-terminal.

Como resultado, verificou-se que as proteínas da Fc da IgG4, incluindo uma região de dobradiça, possuem uma sequência N-terminal de Glu-Ser-Lis-Tir-Gli-Pro-Pro-Cis Pro- Ser-Cis-Pro-CH2-CH3. As sequências de aminoácidos e as sequências N-terminais das proteínas expressas nos transformantes são apresentadas no Quadro 1 a seguir.

Quadro 1

Transformantes Sequências N-terminais Met-[SEQ ID NO:]-CH2- Resultados de análise de sequência Dímero Monómero HM11200 Met-Ser-Cys-Pro-CH2- [18] Ser-Cys- Pro-CH2 Pro-CH2 HM11201 Met-Pro-Ser-Cys-Pro-CH2-[19] Pro-Ser- Cys-Pro- CH2 Pro-Ser- Cys-Pro- CH2 HM11204 Met-Cys-Pro-Ser-Cys-Pro-CH2 [20] Pro-Ser- Cys-Pro- CH2 misturados HM11205 Met-Cys-Pro-CH2-CH3 [21] — Pro-CH2

Os dados da análise de sequenciamento de aminoácidos revelaram que os fragmentos Fc reenovelados dos corpos de inclusão produzidos pelos transformantes de E. coli 30 utilizados na presente invenção foram processados para terem uma sequência N-terminal precisa, livre do resíduo de metionina inicial. O produto proteico que resta em uma forma monomérica, mesmo após o reenovelamento, é destituído de resíduos de cisteína, e, portanto, não pode formar dímeros. Além disso, como se vê na FIG. 1, a parte do monômero nos fragmentos Fc reenovelados difere de um transformante para outro, e não existe nenhum dímero em HM 11205. Esses resultados indicam que a sequência de aminoácidos do sítio N-terminal tem grande influência sobre o processamento do terminal N, fazendo com que uma proteína contendo uma sequência N-terminal desejada possa ser obtida pela modulação da sequência N-terminal. As proteínas, mesmo se tiverem a mesma sequência de aminoácidos, podem ser processadas de maneira diferente, dependendo das condições da cultura das células hospedeiras de E. coli, especialmente a temperatura de cultura, conforme revelado nos testes a seguir. Ο HM11200, quando cultivado a baixas temperaturas (28 °C a 32 °C), expressou a proteína de fusão Fc em uma forma solubilizada na mesma quantidade que a forma do corpo de inclusão. A forma solubilizada da proteína de fusão Fx existia como um monômero livre da sequência de aminoácidos N-terminal Met-Ser-Cis. Assim, os presentes inventores reconheceram que uma proporção controlada dos fragmentos Fc imunoglobulina monomérica e dimérica podem ser obtidos modulando a sequência de aminoácidos N-terminal da proteína de fusão Fc e a condição de cultura das células hospedeiras.

Para determinar quantitativamente a expressão das regiões Fc da imunoglobulina nos transformantes de E. coli, as regiões Fc da imunoglobulina da solução de reenovelamento foram purificadas usando uma coluna de afinidade com proteína A conhecida por ter forte afinidade com imunoglobulinas, como segue.

Os corpos de inclusão colhidos por centrifugação foram 31 reenovelados, e então purificados por cromatografia em coluna. Após 5 ml de uma coluna de afinidade com proteína A (Pharmacia) terem sido equilibrados com PBS, os lisados celulares foram carregados para a coluna a uma taxa de fluxo de 5 ml/min. As proteínas não ligadas foram removidas por enxágue com PBS, e as proteínas ligadas foram eluídas com 100 mM de citrato (pH 3,0). As frações colhidas foram dessalinizadas usando uma coluna de dessalinização HiPrep 26/10 (Pharmacia) com 10 mM de tampão Tris (pH 8,0). Em seguida, foi realizada cromatografia em coluna por troca de aniões secundária usando 50 ml de uma coluna Q HP 26/10 (Pharmacia). As regiões Fc primárias da imunoglobulina purificada recombinante foram carregadas na coluna Q-Sepharose HP 26/10 (pharmacia), e a coluna foi eluída com um gradiente linear (0 a 0,2 M NaCl) em 19 mM de tampão Tris (Ph 8,0), obtendo assim frações altamente puras. Após serem parcialmente purificadas usando a coluna de afinidade com proteína A, os níveis de expressão das regiões Fc da Ig recombinante foram determinados, sendo os resultados apresentados no Quadro 2 a seguir.

Quadro 2

Plasmídeos Transformantes Rendimentos de Expressão Após Purificação de Proteína A pmSCPFc HM11200 5-6 g/L pmPSCFc HM11201 4-5 g/L pmCPSFc HM11204 4-5 g/L pmCPFc HM11205 3-4 g/L EXEMPLO 2: Construção do Vetor de Expressão da Região Fc da Imunoglobulina Humana IgGl, Expressão e Purificação da Região Fc da IgGl e Análise da Sequência N-Terminal <2-l> Construção do vetor de expressão da região Fc da IgGl Para clonar uma região Fc de cadeia pesada incluindo a região de dobradiça da imunoglobulina humana IgGl, a RT-PCR foi realizada da mesma forma que no Exemplo <1-1>. Para 32 amplificar genes contendo diferentes de sequências N-terminais, foram usados os seguintes oligonucleótidos iniciadores. QUADRO 3

Sequência de Oligonucleótidos Iniciadores 5' Utilizados Sequência de Oligonucleótidos Iniciadores 5' MEPK 5'GGA ATT CCA TAT GGA GCC CAA ATC TTG TGA CAA AAC TCA C 3' [61] MSCD 5'GGA ATT CCA TAT GTC TTG TGA CAA AAC TCA CAC ATG CCC 3' [62] MDKT 5'GGA ATT CCA TAT GGA CAA AAC TCA CAC ATG CCC ACC GTG 3 3' [63] MCPA 5’GGG AAT TCC ATA TGT GCC CAG CAC CTG AAC TCC TGG GG [64] MPKS 5’GGG AAT TCC ATA TGC CCA AAT CTT GTG ACA AAA CTC AC [65] MCPP 5'GGG AAT TCC ATA TGT GCC CAC CGT GCC CAG CAC CTG AAC TCC [66] MPPC 5'GGA ATT CCA TAT GCC ACC GTG CCC AGC ACC TGA ACT CCT G 3* [67] MPCP 5'GGA ATT CCA TAT GCC GTG CCC AGC ACC TGA ACT CCT GGG G 3' [68]

Quanto ao oligonucleótido iniciador 3', ele tinha a sequência de 5'-CGC GGA TCC TCA TTT ACC CGG AGA CAG GGA GAG GCT CTT C-3' [SEQ ID NO: 69] e foi usado para a amplificação de todos os genes contendo sequências N-terminais diferentes. Para facilitar um procedimento de clonagem gênica subsequente, um sitio de reconhecimento Nde I foi introduzido em cada um dos oligonucleótidos iniciadores 5', e um sitio de reconhecimento BamHI foi introduzido no oligonucleótido iniciador 3'. Os produtos da região Fc amplificados com pares dos oligonucleótidos iniciadores foram inseridos em um vetor, obtendo assim 33 respetivos plasmídeos recombinantes projetados para conterem partes da sequência total de aminoácidos Glu-Pro-Lys-Ser-Cys-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro [SEQ ID NO: 14] da região de dobradiça da IgGl, como segue. 0 plasmideo que continha um gene amplificado com o oligonucleótido iniciador MEPK foi chamado de pMEPKFcl, e foi ancorada a ele uma sequência de ADN que codifica para o CH2 e CH3 da IgGl, iniciando com Met-Glu-Pro-Lys (Met-[SEQ ID NO: 48]), que foi analisada, pelo sequenciamento de bases, como tendo o SEQ. ID. N° 22 correspondendo à sequência de aminoácidos do SEQ. ID. N° 23. 0 plasmideo que continha um gene amplificado com o oligonucleótido iniciador MSCD foi chamado de pMSCKFcl, e foi ancorada a ele uma sequência de ADN que codifica para o CH2 e CH3 da IgGl, iniciando com Met-Ser-Cys-Asp (Met-[SEQ ID NO: 49]), que foi analisada, pelo sequenciamento de bases, como tendo o SEQ. ID. N2 24 correspondendo à sequência de aminoácidos do SEQ. ID. N° 25. Um plasmideo que continha um gene amplificado com o oligonucleótido iniciador MDKT foi chamado de pMDKTFcl, e foi ancorada a ele uma sequência de ADN que codifica para o CH2 e CH3 da IgGl, iniciando com Met-Asp-Lys-Thr (Met-[SEQ ID NO: 50]), que foi analisada, pelo sequenciamento de bases, como tendo o SEQ. ID. Ne 26 correspondendo à sequência de aminoácidos do SEQ. ID. NQ 27. Um plasmideo que continha um gene amplificado com o oligonucleótido iniciador MCPA foi chamado de pMCPAFcl, e foi ancorada a ele uma sequência de ADN que codifica para o CH2 e CH3 da IgGl, iniciando com Met-Cys-Pro (Met-[SEQ ID NO: 51]), que foi analisada, pelo sequenciamento de bases, como tendo o SEQ. ID. N° 28 correspondendo à sequência de aminoácidos do SEQ. ID. N° 29. Um plasmideo que continha um gene amplificado com o oligonucleótido iniciador MPKS foi chamado de pMPKSFcl, e foi ancorada a ele uma sequência de ADN que codifica para o CH2 e CH3 da IgGl, iniciando com Met-Pro-Lys-Ser (Met-[SEQ ID NO:52]), que foi analisada, 34 pelo sequenciamento de bases, como tendo o SEQ. ID. N° 30 correspondendo à sequência de aminoácidos do SEQ. ID. N° 31. Um plasmídeo que continha um gene amplificado com o oligonucleótido iniciador MCPP foi chamado de pMCPPFcl, e foi ancorada a ele uma sequência de ADN que codifica para o CH2 e CH3 da IgGl, iniciando com Met-Cys-Pro-Pro (Met-[SEQ ID NO: 53]), que foi analisada, pelo sequenciamento de bases, como tendo o SEQ. ID. N° 32 correspondendo à sequência de aminoácidos do SEQ. ID. N° 33. Um plasmídeo que continha um gene amplificado com o oligonucleótido iniciador MPPC foi chamado de pMPPCFc, e foi ancorada a ele uma sequência de ADN que codifica para o CH2 e CH3 da IgGl, iniciando com Met-Pro-Pro-Cys (Met-[SEQ ID NO: 54]), que foi analisada, pelo sequenciamento de bases, como tendo o SEQ. ID. N° 34 correspondendo à sequência de aminoácidos do SEQ. ID. N° 35. Um plasmídeo que continha um gene amplificado com o oligonucleótido iniciador MPCP foi chamado de pMPCPFc, e foi ancorada a ele uma sequência de ADN que codifica para o CH2 e CH3 da IgGl, iniciando com Met-Pro-Cys-Pro (Met-[SEQ ID NO: 55]), que foi analisada, pelo sequenciamento de bases, como tendo o SEQ. ID. N° 36 correspondendo à sequência de aminoácidos do SEQ. ID. N° 37. Os vetores de expressão foram transformados em E. coli BL21 (DE3) para preparar transformantes, respetivamente designados como BL21/pMEPKFcl(HM11206) , BL21/pMSCDFcl(HM11207), BL21/pMDKTFcl(HM11208), BL21/pMCPAF c1 (HM11209) BL21/pMPKSFcl(HM11210) , BL21/pMCPPFcl(HM11211) , BL21/pMPPCFcl(HM11212) e BL21/pMPCPFcl(HM11213). <2-2> Expressão e purificação da Fc da IgGl

Como no caso da IgG4, os transformantes bacterianos preparados no Exemplo <2-l> foram inoculados nos respetivos fermentadores (Marubishi Company) e deixados crescer, seguido pela determinação quanto a se eles expressaram fragmentos da região Fc da imunoglobulina. 35

Em primeiro lugar, cada transformante foi cultivado em 100 ml do meio LB com agitação noturna, e inoculado no fermentador para cultura em grande escala. O fermentador foi mantido a 28oC ou 35oC. Para impedir a conversão de uni ambiente aeróbico para anaeróbico, as culturas foram aeradas com 20-vvm de ar e agitadas a 500 rpm. Para compensar os nutrientes insuficientes para o crescimento bacteriano durante a fermentação, as culturas foram suplementadas com glicose e extratos de levedura, de acordo com os estados de fermentação das bactérias. Quando as culturas atingiram um valor 0D600 de 80, um indutor, IPTG, foi adicionado às culturas para induzir a expressão de proteína. As culturas foram adicionalmente cultivadas durante 40 a 45 horas para aumentar o valor OD a 600 nm a 100 a 120. A expressão da Fc da imunoglobulina, a formação de corpos de inclusão e a formação de dimeros da Fc Ig expressa nos transformantes de E. coli foram examinadas como segue. Para investigar a expressão intracelular geral das regiões Fc da imunoglobulina, as soluções fermentadas foram divididas em alíquotas antes e após a indução.

