KR100562873B1 - 인간 인슐린 발현 플라스미드 및 이를 이용한 인간인슐린의 제조 방법 - Google Patents

인간 인슐린 발현 플라스미드 및 이를 이용한 인간인슐린의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 인슐린 발현 플라스미드 및 이를 이용한 인슐린의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 플라스미드는 R-B-X-A 구조의 화합물을 암호화하는 염기서열을 포함한다.
상기 구조에서 R은 Met-Thr-Met-Ile-Thr-Y의 구조로 이루지는 전서열 펩티드로, Y는 리신, 아르기닌, C-말단의 아미노산이 리신인 펩티드, 또는 C-말단의 아미노산이 아르기닌인 펩티드 중 선택된 하나이며, B는 인간 인슐린 B쇄 또는 그 유사체이고, X는 B와 A를 연결하는 펩티드이며, A는 인간 인슐린 A쇄 또는 그 유사체이다.
본 발명의 플라스미드를 이용한 인슐린의 제조 방법은 한번의 효소 절단 과정에 의해 프로인슐린 융합단백질을 인간 인슐린으로 전환하며, 효소 절단 후 수반되는 부산물 생성 또한 최소화하므로, 높은 수율로 인슐린을 얻게 한다.
따라서, 본 발명의 플라스미드 및 이를 이용한 인슐린의 제조 방법은 인간 인슐린의 산업적 대량 생산에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

인간 인슐린 발현 플라스미드 및 이를 이용한 인간 인슐린의 제조 방법 {Plasmids expressing human insulin and the preparation method for human insulin thereby}
도 1은 본 발명의 pK-BKpi계 및 pK-BRpi계 플라스미드의 구조 및 제조 방법에 대한 개략도이다.
도 2는 pPT 벡터의 구조 및 제조 방법에 대한 개략도이다.
도 3은 본 발명의 pPT-BKpi계 및 pPT-BRpi계 플라스미드의 구조 및 제조 방법에 대한 개략도이다.
도 4는 본 발명의 pPL-BKpi계, pPL-BRpi계, pPLD-BKpi계 및 pPLD-BRpi계 플라스미드의 구조 및 제조 방법에 대한 개략도이다.
도 5는 본 발명의 플라스미드가 발현하는 프로인슐린 융합단백질에서 전서열 펩티드의 구조를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 pK-BKpi계 플라스미드 및 기존의 메치오닌-리신-프로인슐린 융합단백질 발현 플라스미드에 대해, 융합단백질의 발현량을 비교하여 그 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 pK-B5Kpi, pPT-B5Kpi, pPL-B5Kpi 및 pPLD-B5Kpi 플라스미드에 대해, 융합단백질의 발현량을 비교하여 그 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 플라스미드 및 기존의 메치오닌-리신-프로인슐린 융합단백질 발현 플라스미드에 대해, 부산물의 생성 정도를 비교하여 그 결과를 나타낸 도이다.
본 발명은 인간 인슐린(insulin) 발현 플라스미드(plasmid) 및 이를 이용한 인슐린의 제조 방법에 관한 것이다.
인슐린은 이자에서 분비되는 당 조절 호르몬으로, 각 세포의 표면에 있는 인슐린 수용체와 결합하여 세포가 포도당을 이용할 수 있도록 촉진함으로써 혈당량을 낮추는 작용을 하며, 현재 당뇨병 치료제로 널리 사용되고 있다. 인슐린은 이자에서 생성될 당시에는 A쇄, B쇄 및 이들을 연결하는 C쇄로 이루어진 프로인슐린(proinsulin)이라는 전구체 형태로 형성되며, 프로인슐린은 세포 내에서 C쇄가 잘려나가면서 A쇄와 B쇄만으로 구성된 활성인슐린으로 전환된다.
유전공학기술의 발달로, 재조합 플라스미드에 의해 형질전환된 대장균을 이용하여 각종 유용한 재조합 단백질들의 대량생산이 가능해졌다. 재조합 단백질을 생산하는데 있어서 가장 중요한 문제는 숙주세포에서 반감기가 짧다는 것이다(Talmadge K, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 1982;79:1830-3, Shen SH. Proc Natl Acad Sci U S A. 1984;81:4627-31). 일례로, 대장균에서 쥐(rat) 프로인슐린의 반감기는 단지 2분으로 보고되었다(Talmadge K, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 1982;79:1830-3).
특히 발현된 단백질의 분해는 단백질 접힘과 밀접한 관련이 있는데, 세포는 제대로 3차 구조를 갖추지 못한 단백질 또는 손상된 단백질을 분해하여 아미노산으로 전환함으로써 세포내 조성물의 효율적인 사용을 가능하게 하기 때문이다. 대장균의 세포질 내에서는 ATP를 이용하는 Hsps(heat shock proteins)에 의해서 초기 단백질 분해과정이 일어난다.
재조합 단백질의 안정성을 높이고자, 단백질을 내포체(inclusion body) 형태로 발현시켜 재접힘(refolding)으로 활성을 회복시키는 방법이 사용될 수 있다. 내포체는 일반적으로 단백질 분해효소의 영향을 덜 받으며, 세포 내 단백질의 50%까지 차지할 정도로 고농도로 축적된다. 그러므로 내포체 형태로 발현시킬 경우, 단백질의 올바른 3차 구조의 형성을 위한 효율적인 재접힘 공정을 개발하여 적용함으로써 목적 단백질을 경제적으로 생산할 수 있는 매우 좋은 방법으로 이용할 수 있다(Mukhopadhyay A. Adv Biochem Eng Biotechnol. 1997;56:61-109).
대장균에서 인간 인슐린을 생산하는 경우에 대부분 상기의 방법을 적용하고 있다. 통상적으로 사용되어 온 방법은, 안정성을 증가시키기 위하여 재조합 인슐린을 융합단백질 형태로 발현시키고 화학적으로 절단하는 방법으로, 베타갈락토시다제(β- galactosidase)와 같이 대장균에서 안정성이 높은 단백질의 유전자를 함유하는 플라스미드에 프로인슐린 유전자를 삽입하여 재조합 플라스미드를 만들고, 이를 이용하여 형질전환시킨 대장균에서 프로인슐린 융합단백질을 발현시킨다.
상기 방법에서 프로인슐린 융합단백질을 정제하여 인간 인슐린을 제조하기 위해서, 내포체를 정제하여 목적 단백질의 순도를 증가시키고, 세척된 내포체에 대해 변성제를 처리하여 용해시키고 설폰화(sulfonation)시켜, 분자간 소수성 작용과 잘못된 디설파이드 결합의 형성을 최소화한다. 이후 프로인슐린 융합단백질은 시아노겐 브로마이드(cyanogen bromide, 이하 'CNBr'이라 한다)를 처리하여 전서열 펩티드(leader peptide) 결합부위의 메치오닌(methionine) 잔기를 절단한다. 절단 완료 후 CNBr을 제거하고, 그 결과 얻은 프로인슐린을 분리 정제한 후, 산화ㆍ환원 체계를 이용하여 재접힘한다. 프로인슐린은 트립신(trypsin)과 카복시펩티다제 B(carboxypeptidase B)를 사용하여 A쇄와 B쇄를 연결하고 있는 C쇄를 제거함으로써 활성인슐린으로 전환된다. 인슐린은 이온 교환 크로마토그래피와 역상 고성능 크로마토그래피 등을 거쳐 정제하며, 최종단계에서 아연-결정화에 의해 결정화된다.
상기 방법은 복잡한 정제공정들로 이루어지므로, 프로인슐린 융합단백질의 인슐린 전환수율이 결과적으로 낮아지게 되고, 산업적 생산 측면에서 보면 상당한 비용과 시간이 걸리는 문제가 있다.
또한 상기 방법에 의해 융합단백질의 발현율은 높아질 수 있어도, 재조합 인간 인슐린의 최종수율은 만족할 만한 수준이 되지 못한다(Goeddel DV, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 1979;76:106-10, Talmadge K, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 1980;77:3988-92, Sung WL, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 1986;83:561-5).
또한 산업적 생산 과정에서 유독한 CNBr을 사용하면 독성 물질을 취급하는데 위험이 따르고, 사용된 CNBr을 처리하는데 많은 비용이 소요되는 문제가 있으므로, 전서열 펩티드를 단백질 분해효소에 의해 절단하는 것이 바람직하다.
효소 절단 방법에 있어서는 다음과 같은 방법들이 개발되어 왔다.
Evans 등은 8개의 아미노산으로 구성되고 금속 결합 부위를 포함하는 펩티드와 레닌(renin) 절단 부위를 목적 단백질의 N-말단에 융합시켜, 전서열 펩티드를 분해효소인 레닌으로 절단하는 방법을 사용하였다(Evans DB, et al. Protein Expr Purif. 1991;2:205-13).
Sharma 등은 9개의 아미노산으로 구성되고 연속된 6개의 히스티딘(histidine)을 포함하는 펩티드와 레닌 절단 부위를 전서열 펩티드로 사용하였다(Sharma SK, et al. Biotechnol Appl Biochem. 1991;14:69-81).
인슐린의 생산에 있어서는, 단백질 분해효소에 의해 절단될 수 있는 인식부위를 갖는 프로인슐린 전구체를 대장균 내에서 발현시켜, 내포체를 얻고, 재접힘 과정 등을 거쳐 정제하는 방법이 개발되어 왔다.
그 예로, 미국특허 5126249와 5378613에서는 대장균의 단백질 합성 개시부위인 메치오닌만 남겨두고 메치오닌과 목적 단백질 사이에 단 한 개의 아미노산만 삽입하여, 메치오닌 - 티로신(tyrosine) 또는 아르기닌(arginine) - 프로인슐린 형태의 유전자를 제조하였다. 보통 융합단백질이 아닌 단독 형태의 발현산물들은 발현율이 낮거나 단백질 분해가 쉽게 일어나고 전사 및 번역과정이 손상될 가능성이 있으나, 상기 방법에서는 발현율이 높은 것으로 보고되었다.
그러나 이 방법에서는 단백질 분해효소에 의한 C쇄의 절단 이전에, 프로인슐린 앞의 두 개의 아미노산을 제거하기 위하여 카텝신 C(cathepsin C) 또는 디펩티 딜 아미노펩티다제(dipeptidyl-aminopeptidase)를 별도로 사용해야하므로, 오히려 또 다른 효소 반응 과정이 추가되어 정제 공정이 복잡하다.
