JP4870574B2 - ペプチドおよびタンパク質のプロセシング - Google Patents
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Description
本発明は、開始メチオニンがフリーのペプチドを産生するための、開始メチオニン含有タンパク質を酵素メチオニンアミノペプチダーゼでプロセシングする方法及びその変異体に関する。
原核生物または真核生物の発現系を用いた組換え技術によるペプチドの産生は、先行するメチオニンアミノ酸を有するペプチドを生得的(inherently)に産出する。このアミノ酸は、本来のタンパク質(即ち、トランスロケーションのためにプロセスされるペプチドのバリアント)には存在しないだろう。先行するメチオニン無しのペプチドを得るには、このような更なるプロセシング工程が必要とされる。本発明において、前記工程は、酵素メチオニンアミノペプチダーゼによって実施され、これによって開始メチオニンがペプチドから選択的に切断される。
本発明は、新規の変異体メチオニンアミノペプチダーゼを提供する。
P1は、前記酵素の認識部位に対してN端(N-terminal)の最初のアミノ酸を規定する。P1’は、C端(C-terminal)の方向でP1に隣接するアミノ酸を意味する。本発明においてP1は、メチオニンである。
大腸菌からのMet-Apは、基質規定ポケット(活性部位の一部として)を有し、これは基本的に(しかし、おそらくは排他的ではなく)、アミノ酸Tyr 168、Met 206およびGln 233によって規定される。これらのポジションを変異させることによって、前記酵素の基質特異性が拡張される。本発明に記載される新規の大腸菌アミノペプチダーゼは、メチオニンアミノペプチダーゼの適用性が拡張されて、メチオニンの下流のアミノ酸配列(P1’ ポジション)にかかわらず、開始メチオニンをほとんど如何なるタイプのタンパク質またはペプチドから除去することに有用となった。それ故、開始メチオニンが、開始メチオニンを含んでいるペプチドまたはタンパク質から除去されて、開始メチオニンがフリーのペプチドまたはタンパク質を産生することができる。
本発明は、以下に記す配列(配列番号1としても記載される)を有しているメチオニンアミノペプチダーゼ酵素を提供する、
YDSRETNVVLKPGMTFTIEPXb VNAGKKEIRTMKDGWTVKTKDRSLSAXc YEHTIVVT
DNGCEILTLRKDDTIPAIISHDE,
MAISIKTPEDIEKMRVAGRLAAEVLEMIEPYVKPGVSTGELDRICNDYIVNEQHAVSACLGYHGYPKSVCISINEVVCHGIPDDAKLLKDGDIVNIDVTVIKDGFHGDTSKMFIVGKPTIMGERLCRITQESLYLALRMVKPGINLREIGAAIQKFVEAEGFSVVREACGHGIGRGFHEEPQVLHYDSRETNVVLKPGMTFTIEPMVNAGKKEIRTMKDGWTVKTKDRSLSAQYEHTIVVTDNGCEILTLRKDDTIPAIISHDE
また、配列番号8として上記をコード化している対応するDNAを提供する;
これによって、酵素の基質特異性が拡張され、次に記すアミノ酸が許容される:そのアミノ酸とは、P1’ポジションにおけるAsn, Leu, Ile および Pheである。
又は、Met206およびGln233の双方のAlaへの置換(M206A Q233A)(配列番号7)を提供する:
MAISIKTPEDIEKMRVAGRLAAEVLEMIEPYVKPGVSTGELDRICNDYIVNEQHAVSACLGYHGYPKSVCISINEVVCHGIPDDAKLLKDGDIVNIDVTVIKDGFHGDTSKMFIVGKPTIMGERLCRITQESLYLALRMVKPGINLREIGAAIQKFVEAEGFSVVREXCGHGIGRGFHEEPQVLHYDSRETNVVLKPGMTFTIEPAVNAGKKEIRTMKDGWTVKTKDRSLSAAYEHTIVVTDNGCEILTLRKDDTIPAIISHDE,
これによって、さらにP1’アミノ酸がHis, Gln および Trpとなることが許容される。
様々なMet-AP発現構築物(図1に概要が示される)が作出された。NT1(HHHNSWDHDINR)またはヘキサ-Hisタグが、Met-APの様々な突然変異体形態に精製の目的で付加された。精製タグは、Xa因子を幾つかの構築物に又はエンテロキナーゼを他のものに用いて除去し得る。或いは、精製タグは前記酵素に残存してもよい。mRNA発現は、T7またはtacプロモーターのコントロール下であった。T7プロモーターのコントロール下の構築物をBL21(DE3)において発現させ、他方でtacプロモーターのコントロール下の構築物をBL21において発現させた。発現を、LB-培地中でOD600 0.4にまで成長させた培養物(6 mL)に0.4 mMまでIPTGを添加することによって誘導した。細胞を、2.5時間後に遠心分離によって収穫した。細胞溶解を、複数回の凍結融解サイクルによって行った。そして可溶性または不溶性のタンパク質分画を、遠心分離によって分離した。同等量の細胞(OD600で測定)に由来する可溶性の又は不溶性のタンパク質を、発現誘導の前後で、SDS-PAGEに供試し、引続いてコロイドブルー染色(colloidal blue staining)した(図2)。Met-AP発現レベルは、6mL培養物中で2.5 hの誘導後に〜250 mg/Lと見積もられた。
