WO2007061136A1 - 非天然型アミノ酸を組み込んだタンパク質の製造方法 - Google Patents

非天然型アミノ酸を組み込んだタンパク質の製造方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2007061136A1
WO2007061136A1 PCT/JP2006/324043 JP2006324043W WO2007061136A1 WO 2007061136 A1 WO2007061136 A1 WO 2007061136A1 JP 2006324043 W JP2006324043 W JP 2006324043W WO 2007061136 A1 WO2007061136 A1 WO 2007061136A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
amino acid
gene
trna
natural amino
trna synthetase
Prior art date
Application number
PCT/JP2006/324043
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Shigeyuki Yokoyama
Kensaku Sakamoto
Fumie Iraha
Original Assignee
Riken
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Riken filed Critical Riken
Priority to JP2007546542A priority Critical patent/JP4936290B2/ja
Priority to US12/094,859 priority patent/US8183013B2/en
Priority to AU2006317944A priority patent/AU2006317944A1/en
Priority to EP06833846A priority patent/EP1961817B1/en
Publication of WO2007061136A1 publication Critical patent/WO2007061136A1/ja
Priority to US13/470,752 priority patent/US8642291B2/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a protein incorporating an unnatural amino acid at a desired position, a host cell used in the production method, and a cell-free protein synthesis system reagent kit used in the production method.
  • Natural proteins are composed of 20 kinds of naturally occurring amino acids (hereinafter referred to as natural amino acids).
  • natural amino acids When analyzing the structure or function of a protein or extending its chemical properties, a method is known that incorporates a non-naturally occurring amino acid (hereinafter referred to as an unnatural amino acid) at a desired position in an amino acid sequence. .
  • a protein incorporating a non-natural amino acid By the way, aminoacyl tRNA synthetase (hereinafter referred to as aaRS) is an enzyme that specifically binds a specific amino acid and a specific tRNA. For each species, there are 20 types, with some exceptions. There are 20 types corresponding to each natural amino acid.
  • aaRS * a new aaRS
  • tRNA * a tRNA paired with a codon that does not encode the natural amino acid. It needs to be incorporated into cells and function correctly.
  • a taro * which is not originally encoded with a natural amino acid, is paired with a tRNA * in which a non-natural amino acid is bound by aaRS * to synthesize aloprotein containing the non-natural amino acid. can do.
  • aaRS * is based on an existing aaRS specific to a specific natural amino acid so as to have an activity using a non-natural amino acid similar to this specific natural amino acid as a substrate.
  • Created by functional modification For example, when creating aaRS * specific for 0-methyltyrosine (unnatural amino acid) similar to tyrosine (natural amino acid), based on the existing tyrosyl tRNA synthetase (TyrRS), Produces TyrRS mutants with increased isomerism to O-methylthiocin.
  • aloRS * produced in this way is used to synthesize aloprotein, it does not react with the 20 naturally occurring amino acid friends inherent in the host cell and their corresponding tRNAs. : You must use aaRS * which reacts specifically with acid and tRNA *. .
  • aaRS * uses aaRS * whose specificity for a given non-natural amino acid is sufficiently higher than the specificity for an existing natural amino acid. Otherwise, a protein into which a natural amino acid is introduced is synthesized at a position where a predetermined unnatural amino acid is to be introduced. In addition, if aaRS * also reacts with tRNA inherent in the host cell in addition to tRNA *, in addition to the position where non-natural amino acid is to be introduced, it is unnatural at the position where natural amino acid should be introduced. Type amino acids will be introduced. In order to avoid this problem, when prokaryotic cells are used as host cells, aaRS * should be aaRS * constructed based on eukaryotic type aaRS.
  • eukaryotic type aaRS is difficult to react with prokaryotic tRNA.
  • “eukaryotic type aaRS” means aaRS derived from eukaryotic organisms, or aaRS derived from archaea. If prokaryotic cells are used as host cells and aaRS * derived from prokaryotes is introduced, the aaRS * is not only a tRNA * but also a tRNA corresponding to the natural amino acid inherent in the host. There is a risk of synthesizing multiple types of aminoacyl-tRNA. In this case, it becomes difficult to translate the gene into a unique protein for the reasons described above.
  • aaRS * should be constructed based on aaRS derived from prokaryotes.
  • aaRS * As described above, when aloprotein is synthesized, an appropriate aaRS * must be produced depending on whether the host cell used is a eukaryotic cell or a prokaryotic cell. Regardless of whether the host cell is eukaryotic or prokaryotic, aaRS * that can be used in either case is rare. Therefore, if a protein containing a specific unnatural amino acid is synthesized in eukaryotic cells and prokaryotic cells, it is necessary to create prokaryotic aaRS * and eukaryotic type aaRS *. Ah The However, the creation of aaRS * has the problem that it has to succeed in modifying the function of the existing aaRS so that it has an activity using an unnatural amino acid as a substrate, which requires a lot of labor. '
  • Patent Document 1 WO 2 0 0 3 0 1 4 3 5 4
  • Patent Document 2 W O 2 0 0 4/0 3 9 9 8 9 Disclosure of Invention
  • the present invention uses either prokaryotic aaRS * or eukaryotic type aaRS *, and both prokaryotic and eukaryotic type cells are used as host cells.
  • the object is to provide a method for producing aloprotein which can be used.
  • the method for producing aloprotein according to the present invention that has achieved the above-mentioned object includes the following steps.
  • a eukaryotic type having specificity for the above-mentioned predetermined natural amino acid, and a tRNA gene for non-natural amino acid capable of binding to the non-natural amino acid in the presence of the aminoacyl tRNA synthetase mutant derived from the prokaryote A gene that encodes the aminoacyl-tRNA synthetase and a tRNA gene that can bind to the natural amino acid in the presence of the eukaryotic-type aminoacyl-tRNA synthetase.
  • the anticodon is paired. 6 324043
  • the above non-natural amino acid can be incorporated into the codon position to produce the desired aloprotein in prokaryotic cells.
  • the prokaryotic-derived aminoacyl tRNA synthetase variant used in the present invention is not limited to a system that synthesizes aloprotein in prokaryotic cells, but can also be applied to a system that synthesizes aloprotein in eukaryotic cells.
  • the method for producing aloprotein according to the present invention is not limited to a system that uses prokaryotic cells as host cells as described above, and uses a eukaryotic type aminoacyl tRNA synthetase mutant.
  • the present invention can also be applied to a system using a nuclear cell as a host cell.
  • the prokaryotic cell according to the present invention has the following characteristics.
  • prokaryotic cell according to the present invention having the above-described features incorporates a natural amino acid similar to a non-natural amino acid, a eukaryotic aminoacyl-tRNA synthetase and a corresponding eukaryotic type tRNA will be used.
  • the cell-free protein synthesis system reagent kit includes at least the following elements.
  • a cell-free protein synthesis reagent kit when incorporating a natural amino acid similar to a non-natural amino acid, a eukaryotic type aminoacyl tRNA synthetase and a corresponding true amino acid Nuclear tRNA will be used.
  • the cell-free protein synthesis reagent kit according to the present invention is not limited to the system using the prokaryotic cell extract as described above, and the eukaryotic type amino acid tRNA synthetase mutant is used. It can also be applied to a system using a nuclear cell extract.
  • Figure 1 shows the results of transforming the T0P10 [AtyrlI, AtyrS, ⁇ 3 '] and T0P10 strains with plasmid 2541supF, respectively, and then culturing them in a culture medium containing kuram lam funicol and a medium not containing mouth ram felicol. It is a photograph which shows.
  • FIG. 6 is a characteristic diagram showing a growth curve when grown in a non-containing medium.
  • Fig. 3 is a photograph showing the results of performing PCR after extracting chromosomal DNA for T0P10 [A tyrT, ⁇ tyrU, ⁇ tyrS, pTK3] and T0P10 strains and confirming the PCR amplified fragments by electrophoresis. It is. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • Aloprotein is defined as a protein incorporating an unnatural amino acid.
  • a method for producing a protein incorporating an unnatural amino acid according to the present invention (hereinafter referred to as a method for producing aloprotein) is a prokaryotic or eukaryotic type aminoamino tRNA synthetase mutant (hereinafter referred to as aaRS *).
  • AaRS * can be used for a wide variety of host cells, regardless of whether it is.
  • eukaryotic type means eukaryotic organisms and archaea. Therefore, the expression “eukaryotic type aminoacyl tRNA synthetase” means that it includes an eukaryotic aminoacyl tRNA synthetase and an archaebacterial aminoacyl tRNA synthetase.
  • the natural amino acid is an amino acid having a structure different from 20 kinds of natural amino acids.
  • Non-natural amino acids have a structure similar to natural amino acids, and are therefore classified as derivatives or analogs of specific natural amino acids.
  • examples of the non-natural amino acid include 3-substituted tyrosine and 4-substituted tyrosine, which are derivatives of natural amino acid tyrosine.
  • Examples of the 3-substituted tyrosines include 3-halogenated thiocins such as 3-odotyrosine and 3-bromotyrosine.
  • 4-substituted tyrosine examples include 4-acetyl-L-phenylalanine, 4-benzoyl-L-phenylalanine, 4-azido-L-phenolinalanin, O-methyl-1-tyrosine, 4-methyl-1-tyrosine, etc. Can be mentioned.
  • Non-natural amino acids are not limited to tyrosine derivatives.
  • aaRS * means a variant aminoacyl tRNA synthetase having an increased specificity for a non-natural amino acid similar to the natural amino acid as compared with the specificity for a predetermined natural amino acid.
  • Increased specificity means that the activity value for non-natural amino acids (reaction rate K cat divided by Michaelis constant K m ) is significantly greater than the activity value for natural amino acids.
  • Activity values can be measured by in vitro assays, but the relative magnitude of activity values can also be determined from genetic data.
  • aaRS * defined as described above can be obtained by introducing a mutation at a predetermined position of a known aminoacyl tRNA synthetase corresponding to a natural amino acid.
  • a known amino acid tRNA synthetase corresponding to a natural amino acid is activated by first recognizing an amino acid specifically and adding AMP when synthesizing aminoacyl tNA.
  • sites that contribute to specific recognition of amino acids are known, and the specificity can be changed by introducing mutations into the sites. Based on such knowledge, it is possible to introduce a mutation that reduces the specificity for a natural amino acid and increases the specificity for a non-natural amino acid similar to the natural amino acid.
  • aaRS * having a desired specificity can be prepared by introducing a mutation at a predetermined site in a known aminoacyl tRNA synthetase.
  • Such aaRS * may be derived from either prokaryotic or eukaryotic types, but one example of aaRS * derived from prokaryotic organisms is specificity for 3-yodo L-tyrosine (an unnatural amino acid).
  • AaRS * (referred to as mutant TyrRS), which has an increased specificity compared to tyrosine (natural amino acid).
  • TyrRS is described in the following literature. Kiga, D., Sakamoto, K., Kodama, ⁇ . Kigawa, T., Matsuda, T., Yabuki, T., Shirouzu, M., Harada, Y., Naklayama,
  • tyrosin (Y) at position 7 and glutamine (Q) at position 1955 in tyrosyl-tRNA synthetase derived from Escherichia coli with other amino acids
  • 3 -Mutants with increased specificity for halogenated tyrosine (non-natural amino acid) can be obtained.
  • the position corresponding to position 37 tyrosine (Y) is palin (V :), leucine (L), isoleucine (I) or alanine.
  • the position substituted with (A) and corresponding to 1 9-position glutamine (Q) is alanine.
  • Mutants substituted with (A), cysteine (C), serine (S) or asparagine (N) can be used. These mutants have increased specificity specifically for 3-yodo L-tyrosine.
  • the method for producing a gene encoding such a mutant can be easily performed by a known gene manipulation technique.
  • a gene encoding a mutant can be produced by a technique called site-directed mutagenesis or using a commercially available kit for performing site-directed mutagenesis. .
  • examples of aaRS * derived from eukaryotic types include Santoro, S. W., Wang,
  • the non-natural amino acid tRNA gene is a gene that is recognized by the above-mentioned aa and RS * and encodes a tRNA having a 3 ′ end to which an activated non-natural amino acid is transferred. That is, the above-mentioned aaRS * recognizes a specific unnatural amino acid, synthesizes an unnatural amino acid-AMP, and has an activity of transferring the unnatural amino acid to the 3 ′ end of the tRNA for the unnatural amino acid. Have.
  • the tRNA for unnatural amino acid has an anticodon that specifically pairs with a genetic code other than the codon corresponding to 20 types of natural amino acids.
  • the anticodon of the non-natural amino acid tRNA is preferably a sequence that matches a nonsense codon consisting of UAG amber codon, UAA ocher codon and UGA opal codon.
  • the tRNA for non-natural amino acid is preferably a nonsense / subletter tRNA.
  • the t-RNA for unnatural amino acid preferably has an anticodon that matches UAG (amber codon) in the suppressor tRNA.
  • opal codons can be translated into tributophane with low efficiency, and when this codon is used, it can be translated into two types of amino acids: unnatural amino acids and tryptophan. This is because opal codon is not suitable for use. Another reason is that the amber codon has a G at the third letter. The base pairing of the 3rd codon and the 1st anticodon is relatively uneasy, and the formation of a stable GC base pair at this position indicates that the sub-responder tRNA turns the UAG codon into an unnatural amino acid. This is advantageous for efficient translation.
  • prokaryotic-derived aaRS mutant When a prokaryotic-derived aaRS mutant is used as the aaRS * described above, the same prokaryotic-derived tRNA gene can be used as the non-naturally occurring tRNA gene for amino acids.
  • the above-mentioned mutant TyrRS derived from E. coli it is preferable to use a sub-lesser tRNA gene derived from E. coli.
  • the anticodon of tRNA for unnatural amino acids corresponds to the stop codon.
  • the sequence is not limited to a specific sequence, and may consist of a sequence that specifically pairs with a codon of 4 bases.
  • the anticodon of the tRNA for unnatural amino acid may contain an unnatural base. In this case, a different kind of unnatural base that can specifically form a base pair with the unnatural base is introduced at the corresponding position of the codon.
  • Such unnatural base pairs include isoguanine and isotidine, 2-amino-6- (2-chenyl) purine and pyridine 1-one.
  • the host cells are eukaryotic type cells and prokaryotic cells. Either may be sufficient.
  • a prokaryotic aaRS * gene and a non-natural amino acid tRNA gene are used, and prokaryotic cells are used as host cells, in the prokaryotic cell, a non-natural amino acid as a substrate for aaRS *
  • a gene encoding aaRS having specificity for a similar natural amino acid hereinafter referred to as “corresponding prokaryotic endogenous aaRS gene” and the corresponding natural prokaryotic endogenous aaRS gene.
  • a tRNA gene hereinafter referred to as “corresponding prokaryotic endogenous tRNA gene” and aaRS gene of the “eukaryotic” type (hereinafter referred to as “corresponding eukaryotic type aaRS gene”).
  • corresponding prokaryotic type tRNA gene replace with tRNA gene (hereinafter referred to as “corresponding eukaryotic type tRNA gene”).
  • the host cell is a prokaryotic cell
  • the corresponding prokaryotic endogenous aaRS gene and the corresponding prokaryotic endogenous tRNA gene are knocked out, and the corresponding prokaryotic cell.
  • Prokaryotic aaRS * will only aminoacylate tRNA for non-natural amino acids without aminoacylating the corresponding eukaryotic type tRNA.
  • the corresponding eukaryotic type aaRS will aminoacylate only the corresponding eukaryotic type tRNA without aminoacylating tR.NA for unnatural amino acids.
  • a corresponding eukaryotic type aaRS gene and a corresponding eukaryotic type tRNA gene are introduced into a prokaryotic cell
  • these corresponding eukaryotic type aaRS genes A method that uses an expression vector introduced in a form capable of expressing a child and a corresponding eukaryotic type tRNA gene, and the corresponding eukaryotic type aaRS gene and the corresponding eukaryotic type tRNA gene can be expressed. Any of the methods of introducing the DNA into the prokaryotic genome in any form may be used.
  • a method using an expression vector is preferred because the introduced gene can be expressed at high levels, and an alloprotein can be efficiently synthesized.
  • prokaryotic cells prepared in this way natural amino acids similar to the non-natural amino acid to be introduced are incorporated into the protein by the eukaryotic type aaRS and tRNA, and have the desired amino acid sequence. It can be used as a host cell for accurately synthesizing proteins.
  • Prokaryotic cells that can be used as host cells here are not particularly limited, and examples include E. coli and Bacillus subtilis.
  • tyrosyl-tRNA synthetase derived from Methanococcus jannaschi i can be used as the eukaryotic type aaRS.
  • Tyrosyl tRNA synthetase derived from Methanococcus jannaschi i is composed of one protein selected from the group consisting of the following (a), (b) friends (c).
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added, and has the activity to activate tyrosine and synthesize tyrosyl tRNA.
  • the tyrosin tRNA gene derived from Methanococcus jannaschi i can be used as the eukaryotic type tRNA.
  • Methano Coccus Janacy The tyrosine tRNA derived from (Methanococcus jannaschi i) is composed of any one polynucleotide selected from the group consisting of the following (a), (b) and (c). (&) A polynucleotide comprising the nucleotide sequence shown at positions 4334 to 4410 in SEQ ID NO: 1;
  • the stringent condition means a condition where a specific hybrid is formed but a non-specific hybrid is not formed.
  • 6 X SSC (0..9M NaCl as a buffer solution).
  • 0.09M 'sodium citrate 0.09M 'sodium citrate
  • the eukaryotic cell when a prokaryotic-derived aaRS * gene and a non-natural amino acid tRNA gene are used and a eukaryotic cell is used as a host cell, the eukaryotic cell is essential.
  • the aaRS specific for natural amino acids and the tRNA gene capable of binding to natural amino acids in the presence of the aaRS can be used without any significant substitution.
  • the eukaryotic type cells that serve as host cells can be used as they are.
  • eukaryotic cells that can be used as host cells here include, but are not limited to, eukaryotic cells such as yeast cells, plant cells, insect cells, and mammalian cells, and archaea. Of these, mammalian cells in which a gene recombination system has been established are preferred.
  • Useful mammalian cell lines include Chinese hamster ovary (CH0) cells and COS cells. More specifically, monkey kidney CV1 transformed with SV40 (COS-7), human embryonic kidney (293 cells), Chinese hamster ovary / -DHFR, mouse Sertoli cells (TM4), human Lung cells (W138), human liver cells (Hep G2) And mouse breast cancer cells ( ⁇ T060562).
  • a eukaryotic type aaRS * gene and a tRNA gene for an unnatural amino acid are used, and a eukaryotic type cell is used as a host cell
  • the aaRS * A gene that encodes aaRS having specificity for a natural amino acid similar to the non-natural amino acid that is the substrate of * (hereinafter referred to as the “corresponding eukaryotic endogenous aaRS gene”) and the corresponding A tRNA gene that can bind to a natural amino acid in the presence of a eukaryotic endogenous aaRS gene (hereinafter referred to as “corresponding eukaryotic endogenous tRNA gene”) is a prokaryotic aaRS gene (hereinafter referred to as “corresponding” To a prokaryote-derived aaRS gene) and a tRNA gene (hereinafter referred to as a “corresponding prokaryote-derived tRNA gene”).
  • the host cell is a eukaryotic type cell
  • the corresponding eukaryotic endogenous aaRS gene and the corresponding eukaryotic endogenous tRNA gene are knocked out in the eukaryotic type cell.
  • the corresponding prokaryotic-derived aaRS gene and the corresponding prokaryotic-derived tRNA gene are introduced into the cells of the eukaryotic type.
  • Eukaryotic type aaRS * will aminoacylate only the tRNA for non-natural amino acid without aminoacylating the corresponding prokaryotic tRNA.
  • a corresponding prokaryotic-derived aaRS gene and a corresponding prokaryotic-derived tRNA gene are introduced into a eukaryotic-type cell
  • the corresponding prokaryotic-derived aaRS gene and the corresponding prokaryotic-derived tRNA gene can be expressed.
  • a method for introducing the corresponding prokaryotic-derived aaRS gene and the corresponding prokaryotic-derived tRNA gene into the genome of a eukaryotic type cell Any of these may be used.
  • a method using an expression vector is preferable because the introduced gene can be highly expressed and seroprotein can be synthesized efficiently.
  • the natural amino acid that the prokaryotic cell inherently has It can be used without replacing any tRNA gene that can bind to natural amino acid in the presence of acid-specific aaRS and aaRS.
  • the prokaryotic cell as the host cell can be used as it is.
  • a self-protein (alloprotein) incorporating a non-natural amino acid can be produced.
  • the type of target protein is not limited at all.
  • the codon at the desired position is set as a sequence that matches the anticodon of the above-mentioned tRNA for non-natural amino acid. This makes it possible to produce an aloprotein having a non-natural amino acid at a desired position.
  • the so-called site-directed mutagenesis method is used to change the desired position in the wild-type gene to a sequence that matches the anticodon of the tRNA for non-natural amino acids, thereby encoding the aloprotein.
  • Gene can be made.
  • the gene encoding the produced target protein is introduced into a host cell by a normal method and expressed in the host cell. In the host cell, it is possible to synthesize an aloprotein incorporating an unnatural amino acid at the codon position that matches the anticodon of the tRNA for the unnatural amino acid in the gene.