다른 예로, 미국특허 5227293과 5358857에서는 단백질 합성 개시부위인 메치오닌, (DCD)x 형태의 짧은 염기서열에 의해 암호화되는 펩티드, 효소 절단 부위, 그리고 프로인슐린 유사체가 순서대로 융합되어 있는 단백질을 미생물에서 발현하였다. 상기 방법에서 사용하는 (DCD) 형태의 염기서열에서 D는 아데닌(adenine), 구아닌(guanine), 또는 티민(thymine)을 의미하고, C는 시토신(cytosine)을 의미하고, x는 4 개에서 12개를 의미하므로, 상기 염기서열이 암호화하는 아미노산은 세린(serine), 스레오닌(threonine), 또는 알라닌(alanine)에만 한정된다. 상기 방법에서는 완전한 프로인슐린을 목적단백질로 사용하지 않고, C쇄가 아르기닌 한 개로 이루어진 "미니-프로인슐린"을 전서열 펩티드와 융합한다.
그러나 상기 방법에서는 트립신과 카복시펩티다제 B를 동시에 사용하여 프로인슐린 융합단백질을 인슐린으로 한번에 전환하는 실시예가 명시되어 있지 않아, 정제 공정의 복잡성을 여전히 해소하지 못하고 있다.
또 다른 방법으로, Chen 등은 대장균 내에서 메치오닌 - 리신(lysine) - 프로인슐린 형태를 발현시킴으로써, 발현율을 향상시키고 정제공정을 단순화하였다(Chen JQ, et al. Appl Biochem Biotechnol. 1995;55:5-15).
그러나, 상기 방법은 메치오닌 - 리신 - 프로인슐린을 트립신과 카복시펩티다제 B로 절단하여 활성인슐린으로 전환할 때, 인슐린 부산물이 다량 생성된다는 문제가 있다(Yang ZH, et al. Appl Biochem Biotechnol. 1999;76:107-14).
대한민국 등록특허 1002029580000에서는 전서열 펩티드 - 프로인슐린 형태를 발현시킴으로써, 재접힘의 효율성 및 효소 절단을 용이하게 하는 방법이 제시되었다. 이 방법에서 전서열 펩티드는 베타갈락토시다제의 N 말단 일부, 6개의 연속된 스레오닌, 리신 또는 아르기닌으로 이루어지는 두 개의 아미노산으로 구성되고, 전체적으로 친수성의 경향을 나타내고 있어서 프로인슐린의 재접힘시 영향을 적게 주며, 단백질 분해효소가 용이하게 인식하여 반응할 수 있게 하였다.
그러나 상기 특허에서는 효소적 절단을 통해 융합단백질을 인간 인슐린으로 전환할 때, 인슐린 부산물의 생성 여부에 대해서 언급되어 있지 않아, 부산물 생성에 대한 문제가 확실히 해결되었다고 보기 힘들다. 실제로 이 방법에 의해 인슐린으로 전환할 때 인슐린 부산물이 다량 생성되는 것으로 나타났다. 또한 융합단백질의 발현율이 높아도 효소적 절단 효율이 낮기 때문에, 후속 공정에서 인슐린과 부산물의 분리가 어려워지므로, 결과적인 인슐린 생산 수율은 낮다.
한편, Jonasson 등은 두 개의 IgG 결합 도메인(IgG binding domain, 이하 'ZZ'라 한다) - 리신 또는 아르기닌 중 하나 이상의 아미노산으로 이루어진 링커(linker) - 프로인슐린의 형태를 발현시켜, 트립신에 의한 효소적 절단을 가능하게 하였다(Jonasson P, et al. Eur J Biochem. 1996;236:656-61). 이 방법에서는 ZZ 전서열 펩티드가 융합된 상태로 프로인슐린의 재접힘이 일어나도록 하고, 트립신과 카복시펩티다제 B에 의해 전서열 펩티드와 프로인슐린의 C쇄가 동시에 절단되도록 하여 효소 처리 공정을 단순화하였다.
그러나 이 방법에서는 ZZ 전서열 펩티드를 구성하는 아미노산의 개수가 프로 인슐린을 구성하는 아미노산의 개수보다 많기 때문에, 발현된 재조합 단백질에서 절반 이상의 폴리펩티드가 정제 공정에서 제거되어야 하므로 상대적인 수율이 낮은 단점이 있다. 또한, 리신-아르기닌 링커를 사용하는 경우에는, 아르기닌이 인슐린 B쇄에 붙은 형태의 부산물이 생성되는 문제가 있었다.
비슷한 예로, 미국특허 6001604에서는 SOD(superoxide dismutase) - 아르기닌 - 프로인슐린 형태의 단백질을 발현시켰다. 이 방법에서 프로인슐린의 C쇄는 하나 또는 두 개의 아미노산으로 구성되어 있으며, SOD 전서열 펩티드가 융합된 상태로 프로인슐린의 재접힘이 일어나고, 트립신과 카복시펩티다제 B에 의해 SOD와 C쇄의 아미노산이 동시에 절단되도록 하였다.
이 방법에서도 전서열 펩티드를 구성하는 아미노산의 개수가 변형된 프로인슐린을 구성하는 아미노산의 개수보다 많다는 문제점이 있다.
미국특허 6068993에서는 11개의 아미노산으로 구성되고 연속된 6개의 히스티딘을 포함하며 C-말단의 아미노산이 아르기닌인 전서열 펩티드와 프로인슐린의 융합단백질을 발현하였다. 이 방법에서 금속 이온 흡착 공정을 수행한 후 재접힘을 거쳐 효소 반응에 의해 융합단백질을 인슐린으로 전환하고 이온 교환 크로마토그래피와 역상 크로마토그래피를 수행하여 인슐린을 정제하였다.
이 방법에서는 재접힘 이전에 니켈-세파로즈(Ni-chelating Sepharose FF) 수지를 사용하는 크로마토그래피와 세파덱스(Sephadex G-25) 수지를 사용하는 완충용액 교환을 수행해야 하므로 정제 공정이 복잡해지는 문제가 있다.
따라서, 단순한 공정을 통해 우수한 수율로 인간 인슐린 단백질을 얻을 수 있게 하는 재조합 플라스미드 및 그 제조 방법에 대한 발명은 여전히 과제로 남아있다.
상기 과제를 달성하기 위해, 본 발명에서는 미생물에서 안정적으로 발현되고, 효소에 의해 선택적으로 절단되는 부위를 포함하며, 발현 대상 단백질로부터 분리하기 쉬운 전서열 펩티드와 프로인슐린 또는 그 유사체의 융합단백질을 발현할 수 있는 재조합 플라스미드를 제공하고자 한다.
또한 본 발명에서는 상기 재조합 플라스미드를 이용하여 간단한 공정으로 프로인슐린 융합단백질을 활성인슐린으로 전환시키고, 부산물 생성을 최소화하면서 동시에 대량생산이 가능한 인슐린 제조 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 인간 인슐린 발현 플라스미드 및 이를 이용한 인슐린의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 플라스미드는 하기 식(Ⅰ)의 화합물을 암호화하는 염기서열을 포함한다.
R-B-X-A(Ⅰ)
상기 식(Ⅰ)에서, R은 하기 일반식(II)와 같은 전서열 펩티드이다.
Met-Thr-Met-Ile-Thr-Y (II)
상기 식(II)에서 Y는 리신, 아르기닌, C-말단의 아미노산이 리신인 펩티드, 또는 C-말단의 아미노산이 아르기닌인 펩티드 중 선택된 하나이다.
상기 식(Ⅰ)에서 B는 인간 인슐린 B쇄 또는 그 유사체이고, X는 B와 A를 연결하는 펩티드이며, A는 인간 인슐린 A쇄 또는 그 유사체이다.
본 발명의 플라스미드에서 식(Ⅰ)의 R은 Y가 리신일 경우 하기 아미노산 서열이 될 수 있다.
서열번호 1: Met-Thr-Met-Ile-Thr-Lys
본 발명의 플라스미드에서 식(Ⅰ)의 R은 Y가 C-말단의 아미노산이 리신인 펩티드일 경우 하기 아미노산 서열이 될 수 있다.
서열번호 2: Met-Thr-Met-Ile-Thr-Asp-Ser-Leu-Ala-Lys
서열번호 3: Met-Thr-Met-Ile-Thr-Asp-Ser-Leu-Ala-Val-Val-Leu-Gln-Lys
서열번호 4: Met-Thr-Met-Ile-Thr-Asp-Ser-Leu-Ala-Val-Val-Leu-Gln-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys
본 발명의 플라스미드에서 식(Ⅰ)의 R은 Y가 아르기닌일 경우 하기 아미노산 서열이 될 수 있다.
서열번호 5: Met-Thr-Met-Ile-Thr-Arg
본 발명의 플라스미드에서 식(Ⅰ)의 R은 Y가 C-말단의 아미노산이 아르기닌인 펩티드일 경우 하기 아미노산 서열이 될 수 있다.
서열번호 6: Met-Thr-Met-Ile-Thr-Asp-Ser-Leu-Ala-Arg
서열번호 7: Met-Thr-Met-Ile-Thr-Asp-Ser-Leu-Ala-Val-Val-Leu-Gln-Arg
서열번호 8: Met-Thr-Met-Ile-Thr-Asp-Ser-Leu-Ala-Val-Val-Leu-Gln-Gly-Ser-Leu-Gln-Arg
본 발명의 플라스미드에서 서열번호 1~8의 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열의 바람직한 예는 각각 다음과 같다.
서열번호 9: ATG ACC ATG ATT ACG AAG
서열번호 10: ATG ACC ATG ATT ACG GAT TCA CTG GCC AAG
서열번호 11: ATG ACC ATG ATT ACG GAT TCA CTG GCC GTC GTT TTA CAA AAG
서열번호 12: ATG ACC ATG ATT ACG GAT TCA CTG GCA GTC GTT TTA CAA GGT TCT CTG CAG AAG
서열번호 13: ATG ACC ATG ATT ACG CGT
서열번호 14: ATG ACC ATG ATT ACG GAT TCA CTG GCC CGT
서열번호 15: ATG ACC ATG ATT ACG GAT TCA CTG GCC GTC GTT TTA CAA CGT
서열번호 16: ATG ACC ATG ATT ACG GAT TCA CTG GCA GTC GTT TTA CAA GGT TCT CTG CAG CGT
본 발명의 전서열 펩티드는 대장균에서 안정적으로 발현되기 때문에, 프로인슐린 또는 그 유사체가 안정적으로 존재하고 발현되도록 돕는 마스크(mask) 기능을 수행한다. 본 발명에서는 짧은 전서열 펩티드를 사용하므로, 발현 대상 단백질이 차지하는 비율이 상대적으로 높고, 융합단백질을 절단하여 발현 대상 단백질을 분 리 정제하기가 용이하다.