Partes das soluções fermentadas foram misturadas com volumes iguais de tampão de amostra de proteínas 2x e submetidas à eletroforese em um gel SDS-PAGE a 15 % (Criterion Gel, Bio-Rad) sob as seguintes condições de redução. Os resultados da eletroforese são apresentados na FIG. 7. Um controlo da Fc da IgG4 foi corrido na pista 1, ao passo que os níveis de expressão do transformante HM11208 de acordo com o tempo são apresentados nas pistas 2 a 4 e os níveis de expressão do transformante HM 11206 de acordo com o tempo são apresentados nas pistas 5 a 7. Os níveis de expressão nos transformantes HM11207, HM11212, HM11209, HM11210, F1M11213 e HM11211 são apresentados nas pistas 8 a 13, respetivamente. Como visto na FIG. 7, uma banda única de 30 kDa (região Fc) , que não foi observada 36 antes da indução com IPTG, apareceu muito claramente em todas as amostras submetidas à indução com IPTG, indicando que as regiões Fc da IgGl recombinante foram expressas, em contraste ao controlo G4Fc. Além disso, as regiões Fc foram superexpressas, totalizando até pelo menos 30 % da quantidade total de proteínas expressas.

Para determinar quantitativamente a expressão das regiões Fc da imunoglobulina nos transformantes de E. coli, as regiões Fc da imunoglobulina da solução de reenovelamento foram purificadas usando uma coluna de afinidade com proteína A conhecida por ter forte afinidade com imunoglobulinas, da mesma forma que a utilizada para a Fc da IgG4.

Dos transformantes, o transformante de plasmídeo pMSCDFc foi medido como o que tinha a maior taxa de expressão, equivalente a tanto quanto 340 mg por 10 g de corpo de inclusão, ao passo que os transformantes pMDKTFc, pMEPKFc, pMPPCFc e pMPCPFc apresentaram taxas de expressão de 133,3 mg, 139 mg, 110 mg e 120 mg, respetivamente. 0 conteúdo da Fc dimérica da IgGl nos produtos expressos foi medido da mesma forma que a utilizada para o conteúdo da Fc dimérica da IgF4. As células das soluções de fermentação foram rompidas usando um ultrasonicador (Misonix Company). O lisado celular assim obtido foi centrifugado para separar as substâncias solúveis em água das substâncias insolúveis em água. Verificou-se que a maioria das substâncias superexpressas existia como corpos de inclusão, conforme medido por eletroforese em SDS-PAGE a 15 %. Os corpos de inclusão foram reenovelados com o objetivo de examinar a qual grau a Fc foi reenovelada e se, e a qual grau, as regiões Fc diméricas foram formadas. As proteínas reenoveladas da Fc foram purificadas usando uma coluna de afinidade com proteína A e misturadas com um tampão de amostra de proteínas livre de agentes redutores, tal como DTT ou beta-mercaptoetanol, seguido pela 37 eletroforese em SDS-PAGE a 15 % (Criterion Gel, Bio-Rad). As bandas de proteínas foram visualizadas com um corante, tal como Coomassie Briliant. A FIG. 8 é uma fotografia tirada de um gel no qual isolados em coluna de proteína A das proteínas reenoveladas a partir dos corpos de inclusão expressos pelo reformante HM11208 (pista 1), pelo reformante HM11206 (pista 2), pelo reformante HM 11207 (pista 4), pelo reformante HM11212 (pista 5) e pelo reformante HM11213 (pista 7) foram corridos na presença de um campo elétrico sob uma condição sem redução, junto com uma proteína Fc da IgG4 usada como controlo (pistas 3, 6 e 8). Conforme apresentado na FIG. 8, verificou-se que todos os fragmentos Fc da IgGl usados no teste formaram dímeros, apesar de a quantidade deles ter divergido até certo ponto. <2-3> Análise da sequência N-terminal

Como reconhecido no caso da Fc da IgG4, a sequência de aminoácidos N-terminal determinou o processamento pós-translacional quanto a se o resíduo de metionina inicial restou ou se o resíduo de metionina inicial foi processado precisamente, ou junto com outros resíduos de aminoácidos para obter sequências de aminoácidos diferentes da desejada. Com o intuito de determinar se o resíduo de metionina foi processado pelas proteases de E. coli, as diferentes sequências de aminoácidos N-terminais das regiões Fc da IgGl foram analisadas pelo Basic Science Research Institute, Seoul, Coréia. Os resultados da análise apresentam-se de maneira resumida no Quadro 4 a seguir.

Quadro 4

Transformantes Resultados do Sequenciamento N-Terminal (Dímeros) HM11208 Met HM11206 Met HM11207 Ser 38 HM11212 Pro HM11213 Pro

Como visto no Quadro 4, o resíduo de metionina inicial permanece não processado nos transformantes de HM 11208 e HM 11206, em que as regiões Fc da IgGl foram superexpressas em formas diméricas enquanto que os produtos fermentados de HM11207, HM11212 e HM11213 não tiveram resíduos de metionina inicial como resultado do processamento pós-translacional preciso.

Juntos, os dados obtidos pelos experimentos mencionados acima indicam que quando uma região Fc da IgGl é expressa em E. coli, a sua sequência N-terminal determina a expressão, o nível de expressão, a proporção de dímeros e seu processamento N-terminal, e que as regiões Fc livres dos resíduos de metionina inicial podem ser produzidas em grande escala beneficiando-se da sequência N-terminal. As regiões Fc da IgGl obtidas de acordo com a presente invenção podem ser usadas para aperfeiçoar a semivida em soro e a atividade fisiológica do polipéptido fisiologicamente ativo ligado a elas sem indução de resposta imunológica devido à adição de resíduos de aminoácidos exógenos. EXEMPLO 3: Construção do Vetor de Expressão da Região Fc da Imunoglobulina Humana IgG2 <3-l> Construção do vetor de expressão da região Fc da IgG2

Para clonar uma região Fc de cadeia pesada incluindo a região de dobradiça da IgG2, a RT-PCR foi realizada da mesma forma que na região Fc da IgG4. Para amplificar genes contendo diferentes de sequências N-terminais, foram usados os seguintes oligonucleótidos iniciadores. 39 QUADRO 5

Sequências de Oligonucleótidos Iniciadores 5' G2MPPCSS 5’ GGG AAT TCC ATA TGC CAC CGT GCC CAG CAC CAC CTG TGG CAG G 3’ [70] G2MPCPSS 5' GGG AAT TCC ATA TGC CGT GCC CAG CAC CAC CTG TGG CAG GAC 3’ [71] G2MCPSS 5' GGG AAT TCC ATA TGT GCC CAG CAC CAC CTG TGG CAG GAC 3' [72] G2MCCVS S 5' GGG AAT TCC ATA TGT GTT GTG TCG AGT GCC CAC CGT GCC CAG C 3’ [73] G2MCVESS 5' GGG AAT TCC ATA TGT GTG TCG AGT GCC CAC CGT GCC CAG CAC C 3’ [74] O oligonucleótido iniciador 3' ele tinha a sequência de 5' -CGC GGA TCC TCA TTT ACC CGG AGA CAG GGA GAG GCT CTT C-3' [SEQ ID NO: 75] e foi usado para a amplificação de todos os genes contendo sequências N-terminais diferentes. Para facilitar um procedimento de clonagem gênica subsequente, um sitio de reconhecimento Nde I foi introduzido em cada um dos oligonucleótidos iniciadores 5', e um sitio de reconhecimento BamHI foi introduzido no oligonucleótido iniciador 3'. Os produtos da região Fc amplificados com pares dos oligonucleótidos iniciadores foram inseridos em um vetor, obtendo assim respetivos plasmideos recombinantes projetados para conterem partes da sequência total de aminoácidos Glu-Arg-Lys-Cys-Cys-Val-Glu-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro [SEQ ID NO: 15] da região de dobradiça da IgGl, como segue. 0 plasmídeo que continha um gene amplificado com o oligonucleótido iniciador G2MPPCSS foi chamado de pmPPCG2Fc, e a ele foi ancorada uma sequência de ADN que codifica para o CH2 e CH3 da IgG2, iniciando com 40

Met-Pro-Pro-Cys (Met-[SEQ ID NO: 56]), que foi analisada, pelo sequenciamento de bases, como tendo o SEQ. ID. Ne 38 correspondendo à sequência de aminoácidos do SEQ. ID. N-39. O plasmideo que continha um gene amplificado com o oligonucleótido iniciador G2MPCPSS foi chamado de pmPCPG2Fc, e a ele foi ancorada uma sequência de ADN que codifica para o CH2 e CH3 da IgG2, iniciando com Met-Pro-Cys-Pro (Met-[SEQ ID NO: 57]), que foi analisada, pelo sequenciamento de bases, como tendo o SEQ. ID. N- 40 correspondendo à sequência de aminoácidos do SEQ. ID. N-41. O plasmideo que continha um gene amplificado com o oligonucleótido iniciador G2MCPSS foi chamado de pmCPG2Fc, e a ele foi ancorada uma sequência de ADN que codifica para o CH2 e CH3 da IgG2, iniciando com Met-Cys-Pro (Met-[SEQ ID NO: 58]), que foi analisada, pelo sequenciamento de bases, como tendo o SEQ. ID. N° 42 correspondendo à sequência de aminoácidos do SEQ. ID. N° 43. Um plasmideo que continha um gene amplificado com o oligonucleótido iniciador G2MCCVSS foi chamado de pmCCVG2Fc, e foi ancorada a ele uma sequência de ADN que codifica para o CH2 e CH3 da IgG2, iniciando com Met-Cys-Cys-Val-Glu-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro (Met-[SEQ ID NO: 59]), que foi analisada, pelo sequenciamento de bases, como tendo o SEQ. ID. N° 44 correspondendo à sequência de aminoácidos do SEQ. ID. N° 45. Um plasmideo que continha um gene amplificado com o oligonucleótido iniciador G2MCVESS foi chamado de pmCVEG2Fc, e foi ancorada a ele uma sequência de ADN que codifica para o CH2 e CH3 da IgG2, iniciando com Met-Cys-Val-Glu-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro (Met-[SEQ ID NO: 60]), que foi analisada, pelo sequenciamento de bases, como tendo o SEQ. ID. N° 46 correspondendo à sequência de aminoácidos do SEQ. ID. N° 47. Os vetores de expressão foram transformados em E. coli BL21 (DE3) para preparar transformantes, respetivamente designados como BL21/pmPPCPG2Fc (HM11206), BL21/pmPCPG2Fc (HM112 07), BL21/pmCPG2Fc (HM11216), BL21/pmCCVG2F c 41 (ΗΜ11217) e BL21/pmCVEG2Fc (HM11218). <3-2> Expressão, Purificação e Análise da Sequência N-terminal da Fc da IgG2

