WO2020138336A1

WO2020138336A1 - コドン拡張のための変異ｔＲＮＡ

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Publication number: WO2020138336A1
Application number: PCT/JP2019/051241
Authority: WO
Inventors: 正次郎篠原; 貴昭谷口; 美樹美細津; 香緒梨西村; 万奈岩橋; 岳江村; 効彦中野; 田中　正彦; 崇倫大嶽; 太田　淳
Original assignee: 中外製薬株式会社
Priority date: 2018-12-26
Filing date: 2019-12-26
Publication date: 2020-07-02
Also published as: EP3904568A1; CN113423877A; SG11202106747WA; KR20210108994A; EP3904568A4; US20220205009A1; JP2023182649A; JPWO2020138336A1; JP7357642B2

Abstract

いくつかの態様において、本開示は、アンチコドンの1文字目がライシジンまたはアグマチジンに置換された変異tRNA、および当該変異tRNAを含む翻訳系に関する。特定の態様において、本開示は、NNAのコドンを選択的に翻訳することが可能な変異tRNAを提供する。別の態様において、本開示は、一つのコドンボックスから２種類または３種類のアミノ酸を翻訳することが可能な翻訳系を提供する。別の態様において、本開示は、ライシジン二リン酸、アグマチジン二リン酸およびこれらの誘導体の新規な合成方法を提供する。

Description

コドン拡張のための変異ｔＲＮＡ

　本開示は、tRNAおよび翻訳系、ならびにその使用方法に関する。

　ディスプレイライブラリーは、標的タンパク質に結合する分子を進化工学的に効率よく取得できる、大変有用な技術である。ディスプレイライブラリーを用いて、任意の標的分子に対し高結合能を示す分子を取得したり、あるいは複数のエピトープに対してそれぞれ結合する分子を多種類取得したりするためには、高い多様性をもつライブラリーからのパニングが必要である。多様性の高いライブラリーを構築するためには、その構成単位（building block）の数を増やす、あるいは種類を増やすことが考えられるが、膜透過性の観点から分子量に制限がある場合、building blockの数にも制限がかかる。よって、ライブラリーの多様性を高めるためにbuilding blockの種類を増やすという手段は重要な意味を持つ。

　PURESYSTEM（非特許文献１）のような再構成された無細胞翻訳系は、アミノ酸、tRNA、アミノアシルtRNA合成酵素（aminoacyl-tRNA synthetase; ARS）等の構成成分の濃度調整が可能であるため、天然のコドン－アミノ酸の対応付けを変更できる。このような翻訳系を用いることにより、任意のbuilding blockを20種類以上導入したディスプレイライブラリーを構築することも可能となっているが、3塩基コドンを用いた大腸菌の翻訳系においては、ウォブル（wobble）則の存在により、原理上は32種類が導入できるbuilding blockの上限であると考えられる。より具体的に説明すると、コドンの3文字目とアンチコドンの1文字目の対合には、“遊び”が存在し、ワトソン－クリック（Watson-Crick）塩基対以外にも、wobble塩基対と呼ばれるG・U間の対合が可能となっている。そのため、アンチコドンGNNはNNUおよびNNCのコドンを、アンチコドンUNNはNNAおよびNNGのコドンを解読（decode）してしまうため、これらのコドンを読み分けることができず、１つのコドンボックスに導入できるアミノ酸の種類は最大２アミノ酸に制限されてしまう（非特許文献２）。

　一方、自然界では、AUAおよびAUGのコドンの読み分けを可能にする手段が存在する。大腸菌のtRNA Ile2の34位（アンチコドン1文字目）に導入されているライシジン（Lysidine）修飾がその一例であり、この修飾によりtRNA Ile2はAUAコドンのみを解読し、AUGコドンは解読しないことが分かっている（非特許文献３）。この修飾は、イソロイシンtRNA－ライシジン合成酵素（tRNA^Ile -lysidine synthetase; TilS）によって導入されるが（非特許文献４）、その基質となるtRNAはtRNA Ile2に限定されるため、それ以外のtRNAにライシジンを導入することは容易ではない（非特許文献５）。

Shimizu et al., Nat Biotechnol. 2001 Aug; 19(8): 751-755. Iwane et al., Nat Chem. 2016 Apr; 8(4): 317-325. Grosjean et al., Trends Biochem Sci. 2004 Apr; 29(4): 165-168. Suzuki T et al., FEBS Lett. 2010 Jan 21; 584(2): 272-277. Lajoie et al., J Mol Biol. 2016 Feb 27; 428(5 Pt B): 1004-1021.

　上述の通り、tRNA Ile2では34位（アンチコドン1文字目）にライシジンが導入されることによって、AUAおよびAUGのコドンが読み分けられているが、天然において、それ以外のtRNAにライシジン修飾が行われている例は見出されていない。また、何らかの人工的な手段によって、NNAおよびNNGのコドンが読み分けられた例も報告されていない。本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、NNAおよびNNGのコドンの読み分けを可能とする新たな手段を提供することを本開示の目的の一つとする。

　今回本発明者らは、化学合成したtRNA断片とライシジン（別名2-リシルシチジン）を酵素反応により連結させることで、34位にライシジンが導入され、なおかつ35位および36位（アンチコドン2文字目および3文字目）に様々な配列を有するtRNAを調製した。それらのtRNAを含む翻訳系を再構成して、アミノ酸の翻訳を行ったところ、いずれの翻訳系においてもNNAおよびNNGコドンの読み分けが可能であることが見出された。また、これらの検討過程において、UNNのアンチコドンを有するtRNAは、NNAやNNGのコドンだけでなくNNUのコドンも解読してしまうことが見出されたが、ライシジン導入tRNAの使用により、このNNUコドンのミスリードも大幅に低減された。

　本開示はこのような知見に基づくものであり、具体的には以下に例示的に記載する実施態様を包含するものである。
〔１〕 tRNAを改変することにより作製されている変異tRNAであって、当該改変が、N₁N₂N₃で表されるアンチコドンの改変後の1文字目のヌクレオシドN₁がライシジン(k2C)、ライシジン誘導体、アグマチジン(agm2C)、またはアグマチジン誘導体のいずれかである改変を含み、N₂およびN₃はそれぞれ、該アンチコドンの2文字目および3文字目の任意のヌクレオシドである、変異tRNA。
〔２〕改変前のN₁がシチジン(C)であって、かつ当該シチジン(C)からライシジン(k2C)への改変が、配列番号：５１のアミノ酸配列を有するライシジン合成酵素（tRNA^Ile-lysidine synthetase; TilS）では触媒され得ない、〔１〕に記載の変異tRNA。
〔３〕改変前のN₁がシチジン(C)であって、かつ当該シチジン(C)からアグマチジン(agm2C)への改変が、配列番号：５２のアミノ酸配列を有するアグマチジン合成酵素（tRNA^Ile-agmatidine synthetase; TiaS）では触媒され得ない、〔１〕に記載の変異tRNA。
〔４〕 M₁M₂Aで表されるコドン（ここで、M₁およびM₂はそれぞれコドンの1文字目および2文字目のヌクレオシドを表し、M₁およびM₂はそれぞれアデノシン(A)、グアノシン(G)、シチジン(C)、ウリジン(U)のいずれかから選択され、3文字目のヌクレオシドはアデノシンである）に相補的なアンチコドンを有する、〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の変異tRNA。
〔５〕アンチコドンがk2CN₂N₃またはagm2CN₂N₃（ここで、アンチコドンの1文字目のヌクレオシドはライシジン(k2C)またはアグマチジン(agm2C)であり、2文字目のヌクレオシド(N₂)、3文字目のヌクレオシド(N₃)はそれぞれM₂、M₁に相補的である）で表される、〔４〕に記載の変異tRNA。
〔６〕 N₂およびN₃がそれぞれアデノシン(A)、グアノシン(G)、シチジン(C)、ウリジン(U)のいずれかから選択される、〔５〕に記載の変異tRNA。
〔７〕 tRNAが開始tRNAまたは伸長tRNAである、〔１〕から〔６〕のいずれかに記載の変異tRNA。
〔８〕 tRNAが原核または真核生物由来のtRNAである、〔１〕から〔７〕のいずれかに記載の変異tRNA。
〔９〕天然の遺伝暗号表において、3文字目のヌクレオシドがAであるコドンとGであるコドンがともに同じアミノ酸をコードしているコドンボックスを構成するコドンから、M₁およびM₂が選択される、〔４〕から〔８〕のいずれかに記載の変異tRNA。
〔１０〕天然の遺伝暗号表において、3文字目のヌクレオシドがUであるコドンとAであるコドンがともに同じアミノ酸をコードしているコドンボックスを構成するコドンから、M₁およびM₂が選択される、〔４〕から〔８〕のいずれかに記載の変異tRNA。
〔１１〕天然の遺伝暗号表において、3文字目のヌクレオシドがUであるコドン、Cであるコドン、Aであるコドン、およびGであるコドンがいずれも同じアミノ酸をコードしているコドンボックスを構成するコドンから、M₁およびM₂が選択される、〔４〕から〔８〕のいずれかに記載の変異tRNA。
〔１２〕天然の遺伝暗号表において、3文字目のヌクレオシドがAであるコドンとGであるコドンが互いに異なるアミノ酸をコードしているコドンボックスを構成するコドンから、M₁およびM₂が選択される、〔４〕から〔８〕のいずれかに記載の変異tRNA。
〔１３〕天然の遺伝暗号表において、3文字目のヌクレオシドがAであるコドンおよび／またはGであるコドンが終止コドンであるコドンボックスを構成するコドンから、M₁およびM₂が選択される、〔４〕から〔８〕のいずれかに記載の変異tRNA。
〔１４〕 M₁がウリジン(U)であり、M₂がシチジン(C)である、〔４〕から〔８〕のいずれかに記載の変異tRNA。
〔１５〕 M₁がシチジン(C)であり、M₂がウリジン(U)である、〔４〕から〔８〕のいずれかに記載の変異tRNA。
〔１６〕 M₁がシチジン(C)であり、M₂がシチジン(C)である、〔４〕から〔８〕のいずれかに記載の変異tRNA。
〔１７〕 M₁がシチジン(C)であり、M₂がグアノシン(G)である、〔４〕から〔８〕のいずれかに記載の変異tRNA。
〔１８〕 M₁がアデノシン(A)であり、M₂がウリジン(U)である、〔４〕から〔８〕のいずれかに記載の変異tRNA。
〔１９〕 M₁がグアノシン(G)であり、M₂がウリジン(U)である、〔４〕から〔８〕のいずれかに記載の変異tRNA。
〔２０〕 M₁がグアノシン(G)であり、M₂がシチジン(C)である、〔４〕から〔８〕のいずれかに記載の変異tRNA。
〔２１〕 M₁がグアノシン(G)であり、M₂がグアノシン(G)である、〔４〕から〔８〕のいずれかに記載の変異tRNA。
〔２２〕 N₂がグアノシン(G)であり、N₃がアデノシン(A)である、〔１４〕に記載の変異tRNA。
〔２３〕 N₂がアデノシン(A)であり、N₃がグアノシン(G)である、〔１５〕に記載の変異tRNA。
〔２４〕 N₂がグアノシン(G)であり、N₃がグアノシン(G)である、〔１６〕に記載の変異tRNA。
〔２５〕 N₂がシチジン(C)であり、N₃がグアノシン(G)である、〔１７〕に記載の変異tRNA。
〔２６〕 N₂がアデノシン(A)であり、N₃がウリジン(U)である、〔１８〕に記載の変異tRNA。
〔２７〕 N₂がアデノシン(A)であり、N₃がシチジン(C)である、〔１９〕に記載の変異tRNA。
〔２８〕 N₂がグアノシン(G)であり、N₃がシチジン(C)である、〔２０〕に記載の変異tRNA。
〔２９〕 N₂がシチジン(C)であり、N₃がシチジン(C)である、〔２１〕に記載の変異tRNA。
〔３０〕 3’末端にアミノ酸またはアミノ酸類縁体が結合している、〔１〕から〔２９〕のいずれかに記載の変異tRNA。
〔３１〕アミノ酸が、天然アミノ酸または非天然アミノ酸である、〔３０〕に記載の変異tRNA。
〔３２〕天然アミノ酸が、グリシン(Gly)、アラニン(Ala)、セリン(Ser)、トレオニン(Thr)、バリン(Val)、ロイシン(Leu)、イソロイシン(Ile)、フェニルアラニン(Phe)、チロシン(Tyr)、トリプトファン(Trp)、ヒスチジン(His)、グルタミン酸(Glu)、アスパラギン酸(Asp)、グルタミン(Gln)、アスパラギン(Asn)、システイン(Cys)、メチオニン(Met)、リジン(Lys)、アルギニン(Arg)、プロリン(Pro)からなる群より選択される、〔３１〕に記載の変異tRNA。
〔３３〕天然アミノ酸が、グリシン(Gly)、アラニン(Ala)、セリン(Ser)、トレオニン(Thr)、バリン(Val)、ロイシン(Leu)、フェニルアラニン(Phe)、チロシン(Tyr)、トリプトファン(Trp)、ヒスチジン(His)、グルタミン酸(Glu)、アスパラギン酸(Asp)、グルタミン(Gln)、アスパラギン(Asn)、システイン(Cys)、リジン(Lys)、アルギニン(Arg)、プロリン(Pro)からなる群より選択される、〔３２〕に記載の変異tRNA。
〔３４〕複数の異なる種類のtRNAを含む翻訳系であって、〔１〕から〔３３〕のいずれかに記載の変異tRNAを含む、翻訳系。
〔３５〕変異tRNAが、M₁M₂Aで表されるコドンとは異なるコドンに比べて、M₁M₂Aで表されるコドンを選択的に翻訳することが可能であり、かつM₁M₂Aで表されるコドンが、前記変異tRNAとは異なるtRNAと比較して、前記変異tRNAによって選択的に翻訳され得る、〔３４〕に記載の翻訳系。
〔３６〕（ａ）〔１〕から〔３３〕のいずれかに記載の変異tRNA、および（ｂ）M₁M₂Gで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAを含む、〔３４〕または〔３５〕に記載の翻訳系。
〔３７〕〔３６〕（ｂ）に記載のtRNAのアンチコドンがCN₂N₃、ac4CN₂N₃、またはCmN₂N₃（ここで、ac4CはN4-アセチルシチジン、Cmは2’-O-メチルシチジンを表す）である、〔３６〕に記載の翻訳系。
〔３８〕〔３６〕（ｂ）に記載のtRNAが、M₁M₂Gで表されるコドンとは異なるコドンに比べて、M₁M₂Gで表されるコドンを選択的に翻訳することが可能であり、かつM₁M₂Gで表されるコドンが、〔３６〕（ｂ）に記載のtRNAとは異なるtRNAと比較して、〔３６〕（ｂ）に記載のtRNAによって選択的に翻訳され得る、〔３６〕または〔３７〕に記載の翻訳系。
〔３９〕〔３６〕（ａ）および〔３６〕（ｂ）に記載のtRNAに結合しているアミノ酸またはアミノ酸類縁体が互いに異なる、〔３６〕から〔３８〕のいずれかに記載の翻訳系。
〔４０〕 M₁M₂AおよびM₁M₂Gのコドンから、2種類のアミノ酸が翻訳可能である、〔３９〕に記載の翻訳系。
〔４１〕 M₁M₂AおよびM₁M₂Gのコドンが、互いに異なるアミノ酸またはアミノ酸類縁体をコードし得る、〔３９〕に記載の翻訳系。
〔４２〕さらに、（ｃ）M₁M₂UまたはM₁M₂Cで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAを含む、〔３４〕から〔４１〕に記載の翻訳系。
〔４３〕〔４２〕（ｃ）に記載のtRNAのアンチコドンがAN₂N₃、GN₂N₃、QN₂N₃、およびGluQN₂N₃（ここでQはキューオシン（queuosine）、GluQはグルタミルキューオシン（glutamyl-queuosine）を表す）からなる群より選択される、〔４２〕に記載の翻訳系。
〔４４〕〔４２〕（ｃ）に記載のtRNAが、M₁M₂UまたはM₁M₂Cで表されるコドンとは異なるコドンに比べて、M₁M₂UまたはM₁M₂Cで表されるコドンを選択的に翻訳することが可能であり、かつM₁M₂UまたはM₁M₂Cで表されるコドンが、〔４２〕（ｃ）に記載のtRNAとは異なるtRNAと比較して、〔４２〕（ｃ）に記載のtRNAによって選択的に翻訳され得る、〔４２〕または〔４３〕に記載の翻訳系。
〔４５〕〔３６〕（ａ）、〔３６〕（ｂ）、および〔４２〕（ｃ）に記載のtRNAに結合しているアミノ酸またはアミノ酸類縁体がいずれも互いに異なる、〔４２〕から〔４４〕のいずれかに記載の翻訳系。
〔４６〕 M₁M₂U、M₁M₂C、M₁M₂A、およびM₁M₂Gによって構成されるコドンボックスから、3種類のアミノ酸が翻訳可能である、〔４５〕に記載の翻訳系。
〔４７〕 M₁M₂U、M₁M₂C、M₁M₂A、およびM₁M₂Gによって構成されるコドンボックスにおいて、
（ｉ） M₁M₂A、M₁M₂GおよびM₁M₂Uが互いに異なるアミノ酸またはアミノ酸類縁体をコードし得る、または
（ｉｉ） M₁M₂A、M₁M₂GおよびM₁M₂Cが互いに異なるアミノ酸またはアミノ酸類縁体をコードし得る、
〔４５〕に記載の翻訳系。
〔４８〕〔３６〕（ａ）、〔３６〕（ｂ）、および〔４２〕（ｃ）に記載のtRNAのうち、少なくとも一つに非天然アミノ酸が結合している、〔４５〕から〔４７〕のいずれかに記載の翻訳系。
〔４９〕 20種類より多くのアミノ酸を翻訳可能である、〔３４〕から〔４８〕のいずれかに記載の翻訳系。
〔５０〕無細胞翻訳系である、〔３４〕から〔４９〕のいずれかに記載の翻訳系。
〔５１〕再構成型の無細胞翻訳系である、〔５０〕に記載の翻訳系。
〔５２〕大腸菌由来のリボソームを含む、〔５０〕または〔５１〕に記載の翻訳系。
〔５３〕〔３４〕から〔５２〕のいずれかに記載の翻訳系を用いて核酸を翻訳することを含む、ペプチドの製造方法。
〔５４〕ペプチドが環状部を有するペプチドである、〔５３〕に記載の方法。
〔５５〕〔５３〕または〔５４〕に記載の方法により製造されたペプチド。
〔５６〕〔３４〕から〔５２〕のいずれかに記載の翻訳系を用いて核酸ライブラリーを翻訳することを含む、ペプチドライブラリーの製造方法。
〔５７〕〔５６〕に記載の方法により製造されたペプチドライブラリー。
〔５８〕〔５７〕に記載のペプチドライブラリーに標的分子を接触させることを含む、当該標的分子に対して結合活性を有するペプチドの同定方法。
〔５９〕ペプチドおよび該ペプチドをコードする核酸を含む核酸－ペプチド複合体であって、前記ペプチドをコードする核酸は以下の（Ａ）または（Ｂ）のいずれかに記載の３種類のコドンを含み：
（Ａ）M₁M₂U、M₁M₂A、およびM₁M₂G；
（Ｂ）M₁M₂C、M₁M₂A、およびM₁M₂G、
前記ペプチド上において、前記３種類のコドンに対応するアミノ酸の種類がいずれも異なる、前記核酸－ペプチド複合体。
〔６０〕〔５９〕に記載の核酸－ペプチド複合体を含むライブラリー。
〔６１〕以下の化合物またはその塩。