또한 본 발명의 전서열 펩티드에서, 그 C-말단에 있는 리신 또는 아르기닌은 트립신에 의해 선택적으로 절단되는 부위를 제공하므로, 기존에 사용되어 온 유독한 CNBr 처리를 하지 않고 효소적 절단 방법만으로 프로인슐린 융합단백질을 활성인슐린으로 전환시키는 것이 가능하다.
본 발명의 플라스미드에서, 상기 서열의 3'-말단 방향에는 프로인슐린 또는 그 유사체(B-X-Y)를 암호화하는 염기서열이 연결된다.
본 발명에서, 프로인슐린 유사체 중 대표적인 것은 B쇄의 28번 및 29번 아미노산의 위치가 서로 바뀌어 발현되는 단백질(이하 'LysB28ProB29 유사체'라 한다)이다. LysB28ProB29 인슐린 유사체는 인간 인슐린과 동등한 효능을 갖고 있으며 피하 주입 자리에서부터 보다 빠르게 흡수되는 특성을 지닌다.
본 발명의 플라스미드 제조시, 프로인슐린 융합단백질을 암호화하는 유전자는 pPRO 플라스미드(대한민국 등록특허 1000766010000)를 제한효소 EcoRI과 BglII로 절단하고 리가제(ligase)로 연결하여 pHHI 플라스미드를 얻고, 이를 주형(template)으로 하여 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 수행함으로써 얻는다.
본 발명에서 사용하는 pHHI 플라스미드는 tac 프로모터(promoter)의 3' 쪽에 28개의 아미노산으로 구성되고 히스티딘 태그(tag)를 포함하는 펩티드, 메치오닌, 그리고 프로인슐린의 순서대로 발현되는 융합단백질의 유전자를 암호화하고 있다.
본 발명의 플라스미드 제조시, 클로닝에 사용되는 발현 벡터(vector)는 대장균 내에서 높은 발현율을 나타내는 벡터라면 모두 사용가능하나, 바람직하게는 강력한 T7 프로모터를 지니는 pET-24a(+)(Novagen, 카탈로그 번호 69749-3) 벡터와 E. coli rrnB P2 프로모터(Lukacsovich T, et al. Gene. 1989;78:189-94) 또는 rac 프로모터(Boros I, et al. Gene. 1986;42:97-100)를 지니는 pHHI 유래 벡터를 사용한다.
본 발명의 플라스미드의 대표적인 예는 pK-BKpi계, pK-BRpi계, pPT-BKpi계, pPT-BRpi계, pPL-BKpi계, pPL-BRpi계, pPLD-BKpi계, pPLD-BRpi계, pPT-BKpiKP계, pPT-BRpiKP계 플라스미드이며, 이들은 벡터, 전서열 펩티드의 종류 및 발현하고자 하는 목적단백질의 종류에 따라 분류된다.
이하 본 발명의 구체적인 상기 플라스미드에 대해, 도면을 참조로 하여 설명한다.
1) pK-BKpi계 및 pK-BRpi계 플라스미드
본 발명의 pK-BKpi계 및 pK-BRpi계 플라스미드는 도 1에 나타난 바와 같이, pHHI 플라스미드를 주형으로 하는 PCR을 통해 프로인슐린 융합단백질 유전자(도 1a)를 얻고, 적절한 제한 효소로 절단된 발현 벡터 pET-24a(+)(도 1b)와 연결시켜 제조한 재조합 플라스미드(도 1c)이다.
본 발명의 pK-BKpi계 플라스미드는 전서열 펩티드의 종류에 따라 pK-B5Kpi, pK-B9Kpi, 및 pK-B13Kpi으로 분류되며, 이들은 각각 서열번호 1, 2 및 3의 전서열 펩티드와 프로인슐린의 융합단백질을 발현한다.
본 발명의 pK-BRpi계 플라스미드는 전서열 펩티드의 종류에 따라 pK-B5Rpi, pK-B9Rpi 및 pK-B13Rpi으로 분류되며, 이들은 각각 서열번호 5, 6 및 7의 전서열 펩티드와 프로인슐린의 융합단백질을 발현한다.
2) pPT-BKpi계 및 pPT-BRpi계 플라스미드
본 발명의 pPT-BKpi계 및 pPT-BRpi계 플라스미드는 우선 pPT 벡터를 제조한 후, 이를 주골격으로 하여 얻은 플라스미드이다.
pPT 벡터는 도 2에 나타난 바와 같이, PCR을 통해 rrnB P2 프로모터(도 2a)를 합성하고, 적절한 제한효소로 pHHI 플라스미드를 절단하여 기존의 tac 프로모터, 전서열 펩티드 및 프로인슐린을 제거한 벡터(도 2b)와 연결시켜 제조한 재조합 벡터(도 2c)이다.
본 발명의 pPT-BKpi계 및 pPT-BRpi계 플라스미드는 도 3에 나타난 바와 같이, pHHI 플라스미드를 주형으로 하는 PCR을 통해 프로인슐린 융합단백질 유전자(도 3a)를 얻고, 적절한 제한 효소로 절단한 발현 벡터 pPT(도 3b)와 연결시켜 제조한 재조합 플라스미드(도 3c)이다.
본 발명의 pPT-BKpi계 플라스미드는 전서열 펩티드의 종류에 따라 pPT-B5Kpi, pPT-B9Kpi 및 pPT-B13Kpi으로 분류되며, 이들은 각각 서열번호 1, 2 및 3의 전서열 펩티드와 프로인슐린의 융합단백질을 발현한다.
본 발명의 pPT-BRpi계 플라스미드는 전서열 펩티드의 종류에 따라 pPT- B5Rpi, pPT-B9Rpi 및 pPT-B13Rpi으로 분류되며, 이들은 각각 서열번호 5, 6 및 7의 전서열 펩티드와 프로인슐린의 융합단백질을 발현한다.
3) pPT-17Kpi 및 pPT-17Rpi 플라스미드
본 발명의 pPT-17Kpi 및 pPT-17Rpi 플라스미드는 pHHI 플라스미드를 주형으로 하는 PCR을 통해 프로인슐린 융합단백질 유전자를 얻고, 적절한 제한 효소로 절단한 발현 벡터 pPT와 연결시켜 제조한 재조합 플라스미드이다.
본 발명의 pPT-17Kpi 플라스미드는 서열번호 4의 전서열 펩티드와 프로인슐린의 융합단백질을 발현한다.
본 발명의 pPT-17Rpi 플라스미드는 서열번호 8의 전서열 펩티드와 프로인슐린의 융합단백질을 발현한다.
4) pPL-BKpi계, pPL-BRpi계, pPLD-BKpi계 및 pPLD-BRpi계 플라스미드
본 발명의 pPL-BKpi계, pPL-BRpi계, pPLD-BKpi계 및 pPLD-BRpi계 플라스미드는 도 4에 나타난 바와 같이, pPT-BKpi계 또는 pPT-BRpi계 플라스미드를 주형으로 하는 PCR을 통해 rac 프로모터(도 4a)를 얻고, 적절한 제한 효소로 절단하여 P2 프로모터를 제거한 pPT-BKpi계 또는 pPT-BRpi계 플라스미드(도 4b)와 연결시켜 제조한 재조합 플라스미드(도 4c)이다.
본 발명의 pPL-BKpi계 플라스미드는 전서열 펩티드의 종류에 따라 pPL-B5Kpi, pPL-B9Kpi 및 pPL-B13Kpi으로 분류되며, 이들은 각각 서열번호 1, 2 및 3의 전서열 펩티드와 프로인슐린의 융합단백질을 발현한다.
본 발명의 pPL-BRpi계 플라스미드는 전서열 펩티드의 종류에 따라 pPL-B5Rpi, pPL-B9Rpi 및 pPL-B13Rpi으로 분류되며, 이들은 각각 서열번호 5, 6 및 7의 전서열 펩티드와 프로인슐린의 융합단백질을 발현한다.
본 발명의 pPLD-BKpi계 플라스미드는 전서열 펩티드의 종류에 따라 pPLD-B5Kpi, pPLD-B9Kpi 및 pPLD-B13Kpi으로 분류되며, 이들은 각각 서열번호 1, 2 및 3의 전서열 펩티드와 프로인슐린의 융합단백질을 발현한다.
본 발명의 pPLD-BRpi계 플라스미드는 전서열 펩티드의 종류에 따라 pPLD-B5Rpi, pPLD-B9Rpi 및 pPLD-B13Rpi으로 분류되며, 이들은 각각 서열번호 5, 6 및 7의 전서열 펩티드와 프로인슐린의 융합단백질을 발현한다.
5) pPT-BKpiKP계 및 pPT-BRpiKP계 플라스미드
본 발명의 pPT-BKpiKP계 및 pPT-BRpiKP계 플라스미드는 PCR에 의한 국소 돌연변이 유도(site-directed mutagenesis)에 의해 pPT-BKpi계 및 pPT-BRpi계 플라스미드로부터 원하는 LysB28ProB29 유사체 융합단백질 유전자를 얻고, 적절한 제한 효소로 절단된 pHHI 플라스미드와 연결시켜 제조한다.
본 발명의 pPT-BKpiKP계 플라스미드는 전서열 펩티드의 종류에 따라 pPT-B5KpiKP, pPT-B9KpiKP 및 pPT-B13KpiKP로 분류되며, 이들은 각각 서열번호 1, 2 및 3의 전서열 펩티드와 LysB28ProB29 유사체의 융합단백질을 발현한다.
본 발명의 pPT-BRpiKP계 플라스미드는 전서열 펩티드의 종류에 따라 pPT-B5RpiKP, pPT-B9RpiKP 및 pPT-B13RpiKP로 분류되며, 이들은 각각 서열번호 5, 6 및 7의 전서열 펩티드와 LysB28ProB29 유사체의 융합단백질을 발현한다.
상기와 같이 제조되는 본 발명의 플라스미드가 각각 지니는 전서열 펩티드의 구조는 도 5에 나타나 있다.
본 발명의 플라스미드는, 프로인슐린 융합단백질을 안정적으로 발현하고, 활성인슐린으로의 전환을 위한 효소적 절단이 간단하며, 또한 효소적 절단과정에서 부산물의 생성이 매우 적다.