Como no caso da IgG4, os transformantes bacterianos preparados no Exemplo <3-l> foram inoculados nos respetivos fermentadores (Marubishi Company) e deixados crescer, seguido pela determinação quanto a se eles expressaram fragmentos da região Fc da imunoglobulina. As condições da cultura não foram significativamente diferentes das apresentadas para a Fc da IgG4. Verificou-se que os fragmentos da região Fc da IgG2 foram superexpressos sob várias condições, inclusive temperatura, composição do meio, concentração do indutor, etc., conforme medido por SDS-PAGE em uma condição de redução. A FIG. 9 mostra o resultado de um SDS-PAGE a 15 % das soluções de fermentação misturadas com volumes iguais de tampão de amostra de proteínas 2x. Um fragmento Fc da IgG4 foi usado como controlo na pista 1, ao passo que os fragmentos expressos pelo HM11214, HM11215, HM11216, HM11217 e HM11218 foram corridos nas pistas 2 a 6, respetivamente. Como visto na FIG. 9, todos os cinco transformantes usados no experimento superexpressaram os fragmentos Fc. 0 conteúdo da Fc dimérica da IgG4 nos produtos expressos foi medido da mesma forma que descrito acima. As células das soluções de fermentação foram rompidas e as substâncias insolúveis em água do lisado celular foram reenoveladas, após o que apenas os fragmentos da região Fc foram purificados usando uma coluna de afinidade com proteína A. Os produtos de expressão purificados foram misturados com um tampão de amostra de proteínas livre de agentes redutores, tal como DTT ou beta-mercaptoetanol, e separados em SDS-PAGE a 15 % (Criterion Gel, Bio-Rad) . As bandas de proteínas foram visualizadas com um corante, tal como Coomassie Briliant. A FIG. 10 ilustra o resultado da eletroforese. Um fragmento Fc da IgG4 foi usado como 42 controlo nas pistas 1 e 7, ao passo que dímeros do fragmento de HM11215, HM11216, HM11217 e HM11218 foram observados nas pistas 2 a 6. Conforme interpretado pelos dados da FIG. 10, todos os produtos de expressão dos transformantes, apesar de diferentes uns dos outros com respeito à sequência N-terminal ou à condição de expressão, podem formar dimeros.

Com o intuito de examinar se o resíduo de metionina foi processado pelas proteases de E. coli, diferentes sequências de aminoácidos N-terminais das regiões Fc diméricas da IgG4 foram analisadas pelo Basic Science Research Institute, Seoul, Coréia. O resíduo de metionina inicial foi removido dos produtos dos transformantes HM11214 e HM11215, ambos os quais possuem um resíduo de prolina na posição 2.

Conforme evidenciado nesses experimentos, as regiões Fc da IgG2 podem ser expressas em grande escala no E. coli. Além disso, os dados obtidos nos experimentos mencionados acima indicam que a sequência N-terminal de uma região Fc da IgGl determina a expressão, o nível de expressão, a proporção de dímeros e seu processamento N-terminal, e que as regiões Fc livres dos resíduos de metionina inicial podem ser produzidas em grande escala beneficiando-se da sequência N- terminal. As regiões Fc da IgGl obtidas de acordo com a presente invenção podem ser usadas para aperfeiçoar a semivida em soro e a atividade fisiológica do polipéptido fisiologicamente ativo ligado a elas sem indução de resposta imunológica devido à adição de resíduos de aminoácidos exógenos.

EXEMPLO 4: Ensaio de Ligação ao Clq usando ELISA

Para determinar se os derivados preparados no Exemplo <l-2> e as proteínas correspondendo às regiões Fc das imunoglobulinas, expressas nos transformantes de E. coli e purificadas, ligam-se ao Clq humano, efetuou-se um imunoensaio enzimático (ELISA) como se segue. Como grupos 43 de teste, foram usadas as regiões Fc da imunoglobulina produzidas pelos transformantes HM11200 e HM 11201 preparados nos Exemplos anteriores. Como padrão, utilizou-se uma imunoglobulina glicosilada (IVIGG-globulina S, Green Cross PBM) As amostras teste e padrão foram preparadas em 10 mM de tampão carbonato (pH 9,6) a uma concentração de 1 jug/ml. As amostras foram dividas em aliguotas em uma placa de 96 poços (Nunc) em uma guantidade de 200 ng por poço, e a placa foi revestida durante a noite a 4 °C. Em seguida, cada poço foi lavado com PBS-T (137 mM Ncl, 2 mM KC1, 10 mM NA2HP04, 2 mM KH2P04, 0,05 % Tween 20) três vezes, bloqueado com 250 jul de um tampão de bloqueio (1 % de soroalbumina bovina em PBS-T) à temperatura ambiente durante 1 hora, e lavado novamente com o mesmo PBS- T três vezes. As amostras padrão e teste foram diluidas em PBS- T até uma concentração predeterminada e adicionadas a poços revestidos com anticorpos, e a chapa foi incubada à temperatura ambiente durante 1 hora e lavada com PBS-T três vezes. Em seguida, foram adicionados 2 (g/ml Clq (R&D Systems) à placa, reagidos à temperatura ambiente durante 2 horas, em seguida lavando a placa com PBS-T seis vezes. Foram adicionados 200 jul de uma diluição 1:1000 de conjugado de peroxidase-anticorpo humano anti-Clq humano (Biogenesis, USA) no tampão de bloqueio a cada poço, deixando reagir à temperatura ambiente por 1 hora. Após cada poço ter sido lavado com PBS-T três vezes, foram misturados volumes iguais de reagentes coloridos A e B (Cor A: peróxido estabilizado e Cor B: cromogênio estabilizado; DY 999, R&D Systems) , e 200 [ú da mistura foram adicionados a cada poço, seguido por incubação durante 30 minutos. Em seguida, adicionaram-se 50 jul de uma solução de término de reação e 2 M de ácido sulfúrico a cada poço. A placa foi lida usando um leitor de microplacas (Molecular Device). A absorvância das amostras padrão e teste foi medida em 450 nm, sendo os resultados apresentados na FIG. 2. 44

Conforme ilustrado na FIG. 2, as proteínas da região Fc da imunoglobulina produzidas em E. coli de acordo com a presente invenção apresentaram afinidade de ligação notoriamente reduzidas com Clg. Esses resultados indicam gue as proteínas da região Fc da imunoglobulina da presente invenção raramente correm o risco de induzir respostas imunológicas, tal como citotoxicidade e inflamação no corpo, quando usadas como um veículo para polipéptidos fisiologicamente ativos em uma forma conjugada.

EXEMPLO 5: Ensaio para ligação com FcyRI, FcyRIII e FcRnoí3 usando ELISA A Fc da imunoglobulina é conhecida por ligar os recetores de hematócitos a FcyRI e FcyRIII para mediar funções efetoras, como a citotoxicidade dependente de anticorpos. Para determinar se a Fc da imunoglobulina produzida no E. coli media tais funções efetoras, cada um dos recetores foi obtido e examinado em relação à capacidade de ligação pelo ELISA. Além disso, a Fc da imunoglobulina foi examinada em relação à ligação ao recetor FcRn, que é conhecido por ter influência sobre o metabolismo in vivo da imunoglobulina, da mesma forma. <5-l> Construção das Linhagens de Expressão FcyRI, FcyRIII e FcRnap humanas 0 ARN total foi isolado das células mononucleares de sangue periférico humano usando um kit (Qiagen, Cat. No. ???) e foi usado para "pescar" genes que codificam os domínios de ligação ao ligante extracelular da FcyRI, FcyRIII e FcRno^ humana por meio da RT-PCR e PCT. Os genes foram fusionados a um gene GST (Glutationa S-transferase) e clonados em respetivos vetores de expressão de células de mamíferos, ancorando a ele um gene deidrofolato- redutase. 0 plasma pHMOOO recombinante assim preparado foi transfectado para células CHO. Nesse aspeto, as células CHO foram inoculadas, numa contagem de lxlO6 células por 6 cm da cápsula de cultura, incubadas a 37 °C ou 24 horas em uma 45 incubadora de C02 a 5 %, e lavadas duas vezes com Opti-MEM (Gibco., Cat. no. 31985-070). 1 ml do Opti-MEM contendo 10 I ig de pHMOOO foi misturado com lml do reagente Lipofectamina™ (Invitrogen, Cat. no. 18324-020). Após ser deixada em repouso por 20 minutos, a mistura resultante foi adicionada às células CHO preparadas. Essas células foram incubadas a 37 °C durante 18 horas em uma incubadora de C02 a 5 % e revigoradas com DMEM/F12, suplementadas com soro feral bovino a 10 % e penicilina-estreptomicina a 1 %, antes da incubação durante 48 horas adicionais. De modo a selecionar as linhagens transformadas, as células foram tratadas com 0,5 % de tripsina (Gibco., Cat. N° 15400-054) no meio de seleção α-MEM (Welgene, Cat. N° LM008-02), que incluía soro fetal bovino dializado a 10 %, penicilina-estreptomicina a 1 % e 800ug/ml de geneticina (Mediatech, Cat. No. 61-234RG), seguido por centrifugação. As células assim transformadas foram transferidas para uma cápsula de cultura T25 (Nunc) e cultivadas a 37 °C em uma incubadora de C02 a 5 % até 90 % de confluência ou mais. A fim de determinar os níveis de expressão de FcyRI, FcyRIII e FcRnap, as linhagens selecionadas foram incubadas a 37 °C em Uma incubadora com C02 a 5 % com concentrações crescentes de MTX (Sigma, Cat. No. M-8407) de 20 nM, com um incremento de 20 nM a cada duas semanas. <5-2> Produção e Purificação da FcyRI, FcyRIII e FcRna3 humana

FcyRI, FcyRIII e FcRna3 foram purificados como segue. As linhagens celulares selecionadas foram inoculadas em Cell Factory (Nunc, Cat. N° . 170009) a uma contagem de 3,5xl08 células por fábrica e cultivadas a 37 °C durante 38 horas em uma incubadora de C02 a 5 %, e depois lavadas duas vezes com 1 litro de PBS por fábrica. As células foram suplementadas com 1 litro do meio de produção CHO-A-SFM contendo 0,3 mM de butirato de sódio (Sigma, Cat. No. B-5887) e cultivadas a 33 °C em uma incubadora de C02 a 5 %, 46 durante o que o sobrenadante da expressão foi recuperado dia sim, dia não, no total de 7 dias. 0 sobrenadante colhido foi centrifugado, filtrado por meio de um sistema de filtragem de 0,22 \im (Corning), concentrado usando um sistema de concentração (PALL, Cat. no. PN OS010C70) e carregado em uma resina FF de sefarose quelante FF (Amersharm pharmacia, Cat. no. 17-0575-02) carregada com 0, 1M de sulfureto de níquel (Sigma, Cat. No. N4887) , de modo que os GST de FcyRI, FcyRIII, e FcRnap2 fossem ligados ao níquel. FcyRI, FcyRIII, e FcRnap2 ligados foram separados e purificados da coluna usando 50mM de NaPi (pH 8,0), 300 mM de NaCl e 230 mM de imidazol.