〔６２〕〔６１〕に記載の化合物とtRNAを構成する核酸断片とを酵素反応によって連結する工程を含む、ライシジンをtRNAナンバリング則の34位に有する変異tRNAの製造方法。
〔６３〕〔６１〕に記載の化合物、tRNAを構成する1または複数の核酸断片、およびアミノ酸またはアミノ酸類縁体とを酵素反応によって連結する工程を含む、ライシジンをtRNAナンバリング則の34位に有する変異tRNAであって、3’末端にアミノ酸またはアミノ酸類縁体が結合している変異tRNAの製造方法。
〔６４〕以下の化合物またはその塩。

〔６５〕〔６４〕に記載の化合物とtRNAを構成する核酸断片とを酵素反応によって連結する工程を含む、アグマチジンをtRNAナンバリング則の34位に有する変異tRNAの製造方法。
〔６６〕〔６４〕に記載の化合物、tRNAを構成する1または複数の核酸断片、およびアミノ酸またはアミノ酸類縁体とを酵素反応によって連結する工程を含む、アグマチジンをtRNAナンバリング則の34位に有する変異tRNAであって、3’末端にアミノ酸またはアミノ酸類縁体が結合している変異tRNAの製造方法。
〔６７〕アミノ酸がメチオニン（Met）およびイソロシン（Ile）以外のアミノ酸である、〔６３〕または〔６６〕に記載の方法。
〔６８〕〔６２〕または〔６５〕に記載の方法により製造される、変異tRNA。
〔６９〕〔６３〕、〔６６〕、または〔６７〕に記載の方法により製造される、3’末端にアミノ酸またはアミノ酸類縁体が結合している変異tRNA。
〔７０〕〔６８〕および／または〔６９〕に記載の変異tRNAを含む、翻訳系。
〔７１〕〔７０〕に記載の翻訳系を用いて核酸を翻訳することを含む、ペプチドの製造方法。
〔７２〕以下の工程を含む、下記式Ａ：

（式中、
　Ｒ_１およびＲ_２は、それぞれ独立してＨまたはＣ_１－Ｃ_３アルキルであり、
　Ｌは、ヒドロキシおよびＣ_１－Ｃ_３アルキルからなる群より選択される１つまたは複数の置換基によって置換されていてもよい、Ｃ_２－Ｃ_６直鎖アルキレンまたはＣ_２－Ｃ_６直鎖アルケニレンであり、該Ｃ_２－Ｃ_６直鎖アルキレンの炭素原子は、１個の酸素原子または硫黄原子によって置換されていてもよく、
　Ｍは、単結合、

であり、波線は炭素原子との結合点を示し、＊は、水素原子との結合点を示し、＊＊は窒素原子との結合点を示し、ただしＭが単結合である場合、Ｍに結合したＨは存在しない。）
で表されるライシジン二リン酸もしくはその誘導体、またはアグマチジン二リン酸もしくはその誘導体の製造方法：
　下記式Ｂ１：

（式中、ＰＧ_１１は、アミノ基の保護基である。）
で表される化合物を分子内で環化して、下記式Ｃ１：

（式中、ＰＧ_１１は上記と同じである。）
で表される化合物を得る工程、
　式Ｃ１で表される化合物に、下記式Ｄ１：

（式中、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｌ、およびＭは上記と同じである。）
で表されるアミンまたはその塩を導入して、下記式Ｅ１：

（式中、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｌ、Ｍ、およびＰＧ_１１は上記と同じである。）
で表される化合物を得る工程、
　式Ｅ１で表される化合物にＰＧ_１２および／またはＰＧ_１３を導入して、下記式Ｆ１Ａまたは式Ｆ１Ｂ：

（式中、
　Ｒ_２は、Ｃ_１－Ｃ_３アルキルであり、
　ＰＧ_１２は、アミノ基の保護基であり、
　ＰＧ_１３は、カルボキシル基またはイミノ基の保護基であり、
　Ｒ_１、Ｌ、Ｍ、およびＰＧ_１１は上記と同じであり、
　但し、Ｍが単結合である場合、ＰＧ_１３は存在しない。）
で表される化合物を得る工程、
　式Ｆ１ＡまたはＦ１Ｂで表される化合物からアセトニドを除去し、ＰＧ_１４およびＰＧ_１５を導入して、下記式Ｇ１ＡまたはＧ１Ｂ：

（式中、
　Ｒ_２は、Ｃ_１－Ｃ_３アルキルであり、
　ＰＧ_１４は、水酸基の保護基であり、
　ＰＧ_１５は、水酸基の保護基であり、
　Ｒ_１、Ｌ、Ｍ、ＰＧ_１１、ＰＧ_１２、およびＰＧ_１３は上記と同じである。）
で表される化合物を得る工程、
　式Ｇ１ＡまたはＧ１Ｂで表される化合物にＰＧ_１６を導入して、下記式Ｈ１ＡまたはＨ１Ｂ

（式中、
　Ｒ_２は、Ｃ_１－Ｃ_３アルキルであり、
　ＰＧ_１６は、水酸基および／またはアミノ基の保護基であり、
　Ｒ_１、Ｌ、Ｍ、ＰＧ_１１、ＰＧ_１２、ＰＧ_１３、ＰＧ_１４、およびＰＧ_１５は上記と同じである。）
で表される化合物を得る工程、
　式Ｈ１ＡまたはＨ１Ｂで表される化合物からＰＧ_１４およびＰＧ_１５を除去して、下記式Ｉ１Ａまたは式Ｉ１Ｂ：

（式中、
　Ｒ_２は、Ｃ_１－Ｃ_３アルキルであり、
　Ｒ_１、Ｌ、Ｍ、ＰＧ_１１、ＰＧ_１２、ＰＧ_１３、およびＰＧ_１６は上記と同じである。）
で表される化合物を得る工程、
　式Ｉ１ＡまたはＩ１Ｂで表される化合物を亜リン酸エステル化し、次いで酸化して、下記式Ｊ１ＡまたはＪ１Ｂ：

（式中、
　Ｒ_２は、Ｃ_１－Ｃ_３アルキルであり、
　ＰＧ_１７は、水酸基の保護基であり、
　Ｒ_１、Ｌ、Ｍ、ＰＧ_１１、ＰＧ_１２、ＰＧ_１３、およびＰＧ_１６は上記と同じである。）
で表される化合物を得る工程、
　式Ｊ１Ａで表される化合物からＰＧ_１１、ＰＧ_１２、ＰＧ_１３、およびＰＧ_１７を除去して、あるいは式Ｊ１Ｂで表される化合物からＰＧ_１１、ＰＧ_１３、およびＰＧ_１７を除去して、下記式Ｋ１：

（式中、
　Ｒ_２は、ＨまたはＣ_１－Ｃ_３アルキルであり、
　Ｒ_１、Ｒ_２、Ｌ、Ｍ、およびＰＧ_１６は上記と同じである。）
で表される化合物を得る工程、および
　式Ｋ１で表される化合物からＰＧ_１６を除去して、式Ａで表される化合物を得る工程。
〔７３〕式Ａで表される化合物が、ライシジン二リン酸：

またはアグマチジン二リン酸：

である、〔７２〕記載の方法。
〔７４〕ＰＧ_１１が、ｐ－ブロモベンゾイル、置換されていてもよいベンゾイル、ピリジンカルボニル、またはアセチルである、〔７２〕記載の方法。
〔７５〕ＰＧ_１２が、Ｆｍｏｃである、〔７２〕記載の方法。
〔７６〕ＰＧ_１３が、Ｍが

の場合にはメチル、エチル、または置換されていてもよいベンジルであり、Ｍが

の場合には置換されていてもよいベンジル、Ｃｂｚまたは置換されていてもよいベンジルオキシカルボニルである、〔７２〕記載の方法。
〔７７〕ＰＧ_１４およびＰＧ_１５は一緒になって、ジ－ｔｅｒｔ－ブチルシリルを形成する、〔７２〕記載の方法。
〔７８〕ＰＧ_１６が、ＴＯＭである、〔７２〕記載の方法。
〔７９〕ＰＧ_１７が、シアノエチルである、〔７２〕記載の方法。
〔８０〕分子内環化がアゾジカルボン酸ジイソプロピルおよびトリフェニルホスフィンの存在下で行われる、〔７２〕記載の方法。
〔８１〕式Ｄ１で表されるアミンまたはその塩の導入が塩化リチウムおよびＤＢＵの存在下で行われる、〔７２〕記載の方法。
〔８２〕ＰＧ_１２がＦｍｏｃであり、ＰＧ_１２の導入に用いられる試薬が、炭酸（２，５－ジオキソピロリジン－１－イル）（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチルおよび炭酸ナトリウムである、〔７２〕記載の方法。
〔８３〕ＰＧ_１３がメチルであり、ＰＧ_１３の導入に用いられる試薬が、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド、メタノール、およびＮ，Ｎ－ジメチル－４－アミノピリジンである、〔７２〕記載の方法。
〔８４〕アセトニドの除去に用いられる試薬が、ＴＦＡである、〔７２〕記載の方法。
〔８５〕ＰＧ_１４およびＰＧ_１５が一緒になってジ－ｔｅｒｔ－ブチルシリルを形成し、ジ－ｔｅｒｔ－ブチルシリルの導入に用いられる試薬が、ビス（トリフルオロメタンスルホン酸）ジ－ｔｅｒｔ－ブチルシリルである、〔７２〕記載の方法。
〔８６〕ＰＧ_１６がＴＯＭであり、ＰＧ_１６の導入に用いられる試薬が、ＤＩＰＥＡ、および塩化（トリイソプロピルシロキシ）メチルである、〔７２〕記載の方法。
〔８７〕ＰＧ_１４およびＰＧ_１５の除去に用いられる試薬が、フッ化水素ピリジンコンプレックスである、〔７２〕記載の方法。
〔８８〕亜リン酸エステル化に用いられる試薬が、ビス（２－シアノエチル）－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミノホスホルアミジットである、〔７２〕記載の方法。
〔８９〕酸化に用いられる試薬が、ｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシドである、〔７２〕記載の方法。
〔９０〕ＰＧ_１１、ＰＧ_１２、ＰＧ_１３、およびＰＧ_１７の除去に用いられる試薬が、ビス－（トリメチルシリル）アセトアミドおよびＤＢＵである、〔７２〕記載の方法。
〔９１〕ＰＧ_１６の除去に用いられる試薬が、フッ化アンモニウムである、〔７２〕記載の方法。
〔９２〕Ｒ_１がＨである、〔７２〕記載の方法。
〔９３〕Ｒ_２がＨである、〔７２〕記載の方法。
〔９４〕Ｃ_２－Ｃ_６直鎖アルキレンまたはＣ_２－Ｃ_６直鎖アルケニレンが、Ｃ_４－Ｃ_５直鎖アルキレンまたはＣ_４－Ｃ_５直鎖アルケニレンである、〔７２〕記載の方法。
〔９５〕Ｌが－（ＣＨ_２）_３－、－（ＣＨ_２）_４－、－（ＣＨ_２）_５、－（ＣＨ_２）_２－Ｏ－ＣＨ_２－、－（ＣＨ_２）_２－Ｓ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ_２）_２－、または－ＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ－（シスまたはトランス）である、〔７２〕記載の方法。
〔９６〕以下の工程を含む、下記式Ａ：

であり、波線は炭素原子との結合点を示し、＊は、水素原子との結合点を示し、＊＊は窒素原子との結合点を示し、ただしＭが単結合である場合、Ｍに結合したＨは存在しない）
で表されるライシジン二リン酸もしくはその誘導体、またはアグマチジン二リン酸もしくはその誘導体の製造方法：
　下記式Ｂ２：

（式中、ＰＧ_２１は、アミノ基の保護基である。）
で表される化合物を分子内で環化して、下記式Ｃ２：

（式中、ＰＧ_２１は上記と同じである。）
で表される化合物を得る工程、
　式Ｃ２で表される化合物に、下記式Ｄ２ＡまたはＤ２Ｂ：

（式中、
　Ｒ_２は、Ｃ_１－Ｃ_３アルキルであり、
　ＰＧ_２２は、アミノ基の保護基であり、
　ＰＧ_２３は、カルボキシル基またはイミノ基の保護基であり、
　Ｒ_１、Ｌ、およびＭは上記と同じであり、
　但し、Ｍが単結合である場合、ＰＧ_２３は存在しない。）
で表されるアミンまたはその塩を導入して、下記式Ｅ２ＡまたはＥ２Ｂ：

（式中、
　Ｒ_２は、Ｃ_１－Ｃ_３アルキルであり、
　Ｒ_１、Ｌ、Ｍ、ＰＧ_２１、ＰＧ_２２、およびＰＧ_２３は上記と同じである。）
で表される化合物を得る工程、
　式Ｅ２ＡまたはＥ２Ｂで表される化合物からアセトニドを除去し、ＰＧ_２４およびＰＧ_２５を導入して、下記式Ｆ２ＡまたはＦ２Ｂ：

（式中、
　Ｒ_２は、Ｃ_１－Ｃ_３アルキルであり、
　ＰＧ_２４は、水酸基の保護基であり、
　ＰＧ_２５は、水酸基の保護基であり、
　Ｒ_１、Ｒ_２、Ｌ、Ｍ、ＰＧ_２１、ＰＧ_２２、およびＰＧ_２３は上記と同じである。）
で表される化合物を得る工程、
　式Ｆ２ＡまたはＦ２Ｂで表される化合物にＰＧ_２６を導入して、下記式Ｇ２ＡまたはＧ２Ｂ

（式中、
　Ｒ_２は、Ｃ_１－Ｃ_３アルキルであり、
　ＰＧ_２６は、水酸基の保護基であり、
　Ｒ_１、Ｒ_２、Ｌ、Ｍ、ＰＧ_２１、ＰＧ_２２、ＰＧ_２３、ＰＧ_２４、およびＰＧ_２５は上記と同じである。）
で表される化合物を得る工程、
　式Ｇ２ＡまたはＧ２Ｂで表される化合物からＰＧ_２４およびＰＧ_２５を除去して、下記式Ｈ２ＡまたはＨ２Ｂ：

で表される化合物を得る工程、
（式中、
　Ｒ_２は、Ｃ_１－Ｃ_３アルキルであり、
　Ｒ_１、Ｌ、Ｍ、ＰＧ_２１、ＰＧ_２２、ＰＧ_２３、およびＰＧ_２６は上記と同じである。）
　式Ｈ２ＡまたはＨ２Ｂで表される化合物を亜リン酸エステル化し、次いで酸化して、下記式Ｉ２ＡまたはＩ２Ｂ：

（式中、
　Ｒ_２は、Ｃ_１－Ｃ_３アルキルであり、
　ＰＧ_２７は、水酸基の保護基であり、
　Ｒ_１、Ｌ、Ｍ、ＰＧ_２１、ＰＧ_２２、ＰＧ_２３、およびＰＧ_２６は上記と同じである。）
で表される化合物を得る工程、
　式Ｉ２Ａで表される化合物からＰＧ_２１、ＰＧ_２２、ＰＧ_２３、およびＰＧ_２７を除去して、あるいは式Ｉ２Ｂで表される化合物からＰＧ_２１、ＰＧ_２３、およびＰＧ_２７を除去して、下記式Ｊ２：

（式中、
　Ｒ_２は、ＨまたはＣ_１－Ｃ_３アルキルであり、
　Ｒ_１、Ｌ、Ｍ、およびＰＧ_２６は上記と同じである。）
で表される化合物を得る工程、および
　式Ｊ２で表される化合物からＰＧ_２６を除去して、式Ａで表される化合物を得る工程。
〔９７〕式Ａで表される化合物が、ライシジン二リン酸：

またはアグマチジン二リン酸：

である、〔９６〕記載の方法。
〔９８〕ＰＧ_２１が、Ｃｂｚ、置換されていてもよいベンジルオキシカルボニル、または置換されていてもよいベンジルである、〔９６〕記載の方法。
〔９９〕ＰＧ_２２が、Ｃｂｚ、置換されていてもよいベンジルオキシカルボニル、または置換されていてもよいベンジルである、〔９６〕記載の方法。
〔１００〕ＰＧ_２３が、Ｍが

の場合には置換されていてもよいベンジルであり、Ｍが

の場合には置換されていてもよいベンジル、Ｃｂｚ、または置換されていてもよいベンジルオキシカルボニルである、〔９６〕記載の方法。
〔１０１〕ＰＧ_２４およびＰＧ_２５は一緒になって、ジ－ｔｅｒｔ－ブチルシリルを形成する、〔９６〕記載の方法。
〔１０２〕ＰＧ_２６が、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロフラニル、またはメトキシメチルである、〔９６〕記載の方法。
〔１０３〕ＰＧ_２７が、ベンジルである、〔９６〕記載の方法。
〔１０４〕分子内環化がアゾジカルボン酸ジイソプロピルおよびトリフェニルホスフィンの存在下で行われる、〔９６〕記載の方法。
〔１０５〕式Ｄ２で表されるアミンまたはその塩の導入が塩化リチウムおよびＤＢＵの存在下で行われる、〔９６〕記載の方法。
〔１０６〕アセトニドの除去に用いられる試薬が、ＴＦＡである、〔９６〕記載の方法。
〔１０７〕ＰＧ_２４およびＰＧ_２５が一緒になってジ－ｔｅｒｔ－ブチルシリルを形成し、ジ－ｔｅｒｔ－ブチルシリルの導入に用いられる試薬が、ビス（トリフルオロメタンスルホン酸）ジ－ｔｅｒｔ－ブチルシリルである、〔９６〕記載の方法。
〔１０８〕ＰＧ_２６がテトラヒドロピラニルであり、ＰＧ_２６の導入に用いられる試薬が、ＴＦＡ、および３，４－ジヒドロ－２Ｈ－ピランである、〔９６〕記載の方法。
〔１０９〕ＰＧ_２４およびＰＧ_２５の除去に用いられる試薬が、テトラブチルアンモニウムフルオリドである、〔９６〕記載の方法。
〔１１０〕亜リン酸エステル化に用いられる試薬が、ジベンジルＮ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイトである、〔９６〕記載の方法。
〔１１１〕酸化に用いられる試薬が、デス－マーチンペルヨージナンである、〔９６〕記載の方法。
〔１１２〕ＰＧ_２１、ＰＧ_２２、ＰＧ_２３、およびＰＧ_２７が、接触水素化によって除去される、〔９６〕記載の方法。
〔１１３〕ＰＧ_２６の除去に用いられる試薬が、塩酸である、〔９６〕記載の方法。
〔１１４〕Ｒ_１がＨである、〔９６〕記載の方法。
〔１１５〕Ｒ_２がＨである、〔９６〕記載の方法。
〔１１６〕Ｃ_２－Ｃ_６直鎖アルキレンまたはＣ_２－Ｃ_６直鎖アルケニレンが、Ｃ_４－Ｃ_５直鎖アルキレンまたはＣ_４－Ｃ_５直鎖アルケニレンである、〔９６〕記載の方法。
〔１１７〕Ｌが－（ＣＨ_２）_３－、－（ＣＨ_２）_４－、－（ＣＨ_２）_５、－（ＣＨ_２）_２－Ｏ－ＣＨ_２－、－（ＣＨ_２）_２－Ｓ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ_２）_２－、または－ＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ－（シスまたはトランス）である、〔９６〕記載の方法。