상기 요건들을 종합하여 볼 때, 본 발명의 플라스미드는 결과적으로 높은 수율의 인슐린 생산을 가능하게 한다.
본 발명의 플라스미드를 이용한 인슐린의 제조 방법은 (a) 본 발명의 플라스미드를 함유하는 미생물로부터 상기 일반식 (I)의 화합물의 발현을 유도하는 단계, (b) 세포파쇄 및 용해단계, (c) 재접힘 단계, (d) 효소반응에 의한 R과 X의 동시절단단계, (e) 크로마토그래피에 의한 활성인슐린의 정제단계로 이루어진다.
(a) 단계에서는 우선 본 발명의 플라스미드를 이용하여 적절한 미생물을 형질전환시킨다. 본 발명에서 형질전환에 사용가능한 균주는 pK-B5Kpi 플라스미드의 경우 대장균 BL21(DE3)를, pPT-B5Kpi 플라스미드의 경우 대장균 JM109를 사용하는 것이 바람직하다.
형질전환된 미생물을 대량으로 고밀도 세포 배양(high cell density culture, HCDC)하기 위해, 유가식 배양(fed batch fermentation)을 실시한다. 배양 조건은 37℃의 온도, 30%의 용존산소, 1VVM의 통기속도 및 pH 6.8∼7.0이 유지되도록 하며, 적절한 농도로 균이 증식하면 IPTG(Isopropyl β-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 단백질 발현을 유도한다.
(b) 단계에서는 상기와 같이 배양하여 얻은 균체를 완충용액에서 현탁시킨 후, 파쇄 및 원심분리하여 내포체를 분리하고 세척하여 요소 용액에서 용해시킨다.
이 단계에서는 내포체를 세척한 후 용해시키기 전에, 필요에 따라 설폰화를 시행할 수도 있다. 이 경우 내포체를 설폰화시켜 프로인슐린 S-설포네이트 형태의 융합단백질을 얻은 후, 원심분리하여 침전물을 제거한다.
(c) 단계에서는 그 결과 얻는 상등액을 정제수로 희석한 후 탈기 밀봉하고, 별도 용기에 담긴 글리신 완충용액에 베타머캅토에탄올을 첨가하고 밀봉한 후, 두 용액을 신속하게 혼합함으로써 단백질의 재접힘을 실시한다.
(d) 단계에서는 트립신과 카복시펩티다제 B를 사용하여 재접힘된 프로인슐린 융합단백질로부터 전서열 펩티드와 C쇄를 동시에 제거함으로써, 활성인슐린으로 전환시킨다.
상기 단계에서 최적 반응 조건은 반응 pH 7∼8, 반응 온도 4℃∼28℃, 단백질 1mg당 트립신 효소량 0.1u∼0.5u, 단백질 1mg당 카복시펩티다제 B 효소량 0.1u∼0.3u, 반응시간 12시간∼24시간이다.
또한 상기 단계에서는 필요에 따라 적절한 수지상에 고정화된 효소들을 사용 할 수 있으며, 이 경우 고정화 트립신과 고정화 카복시펩티다제 B를 함께 사용한다.
(e) 단계에서는 이온 교환 수지와 역상 고압 액체 크로마토그래피를 이용하여 활성인슐린을 최종 정제한다.
본 발명의 플라스미드를 이용한 인슐린 생산 방법은, 재접힘을 위해 기존에 수행되어 온 크로마토그래피 공정 없이 설폰화 프로인슐린 용액과 글리신 완충용액을 신속하게 혼합하여 직접 재접힘이 일어나도록 하므로, 유기용매 및 수지세척용액 사용으로 인한 폐수발생 문제를 해결하고, 단순한 과정에 의해 재접힘 효율을 향상시킨다.
또한 본 발명의 플라스미드를 이용한 인슐린 생산 방법은, 본 발명의 플라스미드의 구조적 특성상 프로인슐린 융합단백질로부터 활성인슐린으로의 전환을 단일 과정으로 단순화하므로, 공정의 효율을 높이는 한편 기존에 사용되어 온 유독한 개미산(formic acid)이나 CNBr의 사용 및 처리 문제를 해결하여 환경친화적인 공정을 제공한다. 또한 활성인슐린으로의 전환 과정 후 부산물의 생성이 최소화되어 결과적인 인슐린 수득률을 최대화한다.
따라서, 본 발명의 플라스미드 및 이를 이용한 인슐린 생산 방법을 인간 인슐린의 산업적 대량 생산에 적용하면, 인슐린을 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물의 제조를 비롯한 당뇨병 치료 등, 인슐린을 필요로 하는 다양한 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통해 보다 상세히 설명하되, 하기 실시예에 의해 본 발명의 범위가 국한되는 것은 아니다.
[실시예 1] 본 발명의 pK-BKpi계 및 pK-BRpi계 플라스미드의 제조
본 발명의 pK-BKpi 계 및 pK-BRpi 계 플라스미드를 다음과 같이 제조하였다.
1) 프로인슐린 융합단백질 유전자의 제조
발현 벡터에 삽입할 프로인슐린 융합단백질 유전자를 제조하기 위해, 프로인슐린 융합단백질의 발현 플라스미드인 pHHI를 주형으로 사용하여 PCR을 수행하였다.
이때 사용된 프라이머(primer) 중 정방향 프라이머는, NdeI 제한효소 인식부위, 서열번호 1, 2, 3, 5, 6 또는 7의 전서열 펩티드를 암호화하는 염기서열, 그리고 인슐린 B쇄의 N-말단 일부를 암호화하는 염기서열을 순서대로 포함하도록 제작하였으며(서열번호 1의 전서열 펩티드: 서열번호 17, 서열번호 2의 전서열 펩티드: 서열번호 18, 서열번호 3의 전서열 펩티드: 서열번호 19, 서열번호 5의 전서열 펩티드: 서열번호 20, 서열번호 6의 전서열 펩티드: 서열번호 21, 서열번호 7의 전서열 펩티드: 서열번호 22), 역방향 프라이머는 XhoI 제한효소 인식부위를 포함하도록 제작하였다(서열번호 23). 각 프라이머의 염기서열은 다음과 같다.
서열번호 17: 5'- CAC CAG CAT ATG ACC ATG ATT ACG AAG TTT GTG AAC CAA CAC CTG T -3'
서열번호 18: 5'- CAC CAG CAT ATG ACC ATG ATT ACG GAT TCA CTG GCC AAG TTT GTG AAC CAA CAC CTG TGC -3'
서열번호 19: 5'- CAC CAG CAT ATG ACC ATG ATT ACG GAT TCA CTG GCC GTC GTT TTA CAA AAG TTT GTG AAC CAA CAC CTG TGC -3'
서열번호 20: 5'- CAC CAG CAT ATG ACC ATG ATT ACG CGT TTT GTG AAC CAA CAC CTG T -3'
서열번호 21: 5'- CAC CAG CAT ATG ACC ATG ATT ACG GAT TCA CTG GCC CGT TTT GTG AAC CAA CAC CTG TGC -3'
서열번호 22: 5'- CAC CAG CAT ATG ACC ATG ATT ACG GAT TCA CTG GCC GTC GTT TTA CAA CGT TTT GTG AAC CAA CAC CTG TGC -3'
서열번호 23: 5'- GCA TGC CTC GAG GTC GAC TCT AGA -3'
PCR에서 변성반응은 94℃에서 30초 동안, 결합반응은 55℃에서 30초 동안, 그리고 중합반응은 72℃에서 25초 동안 수행하였으며, 상기 과정을 30회 반복 실시하였다. PCR을 통해 얻은 DNA를 제한효소 NdeI(Takara, Japan)과 XhoI(Gibco, U.S.)으로 절단한 후, 1% 아가로스 겔(agarose gel) 상에서 전기영동하여 0.3 kbp의 유전자 절편을 분리하였다.
2) 발현 벡터 준비
발현 벡터로 pET-24a(+) 벡터를 사용하여, 상기 벡터를 제한효소 NdeI과 XhoI으로 절단한 후, 1% 아가로스 겔 상에서 전기영동하여 5.2Kb의 DNA 절편을 분리하였다.
3) 클로닝
상기와 같이 얻은 두 개의 DNA 절편을, T4 DNA 리가제(Takara, Japan)를 사 용하여 연결함으로써 플라스미드를 제조한 후, 각 플라스미드를 이용하여 염화칼슘법으로 대장균 BL21(DE3)를 형질전환시켰다. 카나마이신에 저항성을 지닌 형질전환된 균주를 선별하고 플라스미드 DNA를 분리하여, 제한효소 절단에 의한 분석방법으로 원하는 DNA가 제대로 삽입되었는지를 확인하였다.
본 발명의 플라스미드 중 pK-B5Kpi는 2002년 11월 4일 생명공학연구소 유전자은행에 기탁번호 KCTC 10363BP로 기탁되었다.
[실시예 2] 본 발명의 pPT-BKpi계 및 pPT-BRpi계 플라스미드의 제조
본 발명의 pPT-BKpi계 및 pPT-BRpi계 플라스미드를 다음과 같이 제조하였다.
1) 프로모터의 제조
벡터에 삽입할 P2 프로모터, lac 오퍼레이터(operator), T7 리보솜 결합부위(ribosome binding site), 그리고 제한효소 절단부위를 제조하기 위해, 이들의 염기서열을 부분적으로 포함하고 있는 프라이머 3개를 사용하여 PCR을 수행하였다.
첫번째 프라이머는 정방향으로, EcoRI 제한효소 인식부위와 P2 프로모터의 상위(upstream) 부분을 포함하도록 제작하였고(서열번호 24), 두번째 프라이머는 역방향으로, P2 프로모터의 -35 부위, -10 부위, 그리고 lac 오퍼레이터를 순서대로 포함하도록 제작하였으며(서열번호 25), 세번째 프라이머는 역방향으로, T7 리보솜 결합부위와 NdeI, KpnI, XhoI, SalI, HindIII 제한효소 절단부위를 순서대로 포함하도록 제작하였다(서열번호 26).
첫번째 프라이머의 3' 말단과 두번째 프라이머의 3' 말단은 18개의 염기가 상보적이며, 두번째 프라이머의 5' 말단과 세번째 프라이머의 3' 말단은 18개의 염기가 동일하므로 PCR에 의해 세 개의 프라이머를 연결할 수 있다. 상기 프라이머의 염기서열은 다음과 같다.