<5-3> Ensaio para ligação a FcyRI O FcyRI purificado no Exemplo <5-2> foi diluído até uma concentração de 0,75 pg/ml em PBS (pH 7,4), dividido em alíquotas em uma placa de 96 poços (Nunc, Maxisorp) a uma quantidade de 100 μΐ por poço, e incubado durante 18 horas a 4 °C de modo que o recetor fosse ligado ao fundo da placa de 96 poços. Cada poço da placa de 96 poços foi lavado três vezes com 300 μΐ de um tampão de lavagem PBS (pH 7,4) contendo 0,05 % de Tween-20 (Amresco, Cat. No. 0777). Depois, 300 μΐ do PBS (pH 7,4) contendo 0,1 % de Tween-20 e 3 % de BSA (soroalbumina bovina, Amresco, Cat. No. 0332) foram adicionados a cada poço de modo a impedir a ligação indesejada de outras substâncias ao fundo do poço, e foram incubados a 37 °C durante 1 hora, após o que a solução de reação foi totalmente removida. Com a IgG do soro humano e a Fc separados pelo tratamento da IgG do soro humano com papaína servindo como controlos, HM11200 e o produto HM11201 purificados no Exemplo 2 foram diluídos até uma concentração de 9 | ig/ml nos respetivos tampões de ensaio, seguido pela repetição de uma diluição 1:3 em série com o tampão de ensaio sete vezes. 100 μΐ da diluição foram colocados em cada poço de uma placa de 96 poços e deixados reagir a 25 °C durante 2 horas com agitação a uma 47 velocidade constante, em seguida lavando os poços seis vezes com um tampão de lavagem. Para examinar se ο HM11200, o produto de HM11201 e os controlos, todos os quais estavam ancorados ao fundo da placa de poços, estavam ligados a FcyRI, uma diluição de 1:100000 de um anticorpo de cadeia pesada anti-humano de cabra conjugado com HRP (Chemicon, AP309P) em um tampão de ensaio foi colocado a um volume de 100 jil em cada poço e deixada reagir a 25 °C durante 2 horas com agitação a uma velocidade constante. Após lavar seis vezes com um tampão de lavagem, 100 (1 de um substrato (BD bioscience, Cat. No. 555214), capaz de reagir com o HRP conjugado com o anticorpo, foram colocados em cada poço e reagidos a 25 °C durante 20 minutos. A reação foi terminada com ácido sulfúrico 2 N e a intensidade da cor foi medida com um leitor ELISA (Molecular Devices, leitor de microplacas) a 450 nm. Como visto na FIG. 3, praticamente nenhuma das proteínas Fc produzidas no E. coli se ligou ao FcyRI, ao passo que a IgG e a Fc, ambas glicosiladas, se associaram fortemente ao FcyRI.

<5-4> Ensaio para ligação ao FcyRIII

Com a IgG do soro humano e a Fc separadas pelo tratamento da IgG do soro humano, com papaína servindo como controlos, ο HM11200 e o produto de HM11201 purificados no exemplo <l-2> foram diluídos até uma concentração de 9 pg/ml no respetivo tampão carbonato (pH 9,0), seguido pela repetição de uma diluição em série de 1:3 com o tampão carbonato sete vezes. 100 μΐ da diluição foram colocados em cada poço de uma placa de 96 poços e incubados a 4 °C durante 18 horas, de modo que eles fossem ligados ao fundo da placa de 96 poços. Cada poço da placa de 96 poços foi lavado três vezes com 300 (1 de um tampão de lavagem consistindo de PBS (pH 7,4) contendo 0,05 % de Tween-20 (Amresco, Cat. No. 0777) . Em seguida, 300 (1 de um tampão de ensaio consistindo de PBS (pH 7,4) contendo 0,1 % de Tween-20 e 5 % de leite desnatado em pó (Difco, Cat. No. 48 232100) foram adicionados a cada poço para impedir a ligação indesejada de outras substâncias ao fundo do poço, e foram incubados a 37 °C durante 1 hora, seguido pela remoção completa da solução de reação. O FcyRIII purificado no Exemplo <4-2> foi diluído até uma concentração 1 (g/ml na solução de ensaio. 100 pi da diluição foram colocados em cada poço de uma placa de 96 poços e deixados reagir a 25 °C durante 2 horas, com agitação a uma velocidade constante. Os poços foram lavados seis vezes com um tampão de lavagem. Um anticorpo anti-GST de coelho (Chemicon, AB3282) , que foi capaz de se ligar ao GST (glutationa S-transferase) do FcyRIII associado ao HM11200, ao produto de HM11201 e aos controlos, foi diluído em 1:10000 no tampão de ensaio, e 100 μΐ da diluição foram colocados em cada poço e deixados reagir a 25 °C durante 21 horas com agitação a uma velocidade constante. Subsequentemente, após lavar os poços seis vezes com um tampão de lavagem 100 μΐ de uma diluição de 1:7500 do anticorpo com o anticorpo de coelho no tampão de ensaio foram colocados em cada poço.

Após a reação a 25 °C durante 2 horas com agitação a uma velocidade constante, a placa de 96 poços foi lavada seis vezes com um tampão de lavagem. Um substrato foi adicionado da mesma forma que no Exemplo <5-3> e a intensidade da cor foi medida com um leitor ELISA. Como visto na FIG. 4, praticamente nenhuma das proteínas FcyRIII produzidas no E. coli se ligou ao FcyRI, ao passo que a IgG e a Fc, ambas glicosiladas, se associaram fortemente ao FcyRIII. <5-5> Ensaio para ligação ao FcRno^

Com a IgG do soro humano e a Fc separadas pelo tratamento da IgG do soro humano com papaína servindo como controlos, HM11200 e o produto de HM11201 purificado no Exemplo <l-2> foram diluídos até uma concentração de 20 pg/ml no respetivo tampão carbonato (pH 9,0), seguido pela repetição de uma diluição em série de 1:3 com o tampão 49 carbonato sete vezes. 100 μΐ da diluição foram colocados em cada poço de uma placa de 96 poços e incubados a 4 °C durante 18 horas, de modo que eles fossem ligados ao fundo da placa de 96 poços. Cada poço da placa de 96 poços foi lavado três vezes com 300 jul de um tampão de lavagem consistindo de PBS (pH 7,4) contendo 0,05 % de Tween-20 (Amresco, Cat. No. 0777) . Em seguida, 300 μΐ de um tampão de ensaio consistindo de PBS (pH 7,4) contendo 0,1 % de Tween-20 e 0,5 % de BSA (Amresco, Cat. No. 0332) foram adicionados a cada poço para impedir a ligação indesejada de outras substâncias ao fundo do poço, e foram incubados a 37 °C durante 1 hora, seguido pela remoção completa da solução de reação. O FcRnap purificado no Exemplo <5-2> foi diluido até uma concentração 3 (g/ml na solução de ensaio. 100 (1 da diluição foram colocados em cada poço de uma placa de 96 poços e deixados reagir a 25 °C durante 2 horas, com agitação a uma velocidade constante. Os poços foram lavados seis vezes com o tampão de lavagem. Um anticorpo anti-GST de coelho (Chemicon, AB3282), que foi capaz de se ligar ao GST (glutationa S-transferase) do

FcRna(32 associado ao HM11200, ao produto de HM11201 e aos controlos, foi diluido em 1:10000 no tampão de ensaio, e 100 (1 da diluição foram colocados em cada poço e deixados reagir a 25 °C durante 21 horas com agitação a uma velocidade constante. Subsequentemente, após lavar os poços seis vezes com um tampão de lavagem, 100 (1 de uma diluição de 1:7500 do anticorpo com o anticorpo de coelho no tampão de ensaio foram colocados em cada poço.

Após a reação a 25 °C durante 2 horas com agitação a uma velocidade constante, a placa de 96 poços foi lavada seis vezes com um tampão de lavagem. Um substrato foi adicionado da mesma forma que no Exemplo 5-3 e a intensidade <ia cor foi medida com um leitor ELISA. Assim como a IgG e a Fc glicosilada, como visto na FIG. 5, as proteínas da Fc produzidas no E. coli se ligaram fortemente 50 ao FcRnap. EXEMPLO 6: Preparação e Análise Farmacocinética do

Conjugado de EPO humana <6-1 > Preparação da EPO humana

Para preparar um conjugado de EPO humana (eritropoietina), primeiro um gene da EPO foi amplificado por RT-PCR usando o ARN total isolado das células sanguíneas e clonado em um vetor pBluscript II (Stratagen), gerando assim um vetor pBlueEP. Para transferir o gene EPO clonado para um vetor de expressão de célula animal pCMV/dhfr-(pCADN3.1 (Invitrogen Company) contendo um gene dhfr), o pBlueEP foi digerido com HindIII e BamHI, e o fragmento contendo o gene EPO assim obtido foi inserido no vetor de expressão da célula animal tratado com as mesmas enzimas de restrição, obtendo assim o pcmvEP. Esse vetor de expressão carregando um gene EPO foi transfetado para células CHO, uma linhagem de expressão de proteína, usando um reagente de Lipofectamina (Gibco). As células foram tratadas com concentrações gradativamente crescentes de MTX até 120 nM para elevar seus niveis de expressão. A EPO foi expressa em níveis altos, maiores do que 100 mg por litro. <6-2> Preparação do complexo EPO-PEG humano ALD-PEG-ALD (Shearwater), um polietilenoglicol de 3,4 kDa contendo um grupo reativo de aldeídos em ambas as extremidades, foi misturado com concentrações de um tampão fosfato de 100 mM contendo a EPO preparada em <6-l> a uma concentração de 5 mg/ml apropriada para formar uma razão molar EPO: PEG de 1:1, 1:2,5, 1:5, 1:10 e 1:20. A essa mistura, foi adicionado um agente redutor, cianoboroidreto de sódio (NaCNBH3, Sigma), a uma concentração final de 20 mM, deixando-o reagir a 4 °C durante 2 horas com agitação moderada para permitir que o PEG se ligue seletivamente à extremidade amino terminal da EPO. Para obter um complexo 1:1 de PEG e EPO, a mistura de reação foi submetida à cromatografia de exclusão por tamanho usando uma coluna 51

SuperdexR (Pharmacia). 0 complexo EPO-PEG foi eluído a partir da coluna usando 10 mM de tampão fosfato de potássio (pH 6,0) como um tampão de eluição, e a EPO não ligada ao PEG, o PEG não reagido e os subprodutos diméricos, onde o PEG estava ligado a duas moléculas de EPO, foram removidos. O complexo EPO-PEG purificado foi concentrado até 5 mg/ml. Por meio desse experimento, verificou-se que a razão molar ideal da reação para EPO com PEG, proporcionando a maior reatividade e gerando a menor quantidade de subprodutos, como dimeros, é de 1:2,5 a 1:5. <6-3> Preparação do conjugado do complexo EPO-PEG humano e da região Fc da imunoglobulina recombinante O complexo EPO-PEG preparado no exemplo <6-2> foi ligado a uma região Fc da imunoglobulina produzida usando o HM11201 no Exemplo <l-3>. Em detalhes, o fragmento da região Fc da imunoglobulina (cerca de 53 kDa) preparado no Exemplo <l-3> foi dissolvido em 10 mM de tampão fosfato e misturado com o complexo EPO-PEG em uma razão molar de complexo EPO-PEG: região Fc de 1:1, 1:2, 1:4 e 1:8. Após a concentração do tampão fosfato da solução de reação ter sido ajustada para 100 mM, um agente redutor, NaCNBH3, foi adicionado à solução de reação a uma concentração final de 20 mM e foi deixado reagir a 4 °C durante 20 horas com agitação moderada. Por meio desse experimento, verificou-se que a razão molar ideal da reação para o complexo EPO-PEG com o fragmento da região Fc, proporcionando a maior reatividade e gerando a menor quantidade de subprodutos, como dimeros, foi de 1:2.