図１は、実施例１０に記載されるように、ライゲーション反応を利用して調製されたtRNA(Glu)uga-CA（UR-1）をRNaseで断片化したもののマスクロマトグラムを示す図である。上段はCCCUUGpの配列を有する断片、下段はCCCUGpの配列を有する断片の結果をそれぞれ示す。図２は、実施例１０に記載されるように、ライゲーション反応を利用して調製されたtRNA(Glu)Lga-CA（LR-1）をRNaseで断片化したもののマスクロマトグラムを示す図である。上段はCCCULGpの配列を有する断片、中段はCCCUGpの配列を有する断片、下段はCCCUUGpの配列を有する断片の結果をそれぞれ示す。図３は、実施例１０に記載されるように、ライゲーション反応を利用して調製されたtRNA(Glu)Lag-CA（LR-2）をRNaseで断片化したもののマスクロマトグラムを示す図である。上段はCCCULAGpの配列を有する断片、中段はCCCUAGpの配列を有する断片、下段はCCCUUAGpの配列を有する断片の結果をそれぞれ示す。図４は、実施例１０に記載されるように、ライゲーション反応を利用して調製されたtRNA(Glu)Lac-CA（LR-3）をRNaseで断片化したもののマスクロマトグラムを示す図である。上段はCCCULACACGp（配列番号：１９７）の配列を有する断片、中段はCCCUACACGpの配列を有する断片、下段はCCCUUACACGp（配列番号：１９８）の配列を有する断片の結果をそれぞれ示す。図５は、実施例１０に記載されるように、ライゲーション反応を利用して調製されたtRNA(Glu)Lcc-CA（LR-4）をRNaseで断片化したもののマスクロマトグラムを示す図である。上段はCCCULCCACGp（配列番号：１９９）の配列を有する断片、中段はCCCUCCACGpの配列を有する断片、下段はCCCUUCCACGp（配列番号：２００）の配列を有する断片の結果をそれぞれ示す。図６は、実施例１０に記載されるように、ライゲーション反応を利用して調製されたtRNA(Asp)Lag-CA（LR-5）のマスクロマトグラムを示す図である。上段はpGGAGCGGUAGUUCAGUCGGUUAGAAUACCUGCUULAGGUGCAGGGGGUCGCGGGUUCGAGUCCCGUCCGUUCCGC（配列番号：１３４）の配列を有する核酸（目的物）、中段はpGGAGCGGUAGUUCAGUCGGUUAGAAUACCUGCUUAGGUGCAGGGGGUCGCGGGUUCGAGUCCCGUCCGUUCCGC（配列番号：２０１）の配列を有する核酸（pLpがライゲーションされなかった場合の副生成物）、下段はpGGAGCGGUAGUUCAGUCGGUUAGAAUACCUGCUUUAGGUGCAGGGGGUCGCGGGUUCGAGUCCCGUCCGUUCCGC（配列番号：１５４）の配列を有する核酸（pLpの代わりにpUpがライゲーションされた場合の副生成物）の結果をそれぞれ示す。図７は、実施例１０に記載されるように、ライゲーション反応を利用して調製されたtRNA(AsnE2)Lag-CA（LR-6）をRNaseで断片化したもののマスクロマトグラムを示す図である。上段はAUULAGpの配列を有する断片、中段はAUUAGpの配列を有する断片、下段はAUUUAGpの配列を有する断片の結果をそれぞれ示す。図８は、実施例１０に記載されるように、ライゲーション反応を利用して調製されたtRNA(Glu)Lcg-CA（LR-7）をRNaseで断片化したもののマスクロマトグラムを示す図である。上段はCCCULCGpの配列を有する断片、中段はCCCUCGpの配列を有する断片、下段はCCCUUCGpの配列を有する断片の結果をそれぞれ示す。図９は、実施例１０に記載されるように、ライゲーション反応を利用して調製されたtRNA(Glu)Lau-CA（LR-8）をRNaseで断片化したもののマスクロマトグラムを示す図である。上段はCCCULAUACGp（配列番号：２０２）の配列を有する断片、中段はCCCUAUACGpの配列を有する断片、下段はCCCUUAUACGp（配列番号：２０３）の配列を有する断片の結果をそれぞれ示す。図１０は、実施例１０に記載されるように、ライゲーション反応を利用して調製されたtRNA(Glu)(Agm)ag-CA（AR-1）をRNaseで断片化したもののマスクロマトグラムを示す図である。上段はCCCU(Agm)AGpの配列を有する断片、中段はCCCUAGpの配列を有する断片、下段はCCCUUAGpの配列を有する断片の結果をそれぞれ示す。図１１は、実施例１２～１３に記載されるように、Lysidine修飾の有無による、１コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価の結果を示す図である。評価したコドンはＵＣＵ、ＵＣＡ、ＵＣＧである。以下に記載のtRNAおよびmRNAのそれぞれの組合せで翻訳を行った場合に得られるペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表１２を参照）。（図左）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 tRNA：化合物ＡＡｔＲ－１（アンチコドン：aga、アミノ酸：dA）　　　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－２（アンチコドン：uga、アミノ酸：SPh2Cl）　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－５（アンチコドン：cga、アミノ酸：nBuG）　　　　mRNA：ｍＲ－１（UCUのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－２（UCAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－３（UCGのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　（図中）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 tRNA：化合物ＡＡｔＲ－１（アンチコドン：aga、アミノ酸：dA）　　　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－３（アンチコドン：uga、アミノ酸：SPh2Cl）　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－５（アンチコドン：cga、アミノ酸：nBuG）　　　　mRNA：ｍＲ－１（UCUのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－２（UCAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－３（UCGのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　（図右）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 tRNA：化合物ＡＡｔＲ－１（アンチコドン：aga、アミノ酸：dA）　　　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－４（アンチコドン：Lga、アミノ酸：SPh2Cl）　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－５（アンチコドン：cga、アミノ酸：nBuG）　　　　mRNA：ｍＲ－１（UCUのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－２（UCAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－３（UCGのコドンを含む）図１２は、実施例１２～１３に記載されるように、Lysidine修飾の有無による、１コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価の結果を示す図である。評価したコドンはＣＵＵ、ＣＵＡ、ＣＵＧである。以下に記載のtRNAおよびmRNAのそれぞれの組合せで翻訳を行った場合に得られるペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表１３を参照）。（図左）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 tRNA：化合物ＡＡｔＲ－６（アンチコドン：aag、アミノ酸：nBuG）　　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－７（アンチコドン：uag、アミノ酸：Pic2）　　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－９（アンチコドン：cag、アミノ酸：dA）　　　　　mRNA：ｍＲ－４（CUUのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－５（CUAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－６（CUGのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　（図右）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 tRNA：化合物ＡＡｔＲ－６（アンチコドン：aag、アミノ酸：nBuG）　　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－８（アンチコドン：Lag、アミノ酸：Pic2）　　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－９（アンチコドン：cag、アミノ酸：dA）　　　　　mRNA：ｍＲ－４（CUUのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－５（CUAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－６（CUGのコドンを含む）図１３は、実施例１２～１３に記載されるように、Lysidine修飾の有無による、１コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価の結果を示す図である。評価したコドンはＧＵＵ、ＧＵＡ、ＧＵＧである。以下に記載のtRNAおよびmRNAのそれぞれの組合せで翻訳を行った場合に得られるペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表１４を参照）。（図左）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 tRNA：化合物ＡＡｔＲ－１０（アンチコドン：aac、アミノ酸：nBuG）　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－１１（アンチコドン：uac、アミノ酸：Pic2）　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－１３（アンチコドン：cac、アミノ酸：dA）　　　　mRNA：ｍＲ－７（GUUのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－８（GUAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－９（GUGのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　（図右）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 tRNA：化合物ＡＡｔＲ－１０（アンチコドン：aac、アミノ酸：nBuG）　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－１２（アンチコドン：Lac、アミノ酸：Pic2）　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－１３（アンチコドン：cac、アミノ酸：dA）　　　　mRNA：ｍＲ－７（GUUのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－８（GUAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－９（GUGのコドンを含む）図１４は、実施例１２～１３に記載されるように、Lysidine修飾の有無による、１コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価の結果を示す図である。評価したコドンはＧＧＵ、ＧＧＡ、ＧＧＧである。以下に記載のtRNAおよびmRNAのそれぞれの組合せで翻訳を行った場合に得られるペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表１５を参照）。（図左）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 tRNA：化合物ＡＡｔＲ－１４（アンチコドン：gcc、アミノ酸：dA）　　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－１５（アンチコドン：ucc、アミノ酸：Pic2）　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－１７（アンチコドン：ccc、アミノ酸：MeHph）　　 mRNA：ｍＲ－１０（GGUのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－１１（GGAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－１２（GGGのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　（図右）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 tRNA：化合物ＡＡｔＲ－１４（アンチコドン：gcc、アミノ酸：dA）　　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－１６（アンチコドン：Lcc、アミノ酸：Pic2）　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－１７（アンチコドン：ccc、アミノ酸：MeHph）　　 mRNA：ｍＲ－１０（GGUのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－１１（GGAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－１２（GGGのコドンを含む）図１５は、実施例１２～１３に記載されるように、Lysidine修飾の有無による、１コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価の結果を示す図である。評価したコドンはＣＵＵ、ＣＵＡ、ＣＵＧである。以下に記載のtRNAおよびmRNAのそれぞれの組合せで翻訳を行った場合に得られるペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表１６を参照）。（図左）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 tRNA：化合物ＡＡｔＲ－１９（アンチコドン：aag、アミノ酸：nBuG）　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－２０（アンチコドン：uag、アミノ酸：SPh2Cl）　　　　　化合物ＡＡｔＲ－２２（アンチコドン：cag、アミノ酸：dA）　　　　mRNA：ｍＲ－４（CUUのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－５（CUAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－６（CUGのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　（図右）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 tRNA：化合物ＡＡｔＲ－１９（アンチコドン：aag、アミノ酸：nBuG）　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－２１（アンチコドン：Lag、アミノ酸：SPh2Cl）　　　　　化合物ＡＡｔＲ－２２（アンチコドン：cag、アミノ酸：dA）　　　　mRNA：ｍＲ－４（CUUのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－５（CUAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－６（CUGのコドンを含む）図１６は、実施例１２～１３に記載されるように、Lysidine修飾の有無による、１コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価の結果を示す図である。評価したコドンはＣＵＵ、ＣＵＡ、ＣＵＧである。以下に記載のtRNAおよびmRNAのそれぞれの組合せで翻訳を行った場合に得られるペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表１７を参照）。（図左）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 tRNA：化合物ＡＡｔＲ－２３（アンチコドン：aag、アミノ酸：nBuG）　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－２４（アンチコドン：uag、アミノ酸：SPh2Cl）　　　　　化合物ＡＡｔＲ－２６（アンチコドン：cag、アミノ酸：dA）　　　　mRNA：ｍＲ－４（CUUのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－５（CUAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－６（CUGのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　（図右）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 tRNA：化合物ＡＡｔＲ－２３（アンチコドン：aag、アミノ酸：nBuG）　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－２５（アンチコドン：Lag、アミノ酸：SPh2Cl）　　　　　化合物ＡＡｔＲ－２６（アンチコドン：cag、アミノ酸：dA）　　　　mRNA：ｍＲ－４（CUUのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－５（CUAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－６（CUGのコドンを含む）図１７は、実施例１２～１３に記載されるように、Lysidine修飾の有無による、１コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価の結果を示す図である。評価したコドンはＣＵＵ、ＣＵＡ、ＣＵＧである。以下に記載のtRNAおよびmRNAのそれぞれの組合せで翻訳を行った場合に得られるペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表１８を参照）。（図左）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 tRNA：化合物ＡＡｔＲ－６（アンチコドン：aag、アミノ酸：nBuG）　　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－２７（アンチコドン：uag、アミノ酸：MeHph）　　　　　化合物ＡＡｔＲ－９（アンチコドン：cag、アミノ酸：dA）　　　　　mRNA：ｍＲ－４（CUUのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－５（CUAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－６（CUGのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　（図右）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 tRNA：化合物ＡＡｔＲ－６（アンチコドン：aag、アミノ酸：nBuG）　　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－２８（アンチコドン：Lag、アミノ酸：MeHph）　　　　　化合物ＡＡｔＲ－９（アンチコドン：cag、アミノ酸：dA）　　　　　mRNA：ｍＲ－４（CUUのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－５（CUAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－６（CUGのコドンを含む）図１８は、実施例１２～１３に記載されるように、Lysidine修飾の有無による、１コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価の結果を示す図である。評価したコドンはＣＵＵ、ＣＵＡ、ＣＵＧである。以下に記載のtRNAおよびmRNAのそれぞれの組合せで翻訳を行った場合に得られるペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表１９を参照）。（図左）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 tRNA：化合物ＡＡｔＲ－６（アンチコドン：aag、アミノ酸：nBuG）　　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－２９（アンチコドン：uag、アミノ酸：F3Cl）　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－９（アンチコドン：cag、アミノ酸：dA）　　　　　mRNA：ｍＲ－４（CUUのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－５（CUAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－６（CUGのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　（図右）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 tRNA：化合物ＡＡｔＲ－６（アンチコドン：aag、アミノ酸：nBuG）　　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－３０（アンチコドン：Lag、アミノ酸：F3Cl）　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－９（アンチコドン：cag、アミノ酸：dA）　　　　　mRNA：ｍＲ－４（CUUのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－５（CUAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－６（CUGのコドンを含む）図１９は、実施例１２～１３に記載されるように、Lysidine修飾の有無による、１コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価の結果を示す図である。評価したコドンはＣＵＵ、ＣＵＡ、ＣＵＧである。以下に記載のtRNAおよびmRNAのそれぞれの組合せで翻訳を行った場合に得られるペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表２０を参照）。（図左）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 tRNA：化合物ＡＡｔＲ－６（アンチコドン：aag、アミノ酸：nBuG）　　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－３１（アンチコドン：uag、アミノ酸：SiPen）　　　　　化合物ＡＡｔＲ－９（アンチコドン：cag、アミノ酸：dA）　　　　　mRNA：ｍＲ－４（CUUのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－５（CUAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－６（CUGのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　（図右）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 tRNA：化合物ＡＡｔＲ－６（アンチコドン：aag、アミノ酸：nBuG）　　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－３２（アンチコドン：Lag、アミノ酸：SiPen）　　　　　化合物ＡＡｔＲ－９（アンチコドン：cag、アミノ酸：dA）　　　　　mRNA：ｍＲ－４（CUUのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－５（CUAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－６（CUGのコドンを含む）図２０は、実施例１２～１３に記載されるように、Lysidine修飾による、１コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価の結果を示す図である。評価したコドンはＣＧＵ、ＣＧＡ、ＣＧＧである。以下に記載のtRNAおよびmRNAのそれぞれの組合せで翻訳を行った場合に得られるペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表２１を参照）。　　　　 tRNA：化合物ＡＡｔＲ－３３（アンチコドン：gcg、アミノ酸：dA）　　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－３４（アンチコドン：Lcg、アミノ酸：Pic2）　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－３５（アンチコドン：ccg、アミノ酸：nBuG）　　　mRNA：ｍＲ－１３（CGUのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－１４（CGAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－１５（CGGのコドンを含む）図２１は、実施例１２～１３に記載されるように、Lysidine修飾による、１コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価の結果を示す図である。評価したコドンはＡＵＵ、ＡＵＡ、ＡＵＧである。以下に記載のtRNAおよびmRNAのそれぞれの組合せで翻訳を行った場合に得られるペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表２２を参照）。　　　　 tRNA：化合物ＡＡｔＲ－３６（アンチコドン：aau、アミノ酸：nBuG）　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－３７（アンチコドン：Lau、アミノ酸：Pic2）　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－３８（アンチコドン：cau、アミノ酸：dA）　　　　mRNA：ｍＲ－１６（AUUのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－１７（AUAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－１８（AUGのコドンを含む）図２２は、実施例１２～１３に記載されるように、Agmatidine修飾の有無による、１コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価の結果を示す図である。評価したコドンはＣＵＵ、ＣＵＡ、ＣＵＧである。以下に記載のtRNAおよびmRNAのそれぞれの組合せで翻訳を行った場合に得られるペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表２３を参照）。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（図左）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 tRNA：化合物ＡＡｔＲ－６（アンチコドン：aag、アミノ酸：nBuG）　　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－３９（アンチコドン：uag、アミノ酸：SPh2Cl）　　　　　化合物ＡＡｔＲ－９（アンチコドン：cag、アミノ酸：dA）　　　　　mRNA：ｍＲ－４（CUUのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－５（CUAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－６（CUGのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　（図右）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 tRNA：化合物ＡＡｔＲ－６（アンチコドン：aag、アミノ酸：nBuG）　　　　　　　化合物ＡＡｔＲ－４０（アンチコドン：(Agm)ag、アミノ酸：SPh2Cl）　　　化合物ＡＡｔＲ－９（アンチコドン：cag、アミノ酸：dA）　　　　　mRNA：ｍＲ－４（CUUのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－５（CUAのコドンを含む）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍＲ－６（CUGのコドンを含む）

Ｉ．定義
　本明細書を解釈する目的のために、以下の定義が適用され、該当する場合はいつでも、単数形で使用された用語は複数形をも含み、その逆もまた同様である。本明細書で使用される用語は、特定の態様を説明することのみを目的としており、限定を意図したものではないことが、理解されるべきである。下記の定義のいずれかが、参照により本明細書に組み入れられた任意の文書と矛盾する場合には、下記の定義が優先するものとする。

　「コドン」とは、生体内の遺伝情報がタンパク質に翻訳される際の、各アミノ酸に対応する3つのヌクレオシドの組合せ（トリプレット）のことである。DNAの場合は、アデニン（A）、グアニン（G）、シトシン（C）、およびチミン（T）の４種類の塩基が用いられ、mRNAの場合は、アデニン（A）、グアニン（G）、シトシン（C）、およびウラシル（U）の４種類の塩基が用いられる。各コドンとアミノ酸の対応関係を示した表は遺伝暗号表あるいはコドン表と呼ばれ、終止コドンを除く61種類のコドンに、20種類のアミノ酸が割り当てられている（表１）。表１に記載の遺伝暗号表は、真核生物および原核生物（真正細菌および古細菌）におけるほとんどすべての生物で共通して使用されていることから、標準遺伝暗号表あるいは普遍遺伝暗号表とも呼ばれる。本開示においては、天然に存在する生物で使用されている遺伝暗号表を天然の遺伝暗号表と称し、人工的にリプログラミングされた（コドンとアミノ酸の対応関係が改変された）遺伝暗号表とは区別する。遺伝暗号表においては、通常、1文字目と2文字目が共通で3文字目のみが異なる4つのコドンが一つのボックスにまとめられており、これらをコドンボックスと呼ぶ。

　本開示において、mRNAにおけるコドンは「M₁M₂M₃」で表されることがある。ここで、M₁、M₂、およびM₃はそれぞれコドンの1文字目、2文字目、および3文字目のヌクレオシドを表す。