서열번호 24: 5'- CAT GTT GAA TTC TGC GCC ACC ACT GAC ACG GAC AAC GGC AAA CAC GCC GCC GGG TCA GCG GGG TTC TCC TGA GAA CTC CGG CAG AGA AAG C -3'
서열번호 25: 5'- TGT TTC CTG TGT GAA ATT GTT ATC CGC TCA CAA TTC CAT AAT ACG CCT TCC CGC TAC AGA GTC AAG CAT TTA TTT TTG CTT TCT CTG CCG GAG TTC -3'
서열번호 26: 5'- ACA GCC AAG CTT GTC GAC TCG AGG TAC CGA CAT ATG TAT ATC TCC TTC TTA AAG TTA AAC AAA ATT ATT TCT AGA AGC TGT TTC CTG TGT GAA ATT -3'
PCR에서 변성반응은 94℃에서 30초 동안, 결합반응은 55℃에서 30초 동안, 그리고 중합반응은 72℃에서 20초 동안 수행하였으며, 상기 과정을 30회 반복 실시하였다.
2) pPT 벡터의 제조
PCR에 의해 증폭한 프로모터 DNA를 제한효소 EcoRI(Takara, Japan)과 HindIII(Gibco, U.S.)로 절단한 후, 1% 아가로스 겔 상에서 전기영동하여 0.2 kbp의 DNA 절편을 분리하였다.
pHHI 플라스미드를 제한효소 EcoRI과 HindIII로 절단한 후, 1% 아가로스 겔 상에서 전기영동하여 tac 프로모터 및 프로인슐린 융합유전자가 제거된 3.1 kbp의 DNA 절편을 분리하였다.
상기와 같이 얻은 두 개의 DNA 절편을, T4 DNA 리가제를 사용하여 연결함으로써 벡터를 제조한 후, 염화칼슘법으로 대장균 JM109를 형질전환시켰다. 앰피실린에 저항성을 지닌 형질전환된 균주를 선별하고 벡터 DNA를 분리하여, 제한효소 절단에 의한 분석방법으로 원하는 DNA가 제대로 삽입되었는지를 확인하였다.
3) pPT-BKpi계 및 pPT-BRpi계 플라스미드의 제조
pK-BKpi계 및 pK-BRpi계 플라스미드를 제조할 때와 같은 방법으로, pHHI 플라스미드로부터 프로인슐린 융합단백질 유전자를 PCR에 의해서 얻고, 제한효소 NdeI과 XhoI으로 절단한 후, 1% 아가로스 겔 상에서 전기영동하여 0.3 kbp의 유전자 절편을 분리하였다.
pPT 벡터를 제한효소 NdeI과 XhoI으로 절단한 후, 1% 아가로스 겔 상에서 전기영동하여 3.2 kbp의 DNA 절편을 분리하였다.
상기와 같이 얻은 두 개의 DNA 절편을, T4 DNA 리가제를 사용하여 연결함으로써 플라스미드를 제조한 후, 염화칼슘법으로 대장균 JM109를 형질전환시켰다. 앰피실린에 저항성을 지닌 형질전환된 균주를 선별하고 플라스미드 DNA를 분리하여, 제한효소 절단에 의한 분석방법으로 원하는 DNA가 제대로 삽입되었는지를 확인하였다.
[실시예 3] 본 발명의 pPT-17Kpi 및 pPT-17Rpi 플라스미드의 제조
본 발명의 pPT-17Kpi 및 pPT-17Rpi 플라스미드를 다음과 같이 제조하였다.
1) 프로인슐린 융합단백질 유전자의 제조
발현 벡터에 삽입할 프로인슐린 융합단백질 유전자를 제조하기 위해, 프로인슐린 융합단백질의 발현 플라스미드인 pHHI를 주형으로 사용하여 PCR을 수행하였다.
이때 사용된 프라이머(primer) 중 정방향 프라이머는 NdeI 제한효소 인식부위, 서열번호 4 또는 8의 전서열 펩티드를 암호화하는 염기서열, 그리고 B쇄 N-말단의 일부를 암호화하는 염기서열을 순서대로 포함하도록 제작하였으며(서열번호 4의 전서열 펩티드: 서열번호 27, 서열번호 8의 전서열 펩티드: 서열번호 28), 역방향 프라이머는 XhoI 제한효소 인식부위를 포함하도록 제작하였다(서열번호 23). 각 프라이머의 염기서열은 다음과 같다.
서열번호 27: 5'- GAA ACA CAT ATG ACC ATG ATT ACG GAT TCA CTG GCA GTC GTT TTA CAA GGT TCT CTG CAG AAG TTT GTG AAC CAA CAC CTG TG -3'
서열번호 28: 5'- GAA ACA CAT ATG ACC ATG ATT ACG GAT TCA CTG GCA GTC GTT TTA CAA GGT TCT CTG CAG CGT TTT GTG AAC CAA CAC CTG TG -3'
PCR에서 변성반응은 94℃에서 30초 동안, 결합반응은 55℃에서 30초 동안, 그리고 중합반응은 72℃에서 25초 동안 수행하였으며, 상기 과정을 30회 반복 실시하였다. PCR을 통해 얻은 DNA를 제한효소 NdeI과 XhoI으로 절단한 후, 1% 아가로스 겔(agarose gel) 상에서 전기영동하여 0.3 kbp의 유전자 절편을 분리하였다.
2) 발현 벡터 준비
발현 벡터로 pPT 벡터를 사용하여, 상기 벡터를 제한효소 NdeI과 XhoI으로 절단한 후, 1% 아가로스 겔 상에서 전기영동하여 3.2Kb의 DNA 절편을 분리하였다.
3) 클로닝
상기와 같이 얻은 두 개의 DNA 절편을, T4 DNA 리가제를 사용하여 연결함으로써 플라스미드를 제조한 후, 각 플라스미드를 이용하여 염화칼슘법으로 대장균 JM109를 형질전환시켰다. 앰피실린에 저항성을 지닌 형질전환된 균주를 선별하고 플라스미드 DNA를 분리하여, 제한효소 절단에 의한 분석방법으로 원하는 DNA가 제대로 삽입되었는지를 확인하였다.
[실시예 4] 본 발명의 pPL-BKpi계, pPL-BRpi계, pPLD-BKpi계 및 pPLD-BRpi계 플라스미드의 제조
본 발명의 pPL-BKpi계, pPL-BRpi계, pPLD-BKpi계 및 pPLD-BRpi계 플라스미드를 다음과 같이 제조하였다.
1) 프로모터의 제조
플라스미드에 삽입할 rac 프로모터, lac 오퍼레이터, T7 리보솜 결합부위, 그리고 제한효소 절단부위를 제조하기 위해, pPT-B5Kpi 플라스미드를 주형으로 사용하여 PCR을 수행하였다.
이때 사용한 3개의 프라이머 중 첫번째 것은 정방향으로, pPT-B5Kpi 플라스미드의 EcoRI 제한효소 인식부위에서 상위 방향으로 약 60 bp 떨어진 부위에 상보적이고(서열번호 29), 두번째 프라이머는 역방향으로, P2 프로모터의 -35 부위, lac 프로모터의 -10 부위, 그리고 lac 오퍼레이터의 일부를 순서대로 포함하도록 제작하였으며(pPL 벡터: 서열번호 30, pPLD 벡터: 서열번호 31), 세번째 프라이머는 역방향으로, lac 오퍼레이터, T7 리보솜 결합부위와 NdeI 제한효소 절단부위를 순서대로 포함하도록 제작하였다(서열번호 32). 두번째 프라이머의 5' 말단과 세번째 프라이머의 3' 말단은 18개의 염기가 동일하다. 상기 프라이머의 염기서열은 다음과 같다.
서열번호 29: 5'- AGT AAG GCA ACC CCG CCA GC -3'
서열번호 30: 5'- TTA TCC GCT CAC AAT TCC ACA CAA CAT ACG AGC CTT CCC GCT ACA GAG T -3'
서열번호 31: 5'- TTA TCC GCT CAC AAT TCC AAC ATA CGA GCC TTC CCG CTA CAG AGT -3'
서열번호 32: 5'- TAC CGA CAT ATG TAT ATC TCC TTC TTA AAG TTA AAC AAA ATT ATT TCT AGA GGG AAA TTG TTA TCC GCT CAC AAT TCC -3'
PCR에서 변성반응은 94℃에서 30초 동안, 결합반응은 55℃에서 30초 동안, 그리고 중합반응은 72℃에서 20초 동안 수행하였으며, 상기 과정을 30회 반복 실시하였다.
2) pPL-BKpi계, pPL-BRpi계, pPLD-BKpi계 및 pPLD-BRpi계 플라스미드의 제조
PCR에 의해 증폭한 프로모터 DNA를 각각 제한효소 EcoRI과 NdeI으로 절단한 후, 1% 아가로스 겔 상에서 전기영동하여 0.2 kbp의 DNA 절편을 분리하였다.
pPT-BKpi계 또는 pPT-BRpi계 플라스미드를 제한효소 EcoRI과 NdeI으로 절단 한 후, 1% 아가로스 겔 상에서 전기영동하여 P2 프로모터가 제거된 3.4 kbp의 DNA 절편을 분리하였다.
상기와 같이 얻은 프로모터와 플라스미드 DNA 절편을, T4 DNA 리가제를 사용하여 연결함으로써 플라스미드를 제조한 후, 염화칼슘법으로 대장균 JM109를 형질전환시켰다. 앰피실린에 저항성을 지닌 형질전환된 균주를 선별하고 플라스미드 DNA를 분리하여, 제한효소 절단에 의한 분석방법으로 원하는 DNA가 제대로 삽입되었는지를 확인하였다.
[실시예 5] 본 발명의 pPT-BKpiKP계 및 pPT-BRpiKP계 플라스미드의 제조
본 발명의 pPT-BKpiKP계 및 pPT-BRpiKP계 플라스미드를 다음과 같이 제조하였다.
1) 프로인슐린 유사체 융합단백질 유전자의 제조
프로인슐린 유사체 융합단백질의 유전자를 얻기 위해, pPT-BKpi계 또는 pPT-BRpi계 플라스미드를 주형으로 하여 PCR에 의한 국소 돌연변이 유발을 수행하여 프로인슐린 B쇄의 28번 및 29번 아미노산을 역전시켰다.
PCR에 의해 P2 프로모터와, 서열번호 1, 2, 3, 5, 6 또는 7의 전서열 펩티드, B쇄, 그리고 C쇄의 N-말단 일부를 암호화하는 유전자를 증폭하였다.