Após a reação de acoplamento, a mistura de reação foi submetida à cromatografia de alta pressão de modo a eliminar substâncias e subprodutos que não reagiram. A solução de reação de acoplamento foi dessalinizada usando uma coluna de dessalinização HiPrep 26/10 (Pharmacia) com 10 mM de tampão Tris (pH 8,0) . Em seguida, a solução de reação foi carregada em 50 ml de uma coluna Q HP 26/10 52 (Pharmacia) a uma taxa de fluxo de 8 ml/min, e essa coluna foi eluida com um gradiente linear de NaCl de 0 M a 0,2 M para obter frações desejadas. As frações colhidas foram novamente carregadas em uma coluna polyCAT 21.5x250 eguilibrada com 10 mM de tampão acetato (pH 5,2) a uma taxa de fluxo de 15 ml/min, e essa coluna foi eluida com um gradiente linear de NaCl de 0,1 a 0,3 M, obtendo assim frações extremamente puras. <6-4> Análise farmacocinética A EPO nativa preparada no Exemplo <5-l>, Aranesp (Amgen), contendo um teor mais elevado de ácido siálico a fim de aumentar sua semivida, e o conjugado de EPO- PEG-Fc (grupo teste) preparado no Exemplo <5-3> foram injetados por via subcutânea a uma dosagem de 100 ng/kg em cinco ratos SD por grupo. Após a injeção subcutânea, amostras de sangue foram colhidas em 0,5, 1, 2, 4, 5, 12, 24 e 48 horas nos grupos de controlo e em 1, 12, 24, 30, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 240, 288, 336 e 384 horas nos grupos de teste. As amostras de sangue foram colhidas em tubos de 1,5 ml, coaguladas e centrifugadas durante 10 minutos usando um microcentrifugador de alta velocidade Eppendorf para remover as células sanguíneas. Os níveis de proteína no soro foram medidos por ELISA usando um anticorpo específico à EPO. O Quadro 6, apresentada a seguir, e a FIG. 6, ilustram as meias-vidas em soro da proteína nativa e do conjugado proteico. O conjugado proteico de EPO-PEG-Fc (E. coli), preparado usando a região Fc da imunoglobulina produzida de acordo com a presente invenção como um veículo, apresentou semivida em soro muito maior do que a da EPO nativa. Verificou-se que essa semivida estendida é maior do que a do Aranesp, conhecido por ser uma EPO de segunda geração com grande semivida em soro. 53 QUADRO 6 EPO Conjugado de EPO-PEG-Fc Aranesp Cmax1 (ng/ml) 30,4 192,8 96, 8 Tmaxz (h) 12,0 48,0 12,0 TI/2J (h) 6,1 47,0 16, 4 AUC4 (ng.h/ml) 713 20436 4064 MRT' (h) 15, 1 88 32 1Concentraçao máxima do soro zTempo necessário para atingir concentração máxima do fármaco 3Semivida em soro de um fármaco 4Área sob a concentração do soro versus curva de tempo 5Tempo médio durante o qual uma molécula de fármaco reside no corpo

Aplicabilidade Industrial

Como descrito até agora, o método de acordo com a presente invenção permite a produção em massa de uma região Fc da imunoglobulina em uma forma de corpo de inclusão em E. coli usando uma região Fc da imunoglobulina recombinante que compreende uma região de dobradiça. Quando ligada a uma proteína fisiologicamente ativa, a região Fc da imunoglobulina produzida pode ser usada de maneira eficaz para melhorar a semivida em soro e a atividade fisiológica da proteína fisiologicamente ativa sem nenhum risco de induzir respostas imunológicas.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIA <110> Hanmi

<120> Um Método Para Produção Em Massa De Uma Região Fc Da Imunoglobulina Com Deleção Dos Resíduos De Metionina Inicial <130> HAN P840EP 54 Λ O \—1 V PCT/KR 06/003207 <141> 16-10-2006 <1 60> 75 <17 0> Patentln versão 3. 3 <210> 1 <211> 39 <212> ADN <213> Sequência artifici .ai <22 0> <223> iniciador 5' para amplificação <4 0 0> 1 gggcatatgt catgcccagc acctgagttc ctgggggga 39

<210> 2 <211> 32 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciador 3' para amplificação de IgG4 Fc <400> 2 gggggatccc tatttaccca gagacaggga ga 32

<210> 3 <211> 39 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> 55 <223> iniciador 5' para amplificação de IgG4 Fc <400> 3 gggcatatgc catcatgccc agcacctgag ttcctgggg 39

<210> 4 <211> 40 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> iniciador 5' para amplificação de IgG4 Fc <400> 4 gggcatatgt gcccatcatg cccagcacct gagttcctgg 40

<210> 5 <211> 36 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciador 5' para amplificação de IgG4 Fc <400> 5 gggcatatgt gcccagcacc tgagttcctg ggggga 36

<210> 6 <211> 663 <212> ADN <213> Homo Sapiens <220> <221> misc feature <222> (1)..(663) <223> nucleótido que codifica proteína recombinante Met- 56 (Fragmento de região de dobradiça de IgG4) fusionado a (Região Fc de IgG4)

Met-(Ser-Cys-Pro)-IgG4 Fc <400> 6 atgtcatgcc cagcacctga gttcctgggg ggaccatcag tcttcctgtt ccccccaaaa 60 cccaaggaca ctctcatgat ctcccggacc cctgaggtca cgtgcgtçgt ggtggacgtg 120 agccaggaag accccgaggt ccagttcaac tggtacgtgg atggcgtgga ggtgcataat 180 gccaagacaa agccgcggga ggagcagttc aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 240 accgtcctgc accaggactg gctgaacggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 300 ggcctcccgt cctccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagagcca 360 caggtgtaca ccctgccccc atcccaggag gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc 420 tgcctggtca aaggcttcta ccccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 480 ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc 540 tacagcaggc taaccgtgga caagagcagg tggcaggagg ggaatgtctt ctcatgctcc 600 gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acacagaaga gcctetccct gtctctgggt 660 aaa 663 <210> 7 <211> 221 <212> PRT <213> Homo Sapiens <22 0> <221> mat_péptido <222> (D .. (221) <223> proteina recombinante Met-(Fragmento de região de dobradiça de IgG4) fusionado a (Região Fc de IgG4) Met-(Ser-Cys-Pro)-IgG4 Fc <22 0> <221> SITE <222> (2) .. (4) 57

<223> Fragmento de região de dobradiça de IgG4 = SEQ ID NO 18 <220> <221> SITE <222> (5)..(221) <223> IgG4 Fc <400> 7

Met 1 Ser Cys Pro Ala 5 Pro Glu Phe Leu Gly 10 Gly Pro Ser Vai Phe 15 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 20 25 30

Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser Gin Glu Asp Pro Glu Vai Gin 35 40 45 58

Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys 50 55 60

Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai Leu 65 70 75 80

Thr Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 85 90 95

Vai Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 100 105 110

Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 115 120 125

Gin Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys 130 135 140

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin 145 150 155 160

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly 165 170 175

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin 180 185 190

Glu Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn 195 200 205

His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 210 215 220

<210> 8 <211> 666 <212> ADN <213> Homo Sapiens <22 0> 59 <221> misc_feature <222> (1) .. (666) <223> nucleótido que codifica proteína recombinante Met-(Fragmento de região de dobradiça de IgG4) fusionado a (Região Fc de IgG4)

Met- (Pro-Ser-Cys-Pro)-IgG4Fc <400> 8 atgccatcat gcccagcacc tgagttcctg gggggaccat cagtcttcct gttcccccca 60 aaacocaagg acactctcat gatctcccgg acccctgagg tcacgtgcgt ggtggtggao 120 gtgagccagg aagaccccga ggtccagttc aactggtacg tggatggcgt ggaggtgcat 180 aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag ttcaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc 240 ctcaccgtcc tgcaccaçga ctggctgaac ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 300 aaaggcctcc cgtcctccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagag 360 ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccag gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg 420 acctgcctgg tcaaaggctt ctaccccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg 480 cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc 540 ctctacagca ggctaaccgt ggacaagagc aggtggcagg aggggaatgt cttctcatgc 600 tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacacaga agagcctctc cctgtctctg 660 ggtaaa 666

<210> 9 <211> 222 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> mat_péptido <222> (1) .. (222) <223> proteína recombinante Met-(Fragmento de região de dobradiça de IgG4) fusionado a (Região Fc de IgG4) Met-(Pro-Ser-Cys-Pro)-IgG4 60

Fc <22 0> <221> SITE <222> (2) . . (5) <223> Fragmento de região de dobradiça de IgG4 = SEQ ID NO: 19 <22 0>

<221> SITE <222> (6) .. (222) <223> IgG4 Fc <400> 9 61

Met Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu 1 5

Phe Leu Gly Gly Pro Ser Vai Phe 10 15

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 20

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 25 30

Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp 35 40

Vai Ser Gin Glu Asp Pro.Glu Vai 45

Gin Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly 50 55

Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr 60

Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn 65 70

Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai 75 80

Leu Thr Vai Leu His Gin Asp Trp 85

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 90 95

Lys Vai Ser Asn Lys Gly Leu Pro 100

Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser 105 110

Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu 115 120

Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro 125

Ser Gin Glu Glu Met Thr Lys Asn 130 135

Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai 140

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 145 150

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 155 160

Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 165

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 170 175

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg 180

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 185 190

Gin Glu Gly Asn Vai Phe Ser Cys 195 200

Ser Val Met His Glu Ala Leu His 205

Ser Leu Ser Leu Gly Lys 220

Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu 210 215 62

<210> 10 <211> 669 <212> ADN <213> Homo Sapiens <22 0> <221> misc_feature <222> (1) .. (669) <223> nucleótido que codifica proteína recombinante Met-(Fragmento de região de dobradiça de IgG4) fusionado a (Região Fc de IgG4 ) Met-Cys -Pro-Ser- -Cys-Pro- IgG4 Fc <4 0 0> 10 atgtgcccat catgcccagc acctgagttc ctggggggac catcagtctt cctgttcccc 60 ccaaaaccca aggacactct oatgatctcc cggacccctg aggtcacgtg cgtggtggtg 120 gacgtgagcc aggaagaccc cgaggtccag ttcaactggt acgtggatgg cgtggaggtg 180 cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagttcaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 240 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 300 aacaaaggcc tcccgtcctc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 360 gagccacagg tgtacaccct gcccccatcc caggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 420 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctacccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 480 gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 540 ttoctctaca gcaggetaac cgtggacaag agcaggtggc aggaggggaa tgtcttctca 600 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac caotacacac agaagagcct ctccctgtct 660 ctgggtaaa $69

<210> 11 <211> 223 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> 63 <221> mat_péptido <222> (1) .. (223) <223> proteína recombinante Met-(Fragmento de região de dobradiça de IgG4) fusionado a (Região Fc de IgG4 ) Met-Cys- Pro-Ser-Cys-Pro-IgG4 Fc <22 0> <221> SITE <222> (2) . . (6) <223> Fragmento de região de dobradiça de IgG4 = SEQ ID NO: 20 <22 0> <221> SITE <222> (7)..(223) <223> IgG4 Fc <4 Ο 0> 11 64

Met Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 1 5

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Vai 10 15

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 20

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 25 30

Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai 35 40

Asp Vai Ser Gin Glu Asp Pro Glu 45

Vai Gin Phe Asn Trp Tyr Vai Asp 50 55

Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys 60

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe 65 70

Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser 75 80

Vai Leu Thr Vai Leu His Gin Asp 85

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 90 95

Cys Lys Vai Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile 100 105 110

Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro 115 120 125

Pro Ser Gin Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu 130 135 140

Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn 145 150 155 160

Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser 165 170 175

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg 180 185 190

Trp Gin Glu Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu 195 200 205

His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 210 215 220 65

<210> 12 <211> 660 <212> ADN <213> Homo Sapiens <22 0> <221> misc_feature <222> (1) .. (660) <223> nucleótido que codifica proteína recombinante Met-(Fragmento de região de dobradiça de IgG4) fusionado a (Região Fc de IgG4) Met-Cys-Pro-IgG4 Fc <4 0 0> 12 atgtgcccag cacctgagtt cctgggggga ccatcagtct tcctgttccc cccaaaaccc 60 aaggacactc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacgt gcgtggtggt çgacgtgagc 120 caggaagacc ccgaggtcca gttcaactgg tacgtggatg gcgtggaggt gcataatgcc 180 aagacaaagc cgcgggagga gcagttcaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 240 gtcctgcacc aggactggct gaacggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaaggc 300 ctcccgtcct ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccecg agagccacag 360 gtgtacaccc tgcccccatc ccaggaggag atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 420 ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 480 gagaacaact acaagaecac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 540 agcaggctaa ccgtggacaa gagcaggtgg caggagggga atgtcttctc atgctccgtg 600 atgcatgagg ctctgcacaa ccactacaca cagaagagcc tctccctgtc tctgggtaaa 660