　「アンチコドン」とは、mRNA上のコドンに対応する、tRNA上の3つの連続したヌクレオシドのことである。mRNAと同様に、アンチコドンには、アデニン（A）、グアニン（G）、シトシン（C）、およびウラシル（U）の４種類の塩基が用いられる。さらに、それらを修飾して得られる修飾塩基が用いられることもある。コドンがアンチコドンによって特異的に認識されることによって、mRNA上の遺伝情報が読み取られ、タンパク質に翻訳される。mRNA上の5’から3’方向のコドン配列とtRNA上の5’から3’方向のアンチコドン配列は相補的に結合するため、コドンの1文字目、2文字目、および3文字目のヌクレオシドと、アンチコドンの3文字目、2文字目、および1文字目のヌクレオシドとの間でそれぞれ相補的な塩基対が形成される。

　本開示において、tRNAにおけるアンチコドンは「N₁N₂N₃」で表されることがある。ここで、N₁、N₂、およびN₃はそれぞれアンチコドンの1文字目、2文字目、および3文字目のヌクレオシドを表す。後述のtRNAナンバリング則に従うと、N₁、N₂、およびN₃はそれぞれtRNAの34位、35位、および36位に番号付けされる。

　本開示においては、熱力学的に安定な塩基対を形成し得るような核酸の組合せを互いに「相補的」であるという。アデノシンとウリジン（A-U）、グアノシンとシチジン（G-C）といったワトソン－クリック型塩基対に加えて、グアノシンとウリジン（G-U）、イノシンとウリジン（I-U）、イノシンとアデノシン（I-A）、イノシンとシチジン（I-C）などの非ワトソン－クリック型塩基対を形成する核酸の組合せも、本開示における「相補的」な核酸の組合せに含まれる。特に、コドンの1文字目とアンチコドンの3文字目、コドンの2文字目とアンチコドンの2文字目の間にはワトソン－クリック型塩基対の形成のみが許容されるのに対し、コドンの3文字目とアンチコドンの1文字目の間には空間的なゆらぎ（wobble）が存在するため、上記のような非ワトソン－クリック型塩基対の形成も許容されると考えられている（ゆらぎ仮説）。

　「伝令RNA（messenger RNA; mRNA）」とは、タンパク質に翻訳され得る遺伝情報を持ったRNAのことである。遺伝情報はコドンとしてmRNA上にコードされており、それらが全20種類のアミノ酸にそれぞれ対応している。タンパク質の翻訳は開始コドンから始まり、終止コドンで終了する。真核生物における開始コドンは原則としてAUGであるが、原核生物（真正細菌および古細菌）ではAUGの他にGUGやUUGなども開始コドンとして使用されることがある。AUGはメチオニン（Met）をコードするコドンであり、真核生物および古細菌ではそのままメチオニンから翻訳が開始される。一方、真正細菌では、開始コドンのAUG のみN-ホルミルメチオニン（fMet）に対応しているため、ホルミルメチオニンから翻訳が開始される。終止コドンには、UAA（オーカー）・UAG（アンバー）・UGA（オパール）の3種がある。終止コドンが翻訳終結因子（release factor; RF）と呼ばれるタンパク質によって認識されると、それまでに合成されたペプチド鎖がtRNAから解離し、翻訳工程は終了する。

　「転移RNA（transfer RNA; tRNA）」とは、mRNA を鋳型にしたペプチド合成を仲介する 100塩基以下の短い RNA のことである。二次構造上は、３つのステムループ（Ｄアーム、アンチコドンアーム、Ｔアーム）と１つのステム（アクセプターステム）からなる、クローバー葉状の構造を有している。tRNAによっては、さらに１つの可変ループが含まれることがある。アンチコドンアームには、アンチコドンと呼ばれる３つの連続したヌクレオシドからなる領域が存在し、アンチコドンがmRNA上のコドンと塩基対を形成することによってコドンが認識される。一方、tRNAの3’末端には、シチジン－シチジン－アデノシンからなる核酸配列（CCA配列）が存在し、その末端のアデノシン残基にアミノ酸が付加される（具体的には、アデノシン残基のリボースの2位または3位のヒドロキシル基と、アミノ酸のカルボキシル基がエステル結合する）。アミノ酸が付加したtRNAはアミノアシルtRNAと呼ばれる。本開示においては、アミノアシルtRNAもtRNAの定義に含まれる。また、後述のように、tRNAのCCA配列から末端の２残基（CおよびA）を除去し、それをアミノアシルtRNAの合成に用いる方法が知られている。そのような3’末端のCA配列が除去されたtRNAも、本開示におけるtRNAの定義に含まれる。生体内において、tRNA へのアミノ酸の付加は、アミノアシルtRNA合成酵素（aminoacyl-tRNA synthetase; aaRSまたはARS）という酵素によって行われる。通常、アミノ酸ごとに1種類のアミノアシルtRNA合成酵素が存在していて、なおかつそれぞれのアミノアシルtRNA合成酵素が複数のtRNAの中から特定のtRNAのみを基質として特異的に認識することから、tRNAとアミノ酸との対応関係は厳密に制御されている。

　tRNAにおける各ヌクレオシドは、tRNAナンバリング則に従って番号付けがなされている（Sprinzl et al., Nucleic Acids Res (1998) 26: 148-153）。例えば、アンチコドンは34位～36位に、CCA配列は74～76位にそれぞれ番号付けされている。

　「開始tRNA（initiator tRNA）」とは、mRNAの翻訳の開始時に使用される特定のtRNAのことである。開始アミノ酸を結合した開始tRNAが、翻訳開始因子（initiation factor; IF）に触媒されてリボソームに導入され、mRNA上の開始コドンに結合することで、翻訳が始まる。開始コドンとして、一般的にはメチオニンのコドンであるAUGが用いられるため、開始tRNAはAUGに対応するアンチコドンを有しており、また、開始アミノ酸としてメチオニン（原核生物ではホルミルメチオニン）を結合している。開始tRNAの例として、tRNA fMet（配列番号：１０、１１）を挙げることができる。

　「伸長tRNA（elongator tRNA）」とは、翻訳工程におけるペプチド鎖の伸長反応において使用されるtRNAのことである。ペプチド合成においては、アミノ酸を結合した伸長tRNAが、GTP化された翻訳伸長因子（elongation factor; EF）EF-Tu/eEF-1によりリボソームに順次運ばれることによって、ペプチド鎖の伸長反応が進行する。伸長tRNAの例として、各種アミノ酸に対応したtRNA（配列番号：１～９、１２～５０）を挙げることができる。

　「ライシジン（lysidine）」は修飾ヌクレオシドの一種で、2-リジルシチジン（2-lysylcytidine; k2CあるいはL）とも表記される。ライシジンは、真正細菌におけるイソロイシンに対応したtRNA（tRNA Ile2）において、アンチコドンの１文字目のヌクレオシドとして用いられている。tRNA Ile2は、CAUのアンチコドンをもった前駆体の状態で合成された後、tRNA Ile-ライシジン合成酵素（tRNA Ile-lysidine synthetase; TilS）と呼ばれる酵素の作用により、アンチコドンの１文字目のシチジン（C）がライシジン（k2C）に改変（変換）される。その結果、k2CAUのアンチコドンをもったtRNA Ile2が完成する（Muramatsu et al., J Biol Chem (1988) 263: 9261-9267、Suzuki et al., FEBS Lett (2010) 584: 272-277）。k2CAUのアンチコドンは、イソロイシンのコドンAUAのみを特異的に認識することが知られている。また、アンチコドンがk2CAUに改変されることによって初めて、イソロイシルtRNA合成酵素によりtRNA Ile2が基質として認識され、tRNA Ile2のアミノアシル化（イソロイシンの付加）が起きると考えられている。大腸菌のTilSのアミノ酸配列を配列番号：５１に示す。

　「アグマチジン（agmatidine）」は修飾ヌクレオシドの一種で、2-アグマチニルシチジン（2-agmatinylcytidine; agm2CあるいはAgm）とも表記される。アグマチジンは、古細菌におけるイソロイシンに対応したtRNA（tRNA Ile2）において、アンチコドンの１文字目のヌクレオシドとして用いられている。tRNA Ile2は、CAUのアンチコドンをもった前駆体の状態で合成された後、tRNA Ile-アグマチジン合成酵素（tRNA Ile-agmatidine synthetase; TiaS）と呼ばれる酵素の作用により、アンチコドンの１文字目のシチジン（C）がアグマチジン（agm2C）に改変（変換）される。その結果、agm2CAUのアンチコドンをもったtRNA Ile2が完成する（Ikeuchi et al., Nat Chem Biol (2010) 6(4): 277-282）。agm2CAUのアンチコドンは、イソロイシンのコドンAUAのみを特異的に認識することが知られている。また、アンチコドンがagm2CAUに改変されることによって初めて、イソロイシルtRNA合成酵素によりtRNA Ile2が基質として認識され、tRNA Ile2のアミノアシル化（イソロイシンの付加）が起きると考えられている。古細菌Methanosarcina acetivoransのTiaSのアミノ酸配列を配列番号：５２に示す。

＜置換基等の定義＞
　本開示において「アルキル」とは、脂肪族炭化水素から任意の水素原子を１個除いて誘導される１価の基であり、骨格中にヘテロ原子または不飽和の炭素－炭素結合を含有せず、水素および炭素原子を含有するヒドロカルビルまたは炭化水素基構造の部分集合を有する。炭素鎖の長さｎは１～２０個の範囲であり、アルキルとしては、例えばＣ_２－Ｃ_１０アルキル、Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、Ｃ_１－Ｃ_３アルキルなどが挙げられ、具体的には、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、イソプロピル、ｔ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、１－メチルプロピル、１，１－ジメチルプロピル、２，２－ジメチルプロピル、１，２－ジメチルプロピル、１，１，２－トリメチルプロピル、１，２，２－トリメチルプロピル、１，１，２，２－テトラメチルプロピル、１－メチルブチル、２－メチルブチル、３－メチルブチル、１，１－ジメチルブチル、１，２－ジメチルブチル、１，３－ジメチルブチル、２，２－ジメチルブチル、２，３－ジメチルブチル、３，３－ジメチルブチル、１－エチルブチル、２－エチルブチル、イソペンチル、ネオペンチルなどが挙げられる。

　本開示において「シクロアルキル」とは、飽和または部分的に飽和した環状の１価の脂肪族炭化水素基を意味し、単環、ビシクロ環、スピロ環を含む。シクロアルキルとしては、例えばＣ_３－Ｃ_１０シクロアルキルが挙げられ、具体的には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチルなどが挙げられる。

　本開示において「アルケニル」とは、少なくとも１個の二重結合（２個の隣接ＳＰ２炭素原子）を有する１価の基である。二重結合および置換分（存在する場合）の配置によって、二重結合の幾何学的形態は、エントゲーゲン（Ｅ）またはツザンメン（Ｚ）、シスまたはトランス配置をとることができる。直鎖状または分枝鎖状のアルケニルが挙げられ、内部オレフィンを含む直鎖などを含む。アルケニルとしては、例えばＣ_２－Ｃ_１０アルケニル、Ｃ_２－Ｃ_６アルケニルなどが挙げられ、具体的には、ビニル、アリル、１－プロペニル、２－プロペニル、１－ブテニル、２－ブテニル（シス、トランスを含む）、３－ブテニル、ペンテニル、ヘキセニルなどが挙げられる。

　本開示において「アルキニル」とは、少なくとも１個の三重結合（２個の隣接ＳＰ炭素原子）を有する、１価の基である。直鎖状または分枝鎖状のアルキニルが挙げられ、内部アルキレンを含む。アルキニルとしては、例えばＣ_２－Ｃ_１０アルキニル、Ｃ_２－Ｃ_６アルキニルなどが挙げられ、具体的には、エチニル、１－プロピニル、プロパルギル、３－ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、３－フェニル－２－プロピニル、３－（２'－フルオロフェニル）－２－プロピニル、２－ヒドロキシ－２－プロピニル、３－（３－フルオロフェニル）－２－プロピニル、３－メチル－（５－フェニル）－４－ペンチニルなどが挙げられる。

　本開示において「アリール」とは、１価の芳香族炭化水素環を意味する。アリールとしては、例えばＣ_６－Ｃ_１０アリールが挙げられ、具体的には、フェニル、ナフチル（例えば、１－ナフチル、２－ナフチル）などが挙げられる。

　本開示において「ヘテロアリール」とは、環を構成する原子中にヘテロ原子を含有する芳香族性の環の１価の基を意味し、部分的に飽和されていてもよい。環は単環、または２個の縮合環（例えば、ベンゼンまたは単環へテロアリールと縮合した２環式ヘテロアリール）であってもよい。環を構成する原子の数は例えば５－１０個である（５員－１０員ヘテロアリール）。環を構成する原子中に含まれるヘテロ原子の数は例えば１－５個である。ヘテロアリールとしては、具体的には、フリル、チエニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピリジル、ピリミジル、ピリダジニル、ピラジニル、トリアジニル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾイミダゾリル、インドリル、イソインドリル、インダゾリル、キノリル、イソキノリル、シンノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、ベンゾジオキソリル、インドリジニル、イミダゾピリジルなどが挙げられる。

　本開示において「アリールアルキル（アラルキル）」とは、アリールとアルキルを共に含む基であり、例えば、前記アルキルの少なくとも一つの水素原子がアリールで置換された基を意味する。アラルキルとしては、例えばＣ_５－Ｃ_１０アリールＣ_１－Ｃ_６アルキル」が挙げられ、具体的には、ベンジルなどが挙げられる。

　本開示において「アルキレン」とは、前記「アルキル」からさらに任意の水素原子を１個除いて誘導される二価の基を意味し、直鎖状のものでも分枝鎖状のものでもよい。直鎖アルキレンとしては、Ｃ_２－Ｃ_６直鎖アルキレン、Ｃ_４－Ｃ_５直鎖アルキレンなどが挙げられ、具体的には、－ＣＨ_２－、－（ＣＨ_２）_２－、－（ＣＨ_２）_３－、－（ＣＨ_２）_４－、－（ＣＨ_２）_５－、－（ＣＨ_２）_６－などが挙げられる。分岐アルキレンとしては、Ｃ_２－Ｃ_６分岐アルキレン、Ｃ_４－Ｃ_５分岐アルキレンなどが挙げられ、具体的には、－ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２－、－Ｃ（ＣＨ_３）_２－、－ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＣＨ_２－、－Ｃ（ＣＨ_３）_２ＣＨ_２－、－ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２－、－ＣＨ_２Ｃ（ＣＨ_３）_２－、－ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）－などが挙げられる。

　本開示において「アルケニレン」は、前記「アルケニル」からさらに任意の水素原子を１個除いて誘導される二価の基を意味し、直鎖状のものでも分枝鎖状のものでもよい。二重結合および置換基（存在する場合）の配置によって、エントゲーゲン（Ｅ）またはツザンメン（Ｚ）、シスまたはトランス配置をとることができる。直鎖アルケニレンとしては、Ｃ_２－Ｃ_６直鎖アルケニレン、Ｃ_４－Ｃ_５直鎖アルケニレンなどが挙げられ、具体的には、－ＣＨ＝ＣＨ－、－ＣＨ＝ＣＨＣＨ_２－、－ＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ－、－ＣＨ＝ＣＨＣＨ_２ＣＨ_２－、－ＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨＣＨ_２－、－ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ－、－ＣＨ＝ＣＨＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２－、－ＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨＣＨ_２ＣＨ_２－、－ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨＣＨ_２－、－ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ－などが挙げられる。

　本開示において「アリーレン」とは、前記アリールからさらに任意の水素原子を１個除いて誘導される２価の基を意味する。環は単環でも縮合環でもよい。環を構成する原子の数は特に限定されないが、例えば６－１０個である（Ｃ_６－Ｃ_１０アリーレン）。アリーレンとしては、具体的には、フェニレン、ナフチレンなどが挙げられる。

　本開示において「ヘテロアリーレン」とは、前記ヘテロアリールからさらに任意の水素原子を１個除いて誘導される２価の基を意味する。環は単環でも縮合環でもよい。環を構成する原子の数は特に限定されないが、例えば５－１０個である（５員～１０員ヘテロアリーレン）。ヘテロアリーレンとしては、具体的には、ピロールジイル、イミダゾールジイル、ピラゾールジイル、ピリジンジイル、ピリダジンジイル、ピリミジンジイル、ピラジンジイル、トリアゾールジイル、トリアジンジイル、イソオキサゾールジイル、オキサゾールジイル、オキサジアゾールジイル、イソチアゾールジイル、チアゾールジイル、チアジアゾールジイル、フランジイル、チオフェンジイルなどが挙げられる。

　本開示における「翻訳系」とは、ペプチドを翻訳するための方法およびペプチドを翻訳するためのキットの両方を含む概念として定義される。翻訳系には、通常、リボソーム、翻訳因子、tRNA、アミノ酸、アミノアシルtRNA合成酵素（aaRS）、及びATPやGTPなどのペプチドの翻訳反応に必要な因子が構成成分として含まれる。翻訳系の主な種類としては、生細胞を利用した翻訳系や、細胞抽出液を利用した翻訳系（無細胞翻訳系）がある。生細胞を利用した翻訳系としては、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞や哺乳動物細胞などの生細胞に、所望のアミノアシルtRNAおよびmRNAをマイクロインジェクション法やリポフェクション法により導入してペプチド翻訳を行う系が知られている（Nowak et al., Science (1995) 268: 439-442）。無細胞翻訳系の例としては、大腸菌（Chen et al., Methods Enzymol (1983) 101: 674-690）、酵母（Gasior et al., J Biol Chem (1979) 254: 3965-3969）、小麦胚芽（Erickson et al., Methods Enzymol (1983) 96: 38-50）、ウサギ網状赤血球（Jackson et al., Methods Enzymol (1983) 96: 50-74）、HeLa細胞（Barton et al., Methods Enzymol (1996) 275: 35-57）、あるいは昆虫細胞（Swerdel et al., Comp Biochem Physiol B (1989) 93: 803-806）などからの抽出液を利用した翻訳系が知られている。このような翻訳系は、当業者に公知の方法またはそれに準ずる方法によって適宜調製することができる。無細胞翻訳系には、ペプチド翻訳に必要な因子をそれぞれ単離・精製して、それらを再構成して構築された翻訳系（再構成型の無細胞翻訳系）も含まれる（Shimizu et al., Nat Biotech (2001) 19: 751-755）。再構成型の無細胞翻訳系には、通常、リボソーム、アミノ酸、tRNA、アミノアシルtRNA合成酵素（aaRS）、翻訳開始因子（例えば、IF1、IF2、IF3）、翻訳伸長因子（例えばEF-Tu、EF-Ts、EF-G）、翻訳終結因子（例えばRF1、RF2、RF3）、リボソーム再生因子（ribosome recycling factor; RRF）、エネルギー源としてのNTP類、エネルギー再生系、および翻訳に必要なその他の因子などが含まれ得る。DNAからの転写反応を併せて行う場合は、さらにRNAポリメラーゼなどが含まれ得る。無細胞翻訳系に含まれる種々の因子は、当業者に周知の方法によって単離・精製することが可能であり、それらを用いて再構成型の無細胞翻訳系を適宜構築することができる。あるいは、ジーンフロンティア社のPUREfrex（登録商標）や、New England BioLabs社のPURExpress（登録商標）などの市販されている再構成型の無細胞翻訳系を利用することもできる。再構成型の無細胞翻訳系の場合、翻訳系の構成成分のうち必要な成分だけを再構成して、所望の翻訳系を構築することができる。