  • the target protein is not limited at all.
  • a group of proteins involved in cell signal transmission epidermal growth factor receptor, nerve growth factor receptor, Grab2 protein, Src kinase, Ras protein, etc.
  • translation A group of proteins polypeptide elongation factor, initiation factor, transcription termination factor, ribosomal protein, aminoacyl tRNA synthetase, etc.
  • transcription factor membrane protein, and the like.
  • the obtained aloprotein can be used for (i) structure determination by X-ray crystallography, or (ii) In order to elucidate cell signal transduction pathways, optical cross-linking is applied with site-specific fluorescent labeling, or (iii) site-specific polyethylene glycolation is used to increase drug efficacy and then used as a proteinaceous drug.
  • site-specific amino acid substitution in protein functional analysis, the types of amino acids that can be used for substitution have been limited to 20 naturally occurring amino acids, but unnatural amino acids are used. For example, various amino acid residues can be substituted without limitation. In this way, by creating and analyzing a series of mutants, it is also possible to clarify in detail the role of a specific amino acid residue in a protein.
  • cell-free protein synthesis system reagent kit contains various cell extracts in a form that does not lack protein synthesis ability.
  • cell-free protein synthesis systems translation systems and transcription / translation systems are known. By adding mRNA or DNA encoding the target protein to the reaction solution, proteins can be produced by the action of various enzymes contained in the extract. Synthesized. .
  • the cell-free protein synthesis system reagent kit according to the present invention comprises at least an amino acid solution containing a non-natural amino acid similar to a predetermined natural amino acid, the set of aaRS * and the tRNA for the non-natural amino acid described above, and a host. Cell extract.
  • the cell-free protein synthesis reagent kit according to the present invention includes a vector vector solution that can be incorporated into a gene encoding a target protein contained in a known cell-free protein synthesis reagent kit that is generally commercially available.
  • a reagent set containing RNA polymerase for transcription of the gene encoding the target protein may be included.
  • the above-described host cell extract may be an eukaryotic type cell or prokaryotic cell extract.
  • prokaryote-derived aaRS * and using a prokaryotic cell extract, knock out the ⁇ corresponding prokaryotic endogenous aaRS gene '' and ⁇ corresponding prokaryotic endogenous tRNA gene '' described above, "Corresponding eukaryotic type aaRS gene” and Use a prokaryotic extract that has been introduced with a “corresponding eukaryotic type tRNA gene”.
  • aaRS * gene and “tRNA gene for unnatural amino acid” are further introduced into prokaryotic cells, or “aaRS * '” and “tRNA for unnatural amino acid” remain as they are in prokaryotic cells.
  • aaRS * J By adding to the nutrient solution, “aaRS * J” and “tRNA for unnatural amino acid” can be included in the prokaryotic cell extract.
  • the cells of the eukaryotic type can be used without any replacement of the naturally-occurring aaRS specific to the natural amino acid and the tRNA gene that can bind to the natural amino acid in the presence of the aaRS.
  • a wild-type eukaryotic type extract can be used as it is.
  • the eukaryotic type aaRS * when used and the eukaryotic type cell extract is used, Use eukaryotic cell extracts that are knocked out of the “eukaryotic resident aaRS gene” and “corresponding eukaryotic endogenous tRNA gene”.
  • the ⁇ corresponding prokaryotic-derived aaRS gene '' and ⁇ corresponding prokaryotic-derived tRNA gene '' have been introduced into a eukaryotic cell, and Corresponding prokaryotic aaRS 'and' corresponding prokaryotic tRNA 'can be included.
  • each product of “corresponding prokaryotic-derived aaRS gene” and “corresponding prokaryotic-derived tRNA gene” may be added separately to the extract.
  • the prokaryotic cell inherently has The aaRS specific to the natural amino acid and the tRNA gene capable of binding to the natural amino acid in the presence of the aaRS can be used without any replacement.
  • the wild-type prokaryotic cell extract can be used as it is.
  • Example 1 In this example, aaRS * derived from Escherichia coli (mutated TyrRS whose specificity for 3-chloro-L-tyrosine was increased compared to its specificity for tyrosine) was used to produce aloprotein using Escherichia coli as a host cell. The method was demonstrated.
  • mutant TyrRS gene and the suppressor tRNA T "gene were prepared as follows.
  • the E. coli TyrRS gene is isolated from the E. coli chromosome and cloned. By substituting the cloned gene for amino acids tyrosine ⁇ valine (position 7) and asparagine ⁇ systemine (position 1 95), the specificity for 3-yode L-tyrosine is more specific for tyrosine.
  • a mutated TyrRS gene was produced that was enhanced compared to Preparation of E. coli chromosome, isolation of the desired gene from the chromosome by gene amplification method (PCR method), and cloning of the isolated gene into an appropriate vector can be easily performed by known gene manipulation techniques. It can be carried out. In order to express the mutant TyrRS gene, the original promoter of the TyrRS gene may be isolated and cloned together with the TyrRS structural gene.
  • the vector specifically, a vector derived from the plasmid pBR322 can be used.
  • RNA sizes such as tRNA can be produced by chemical methods over their entire length.
  • the base sequence of the suppressor tRNA Ty r gene is
  • TCCCCCACCACCA TCCCCCACCACCA.
  • a transcription promoter derived from the lpp gene was isolated and ligated from the Escherichia coli chromosome, and a transcription termination sequence derived from the rrnC gene produced by chemical synthesis was ligated behind the gene.
  • the full-length base sequence after ligation is
  • Plasmid pEcIYRS The plasmid having the above-mentioned mutant TyrRS gene and suppressor tRNA T gene is named pEcIYRS.
  • the mutant TyrRS gene is constitutively expressed from its own transcriptional promonitor and the suppressor tRNA is constitutively expressed from the lpp promoter.
  • corresponding eukaryotic type aaRS and “corresponding eukaryotic type tRNAj, TyrRS and chi-P syn-tRNA of Methanococcus jannaschi i are expressed in the host cell.
  • plasmid P TK3 expressing these Methanococcus jannaschi i derived TyrRS gene and tyrosine tRNA gene was constructed as follows. Note that shows the entire nucleotide sequence of plasmid ⁇ 3 in SEQ ID NO: 1. in addition, old Itoda bacteria Methanococcus jannaschi i The TyrRS gene of ⁇ ⁇ !] Consists of the 3284th to 4204th base sequences in No. 1.
  • the TyrRS amino acid and noic acid sequences of the archaebacteria Methanococcus jannaschii are shown in SEQ ID NO: 2.
  • the archaea Methanococcus jannaschi i The tyrosin tRNA gene consists of nucleotide sequences 4410 to 4334 in SEQ ID NO: 1.
  • the kanamycin resistance gene contained in plasmid pTK3 is The amino acid sequence of the protein encoded by. Kanamycin resistance gene consisting Contact Keru 47-5662 th nucleotide sequence ID NO: 1 to SEQ ID NO: 3.
  • Plasmid ⁇ ⁇ 3 The outline of the construction of Plasmid ⁇ ⁇ 3 is as follows.
  • the promoter region of the TrpRS gene was isolated from the E. coli chromosome by PCR and cloned into the pACYC184 vector. This plasmid is called pPTRP.
  • the TyrRS gene of Methanococcus jannaschii was isolated from the same chromosome by PCR and cloned immediately after the TrpRS promoter motor site on plasmid pPTRP to produce plasmid pMjYS.
  • Preparation of E. coli chromosomes, isolation of the desired gene from the chromosome by gene amplification (PCR), and cloning of the isolated gene onto an appropriate plasmid is a known genetic manipulation.
  • the tyrosine tRNA gene of Methanococcus jannaschi i was produced by chemical methods over its entire length. Before this gene, the lpp gene-derived transcription promoter was isolated and ligated from the E. coli chromosome, followed by the rrnC gene produced by chemical synthesis. After ligation of the transcription termination sequence derived from the plasmid, the plasmid pMjYRS was prepared by cloning on plasmid pMjYS.
  • the kanamycin resistance gene was extracted from the commercially available plasmid PHSG299 (Takara Shuzo) by PCR and cloned into the plasmid pMjYRS to prepare the plasmid pTK3.
  • the plasmid ⁇ 3 obtained as described above was used to transform E. coli T0P10 strain.
  • the TOP10 strain that had been subjected to treatment suitable for transformation using the electroporation method was commercially available (Invitrogen), and this was used.
  • tyrosyl tRNA synthetase gene (tyrS gene) and tyrosine tRNA gene (tyrT gene and tyrU gene) were knocked out in E. coli TOP10 strain of host cells.
  • the tyrS, tyrT, and tyrU genes were knocked out in the T0P10 strain transformed with the plasmid pTK3 using a Quick and easy BAC modification kit (hereinafter referred to as QBM kit) manufactured by Gene Bridges.
  • QBM kit Quick and easy BAC modification kit manufactured by Gene Bridges.
  • the order of knocking out each gene is not limited to the order shown in the examples, and it is sufficient that each gene is finally knocked out.
  • the QBM kit is for manipulating the human yeast chromosome (BAC), but it can also be used to knock down genes on the E. coli chromosome.
  • the experimental procedure was in accordance with the instructions attached to the kit.
  • the gene X (tyrS gene, tyrT gene or tyrU gene) to be removed from the chromosome and the two base sequences adjacent to each other on the chromosome (both about 50 bases) are designated as sequences X-L and x-R, respectively.
  • sequences X-L and x-R are designated as sequences X-L and x-R, respectively.
  • CAT gene chloramphenicol resistance gene
  • tyrS-L was determined as X-L and tyrS-R was determined as x-R.
  • tyrS-L ATGCGTGGAAGATTGATCGTCTTGCACCCTGAAAAGATGCAAAAATCTTG (SEQ ID NO: 4)
  • tyrS-R ACAGGGAACATGATGAAAAATATTCTCGCTATCCAGTCTCACGTTGTTTA (SEQ ID NO: 5)
  • tyrS-Lm Primers were made.
  • tyrSL-CmF and tyrSR-CmRl A DNA fragment containing the CAT gene with tyrS-L and tyrS-R ligated to both ends was amplified by performing PCR using the vector pACYC184 as a saddle type.
  • the nucleotide sequence of the CAT gene is shown in SEQ ID NO: 16.
  • the CAT gene consists of a transcriptional promoter sequence and a Shine-Dalgarno sequence.
  • SD sequence is included, and transcription termination sequence is not included.
  • the transcription promoter and SD sequence allow the expression of the CAT gene itself. Since the transcription promoter of the pdxY gene located downstream of the tyrS gene is present inside the tyrS gene, knocking out the tyrS gene causes the expression of the pdxY gene to disappear. Therefore, the expression of the pdxY gene can be coupled to the expression of the CAT gene by not including a transcription termination sequence in the introduced CAT gene.
  • the DNA fragment thus amplified was knocked into the chromosome of E. coli T0P10 strain using the QBM kit.
  • the CAT gene knocked in on the chromosome has tyrS-L and tyrS-R at both ends. Therefore, the CAT gene can be removed from the chromosome by knocking in the DNA fragment directly linked to tyrS-L and tyrS-R onto the chromosome using the QBM kit. That is, tyrS-L and DNA breaks directly linked to tyrS-R! When the piece is knocked into the chromosome correctly,
  • Strain T0P10 becomes chloramphee-coal (Cra) sensitive.
  • Cm-sensitive Escherichia coli was selected according to the following procedure.
  • 1 to 100,000 E. coli are cultured in a liquid LB medium.
  • 10 ⁇ g / mL add 10 ⁇ g / mL Cm to the medium and continue the culture.
  • After 30 minutes add 200 ⁇ g / mL ampicillin to the medium, and continue culturing for about 30 minutes to 1 hour until E. coli is dissolved.
  • the tyrS gene is knocked out from the chromosome of E. coli T0P10.
  • tyrT gene which is one of tyrosine tRNA genes in E. coli strain 0-0, was knocked out. At this time, tyrT-L was determined as x-L and tyrT-R was determined as x-R.
  • tyrT-L AAAATAACTGGTTACCTTTAATCCGTTACGGATGAAAATTACGCAACCAG (SEQ ID NO: 8)
  • tyrT-R AGTCCCTGAACTTCCCAACGAATCCGCAATTAAATATTCTGCCCATGCGG (SEQ ID NO: 9)
  • yr-C is a pair of TL-C that uses the CAT gene on the vector pACYC184 for PCR Designed and chemically synthesized.
  • the CAT gene contained in the DNA fragment amplified by PCR contains a transcription promoter sequence and a Shine-Dalgarno sequence (SD sequence), and a transcription termination sequence.
  • SD sequence Shine-Dalgarno sequence
  • the expression of the tpr gene present downstream of the tyrT gene and the expression of the CAT gene can be coupled.
  • the tyrT gene could be knocked out by removing the CAT gene in the same manner.
  • tyrU-L GTAATCAGTAGGTCACCAGTTCGATTCCGGTAGTCGGCACCATCAAGTCC (SEQ ID NO: 1 2)
  • tyrU-R GGCCACGCGATGGCGTAGCCCGAGACGATAAGTTCGCTTACCGGCTCGAA (SEQ ID NO: 13)
  • tyrUR-CmRl was designed and chemically synthesized.
  • the CAT gene contained in the DNA fragment amplified by PCR contains an SD sequence and does not contain a transcription promoter sequence and a transcription termination sequence.
  • the tyrU gene is transcriptionally coupled to both the upstream thrU gene and the downstream glyT gene.
  • a transcription promoter is not required upstream of the CAT gene, and expression of the CAT gene itself is possible if there is an SD sequence for translation. .
  • the CAT gene to be introduced does not contain a transcription termination sequence, the expression of the glyT gene and the expression of the CAT gene can be coupled.
  • the CAT gene was removed in the same manner to knock out the tyrU gene!).
  • CAT gene base sequence 'Is shown in SEQ ID NO: 16.
  • nucleotide sequence of the CAT gene which was used when knocking out the tyrU gene and contained the SD sequence but not the transcription promoter sequence or transcription termination sequence, is shown in SEQ ID NO: 17.
  • E. coli strain T0P10 obtained by knocking out the tyrS, tyrT and tyrU ′ genes as described above (hereinafter referred to as “T0P10 * J” or “ ⁇ 0 ⁇ 10 [ ⁇ tyrT, ⁇ tyrU, ⁇ tyrS , pTK3] strain)) will incorporate tyrosine by TyrRS and tyrosin tRNA of archaeon Methanococcus jannaschi i at the position where tyrosin of all genes expressed in this strain is coded.
  • the suppressor tRNA Taro will synthesize an aloprotein incorporating 3-yodotyrosine at the position of the amber codon that matches the anticodon in T ". Introduced. In addition to the position of the codon encoding tyrosine in the gene encoding the target protein.
  • TyrRS and tyrosine tRNA of archaea ethanococcus jannaschi i are tyrosine incorporated in the same manner as the gene of,
  • the prokaryotic aaRS * mutant TyrRS does not have the ability to aminate tRNA from Methanococcus jannaschi i
  • the TyrRS of Methanococcus jannaschii Aminoashi a suppressor tRNA Tyi " Not be of. Therefore, according to E. coli T0P10 strain into which the plasmid pEcIYRS has been introduced, it is possible to synthesize aloprotein incorporating 3-non-tyrosine, a non-natural amino acid, only at the desired position.
  • an amber mutant gene (SEQ ID NO: 18) of glutathione S monotransferase (hereinafter GST) in which an amber codon was introduced into the coding sequence was used.
  • GST glutathione S monotransferase
  • the 25th codon from the N-terminus is replaced with an amber codon.
  • Peptides obtained by trypsinization of GST protein. Peptides containing this site can be easily detected by mass spectrometry, so it is possible to determine whether the amino acid at this position is odotyrosine. .
  • the GST amber mutant gene is linked to the appropriate expression promoter and cloned onto pEcIYRS. By roning, it can be expressed in E. coli.
  • a suitable promoter is, for example, the lacZ-UV5 promoter.
  • the plasmid pEcIYRS obtained by cloning the GST amber mutant gene is designated as plasmid pEcIYRS-GST. (Am).
  • the method for introducing plasmid pEcIYRS-GST (Am) into the T0P10 * strain is as follows.
  • Liquid LB medium 1. Inoculate and culture TOP10 * in 5 mL, collect the culture solution when the bacteria have grown to a concentration of about 1 million cells / mL, and centrifuge at 4 degrees for 30 seconds at llOOOrpm to remove the cells. Precipitate. After discarding the supernatant, suspend the precipitate in ImL of ice-cold sterile water. Centrifuge again 4 times at lOOOrpm for 30 seconds to precipitate the cells, discard the supernatant, and then resuspend in ImL of ice-cold sterile water. Finally,.
  • plasmid pEcIYRS-GST (Am) is introduced into the same strain to produce TOP10 * [pEcIYRS-GST (Am)].
  • T0P10 * [pEcIYRS-GST (Am)] was added to 0. lmg / mL of 3-L-yodotyrosine, and 0. lmg. Incubate in liquid LB medium containing / mL ampicillin. To induce GST (Am) gene expression, add isopropyl 1_thio- ⁇ -D-galactosid (IPTG) to the medium to a final concentration of 1 mM. Bacteria are collected within a few hours after the addition of IPTG, and an E.
  • IPTG isopropyl 1_thio- ⁇ -D-galactosid
  • coli extract is prepared by a known method, and then GST is purified using a GST absorptive column (Amersham). By analyzing the obtained GST by mass' analysis, it can be confirmed that the tyrosine tyrosine is introduced at the predetermined position 25 and that other thymus codons are translated into tyrosine.
  • E. coli strain T0P10 having ⁇ 3 was obtained by the method described above.
  • a mutant strain ( ⁇ 0 ⁇ 10 [ ⁇ tyrS, PTK3] strain) in which the tyrS gene was knocked out in (T0P10 [pTK3] strain) was prepared.
  • mutant strain (T0P10 [A tyrU, ⁇ tyrS, pTK3] strain) in which the tyrU gene was knocked out in the mutant strain (TOP10 [A tyrS, pTK3] strain) was prepared by the method described above.
  • plasmid 2541supF was prepared.
  • the plasmid 2541su P F, and click port Ramufuwenikoru resistance gene ⁇ members variant, the amber suppressor tRNA gene derived from Escherichia coli tyrosine tRNA is Kuroyungu.
  • SEQ ID NO: 19 shows the full-length base sequence of plasmid 2541supF.
  • E. coli In E. coli was introduced plasmid 2541su P F, if E. coli TyrRS (tyrS gene product) is expressed, the suppressor tRNA is working Kunoda present in plasmid 2541su P F. To Nba one mutation is suppressed Thus, chloramphenicol resistance is developed. On the other hand, if Escherichia coli TyrRS (tyrS gene product) is knocked out in E. coli into which plasmid 2541supF has been introduced, chloramphenicol resistance is not expected to be expressed.
  • the suppressor tRNA present in plasmid 2541supF is not recognized by archaeal TyrRS, so even if archaea-derived TyrRS is expressed in Escherichia coli introduced with plasmid 2541supF, chloramphenicol resistance is not expressed. . '
  • Fig. 1 shows the results of transforming T0P10 [AtyrU, AtyrS, pTK3] strain and wild-type T0P10 strain with plasmid 2541supF and then culturing in chloramphenicol-containing medium.
  • the T0P10 strain designated WT
  • plasmid 2541supF was able to grow on a medium containing chloramphenicol (Cm).
  • the T0P10 [A tyrU, A tyrS, pTK3] strain designated as tyrS KO
  • the T. coli TyrRS was not expressed in the T0P10 [A tyrU, ⁇ tyrS, pTK3] strain.
  • the tyrT gene was knocked out in the T0P10 [AtyrU, ⁇ tyrS, pTK3] strain by the method described above, and a mutant strain (T0P10 [AtyrT, ⁇ tyrU, ⁇ tyrS, pTK3] strain) was constructed. In the prepared mutant strain, it was verified that all tyrosine tRNAs endogenous to E. coli were knocked out. The verification experiment was performed as follows.
  • E. coli TyrRS mutant was expressed in the TOP10 [AtyrT, ⁇ tyrU, ⁇ tyrS, pTK3] strain.
  • This mutant one described in the literature (Kiga, D et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 9715-9723.) was used.
  • This Escherichia coli TyrRS mutant has a function of recognizing 3-yodotyrosine (or 3-promotyrosine) and binding it to Escherichia coli tyrosinal tRNA. Therefore, when E.
  • T0P10 [AtyrT, ⁇ tyrU, ⁇ tyrS, pTK3] and T0P10 [ ⁇ tyrU, AtyrS, pTK3] strains were introduced into E. coli TyrRS mutants in bromotyrosine-containing and bromotyrosine-free media, respectively.
  • the growth curve is shown in FIG.
  • the strain in which the E. coli TyrRS mutant was introduced into the T0P10 [AtyrU, ⁇ tyrS, pTK3] strain is denoted as “AtyrS”, and the E. coli TyrRS mutant in the T0P10 [AtyrT, ⁇ tyrU, ⁇ tyrS, pTK3] strain.
  • the strain into which was introduced was expressed as “tyr-MjJ.
  • the horizontal axis represents the culture time.
  • Chromosomal DNA was extracted using a commercially available kit Gen Torukun TM (for yeast) (Takara Bio Inc.).
  • Gen Torukun TM for yeast
  • tyrU gene and tyrS gene a pair of primers having the following base sequences were designed and prepared by chemical synthesis.
  • AAAAGTCGTGTACCGGCAAAG SEQ ID NO: 2 4)
  • the tyrT gene amplification primer is set to the sequence before and after the tyrT gene and the tyrV gene
  • the tyrU gene amplification primer is set to the sequence before and after the tyrU gene
  • the tyrS gene amplification primer is set to the sequence before and after the tyrS gene. Set to array.
  • T0P10 [A tyrT, AtyrU, AtyrS, pTK3] and wild T0P10 strains chromosomal DNA was extracted and PCR was performed, and the PCR amplified fragments were confirmed by electrophoresis as shown in Fig. 3. .
  • the results using the T0P10 strain are expressed as “WT”
  • the results using the T0P10 [A tyrT, ⁇ tyrU, ⁇ tyrS, pTK3] strain are expressed as “ ⁇ ”. It was written as “tyrU”, “A tyrS” and “A tyrT”.
  • the positions of the amplified fragments that appear when the tyrT, tyrU, and tyrS genes are amplified using the chromosomal DNA of the T0P10 strain as a saddle type are indicated by triangles.
  • a non-natural amino acid is used at a desired position using a prokaryotic aminoacyl tRNA synthetase mutant and a prokaryotic cell as a host cell.
  • This prokaryotic-derived aminoacyl-tRNA synthetase mutant can also be used in a method for producing a protein incorporating an unnatural amino acid using a eukaryotic cell as a host.
  • a prokaryotic cell-derived aminoamino tRNA synthetase mutant can be used in a system in which either a prokaryotic cell or a eukaryotic cell is used as a host cell.
  • a eukaryotic type aminoacyl tRNA synthetase mutant is used, and a eukaryotic type cell is used as a host cell. Proteins incorporating natural amino acids can be produced.
  • this eukaryotic type aminoacyl-tRNA synthetase mutant is a protein that incorporates a non-natural amino acid hosted in a prokaryotic cell. It can also be used in high quality production methods.
  • a eukaryotic type amino acid / 'retRNA synthase mutant is used in a prokaryotic cell or a eukaryotic type cell as a host cell. Can do.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