이때 사용한 프라이머 중 첫번째 것은 정방향으로, pPT-BKpi계 또는 pPT-BRpi계 플라스미드의 EcoRI 제한효소 인식부위에서 상위 방향으로 약 60 bp 떨어진 부위에 상보적이고(서열번호 29), 두번째 프라이머는 역방향으로, B쇄의 28번 및 29번 아미노산을 역전시키는 염기서열을 포함하도록 제작하였다(서열번호 33). 상기 프라이머의 염기서열은 다음과 같다.
서열번호 33: 5'- CTC CCG GCG GGT GGG CTT TGT GTA GAA GAA GCC -3'
PCR에 의해 B쇄의 C-말단 일부, C쇄, 그리고 A쇄를 암호화하는 유전자를 증폭하였으며, 이때 사용한 프라이머 중 첫번째 것은 정방향으로, B쇄의 28번 및 29번 아미노산을 역전시키는 염기서열을 포함하고, 서열번호 25의 프라이머와 상보적이며(서열번호 34), 두번째 프라이머는 역방향으로, pPT-BKpi계 또는 pPT-BRpi계 플라스미드의 HindIII 제한효소 인식부위에서 downstream 방향으로 약 80 bp 떨어진 부위에 상보적이다(서열번호 35). 상기 프라이머의 염기서열은 다음과 같다.
서열번호 34: 5'- GGC TTC TTC TAC ACA AAG CCC ACC CGC CGG GAG -3'
서열번호 35: 5'- CTG CCG CCA GGC AAA TTC TG -3'
상기와 같이 얻은 두 개의 DNA절편은 B쇄의 C-말단 일부와 C쇄의 N-말단 일부를 암호화하는 동일한 염기서열을 가지고 있으므로, 서열번호 29과 서열번호 35의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 P2 프로모터에서 A쇄까지 포함하도록 DNA를 연결시켰다. 그 결과, P2 프로모터와, 서열번호 1, 2, 3, 5, 6 또는 7의 전서열 펩티드 및 프로인슐린의 B28과 B29의 아미노산 서열이 역전된 프로인슐린 유사체를 암호화하는 유전자가 연결된 DNA를 얻었다.
상기 DNA를 제한효소 EcoRI과 HindIII로 절단한 후, 1% 아가로스 겔 상에서 전기영동하여 0.5 kbp의 유전자 절편을 분리하였다.
2) 발현 벡터 준비
pHHI 플라스미드를 제한효소 EcoRI과 HindIII로 절단한 후, 1% 아가로스 겔 상에서 전기영동하여 tac 프로모터 및 프로인슐린 융합유전자가 제거된 3.1 kbp의 DNA 절편을 분리하였다.
3) 클로닝
상기와 같이 얻은 두 개의 DNA 절편을, T4 DNA 리가제를 사용하여 연결함으로써 플라스미드를 제조한 후, 염화칼슘법으로 대장균 JM109를 형질전환시켰다. 앰피실린에 저항성을 지닌 형질전환된 균주를 선별하고 플라스미드 DNA를 분리하여, 제한효소 절단에 의한 분석방법으로 원하는 DNA가 제대로 삽입되었는지를 확인하였다.
[실험예 1] 본 발명의 플라스미드를 이용한 프로인슐린 융합단백질의 발현율 확인
본 발명의 플라스미드를 이용한 프로인슐린 융합단백질의 발현을 다음과 같이 확인하였다.
실시예 1, 2, 4에서 제조한 본 발명의 pK-BKpi계, pPT-B5Kpi, pPL-B5Kpi, pPLD-B5Kpi 플라스미드로 각각 형질전환한 대장균을 준비하였다. 이때 대조군으로 기존에 사용되어 온 인슐린 발현 플라스미드의 한 종류인 메치오닌-리신-프로인슐린 발현 플라스미드(Jin 등, 1995)에 의해 형질전환한 대장균 BL21(DE3)도 함께 준비하여, 다음과 같이 유가식 배양하였다.
-70℃에서 20% 글리세롤에 보관 중인 균주를 약 30℃ 정제수에서 급속히 해동시킨 후, 600㎖의 LB(Luria-Bertani) 배지를 넣은 7ℓ부피의 둥근 플라스크에 접종하고, 37℃, 250rpm의 조건에서 7시간 동안 배양하여 종균 배양을 수행하였다.
종균 배양액을 포도당 함유 배지 140ℓ가 들어있는 300ℓ 발효조(B. Braun, Biostat D-300, Germany)에 접종하여, 37℃, pH 6.8∼7.0, 용존산소 30%가 유지되도록 하면서 200∼500rpm, 통기속도 1VVM의 조건으로 배양을 실시하였다.
유가식 배양에 사용되는 발효배지의 조성은 하기 표 1과 같다.
성분 초기 배지(g/ℓ) 공급 배지(g/ℓ)
Na2HPO4 8 ㆍ
KH2PO4 4 ㆍ
MgSO4ㆍ7H2O 2 10
포도당 6 400
이스트 엑기스 4 100
카나마이신(*) 0.02 ㆍ
미량원소(trace elements) 미량 미량
(*); 대장균 JM109/pPT-B5Kpi의 배지 조성에서는 앰피실린을 사용
초기 배지의 포도당 농도가 0.1% 이하로 급격히 낮아지면, 포도당 농도가 0.01% 이하에서 유지되도록 포도당을 공급하여 균체의 성장을 지속시켰다. 600㎚에서의 흡광도가 약 60에 이르면, 0.5mM IPTG를 첨가하여 단백질 발현을 유도한 후, 균체를 얻고 프로인슐린 융합단백질의 발현 정도를 측정하였다(도 4).
도 6에 나타난 바와 같이, 본 발명의 pK-BKpi계 플라스미드(2열: pK-B5Kpi, 3열: pK-B9Kpi, 4열: pK-B13Kpi)는 높은 프로인슐린 융합단백질 발현율을 나타내는 것으로 공지된 기존의 발현물, 즉 메치오닌-리신-프로인슐린(1열)과 비슷한 정도의 높은 단백질 발현율을 나타냈다. 그리고, 도 7에 나타난 바와 같이 본 발명의 P2 또는 rac 프로모터를 가지고 있는 플라스미드(2열: pPT-B5Kpi, 3열: pPL-B5Kpi, 4열: pPLD-B5Kpi)는 T7 프로모터를 가지고 있는 pK-B5Kpi 플라스미드(1열)와 유사한 목적단백질 발현율을 나타냈다.
따라서, 본 발명의 플라스미드는 높은 발현율로 프로인슐린 융합단백질을 발현할 수 있음을 알 수 있다.
[실험예 2] 본 발명의 플라스미드를 이용한 인슐린 제조시, 부산물의 생성 정도 확인
본 발명의 플라스미드를 이용한 인슐린 제조시, 부산물의 생성 정도를 다음과 같이 확인하였다.
1) 본 발명의 플라스미드로 형질전환된 대장균의 유가식 배양
본 발명의 pK-B5Kpi 플라스미드로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)(이하 'BL21(DE3)/pK-B5Kpi'라 한다) 및 pPT-17Kpi로 형질전환된 대장균 JM109(이하 'JM109/pPT-17Kpi'라 한다)에 대해, 상기 실험예 1과 마찬가지의 방법에 따라 유가식 배양을 수행하였다. 메치오닌-리신-프로인슐린 융합단백질을 발현하는 대장균의 준비 및 배양도 마찬가지의 방법에 따라 수행하였다.
각각에 대해 균체를 얻고 프로인슐린 융합단백질의 발현 정도를 측정한 결과는 다음과 같다(표 2).
대장균/플라스미드 발현유도시 흡광도(600㎚) 최종균흡광도 (600㎚) 건조균체중량 (g/ℓ) 발현율 (%)
BL21(DE3)/pK-B1Kpi 60 106 33 38
BL21(DE3)/pK-B5Kpi 60 109 33 35
JM109/pPT-17Kpi 60 106 32 30
표 2에 나타난 바와 같이, 본 발명의 플라스미드로 형질전환된 균주들은 높은 프로인슐린 융합단백질 발현율을 나타내었다.
2) 프로인슐린 융합단백질의 정제 및 설폰화
배양된 균체에 완충용액(10% 수크로스, 0.1M 트리스, 50mM EDTA, 0.2M 염화나트륨, pH 7.9)을 첨가하고, 균질분쇄기(Rannie, 14.56VH, Denmark)를 이용하여 약 13,000∼14,000psi의 압력 하에서 파쇄를 실시하였다.
파쇄된 세포는 연속식 원심분리기(Tomo-e, AS-46NF, Japan)로 10,000rpm에서 원심분리하고, 용해성 단백질과 일부 세포파편을 제거하여, 내포체가 포함된 침전물을 분리하였다.
분리된 내포체는, 2% Triton X-100 및 1M 요소를 함유하는 용액을 이용하여 세척한 후, 10,000rpm에서 원심분리하여 침전물을 얻었다.
정제된 내포체의 함수 중량의 15배 부피의, 8M 요소, 20mM 트리스 및 1mM EDTA를 함유하는 pH 9.0 용액을 이용하여 내포체를 용해시킨 후, 아황산나트륨(sodium sulfite)과 사티온산나트륨(sodium tetrathionate)을 최종 농도가 각각 0.2∼0.4M과 20∼100mM이 되도록 첨가하였다. 이때 각각의 첨가량은 0.2M과 20mM이 되도록 하는 것이 바람직하다.
상기 용액을 4℃에서 12시간 동안 교반하여 프로인슐린 융합단백질의 시스테인 잔기들을 설폰화시키고, 12000rpm에서 원심분리하여 불용해성 침전물을 제거하였다.
3) 설폰화된 프로인슐린 융합단백질의 직접 재접힘
설폰화된 프로인슐린 융합단백질을 함유하는 원심분리 상등액을 최종 단백질 농도가 1㎎/㎖이 되도록 정제수로 희석시킨 후, 질소가스를 주입하여 탈기하고 밀봉하였다.
또다른 용기에는 상기와 같은 양의 글리신 완충용액(0.6M 요소, 50mM 글리신, pH 10.6)에, 인슐린 시스테인 잔기의 1.5 당량비가 되도록 베타-머캅토에탄올을 첨가하고 질소가스를 주입하여 탈기하고 밀봉하였다.
상기 두 용액을 1 : 1의 부피비로 신속하게 혼합하여, 10℃에서 18시간 동안 반응시켜 재접힘 과정을 수행하였다.