　アミノ酸・tRNA・アミノアシルtRNA合成酵素の特異的な組合せにより、アミノアシルtRNAが合成され、それがペプチドの翻訳に用いられる。上記の組合せの代わりに、アミノアシルtRNAをそのまま翻訳系の構成成分として用いることもできる。特に、非天然アミノ酸など、アミノアシルtRNA合成酵素でアミノアシル化することが困難なアミノ酸が翻訳に用いられる場合は、あらかじめ非天然アミノ酸でアミノアシル化されたtRNAを構成成分として用いることが望ましい。

　翻訳系にmRNAを加えることによって、その翻訳が開始される。mRNAには、通常、目的のペプチドをコードする配列が含まれており、さらに、翻訳反応の効率を上昇させるための配列（例えば、原核生物におけるシャイン・ダルガーノ（Shine-Dalgarno; SD）配列、真核生物におけるコザック（Kozac）配列など）が含まれていてもよい。あらかじめ転写されたmRNAを系に直接加えてもよいし、mRNAの代わりに、プロモーターを含む鋳型DNAとそれに適したRNAポリメラーゼ（例えばT7プロモーターとT7 RNAポリメラーゼなど）を系に加えることによって、mRNAが鋳型DNAから転写されるようにしてもよい。

ＩＩ．組成物および方法
＜変異tRNA＞
　一局面において、本開示は、改変されたtRNAを提供する。具体的には、本発明は、tRNAを改変することにより作製されている変異tRNAを提供する。改変されるtRNAは、任意の生物（例えば大腸菌など）に由来する天然tRNAであってもよいし、または天然tRNAとは異なる配列を人工的に合成した非天然tRNAであってもよい。あるいは、天然tRNAと同じ配列を人工的に合成したtRNAであってもよい。本開示においてtRNAに導入される改変はいずれも人工的な改変であって、当該改変により作製される変異tRNAはいずれも天然には存在しない核酸配列を有していることを特徴とする。

　いくつかの態様において、本開示におけるtRNAの改変とは、tRNAを構成する１つ以上のヌクレオシドに対して、以下の群から選択される少なくとも１種類以上の改変を導入することを意味する：(i) 付加（既存のtRNAに任意の新たなヌクレオシドを付け足すこと）、(ii) 欠失（既存のtRNAから任意のヌクレオシドを削除すること）、(iii) 置換（既存のtRNAにおける任意のヌクレオシドを別の任意のヌクレオシドに置き換えること）、(iv) 挿入（既存のtRNAにおける任意の２つのヌクレオシドの間に新たな任意のヌクレオシドを追加すること）、(v) 修飾（既存のtRNAにおける任意のヌクレオシドの構造の一部（例えば塩基部分や糖部分）を別の構造に変化させること）。改変はtRNAのどの構造（例えばＤアーム、アンチコドンアーム、Ｔアーム、アクセプターステム、可変ループなど）に対して行われてもよい。特定の態様において、本開示におけるtRNAの改変は、アンチコドンアームに含まれるアンチコドンに対して行われる。さらなる態様において、本開示におけるtRNAの改変は、アンチコドンの1文字目、2文字目、および3文字目のヌクレオシドのうちの少なくとも１つに対して行われる。tRNAにおけるヌクレオシドのナンバリング則に従うと、アンチコドンの1文字目、2文字目、および3文字目のヌクレオシドは、それぞれtRNAの34位、35位、および36位に該当する。本明細書においては、アンチコドンの1文字目、2文字目、および3文字目のヌクレオシドをそれぞれN₁、N₂、およびN₃と表現することがある。特定の態様において、本開示におけるtRNAの改変は、アンチコドンの1文字目のヌクレオシドに対して行われる改変を含む。本開示のtRNAにおいて改変されるヌクレオシドの数は1以上の任意の数であることができる。いくつかの態様において、本開示のtRNAにおいて改変されるヌクレオシドの数は、20以下、15以下、10以下、9以下、8以下、7以下、6以下、5以下、4以下、3以下、2以下、あるいは1である。別の態様において、改変後のtRNAの核酸配列は、改変前の核酸配列と比べて、80％以上、85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、あるいは99％以上同一である。

　特定の態様において、本開示におけるtRNAの改変とは、tRNAを構成する１つ以上のヌクレオシドを置換することを意味する。ヌクレオシドの種類に関して、置換された後のヌクレオシドは、天然tRNA中に存在するいずれかのヌクレオシドであってもよいし、天然tRNA中には存在しない任意のヌクレオシド（人工的に合成されたヌクレオシド）であってもよい。天然tRNA中には、4つの典型的なヌクレオシドであるアデノシン、グアノシン、シチジンおよびウリジンの他に、それらを修飾して得られる改変体（修飾ヌクレオシド）も含まれている。いくつかの態様において、天然tRNA中に存在するヌクレオシドは、以下のヌクレオシドの中から選択され得る：アデノシン（adenosine; A）、シチジン（cytidine; C）、グアノシン（guanosine; G）、ウリジン（uridine; U）、1-メチルアデノシン（1-methyladenosine; m1A）、2-メチルアデノシン（2-methyladenisine; m2A）、N6-イソペンテニルアデノシン（N6-isopentenyladenosine; i6A）、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデノシン（2-methylthio-N6-isopentenyladenosine; ms2i6A）、N6-メチルアデノシン（N6-methyladenosine; m6A）、N6-トレオニルカルバモイルアデノシン（N6-threonylcarbamoyladenosine; t6A）、N6-メチル-N6-トレオニルカルバモイルアデノシン（N6-methyl-N6-threonylcarbamoyladenosine; m6t6A）、2-メチルチオ-N6-トレオニルカルバモイルアデノシン（2-methylthio-N6-threonylcarbamoyladenosine; ms2t6A）、2’-O-メチルアデノシン（2’-O-methyladenosine; Am）、イノシン（inosine; I）、1-メチルイノシン（1-methylinosine; m1I）、2’-O-リボシルアデノシン(リン酸塩)（2’-O-ribosyladenosine (phosphate); Ar(p)）、N6-(cis-ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン（N6-(cis-hydroxyisopentenyl)adenosine; io6A）、2-チオシチジン（2-thiocytidine; s2C）、2’-O-メチルシチジン（2’-O-methylcytidine; Cm）、N4-アセチルシチジン（N4-acetylcytidine; ac4C）、5-メチルシチジン（5-methylcytidine; m5C）、3-メチルシチジン（3-methylcytidine; m3C）、ライシジン（lysidine; k2C）、5-ホルミルシチジン（5-formylcytidine; f5C）、2’-O-メチル-5-ホルミルシチジン（2’-O-methyl-5-formylcytidine; f5Cm）、アグマチジン（agmatidine; agm2C）、2’-O-リボシルグアノシン(リン酸塩)（2’-O-ribosylguanosine (phosphate); Gr(p)）、1-メチルグアノシン（1-methylguanosine; m1G）、N2-メチルグアノシン（N2-methylguanosine; m2G）、2’-O-メチルグアノシン（2’-O-methylguanosine; Gm）、N2, N2-ジメチルグアノシン（N2, N2-dimethylguanosine; m22G）、N2, N2, 2’-O-トリメチルグアノシン（N2, N2, 2’-O-trimethylguanosine; m22Gm）、7-メチルグアノシン（7-methylguanosine; m7G）、アーキオシン（archaeosine; G*）、キューオシン（queuosine; Q）、マンノシルキューオシン（mannosylqueuosine; manQ）、ガラクトシルキューオシン（galactosylqueuosine; galQ）、ワイブトシン（wybutosine; yW）、ペルオキシワイブトシン（peroxywybutosine; o2yW）、5-メチルアミノメチルウリジン（5-methylaminomethyluridine; mnm5U）、2-チオウリジン（2-thiouridine; s2U）、2’-O-メチルウリジン（2’-O-methyluridine; Um）、4-チオウリジン（4-thiouridine; s4U）、5-カルバモイルメチルウリジン（5-carbamoylmethyluridine; ncm5U）、5-メトキシカルボニルメチルウリジン（5-methoxycarbonylmethyluridine; mcm5U）、5-メチルアミノメチル-2-チオウリジン（5-methylaminomethyl-2-thiouridine; mnm5s2U）、5-メトキシカルボニルメチル-2-チオウリジン（5-methoxycarbonylmethyl-2-thiouridine; mcm5s2U）、ウリジン5-オキシ酢酸（uridine 5-oxyacetic acid; cmo5U）、5-メトキシウリジン（5-methoxyuridine; mo5U）、5-カルボキシメチルアミノメチルウリジン（5-carboxymethylaminomethyluridine; cmnm5U）、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン（5-carboxymethylaminomethyl-2-thiouridine; cmnm5s2U）、3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)ウリジン（3-(3-amino-3-carboxypropyl)uridine; acp3U）、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウリジンメチルエステル（5-(carboxyhydroxymethyl)uridinemethyl ester; mchm5U）、5-カルボキシメチルアミノメチル-2’-O-メチルウリジン（5-carboxymethylaminomethyl-2’-O-methyluridine; cmnm5Um）、5-カルバモイルメチル-2’-O-メチルウリジン（5-carbamoylmethyl-2’-O-methyluridine; ncm5Um）、ジヒドロウリジン（dihydrouridine; D）、シュードウリジン（pseudouridine; Ψ）、1-メチルシュードウリジン（1-methylpseudouridine; m1Ψ）、2’-O-メチルシュードウリジン（2’-O-methylpseudouridine; Ψm）、5-メチルウリジン（5-methyluridine; m5U）、5-メチル-2-チオウリジン（5-methyl-2-thiouridine; m5s2U）、5, 2’-O-ジメチルウリジン（5, 2’-O-dimethyluridine; m5Um）。特定の態様において、本開示のtRNAを構成する１つ以上のヌクレオシドが、ライシジンまたはアグマチジンに置換される。上述の天然tRNA中に存在するヌクレオシドの構造の一部（例えば塩基部分）を修飾して得られたヌクレオシド誘導体も置換に用いることができる。特定の態様において、本開示のtRNAを構成する１つ以上のヌクレオシドが、ライシジン誘導体またはアグマチジン誘導体に置換される。

　本開示において改変されるtRNAは、任意の核酸配列を有するtRNAの中から適宜選択することができる。いくつかの態様において、tRNAはtRNA Ala、tRNA Arg、tRNA Asn、tRNA Asp、tRNA Cys、tRNA Gln、tRNA Glu、tRNA Gly、tRNA His、tRNA Ile、tRNA Leu、tRNA Lys、tRNA Met、tRNA Phe、tRNA Pro、tRNA Ser、tRNA Thr、tRNA Trp、tRNA Tyr、tRNA Valのいずれかである。上記の20種類のtRNA以外もに、tRNA fMetやtRNA Sec（セレノシステイン）、tRNA Pyl（ピロリシン）、tRNA AsnE2なども用い得る。特定の態様において、tRNAはtRNA Glu、tRNA Asp、tRNA AsnE2のいずれかである。いくつかのtRNAについて、例示的な核酸配列を配列番号：１～５０に示す。tRNAの本体部分（核酸で構成された主要な構造部分）を指してtRNA bodyとの用語が用いられることもある。

　なお、本開示において、tRNAは以下のように表記されることがある。
・「tRNA Xxx」あるいは「tRNA(Xxx)」・・・アミノ酸Xxxに対応したtRNA（全長）を示す（例えばtRNA GluやtRNA(Glu)など）。
・「tRNA(Xxx)nnn」・・・アミノ酸Xxxに対応したtRNAであって、アンチコドン配列がnnnであるtRNA（全長）を示す（例えばtRNA(Glu)ugaやtRNA(Glu)Lgaなど）。
・「tRNA(Xxx)nnn-CA」・・・アミノ酸Xxxに対応したtRNAであって、アンチコドン配列がnnnであるtRNA（3’末端のCA配列が除去されたもの）を示す（例えばtRNA(Glu)uga-CAやtRNA(Glu)Lga-CAなど）。

　特定の態様において、本開示におけるtRNAの改変は、アンチコドンの1文字目のヌクレオシド（N₁）をライシジン、ライシジン誘導体、アグマチジン、またはアグマチジン誘導体のいずれかに置換する改変を含む。ここで、ライシジン誘導体とは、ライシジンの構造の一部（例えば塩基部分）に修飾を加えて作製されている分子であって、アンチコドンの一部として用いられた場合に、ライシジンと同等のコドン識別能（相補的塩基対の形成能）を有している分子を意味する。また、アグマチジン誘導体とは、アグマチジンの構造の一部（例えば塩基部分）に修飾を加えて作製されている分子であって、アンチコドンの一部として用いられた場合に、アグマチジンと同等のコドン識別能（相補的塩基対の形成能）を有している分子を意味する。

　天然tRNAにおけるライシジンは、tRNA Ile-ライシジン合成酵素（tRNA Ile-lysidine synthetase; TilS）と呼ばれる酵素の作用により合成される。TilSは、イソロイシンに対応したtRNA（tRNA Ile2）を基質として特異的に認識し、そのアンチコドンの１文字目（N₁）におけるシチジン（C）をライシジン（k2C）に改変（変換）する活性を有している。本開示のtRNAにおけるライシジンは、TilSを介して合成されたものであってもよいし、TilSを介さずに合成されたものであってもよい。

　前者の場合（ライシジンがTilSを介して合成されたものである場合）、本開示のtRNAは、TilSによって基質として認識され得る。すなわち、当該tRNAにおける改変前のN₁がシチジンであった場合、当該シチジンはTilSによってライシジンに改変され得る。あるtRNAのN₁におけるシチジンがTilSによってライシジンに改変され得るか否かは、例えば遺伝子組み換え手法によりTilSを調製し、または生物学的材料からTilSを抽出し、それをN₁がシチジンであるtRNAと適切な条件下で反応させた後、反応産物中におけるライシジンを検出することで確認することができる（例えば、Suzuki et al., FEBS Lett (2010) 584: 272-277などを参照のこと）。あるいは、TilS を内在的に発現する細胞に、またはTilSを遺伝子組み換え手法により発現させた細胞に、N₁がシチジンであるtRNAを導入して、細胞内のTilSと適切な条件下で反応させた後、当該tRNAに含まれるライシジンを検出することでも確認することができる。本開示の一態様において、tRNAにおける改変前のN₁がシチジンであった場合、当該シチジンからライシジンへの改変がTilSによって触媒され得る。

　一方、後者の場合（ライシジンがTilSを介さずに合成されたものである場合）、本開示のtRNAは、TilSによって基質として認識され得ない。すなわち、当該tRNAにおける改変前のN₁がシチジンであったとしても、当該シチジンはTilSによってライシジンに改変され得ない。その場合、ライシジンおよびそれを含むtRNAは、TilSを用いない方法（例えば、化学的な合成法）によって合成することができる。後述の実施例には、そのような合成法の一例が示されている。本開示の一態様において、tRNAにおける改変前のN₁がシチジンであった場合、当該シチジンからライシジンへの改変がTilSでは触媒され得ない。シチジンからライシジンへの改変がTilSでは触媒され得ない状態とは、例えば、100 mM Hepes-KOH (pH 8.0), 10 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 2 mM DTT, 2 mM ATP, 100 μM Lysine中で10 μg/mL TilS と1 μMのtRNAを37℃で2時間反応させたときに、天然の基質であるtRNA Ile2のシチジンをライシジンに改変する活性を1とした場合、TilSが対象tRNAのシチジンをライシジンに改変する活性がそれより10倍以上、20倍以上、40倍以上、100倍以上、200倍以上、あるいは400倍以上低下している状態として表現することができる。TilSによる触媒活性が低下している場合、結果的にN₁がシチジンのままの未改変tRNAを多く含むような低純度の目的物しか得られないため、TilSを用いた方法でライシジンを合成するよりも、TilSを用いない方法（例えば、化学的な合成法）でライシジンを合成する方が有利であると考えられる。特定の態様において、TilSは大腸菌由来のTilSである。さらなる態様において、TilSは配列番号：５１のアミノ酸配列を有する大腸菌由来の野生型のTilSである。

　また、TilSは、tRNA Ile2における一部のヌクレオシドが他のヌクレオシドに改変された後のtRNAに対しても、ある程度のライシジン合成能を維持していることが報告されている（Ikeuchi et al., Mol Cell (2005) 19: 235-246）。

　天然tRNAにおけるアグマチジンは、tRNA Ile-アグマチジン合成酵素（tRNA Ile-agmatidine synthetase; TiaS）と呼ばれる酵素の作用により合成される。TiaSは、イソロイシンに対応したtRNA（tRNA Ile2）を基質として特異的に認識し、そのアンチコドンの１文字目（N₁）におけるシチジン（C）をアグマチジン（agm2C）に改変（変換）する活性を有している。本開示のtRNAにおけるアグマチジンは、TiaSを介して合成されたものであってもよいし、TiaSを介さずに合成されたものであってもよい。

　前者の場合（アグマチジンがTiaSを介して合成されたものである場合）、本開示のtRNAは、TiaSによって基質として認識され得る。すなわち、当該tRNAにおける改変前のN₁がシチジンであった場合、当該シチジンはTiaSによってアグマチジンに改変され得る。あるtRNAのN₁におけるシチジンがTiaSによってアグマチジンに改変され得るか否かは、例えば遺伝子組み換え手法によりTiaSを調製し、または生物学的材料からTiaSを抽出し、それをN₁がシチジンであるtRNAと適切な条件下で反応させた後、反応産物中におけるアグマチジンを検出することで確認することができる（例えば、Ikeuchi et al., Nat Chem Biol (2010) 6(4): 277-282などを参照のこと）。あるいは、TiaS を内在的に発現する細胞に、またはTiaSを遺伝子組み換え手法により発現させた細胞に、N₁がシチジンであるtRNAを導入して、細胞内のTiaSと適切な条件下で反応させた後、当該tRNAに含まれるアグマチジンを検出することでも確認することができる。本開示の一態様において、tRNAにおける改変前のN₁がシチジンであった場合、当該シチジンからアグマチジンへの改変がTiaSによって触媒され得る。

　一方、後者の場合（アグマチジンがTiaSを介さずに合成されたものである場合）、本開示のtRNAは、TiaSによって基質として認識され得ない。すなわち、当該tRNAにおける改変前のN₁がシチジンであったとしても、当該シチジンはTiaSによってアグマチジンに改変され得ない。その場合、アグマチジンおよびそれを含むtRNAは、TiaSを用いない方法（例えば、化学的な合成法）によって合成することができる。本開示の一態様において、tRNAにおける改変前のN₁がシチジンであった場合、当該シチジンからアグマチジンへの改変がTiaSでは触媒され得ない。シチジンからアグマチジンへの改変がTiaSでは触媒され得ない状態とは、例えば、TiaS が天然の基質であるtRNA Ile2のシチジンをアグマチジンに改変する活性を1とした場合、TiaSが対象tRNAのシチジンをアグマチジンに改変する活性がそれより10倍以上、20倍以上、40倍以上、100倍以上、200倍以上、あるいは400倍以上低下している状態として表現することができる。TiaSによる触媒活性が低下している場合、結果的にN₁がシチジンのままの未改変tRNAを多く含むような低純度の目的物しか得られないため、TiaSを用いた方法でアグマチジンを合成するよりも、TiaSを用いない方法（例えば、化学的な合成法）でアグマチジンを合成する方が有利であると考えられる。特定の態様において、TiaSは古細菌由来のTiaSである。さらなる態様において、TiaSは配列番号：５２のアミノ酸配列を有する古細菌Methanosarcina acetivorans由来の野生型のTiaSである。