　原核生物由来のaaRS*及び真核生物タイプのaaRS*のいずれか一方を用い、原核細胞及び真核生物タイプの細胞のいずれも宿主細胞として使用する　(a)所定の天然型アミノ酸に対する特異性に比べて、当該天然型アミノ酸に類似する非天然型アミノ酸に対する特異性が高められた原核生物由来アミノアシルtRNA合成酵素変異体をコードする遺伝子と、当該原核生物由来アミノアシルtRNA合成酵素変異体の存在下で当該非天然型アミノ酸と結合可能な非天然型アミノ酸用tRNA遺伝子とを、上記所定の天然型アミノ酸に対する特異性を有する真核生物タイプのアミノアシルtRNA合成酵素をコードする遺伝子と、当該真核生物タイプのアミノアシルtRNA合成酵素の存在下で当該天然型アミノ酸と結合可能なtRNA遺伝子とを発現する原核細胞に導入する工程、(b)上記原核細胞に本来的に存在する、上記天然型アミノ酸に対する特異性を有する内在のアミノアシルtRNA合成酵素をコードする遺伝子と、当該内在のアミノアシルtRNA合成酵素の存在下で当該天然型アミノ酸と結合可能な内在のtRNA遺伝子とをノックアウトする工程を備える。

Description

, 明 細 書 非天然型ァミノ酸を組み込んだタンパク質の製造方法 技術分野 .
本発明は、所望の位置に非天然型アミノ酸を組み込んだタンパク質の製造方法、 当該製造方法に使用する宿主細胞及び当該製造方法に使用する無細胞タンパク質 合成系試薬キッ トに関する。 . 背景技術 '
天然のタンパク質は、 天然に存在する 20種類のアミノ酸 （以下、 天然型ァミノ 酸と称する） から構成される。 タンパク質の構造や機能を解析したり、 その化学 的性質を拡張する場合、 アミノ酸配列における所望の位置に、 天然に存在しない アミノ酸 （以下、 非天然型アミノ酸と称する） を組み込む手法が知られている。 なお、 非天然型ァミ.ノ酸を組み込んだタンパク質をァロプロティ 'と称する。 ところで、 アミノアシル tRNA合成酵素.（以下、 aaRS と称する） は、 特定のァ ミノ酸と特定の tRNAとを特異的に結合させる酵素であり、生物種ごとに、一部の 例外を除き 20種類の天然型アミノ酸それぞれに対応して 20種類存在する。 ァロ プロテインを合成する場合、 非天然型アミノ酸に対応する新たな aaRS (以下、 aaRS*と称する） 及び天然型アミノ酸をコードしないコドンと対合する tRNA (以 下、 tRNA*と称する） を宿主細胞に組み込み、 正確に機能させる必要がある。 すな わち、 宿主細胞において、 本来は天然型アミノ酸をコードしないコ ドンに、 aaRS* によって非天然型アミノ酸を結合した tRNA*を対合させ、 非天然型アミノ酸を組 み込んだァロプロティンを合成することができる。
このとき、 aaRS*は、 特定の天然型アミノ酸に特異的な既存の aaRSをベースと して、 この特定の天然型ァ ノ酸と類似する非天然型アミノ酸を基質とする活性 を持たせるように機能改変することによって作出される。 例えば、 チロシン （天 然型アミノ酸） に類似する 0-メチルチロシン （非天然型アミノ酸） に特異的な aaRS*を作出する際には、既存のチロシル tRNA合成酵素（TyrRS)をベースとして、 O -メチルチ口シンに対する 異性が高められた TyrRS変異体を作出する。このよ うに作出した aaRS*を使用してァロプロテインを合成する場合、 宿主細胞が本来 的に備える 20種類の天然型アミノ酸友びこれらに対応する tRNAと反応せず、 所 定の非天然型ア^:ノ酸及び tRNA*と特異的に反応する aaRS*を使用しなければな らない。 .
したがって、 aaRS*は、 所定の非天然型アミノ酸に対する特異性が、 既存の天然 型アミノ酸に対する特異性に比べて十分に高められた aaRS*を用いる。 そうでな ければ、 所定の非天然型アミノ酸が導入されるべき位置に天然型ァミノ酸が導入 されたタンパク質が合成されてしまうからである。 また、 aaRS*が、 tRNA*以外に 宿主細胞に本来的に備わっている tRNAとも反応するならば、非天然型ァミノ酸を 導入すべき位置以外にも、 天然型アミノ酸であるべき位置に非天然型アミノ酸が 導入されることになる。 この問題が起こらないためには、 宿主細胞として原核細 胞を使用する場合、 aaRS*は真核生物タイプの aaRS をベースに構築した aaRS*を 使用する。 なぜなら、 真核^物タイプの aaRSは原核生物の tRNAとは反応しにく いからである。なお、 ここで"真核生物タイプの aaRS"とは、真核生,物由来の aaRS または古細菌由来の aaRSを意味している。.仮に、宿主細胞として原核細胞を使用 し、 原核生物由来の aaRS*を導入した場合、 当該 aaRS*は、 tRNA*のみならず、 宿 主に本来備わった天然型アミノ酸に対応する tRNA を基質として複数種のアミノ ァシル tRNAを合成してしまう虞があり、 この場合には上記の理由から、遺伝子の 一意的なタンパク質への翻訳が困難となる。 よって、 宿主細胞として原核細胞を 使用する場合、 真核生物タイプの aaRS*を使用する。 逆に、 宿主細胞として真核 生物タイプの細胞を使用する場合、 aaRS*は原核生物由来の aaRSをベースに構築 するものを使用する。
以上のように、 ァロプロテインを合成する場合、 使用する宿主細胞が真核細胞 であるか原核細胞であるかによって、 適切な aaRS*を作出しなければならない。 宿主細胞が真核生物タイプであるか原核細胞であるかに拘わらず、 いずれの場合 において使用可能な aaRS*はまれである。 したがって、 特定の非天然型アミノ酸 を組み込んだァ口プロティンを真核生物タイプの細胞及ぴ原核細胞で合成しよう とすると、原核生物由来の aaRS*及び真核生物タイプの aaRS*を作出する必要があ る。 ところが、 aaRS*の作出に 、 非天然型アミノ酸を基質とする活性を持たせる ように既存の aaRSの機能改変を成功させなければならず、多大な労力を要すると いった問題がある。 '
特許文献 1 WO 2 0 0 3 0 1 4 3 5 4
特許文献 2 W O 2 0 0 4 / 0 3 9 9 8 9 発明の開示
そこで、 本発明は、 上述 ·した実状に鑑み、 原核生物由来の aaRS*及び真核生物 タイプの aaRS*のいずれか一方を用い、 原核細胞及び真核生物タイプの細胞のい ずれも宿主細胞として使用することができるァロプロティンの製造方法を提供す ることを目的とする。
上述した目的を達成した本発明に係るァロプロテインの製造方法は以下の工程 を含む。
(a) 所定の天然型アミノ酸に対する特異性に比べて、当該天然型アミノ酸に類 似する非天然型アミノ酸に対する特異性が高められた原核生物由来 /アミノアシル tRNA合成酵素変異体をコードする遺伝子と、当該原核生物由来アミノアシル tRNA 合成酵素変異体の存在下で当該非天然型ァミノ酸と結合可能な非天然型ァミノ酸 用 tRNA遺伝子とを、上記所定の天然型アミノ酸に対する特異性を有する真核生物 タイプのアミノアシル tRNA合成酵素をコ一ドする遺伝子と、当該真核生物タイプ のアミノアシル tRNA合成酵素の存在下で当該天然型アミノ酸と結合可能な tRNA 遺伝子とを発現する原核細胞に導入する工程
(b) 上記原核細胞に本来的に存在する、上記天然型アミノ酸に対する特異性を 有する内在のァミノアシノレ tRNA合成酵素をコードする遺伝子と、当該内在のァミ ノアシル tRNA合成酵素の存在下で当該天然型ァミノ酸と結合可能な内在の tRNA 遺伝子とをノックアウトする工程
(c) 上記非天然型アミノ酸用 tRNA遺伝子のアンチコドンに対合するコ ドンを 有する目的遺伝子によりコードされる目的タンパク質を、 上記原核細胞中で発現 させる工程
以上の本発明に係るァロプロテインの製造方法では、 上記アンチコドンに対合 6 324043 するコ ドンの位置に上記非天 型アミノ酸を取り込ませ、 原核細胞において所望 のァロプロテインを製造することができる。 なお、 本発明において使用する原核 生物由来アミノアシル tRNA合成酵素 異体は、原核細胞においてァロプロテイン を合成する系に限定されず、 真核細胞でァロプロティンを合成する系にも適用す ることができる。
また、 本発明に係るァロプロテインの製造方法は、 以上のような原核細胞を宿 主細胞として使用する系に限定されず、真核生物タイプのアミノアシル tRNA合成 酵素変異体.を使用して真核生物タイプの細胞を宿主細胞として使用する系にも適 用することができる。
また、 本発明に係る原核細胞ほ、 以下の特徴を有している。
(a) 所定の天然型アミノ酸に対する特異性を有する真核生物タイプアミノア シル tRNA 合成酵素をコードする遺伝子と、 当該真核生物タイプのアミノアシル tRNA合成酵素の存在下で当該天然型アミノ酸と結合可能な tRNA遺伝子とが導入 されている ，
(b) 原核細胞に本来的に存在する、上記天然型アミノ酸に対する ,特異性を有す る内在のァミノアシル tRNA合成酵素をコードする遺伝子と、当該内在のァミノア シル tRNA合成酵素の存在下で当該天然型アミノ酸と結合可能な内在の tRNA遺伝 子とがノックアウトされている。
以上のような特徴を有する本発明に係る原核細胞は、 非天然型アミノ酸と類似 する天然型アミノ酸を組み込む際には、真核生物タイプのアミノアシル tRNA合成 酵素及びこれに対応する真核生物タイプの tRNAを使用することとなる。
さらに、 本発明に係る無細胞タンパク質合成系試薬キットは、 少なくとも以下 の要素を含む。
(a) 所定の天然型アミノ酸に対する特異性に比べて、当該天然型アミノ酸に類 似する非天然型アミノ酸に対する特異性が高められた原核生物由来アミノアシル tRNA合成酵素変異体 .
(b) 上記原核生物由来ァミノアシル tRNA合成酵素変異体の存在下で上記非天 然型アミノ酸と結合可能な非天然型アミノ酸用 tRNA
(c) 上記非天然型ァミノ酸を含むァミノ酸溶液 (d) ·上記所定の天然型ァ ノ酸に対する特異性を有する真核生物タイプのァ ミノァシル tRNA合成酵素をコ一ドする遺伝子と、当該真核生物タイプのアミノア シル tRNA合成酵素の存在下で当該天然型ァミノ酸と結合可能な tRNA遺伝子とが 導入されるとともに、 原核細胞に本来的に存在する、 上記天然型アミノ酸に対す る特異性を有する内在のアミノアシル tRNA合成酵素をコ一ドする遺伝子と、当該 内在のアミノアシル tRNA 合成酵素の存在下で当該天然型アミノ酸と結合可能な 内在の tRNA遺伝子とがノックアウトされた原核細胞の抽出液
以上のような無細胞タンパク質合成系試薬キットを使用した場合、 非天然型ァ ミノ酸と類似する天然型アミノ酸を組み込む際には、 真核生物タイプのアミノア シル tRNA合成酵素及びこれに対応する真核生物タイプの tRNAを使用することと なる。 なお、 本発明に係る無細胞タンパク質合成系試薬キッ トは、 以上のような 原核細胞の抽出液を使用する系に限定されず、 真核生物タイプのァミノァシル tRNA 合成酵素変異体を使用して真核細胞の抽出液を使用する系にも適用するこ とができる。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2005-338402号の明細書 および または図面に記載される内容を匂含する。 図面の簡単な説明 '
図 1は、 T0P10 [ A tyrlI， A tyrS, ρΤΚ3']株及び T0P10 株をそれぞれプラスミ ド 2541supFで形質転換した後、 ク口ラムフユ二コール含有培地及ぴ 口ラムフエ二 コール非含有培地で培養した結果を示す写真である。
図 2は、 T0P10 [ A tyrT, Δ tyrU, 'Δ tyfS, pTK3]株及ぴ ΤΟΡ10 [ Δ tyrU， A tyrS, pTK3]株にそれぞれ大腸菌 TyrRS 変異体を導入した株をプロモチロシン含有培地 及びプロモチロシン非含有培地において生育したときの増殖曲線を示す特性図で ある。
図 3は、 T0P10 [ A tyrT, Δ tyrU, Δ tyrS, pTK3〕株及び T0P10株について、 それ ぞれ染色体 DNAを抽出して PCRを行い、 PCR増幅断片を電気泳動によって確認し た結果を示す写真である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明をより詳細に説明する。
ァロプロテインは、 非天然型アミノ酸を組み込んだタンパク質として定義され る。 本発明に係る非天然型アミノ酸を組み込んだタンパク質の製造方法 （以下、 ァロプロテインの製造方法と称する） は、 原核生物由来又は真核生物タイプのァ ミノァシル tRNA合成酵素変異体 （以下、 aaRS*と称する） を使用するが、 宿主細 胞の種類、 すなわち原核細胞、 真核生物タイプの細胞、 原核細胞由来の無細胞タ ンパク質合成系或いは真核生物タイプの細胞由来の無細胞タンパク質合成系であ るか'を問わず、広く如何なる宿主細胞に対しても aaRS*を使用することができる。 なお、 本発明において、 「真核生物タイプ」 とは、 真核生物及び古細菌を含む意 味である。 従って、 「真核生物タイプのアミノアシル tRNA合成酵素」 と表現した 場合、真核生物由来のアミノアシル tRNA合成酵素及び古細菌由来のアミノアシル tRNA合成酵素を含む意味である。
非天然型アミノ酸
本発明において、 天然型アミノ酸とは、 20種類の天然型アミノ酸とは異なる 構造を有するアミノ酸である。 非天然型アミノ酸は、 天然型アミノ酸に類似する 構造を有するため、特定の天然型アミノ酸の誘導体又は類似体として分類される。 例えば、 非天然型アミノ酸'としては、 天然型アミノ酸であるチロシンの誘導体で ある 3位置換チロシン、 4位置換チロシンを挙げることができる。 3位置換チロ シンとしては、 3—ョードチロシン、 3—ブロモチロシン等の 3—ハロゲン化チ 口シンが挙げられる。 4位置換チロシンとしては、 4一ァセチルー L—フエニル ァラニン、 4—ベンゾィルー L—フエ二ルァラニン、 4一アジドー L—フエ二ノレ ァラニン、 O—メチル一チロシン、 4一ョード一 L—フエ二ルァラニン等を挙げ ることができる。
また、 非天然型アミノ酸としては、 チロシン誘導体に限定されず、 例えば、 ァ ジドアラニン、 アジドホモァラニン、 ノルロイシン、 ノルパリン、 4—アミノ ト リプトフアン、 7—ァザトリブトファン、 6—メチルトリプトファン、 ァセチル リジン、 ボクリジン、 £ーメチルリジン、 1一ナフチルァラユン、 2—ナフ チルァラニン、 スチリルァラニン、 ジフエ二ルァラニン、 チアゾリルァラニン、 2—ピリジルァラニン、 3—ピリジルァラニン、 4一ピリジルァラニン、 アント リルァラニン、 2—ァミノ一 5—へキシノイン酸、 フリルァラニン、 ベンゾチェ 二ルァラニン、 チェ二ルァラニン、 ァリルグリシン、 プロパルギルグリシン、 ホ スホリルセリン、 ホスホリルトレォニン、 2， 3—ジァミノプロピオン酸等を挙 げることができる。
アミノアシル tRNA合成酵素変異体
本発明において、 aaRS*とは、 所定の天然型アミノ酸に対する特異性に比べて、 当該天然型アミノ酸に類似する非天然型アミノ酸に対する特異性が高められた変 異型アミノアシル tRNA合成酵素を意味する。特異性が高められたとは、非天然型 アミノ酸に対する活性値 （反応速度 Kcatをミカエリス定数 Kmで割った値） 天 然型アミノ酸に対する活性値よりも有意に大となっていることを意味する。 活性 値は、 インビトロのアツセィによって測定することができるが、 遺伝学的なデー タから活性値の相対的な大きさを判定することもできる。
,このように定義される aaRS*は、 天然型アミノ酸に対応する既知のアミノアシ ル tRNA 合成酵素の所定の位置に変異を導入することによって取得することがで きる。天然型アミノ酸に対応する既知のァ.ミノァシル tRNA合成酵素は、 アミノア シル t NAを合成するに際して、先ず、アミノ酸を特異的に認識して AMPを付加す ることで活性化する。既知のアミノアシル tRNA合成酵素については、 アミノ酸の 特異的な認識に寄与する部位が知られており、 当該部位に変'異を導入することに よってその特異性を変化させることができる。 このような知見に基づけば、 天然 型アミノ酸に対する特異性を低減して、 当該天然型アミノ酸に類似する非天然型 ァミノ酸に対する特異性を高めるような変異を導入することができる。 このよう に、既知のアミノアシル tRNA合成酵素における所定の部位に変異を導入すること によって、 所望の特異性を有する aaRS*を作製することができる。
このような aaRS*は、 原核生物及び真核生物タイプのいずれを由来としてもよ いが、原核生物に由来する aaRS*の一例としては、 3—ョードー Lーチロシン（非 天然型アミノ酸） に対する特異性がチロシン （天然型アミノ酸） に対する特異性 に比べて高められた aaRS* (変異 TyrRS と称する） を挙げることができる。 変異
TyrRSは、 下記の文献に記載されている。 Kiga, D. , Sakamoto, K. , Kodama, Κ. , Kigawa, T.， Matsuda, T. , Yabuki, T.， Shirouzu, M. , Harada, Y. , Naklayama,
H.， Takio, K. , Hasegawa, Y. , Endo, Y.， Hirao, I. and Yokoyama, S. (2002) An engineered Escherichia col i tyros'yl - tRNA synthetase for site-specific incorporation of an unnatural amino acid into proteins in eukaryotic translation and its appl ication in a wheat germ cell-free system. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 99， 9715-9723.