본 발명의 인슐린 제조 방법에 따른 직접 재접힘의 수율 및 재접힘된 프로인슐린 융합단백질의 효율을 확인하기 위해, 상기에서 얻은 설폰화된 프로인슐린 융합단백질을 크로마토그래피로 정제한 후 재접힘을 수행한 비교군도 함께 준비하여, 그 결과를 표 3에 나타내었다.
설폰화된 프로인슐린 융합단백질 재접힘 수율(%) 재접힘된 프로인슐린 융합단백질(㎎/ℓ)
크로마토그래피 후 재접힘 65 360
직접 재접힘 62 383
표 2에 나타난 바와 같이, 본 발명의 플라스미드로 형질전환된 균주들은 높은 프로인슐린 융합단백질 발현율을 나타내었다.
2) 프로인슐린 융합단백질의 정제 및 설폰화
배양된 균체에 완충용액(10% 수크로스, 0.1M 트리스, 50mM EDTA, 0.2M 염화나트륨, pH 7.9)을 첨가하고, 균질분쇄기(Rannie, 14.56VH, Denmark)를 이용하여 약 13,000∼14,000psi의 압력 하에서 파쇄를 실시하였다.
파쇄된 세포는 연속식 원심분리기(Tomo-e, AS-46NF, Japan)로 10,000rpm에서 원심분리하고, 용해성 단백질과 일부 세포파편을 제거하여, 내포체가 포함된 침전물을 분리하였다.
분리된 내포체는, 2% Triton X-100 및 1M 요소를 함유하는 용액을 이용하여 세척한 후, 10,000rpm에서 원심분리하여 침전물을 얻었다.
정제된 내포체의 함수 중량의 15배 부피의, 8M 요소, 20mM 트리스 및 1mM EDTA를 함유하는 pH 9.0 용액을 이용하여 내포체를 용해시킨 후, 아황산나트륨(sodium sulfite)과 사티온산나트륨(sodium tetrathionate)을 최종 농도가 각각 0.2∼0.4M과 20∼100mM이 되도록 첨가하였다. 이때 각각의 첨가량은 0.2M과 20mM이 되도록 하는 것이 바람직하다.
상기 용액을 4℃에서 12시간 동안 교반하여 프로인슐린 융합단백질의 시스테인 잔기들을 설폰화시키고, 12,000rpm에서 원심분리하여 불용해성 침전물을 제거하였다.
3) 설폰화된 프로인슐린 융합단백질의 직접 재접힘
설폰화된 프로인슐린 융합단백질을 함유하는 원심분리 상등액을 최종 단백질 농도가 1㎎/㎖이 되도록 정제수로 희석시킨 후, 질소가스를 주입하여 탈기하고 밀봉하였다.
또다른 용기에는 상기와 같은 양의 글리신 완충용액(0.6M 요소, 50mM 글리신, pH 10.6)에, 인슐린 시스테인 잔기의 1.5 당량비가 되도록 베타-머캅토에탄올을 첨가하고 질소가스를 주입하여 탈기하고 밀봉하였다.
상기 두 용액을 1 : 1의 부피비로 신속하게 혼합하여, 10℃에서 18시간 동안 반응시켜 재접힘 과정을 수행하였다.
본 발명의 인슐린 제조 방법에 따른 직접 재접힘의 수율 및 재접힘된 프로인슐린 융합단백질의 효율을 확인하기 위해, 상기에서 얻은 설폰화된 프로인슐린 융합단백질을 크로마토그래피로 정제한 후 재접힘을 수행한 비교군도 함께 준비하여, 그 결과를 표 3에 나타내었다.
생산균주 인슐린 (%) 인슐린 부산물 (%)
BL21(DE3)/pK-B1Kpi 48 39
BL21(DE3)/pK-B5Kpi 75 11
JM109/pPT-17Kpi 71 15
따라서, 본 발명의 플라스미드는 인슐린 부산물의 생성량이 적기 때문에 부산물의 다량 생성으로 인한 별도의 정제과정을 필요로 하지 않으므로, 효율적으로 인슐린을 생산할 수 있다.
[실험예 3] 설폰화 공정을 생략한 인슐린의 제조
본 발명의 pPT-B5Kpi 플라스미드를 이용하여 설폰화 공정을 생략하고 다음과 같이 인슐린을 제조하였다.
1) 본 발명의 플라스미드로 형질전환된 대장균의 유가식 배양
실시예 2에서 제조한 본 발명의 pPT-B5Kpi로 형질전환된 대장균 JM109/pPT-B5Kpi에 대해 유가식 배양을 수행하였다. 배양 방법은 상기 실험예 1과 마찬가지의 방법에 따라 수행하였다.
2) 프로인슐린 융합단백질의 정제
배양된 균체에 완충용액(10% 수크로스, 0.1M 트리스, 50mM EDTA, 0.2M 염화나트륨, pH 7.9)을 첨가하고 균질분쇄기를 이용하여 파쇄하였다. 원심분리할 때 내포체를 포함한 침전물의 손실을 최소화하고 회수율을 높이기 위하여 파쇄된 세포를 낮은 온도(10℃) 및 산성 조건(pH 5.0)으로 조정하였다.
연속식 원심분리기로 원심분리하여 내포체가 포함된 침전물을 회수하였다. 분리된 내포체는 세척 조건으로 조정하기 위하여 20mM 트리스 및 1mM EDTA를 함유하는 pH 7.0 용액을 이용하여 현탁시켰다.
지질이나 막 단백질을 제거하기 위하여 1% Triton X-100으로 2시간 동안 세척하였고, 내포체에 붙어있는 단백질을 제거하기 위하여 2M 요소를 첨가하여 3시간 동안 세척하였다.
이상의 개선된 방법으로 세척된 내포체를 원심분리하여 회수하였을 때, 내포체의 회수량이 증가하였고 순도도 향상된 결과를 얻었다.
3) 설폰화 공정을 생략한 프로인슐린 융합단백질의 재접힘
정제된 내포체를 함수 중량의 20배 부피의 8M 요소를 함유하는 pH 9.0 용액을 이용하여 내포체를 완전히 용해시킨 후, 물로 20배 희석하였다. 이후 상기 용액에 베타머캅토에탄올을 0.25mM이 되도록 첨가한 후 pH 10.6으로 조정하고 4℃에서 12시간 동안 교반하여 재접힘 공정을 수행하였다.
4) 단백질 분해효소의 절단에 의한 활성인슐린으로의 전환
상기와 같이 재접힘된 프로인슐린 융합단백질 용액에 대해, 상기 실험예 2의 4)와 마찬가지의 방법에 따라 트립신 및 카복시펩티다제 B를 처리하였다.
위 방법에 따른 재접힘 공정과 실험예 2의 3)과 같은 설폰화 후 재접힘 공정을 비교하면, 인슐린 전환수율과 순도에서 비슷한 결과를 나타내어 인슐린 제조 공정을 훨씬 단순화시킬 수 있었다.
5) 결론
따라서, 본 발명의 플라스미드 및 이를 이용한 인슐린의 제조 방법은 기존에 비해, 훨씬 단순한 과정을 통하여 높은 수율로 인슐린을 생산하며, 부산물 생성 또한 최소화한다.
[실험예 4] 고정화된 단백질 분해효소에 의한 인슐린의 제조
1) 단백질 분해효소의 고정화
10g의 Amberlite XAD-7을 메탄올, 25% 과산화수소, 5% 질산(nitric acid) 등을 사용하여 세척한 후, 50㎖ 에틸렌디아민(ethylenediamine)을 첨가하여 4시간 처리한 후 물로 세척하고 건조하였다.
상기 수지에 3% 글루타알데히드(glutaldehyde)가 녹아있는 인산완충액(pH 7.5) 230㎖을 첨가하고 20℃에서 1시간 반응한 후, 0.02M 인산완충액(pH 7.5)를 사용하여 세척하였다.
상기 수지에 트립신 200u/㎖ 또는 카복시펩티다제 B 100u/㎖이 포함된 0.1M 인산완충액(pH 7.5) 400㎖을 첨가하여 20℃에서 2시간 교반시킨 후, 0.02M 인산완충액으로 수지를 세척하였다.
상기 수지에 보로수소화나트륨(sodium borohydride) 0.06g이 포함된 인산완충액 400㎖을 첨가하여 20℃에서 1시간 교반시킨 후, 완충액으로 세척하여 고정화 트립신 및 고정화 카복시펩티다제 B를 준비하였다.
2) 고정화된 단백질 분해효소에 의한 활성인슐린으로의 전환
효소반응을 위해, 재접힘된 프로인슐린 융합단백질을 20mM 트리스(pH 7.5)에 0.5mg/㎖ 농도가 되도록 용해시킨 후, 프로인슐린 융합단백질 1g당 2000u의 고정화 트립신과 1000u의 고정화 카복시펩티다제 B를 첨가하여 15℃에서 반응시켰다.
3) 결론
상기 방법에 따른 인슐린 전환수율과 순도는 상기 실험예 2 및 3에서 얻은 결과와 비슷한 것으로 나타났다.
따라서, 고정화 효소를 이용하는 본 발명의 인슐린 제조방법은 효율적으로 인슐린을 생산할 수 있게 한다.
본 발명의 플라스미드 및 이를 이용한 인슐린의 제조 방법은 단일과정에 의 해 프로인슐린 융합단백질을 인간 인슐린으로 전환시킬 수 있다.
또한 본 발명의 플라스미드 및 이를 이용한 인슐린의 제조 방법은 부산물 생성을 최소화하므로, 높은 수율로 인슐린을 얻게 하는 효과가 있다.
따라서, 본 발명의 플라스미드 및 이를 이용한 인슐린의 제조 방법은 인간 인슐린의 산업적 대량 생산에 유용하게 사용될 수 있다.