　また、TiaSは、tRNA Ile2における一部のヌクレオシドが他のヌクレオシドに改変された後のtRNAに対しても、ある程度のアグマチジン合成能を維持していることが報告されている（Osawa et al., Nat Struct Mol Biol (2011) 18: 1275-1280）。

　いくつかの態様において、本開示の変異tRNAは、開始tRNAまたは伸長tRNAである。開始tRNAまたは伸長tRNAを改変することによって変異tRNAを作製してもよいし、改変により作製された変異tRNAが開始tRNAまたは伸長tRNAとしての機能を有していてもよい。あるtRNAが開始tRNAとしての機能を有しているか否かは、当該tRNAを翻訳系で用いた場合に、(i) IF2を介してリボソームに導入され、なおかつ(ii) 当該tRNAに結合しているアミノ酸を開始アミノ酸として用いて、ペプチド翻訳を開始させることができるか否かによって判断することができる。また、あるtRNAが伸長tRNAとしての機能を有しているか否かは、当該tRNAを翻訳系で用いた場合に、(i) EF-Tuを介してリボソームに導入され、なおかつ(ii) 当該tRNAに結合しているアミノ酸をペプチド鎖に取り込ませて、ペプチド鎖を伸長させることができるか否かによって判断することができる。

　いくつかの態様において、本開示の変異tRNAは、原核生物由来のtRNAまたは真核生物由来のtRNAである。原核生物由来のtRNAまたは真核生物由来のtRNAを改変することによって変異tRNAを作製してもよいし、改変により作製された変異tRNAが、原核生物由来のtRNAまたは真核生物由来のtRNAと最も高い核酸配列同一性を有していてもよい。真核生物はさらに動物、植物、菌類および原生生物に分類される。本開示の変異tRNAは、例えばヒト由来のtRNAであってもよい。原核生物は、さらに真正細菌と古細菌に分類される。真正細菌としては、例えば大腸菌、枯草菌、乳酸菌、またはDesulfitobacterium hafnienseなどを挙げることができる。古細菌としては、例えば高度好塩菌、好熱菌、またはメタン菌（例えばMethanosarcina mazei, Methanosarcina barkeri, Methanocaldococcus jannaschii）などを挙げることができる。本開示の変異tRNAは、例えば大腸菌やDesulfitobacterium hafniense、Methanosarcina mazei由来のtRNAであってもよい。

　いくつかの態様において、本開示の変異tRNAは、M₁M₂Aで表されるコドンを翻訳することができる。ここで、コドンの1文字目のヌクレオシド（M₁）および2文字目のヌクレオシド（M₂）は、それぞれ独立にアデノシン（A）、グアノシン（G）、シチジン（C）、ウリジン（U）のいずれかから選択され、なおかつ3文字目のヌクレオシドはアデノシンである。別の態様において、本開示の変異tRNAは、M₁M₂Aで表される特定のコドンに相補的なアンチコドンを有する。特定の態様において、本開示の変異tRNAは、k2CN₂N₃またはagm2CN₂N₃で表されるアンチコドンを有する。ここで、アンチコドンの1文字目のヌクレオシドはライシジン（k2C）またはアグマチジン（agm2C）であり、なおかつ2文字目のヌクレオシド（N₂）および3文字目のヌクレオシド（N₃）はそれぞれ上述のM₂およびM₁に相補的なヌクレオシドである。ライシジンおよびアグマチジンは、いずれもアデノシンに相補的に結合するヌクレオシドとして知られている。さらなる態様において、N₂およびN₃は、それぞれ独立にアデノシン（A）、グアノシン（G）、シチジン（C）、ウリジン（U）のいずれかから選択され得る。具体的には、M₂（またはM₁）がアデノシンのとき、N₂（またはN₃）はウリジンである。M₂（またはM₁）がグアノシンのとき、N₂（またはN₃）はシチジンである。M₂（またはM₁）がシチジンのとき、N₂（またはN₃）はグアノシンである。M₂（またはM₁）がウリジンのとき、N₂（またはN₃）はアデノシンである。

　本開示の文脈において、「あるtRNAが特定のコドンを翻訳可能である」との態様は、「あるtRNAが特定のコドンに相補的なアンチコドンを有している」との態様を本質的に内包するものであり、当該tRNA上のアンチコドンの配列について言及する限りにおいて、これらの表現は置き換えが可能である。

　本開示の変異tRNAが翻訳可能なコドンの1文字目のヌクレオシド（M₁）および2文字目のヌクレオシド（M₂）は、遺伝暗号表における特定のコドンボックスを構成するコドンの1文字目のヌクレオシド（M₁）および2文字目のヌクレオシド（M₂）からそれぞれ選択することができる。特定の態様において、遺伝暗号表は標準遺伝暗号表である。別の態様において、遺伝暗号表は天然の遺伝暗号表である。

　一態様において、M₁およびM₂は、3文字目がAであるコドンとGであるコドンがともに同じアミノ酸をコードしているコドンボックスを構成するコドンのM₁およびM₂からそれぞれ選択され得る。一例として、コドンがUUNで表されるコドンボックスにおいては、3文字目がAであるコドン（UUA）とGであるコドン（UUG）がともに同じアミノ酸（Leu）をコードしているので、同コドンボックスを構成するコドンにおける1文字目のヌクレオシド（U）および2文字目のヌクレオシド（U）をそれぞれM₁およびM₂として選択することができる。

　一態様において、M₁およびM₂は、3文字目がUであるコドンとAであるコドンがともに同じアミノ酸をコードしているコドンボックスを構成するコドンのM₁およびM₂からそれぞれ選択され得る。一例として、コドンがAUNで表されるコドンボックスにおいては、3文字目がUであるコドン（AUU）とAであるコドン（AUA）がともに同じアミノ酸（Ile）をコードしているので、同コドンボックスを構成するコドンにおける1文字目のヌクレオシド（A）および2文字目のヌクレオシド（U）をそれぞれM₁およびM₂として選択することができる。

　一態様において、M₁およびM₂は、3文字目がUであるコドン、Cであるコドン、Aであるコドン、およびGであるコドンがいずれも同じアミノ酸をコードしているコドンボックスを構成するコドンのM₁およびM₂からそれぞれ選択され得る。一例として、コドンがUCNで表されるコドンボックスにおいては、3文字目がUであるコドン（UCU）、Cであるコドン（UCC）、Aであるコドン（UCA）、およびGであるコドン（UCG）がいずれも同じアミノ酸（Ser）をコードしているので、同コドンボックスを構成するコドンにおける1文字目のヌクレオシド（U）および2文字目のヌクレオシド（C）をそれぞれM₁およびM₂として選択することができる。

　一態様において、M₁およびM₂は、3文字目がAであるコドンとGであるコドンが互いに異なるアミノ酸をコードしているコドンボックスを構成するコドンのM₁およびM₂からそれぞれ選択され得る。一例として、コドンがAUNで表されるコドンボックスにおいては、3文字目がAであるコドン（AUA）とGであるコドン（AUG）が互いに異なるアミノ酸（IleとMet）をコードしているので、同コドンボックスを構成するコドンにおける1文字目のヌクレオシド（A）および2文字目のヌクレオシド（U）をそれぞれM₁およびM₂として選択することができる。

　一態様において、M₁およびM₂は、3文字目がAであるコドンおよび／またはGであるコドンが終止コドンであるコドンボックスを構成するコドンのM₁およびM₂からそれぞれ選択され得る。一例として、コドンがUGNで表されるコドンボックスにおいては、3文字目がAであるコドン（UGA）が終止コドン（オパール）であるので、同コドンボックスを構成するコドンにおける1文字目のヌクレオシド（U）および2文字目のヌクレオシド（G）をそれぞれM₁およびM₂として選択することができる。

　さらなる態様において、M₁およびM₂は、コドンがUUNで表されるコドンボックスを構成するコドンのM₁およびM₂からそれぞれ選択され得る。具体的には、当該コドンにおける1文字目のヌクレオシド（U）および2文字目のヌクレオシド（U）をそれぞれM₁およびM₂として選択することができる。

　さらなる態様において、M₁およびM₂は、コドンがUCNで表されるコドンボックスを構成するコドンのM₁およびM₂からそれぞれ選択され得る。具体的には、当該コドンにおける1文字目のヌクレオシド（U）および2文字目のヌクレオシド（C）をそれぞれM₁およびM₂として選択することができる。

　さらなる態様において、M₁およびM₂は、コドンがUANで表されるコドンボックスを構成するコドンのM₁およびM₂からそれぞれ選択され得る。具体的には、当該コドンにおける1文字目のヌクレオシド（U）および2文字目のヌクレオシド（A）をそれぞれM₁およびM₂として選択することができる。

　さらなる態様において、M₁およびM₂は、コドンがUGNで表されるコドンボックスを構成するコドンのM₁およびM₂からそれぞれ選択され得る。具体的には、当該コドンにおける1文字目のヌクレオシド（U）および2文字目のヌクレオシド（G）をそれぞれM₁およびM₂として選択することができる。

　さらなる態様において、M₁およびM₂は、コドンがCUNで表されるコドンボックスを構成するコドンのM₁およびM₂からそれぞれ選択され得る。具体的には、当該コドンにおける1文字目のヌクレオシド（C）および2文字目のヌクレオシド（U）をそれぞれM₁およびM₂として選択することができる。

　さらなる態様において、M₁およびM₂は、コドンがCCNで表されるコドンボックスを構成するコドンのM₁およびM₂からそれぞれ選択され得る。具体的には、当該コドンにおける1文字目のヌクレオシド（C）および2文字目のヌクレオシド（C）をそれぞれM₁およびM₂として選択することができる。

　さらなる態様において、M₁およびM₂は、コドンがCANで表されるコドンボックスを構成するコドンのM₁およびM₂からそれぞれ選択され得る。具体的には、当該コドンにおける1文字目のヌクレオシド（C）および2文字目のヌクレオシド（A）をそれぞれM₁およびM₂として選択することができる。

　さらなる態様において、M₁およびM₂は、コドンがCGNで表されるコドンボックスを構成するコドンのM₁およびM₂からそれぞれ選択され得る。具体的には、当該コドンにおける1文字目のヌクレオシド（C）および2文字目のヌクレオシド（G）をそれぞれM₁およびM₂として選択することができる。

　さらなる態様において、M₁およびM₂は、コドンがAUNで表されるコドンボックスを構成するコドンのM₁およびM₂からそれぞれ選択され得る。具体的には、当該コドンにおける1文字目のヌクレオシド（A）および2文字目のヌクレオシド（U）をそれぞれM₁およびM₂として選択することができる。

　さらなる態様において、M₁およびM₂は、コドンがACNで表されるコドンボックスを構成するコドンのM₁およびM₂からそれぞれ選択され得る。具体的には、当該コドンにおける1文字目のヌクレオシド（A）および2文字目のヌクレオシド（C）をそれぞれM₁およびM₂として選択することができる。

　さらなる態様において、M₁およびM₂は、コドンがAANで表されるコドンボックスを構成するコドンのM₁およびM₂からそれぞれ選択され得る。具体的には、当該コドンにおける1文字目のヌクレオシド（A）および2文字目のヌクレオシド（A）をそれぞれM₁およびM₂として選択することができる。

　さらなる態様において、M₁およびM₂は、コドンがAGNで表されるコドンボックスを構成するコドンのM₁およびM₂からそれぞれ選択され得る。具体的には、当該コドンにおける1文字目のヌクレオシド（A）および2文字目のヌクレオシド（G）をそれぞれM₁およびM₂として選択することができる。

　さらなる態様において、M₁およびM₂は、コドンがGUNで表されるコドンボックスを構成するコドンのM₁およびM₂からそれぞれ選択され得る。具体的には、当該コドンにおける1文字目のヌクレオシド（G）および2文字目のヌクレオシド（U）をそれぞれM₁およびM₂として選択することができる。

　さらなる態様において、M₁およびM₂は、コドンがGCNで表されるコドンボックスを構成するコドンのM₁およびM₂からそれぞれ選択され得る。具体的には、当該コドンにおける1文字目のヌクレオシド（G）および2文字目のヌクレオシド（C）をそれぞれM₁およびM₂として選択することができる。

　さらなる態様において、M₁およびM₂は、コドンがGANで表されるコドンボックスを構成するコドンのM₁およびM₂からそれぞれ選択され得る。具体的には、当該コドンにおける1文字目のヌクレオシド（G）および2文字目のヌクレオシド（A）をそれぞれM₁およびM₂として選択することができる。

　さらなる態様において、M₁およびM₂は、コドンがGGNで表されるコドンボックスを構成するコドンのM₁およびM₂からそれぞれ選択され得る。具体的には、当該コドンにおける1文字目のヌクレオシド（G）および2文字目のヌクレオシド（G）をそれぞれM₁およびM₂として選択することができる。

　本開示の変異tRNAにおけるアンチコドンの3文字目のヌクレオシド（N₃）および2文字目のヌクレオシド（N₂）は、M₁およびM₂とそれぞれ相補的なヌクレオシドとして選択することができる。

　一態様において、N₃およびN₂は、コドンがUUNで表されるコドンボックスを構成するコドンにおける1文字目のヌクレオシド（U）および2文字目のヌクレオシド（U）とそれぞれ相補的なヌクレオシドとして選択され得る。具体的には、N₃としてAを、N₂としてAをそれぞれ選択することができる。

　一態様において、N₃およびN₂は、コドンがUCNで表されるコドンボックスを構成するコドンにおける1文字目のヌクレオシド（U）および2文字目のヌクレオシド（C）とそれぞれ相補的なヌクレオシドとして選択され得る。具体的には、N₃としてAを、N₂としてGをそれぞれ選択することができる。

　一態様において、N₃およびN₂は、コドンがUANで表されるコドンボックスを構成するコドンにおける1文字目のヌクレオシド（U）および2文字目のヌクレオシド（A）とそれぞれ相補的なヌクレオシドとして選択され得る。具体的には、N₃としてAを、N₂としてUをそれぞれ選択することができる。

　一態様において、N₃およびN₂は、コドンがUGNで表されるコドンボックスを構成するコドンにおける1文字目のヌクレオシド（U）および2文字目のヌクレオシド（G）とそれぞれ相補的なヌクレオシドとして選択され得る。具体的には、N₃としてAを、N₂としてCをそれぞれ選択することができる。

　一態様において、N₃およびN₂は、コドンがCUNで表されるコドンボックスを構成するコドンにおける1文字目のヌクレオシド（C）および2文字目のヌクレオシド（U）とそれぞれ相補的なヌクレオシドとして選択され得る。具体的には、N₃としてGを、N₂としてAをそれぞれ選択することができる。

　一態様において、N₃およびN₂は、コドンがCCNで表されるコドンボックスを構成するコドンにおける1文字目のヌクレオシド（C）および2文字目のヌクレオシド（C）とそれぞれ相補的なヌクレオシドとして選択され得る。具体的には、N₃としてGを、N₂としてGをそれぞれ選択することができる。

　一態様において、N₃およびN₂は、コドンがCANで表されるコドンボックスを構成するコドンにおける1文字目のヌクレオシド（C）および2文字目のヌクレオシド（A）とそれぞれ相補的なヌクレオシドとして選択され得る。具体的には、N₃としてGを、N₂としてUをそれぞれ選択することができる。

　一態様において、N₃およびN₂は、コドンがCGNで表されるコドンボックスを構成するコドンにおける1文字目のヌクレオシド（C）および2文字目のヌクレオシド（G）とそれぞれ相補的なヌクレオシドとして選択され得る。具体的には、N₃としてGを、N₂としてCをそれぞれ選択することができる。

　一態様において、N₃およびN₂は、コドンがAUNで表されるコドンボックスを構成するコドンにおける1文字目のヌクレオシド（A）および2文字目のヌクレオシド（U）とそれぞれ相補的なヌクレオシドとして選択され得る。具体的には、N₃としてUを、N₂としてAをそれぞれ選択することができる。

　一態様において、N₃およびN₂は、コドンがACNで表されるコドンボックスを構成するコドンにおける1文字目のヌクレオシド（A）および2文字目のヌクレオシド（C）とそれぞれ相補的なヌクレオシドとして選択され得る。具体的には、N₃としてUを、N₂としてGをそれぞれ選択することができる。

　一態様において、N₃およびN₂は、コドンがAANで表されるコドンボックスを構成するコドンにおける1文字目のヌクレオシド（A）および2文字目のヌクレオシド（A）とそれぞれ相補的なヌクレオシドとして選択され得る。具体的には、N₃としてUを、N₂としてUをそれぞれ選択することができる。

　一態様において、N₃およびN₂は、コドンがAGNで表されるコドンボックスを構成するコドンにおける1文字目のヌクレオシド（A）および2文字目のヌクレオシド（G）とそれぞれ相補的なヌクレオシドとして選択され得る。具体的には、N₃としてUを、N₂としてCをそれぞれ選択することができる。

　一態様において、N₃およびN₂は、コドンがGUNで表されるコドンボックスを構成するコドンにおける1文字目のヌクレオシド（G）および2文字目のヌクレオシド（U）とそれぞれ相補的なヌクレオシドとして選択され得る。具体的には、N₃としてCを、N₂としてAをそれぞれ選択することができる。

　一態様において、N₃およびN₂は、コドンがGCNで表されるコドンボックスを構成するコドンにおける1文字目のヌクレオシド（G）および2文字目のヌクレオシド（C）とそれぞれ相補的なヌクレオシドとして選択され得る。具体的には、N₃としてCを、N₂としてGをそれぞれ選択することができる。

　一態様において、N₃およびN₂は、コドンがGANで表されるコドンボックスを構成するコドンにおける1文字目のヌクレオシド（G）および2文字目のヌクレオシド（A）とそれぞれ相補的なヌクレオシドとして選択され得る。具体的には、N₃としてCを、N₂としてUをそれぞれ選択することができる。

　一態様において、N₃およびN₂は、コドンがGGNで表されるコドンボックスを構成するコドンにおける1文字目のヌクレオシド（G）および2文字目のヌクレオシド（G）とそれぞれ相補的なヌクレオシドとして選択され得る。具体的には、N₃としてCを、N₂としてCをそれぞれ選択することができる。

　いくつかの態様において、本開示の変異tRNAにはアミノ酸またはアミノ酸類縁体が結合している。アミノ酸またはアミノ酸類縁体は、通常、tRNAの3’末端に、より具体的には、3’末端のCCA配列のアデノシン残基に結合している。変異tRNAに結合しているアミノ酸またはアミノ酸類縁体の具体的な種類は、以下の記載のアミノ酸またはアミノ酸類縁体の中からそれぞれ適宜選択することができる、

　本開示におけるアミノ酸には、α－アミノ酸、β－アミノ酸、γ－アミノ酸などが含まれる。立体構造としては、L型アミノ酸、D型アミノ酸のいずれも含まれる。また、本開示におけるアミノ酸は、天然アミノ酸および非天然アミノ酸を含む。特定の態様において、天然アミノ酸は、以下の20種類のα－アミノ酸：グリシン（Gly）、アラニン（Ala）、セリン（Ser）、トレオニン（Thr）、バリン（Val）、ロイシン（Leu）、イソロイシン（Ile）、フェニルアラニン（Phe）、チロシン（Tyr）、トリプトファン（Trp）、ヒスチジン（His）、グルタミン酸（Glu）、アスパラギン酸（Asp）、グルタミン（Gln）、アスパラギン（Asn）、システイン（Cys）、メチオニン（Met）、リジン（Lys）、アルギニン（Arg）、およびプロリン（Pro）からなる。あるいは、上述の20種類のアミノ酸から、任意の1種類以上のアミノ酸を除いたものを、本開示における天然アミノ酸としてもよい。一態様において、天然アミノ酸は、イソロイシンを除く19種類のアミノ酸からなる。一態様において、天然アミノ酸は、メチオニンを除く19種類のアミノ酸からなる。さらなる態様において、天然アミノ酸は、イソロイシンおよびメチオニンを除く18種類のアミノ酸からなる。天然アミノ酸は通常、L型アミノ酸である。