<210> 13 <211> 220 <212> PRT <213> Homo Sapiens <22 0> <221> mat_péptido 66 <222> (1) .. (220) <223> proteína recombinante Met-(Fragmento de região de dobradiça de IgG4) fusionado a (Região Fc de IgG4 ) Met-Cys- Pro-IgG4 Fc <22 0> <221> SITE <222> (2) .. (3) <223> Fragmento de região de dobradiça de IgG4 = SEQ ID NO: 21 <22 0> <221> SITE <222> (4) .. (220) <223> IgG4 Fc <4 0 0> 13 67

Met Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe 15 10 15

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Vai 20 25 30

Thr Cys Vai vai Vai Asp Vai Ser Gin Glu Asp Pro Glu Vai Gin Phe 35 40 45

Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 50 55 60

Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr 65 70 75 80

Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai 85 90 95

Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 100 105 110

Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gin 115 120 125

Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly 130 135 140

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro 145 150 155 160

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser 165 170 175

Phe Phe Lêu Tyr Ser Arg Lêu Thr Vai Asp LyS Ser Arg Trp Gin Glu 180 185 190

Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser. Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His 195 200 205

Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 210 215 220 68 <210> 14 <211> 15 <212> PRT <213> Homo Sapiens <22 0> <221> DOMÍNIO <222> (D · · (15) <223> Região de dobradiça de IgGl <4 0 0> 14 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 1 5 10 <210> 15 <211> 12 <212> PRT <213> Homo Sapiens <22 0> <221> DOMÍNIO <222> (D .· (12) <223> IgG2 região de dobradiça <4 0 0> 15 Glu Arg Lys Cys Cys Vai Glu Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 0 <210> 16 <211> 62 <212> PRT <213> Homo Sapiens 69 <22 0> <221> DOMÍNIO <222> (1) .. (62) <223> IgG3 região de dobradiça <400> 16

Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys 15 10 15

Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro 20 25 30

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu 35 40 45

Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro 50 55 60

<210> 17 <211> 12 <212> PRT <213> Homo Sapiens <22 0> <221> DOMÍNIO <222> (1) .. (12) <223> Região de dobradiça de IgG4 <4 0 0> 17

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro 1 5 io

<210> 18 <211> 3 <212> PRT 70 <213> Homo Sapiens <22 0> <221> PÉPTIDO <222> (1) . . (3) <223> fragmento de Região de dobradiça de IgG4 <4 0 0> 18

Ser Cys Pro 1

<210> 19 <211> 4 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> PÉPTIDO <222> (1) .. (4) <223> fragmento de Região de dobradiça de IgG4 <4 0 0> 19

Pro Ser Cys Pro 1

<210> 20 <211> 5 <212> PRT <213> Homo Sapiens <22 0> <221> PÉPTIDO <222> (1) .. (5) 71 <223> fragmento de Região de dobradiça de IgG4 <400> 20

Cys Pro Ser Cys Pro 1 5

<210> 21 <211> 2 <212> PRT <213> Homo Sapiens <22 0> <221> PÉPTIDO <222> (1) . . (2) <223> fragmento de Região de dobradiça de IgG4 <400> 21

Cys Pro 1

<210> 22 <211> 699 <212> ADN <213> Homo Sapiens <22 0> <221> misc_feature <222> (1) .. (699) <223> nucleótido que codifica proteína recombinante Met-(Fragmento de região de dobradiça de IgGl) fusionado a (Região Fc de IgGl) Met-Glu-Pro-Lys-IgGl Fc <400> 22 72 atggagccca aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 60 ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 120 cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 180 ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 240 cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 300 aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 360 accatctcca aagccaaagg gcagccccga gagccacagg tgtacaccct gcccccatcc 420 cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 480 agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 540 cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 600 agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 660 cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaa 699

<210> 23 <211> 233 <212> PRT <213> Homo Sapiens <22 0> <221> mat_péptido <222> (1) .. (233) <223> proteína recombinante Met-(Fragmento de região de dobradiça de IgGl) fusionado a (Região Fc de IgGl) Met-Glu-Pro-Lys-IgGl Fc <220> <221> SITE <222> (2) .. (4) <223> Fragmento de região de dobradiça de IgGl = SEQ ID NO: 48 <220>

<221> SITE 73 <222> (5) . . (233) <223> IgGl Fc <400> 23

Met Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr Hís Thr Cys Pro Pro Cys Pro 15 10 15

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys 20 25 30

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai 35 40 45

Vai Val Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp Tyr 50 55 60

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 65 70 75 S0

Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 85 90 95

Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 100 105 110

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin 115 120 125

Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 130 135 140

Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 145 150 155 160

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn 165 170 175

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 180 185 190 74

Tyr Ser Lys Leu Thr vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn vai 195 200 205

Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin 210 215 220

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230

<210> 24 <211> 690 <212> ADN <213> Homo Sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1) .. (690) <223> nucleótido que codifica proteína recombinante Met-(Fragmento de região de dobradiça de IgGl) fusionado a (Região Fc de IgGl) Met-Ser-Cys-Asp-IgGl Fc <400> 24 atgtcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 60 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 120 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaçgtcaa gttcaactgg 180 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagãCââagc cgcgggagga gcagtacaac 240 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 300 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 360 aaagçcaaag ggcagccccg agagccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 420 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctçgtcaaag gcttctatec cagcgacatc 480 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccae gcctcccgtg 540 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 600 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 660 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 690 75

<210> 25 <211> 230 <212> PRT <213> Homo Sapiens <22 0> <221> mat_péptido <222> (1)..(230) <223> proteína recombinante Met-(Fragmento de região de dobradiça de IgGl) fusionado a (Região Fc de IgGl) Met-Ser-Cys-Asp-IgGl Fc <22 0> <221> SITE <222> (2) .. (4) <223> Fragmento de região de dobradiça de IgGl = SEQ ID NO: 49 <22 0> <221> SITE <222> (5) .. (230) <223> IgGl Fc <400> 25 76

Met Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 1 5

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 10 15

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Vál Phe 20

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 25 30

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 35 40

Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp 45

Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai 50 55

Lys Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly 60

Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr 65 70

Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn 75 80

Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai 85

Leu Thr Vai Leu His Gin Asp Trp 90 95 77

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 100 105 110 Ala Pro lie Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu 115 120 125 Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 130 135 140 Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp ile 145 150 155 160 Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 165 170 175 Thr Pro Pro val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 180 185 190 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys 195 200 205 Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu 210 215 220 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230

<210> 26 <211> 684 <212> ADN <213> Homo Sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1) .. (684) <223> nucleótido que codifica proteína recombinante Met-(Fragmento de região de dobradiça de IgGl) fusionado a (Região Fc de IgGl) Met-Asp-Lys-Thr-IgGl Fc 78 <4Ο0> 26 atggacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 60 gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 120 acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 180 gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 240 taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 300 aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 360 aaagggcagc cccgagagcc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 420 aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 480 gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 540 tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 600 gçgaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 660 agcctctccc tgtctccggg taaa 684

<210> 27 <211> 228 <212> PRT <213> Homo Sapiens <22 0> <221> mat_péptido <222> (1) .. (228) <223> proteína recombinante Met-(Fragmento de região de dobradiça de IgGl) fusionado a (Região Fc de IgGl) Met-Asp-Lys-Thr-IgGl Fc <22 0>

<221> SITE <222> (2) .. (4) <223> Fragmento de região de dobradiça de IgGl = SEQ ID NO: 50 79 <22 0> <221> SITE <222> (5) . . (228) <223> IgGl Fc <4Ο0> 27 80

Met Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 15 10 15

Gly Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 20 25 30

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser 35 40 45

His Glu Asp Pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu 50 55 60

Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr 65 70 75 80

Tyr Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn 85 90 95

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 100 105 110

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin 115 120 125

Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Vai 130 135 140

Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Vai 145 150 155 160

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 165 170 175

Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 180 185 190

Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai 195 200 205 81 81 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu 210 215 220

Ser Pro Gly Lys 225

<210> 28 <211> 660 <212> ADN <213> Homo Sapiens <22 0> <221> misc_feature <222> (1) .. (660) <223> nucleótido que codifica proteína recombinante Met-(Fragmento de região de dobradiça de IgGl) fusionado a (Região Fc de IgGl) Met-Cys-Pro-IgGl Fc <400> 28 atgtgcecag cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc 60 aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc 120 cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc 180 aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 240 gtcctgcacc aggactggct gaátggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc 300 ctcccagccc ccatcgaçaa aaccatctcc aaagccaaag gçcagccccç agagccacag 360 gtçtacaccc tgcccccatc ccgggatgag ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 420 ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 480 gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 540 agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 600 atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 660 <210> 29 <211> 220 82

<212> PRT <213> Homo Sapiens <22 0> <221> mat_péptido <222> (1) .. (220) <223> proteína recombinante Met-(Fragmento de região de dobradiça de IgGl) fusionado a (Região Fc de IgGl) Met-Cys-Pro-IgGl Fc <22 0> <221> SITE <222> (2) . . (3) <223> Fragmento de região de dobradiça de IgGl = SEQ ID NO: 51 <22 0> <221> SITE <222> (4) . . (220) <223> IgGl Fc <400> 29 83

Met Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 1 5

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 10 15

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 20

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 25 30

Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser 35 40

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 45

Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu 50 55

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 60

Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr 65 70

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr * 75 80

Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn 85

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 90 95

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 100

Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin 115 120

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 105 110

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 125

Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Vai 130 135

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 140

Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Vai 145 150

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro 155 160

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 165

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 170 175

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 180

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin 185 190

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Vai 195 200

Met His Glu Ala Leu His Asn His 205

Ser Pro Gly Lys 220

Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu 210 215 84

<210> 30 <211> 696 <212> ADN <213> Homo Sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1) .. (696) <223> nucleótido que codifica proteína recombinante Met-(Fragmento de região de dobradiça de IgGl) fusionado a (Região Fc de IgGl) Met-Pro-Lys-Ser-IgGl Fc <400> 30 atgcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 60 gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 120 acccctgagg tcacatgcgt çgtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 180 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag '240 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 300 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 360 atctccaaag ccaaagggca gccccgagag ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 420 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 480 gaeatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 540 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 600 aggtggcagc aggggaacgt cttcteatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 660 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaa 696

<210> 31 <211> 232 <212> PRT <213> Homo Sapiens <22 0> 85 <221> mat_péptido <222> (1) .. (232) <223> proteína recombinante Met-(Fragmento de região de dobradiça de IgGl) fusionado a (Região Fc de IgGl) Met-Pro-Lys-Ser-IgGl Fc <22 0> <221> SITE <222> (2) .. (4) <223> Fragmento de região de dobradiça de IgGl = SEQ ID NO: 52 <22 0> <221> SITE <222> (5) .. (232) <223> IgGl Fc <400> 31

Met Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 15 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Giy Pro ser vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 86

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai 35 40 45

Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Vai 50 55 60

Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin 65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu His Gin 85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala 100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro 115 120 125

Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 130 135 140

Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160

Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190

Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe 195 200 205

Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys 210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 32 87

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<210> 33 <211> 223 <212> PRT <213> Homo Sapiens <22 0> <221> mat_péptido 88 <222> (1) .. (223) <223> proteína recombinante Met-(Fragmento de região de dobradiça de IgGl) fusionado a (Região Fc de IgGl ) Met-Cys- Pro-Pro-IgGl Fc <22 0> <221> SITE <222> (2) ..(4) <223> Fragmento de região de dobradiça de IgGl = SEQ ID NO: 53 <22 0> <221> SITE <222> (5) .. (223) <223> IgGl Fc <4 0 0> 33 89