この文献によれば、大腸菌由来のチロシル tRNA合成酵素における 3 7位のチロ シン （Y ) 及び 1 9 5位のグルタミン （Q ) に相当する位置を他のアミノ酸に置 換するこどで、 3—ハロゲン化チロシン （非天然型アミノ酸） への特異性が高め られた変異体を得ることができる。 さらに好ましくは、 3 7位チロシン （Y ) に 相当する位置がパリン （V：)、 ロイシン （L )、 イソロイシン （ I ) 又はァラニン
(A) で置換され、 且つ、 1 9 5位グルタミン （Q ) に相当する位置がァラニン
( A)、 システィン （C)、 セリン （S ) 又はァスパラギン （N) で置換された変 異体を使用できる。 これらの変異体は、 特に 3—ョードー Lーチロシンに対する 特異性が高められている。 ，
なお、 このような変異体をコードする遺伝子を製造する方法は、 公知の遺伝子 操作技術により容易に行うことができる。 例えば、 部位特異的変異導入法と呼ば れる手法により、 或いは、'部位特異的変異導入法を実施するための市販のキッ ト を使用して変異体をコー 'ドする遺伝子を製造することができる。
また、 その他の原核生物に由来する aaRS*としては、 Chin, J. W. Cropp, Τ. A.，
Anderson, J. C. , Mukherj i, M. , Zhang, Z. , and Schlutz, P. G. (2003) An expanded eukaryotic genetic code.' Science 301， 964— 967 に目 cl載'されたもの、 及び Deiters, A. , Cropp, T. A.， Mukherji, M. , Chin, J. W. , Anderson, J. ， and Schul tz, P. G. . (2003) Adding amino acids with novel reactivity to the genetic cods of Saccharomyces cerevisiae. J. Am. Chem. Soc. 125, 11782-11783 に記載されたものを挙げる.ことができる。
一方、真核生物タイプに由来する aaRS*の一例としては、 Santoro, S. W. , Wang,
L. , Herberich, Β. , King, D. S.， Schultz, P. G.： An efncient system for the evolution of aminoacyl - tRNA synthetase specificity, Nature Biotechnol. 20, 1044-1048 (2002)に記載されたもの、 及び Wang, L. , Brock, A. , Herberich, B. , Schu丄 tz, P. G.： Expanding the genetic code of Escherichia col i, Science 292, 498-500 (2001) に記載されたものを挙げることができる。'
非天然型ァミノ酸用 tRNA遺伝子
非天然型アミノ酸用 tRNA遺伝子とは、上述した aa,RS*により認識されるととも に、 活性化された非天然型アミノ酸が転移する 3'末端を有する tRNAをコードす る遺伝子である。 すなわち、 上述した aaRS*は、 特定の非天然型アミノ酸を認識 して、 非天然型アミノ酸- AMPを合成するとともに、 非天然型アミノ酸用 tRNAの 3'末端に非天然型アミノ酸を転移させる活性を有している。
ここで、 非天然型アミノ酸用 tRNAは、 20種類の天然型アミノ酸に対応するコ ドン以外の遺伝暗号に対して特異的に対合するアンチコドンを有している。 非天 然型アミノ酸用 tRNAのアンチコドンは、 UAGアンバーコ ドン、 UAAオーカーコ ド ン及び UGAオパールコドンからなるナンセンスコドンに対合する配列であること 力 S好ましい。 言い換えると、 非天然型アミノ酸用 tRNAは、 ナンセンス ·サブレツ サ一 tRNAであることが好ましい。 なかでも、 非天然型アミノ酸用 t,RNAは、 サプ レッサー tRNAのうち UAG (アンバーコドン） に対合するアンチコドンを有するも のであることが好ましい。 その理由の 1つは、 オパールコドンは低い効率でトリ ブトファンに翻訳されることがあり、 このコ ドンを用いたとき非天然型アミノ酸 と トリプトファンの 2種類のアミノ酸に翻訳される虞があるために、 オパールコ ドンは用いることが適当でないからである。 もう 1つの理由は、 アンバーコドン は 3字目に Gを持つからである。 コドン 3字目とアンチコドン 1字目の塩基対形 成は比較的不安的であり、 この位置に安定な GC塩基対を形成することは、サブレ ッサー tRNAが UAGコ ドンを非天然型ァミノ酸に効率よく翻訳する上で有利になる からである。
上述した aaRS*として原核生物由来の aaRSの変異体を使用する場合、非天然型 了ミノ酸用 tRNA遺伝子と ては、 同じ原核生物由来の tRNA遺伝子を使用するこ とができる。 特に、 上述した大腸菌由来の変異 TyrRSを使用する場合、 大腸菌由 来のサブレッサ一 tRNA遺伝子を使用することが好ましい。
また、非天然型アミノ酸用 tRNAのアンチコドンとしては、終止コドンに対応す る配列に限定されず、 4塩基 上のコドンと特異的に対合する配列からなるもの であっても良レ、。その他にも、非天然型アミノ酸用 tRNAのアンチコ ドンとしては、 非天然の塩基を含むものであってもよ'い。 この場合には、 'その非天然塩基と特異 的に塩基対を形 することができる別種の非天然塩基をコドンの対応する位置に 導入する。このような非天然塩基のペアとしては、ィソグァニンとィソイチジン、 2—アミノー 6— ( 2—チェニル） プリンとピリジン一 2 _オンが挙げられる。 宿主細胞
上述した aaRS*遺伝子及ぴ非天然型アミノ酸用 tRNA遺伝子が原核生物由来であ るか真核生物タイプであるかに拘わ'らず、 宿主細胞としては真核生物タイプの細 胞及び原核細胞のいずれであっても良い。
原核生物由来の aaRS*遺伝子及び非天然型ァミノ酸用 tRNA遺伝子を使用し、宿 主細胞として原核細胞を使用する場合には、 当該原核細胞において、 aaRS*の基質 となる非天然型ァミノ酸と類似する天然型ァミノ酸に対する特異性を有する aaRSをコードする遺伝子（以下、 「対応する原核細胞内在 aaRS遺伝子」 と称する） と、当該対応する原核細胞内在 aaRS遺伝子の存在下で天然型ァミノ,酸と結合可能 な tRNA遺伝子 （以下、 「対応する原核細胞内在 tRNA遺伝子」 と称する） とを、 真 核生物'タイプの aaRS遺伝子 （以下、 「対応する真核生物タイプ aaRS遺伝子」 と称 する） と tRNA遺伝子 （以下、 「対応する真核生物タイプ tRNA遺伝子」 と称する） とに置き換えるようにする。 '
より具体的には、 宿主細胞が原核細胞である場合、 当該原核細胞において、 対 応する原核細胞内在 aaRS遺伝子 ¾び対応する原核細胞内在 tRNA遺伝子をノック ァゥトするとともに、 当該原核細胞に、対応する真核生物タイプ aaRS遺伝子及び 対応する真核生物タイプ tRNA遺伝子を導入する。 原核生物由来の aaRS*は、 対応 する真核生物タイプ tRNA をアミノアシル化することなく、 非天然型アミノ酸用 tRNAのみをアミノアシル化することとなる。 また、対応する真核生物タイプ aaRS は、非天然型アミノ酸用 tR.NAをアミノアシル化することなく、対応する真核生物 タイプ tRNAのみをアミノアシル化することとなる。
ここで、原核細胞に、対応する真核生物タイプ aaRS遺伝子及び対応する真核生 物タイプ tRNA遺伝子を導入する場合、 これら対応する真核生物タイプ aaRS遺伝 子及び対応する真核生物タイプ tRNA 遺伝子を発現可能な形で導入した発現べク ターを使用する方法、及びこれら対応する真核生物タイプ aaRS遺伝子及び対応す る真核生物タイプ tRNA 遺伝子を発現可能な形で原核細胞のゲノムに導入する方 法のいずれを用いても良い。 導入した遺伝子を高発現させることができ、 ァロプ 口ティンを効率よく合成できるといった理由から発 ¾ベクターを用いる方法が好 ましい。
このように調製した原核細胞では、 導入対象の非天然型アミノ酸に類似する天 然型アミノ酸については、 真核生物タイプ aaRS及び tRNAによってタンパク質に 組み込まれることとなり、 目的とするアミノ酸配列を有するァロプロテインを正 確に合成する際の宿主細胞として利用することができる。
ここで宿主細胞として使用できる原核細胞は、 特に限定されないが、 大腸菌、 枯草菌等を挙げることができる。
また、 上述した大腸菌由来の変異 TyrRSを使用する場合、 真核生物タイプ aaRS としてはメタノコッカス · ジャナシ一 (Methanococcus jannaschi i) 由来のチロ シル tRNA 合成酵素を使用することができる。 メタノコッカス ジャナシ一 (Methanococcus jannaschi i) 由来のチロ.シル tRNA合成酵素は、 以下の （a )、 ( b ) 友び （c ) からなる群から選ばれるいずれか一のタンパク質から構成され ている。
( a ) 配列番号 2に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
( b ) 配列番号 2に示すアミノ酸配列において、 1又は数個 アミ.ノ酸が欠失、 置換又は付加されたァミノ酸配列からなり、 チロシンを活性化するとともにチロ シル tRNAを合成する活性を有するタンパク質
( c ) 配列番号 2に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌク レオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件化でハイブリダィズするポリ ヌクレオチドによりコードされ、 チロシンを活性化するとともにチロシル tRNA を合成する活性を有するタンパク質
さらに、上述した大腸菌由来の変異 TyrRSを使用する場合、真核生物タイプ tRNA としてはメタノコッカス ·ジャナシ一 （Methanococcus jannaschi i) 由来のチロ シン tRNA 遺伝子を使用することができる。 メタノ コッカス · ジャナシー (Methanococcus jannaschi i) 由来のチロシン tRNAは、 以下の （a )、 ( b ) 及び ( c ) からなる群から選ばれるいずれか一のポリヌクレオチドから構成される。 ( & )配列番号1における 4334〜4410番目に示す塩基配列からなるポリヌクレオ チド ；
( b )配列番号 1における 4334〜4410番目に示す塩基配列において、' 1又は数個 の塩基が欠失、 置換又は付加された塩基配列からなり、 活性化されたチロシンを メタノコッカス · ジャナシ一 (Methanococcus jannaschi i) 由来のチロシノレ tRNA 合成酵素の存在下で結合できるポリヌクレオチド '
(じ）配列番号1における 4334〜4410番目に示す塩基配列からなるポリヌクレオ チドの相補鎖に対してストリンジェントな条件化でハイブリダィズし、 活性化さ れたチ口シンをメタノコッカス · ジャナシ一 (Methanococcus jannaschi i) 田来 のチロシル tRNA合成酵素の存在下で結合できるポリヌクレオチド
なお、 ここでストリンジェントな条件とは、 特異的なハイブリダィズが形成さ るが非特異的なハイブリ "ィズは形成されない条件を意味する。 例えば、 緩衝 液として 6 X SSC (0..9M NaCl、 0. 09M 'クェン酸ナトリウム）、 温度 55?Cといった条 件を挙げることができる。
とこ ¾で、原核生物由来の aaRS*遺伝子及び非天然型アミノ酸用 tRNA遺伝子を 使用し、 宿主細胞として真核生物タイプの細胞を使用する場合には、 当該真核生 物タイプの細胞が本来的に有している、天然型ァミノ酸に特異的な aaRS及び当該 aaRSの存在下で天然型アミノ酸と結合可能な tRNA遺伝子を ί可ら置換すること無 く使用することができる。 言い換えれば、 この場合、 宿主細胞となる真核生物タ イブの細胞はそのまま使用することができる。
ここで宿主細胞として使用できる真核生物タイプの細胞は、 特に限定されない が、 酵母細胞、 植物細胞、 昆虫細胞及び哺乳動物細胞等の真核細胞並びに古細菌 を挙げることができる。 なかでも遺伝子組換え系が確立されている哺乳類細胞が 好ましい。 有用な哺乳動物細胞系としては、 チャイニーズハムスター卵巣 （CH0) 細胞と COS細胞が挙げられる。 より具体的には、 SV40によって形質転換したサル 腎臓 CV1系（COS- 7)、ヒ ト胚腎臓系（293細胞）、チャイニーズハムスタ一卵巣/ -DHFR 系、 マウスセルトーリ細胞 （TM4)、 ヒ ト肺細胞 （W138)、 ヒ ト肝臓細胞 （Hep G2) 及びマウス乳癌細胞 （丽 T060562) を挙げることができる。
—方、真核生物タイプの aaRS*遺伝子及び非天然型アミノ酸用 tRNA遺伝子を使 用し、 宿主細胞として真核生物タイプの細胞を使用する場合には、 当該真核生物 タイプの細胞において、 aaRS*の基質となる非天然型アミノ酸と類似する天然型ァ ミノ酸に対する特異性を有する aaRSをコードする ¾伝子 （以下、 「対応する真核 生物内在 aaRS遺伝子」 と称する） と、 当該対応する真核生物内在 aaRS遺伝子の 存在下で天然型アミノ酸と結合可能な tRNA遺伝子 （以下、 「対応する真核生物内 在 tRNA遺伝子」 と称する） とを、 原核生物由来の aaRS遺伝子 （以下、 「対応する 原核生物由来 aaRS遺伝子」 と称する） と tRNA遺伝子 （以下、 「対応する原核生物 由来 tRNA遺伝子」 と称する） とに置き換えるようにする。
より具体的には、 宿主細胞が真核生物タイプの細胞である場合、 当該真核生物 タイプの細胞において、対応する真核生物内在 aaRS遺伝子及び対応する真核生物 内在 tRNA遺伝子をノックァゥトするとともに、 当該真核生物タイプの細胞に、対 応する原核生物由来 aaRS遺伝子及び対応する原核生物由来 tRNA遺伝子を導入す る。 真核生物タイプ.の aaRS*は、 対応する原核細胞由来 tRNAをアミノアシル化す ることなく、非天然型アミノ酸用 tRNAのみをアミノアシル化することとなる。 ま た、 対応する原核生物由来の aaRSは、 非天然型アミノ酸用 tRNAをアミノアシル 化することなく、対応する原核生物由来 tRNAのみをアミノァシル化することとな る。
ここで、真核生物タイプの細胞に、対応する原核生物由来 aaRS遺伝子及び対応 する原核生物由来 tRNA遺伝子を導入する場合、これら対応する原核生物由来 aaRS 遺伝子及び対応する原核生物由来 tRNA 遺伝子を発現可能な形で導入した発現べ クタ一を使用する方法、及びこれら対応する原核生物由来 aaRS遺伝子及び対応す る原核生物由来 tRNA 遺伝子を発現可能な形で真核生物タイプの細胞のゲノムに 導入する方法のいずれを用いても良い。 導入した遺伝子を高発現させることがで き、 ァロプロティンを効率よく合成できるといった理由から発現ベクターを用い る方法が好ましい。
このように調製した真核生物タイプの細胞では、 導入対象の非天然型ァミノ酸 に類似する天然型ァミノ酸については、 原核生物由来の aaRS及び tRNAによって タンパク質に組み込まれるこ となり、 目的とするアミノ酸配列を有するァロプ 口ティンを正確に合成する際の宿主細胞として利用することができる。
また、真核生物タイプの aaRS*遺伝子及び非天然型アミノ酸用 tRNA遺伝子を使 用し、 宿主細胞として原核細胞を使用する場合には、 当該原核細胞が本来的に有 している、 天然型ァミノ酸に特異的な aaRS及び当^ aaRSの存在下で天然型ァミ ノ酸と結合可能な tRNA遺伝子を何ら置換すること無く使用することができる。言 い換えれば、 この場合、 宿主細胞となる原核細胞はそのまま使用することができ る。
目的タンパク質及びその製造方法 '
上述した aaRS*遺伝子、非天然型ァミノ酸用 tRNA遺伝子及び宿主細胞を用いて、 非天然型アミノ酸を組み込んだ自的タンパク質 （ァロプロテイン） を製造するこ とができる。 目的タンパク質の種類としては、 何ら限定されるものではない。 但 し、 目的.タンパク質をコードする遺伝子において、 所望の位置のコドンを上述し た非天然型アミノ酸用 tRNAのアンチコドンと対合する配列としておく。これによ り、 所望の位置に非.天然型ァミノ酸を有するァロプロティンを製造することがで きる。 具体的には、 いわゆる部位特異的変異導入法によって野生型の遺伝子にお ける所望の位置を、非天然型アミノ酸用 tRNAのアンチコドンと対合する配列に変 異させることで、 ァロプロテインをコードする遺伝子を作製することができる。 作製した目的タンパク質をコードする遺伝子は、 通常の方法によって宿主細胞 に導入され、 当該宿主細胞内で発現することとなる。 宿主細^においては、 当該 遺伝子における非天然型アミノ酸用 tRNA のアンチコドンに対合するコ ドンの位 置に非天然型アミノ酸を組み込んだァロプロテインを合成することができる。
目的タンパク質 （ァロプロテイン） としては、 何ら限定されないが、 例えば、 細胞情報伝達に関わる一群のタンパク質 （上皮成長因子受容体、 神経成長因子受 容体、 Grab2タンパク質、 Srcキナーゼ、 Rasタンパク質など）、 翻訳に関わる一 群のタンパク質 （ポリペプチド伸長因子、 開始因子、 転写終結因子、 リボソーム タンパク質、 アミノアシル tRNA合成酵素など） や転写因子、 膜タンパク質などが 挙げられる。