　本開示において、非天然アミノ酸とは、上記の20種類のα－アミノ酸からなる天然アミノ酸を除く全てのアミノ酸を表す。非天然アミノ酸の例として、β－アミノ酸、γ－アミノ酸、Ｄ型アミノ酸、天然アミノ酸とは側鎖が異なるα－アミノ酸、α，α－二置換アミノ酸、主鎖のアミノ基が置換基を有するアミノ酸（Ｎ置換アミノ酸）などを挙げることができる。非天然アミノ酸の側鎖は、特に限定されないが、水素原子の他に、例えばアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、シクロアルキルなどを有していてもよい。また、α，α－二置換アミノ酸の場合、２つの側鎖が環を形成していてもよい。さらに、これらの側鎖は、１つ以上の置換基を有していてもよい。特定の態様において、置換基は、ハロゲン原子、Ｏ原子、Ｓ原子、Ｎ原子、Ｂ原子、Ｓｉ原子、またはＰ原子を含む任意の官能基の中から選択することができる。例えば、本開示において「ハロゲンを置換基に有するＣ_１－Ｃ_６アルキル」とは、アルキルにおける少なくとも一つの水素原子がハロゲン原子で置換された「Ｃ_１－Ｃ_６アルキル」を意味し、具体的には、例えば、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル、フルオロメチル、ペンタフルオロエチル、テトラフルオロエチル、トリフルオロエチル、ジフルオロエチル、フルオロエチル、トリクロロメチル、ジクロロメチル、クロロメチル、ペンタクロロエチル、テトラクロロエチル、トリクロロエチル、ジクロロエチル、クロロエチルなどを含む。また、例えば「置換基を有するＣ_５－Ｃ_１０アリールＣ_１－Ｃ_６アルキル」とは、アリールおよび／またはアルキルにおける少なくとも一つの水素原子が置換基により置換された「Ｃ_５－Ｃ_１０アリールＣ_１－Ｃ_６アルキル」を意味する。さらに、「置換基を２つ以上有している」とは、ある官能基（例えばＳ原子を含む官能基）を置換基として有し、さらにその官能基が別の置換基（例えばアミノやハロゲンなどの置換基）を有していることも含む。非天然アミノ酸の具体的な例としては、WO2013/100132やWO2018/143145なども参照することができる。

　非天然アミノ酸の主鎖のアミノ基は、非置換のアミノ基（ＮＨ_２基）でもよく、置換されたアミノ基（ＮＨＲ基）であってもよい。ここで、Ｒは、置換基を有していてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、シクロアルキルを示す。また、プロリンのように主鎖のアミノ基のＮ原子に結合した炭素鎖とα位の炭素原子とが環を形成していてもよい。置換基は、ハロゲン原子、Ｏ原子、Ｓ原子、Ｎ原子、Ｂ原子、Ｓｉ原子、またはＰ原子を含む任意の官能基の中から選択することができる。アミノ基のアルキル置換の例としては、Ｎ－メチル化、Ｎ－エチル化、Ｎ－プロピル化、Ｎ－ブチル化などが、アラルキル置換の例としては、Ｎ－ベンジル化などが挙げられる。Ｎ－メチルアミノ酸の具体的な例としては、Ｎ－メチルアラニン、Ｎ－メチルグリシン、Ｎ－メチルフェニルアラニン、Ｎ－メチルチロシン、Ｎ－メチル－３－クロロフェニルアラニン、Ｎ－メチル－４－クロロフェニルアラニン、Ｎ－メチル－４－メトキシフェニルアラニン、Ｎ－メチル－４－チアゾールアラニン、Ｎ－メチルヒスチジン、Ｎ－メチルセリン、Ｎ－メチルアスパラギン酸などを挙げることができる。

　ハロゲン原子を含む置換基の例としては、フルオロ（－Ｆ）、クロロ（－Ｃｌ）、ブロモ（－Ｂｒ）、ヨード（－Ｉ）などが挙げられる。

　Ｏ原子を含む置換基の例としては、ヒドロキシル（－ＯＨ）、オキシ（－ＯＲ）、カルボニル（－Ｃ＝Ｏ－Ｒ）、カルボキシル（－ＣＯ_２Ｈ）、オキシカルボニル（－Ｃ＝Ｏ－ＯＲ）、カルボニルオキシ（－Ｏ－Ｃ＝Ｏ－Ｒ）、チオカルボニル（－Ｃ＝Ｏ－ＳＲ）、カルボニルチオ（－Ｓ－Ｃ＝Ｏ－Ｒ）、アミノカルボニル（－Ｃ＝Ｏ－ＮＨＲ）、カルボニルアミノ（－ＮＨ－Ｃ＝Ｏ－Ｒ）、オキシカルボニルアミノ（－ＮＨ－Ｃ＝Ｏ－ＯＲ）、スルホニルアミノ（－ＮＨ－ＳＯ_２－Ｒ）、アミノスルホニル（－ＳＯ_２－ＮＨＲ）、スルファモイルアミノ（－ＮＨ－ＳＯ_２－ＮＨＲ）、チオカルボキシル（－Ｃ（＝Ｏ）－ＳＨ）、カルボキシルカルボニル（－Ｃ（＝Ｏ）－ＣＯ_２Ｈ）などが挙げられる。

　オキシ（－ＯＲ）の例としては、アルコキシ、シクロアルコキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アラルキルオキシなどが挙げられる。

　カルボニル（－Ｃ＝Ｏ－Ｒ）の例としては、ホルミル（－Ｃ＝Ｏ－Ｈ）、アルキルカルボニル、シクロアルキルカルボニル、アルケニルカルボニル、アルキニルカルボニル、アリールカルボニル、ヘテロアリールカルボニル、アラルキルカルボニルなどが挙げられる。

　オキシカルボニル（－Ｃ＝Ｏ－ＯＲ）の例としては、アルキルオキシカルボニル、シクロアルキルオキシカルボニル、アルケニルオキシカルボニル、アルキニルオキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシカルボニル、アラルキルオキシカルボニルなどが挙げられる。

　カルボニルオキシ（－Ｏ－Ｃ＝Ｏ－Ｒ）の例としては、アルキルカルボニルオキシ、シクロアルキルカルボニルオキシ、アルケニルカルボニルオキシ、アルキニルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、ヘテロアリールカルボニルオキシ、アラルキルカルボニルオキシなどが挙げられる。

　チオカルボニル（－Ｃ＝Ｏ－ＳＲ）の例としては、アルキルチオカルボニル、シクロアルキルチオカルボニル、アルケニルチオカルボニル、アルキニルチオカルボニル、アリールチオカルボニル、ヘテロアリールチオカルボニル、アラルキルチオカルボニルなどが挙げられる。

　カルボニルチオ（－Ｓ－Ｃ＝Ｏ－Ｒ）の例としては、アルキルカルボニルチオ、シクロアルキルカルボニルチオ、アルケニルカルボニルチオ、アルキニルカルボニルチオ、アリールカルボニルチオ、ヘテロアリールカルボニルチオ、アラルキルカルボニルチオなどが挙げられる。

　アミノカルボニル（－Ｃ＝Ｏ－ＮＨＲ）の例としては、アルキルアミノカルボニル、シクロアルキルアミノカルボニル、アルケニルアミノカルボニル、アルキニルアミノカルボニル、アリールアミノカルボニル、ヘテロアリールアミノカルボニル、アラルキルアミノカルボニルなどが挙げられる。さらに、－Ｃ＝Ｏ－ＮＨＲ中のＮ原子と結合したＨ原子は、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、およびアラルキルからなる群より選択される置換基で置換されていてもよい。

　カルボニルアミノ（－ＮＨ－Ｃ＝Ｏ－Ｒ）の例としては、アルキルカルボニルアミノ、シクロアルキルカルボニルアミノ、アルケニルカルボニルアミノ、アルキニルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、ヘテロアリールカルボニルアミノ、アラルキルカルボニルアミノなどが挙げられる。さらに、－ＮＨ－Ｃ＝Ｏ－Ｒ中のＮ原子と結合したＨ原子は、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、およびアラルキルからなる群より選択される置換基で置換されていてもよい。

　オキシカルボニルアミノ（－ＮＨ－Ｃ＝Ｏ－ＯＲ）の例としては、アルコキシカルボニルアミノ、シクロアルコキシカルボニルアミノ、アルケニルオキシカルボニルアミノ、アルキニルオキシカルボニルアミノ、アリールオキシカルボニルアミノ、ヘテロアリールオキシカルボニルアミノ、アラルキルオキシカルボニルアミノなどが挙げられる。さらに、－ＮＨ－Ｃ＝Ｏ－ＯＲ中のＮ原子と結合したＨ原子は、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、およびアラルキルからなる群より選択される置換基で置換されていてもよい。

　スルホニルアミノ（－ＮＨ－ＳＯ_２－Ｒ）の例としては、アルキルスルホニルアミノ、シクロアルキルスルホニルアミノ、アルケニルスルホニルアミノ、アルキニルスルホニルアミノ、アリールスルホニルアミノ、ヘテロアリールスルホニルアミノ、アラルキルスルホニルアミノなどが挙げられる。さらに、－ＮＨ－ＳＯ_２－Ｒ中のＮ原子と結合したＨ原子は、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、およびアラルキルからなる群より選択される置換基で置換されていてもよい。

　アミノスルホニル（－ＳＯ_２－ＮＨＲ）の例としては、アルキルアミノスルホニル、シクロアルキルアミノスルホニル、アルケニルアミノスルホニル、アルキニルアミノスルホニル、アリールアミノスルホニル、ヘテロアリールアミノスルホニル、アラルキルアミノスルホニルなどが挙げられる。さらに、－ＳＯ_２－ＮＨＲ中のＮ原子と結合したＨ原子は、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、およびアラルキルからなる群より選択される置換基で置換されていてもよい。

　スルファモイルアミノ（－ＮＨ－ＳＯ_２－ＮＨＲ）の例としては、アルキルスルファモイルアミノ、シクロアルキルスルファモイルアミノ、アルケニルスルファモイルアミノ、アルキニルスルファモイルアミノ、アリールスルファモイルアミノ、ヘテロアリールスルファモイルアミノ、アラルキルスルファモイルアミノなどが挙げられる。さらに、－ＮＨ－ＳＯ_２－ＮＨＲ中のＮ原子と結合した２つのＨ原子のうちの少なくとも１つは、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、およびアラルキルからなる群より選択される置換基で置換されていてもよい。２つのＨ原子がともに置換されている場合は、それぞれ独立して置換基を選択してもよく、また、これらの２つの置換基は環を形成していてもよい。

　Ｓ原子を含む置換基の例としては、チオール（－ＳＨ）、チオ（－Ｓ－Ｒ）、スルフィニル（－Ｓ＝Ｏ－Ｒ）、スルホニル（－Ｓ（Ｏ）_２－Ｒ）、スルホ（－ＳＯ_３Ｈ）などが挙げられる。

　チオ（－Ｓ－Ｒ）の例としては、アルキルチオ、シクロアルキルチオ、アルケニルチオ、アルキニルチオ、アリールチオ、ヘテロアリールチオ、アラルキルチオなどが挙げられる。

　スルフィニル（－Ｓ＝Ｏ－Ｒ）の例としては、アルキルスルフィニル、シクロアルキルスルフィニル、アルケニルスルフィニル、アルキニルスルフィニル、アリールスルフィニル、ヘテロアリールスルフィニル、アラルキルスルフィニルなどが挙げられる。

　スルホニル（－Ｓ（Ｏ）_２－Ｒ）の例としては、アルキルスルホニル、シクロアルキルスルホニル、アルケニルスルホニル、アルキニルスルホニル、アリールスルホニル、ヘテロアリールスルホニル、アラルキルスルホニルなどが挙げられる。

　Ｎ原子を含む置換基の例としては、アジド（－Ｎ_３）、シアノ（－ＣＮ）、１級アミノ（－ＮＨ_２）、２級アミノ（－ＮＨ－Ｒ）、３級アミノ（－ＮＲ（Ｒ'））、アミジノ（－Ｃ（＝ＮＨ）－ＮＨ_２）、置換アミジノ（－Ｃ（＝ＮＲ）－ＮＲ'Ｒ''）、グアニジノ（－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）－ＮＨ_２）、置換グアニジノ（－ＮＲ－Ｃ（＝ＮＲ'''）－ＮＲ'Ｒ''）、アミノカルボニルアミノ（－ＮＲ－ＣＯ－ＮＲ'Ｒ''）などが挙げられる。

　２級アミノ（－ＮＨ－Ｒ）の例としては、アルキルアミノ、シクロアルキルアミノ、アルケニルアミノ、アルキニルアミノ、アリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、アラルキルアミノなどが挙げられる。

　３級アミノ（－ＮＲ（Ｒ'））におけるＮ原子上の２つの置換基ＲおよびＲ'は、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、およびアラルキルからなる群よりそれぞれ独立に選択することができる。３級アミノの例としては、例えばアルキル（アラルキル）アミノなどが挙げられる。これらの２つの置換基は環を形成していてもよい。

　置換アミジノ（－Ｃ（＝ＮＲ）－ＮＲ'Ｒ''）におけるＮ原子上の３つの置換基Ｒ、Ｒ'、およびＲ''は、水素原子、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、およびアラルキルからなる群よりそれぞれ独立に選択することができる。置換アミジノの例としては、例えばアルキル（アラルキル）（アリール）アミジノなどが挙げられる。これらの置換基は互いに環を形成していてもよい。

　置換グアニジノ（－ＮＲ－Ｃ（＝ＮＲ'''）－ＮＲ'Ｒ''）におけるＮ原子上の４つの置換基Ｒ、Ｒ'、Ｒ''、およびＲ'''は、水素原子、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、およびアラルキルからなる群よりそれぞれ独立に選択することができる。これらの置換基は互いに環を形成していてもよい。

　アミノカルボニルアミノ（－ＮＲ－ＣＯ－ＮＲ'Ｒ''）におけるＮ原子上の３つの置換基Ｒ、Ｒ'、およびＲ''は、水素原子、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、およびアラルキルからなる群よりそれぞれ独立に選択することができる。これらの置換基は互いに環を形成していてもよい。

　Ｂ原子を含む置換基の例としては、ボリル（－ＢＲ（Ｒ'））やジオキシボリル（－Ｂ（ＯＲ）（ＯＲ'））などが挙げられる。Ｂ原子上の２つの置換基ＲおよびＲ'は、水素原子、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、およびアラルキルからなる群よりそれぞれ独立に選択することができる。これらの置換基は互いに環を形成していてもよい。

　本開示におけるアミノ酸類縁体の例として、例えばヒドロキシカルボン酸（ヒドロキシ酸）を挙げることができる。ヒドロキシカルボン酸には、α－ヒドロキシカルボン酸、β－ヒドロキシカルボン酸、γ－ヒドロキシカルボン酸などが含まれる。ヒドロキシカルボン酸におけるα位の炭素には、アミノ酸と同様に、水素原子以外の側鎖が結合していてもよい。立体構造としては、L型およびD型のいずれも含まれ得る。側鎖の構造は、上述の天然アミノ酸または非天然アミノ酸の側鎖と同様に定義することができる。ヒドロキシカルボン酸の例として、ヒドロキシ酢酸、乳酸、フェニル乳酸などを挙げることができる。

　本開示におけるアミノ酸は、翻訳可能なアミノ酸であってもよく、アミノ酸類縁体は、翻訳可能なアミノ酸類縁体であってもよい。本明細書において「翻訳可能な」アミノ酸またはアミノ酸類縁体（まとめてアミノ酸等と呼ぶことがある）とは、翻訳合成により（例えば、本開示に記載の翻訳系を用いて）ペプチドに組み込むことが可能なアミノ酸等を意味する。あるアミノ酸等が翻訳可能か否かは、当該アミノ酸等を結合させたtRNAを用いた翻訳合成実験により確認することができる。翻訳合成実験には再構成の無細胞翻訳系を用いてもよい（例えば、WO2013100132を参照のこと）。

　本開示における非天然アミノ酸やアミノ酸類縁体は、従来公知の化学的な合成法や、後述の実施例に記載の合成法、それらに準ずる合成法によって調製することができる。

＜tRNAの調製＞
　tRNAは、例えば、所望のtRNA遺伝子をコードするDNAを用意し、その上流にT7、T3、あるいはSP6などの適切なプロモーターを配置して、当該DNAを鋳型に各プロモーターに適応したRNAポリメラーゼを用いて転写反応を行うことによって合成することができる。また、tRNAは生物学的材料からの精製によっても調製することができる。例えば、細胞などのtRNAを含む材料から抽出液を調製して、そこにtRNAの核酸配列に相補的な配列を含むプローブを添加することによってtRNAを回収することができる。この際、所望のtRNAを発現可能な発現ベクターを用意して、当該発現ベクターで形質転換した細胞を材料に調製を行うこともできる。in vitroの転写によって合成されたtRNAには、通常、4つの典型的なヌクレオシドであるアデノシン、グアノシン、シチジン、およびウリジンのみが含まれている。一方、細胞内で合成されたtRNAには、それらを修飾して得られた修飾ヌクレオシドなども含まれていることがある。天然tRNAにおける修飾ヌクレオシド（例えばライシジンなど）は、tRNAが転写により合成された後に、その修飾を行うための酵素（例えばTilSなど）の作用によって、当該tRNAに特異的に導入されると考えられている。あるいは、転写によって合成された断片もしくは、後述の実施例に記載のように、化学合成された断片等を酵素反応によって連結する手法によってもtRNAを調製することができる。

　アミノアシルtRNAも化学的および／または生物学的な合成法によって調製することができる。例えば、アミノアシルtRNA合成酵素（ARS）を用いて、tRNAにアミノ酸を結合させることによってアミノアシルtRNAを合成することができる。アミノ酸はARSの基質となり得るものであれば、天然アミノ酸であっても、非天然アミノ酸であってもよい。あるいは、天然アミノ酸をtRNAに結合させた後に、アミノ酸に化学的な修飾を加えてもよい。また、ARSにアミノ酸変異を導入することによって、非天然アミノ酸に対する作用が高められた例も多数報告されており（例えばWO2006/135096、WO2007/061136、WO2007/103307、WO2008/001947、WO2010/141851、WO2015/120287などを参照）、そのような変異ARSを用いて、tRNAにアミノ酸を結合させてもよい。ARSを用いる方法以外にも、例えば、tRNAの3’末端からCA配列を除去し、そこにアミノアシル化されたpdCpA（デオキシシチジンおよびアデノシンから構成されるジヌクレオチド）をRNAリガーゼを用いて結合させることによってアミノアシルtRNAを合成することができる（pdCpA法；Hecht et al., J Biol Chem (1978) 253: 4517-4520）。pdCpAの代わりにpCpA（シチジンおよびアデノシンから構成されるジヌクレオチド）を用いる方法も知られている（pCpA法；Wang et al., ACS Chem Biol (2015) 10: 2187-2192）。また、あらかじめエステル化により活性化した非天然型アミノ酸を人工RNA触媒（フレキシザイム）を用いてtRNAに結合させることによってもアミノアシルtRNAを合成することができる（WO2007/066627）。