<110> CKD Bio Corp <120> Vectors expressing human insulin and the preparation method for human insulin thereby <130> 03P-138 <150> KR1020020070188 <151> 2002-11-12 <160> 35 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence for leader peptide 1 <400> 1 Met Thr Met Ile Thr Lys 1 5 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence for leader peptide 2 <400> 2 Met Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Lys 1 5 10 <210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence for leader peptide 3 <400> 3 Met Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Lys 1 5 10 <210> 4 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence for leader peptide 4 <400> 4 Met Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Gly Ser Leu 1 5 10 15 Gln Lys <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence for leader peptide 5 <400> 5 Met Thr Met Ile Thr Arg 1 5 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence for leader peptide 6 <400> 6 Met Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Arg 1 5 10 <210> 7 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence for leader peptide 7 <400> 7 Met Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Arg 1 5 10 <210> 8 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence for leader peptide 8 <400> 8 Met Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Gly Ser Leu 1 5 10 15 Gln Arg <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding leader peptide 1 <400> 9 atgaccatga ttacgaag 18 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding leader peptide 2 <400> 10 atgaccatga ttacggattc actggccaag 30 <210> 11 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding leader peptide 3 <400> 11 atgaccatga ttacggattc actggccgtc gttttacaaa ag 42 <210> 12 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding leader peptide 4 <400> 12 atgaccatga ttacggattc actggcagtc gttttacaag gttctctgca gaag 54 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding leader peptide 5 <400> 13 atgaccatga ttacgcgt 18 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding leader peptide 6 <400> 14 atgaccatga ttacggattc actggcccgt 30 <210> 15 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding leader peptide 7 <400> 15 atgaccatga ttacggattc actggccgtc gttttacaac gt 42 <210> 16 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding leader peptide 8 <400> 16 atgaccatga ttacggattc actggcagtc gttttacaag gttctctgca gcgt 54 <210> 17 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplifying nucleotide sequence encoding leader peptide 1 <400> 17 caccagcata tgaccatgat tacgaagttt gtgaaccaac acctgt 46 <210> 18 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplifying nucleotide sequence encoding leader peptide 2 <400> 18 caccagcata tgaccatgat tacggattca ctggccaagt ttgtgaacca acacctgtgc 60 60 <210> 19 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplifying nucleotide sequence encoding leader peptide 3 <400> 19 caccagcata tgaccatgat tacggattca ctggccgtcg ttttacaaaa gtttgtgaac 60 caacacctgt gc 72 <210> 20 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplifying nucleotide sequence encoding leader peptide 5 <400> 20 caccagcata tgaccatgat tacgcgtttt gtgaaccaac acctgt 46 <210> 21 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplifying nucleotide sequence encoding leader peptide 6 <400> 21 caccagcata tgaccatgat tacggattca ctggcccgtt ttgtgaacca acacctgtgc 60 60 <210> 22 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplifying nucleotide sequence encoding leader peptide 7 <400> 22 caccagcata tgaccatgat tacggattca ctggccgtcg ttttacaacg ttttgtgaac 60 caacacctgt gc 72 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplifying Xho I restriction site of pHHI plasmid <400> 23 gcatgcctcg aggtcgactc taga 24 <210> 24 <211> 91 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplifying EcoRI restriction site and upstream region of P2 promoter <400> 24 catgttgaat tctgcgccac cactgacacg gacaacggca aacacgccgc cgggtcagcg 60 gggttctcct gagaactccg gcagagaaag c 91 <210> 25 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplifying -35 and -10 region of P2 promoter, and lac operator <400> 25 tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccata atacgccttc ccgctacaga 60 gtcaagcatt tatttttgct ttctctgccg gagttc 96 <210> 26 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplifying T7 ribosome binding site, and NdeI, KpnI, XhoI, SalI and HindIII restriction site <400> 26 acagccaagc ttgtcgactc gaggtaccga catatgtata tctccttctt aaagttaaac 60 aaaattattt ctagaagctg tttcctgtgt gaaatt 96 <210> 27 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplifying nucleotide sequence encoding leader peptide 4 <400> 27 gaaacacata tgaccatgat tacggattca ctggcagtcg ttttacaagg ttctctgcag 60 aagtttgtga accaacacct gtg 83 <210> 28 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplifying nucleotide sequence encoding leader peptide 8 <400> 28 gaaacacata tgaccatgat tacggattca ctggcagtcg ttttacaagg ttctctgcag 60 cgttttgtga accaacacct gtg 83 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer complementary to +60 upstream region from EcoRI restriction site of pPT-B5Kpi plasmid <400> 29 agtaaggcaa ccccgccagc 20 <210> 30 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplifying -35 region of P2 promoter, -10 region of lac promoter, and part of lac operator to be used in the construction of pPL vector <400> 30 ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccttcccg ctacagagt 49 <210> 31 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplifying -35 region of P2 promoter, -10 region of lac promoter, and part of lac operator to be used in the construction of pPLD vector <400> 31 ttatccgctc acaattccaa catacgagcc ttcccgctac agagt 45 <210> 32 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplifying T7 ribosome binding site and NdeI restriction site <400> 32 taccgacata tgtatatctc cttcttaaag ttaaacaaaa ttatttctag agggaaattg 60 ttatccgctc acaattcc 78 <210> 33 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for interchanging 28th with 29th in amino acid sequence of insulin B chain <400> 33 ctcccggcgg gtgggctttg tgtagaagaa gcc 33 <210> 34 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer complementary to the sequence of primer 25 <400> 34 ggcttcttct acacaaagcc cacccgccgg gag 33 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer complementary to -80 downstream region from HindIII restriction site <400> 35 ctgccgccag gcaaattctg 20

Claims (18)

  1. 하기 식(Ⅰ)의 화합물을 암호화하는 염기서열을 포함하는 플라스미드
    R-B-X-A(Ⅰ)
    상기 식에서,
    ⅰ) R은 하기 일반식(II)와 같은 전서열 펩티드이다.
    Met-Thr-Met-Ile-Thr-Y (II)
    Y는 리신, 아르기닌, C-말단의 아미노산이 리신인 펩티드, 또는 C-
    말단의 아미노산이 아르기닌인 펩티드 중 선택된 하나이다.
    ⅱ) B는 인간 인슐린 B쇄 또는 그 유사체이다.
    ⅲ) X는 B와 A를 연결하는 펩티드이다.
    ⅳ) A는 인간 인슐린 A쇄 또는 그 유사체이다.
  2. 제 1항에 있어서, 식(Ⅰ)의 R은 하기 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8의 펩티드 서열 중 선택된 하나임을 특징으로 하는 플라스미드
    서열번호 1: Met-Thr-Met-Ile-Thr-Lys
    서열번호 2: Met-Thr-Met-Ile-Thr-Asp-Ser-Leu-Ala-Lys
    서열번호 3: Met-Thr-Met-Ile-Thr-Asp-Ser-Leu-Ala-Val-Val-Leu-Gln-Lys
    서열번호 4: Met-Thr-Met-Ile-Thr-Asp-Ser-Leu-Ala-Val-Val-Leu-Gln-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys
    서열번호 5: Met-Thr-Met-Ile-Thr-Arg
    서열번호 6: Met-Thr-Met-Ile-Thr-Asp-Ser-Leu-Ala-Arg
    서열번호 7: Met-Thr-Met-Ile-Thr-Asp-Ser-Leu-Ala-Val-Val-Leu-Gln-Arg
    서열번호 8: Met-Thr-Met-Ile-Thr-Asp-Ser-Leu-Ala-Val-Val-Leu-Gln-Gly-Ser-Leu-Gln-Arg
  3. 제 1항에 있어서, 서열번호 1~8의 펩티드 서열은 순서대로 하기 서열번호 9~16의 염기 서열에 의해 암호화됨을 특징으로 하는 플라스미드
    서열번호 9: ATG ACC ATG ATT ACG AAG
    서열번호 10: ATG ACC ATG ATT ACG GAT TCA CTG GCC AAG
    서열번호 11: ATG ACC ATG ATT ACG GAT TCA CTG GCC GTC GTT TTA CAA AAG
    서열번호 12: ATG ACC ATG ATT ACG GAT TCA CTG GCA GTC GTT TTA CAA GGT TCT CTG CAG AAG
    서열번호 13: ATG ACC ATG ATT ACG CGT
    서열번호 14: ATG ACC ATG ATT ACG GAT TCA CTG GCC CGT
    서열번호 15: ATG ACC ATG ATT ACG GAT TCA CTG GCC GTC GTT TTA CAA CGT
    서열번호 16: ATG ACC ATG ATT ACG GAT TCA CTG GCA GTC GTT TTA CAA GGT TCT CTG CAG CGT
  4. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 일반식(I)의 B, X, A가 각각 인간 인슐린 B쇄, C쇄, A쇄인 플라스미드
  5. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 일반식(I)의 B가 인간 인슐린 B쇄의 28번 및 29번 아미노산의 위치가 서로 바뀐 펩티드이고, X와 A가 각각 인간 인슐린 C쇄와 A쇄인 플라스미드
  6. 제 4항에 있어서, 도 1c의 구조를 가짐을 특징으로 하는 플라스미드
  7. 삭제
  8. 제 6항에 있어서, 기탁번호 KCTC 10363BP로 기탁된 pK-B5Kpi 플라스미드
  9. 제 4항에 있어서, 도 3c의 구조를 가짐을 특징으로 하는 플라스미드
  10. 삭제
  11. 제 4항에 있어서, 도 4c의 구조를 가짐을 특징으로 하는 플라스미드.
  12. 삭제
  13. 제 5항에 있어서, 도 3c의 구조를 가짐을 특징으로 하는 플라스미드
  14. 삭제
  15. 제6항, 제8항, 제9항, 제11항 및 제13항 중 어느 한 항의 플라스미드를 도입시킨 미생물
  16. 인간 인슐린 또는 그 유사체를 제조함에 있어서,
    (a) 제 15항의 미생물을 발효시켜 일반식(I)의 화합물의 발현을 유도하는 단계,
    R-B-X-A(Ⅰ)
    상기 식에서,
    ⅰ) R은 하기 일반식(II)와 같은 전서열 펩티드이다.
    Met-Thr-Met-Ile-Thr-Y (II)
    Y는 리신, 아르기닌, C-말단의 아미노산이 리신인 펩티드, 또는 C-
    말단의 아미노산이 아르기닌인 펩티드 중 선택된 하나이다.
    ⅱ) B는 인간 인슐린 B쇄 또는 그 유사체이다.
    ⅲ) X는 B와 A를 연결하는 펩티드이다.
    ⅳ) A는 인간 인슐린 A쇄 또는 그 유사체이다.
    (b) 세포파쇄 및 용해단계,
    (c) 재접힘(refolding) 단계,
    (d) 효소반응에 의한 R과 X의 동시절단단계,
    (e) 크로마토그래피에 의한 활성인슐린의 정제단계
  17. 삭제
  18. 제 16항에 있어서, (d) 단계는 고정화 트립신과 고정화 카복시펩티다제 B를 함께 사용함을 특징으로 하는 방법
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