得られたァロプロテインは、 （i) X線結晶解析による構造決定に用いたり、 （i i) 細胞情報伝達経路の解明のた に光クロスリンクゃ部位特異的蛍光標識を施した り、 （i i i) 薬効を高めるためのポリエチレングリコール化を部位特異的に施した 上でタンパク質性薬剤として用いるなどの用途がある。 さらに、 部位特異的なァ ミノ酸置換による ;タンパク質の機能解析において、 置換に用いることのできるァ ミノ酸の種類は従来、 天然の 2 0種類に限られていたが、 非天然型アミノ酸を用 いればこれに制限されることなく様々なアミノ酸残基に置換することができる。 このようにして、 一連の変異体を作成して解析することで、 タンパク質中の特定 部位のァミノ酸残基の役割を詳細に明らかにすることも可能である。
無細胞タンパク質合成系試薬キット '
また、 上述した aaRS*及び非天然型アミノ酸用 tRNAは、 いわゆる無細胞タンパ ク質合成系試薬キットの一部として使用することができる。 一般に無細胞タンパ ク質合成系試薬キッ トは、 各種細胞の抽出液をタンパク質合成能を欠損しない形 で含んでいる。 無細胞タンパク質合成系においては翻訳系、 転写 ·翻訳系が知ら れており、それぞれ目的タンパク質をコードする mRNA又は DNAを反応液に加える ことによって、 抽出液に含まれる各種酵素の働きによりタンパク質,を合成してい る。 .
本発明に係る無細胞タンパク質合成系試薬キットは、 少なくとも、 所定の天然 型アミノ酸と類似する非天然型アミノ酸を含むアミノ酸溶液と、 上述した aaRS* 及び非天然型アミノ酸用 tRNAのセッ 卜と、宿主細胞の抽出液とを含むものである。 また、 本発明に係る無細胞タンパク質合成系試薬キットは、 一般に市販されてい る公知の無細胞タンパク質合成系試薬キットに含まれる、 目的タンパク質をコー ドする遺伝子を組み込むことができる'べグター DNA 溶液、 目的タンパク質をコー ドする遺伝子の転写を行うための RNAポリメラーゼを含む試薬セッ ト等を含んで いても良い。
特に、 本発明に係る無細胞タンパク質合成系試薬キットにおいて、 上述した宿 主細胞の抽出液は、 真核生物タイプの細胞及び原核細胞いずれの抽出液であって も良い。 但し、 原核生物由来 aaRS*を使用し、 原核細胞の抽出液を使用する場合 には、 上述した 「対応する原核細胞内在 aaRS遺伝子」 及び 「対応する原核細胞内 在 tRNA遺伝子」 をノックアウ トし、 「対応する真核生物タイプ aaRS遺伝子」 及び 「対応する真核生物タイプ tRNA遺伝子」を導入した原核細胞の抽出的を使用する。 このとき、 「aaRS*遺伝子」 及び 「非天然型ァミノ酸用 tRNA遺伝子」 を原核細胞 にさらに導入するか、 または、 「aaRS*'」 及び 「非天然型アミノ酸用 tRNA」 をその まま原核細胞の 養液に添加することにより、当該原核細胞の抽出液内に「aaRS*J 及び 「非天然型アミノ酸用 tRNA」 を含ませることが.できる。
また、 本発明に係る無細胞タンパク質合成系試薬キッ トにおいて、 原核生物由 来の aaRS*を使用し、 真核生物タイプの細胞抽出液を使用する場合には、 当該真 核生物タイプの細胞が本来的に有している、天然型アミノ酸に特異的な aaRS及び 当該 aaRSの存在下で天然型アミノ^と結合可能な tRNA遺伝子を何ら置換するこ と無く使用することができる。 言い換えれば、 この場合、 野生型の真核生物タイ プの抽出液をそのまま使用することができる。
'—方、· 本発明に係る無細胞タンパク質合成系試薬キットにおいて、 真核生物タ イブ aaRS*を使用し、 真核生物タイプの細胞抽出液を使用する場合には、 上述し た 「対応する真核生物內在 aaRS遺伝子」 及び 「対応する真核生物内在 tRNA遺伝 子」 をノックアウト.した真核生物タイプの細胞抽出液を使用する。 1のとき、 「対 応する原核生物由来 aaRS遺伝子」 及び 「対応する原核生物由来 tRNA遺伝子」 を 真核生物タイプの細胞に導入しておき、当該真核生物タイプの細胞抽出液内に「対 応する原核生物由来 aaRS」 '及び「対応する原核生物由来 tRNA」 を含ませることが できる。 また、 「対応する原核生物由来 aaRS遺伝子」 及び 「対応する原核生物由 来 tRNA遺伝子」 の各産物は、 抽出液に別途、 添加しても良い。 - また、 本発明に係る無細胞タンパク質合成系試薬キットにおいて、 真核生物タ イブの aaRS*を使用し、 原核細胞の抽出液を使用する場合には、 当該原核細胞が 本来的に有している、 天然型アミノ酸に特異的な aaRS及び当該 aaRSの存在下で 天然型アミノ酸と結合可能な tRNA 遺伝子を何ら置換すること無く使用すること ができる。 言い換えれば、 この場合、 野生型の原核細胞の抽出液をそのまま使用 することができる。
以下、 本発明に係る薬剤を、 実施例を用いてより詳細に説明するが、 本発明の 技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではなレ、。
〔実施例 1〕 本実施例では、 大腸菌由来の aaRS* ( 3—ョードー Lーチロシンに対する特異 性がチロシンに対する特異性に比べて高められた変異 TyrRS) を使用し、 宿主細 胞として大腸菌を用いたァロプロテインの製造方法を実証した。
先ず、 以下のようにして変異 TyrRS遺伝子及ぴサプレッサー tRNAT"遺伝子を準 備した。
変異 TyrRS
大腸菌 TyrRS遺伝子を、 大腸菌染色体から単離してクローニングする。 このク ローニングされた遺伝子に、 チロシン→バリン （3 7位）、 ァスパラギン→システ イン （1 9 5位） というアミノ酸置換を施すことで、 3—ョード一 L—チロシン に対する特異性がチロシンに対する特異性に比べて高められた変異 TyrRS遺伝子 を作製した。 大腸菌染色体の調製、 染色体から遺伝子増幅法 （PCR 法） によって 望みの遺伝子を単離すること、 そして、 単離された遺伝子を適当なベクターにク ローニングすることは、公知の遺伝子操作技術によって容易に行うことができる。 変異 TyrRS遺伝子の発現のためには、 TyrRS遺伝子本来のプロモータを TyrRS構 造遺伝子とともに単.離 . クローニングすればよい。 ベクタ一として,は、 具体的に はプラスミ ド pBR322に由来するべクタ一が使用できる。
サプレッサー tRNATyr
tRNAのように小さなサイズの RNAの遺伝子は、全長を化学的な方法によって製 造する こ と ができ る。 サプレ ッサー tRNATyr 遺伝子の塩基配列は、
TCCCCCACCACCAである。 この遺伝子の前に、 lpp遺伝子由来の転写プロモータを大 腸菌染色体から単離して連結し、 遺伝子の後ろには、 化学合成法によって製造し た rrnC 遺伝子由来の転写終結配列を連結した。 連結後の全長の塩基配列は、
Figure imgf000018_0001
AAATTTTTGATCCTTAGCGAAAGCTAAGGATTTTTTTTAGTCGAC である。 この塩基配列を変異 TyrRS遺伝子とともに pBR322由来のベクターにクローニングした。
プラスミ ド pEcIYRS 上述の作製した変異 TyrRS遺伝子及びサプレツサー tRNAT 遺伝子を有するプラ スミ ドを pEcIYRSと名づける。 このプラスミ ドを導入した大腸菌において、 変異 TyrRS遺伝子はそれ自身の転写プロモニタから、 サプレッサー tRNAは lppプロモ ータから恒常的に発現する。
「対応する真核生物タイプ aaRS」及び「対応する真核生物タイプ tRNA」 発現ブラ スミ ドの構築
本実施例では、 「対応する真核生物タイプ aaRS」 及び 「対応する真核生物タイ プ tRNAj として古糸田菌 Methanococcus jannaschi iの TyrRS及ぴチ Pシン tRNAを 宿主細胞內で発現させることとしだ。 これら Methanococcus jannaschi i 由来 TyrRS遺伝子及びチロシン tRNA遺伝子を発現するプラスミ ド PTK3は以下のよう に構築した。 なお、 プラスミ ド ρΤΚ3の全塩基配列を配列番号 1に示す。 なお、 古 糸田菌 Methanococcus jannaschi i の TyrRS遺伝子は、 酉己歹！]番号 1における 3284〜 4204番目の塩基配列からなる。 古細菌 Methanococcus jannaschiiの TyrRSのァ ミ,ノ酸配列を配列番号 2に示す。 また、 古細菌 Methanococcus jannaschi iのチロ シン tRNA遺伝子は、 配列番号 1における 4410〜4334番目の塩基配列からなる。 さらに、 プラスミ ド pTK3に含まれるカナマイシン耐性遺伝子は、配列番号 1にお ける 47〜5662番目の塩基配列からなる。カナマイシン耐性遺伝子によりコード されるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号 3に示す。
プラスミ ド ΡΤΚ3の構築の概要は次の通りである。大腸菌染色体から TrpRS遺伝 子のプロモータ領域を PCR法によって単離して pACYC184ベクターにクローニング した。 このプラスミ ドを pPTRPとする。 Methanococcus jannaschi iの TyrRS遺伝 子は、 同菌の染色体から PCR法によって単離し、 プラスミ ド pPTRP上の TrpRSプ 口モータ部位の直後にクローニングし、 プラスミ ド p MjYSを作製した。 大腸菌染 色体の調製、 染色体から遺伝子増幅法 （PCR 法） によって望みの遺伝子を単離す ること、 そして、 単離された遺伝子を適当なプラスミ ド上にクローニングするこ とは、 公知の遺伝子操作技術によって容易に行うことができる。 Methanococcus jannaschi i のチロシン tRNA遺伝子は、 全長を化学的な方法によって製造をおこ なった。 この遺伝子の前に、 lpp 遺伝子由来の転写プロモータを大腸菌染色体か ら単離して連結し、遺伝子の後ろには、化学合成法によって製造した rrnC遺伝子 由来の転写終結配列を連結した後、 プラスミ ド pMjYS上にクロ一ユングしてブラ スミ ド pMjYRSを作製した。 カナマイシン耐性遺伝子は、市販されているプラスミ ド PHSG299 (宝酒造社） 上にクローユングされている同遺伝子を PCR法によって とりだしてプラスミ ド pMjYRSにクロ一ユングして、プラスミ ド pTK3を作製した。 以上のようにして得られたプラスミ ド ρΤΚ3を用いて、大腸菌 T0P10株を形質転 換した。 エレク トロポレーシヨ ン法を用いた形質転換に適した処理を施された TOP10株が市販されている （インビトロジェン社） ので、 これを使用した。
「対応する原核生物由来 aaRSj 及び「対応する原核生物由来 tRNA.I のノックァゥ 上 ' . '
本実施例では、宿主細胞の大腸菌 TOP10株における、チロシル tRNA合成酵素遺 伝子 （tyrS遺伝子） 及びチロシン tRNA遺伝子 （tyrT遺伝子及び tyrU遺伝子）.を ノックアウトした。
本実施例では、 Gene Bridges社製の Quick and easy BAC modificationキッ卜 (以下， QBMキット）を使用して、プラスミ ド pTK3によって形質転換された T0P10 株において、 tyrS遺伝子、 tyrT遺伝子及び tyrU遺伝子をノックァ,ゥトした。 な お、 各遺伝子をノックァゥトする順番は実施例に示す順に限定されるものではな く、 各'遺伝子が最終的にノックアウトされていれば良い。 QBM キットは、 人エバ クテリア染色体 （BAC) を操作するためのものだが、 大腸菌染色体上の遺伝子をノ ックァゥ 卜する目的でも用いることができる。 実験操作は ットに添付の説明書 に準じた。 すなわち、 染色体上から除去したい遺伝子 X (tyrS遺伝子、 tyrT遺伝 子又は tyrU遺伝子） に、 染色体上で隣接する 2つの塩基配列 （いずれも 50塩基 程度） をそれぞれ配列 X- L、 x-R とする。' x-L、 x-Rを持つ一対のプライマーを用 いてマーカ一となる遺伝子を PCRで増幅すると， マーカー遺伝子の両側に X- L及 び X- Rが連結した DNAが得られる. この DNAを、 QBMキットを用いて染色体上に ノックインすると、 遺伝子 Xがマーカー遺伝子に置換した大腸菌を得ことができ る。
染色体上にノックインされたマーカー遺伝子を除去する場合を考慮すると、 マ 一力一遺伝子としては、 アンピシリン耐性遺伝子やカナマイシン耐性遺伝子では なく， クロラムフエニコ一ル耐性遺伝子 （CAT 遺伝子） を用いるのが望ましい。 本実施例ではマーカ一遺伝子として CAT遺伝子を使用した。
(D tyrS遺伝子のノックァゥ1ト
tyrS遺伝子をノックァゥトするため、 上記 X - Lとして tyrS- L及び上記 x - Rと して tyrS- Rを決定した。
tyrS-L： ATGCGTGGAAGATTGATCGTCTTGCACCCTGAAAAGATGCAAAAATCTTG (配列番号 4 ) tyrS-R： ACAGGGAACATGATGAAAAATATTCTCGCTATCCAGTCTCACGTTGTTTA (配列番号 5 ) tyrS-Lを有するプライマーとして tyrSL - CmF、 tyrS-Rを有するプライマーとし て tyrSR-CmRlを設計し、 化学合成によってこれらプライマーを作製した。
tyrSL-CmF. (70塩基） ：
TGCGTGGAAGAT'
(配列番号 6 )
tyrSR-CmRl (71塩基）
'AAACAACGTGAG,
(配列番号 7 )
これら tyrSL - CmF及び tyrSR-CmRlを用！/、、 铸型としてベクター pACYC184を用 いた PCRを行うことによって、 両端に tyrS-L及ぴ tyrS- Rを連結'した CAT遺伝子 を含む DNA断片を増幅した。 ここで、 CAT遺伝子の塩基配列を配列番号 1 6に示 す。本例において CAT遺伝子は、転写プロモータ配列とシャイン-ダルガルノ配列
(SD 配列） を含み、 転写終結配列は含まないものとした。 転写プロモータと SD 配列によって、 CAT遺伝子自身の発現が可能となる。 tyrS遺伝子の下流に存在す る pdxY遺伝子の転写プロモータは tyrS遺伝子の内部に存在するため、 tyrS遺伝 子をノックァゥ 卜することによつで pdxY遺伝子の発現が消失してしまう。したが つて、 導入する CAT遺伝子に転写終結配列を含ませないことによって、 pdxY遺伝 子の発現と CAT遺伝子の発現とを共役させることができる。
次に、 このようにして増幅された DNA断片を、 QBMキッ トを用いて大腸菌 T0P10 株の染色体にノックインした。 染色体上にノックインされた CAT遺伝子は、 その 両端に tyrS- L及び tyrS-Rを有することとなる。 したがって、 tyrS-L及び tyrS-R を直接連結した DNA断片を、 QBMキットを用いて染色体上にノックインすること によって CAT遺伝子を染色体から除去することができる。 すなわち、 tyrS- L及び tyrS-R を直接連結した DNA 断！片が染色体に正確にノックインされると、 大腸菌
T0P10株はクロラムフエ-コール （Cra) 感受性になる。
QBMキッ トを用いても正しくノックインされる効率は 10000分の 1以下である ので、 以下の手順 従って Cm感受性大腸菌を選び出した。 先ず、 増幅された DNA 断片を導入する処理を行った後、 1〜10万個の大腸菌を液性 LB培地で培養する。 次に、 培養によって 10万〜 100万個/ mLになったところで 10 μ g /mL濃度の Cm を培地に添加し、培養を続ける。 30分後、 200 μ g /mL濃度のアンピシリンを培地 に加え、 大腸菌が溶解するまで 30分〜 1時間程度培養を続ける。 次に、 溶解した 培養液を遠心にかけ、 沈殿してきた大腸菌を LBプレートに播いて一晚培養する。 得られたコロニーを 100〜200個選んで、 レプリカ法によって Cm感受性菌を選択 する。
以上の処理を行うことによって、大腸菌 T0P10株の染色体から tyrS遺伝子がノ ックアウトされることとなる。
(2) tyrT遺伝子のノックアウト
上記 「（l) tyrS遺伝子のノックアウト」 と同様にして、 大腸菌 Τ0Π0株におけ るチロシン tRNA遺伝子の 1つである tyrT遺伝子をノックァゥトした。このとき、 上記 x-Lとして tyrT - L及び上記 x- Rとして tyrT - Rを決定した。
tyrT- L： AAAATAACTGGTTACCTTTAATCCGTTACGGATGAAAATTACGCAACCAG (配列番号 8 ) tyrT- R： AGTCCCTGAACTTCCCAACGAATCCGCAATTAAATATTCTGCCCATGCGG (配列番号 9 ) また、ベクター pACYC184上の CAT遺伝子を鎵型とした PCRに使用する一対のプ ライマーとして tyrTL-CmF及び tyrTR-CmRlを設計し、 化学合成した。
tyrTL-CmF (70塩基） ： '
.AAATAACTGGTTACI
(配列番号 1 0 )
tyrTR-CraRl (71塩基）
： CGCATGGGCAGAAT,
(配列番号 1 1 )
本例においても PCRによって増幅された DNA断片に含まれる CAT遺伝子は、 転 写プロモータ配列とシャイン-ダルガルノ配列 （SD 配列） を含み、 転写終結配列 は含まないものとした。 tyrT遺伝子の下流に存在する tpr遺伝子の発現と CAT遺 伝子の発現とを共役させることができる。 また、 増幅された DNA断片を、 QBMキ ットを用いて大腸菌 T0P10株の染色体にノックインした後、 同様に CAT遺伝子を 除去することによって tyrT遺伝子をノックァゥトすることができた。
(3) tyrU遺伝子のノックアウト
上記 「（l) tyrS遺伝子のノッグアウト」 と同様にして、 大腸菌 T0P10株におけ るチロシン tRNA遺丫云子の 1つである tyrU遺伝子をノックァゥトした。このとき、 上記 x-Lとして tyrU-L及び上記 x - Rとして tyrU - Rを決定した。