Met Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 1 5

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Vai 10 15

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 20

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 25 30

Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai 35 40

Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu 45

Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Vai Asp 50 55

Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys 60

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr 65 70

Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser 75 80

Vai Leu Thr vai Leu His Gin Asp 85

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 90 95

Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala Leu 100

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 105 110

Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg 115 120

Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro 125

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 130 135

Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu 140

Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 145 150

Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn 155 160

Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 165

Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser 170 175

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 180

Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg 185 190

Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser 195 200

Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu 205

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Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 220 90

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<210> 35 <211> 222 <212> PRT <213> Homo Sapiens 91 <22 0> <221> mat_péptido <222> (1)..(222) <223> proteína recombinante Met-(Fragmento de região de dobradiça de IgGl) fusionado a (Região Fc de IgGl) Met-Pro-Pro-Cys-IgGl Fc <22 0> <221> SITE <222> (2) . . (4) <223> Fragmento de região de dobradiça de IgGl = SEQ ID NO: 54 <22 0>

<221> SITE <222> (5) . . (222) <223> IgGl Fc <400> 35 92

Met Pro Pro Cys Fro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Sèr Vai Phe 15 10 15

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 20 25 30

Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai 35 40 45

Lys Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr 50 55 60

Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai 65 70 75 80

Leu Thr Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 85 90 95

Lys Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 100 105 110

Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro 115 120 125

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai 130 135 140

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly 145 150 155 160

Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp 165 170 175

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp 180 185 190

Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu His 195 200 205

Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220 93

<210> 36 <211> 663 <212> ADN <213> Homo Sapiens <22 0> <221> misc_feature <222> (1) .. (663) <223> nucleótido que codifica proteína recombinante Met-(Fragmento de região de dobradiça de IgGl) fusionado a (Região Fc de IgGl) Met-Pro-Cys-Pro-IgGl Fc <400> 36 atgccgtgcc cageacctga actcctgggg ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa 60 cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggaegtg 120 agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 180 gçcaagacaa agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 240 accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 300 gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagagcca 360 caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc 420 tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgecgtgg agtgggagag caatgggcag 480 ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc 540 tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc 600 gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt 660 aaa 663

<210> 37 <211> 221 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> mat_péptido 94 <222> (D · · (221) <223> proteína recombinante Met-(Fragmento de região de dobradiça de IgGl) fusionado a (Região Fc de IgGl ) Met-Pro- Cys-Pro-IgGl Fc <22 0> <221> SITE <222> (2) . . (4) <223> Fragmento de região de dobradiça de IgGl = SEQ ID NO: 55 <22 0> <221> SITE <222> (5) .. (221) <223> IgGl Fc <4 0 0> 37 95

Met Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser val Phe Leu 1 5 10 15 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met ile Ser Arg Thr Pro Glu 20 25 30 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 35 40 45 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 50 55 60 Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 65 70 75 80 Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 85 90 95 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr ile Ser Lys 100 105 • 110 Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 115 120 125 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin vai Ser Leu Thr Cys Leu val Lyè 130 135 140 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin 145 150 155 160 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro vai Leu Asp Ser Asp Gly 165 170 175 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin 180 185 190 Gin Gly Asn val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 195 200 205 HiS Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220 96

<210> 38 <211> 663 <212> ADN <213> Homo Sapiens <22 0> <221> misc_feature <222> (1) . . (663) <223> nucleótido que codifica proteína recombinante Met-(Fragmento de região de dobradiça de IgG2) fusionado a (Região Fc de IgG2) Met-Pro-Pro-Cys-IgG2 Fc <400> 38 atgccaccgt gcccagcacc tccggtggcg ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa 60 cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg 120 -agccacgaag accctgaggt ccagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 180 gccaagacaa agccgcggga ggagcagttt aacagcacgt ttcgtgtggt cagcgtcctc 240 accgtcgtgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 300 ggcctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaaacca aagggcagcc ccgagagcca 360 caggtgtaca ccctgccccc atcccgggaa gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc 420 tgcctggtoa aaggcttcta tcccagcgac atçgccgtgg agtgggagag caatgggcag 480 ccggagaaca actacaagac cacgcctccc atgctggact ccgacggctc cttcttcctc 540 tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc 600 gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt 660 aaa 663

<210> 39 <211> 221 <212> PRT <213> Homo Sapiens <22 0> 97 <221> mat_péptido <222> (1) . . (221) <223> proteína recombinante Met-(Fragmento de região de dobradiça de IgG2) fusionado a (Região Fc de IgG2) Met-Pro-Pro-Cys-IgG2 Fc <22 0> <221> SITE <222> (2) .. (4) <223> Fragmento de região de dobradiça de IgG2 = SEQ ID NO: 56 <22 0> <221> SITE <222> (5) . . (221) <223> IgG2 Fc <400> 39 98

Met Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu 1 5 10 15 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met ile Ser Arg Thr Pro Glu 20 25 30 Vai Thr Cys vai val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gin 35 40 45 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly val Glu Val HiS Asn Ala Lys Thr LyS 50 55 60 Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu 65 70 75 80 Thr Vai Vai His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 85 90 95 Vai Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr Zle Ser Lys 100 105 110 Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 115 120 125 Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 130 135 140 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin 145 150 155 160 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly 165 170 175 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin 180 185 190 Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 195 200 205 His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220 99

<210> 40 <211> 660 <212> ADN <213> Homo Sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1) . . (660) <223> nucleótido que codifica proteína recombinante Met-(Fragmento de região de dobradiça de IgG2) fusionado a (Região Fc de IgG2) Met-Pro-Cys-Pro-IgG2 Fc <400> 40 atgccgtgcc cagcacctcc ggtggcggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc 60 aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc 120 cacgaagacc ctgaggtcca gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc 180 aagacaaagc cgcgggagga gcagtttaac agcacgtttc gtgtggtcag cgtcctcacc 240 gtcgtgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaaggc 300 ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctce aaaaccaaag ggcagccccg agagccacag 360 gtgtacaccc tçcccccatc ccgggaagag atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 420 ctggtcaaaç gcttctatcc cagcgacatc gccgtçgagt gggagagcaa tgggcagccg 480 gagaacaact acaagaccac gcctcccatg ctgçactccg acggctcctt cttcctctac 540 agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 600 atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 660

<210> 41 <211> 220 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> mat_péptido 100 <222> (1)..(220) <223> proteína recombinante Met-(Fragmento de região de dobradiça de IgG2) fusionado a (Região Fc de IgG2) Met-Pro-Cys-Pro-IgG2 Fc <22 0> <221> SITE <222> (2) . . (4) <223> Fragmento de região de dobradiça de IgG2 = SEQ ID NO: 57 <22 0>

<221> SITE <222> (5) . . (220) <223> IgG2 Fc <400> 41 101

Met Pro Cys Pro Ala Pro Pro Vai 1 5

Ala Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe 10 15

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 20

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Vai 25 30

Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser 35 40

His Glu Asp Pro Glu Vai Gin Phe 45

Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu 50 55

Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 60

Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr 65 70

Phe Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr 75 80

Vai Vai His Gin Asp Trp Leu Asn 85

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai 90 95

Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro 100

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr 105 110

Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin 115 120

Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 125

Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Vai 130 135

Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly 140

Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala vai 145 150

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro .155 160

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 165

Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser 170 175

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 180

Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin 185 190

Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai 195 200

Met His Glu Ala Leu His Asn His 205

Ser Pro Gly Lys 220

Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu 210 215 <210> 42 102

<211> 657 <212> ADN <213> Homo Sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1) .. (657) <223> nucleótido que codifica proteína recombinante Met-(Fragmento de região de dobradiça de IgG2) fusionado a (Região Fc de IgG2) Met-Cys-Pro-IgG2 Fc <400> 42 atgtgcccag cacctccggt ggcgggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag 60 gacaccctca tgatctcceg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac 120 gaagaccctg aggtccagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag 180 acaaagccgc gggaggagca gtttaacagc acgtttcgtg tggtcagcgt cctcaccgtc 240 gtgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc 300 ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa accaaagggc agccccgaga gccacaggtg 360 tacaccctgc ccccatcccg ggaagagatg accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg 420 gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag 480 aacaactaca agaccacgcc tcccatgctg gactccgacg gctccttctt cctctacagc 540 aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg çtccgtgatg 600 catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 657

<210> 43 <211> 219 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> mat_péptido <222> (1) .. (219) 103 <223> proteína recombinante Met-(Fragmento de região de dobradiça de IgG2) fusionado a (Região Fc de IgG2) Met-Cys-Pro-IgG2 Fc <22 0> <221> SITE <222> (2) . . (3) <223> Fragmento de região de dobradiça de IgG2 = SEQ ID NO: 58 <22 0> <221> SITE <222> (4) .. (219) <223> IgG2 Fc <400> 43 104

Met Cys Pro Ala Pro Pro Vai Ala Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro 15 10 15

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr 20 25 30

Cys Vai Vai vai Asp vai Ser His Glu Asp Pro Glu vai Gin Phe Asn 35 40 45

Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 50 55 60

Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai 65 70 75 80

Vai His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser 85 90 95

Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys 100 105 110

Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu 115 120 125

Glu Met Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe 130 135 140

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu 145 150 155 160

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 165 170 175

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly 180 185 190

Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 195 200 205

Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 <210> 44 105

<211> 678 <212> ADN <213> Homo Sapiens <22 0> <221> misc_feature <222> (1) .. (678) <223> nucleótido que codifica proteína recombinante Met-(Fragmento de região de dobradiça de IgG2) fusionado a (Região Fc de IgG2) Met-Cys-Cys-Val-Glu-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro-IgG2 Fc <400> 44 atgtgttgtg tcgagtgccc accgtgccca gcacctccgg tggcgggacc gtcagtcttc 60 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 120 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtccagt tcaactggta cgtggacggc 180 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgçgaggagc agtttaacag cacgtttcgt 240 gtggtcagcg tcctcaccgt cgtgcaceag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 300 aaggtctcca acaaaggoct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa aaccaaaggg 360 cagccccgag agecacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaagagat gaccaagaac 420 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 480 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccatgct ggactccgac 540 ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 600 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 660 tccctgtctc cgggtaaa 678

<210> 45 <211> 226 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> 106 <221> mat_péptido <222> (1) .. (226) <223> proteína recombinante Met-(Fragmento de região de dobradiça de IgG2) fusionado a (Região Fc de IgG2) Met-Cys-Cys-Val-Glu-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro-IgG2 Fc <220> <221> SITE <222> (2) .. (10) <223> Fragmento de região de dobradiça de IgG2 = SEQ ID NO: 59 <22 0> <221> SITE <222> (11)..(226) <223> IgG2 Fc <400> 45

Met Cys Cys Vai Glu Cys Pro Pro 1 5

Cys Pro Ala Pro Pro Vai Ala Gly 10 15

Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro 20

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 25 30

Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys 35 40

Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu 45

Asp Pro Glu Vai Gin Phe Asn Trp 50 55

Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His 60

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 65 70

Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg 75 80 vai vai ser vai Leu Thr Vai Vai 85

His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys 90 95 107

Glu Tyr Lys Cys Lys Vai ser Asn Lys Gly <1> Pro Ala Pro Ile Glu 100 105 110 Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr 115 120 125 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu 130 135 140 The Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp 145 150 155 160 Glu Ser Asn Gly Gin Pro GlU Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met 165 170 175 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp 180 185 190 Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His 195 200 205 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 210 215 220

Gly Lys 225

<210> 46 <211> 675 <212> ADN <213> Homo Sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(675) <223> nucleótido que codifica proteína recombinante Met-(Fragmento de região de dobradiça de IgG2) fusionado a (Região Fc de IgG2) Met-Cys-Val-Glu-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro-IgG2 Fc 108 <400> 46 atgtgtgtcg agtgcccacc gtgcccagca cctccggtgg cgggaccgtc agtcttcctc 60 ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 120 gtggtçgacg tgagccacga agaccctgag gtccagttca actggtacgt ggacggcgtg 180 gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaçgagcagt ttaacagcac gtttcgtgtg 240 gtcagcgtcc tcaccgtcgt gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta ceagtgcaag 300 gtctccaaca aaggcctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaagggcag 360 ccccgagagc cacaggtgta caccctgccc- ccatcccggg aagagatgac caagaaccag 420 gtcagcctga cctgcctggt caaaggettc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 480 agcaatgçgc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccatgctgga ctccgacggc 540 tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 600 ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 660 ctgtctccgg gtaaa 675