精製されたMet-AP(M206A, Q233A)を使用して、開始メチオニンを、部分的に又は完全に精製されたMet-IL21から除去した。切断は、典型的に次に記す成分からなる反応緩衝液で実施された:2〜100 mM K2SO4, 2〜500 mM NaCl, 1〜100 μM ZnCl2 および 2〜30 mM Hepes緩衝剤 pH 6〜8。切断を、MALDI-TOF分光学でアッセイした。反応時間は、2〜66時間であった。これらの条件を用いて、Met-IL21の検出限界以下でMet-IL21からのメチオニンの除去を実施することができた。
精製Met-AP(M206A)を使用して、部分的に又は完全に精製されたMet-IL21から開始メチオニンを除去した。切断は、典型的に次に記す成分からなる反応緩衝液で実施された:2〜100 mM K2SO4, 2〜500 mM NaCl, 1〜100 μM ZnCl2 および 2〜30 mM Hepes緩衝剤 pH 6〜8。切断を、MALDI-TOF分光学でアッセイした。反応時間は、2〜66時間であった。これらの条件を用いて、Met-IL21の検出限界以下でMet-IL21からのメチオニンの除去を実施することができた。
例1に記載された条件およびアッセイを用いて、他のパラメーターを固定した間に温度をそれぞれ4、15、24および30゜C(degrees Celsius)の間で変動させた。前記反応に対する最適温度は、15および24゜Cの間であると決定された。典型的に(Typically)、前記反応を、以後18゜Cで実施した。
例1に記載された条件およびアッセイを用いて、他のパラメーターを固定した間にZnCl2濃度をそれぞれ7.5、11および15 μMの間で変動させた。前記反応に対する最適なZnCl2濃度は、7.5 μMであると決定された。典型的に、前記反応を、以後7.5 μM ZnCl2で実施した。
例1に記載された条件およびアッセイを用いて、他のパラメーターを固定した間にNaCl濃度をそれぞれ80、130および180 mMの間で変動させた。反応を実施するために許容される最大NaCl濃度は、130mMであると決定された。典型的に、前記反応を、以後100 mM NaClで実施した。
上記の例に記載された条件を用いて、Q-シクラーゼを反応混合物へと添加する効果を決定した。再度MALDI-TOFが、メチオニンの除去を及び引続いてIL21中のポジション1におけるグルタミンのピロ-グルタミンへの転換をアッセイするために使用された。Q-シクラーゼを反応混合物へと添加することがMet-IL21から開始メチオニンを除去することに負に影響しなかったこと、更に上記の例に記載した反応条件下で、Q-シクラーゼがIL21中のポジション1における転換グルタミンのピロ-グルタミンへの転換に完全に有効(fully efficient)であったことが認められた。
Met-IL21、IL21およびピロ-グルタミンIL21の間の異なる生物物理学的特性(bio-physical properties)を、精製目的/分離に使用することができる。ピロ-グルタミンIL21は、環化したアミド形成によって、N末端の正常なプロトン化が欠除(lack)する。ピロ-グルタミンで開始されるhIl-21とMet-IL21との間の(-1)電荷差(charge difference)を、陽イオン交換カラムに利用することが可能であり、これによってピロ-グルタミン IL21が最初に溶出され(それが1つの陽性電荷を欠除していることから)、引続いてMet-IL21(これは陽イオンレジンに対しより強い結合を示す)が溶出する。更に、非環化IL21において、N末端に配置されたグルタミンは、側鎖アミド酸素(the side chain amide oxygen)と荷電したN末端バックボーンアミンとの間に水素結合を形成する能力を有し、これによってN末端の電荷がマスクされる。Met-IL21は、類似する電荷マスキングに関する能力を提示(poses)しなく、それゆえ陽イオン交換カラムにIL21よりも強く結合する。Met-IL21、IL21およびピロ-グルタミンIL21の混合物(300 mM NaClを含み、pH6.5に緩衝された)を、Mono-Sカラムに充填した。A緩衝液はpH 6.5に緩衝された300mM NaClから構成され、B緩衝液はpH 6.5に緩衝された1 M NaClから構成される。0-20%のB緩衝液のリニアグラジエント(AKTAシステムで実施した)を、45カラム容量を超えてアプライした。フラクションを、上記のQ-シクラーゼの例で記載したとおりアッセイした。上記に記載されたグラジエントを用いて、Met-IL21、IL21、ピロ-グルタミンIL21の効率的な分離が達成された(図5)。