tyrU-L： GTAATCAGTAGGTCACCAGTTCGATTCCGGTAGTCGGCACCATCAAGTCC (配列番号 1 2 ) tyrU-R： GGCCACGCGATGGCGTAGCCCGAGACGATAAGTTCGCTTACCGGCTCGAA (配列番号 1 3 ) また、ベクター pACYC184上の CAT遺伝子を铸型とした PCRに使用する一対のプ ライマーとレて tyrUL-CmF及び tyrUR- CmRlを設計し、 化学合成した。
tyrUL-CmFl (72塩基） ：
-TAATCAGTAGGTCAi
(配列番号 1 4 )
tyrUR-CmRl (71塩基） ：
CGAGCCGGTAAGCi
(配列番号 1 5 ) ,
本例においては、 PCRによって増幅された DNA断片に含まれる CAT遺伝子は、 SD配列を含み、 転写プロモータ配列と転写終結配列は含まないものとした。 tyrU 遺伝子は上流の thrU遺伝子と下流の glyT遺伝子の両方に転写共役しており、 CAT 遺伝子の上流に転写プロモータは必要なく、 翻訳のための SD 配列があれば CAT 遺伝子自身の発現が可能となる。 また、 導入する CAT遺伝子に転写終結配列を含 ませないことによって、 glyT遺伝子の発現と CAT遺伝子の発現とを共役させるこ とができる。 また、 增幅された DNA断片を、 QBMキッ トを用いて大腸菌 T0P10株 の染色体にノックインした後、 同様に CAT遺伝子を除去することによって、 tyrU 遺伝子をノックァゥトす!)ことができた。
なお、 tyrS遺伝子及び tyrT遺伝子をノックアウトする際に使用した、 転写プ 口モータ配列及び SD配列を含み、転写終結配列は含まな 1/、 CAT遺伝子の塩基配列 'を配列番号 1 6に示した。 また、 tyrU 遺伝子をノックアウトする際に使用した、 SD配列を含み、転写プロモータ配列も転写終結配列も含まない CAT遺伝子の塩基 配列を配列番号 1 7に示した。 ,
ァロプロティンの製造
プラスミ ド pTK3を導入した後、以上のようにして tyrS、 tyrT及ぴ tyrU '遺伝子 をノックァゥトして得られた大腸菌 T0P10株 （以下、 「T0P10*J または 「Τ0Ρ10 [ Δ tyrT, Δ tyrU, Δ tyrS, pTK3]株」） は、 この株で発現するすべての遺伝子のチロ シンをコ一ドする位置に、古細菌 Methanococcus jannaschi iの TyrRS及ぴチロシ ン tRNAによりチロシンを組み込むこ'ととなる。そこで、 3—ョードー L—チロシ ンに对する特異性がチロシンに対する特異性に比べて高められた変異 TyrRSとサ プレッサ一チロシン tRNAを発現するプラスミ ド pEcIYRSを T0P10*株に導入すれ ば、 サプレッサー tRNAT "におけるアンチコドンに対合するアンバーコドンの位置 に 3—ョードチロシンを組み込んだァロプロティンを合成することとなる。 導入 された.目的タンパク質をコードする遺伝子におけるチロシンをコードするコ ドン の位置にも、他の遺伝子と同様に古細菌 ethanococcus jannaschi iの TyrRS及び チロシン tRNAによりチロシンが組み込まれる。 , このとき、原核生物由来の aaRS*である変異 TyrRSは Methanococcus jannaschi i 由来の tRNAをアミノアシゾレイ匕すること力 Sなく、 また、 Methanococcus jannaschii の TyrRS はサプレッサー tRNATyi "をアミノアシル化することがない。 したがって、 プラスミ ド pEcIYRSが導入された大腸菌 T0P10株によれば、 望の位置のみに非 天然型ァミノ酸である 3—ョードチロシンを組み込んだァロプロティンを合成す ることができる。 これは、 以下のような実験によって確認することができる。 この実験のために、 アンバーコドンをコード配列中に導入したグルタチオン S 一トランスフェラーゼ （以下、 GST) のアンバ一変異遺伝子 （配列番号 1 8 ) を用 いる。 この GSTアンパー変異遺伝子では、 N末端から 25番目のコ ドンがアンバー コドンに置換されている。 GST タンパク質をトリプシン処理して得られるぺプチ ドで、 この部位を含むぺプチドは質量分析によって容易に検出することができる ため、この位置のァミノ酸がョードチロシンであるかどうかの判定が可能である。
GSTアンバー変異遺伝子は、適当な発現プロモータと連結させて、 pEcIYRS上にク ローニングすることで、 大腸菌内で発現させることができる。 適当なプロモータ とは、 例えば、 lacZ- UV5プロモータである。 GSTアンバー変異遺伝子をクロ一二 ングしたプラスミ ド pEcIYRSを、 プラスミ ド pEcIYRS-GST.(Am)とする。
T0P10*株に、 プラスミ ド pEcIYRS- GST (Am)を導入する方法は次の通りである。 液性 LB培地 1. 5mLに TOP10*を植菌して培養し、 100万個/ mL程度の濃度まで菌 が増殖したところで培養液を回収し、 4度で llOOOrpmで 30秒間遠心して菌体を 沈殿させる。 上澄みを捨てたのち、 氷冷した滅菌水 ImLに沈殿を懸濁する。 再び 4度、 l lOOOrpmで 30秒間遠心して菌体を沈殿させ、 上澄みを捨てたのち、 再度、 氷冷した滅菌水 ImLに懸濁する。 最後に、. 4度で 11000rPm、 30秒間遠心して菌 体を沈殿させ、 20— 30 し の滅菌水に懸濁する。 これで、 エレク トロポレーショ ン法に適した Τ0Π0*が調製できた。 同法によって、 同菌株にプラス ミ ド pEcIYRS-GST (Am)を導入し、 TOP10* [pEcIYRS- GST (Am) ]を作製する。
3—L—ョードチロシンを 25番目の位置に導入した GSTを作製するためには、 T0P10* [pEcIYRS-GST (Am) ]を、 0. lmg/mL の 3— L—ョー ドチロシン、 および 0. lmg/mLのアンピシリンを含む液性 LB培地で培養する。 GST (Am)遺伝子の発現を 誘導するために、 最終濃度で 1 mMになるようにイソプロピル 1 _チォ一 β -D- ガラク トシド （IPTG) を培地に添加する。 IPTG添加後数時間で菌を回収し、 公知 の方法によって大腸菌抽出液を調製したのち、 GST アブイ二ティーカラム （アマ シャム社） を用いて GSTを精製する。 得られた GSTを、 質量'分析法によって解析 することで所定の 25位にョードチロシンが導入されていること、および、他のチ 口シン · コドンはチロシンに翻訳されていることが確認できる。
実験方法及び結果一 1
上述した説明に準じて、 大腸菌由来の変異 TyrRS 遺伝子及びサブレッサー tRNATyi"遺伝子を用いたァロプロティンの製造に、 宿主細胞として使用できる置換 型大腸菌を作製した。
具体的には、上述した方法により、先ず、 Methanococcus jannaschi i由来 TyrRS 遺伝子及びチロシン tRNA遺伝子を発現するプラスミ ド PTK3を大腸菌 T0P10株に 形質転換した。 その後、 上述した方法により、 ρΤΚ3 を有する大腸菌 T0P10 株 (T0P10 [pTK3]株）における tyrS遺伝子をノックアウトした変異株（Τ0Ρ10 [ Δ tyrS, PTK3]株）を作製した。その後、上述した方法により、変異株（TOP10 [ A tyrS, pTK3] 株） における tyrU 遺伝子をノックアウトした変異株 （T0P10 [ A tyrU, Δ tyrS, pTK3]株） を作製した。
得られた T0P10 [ A tyrU, Δ tyrS, pTK3]株において、 tyrS遺伝子がノックァゥ トされていることを、 アンバー 'サブレッシヨン実験によって検証した。 この検 証実験のためにプラスミ ド 2541supFを作製した。 プラスミ ド 2541suPFには、 ァ ンバー変異型のク口ラムフヱニコール耐性遺伝子と、大腸菌チロシン tRNA由来の アンバーサプレッサー tRNA 遺伝子がクローユングされている。 プラスミ ド 2541supFの全長塩基配列を配列番号 1 9に示した。
プラスミ ド 2541suPFを導入した大腸菌において、大腸菌 TyrRS (tyrS遺伝子産 物） が発現していれば、 プラスミ ド 2541suPFに存在するサプレッサー tRNAが働 くのでァ.ンバ一変異が抑制されることなり、 クロラムフエニコール耐性が発現す る。 一方、 プラスミ ド 2541supFを導入した大腸菌において、 大腸菌 TyrRS (tyrS 遺伝子産物） がノックアウトされていれば、 クロラムフエ二コール耐性が発現し ないと予想される。なお、プラスミ ド 2541supFに存在するサプレッサ一 tRNAは、 古細菌由来 TyrRSからは認識されないので、プラスミ ド 2541supFを導入した大腸 菌において古細菌由来 TyrRSが発現していたとしてもクロラムフエ二コール耐性 は発現しない。 '
T0P10 [ A tyrU, A tyrS, pTK3]株及び野生株である T0P10株 それぞれプラスミ ド 2541supFで形質転換した後、クロラムフエ二コール含有培地で培養した結果を 図 1に示す。図 1に示すように、プラスミ ド 2541supFで形質転換した T0P10株（WT と表示）は、 クロラムフエ二コール（Cm)含有の培地上で生育することができた。 一方、 T0P10 [ A tyrU, A tyrS, pTK3]株 （tyrS KOと表示） は、 Cm培地上で生育す ることができなかった。 この結果から、 T0P10 [ A tyrU， Δ tyrS, pTK3]株には大腸 菌 TyrRSが発現していないことが確認できた。 実験方法及び結果一 2
大腸菌に内在する TyrRS が完全にノックアウ トされていることが確認された T0P10[AtyrU, Δ tyrS, pTK3]株における tyrT遺伝子のノックアウ トを上述した 方法により行い、変異株（T0P10[AtyrT， Δ tyrU, Δ tyrS, pTK3]株）を構築した。 作製された変異株において、大腸菌に内在するチロシン tRNAが全てノックァゥ トされていることを検証した。 検証実験は、 以下のようにして行った。
すなわち、 先ず、 TOP10[AtyrT, Δ tyrU, Δ tyrS, pTK3]株において、 大腸菌 TyrRS変異体を発現させた。この変異体としては、文献（Kiga, Dら， 2002年， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 9715-9723.) に記載されているものを使用した。 この 大腸菌 TyrRS変異体は、 3-·ョードチロシン （又は 3—プロモチロシン） を認識し て大腸菌チ'口シン tRNAに結合させる'機能を有している。 したがって、ブロモチロ シンを含む培地にこの変異体を発現させた大腸菌を植菌すると、 この大腸菌内で はチロシンのかわりにブロモチロシンがあらゆるタンパク質に取り込まれる。 こ のため、.大腸菌 TyrRS変異体が機能し、且つ大腸菌チロシン tRNAが存在する場合 には、あらゆるタンパク質が機能しなくなり、大腸菌が生育することができない。 これに対して、大腸菌 TyrRS,変異体が機能するが大腸菌内に大腸菌チロシン tRNA が存在しない場合には、 大腸菌 TyrRS変異体が機能したとしても、，,プロモチロン ン含有培地上でも大腸菌が生育することが.できる。
T0P10[AtyrT, Δ tyrU, Δ tyrS, pTK3]株及ぴ T0P10[ Δ tyrU, AtyrS, pTK3]株 にそれぞれ大腸菌 TyrRS変異体を導入した株をブロモチロシン含有培地及びブロ モチロシン非含有培地において生育したときの増殖曲線を図 2に示す。
図 2において、 T0P10[AtyrU, Δ tyrS, pTK3]株に大腸菌 TyrRS変異体を導入し た株を 「AtyrS」 と表記し、 T0P10[AtyrT, Δ tyrU, Δ tyrS, pTK3]株に大腸菌 TyrRS 変異体を導入した株を 「tyr- MjJ と表記した。 なお、 図 2において、 横軸 は、 培養時間を示している。
図 2から判るように、 T0P10[AtyrU, Δ tyrS, pTK3]株に大腸菌 TyrRS変異体を 導入した株においては、 プロモチロシンを添加すると増殖速度が低下し始め、 2 時間後に増殖が停止していた。 これは、 T0P10[AtyrU, AtyrS, pTK3]株に大腸菌
TyrRS変異体を導入した株は、 tyrT遺伝子が存在するので大腸菌 TyrRS変異体が 機能するためである。一方、図 2から判るように、 T0P10[AtyrT, Δ tyrU, Δ tyrS, pTK3]株に大腸菌 TyrRS変異体を導入した株においては、プロモチロシンの添加が 増殖に.影響しなかった。 これは、 TOP10 [ A tyrT, Δ tyrU, A tyrS, pTK3]株に大腸 菌 TyrRS変異体を導入した株は、大腸菌チロシン tRNAが全てノックアウトされて おり、 大腸菌 TyrRS変異体が機能しなかったことを意味する。 実験方法及び結果一 3
次に、 作製された T0P10 [ A tyrT, A tyrU, A tyrS, pTK3]株において、 tyrT遺 伝子、 tyrU遺伝子及び tyrS遺伝子が全てゲノム上から除去されているか否かを 確認した。 具体的には、 T0P10 [ A tyrT, Δ tyrU, A tyrS, pTK3]株から染色体 DNA を抽出し、 .染色体 DNAを铸型とした, PCRによって確認した。
染色体 DNAは、市販のキット Genとるくん TM (酵母用） （タカラバイオ株式会社） を用いて抽出した。 tyrT遺伝子、 tyrU遺伝子及ぴ tyrS遺伝子の各遺伝子につい て以下の塩基配列からなる一対のプライマーを設計して化学合成によって作製し た。
tyrT遺伝子増幅用
• GCAGGACGTTATTCATGTCG (配列番号 2 0 )
• GGGACTTTTGAAAGTGATGG (配列番号 2 1 )
tyrU遺伝子増幅用
• GTAATCAGTAGGTCACCAGT (配列番号 2 2 )
• TTCGAGCCGGTAAGCGAACT (配列番号 2 3 )
tyrS遺伝子増幅用 ,
• AAAAGTCGTGTACCGGCAAAG (配列番号 2 4 )
• TAAACAACGTGAGACTGGATAG (配列番号 2 5 )
すなわち、 tyrT遺伝子増幅用プライマーは tyrT遺伝子及び tyrV遺伝子の前後 の配列に設定し、 tyrU遺伝子増幅用プライマ一は tyrU遺伝子の前後の配列に設 定し、 tyrS遺伝子増幅用プライマーは tyrS遺伝子の前後の配列に設定した。
T0P10 [ A tyrT, A tyrU, A tyrS, pTK3]株及び野生株である T0P10株について、 それぞれ染色体 DNAを抽出して PCRを行い、 PCR増幅断片を電気泳動によって確 認した結果を図 3に示す。 図 3において、 T0P10 株を用いたときの結果を 「WT」 と表記し、 T0P10 [ A tyrT， Δ tyrU, Δ tyrS, pTK3]株を用いたときの結果を 「厶 tyrU」、 「A tyrS」 及び 「A tyrT」 と表記した。 また、 図 3において、 T0P10 株の 染色体 DNAを铸型として用いて tyrT遺伝子、 tyrU遺伝子及び tyrS遺伝子を増幅 したときに現れる増幅断片の位置を三角印で指示した。
図 3から判るように、 TOP10 [ A tyrT， A tyrU, Δ tyrS， pTK3]株の染色体 DNA を角いた場合には、 T0P10株の染色体 DNAを用いたときに増幅した爷断片と比較 して、增幅される断片の長さがより短くなっていた。この結果から、 T0P10 [ A tyrT, 厶 tyrU, A tyrS, pTK3]株においては、 tyrT遺伝子、 tyrU遺伝子及び tyrS遺伝子 が全てゲノム上から除去されていることが実証された。
以上のことから、 Τ0Ρ10 [ Δ tyrT, Δ tyrU, A tyrS, . pTK3]株においては、 内在し ていた TyrRS とチロシン tRNA .は全てノックアウトされ、 代わりに古細菌 TyrRS とチロシン tRNAによってチロシン'コドンの翻訳を行って生きていることが示さ れた。 この T0P10 [ A tyrT， Δ tyrU, A tyrS, pTK3]株は、 大腸菌由来の変異 TyrRS 遺伝子及ぴサプレッサー tRNATyi:遺伝子を用いたァロプロテインの製造に使用する ことができ'る。 産業上の利用可能性
本発明に係る非天然型ァミノ酸を組み込んだタンパク質の製造方法によれば、 原核生物由来のアミノアシル tRNA 合成酵素変異体を用いるとともに原核細胞を 宿主細胞として用いて、 所望の位置に非天然型アミノ酸を組み込んだタンパク質 を製造することができる。 また、 この原核生物由来のアミノアシル tRNA合成酵素 変異体は、 真核生物タイプの細胞を宿主とする非天然型アミノ酸を組み込んだタ ンパク質の製造方法にも使用することができる。 このように、 本発明によれば、 原核細胞由来のァミノアシル tRNA合成酵素変異体を、原核細胞及び真核生物タイ プの細胞のいずれを宿主細胞とする系にも使用することができる。
また、 非天然型アミノ酸を組み込んだタンパク質の製造方法によれば、 真核生 物タイプのアミノアシル tRNA 合成酵素変異体を用いるとともに真核生物タイプ の細胞を宿主細胞として角いて、 所望の位置に非天然型アミノ酸を組み込んだタ ンパク質を製造することができる。 また、 この真核生物タイプのアミノアシル tRNA合成酵素変異体は、原核細胞を宿主とする非天然型アミノ酸を組み込んだタ ンパク.'質の製造方法にも使用することができる。 このように、 本発明によれば、 真核生物タイプのァミノアシ /'レ tRNA合成酵素変異体を、原核細胞及び真核生物タ イブの細胞のいずれを宿主細胞とする.系にも使用することができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、 特許および特許出願をそのまま参考として 本 細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲
1 . 所定の天然型アミノ酸に対する特異性に比べて、 当該天然型アミノ酸に 類似する非天然型ァミノ酸に対する特異性が高められた原核生物由来ァミノァシ ル tRNA 合成酵素変異体をコードする遺伝子と、 当該原核生物由来アミノアシル tRNA 合成酵素変異体の存在下で当該非天然型アミノ酸と結合可能な非天然型ァ ミノ酸用 tRNA遺伝子とを、
上記所定の天然型アミノ酸に対する特異性を有する真核生物タイプのアミノア シル tRNA 合成酵素をコードする遺伝子と、 当該真核生物タイプのアミノアシル tRNA合成酵素の存在下で当該天然型ァミノ酸と結合可能な tRNA遺伝子とを発現 する原核細胞に導入する工程と、
'上記原核細胞に本来的に存在する、 上記天然型アミノ酸に対する特異性を有す る内在のアミノアシル tRNA合成酵素をコ一ドする遺伝子と、当該内在のアミノア シル tRNA合成酵素の存在下で当該天然型アミノ酸と結合可能な内在の tRNA遺伝 子とをノ ックアウ トする工程と、
' /
上記非天然型アミノ酸用 tRNA 遺伝子のアンチコドンに対合するコドンを有す る目的遺伝子によりコードされる目的タンパク質を、 上記原核細胞中で発現させ る工程とを備え、
上記アンチコドンに対合するコドンの 置に上記非天然型'アミノ酸を取り込ま せることを特徴とする、 非天然型ァミノ酸を組み込んだタンパク胃の製造方法。
2 . 上記原核生物由来アミノアシル tRNA合成酵素変異体は、大腸菌由来のチ 口シル tRNA合成酵素変異体であるこ'とを特徴とする請求項 1に記載の製造方法。
3 . 上記非天然型アミノ酸は、 チロシン誘導体であることを特徴とする請求 項 1記載の製造方法。
4 . 上記非天然型アミノ酸用 tRNA遺伝子は、大腸菌由来のサブレツサーチ口 シン tRNA遺伝子であることを特徴とする請求項 1記載の製造方法。
5 . 上記真核生物タイプのァミノアシル tRNA合成酵素は、 メタノコッカス . ジャナシー (Methanococcus jannaschi i) 由来のチロシノレ tRNA合成酵素であるこ とを特徴とする請求項 1記載の製造方法。
6. · 上記メタノコッカス ·ジャナシ一 (Methanococcus jannaschii) 由来の チロシル tRNA合成酵素は、 以下の （a)、 (b) 及び （c) からなる群から選ばれ るいずれか一のタンパク質からなるこ.とを特徴とする請求項 5記載の製造方法。
(a) 配列番号 2に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列番号 2に示すアミノ酸配列において、 1又は数個のアミ /酸が欠失、 置換又は付加されたァミノ酸配列からなり、 チロシンを活性化するとともにチロ シル tRNAを合成する活性を有するタンパク質
(c) 配列番号 2に示すアミノ酸配列からなるタ；/パク質をコードするポリヌク レオチドの相補鎖に対してストリン.ジェントな条件化でハイプリダイズするポリ ヌクレオチドによりコードされ、 チロシンを活性化するとともにチロシル tRNA を合成する活性を有するタンパク質
'
7. 上記真核生物タイプのアミノアシル tRNA合成酵素の存在下で当該天然型 アミ ノ酸と結合可能な tRNA 遺伝子は、 メ タ ノ コ ッカス ' ジャナシー ' (Methanococcus jannaschii) 由来のチロシン tRNA遺伝子であることを特徴とす る請求項 1記載の製造方法。 . ' '
8. 上記メタノコッカス · シャナシ一 (Methanococcus jannaschii) 由来の チロシン tRNAは、 以下の （a)、 (b) 及び （c) からなる群から選ばれるいずれ か一のポリヌクレオチドからなることを特徴とする請求項 7記載の製造方法。
( 3)配列番号1における 4334~4410番目に示す塩基配列からなるポリヌクレオ チド . '
(b)配列番号 Γにおける 4334〜4410番目に示す塩基配列において、 1又は数個 の塩基が欠失、 置換又は付加された塩基配列からなり、 チロシンをメタノコッカ ス ·ジャナシー (Methanococcus jannaschii) 由来のチロシノレ tRNA合成酵素の存 在下で結合できるポリヌクレオチド
(c)配列番号 1における 4334〜4410番目に示す塩基配列からなるポリヌクレオ チドの相補鎖に対してストリンジェン卜な条件化でハイブリダィズし、 チロシン をメタノコッカス ·ジャナシー (Methanococcus jannaschii)由来のチロシノレ tRNA 合成酵素の存在下で結合できるポリヌクレオチド
9. 上記原核細胞は大腸菌であることを特徴とする請求項 1記載の製造方法。
10. 所定の天然型アミノ酸に対する特異性を有する真核生物タイプのァミノ ァシル tRNA合成酵素をコードする遺伝子と、当該真核生物タイプのアミノアシル tRNA合成酵素の存在下で当該天然型ァノミノ酸と結合可能な tRNA遺伝子とが導入 され、
原核細胞に本来的に存在する、 上記天然型アミノ酸に対する特異性を有する内 在のアミノアシル tRNA合成酵素をコードする遺伝子と、当該内在のアミノアシル tRNA合成酵素の存在下で当該天然型アミノ酸と結合可能な内在の tRM遺伝子と がノックアウトされた、 原核細胞。
1 1. 上記真核生物タイプのアミノアシル tRNA 合成酵素は、 メタノコッカ ス · ジャナシ一 (Methanococcus jannaschii) 由来のチロシル tRNA合成酵素であ ることを特徴とする請求項 10記載の原核細胞。
1 2.. 上 §Cメタノコッカス · シャナシー (Methanococcus jannaschii) 由来 のチロシル tRNA合成酵素は、 以下の （a)、 (b) 及び （c) からなる群から選ば れるいずれか一のタンパク質からなることを特徴とする請求項 1 1記載の原核細 胞。 . /
(a) 配列番号 2に示すアミノ酸配列から.なるタンパク質 ,
(b) 配列番号 2に示すアミノ酸配列において、 1又は数個のアミノ酸が欠失、. 置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、 チロシンを活性化するとともにチロ シル tRNAを合成する活性を有するタンパク質
(c) 配列番号 2に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌク レオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件化でハイブリダィズするポリ ヌクレオチドによりコードされ、 チ πシンを活性化するとともにチロシル tRNA を合成する活性を有するタンパク質
1 3. 上記真核生物タイプのアミノアシル tRNA合成酵素の存在下で当該天然 型アミ ノ酸と結合可能な tRNA 遺伝子は、 メ タノ コ ッカス . ジャナシー
(Methanococcus jannaschii) 由来のチロシン tRNA遺伝子であることを特徴とす る請求項 10記載の原核細胞。
14. 上 5 メタノコッカス · シャナシー (Methanococcus jannaschii) 由采 のチロシン tRNAは、 以下の （a)、 (b) 及び （c) からなる群から選ばれるいず れか一のポリヌクレオチドからなることを特徴とする請求項 1 3記載の原核細胞。
( 3 )配列番号1における 4334〜4410番目に示す塩基配列からなるポリヌクレオ チド -'
( b )配列番号 1における 4334〜4410番目に示す塩基配列において、 1又は数個 の塩基が欠失、 置換又は付加された塩基配列からなり、 チロシンをメタノコッカ ス ·ジャナシ一 (Methanococcus jannaschi i) 由来のチロシノレ tRNA合成酵素の存 在下で結合できるポリヌクレオチド
( (：)配列番号1における 4334〜4410番目に示す塩基配列からなるポリヌクレオ チドの相補鎖に対してストリンジェントな条件化でハイブリダイズし、 チロシン をメタノコッカス ·ジャナシー (Methanococcus jannaschi i) 由来のチロシノレ t匪 合成酵素の存在下で結合できるポリヌクレオチド
1 5 .. 上記原核細胞は大腸菌であることを特徴とする請求項 1 0〜1 4記載 の原核翊胞。
1 6 . 請求項 1 0〜1 5記載の原核細胞の抽出液。
1 7 . 所定の天然型アミノ酸に対する特異性に比べて、 当該天然型アミノ酸 に類似する非天然型アミノ酸に対する特異性が高められた真核生物タイプのアミ ノァシル tRNA合成酵素変異体をコ一ドする遺伝子と、当該真核生物タイプのアミ ノアシル tRNA 合成酵素変異体の存在下で当該非天然型アミノ酸と結合可能な非 天然型アミノ酸用 tRNA遺伝子とを、 ' '
上記所定の天然型アミノ酸に対する特異性を有する原核生物由来アミノアシル tRNA合成酵素をコードする遺伝子と、 当該原核生物由来ァミノアシル tRNA合成 酵素の存在下で当該天然型アミノ酸と結合可能な tRNA 遺伝子とを発現する真核 生物タイプの細胞に導入する工程と、
上記真核生物タイプの細胞に本来的に存在する、 上記天然型アミノ酸に対する 特異性を有する内在のアミノアシル tRNA合成酵素をコードする遺伝子と、当該内 在のアミノアシル tRNA 合成酵素の存在下で当該天然型アミノ酸と結合可能な内 在の tRNA遺伝子とをノックアウトする工程と、
上記非天然型アミノ酸用 tRNA 遺伝子のアンチコ ドンに対合するコドンを有す る目的遺伝子によりコードされる目的タンパク質を、 上記真核生物タイプの細胞 中で発.現させる工程とを備え、
上記アンチコドンに対合す コドンの位置に上記非天然型アミノ酸を取り込ま せることを特徵とする、 非天然型ァミ.ノ酸を組み込んだタンパク質の製造方法。
1 8 . 上記真核生物タイプの細胞は酵母であることを特徴とする請求項 1 7 記載の製造方法。
1 9 . 所定の天然型アミノ酸に対する特異性を有する原核生物由来アミノアシ ル tRNA合成酵素をコードする遺伝子と、 当該原核生物由来アミノアシル tRNA合 成酵素の存在下で当該天然型ァミノ酸と結合可能な tRNA遺伝子とが導入され、 真核生物タイプの細胞に本来的に存在する、 上記天然型アミノ酸に対する特異 性を有する内在のアミノアシル tRNA合成酵素をコードする遺伝子と、当該内在の アミノアシル tRNA 合成酵素の存在下で当該天然型アミノ酸と結合可能な内在の tRNA遺伝子とがノックアウトされた、 真核生物タイプの細胞。
2 0 . 上記真核生物タイプの細胞は酵母であることを特徴とする請求項 1 9 記載の真核生物タイプの細胞。
2 1： 請求項 1 9〜2 0記載の真核生物タイプの細胞の抽出液。
2 2 . 所定の天然型アミノ酸に対する特異性に比べて、 当該天然型アミノ酸 に類似する非天然型ァ ノ酸に対する特異性が高められた原核生物由来アミノア シル tRNA合成酵素変異体,と、
上記原核生物由来ァミノアシル tRNA 合成酵素変異体の存在下で上記非天然型 アミノ酸と結合可能な非天然型アミノ酸用 tRNAと、 '
上記非天然型アミノ酸を含むアミノ酸溶液と、
上記所定の天然型アミノ酸に対する特異性を有する真核生物タイプのアミノア シル tRNA 合成酵素をコードする遺伝子と、 当該真核生物タイプのアミノアシル tRNA合成酵素の存在下で当該天然型アミノ酸と結合可能な tRNA遺伝子とが導入 されるとともに、 原核細胞に本来的に存在する、 上記天然型アミノ酸に対する特 異性を有する内在のアミノアシル tRNA合成酵素をコードする遺伝子と、当該内在 のアミノアシル tRNA 合成酵素の存在下で当該天然型アミノ酸と結合可能な内在 の tRNA遺伝子とがノックアウトされた原核細胞の抽出液と、
を含む無細胞タンパク質合成系試薬キッ ト。
23, 上記真核生物タイプのアミノアシル' tRNA 合成酵素は、 メタノコッカ ス 'ジャナシー （Methanococcus jannaschii) 由来のチロシル tRNA合成酵素であ ることを特徴とする請求項 22記載の 薬キッ ト。
24. 上記メタノコッカス · ジャナシ一 (Methanococcus jannaschii) 由来 のチロシル tRNA合成酵素は、 以下の （a)、 (b) 及び （c) からなる群から選ば れるいずれか一のタンパク質からなることを特徴とする請求項 23記載の試薬キ ッ 卜。
( a ) 配列番号 2に示すァミノ酸配列からなるタンパク質
(b ) 配列番号 2に示すアミノ酸配列において、 1又は数個のアミノ酸が欠失、 置換又は付加されたアミソ酸配列からなり、 チロシンを活性化するとともにチロ シル tRNAを合成する活性を有するタンパク質
(c ) 配列番号 2に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌク レオチド.の相補鎖に対してストリンジェントな条件化でハイブリダィズするポリ ヌクレオチドによりコードされ、 チロシンを活性化するとともにチロシル tRNA を合成する活性を有するタンパク質 ,
2 5. 上記真核生物タイプのアミノアシル tRNA合成酵素の存在下で当該天然 型アミノ酸と結合可能な tRNAは、 メタノコッカス ' ジャナシー （Methanococcus jannaschii)由来のチロシン tRNAであることを特徴とする請求項 22記載の試薬 キッ ト。
26. 上目己メタノコッカス ·シャナシー (Methanococcus jannaschii) 由来 のチロシン tRNAは、 以下の （a)、 (b) 及び （c) からなる群から選ばれるいず れか一のポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項 25記載の試薬キッ ト。
( a )配列番号 1における 4334〜4410番目に示す塩基配列からなるポリヌクレオ チド
(b)配列番号 1における 4334〜4410番目に示す塩基配列において、 1又は数個 の塩基が欠失、 置換又は付加された塩基配列からなり、 チロシンをメタノコッカ ス .ジャナシー （Methanococcus jannaschii) 由来のチロシル tRNA合成酵素の存 在下で結合できるポリヌクレオチド
(c)配列番号 1における 4334〜4410番目に示す塩基配列からなるポリヌクレオ チドの相補鎖に対してストリンジェントな条件化でハイブリダィズし、 チロシン をメタノコッカス'ジャナシー（Methanococcus jannaschi i)由来のチロシノレ tRNA 合成酵素の存在下で結合できるポリヌクレオチド
2 7 . 上記原核細胞は大腸菌であることを特徴とする請求項 2 2〜 2 6記載 の試薬キッ ト。 ， '
2 8 . 所定の天然型アミノ酸に対する特異性に比べて、 当該天然型アミノ酸 に類似する非天然型ァミノ酸に対する特異性が高められた真核生物タイプのァミ ノ了シル tRNA合成酵素変異体と、
上記真核生物タイプのアミノアシル tRNA 合成酵素変異体の存在下で当該非天 然型アミノ酸と結合可能な非天然型アミノ酸用 tRNAと、
上記非天然型アミノ酸を含むアミノ酸溶液と、
上記所定の天然型アミノ酸に対する特異性を有する原核生物由来アミノアシル tRNA合成酵素をコードする遺伝子と、 当該原核生物由来アミノアシル tRNA合成 酵素の存在下で当該天然型アミノ酸と結合可能な tRNA 遺伝子とが導入されると ともに、 真核生物タイプの細胞に本来的に存在する、 上記天然型ァ,ミノ酸に対す る特異性を有する内在のアミノアシル tRNA合成酵素をコードする遺伝子と、当該 内在のアミノアシル tRNA 合成酵素の存在下で当該天然型アミノ酸と結合可能な 内在の tRNA遺伝子とがノックァゥ卜された真核生物タイプの細胞の抽出液と、 を含む無細胞タンパク質合成系試薬キット。 '
2 9 . 上記真核生物タイプの細胞は、 酵母細胞、 植物細胞、 S虫細胞又は哺 乳動物細胞であることを特徴とする請求項 2 8記載の試薬キッ ト。
PCT/JP2006/324043 2005-11-24 2006-11-24 非天然型アミノ酸を組み込んだタンパク質の製造方法 WO2007061136A1 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2007546542A JP4936290B2 (ja) 2005-11-24 2006-11-24 非天然型アミノ酸を組み込んだタンパク質の製造方法
US12/094,859 US8183013B2 (en) 2005-11-24 2006-11-24 Method for production of protein having non-natural type amino acid integrated therein
AU2006317944A AU2006317944A1 (en) 2005-11-24 2006-11-24 Method for producing proteins comprising non-natural amino acids incorporated therein
EP06833846A EP1961817B1 (en) 2005-11-24 2006-11-24 Method for production of protein having non-natural type amino acid integrated therein
US13/470,752 US8642291B2 (en) 2005-11-24 2012-05-14 Method for producing proteins comprising non-natural amino acids incorporated therein