<210> 47 <211> 225 <212> PRT <213> Homo Sapiens <22 0> <221> mat_péptido <222> (1)..(225) <223> proteína recombinante Met-(Fragmento de região de dobradiça de IgG2) fusionado a (Região Fc de IgG2) Met-Cys-Val-Glu-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro-IgG2 Fc <22 0> <221> SITE <222> (2) .. (9) <223> Fragmento de região de dobradiça de IgG2 = SEQ ID NO: 60 <220> 109 <221> SITE <222> (10)..(225) <223> IgG2 Fc <400> 47 110

Met Cys Vai Glu Cys Pro Pro Cys 1 5

Pro Ala Pro Pro Vai Ala Gly Pro 10 15

Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys 20

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 25 30

Arg Thr Pro Glu Vai Thr cys Vai 35 40

Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp 45

Pro Glu Vai Gin Phe Asn Trp Tyr 50 55

Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn 60

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 65 70

Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg Vai 75 80

Vai Ser Vai Leu Thr Vai Vai His 85

Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 90 95

Tyr Lyâ Cys Lys Vai Ser Asn Lys 100

Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 105 110

Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gin 115 120

Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr 125

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 130 135

Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr 140

Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro 145 150

Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu 155 160

Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn 165

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu 170 175

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 180

Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys 185 190

Ser Arg Trp Gin Glri Gly Asn Vai 195 200

Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu 205

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin 210 215

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 220

Lys 225 111

<210> 48 <211> 3 <212> PRT <213> Homo Sapiens <22 0> <221> PÉPTIDO <222> (1) . . (3) <223> fragmento de Região de dobradiça de IgGl <400> 48

Glu Pro Lys 1

<210> 49 <211> 3 <212> PRT <213> Homo Sapiens <22 0> <221> PÉPTIDO <222> (1) . . (3) <223> fragmento de Região de dobradiça de IgGl <400> 49

Ser Cys Asp 1

<210> 50 <211> 3 <212> PRT <213> Homo Sapiens <22 0> <221> PÉPTIDO 112 <222> (1) .. (3) <223> fragmento de Região de dobradiça de IgGl <400> 50

Asp Lys Thr 1

<210> 51 <211> 2 <212> PRT <213> Homo Sapiens <22 0> <221> PÉPTIDO <222> (1) . . (2) <223> fragmento de Região de dobradiça de IgGl <400> 51

Cys Pro 1

<210> 52 <211> 3 <212> PRT <213> Homo Sapiens <22 0> <221> PÉPTIDO <222> (1) . . (3) <223> fragmento de Região de dobradiça de IgGl <400> 52

Pro Lys Ser 1 113

<210> 53 <211> 3 <212> PRT <213> Homo Sapiens <22 0> <221> PÉPTIDO <222> (1) . . (3) <223> fragmento de Região de dobradiça de IgGl <400> 53

Cys Pro Pro 1

<210> 54 <211> 3 <212> PRT <213> Homo Sapiens <22 0> <221> PÉPTIDO <222> (1) . . (3) <223> fragmento de Região de dobradiça de IgGl <400> 54

Pro Pro Cys 1

<210> 55 <211> 3 <212> PRT <213> Homo Sapiens <22 0> <221> PÉPTIDO 114 <222> <223> <4 Ο 0> (1) · · (3) fragmento de Região de dobradiça de IgGl 55

Pro Cys Pro 1 <210> <211> <212> <213> <22 0> <221> <222> <223> <400> 56 3 PRT Homo Sapiens PEPTIDO (D · · (3) fragmento de região de dobradiça de IgG2 56

Pro Pro Cys 1 <210> <211> <212> <213> <22 0> <221> <222> <223> <4 Ο 0> 57 3 PRT Homo Sapiens PEPTIDO (D · · (3) fragmento de região de dobradiça de IgG2 57

Pro Cys Pro 1 115

<210> 58 <211> 2 <212> PRT <213> Homo Sapiens <22 0> <221> PÉPTIDO <222> (D · · (2) <223> fragmento de região de dobradiça <4 0 0> 58 Cys Pro 1 <210> 59 <211> 9 <212> PRT <213> Homo Sapiens <22 0> <221> PÉPTIDO <222> (D · · (9) <223> fragmento de região de dobradiça <4 0 0> 59 Cys Cys Vai Glu Cys Pro Pro 1 5 <210> 60 <211> 8 <212> PRT <213> Homo Sapiens <22 0> <221> PÉPTIDO 116 <222> (D · · (8) <223> fragmento de região de dobradiça de IgG2 <4 0 0> 60 Cys Vai Glu Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 <210> 61 <211> 40 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciador 5' para amplificação de IgGl Fc <4 0 0> 61 ggaattccat atggagccca aatcttgtga caaaactcac 40 <210> 62 <211> 39 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciador 5' para amplificação de IgGl Fc <4 0 0> 62 ggaattccat atgtcttgtg acaaaactca cacatgccc 39 <210> 63 <211> 40 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> 117 <223> iniciador 5' para amplificação de IgGl Fc <400> 63 ggaattccat atggacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 40

<210> 64 <211> 38 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciador 5' para amplificação de IgGl Fc <400> 64 gggaattcca tatgtgccca gcacctgaac tcctgggg 38

<210> 65 <211> 38 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciador 5' para amplificação de IgGl Fc <400> 65 gggaattcca tatgcccaaa tcttgtgaca aaactcac 38

<210> 66 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciador 5' para amplificação de IgGl Fc <400> 6 6 118 gggaattcca tatgtgccca ccgtgcccag cacctgaact cc 42

<210> 67 <211> 40 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> iniciador 5' para amplificação de IgGl Fc <400> 67 ggaattccat atgccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 40

<210> 68 <211> 40 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> iniciador 5' para amplificação de IgGl Fc <400> 68 ggaattccat atgccgtgcc cagcacctga actcctgggg 40

<210> 69 <211> 40 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> iniciador 3' para amplificação de IgGl Fc <400> 69 cgcggatcct catttacccg gagacaggga gaggctcttc 40 119 <210> 70 <211> 43 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> iniciador 5' para amplificação de IgG2 Fc <400> 70 gggaattcca tatgccaccg tgcccagcac cacctgtggc agg 43 <210> 71 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> iniciador 5' para amplificação de IgG2 Fc <4 0 0> 71 gggaattcca tatgccgtgc ccagcaccac ctgtggcagg ac 42 <210> 72 <211> 39 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciador 5' para amplificação de IgG2 Fc <400> 72 gggaattcca tatgtgccca gcaccacctg tggcaggac 39 <210> 73 <211> 43 120

<212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> iniciador 5' para amplificação de IgG2 Fc <400> 73 gggaattcca tatgtgttgt gtcgagtgcc caccgtgccc age 43

<210> 74 <211> 43 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> iniciador 5' para amplificação de IgG2 Fc <400> 74 gggaattcca tatgtgtgtc gagtgcccac cgtgcccagc acc 43

<210> 75 <211> 40 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciador 3' para amplificação de IgG2 Fc <400> 75 cgcggatcct catttacccg gagacaggga gaggctcttc 40 121

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • KR 249572 [0006] • US 5605690 A [0006] • US 5723125 A [0006] • US 5908626 A [0006] • WO 0069913 A [0006] • US 20030082679 A [0006] • US 20010053539 A [0006] • US 6030613 A [0006] • WO 9902709 A [0006] • WO 0103737 A [0006] • EP 0464533 BI [0006] • US 5349053 A [0007] • US 5585097 A [0009] • US 20030073164 A [0009] • US 6660843 B [0010] • US 20040044188 A [0010] • US 20040053845 A [0010] • EP 0227110 A [0013] [0041] • KR 0092783 [0013] [0041] • WO 0118203 A [0015] • WO 2005047334 A [0015] • KR 06003207 W [0096]

Literatura não relacionada com patentes referida na descrição • GHETIE; WARD. Immunology Today, 1997, vol. 18, 592-598 [0005] COLE et al. J. Immunol., 1997, vol. 159, 3613-3621 [0008] H. NEURATH ; R. L. HILL. The Proteins. Academic Press, 1979 [0022] SAMBROOK et al. Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 [0022] ADAMS et al. J. Mol. Biol., 1968, vol. 33, 571-589 [0039] TAKEDA. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1968, vol. 60, 1487-1494 [0039] MOERSCHELL et al. J. Biol. Chem., 1990, vol. 265, 19638-19643 [0039] JAMES et al. Prot ein Expression and Purification, 2005, vol. 41, 45-52 [0039]

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um método de produção de uma região Fc de imunoglobulina livre de um resíduo de metionina codificada por um codão de iniciação em grande escala, que compreende: preparar um vetor de expressão recombinante incluindo uma sequência de nucleótido que codifica uma região Fc de imunoglobulina recombinante composta de uma região Fc de imunoglobulina ligada no N-terminal da mesma a uma região de dobradiça de imunoglobulina via uma ligação peptídica; transformar uma E. coli com o vetor de expressão recombinante para criar um transformante; cultivar o transformante para expressar a região Fc de imunoglobulina como um corpo de inclusão; isolar e purificar a região Fc de imunoglobulina do corpo de inclusão; e solubilizar e voltar a enrolar o fragmento Fc de imunoglobulina, em que a dita região de dobradiça da imunoglobulina tem cisteína, serina ou prolina como o aminoácido inicial da extremidade N-terminal.

2. 0 método de acordo com a reivindicação 1, em que a região Fc de imunoglobulina é isolada numa forma monomérica ou dimérica.

3. 0 método de acordo com a reivindicação 1, em que a região de dobradiça tem duas ou mais sequências de aminoácido consecutivas derivadas da região de dobradiça de IgG, igA, IgM, IgE, ou IgD.

4. 0 método de acordo com a reivindicação 3, em que a região de dobradiça tem duas ou mais sequências de aminoácido consecutivas, cada uma incluindo pelo menos um 2 resíduo de cisteína.

5. 0 método de acordo com a reivindicação 3, em que a IgG é selecionada a partir do grupo que consiste em IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4.

6. 0 método de acordo com a reivindicação 5, em que a região de dobradiça tem uma sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO. 18, 19, 20, 21, 49, 51, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 ou 60.

7. O método de acordo com a reivindicação 1, em que a região Fc de imunoglobulina é selecionada a partir do grupo que consiste em regiões de Fc de IgG, IgA, IgM, IgE, IgD, e combinações e híbridos dos mesmos.

8. 0 método de acordo com a reivindicação 7, em que a região Fc de imunoglobulina é a região Fc da IgG selecionada a partir do grupo que consiste em IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, e combinações e híbridos dos mesmos.

9. O método de acordo com a reivindicação 1, em que a região Fc de imunoglobulina é composta de um a quatro domínios selecionados a partir do grupo que consiste em domínios CH2, CH3 e CH4.

10. O método de acordo com a reivindicação 1, em que a região Fc de imunoglobulina tem uma sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO. 7, 9, 11, 13, 25, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 ou 47.

11. O método de acordo com a reivindicação 1, em que o vetor de expressão recombinante compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO. 7, 9, 11, 13, 25, 29, 31, 33, 3 35, 37, 39, 41, 43, 45 ou 47.

12. 0 método de acordo com a reivindicação 1, em que o transformante é transformado por um vetor que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO. 7, 9, 11, 13, 25, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 ou 47.

13. 0 método de acordo com a reivindicação 12, em que o transformante é selecionado a partir do grupo que consiste em número de acesso KCCM-10659P, KCCM-10660P, KCCM-10665P e KCCM-10666P.