精製Met-AP(M206A)を使用して、部分的に又は完全に精製されたMet-hGH (ヒト成長ホルモン)から開始メチオニンを除去した(ここで、P1’はPhe残基である)。切断は、典型的には次に記す成分からなる反応緩衝液中で実施された:2〜100 mM K2SO4, 2〜500 mM NaCl, 1〜100 μM ZnCl2 および 2〜30 mM Hepes 緩衝剤 pH 6〜8。切断を、MALDI-TOF分光学でアッセイした。反応時間は、2〜66時間である。これらの条件を用いて、Met-hGHからのメチオニンの部分的な又は完全な除去が実証された。
精製Met-AP(M206A, Q233A)を使用して、部分的に又は完全に精製されたMet-hGH(ヒト成長ホルモン)から開始メチオニンを除去した(ここで、P1’はPhe残基である)。切断は、典型的に次に記す成分からなる反応緩衝液で実施された:2〜100 mM K2SO4, 2〜500 mM NaCl, 1〜100 μM ZnCl2 および 2〜30 mM Hepes 緩衝剤 pH 6〜8。切断を、MALDI-TOF分光学でアッセイした。反応時間は、2〜66時間である。これらの条件を用いて、Met-hGHからのメチオニンの部分的な又は完全な除去が達成された。
精製Met-AP(M206A)を使用して、部分的に又は完全に精製されたMet-IL-20から開始メチオニンを除去した(ここで、P1’はLeu残基である)。切断は、典型的に次に記す成分からなる反応緩衝液で実施された:2〜100 mM K2SO4, 2〜500 mM NaCl, 1〜100 μM ZnCl2 および 2〜30 mM Hepes 緩衝剤 pH 6〜8。切断を、MALDI-TOF分光学でアッセイした。反応時間は、2〜66時間である。これらの条件を用いて、Met-IL-20からのメチオニンの部分的な又は完全な除去が実証された。
精製Met-AP(M206A, Q233A)を使用して、部分的に又は完全に精製されたMet-IL-20から開始メチオニンを除去した(ここで、P1’はLeu残基である)。切断は、典型的に次に記す成分からなる反応緩衝液で実施された:2〜100 mM K2SO4, 2〜500 μM NaCl, 1〜100 μM ZnCl2 および 2〜30 mM Hepes 緩衝剤 pH 6〜8。切断を、MALDI-TOF分光学でアッセイした。反応時間は、2〜66時間である。これらの条件を用いて、Met-IL-20からのメチオニンの部分的な又は完全な除去が実証された。
Claims (9)
- 基質タンパク質から開始メチオニンを除去し、続いて産物を精製する方法であって、開始メチオニンの除去は、大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼを使用して行われ、前記大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼは、ポジション168、206および233における少なくとも1つの残基が、Alaへと変異しており、Met−Glnで開始される基質タンパク質と、基質タンパク質と同一であるがGlnから開始される産物タンパク質とを分離するための方法は、Qシクラーゼを用いて産物のN−末端Glnをピログルタミンに変換する工程と、基質と産物の間の電荷差を利用して精製する工程とを含む方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼのポジション168がAlaである方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼのポジション206がAlaである方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼのポジション233がAlaである方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼのポジション206および233の両方がAlaである方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼは配列番号3で表されるアミノ酸配列を有する方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼは配列番号5で表されるアミノ酸配列を有する方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼは配列番号7で表されるアミノ酸配列を有する方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼは配列番号9で表されるアミノ酸配列を有する方法。
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