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2005338402 2005-11-24
JP2005-338402 2005-11-24

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US12/094,859 A-371-Of-International US8183013B2 (en) 2005-11-24 2006-11-24 Method for production of protein having non-natural type amino acid integrated therein
US13/470,752 Continuation US8642291B2 (en) 2005-11-24 2012-05-14 Method for producing proteins comprising non-natural amino acids incorporated therein

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2007061136A1 true WO2007061136A1 (ja) 2007-05-31

Family

ID=38067349

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2006/324043 WO2007061136A1 (ja) 2005-11-24 2006-11-24 非天然型アミノ酸を組み込んだタンパク質の製造方法

Country Status (5)

Country Link
US (2) US8183013B2 (ja)
EP (1) EP1961817B1 (ja)
JP (1) JP4936290B2 (ja)
AU (1) AU2006317944A1 (ja)
WO (1) WO2007061136A1 (ja)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009011258A1 (ja) * 2007-07-13 2009-01-22 Japan Agency For Marine-Earth Science And Technology 外来遺伝子を細胞に安定に保持する方法
JP2009017842A (ja) * 2007-07-13 2009-01-29 Japan Agengy For Marine-Earth Science & Technology 生産性改善法
JP2014161229A (ja) * 2013-02-21 2014-09-08 National Institute Of Agrobiological Sciences タンパク質の発現を制御する方法
WO2020138336A1 (ja) 2018-12-26 2020-07-02 中外製薬株式会社 コドン拡張のための変異ｔＲＮＡ
WO2021132546A1 (ja) 2019-12-26 2021-07-01 中外製薬株式会社 翻訳用組成物及びペプチドの製造方法
WO2021261577A1 (ja) 2020-06-25 2021-12-30 中外製薬株式会社 改変された遺伝暗号表を有する翻訳系

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160115487A1 (en) * 2013-05-29 2016-04-28 Bradley C. Bundy Cell-free synthetic incorporation of non-natural amino acids into proteins
CN111304234A (zh) * 2020-02-27 2020-06-19 江南大学 一种适用于枯草芽孢杆菌的非天然氨基酸利用工具
CN116376851A (zh) * 2022-08-25 2023-07-04 凯莱英医药集团（天津）股份有限公司 氨酰tRNA合酶突变体及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003014354A1 (en) 2001-08-01 2003-02-20 Japan Science And Technology Agency Tyrosyl-trna synthase variants
WO2004039989A1 (ja) 2002-10-31 2004-05-13 Riken 非天然型アミノ酸組み込みタンパク質の発現方法
JP2005338402A (ja) 2004-05-26 2005-12-08 Internatl Business Mach Corp <Ibm> 音声収録システム、録音装置、音声解析装置および音声収録方法並びにプログラム

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006180701A (ja) * 2003-02-10 2006-07-13 Institute Of Physical & Chemical Research チロシルｔＲＮＡ合成酵素の変異体及びその作製方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003014354A1 (en) 2001-08-01 2003-02-20 Japan Science And Technology Agency Tyrosyl-trna synthase variants
WO2004039989A1 (ja) 2002-10-31 2004-05-13 Riken 非天然型アミノ酸組み込みタンパク質の発現方法
JP2005338402A (ja) 2004-05-26 2005-12-08 Internatl Business Mach Corp <Ibm> 音声収録システム、録音装置、音声解析装置および音声収録方法並びにプログラム

Non-Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHIN J.W. ET AL.: "An expanded eukaryotic genetic code", SCIENCE, vol. 301, 2003, pages 964 - 967, XP002996001 *
HINO N. ET AL.: "Protein photo-cross-linking in mammalian cells by site-specific incorporation of a photoreactive amino acid", NATURE METHODS, vol. 2, March 2005 (2005-03-01), pages 201 - 206, XP003006833 *
IRAHA F. ET AL.: "Iden Ango Kakucho no Tame no Daichokin Naizaisei Tyrosyl-tRNA Gosei Koso no Chikan", 28TH ANNUAL MEETING OF THE MOLECULAR BIOLOGY SOCIETY OF JAPAN KOEN YOSHISHU, 25 November 2005 (2005-11-25), pages 764, 3P-1200, XP003013346 *
KIGA D. ET AL.: "An engineered Escherichia coli tyrosyl-tRNA synthetase for site-specific incorporation of an unnatural amino acid into proteins in eukaryotic translation and its application in a wheat germ cell-free system", PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 99, 2002, pages 9715 - 9720, XP002976285 *
KOBAYASHI T. ET AL.: "Structural basis for orthogonal tRNA specificities of tyrosyl-tRNA synthetases for genetic code expansion", NATURE STRUCT. BIOL., vol. 10, 2003, pages 425 - 432, XP002375045 *
KOBAYASHI T. ET AL.: "Structural basis of nonnatural amino acid recognition by an engineered aminoacyl-tRNA synthetase for genetic code expansion", PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 102, February 2005 (2005-02-01), pages 1366 - 1371, XP003013347 *
SAKAMOTO K. AND YOKOYAMA S.: "Tokushu Proteome Soyaku to DDS Jinko Inden Ango System o Riyo shita Kinosei Tanpakushitsu no Sakusei", DRUG DELIVERY SYSTEM, vol. 18, 2003, pages 502 - 510, XP003013351 *
SANTORO S.W. ET AL.: "An efficient system for the evolution of aminoacyl-tRNA synthetase specificity", NATURE BIOTECHNOL., vol. 20, 2002, pages 1044 - 1048, XP003013349 *
See also references of EP1961817A4
SKAMOTO K. ET AL.: "Site-specific incorporation of an unnatural amino acid into proteins in mammalian cells", NUCLEIC ACIDS RES., vol. 30, 2002, pages 4692 - 4699, XP003013348 *
WANG L. ET AL.: "Expanding the genetic code of Escherichia coli", SCIENCE, vol. 292, 2001, pages 498 - 500, XP002904367 *
XIE J. AND SCHULTZ P.G.: "A chemical toolkit for proteins-an expanded genetic code", NATURE REV. MOL. CELL BIOL., vol. 7, October 2006 (2006-10-01), pages 775 - 782, XP009084566 *
XIE J. ET AL.: "The site-specific incorporation of p-iodo-L-phenylalanine into proteins for structure determination", NATURE BIOTECHNOL., vol. 22, 2004, pages 1297 - 1301, XP003013350 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009011258A1 (ja) * 2007-07-13 2009-01-22 Japan Agency For Marine-Earth Science And Technology 外来遺伝子を細胞に安定に保持する方法
JP2009017842A (ja) * 2007-07-13 2009-01-29 Japan Agengy For Marine-Earth Science & Technology 生産性改善法
JP2009017840A (ja) * 2007-07-13 2009-01-29 Japan Agengy For Marine-Earth Science & Technology 外来遺伝子を細胞に安定に保持する方法
JP2014161229A (ja) * 2013-02-21 2014-09-08 National Institute Of Agrobiological Sciences タンパク質の発現を制御する方法
WO2020138336A1 (ja) 2018-12-26 2020-07-02 中外製薬株式会社 コドン拡張のための変異ｔＲＮＡ
WO2021132546A1 (ja) 2019-12-26 2021-07-01 中外製薬株式会社 翻訳用組成物及びペプチドの製造方法
WO2021261577A1 (ja) 2020-06-25 2021-12-30 中外製薬株式会社 改変された遺伝暗号表を有する翻訳系

Also Published As

Publication number Publication date
EP1961817B1 (en) 2013-03-13
EP1961817A4 (en) 2009-07-15
US8183013B2 (en) 2012-05-22
US8642291B2 (en) 2014-02-04
US20090226963A1 (en) 2009-09-10
EP1961817A1 (en) 2008-08-27
US20120276589A1 (en) 2012-11-01
JP4936290B2 (ja) 2012-05-23
AU2006317944A1 (en) 2007-05-31
JPWO2007061136A1 (ja) 2009-05-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4936290B2 (ja) 非天然型アミノ酸を組み込んだタンパク質の製造方法
JP6294368B2 (ja) 直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を生産するための方法及び組成物
JP7292442B2 (ja) 改変アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素およびその用途
US10465221B2 (en) Genomically recoded organisms lacking release factor 1 (RF1) and engineered to express a heterologous RNA polymerase
KR20150064209A (ko) 개선된 발현을 위해 박테리아 추출물 중 선택 단백질의 단백질분해 불활성화
EP2221370B1 (en) Process for production of non-natural protein having ester bond therein
KR102345759B1 (ko) 뉴클레아제 시스템의 녹-아웃에 의한 시험관 내 생합성 활성을 조절하기 위한 방법
CN114686548A (zh) 用于增强生产的rna相关酶的修饰
WO2014194129A2 (en) Cell-free synthetic incorporation of non-natural amino acids into proteins
US11673921B2 (en) Cell-free protein synthesis platform derived from cellular extracts of Vibrio natriegens
EP4230723A1 (en) Polypeptide with aspartate kinase activity and use thereof in production of amino acid
JP4441170B2 (ja) Ｓ１２リボソームタンパク質に変異を有する大腸菌細胞抽出液及びそれを用いる無細胞系によるタンパク質の製造方法
KR101646728B1 (ko) 디제너러시 리프로그래밍을 통한 비천연 단백질 합성 방법
ES2948496T3 (es) Nuevos aminoácidos que tienen un resto de norborneno
US11203773B2 (en) Designer ribosomes and methods of use thereof for incorporating non-standard amino acids into polypeptides
WO2021222719A1 (en) Methods of producing full-length antibodies using e.coli
JP2009165426A (ja) 翻訳にキャップ構造を必要としない５’ｕｔｒリーダー配列およびかかる配列を利用したインビトロ無細胞系タンパク質合成方法
KR20090068644A (ko) 아데노신 디아미네이즈의 효소 활성 증가 방법, 상기활성이 증가된 아데노신 디아미네이즈 변이체, 및 상기변이체를 이용한 디옥시구아노신의 생산방법
JP2011139640A (ja) タンパク質の可逆的デュアルラベリング法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2007546542

Country of ref document: JP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006317944

Country of ref document: AU

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006833846

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2006317944

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20061124

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 12094859

Country of ref document: US