＜翻訳系＞
　一局面において、本開示は、ペプチド翻訳に適した一揃いのtRNAを提供する。一揃いのtRNAには、複数の異なる種類のtRNAが含まれ、それらのtRNAから複数の異なる種類のアミノ酸を翻訳することができる。一局面において、本開示は、ペプチド翻訳に適した複数の異なる種類のtRNAを含む組成物を提供する。別の局面において、本開示は、ペプチド翻訳に適した複数の異なる種類のtRNAを提供することを含む、ペプチドの翻訳方法を提供する。一局面において、本開示は、ペプチド翻訳に適した複数の異なる種類のtRNAを含む翻訳系を提供する。特定の局面において、前記の複数の異なる種類のtRNAの中に、本開示の変異tRNAが含まれる。以下の記載は、これらのペプチド翻訳に適したtRNA、組成物、翻訳方法、および翻訳系に関するものである。

　一態様において、本開示における変異tRNAは、アンチコドンの1文字目(N₁)にライシジン(k2C)、ライシジン誘導体、アグマチジン(agm2C)、またはアグマチジン誘導体のいずれかを有している。ライシジンやアグマチジンは、アデノシン(A)と相補的な塩基対を形成することから、コドンにおける役割はウリジン(U)に相当するものと考えられる。いくつかの態様において、本開示の変異tRNAは、他のコドンに比べて、M₁M₂Aで表されるコドンを選択的に翻訳することができる。他のコドンとは、M₁M₂Aで表されるコドンとは異なるコドン、例えばM₁M₂U、M₁M₂C、または M₁M₂Gで表されるコドンのいずれかであることができる。特定の態様において、本開示の変異tRNAは、M₁M₂U、M₁M₂C、および M₁M₂Gで表されるいずれのコドンと比べても、M₁M₂Aで表されるコドンを選択的に翻訳することができる。

　本開示の一態様において、ある変異tRNAが、M₁M₂Aのコドンを選択的に翻訳することができるとは、〔当該tRNAによるM₁M₂Aのコドンの翻訳量〕が、〔当該tRNAによる他のコドンの翻訳量〕よりも、例えば2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上、10倍以上、15倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、あるいは100倍以上多いことを意味する。一例として、ある変異tRNAがCUAで表されるコドンを選択的に翻訳することができるか否かは、〔当該tRNAによるCUAのコドンの翻訳量〕が〔当該tRNAによるCUGのコドンの翻訳量〕よりも、例えば2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上、10倍以上、15倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、あるいは100倍以上多いか否かによって判断することができる。

　ある特定のコドン（例えばM₁M₂A）が翻訳される量と、それ以外のコドン（例えばM₁M₂G）が翻訳される量とを比較する際には、例えば、あるペプチドをコードするmRNAであって、M₁M₂Aのコドンが含まれているmRNAと、M₁M₂AのコドンがM₁M₂Gのコドンに置き換えられている以外は全て前記mRNAと同じ核酸配列を有する別のmRNAを用意して、同じ条件下でそれらの２つのmRNAを翻訳し、その結果得られた２つのペプチドの合成量を比較することによって行うことができる。

　本開示の別の態様において、ある変異tRNAが、M₁M₂Aのコドンを選択的に翻訳することができるとは、〔当該tRNAによるM₁M₂A以外のコドンの翻訳量〕が、〔UN₂N₃のアンチコドンを有するtRNAによるM₁M₂A以外のコドンの翻訳量〕よりも少ない、例えば1/2以下、1/3以下、1/4以下、1/5以下、1/6以下、1/7以下、1/8以下、1/9以下、1/10以下、1/15以下、1/20以下、1/30以下、1/40以下、1/50以下、1/60以下、1/70以下、1/80以下、1/90以下、あるいは1/100以下に低下していることを意味する。ここで、UN₂N₃のアンチコドンとは、アンチコドンの1文字目（N₁）がウリジンで、アンチコドンの2文字目（N₂）および3文字目（N₃）がそれぞれM₂およびM₁と相補的なヌクレオシドを表す。アンチコドンにおけるライシジンやアグマチジンの役割はウリジンに相当することから、ここではウリジンが比較の対象として選択されている。また、M₁M₂A以外のコドンとは、M₁M₂U、M₁M₂C、またはM₁M₂Gで表されるコドンのいずれかであることができる。一例として、ある変異tRNAがCUAで表されるコドンを選択的に翻訳することができるか否かは、〔当該tRNAによるCUGのコドンの翻訳量〕が、〔UN₂N₃のアンチコドンを有するtRNAによるCUGのコドンの翻訳量〕よりも少ない、例えば1/2以下、1/3以下、1/4以下、1/5以下、1/6以下、1/7以下、1/8以下、1/9以下、1/10以下、1/15以下、1/20以下、1/30以下、1/40以下、1/50以下、1/60以下、1/70以下、1/80以下、1/90以下、あるいは1/100以下に低下しているか否かによって判断することができる。

　別の態様において、M₁M₂Aで表されるコドンは、他のtRNAよりも、本開示の変異tRNAによって選択的に翻訳され得る。他のtRNAとは、M₁M₂Aで表されるコドンとは異なるコドンを翻訳し得るtRNA、例えばM₁M₂U、M₁M₂C、またはM₁M₂Gのいずれかのコドンを翻訳し得るtRNAであることができる。特定の態様において、M₁M₂Aで表されるコドンは、M₁M₂Uのコドンを翻訳し得るtRNA、M₁M₂Cのコドンを翻訳し得るtRNA、およびM₁M₂Gのコドンを翻訳し得るtRNAのいずれのtRNAよりも、本開示の変異tRNAによって選択的に翻訳され得る。

　本開示の一態様において、M₁M₂Aで表されるコドンが、ある変異tRNAによって選択的に翻訳され得るとは、〔当該tRNAによるM₁M₂Aのコドンの翻訳量〕が、〔他のtRNAによるM₁M₂Aのコドンの翻訳量〕よりも、例えば2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上、10倍以上、15倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、あるいは100倍以上多いことを意味する。一例として、CUAで表されるコドンが、ある変異tRNAによって選択的に翻訳され得るか否かは、〔当該tRNAによるCUAのコドンの翻訳量〕が〔CUGのコドンを翻訳し得るtRNA（例えばCAGのアンチコドンを有するtRNA）によるCUAのコドンの翻訳量〕よりも、例えば2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上、10倍以上、15倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、あるいは100倍以上多いか否かによって判断することができる。

　本開示の変異tRNAを含む翻訳系は、前記の2つの特徴を併せ持っていてもよい。すなわち、特定の態様において、本開示の翻訳系においては、(i) 変異tRNAが、他のコドンに比べて、M₁M₂Aで表されるコドンを選択的に翻訳することができ、なおかつ、(ii) M₁M₂Aで表されるコドンが、他のtRNAよりも、本開示の変異tRNAによって選択的に翻訳され得る。このような関係が成立している場合、本開示の翻訳系においては、本開示の変異tRNAを用いたペプチド翻訳と、それ以外のtRNAを用いたペプチド翻訳とが、互いに相互作用を起こさない独立した関係、すなわち直交性を有する（オルソゴナルな）関係にあるということができる。天然に存在する生物の翻訳系においては、本来、コドンとアミノ酸との間に厳密な対応関係が確立されているため、直交性のない変異tRNAがそこに加わることによって、その対応関係が崩れ、翻訳系の機能に致命的な影響が出るおそれがある。よって、本開示の翻訳系において、本開示の変異tRNAとそれ以外のtRNAとの間に直交性が確立されていることは、重要な特徴の一つになり得る。

　一態様において、本開示における翻訳系は、M₁M₂Gで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA（以後、本tRNAを“tRNA-G”とも表記する）をさらに含む。いくつかの態様において、本開示における翻訳系は、(a) 本開示に記載の変異tRNA、および(b) 本開示に記載のtRNA-Gの少なくとも2つのtRNAを含む。特定の態様において、M₁M₂Gで表されるコドンに相補的なアンチコドンとしては、例えばCN₂N₃、ac4CN₂N₃、またはCmN₂N₃などが挙げられる。ここで、各アンチコドンの1文字目のヌクレオシドは、シチジン（C）、N4-アセチルシチジン（ac4C）、または2’-O-メチルシチジン（Cm）であり、なおかつ2文字目のヌクレオシド（N₂）および3文字目のヌクレオシド（N₃）はそれぞれ上述のM₂およびM₁に相補的なヌクレオシドである。本開示に記載の変異tRNAおよびtRNA-Gは、アンチコドン以外の核酸配列がともに同一であってもよいし、互いに異なっていてもよい。アンチコドン以外の核酸配列が同一である場合、これら2つのtRNAの物理化学的性質が互いに類似したものになり得るため、反応性がより均質で安定した翻訳系を構築できる可能性がある。

　いくつかの態様において、本開示におけるtRNA-Gは、他のコドンに比べて、M₁M₂Gで表されるコドンを選択的に翻訳することができる。他のコドンとは、M₁M₂Gで表されるコドンとは異なるコドン、例えばM₁M₂U、M₁M₂C、または M₁M₂Aで表されるコドンのいずれかであることができる。特定の態様において、本開示のtRNA-Gは、M₁M₂U、M₁M₂C、および M₁M₂Aで表されるいずれのコドンと比べても、M₁M₂Gで表されるコドンを選択的に翻訳することができる。

　本開示の一態様において、あるtRNAが、M₁M₂Gのコドンを選択的に翻訳することができるとは、〔当該tRNAによるM₁M₂Gのコドンの翻訳量〕が、〔当該tRNAによる他のコドンの翻訳量〕よりも、例えば2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上、10倍以上、15倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、あるいは100倍以上多いことを意味する。一例として、ある変異tRNAがCUGで表されるコドンを選択的に翻訳することができるか否かは、〔当該tRNAによるCUGのコドンの翻訳量〕が〔当該tRNAによるCUAのコドンの翻訳量〕よりも、例えば2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上、10倍以上、15倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、あるいは100倍以上多いか否かによって判断することができる。

　別の態様において、M₁M₂Gで表されるコドンは、他のtRNAよりも、本開示におけるtRNA-Gによって選択的に翻訳され得る。他のtRNAとは、M₁M₂Gで表されるコドンとは異なるコドンを翻訳し得るtRNA、例えばM₁M₂U、M₁M₂C、またはM₁M₂Aのいずれかのコドンを翻訳し得るtRNAであることができる。特定の態様において、M₁M₂Gで表されるコドンは、M₁M₂Uのコドンを翻訳し得るtRNA、M₁M₂Cのコドンを翻訳し得るtRNA、およびM₁M₂Aのコドンを翻訳し得るtRNAのいずれのtRNAよりも、本開示におけるtRNA-Gによって選択的に翻訳され得る。

　本開示の一態様において、M₁M₂Gで表されるコドンが、あるtRNAによって選択的に翻訳され得るとは、〔当該tRNAによるM₁M₂Gのコドンの翻訳量〕が、〔他のtRNAによるM₁M₂Gのコドンの翻訳量〕よりも、例えば2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上、10倍以上、15倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、あるいは100倍以上多いことを意味する。一例として、CUGで表されるコドンが、あるtRNAによって選択的に翻訳され得るか否かは、〔当該tRNAによるCUGのコドンの翻訳量〕が〔CUAのコドンを翻訳し得るtRNA（例えばk2CAGのアンチコドンを有するtRNA）によるCUGのコドンの翻訳量〕よりも、例えば2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上、10倍以上、15倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、あるいは100倍以上多いか否かによって判断することができる。

　本開示におけるtRNA-Gを含む翻訳系は、前記の2つの特徴を併せ持っていてもよい。すなわち、特定の態様において、本開示の翻訳系においては、(i) tRNA-Gが、他のコドンに比べて、M₁M₂Gで表されるコドンを選択的に翻訳することができ、なおかつ、(ii) M₁M₂Gで表されるコドンが、他のtRNAよりも、本開示のtRNA-Gによって選択的に翻訳され得る。このような関係が成立している場合、本開示の翻訳系においては、tRNA-Gを用いたペプチド翻訳と、それ以外のtRNAを用いたペプチド翻訳とが、互いに相互作用を起こさない独立した関係、すなわち直交性を有する（オルソゴナルな）関係にあるということができる。本開示の翻訳系において、tRNA-Gとそれ以外のtRNAとの間に直交性が確立されていることは、重要な特徴の一つになり得る。

　さらなる態様において、本開示における変異tRNAに結合しているアミノ酸（以後、本アミノ酸を“アミノ酸-A”とも表記する）と、tRNA-Gに結合しているアミノ酸（以後、本アミノ酸を“アミノ酸-G”とも表記する）とは、アミノ酸の種類が互いに異なっていてもよい。本開示における変異tRNAとtRNA-Gに関して、上述のようなオルソゴナルな関係が成立している場合、本翻訳系においては、M₁M₂Aのコドンとアミノ酸-A、およびM₁M₂Gのコドンとアミノ酸-Gはいずれも一対一の対応関係にある。すなわち、本開示の翻訳系においては、同じコドンボックス内に存在する(i) M₁M₂Aおよび(ii) M₁M₂Gの2つのコドンから、2種類の異なるアミノ酸を翻訳することが可能である。

　一態様において、本開示における翻訳系は、M₁M₂UまたはM₁M₂Cで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNA（以後、本tRNAを“tRNA-U/C”とも表記する）をさらに含む。いくつかの態様において、本開示における翻訳系は、(a) 本開示に記載の変異tRNA、(b) 本開示に記載のtRNA-G、および(c) 本開示に記載のtRNA-U/Cの少なくとも3つのtRNAを含む。特定の態様において、M₁M₂Uで表されるコドンに相補的なアンチコドンとしては、例えばAN₂N₃、GN₂N₃、QN₂N₃、またはGluQN₂N₃などが挙げられる。ここで、各アンチコドンの1文字目のヌクレオシドは、アデノシン（A）、グアノシン（G）、キューオシン（Q）、またはグルタミルキューオシン（GluQ）であり、なおかつ2文字目のヌクレオシド（N₂）および3文字目のヌクレオシド（N₃）はそれぞれ上述のM₂およびM₁に相補的なヌクレオシドである。別の態様において、M₁M₂Cで表されるコドンに相補的なアンチコドンとしては、例えばGN₂N₃、QN₂N₃、またはGluQN₂N₃などが挙げられる。M₁M₂UおよびM₁M₂Cのコドンに相補的なアンチコドンは、互いに重複するものが多いため、本開示においては、これら2つのコドンを1つのコドンとみなして扱うことも可能である。特定の態様において、M₁M₂UまたはM₁M₂Cで表されるコドンに相補的なアンチコドンとしては、AN₂N₃、GN₂N₃、QN₂N₃、またはGluQN₂N₃などが挙げられる。本開示に記載の変異tRNA、tRNA-G、およびtRNA-U/Cは、アンチコドン以外の核酸配列が全て同一であってもよいし、互いに異なっていてもよい。アンチコドン以外の核酸配列が同一である場合、これら3つのtRNAの物理化学的性質が互いに類似したものになり得るため、反応性がより均質で安定した翻訳系を構築できる可能性がある。

　いくつかの態様において、本開示におけるtRNA-U/Cは、他のコドンに比べて、M₁M₂UまたはM₁M₂Cで表されるコドンを選択的に翻訳することができる。他のコドンとは、M₁M₂UまたはM₁M₂Cで表されるコドンとは異なるコドン、例えばM₁M₂Aまたは M₁M₂Gで表されるコドンのいずれかであることができる。特定の態様において、本開示におけるtRNA-U/Cは、M₁M₂Aおよび M₁M₂Gで表されるいずれのコドンと比べても、M₁M₂UまたはM₁M₂Cで表されるコドンを選択的に翻訳することができる。

　本開示の一態様において、あるtRNAが、M₁M₂UまたはM₁M₂Cのコドンを選択的に翻訳することができるとは、〔当該tRNAによるM₁M₂UまたはM₁M₂Cのコドンの翻訳量〕が、〔当該tRNAによる他のコドンの翻訳量〕よりも、例えば2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上、10倍以上、15倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、あるいは100倍以上多いことを意味する。一例として、あるtRNAがCUUまたはCUCで表されるコドンを選択的に翻訳することができるか否かは、〔当該tRNAによるCUUまたはCUCのコドンの翻訳量〕が〔当該tRNAによるCUAのコドンの翻訳量〕よりも、例えば2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上、10倍以上、15倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、あるいは100倍以上多いか否かによって判断することができる。

　別の態様において、M₁M₂UまたはM₁M₂Cで表されるコドンは、他のtRNAよりも、本開示におけるtRNA-U/Cによって選択的に翻訳され得る。他のtRNAとは、M₁M₂UまたはM₁M₂Cで表されるコドンとは異なるコドンを翻訳し得るtRNA、例えばM₁M₂AまたはM₁M₂Gのいずれかのコドンを翻訳し得るtRNAであることができる。特定の態様において、M₁M₂UまたはM₁M₂Cで表されるコドンは、M₁M₂Aのコドンを翻訳し得るtRNAおよびM₁M₂Gのコドンを翻訳し得るtRNAのいずれのtRNAよりも、本開示におけるtRNA-U/Cによって選択的に翻訳され得る。

　本開示の一態様において、M₁M₂UまたはM₁M₂Cで表されるコドンが、あるtRNAによって選択的に翻訳され得るとは、〔当該tRNAによるM₁M₂UまたはM₁M₂Cのコドンの翻訳量〕が、〔他のtRNAによるM₁M₂UまたはM₁M₂Cのコドンの翻訳量〕よりも、例えば2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上、10倍以上、15倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、あるいは100倍以上多いことを意味する。一例として、CUUまたはCUCで表されるコドンが、あるtRNAによって選択的に翻訳され得るか否かは、〔当該tRNAによるCUUまたはCUCのコドンの翻訳量〕が〔CUAのコドンを翻訳し得るtRNA（例えばk2CAGのアンチコドンを有するtRNA）によるCUUまたはCUCのコドンの翻訳量〕よりも、例えば2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上、10倍以上、15倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、あるいは100倍以上多いか否かによって判断することができる。

　本開示におけるtRNA-U/Cを含む翻訳系は、前記の2つの特徴を併せ持っていてもよい。すなわち、特定の態様において、本開示の翻訳系においては、(i) tRNA-U/Cが、他のコドンに比べて、M₁M₂UまたはM₁M₂Cで表されるコドンを選択的に翻訳することができ、なおかつ、(ii) M₁M₂UまたはM₁M₂Cで表されるコドンが、他のtRNAよりも、本開示のtRNA-U/Cによって選択的に翻訳され得る。このような関係が成立している場合、本開示の翻訳系においては、tRNA-U/Cを用いたペプチド翻訳と、それ以外のtRNAを用いたペプチド翻訳とが、互いに相互作用を起こさない独立した関係、すなわち直交性を有する（オルソゴナルな）関係にあるということができる。本開示の翻訳系において、tRNA-U/Cとそれ以外のtRNAとの間に直交性が確立されていることは、重要な特徴の一つになり得る。

　さらなる態様において、本開示における変異tRNAに結合しているアミノ酸（“アミノ酸-A”）、tRNA-Gに結合しているアミノ酸（“アミノ酸-G”）、およびtRNA-U/Cに結合しているアミノ酸（以後、本アミノ酸を“アミノ酸-U/C”とも表記する）は、アミノ酸の種類がいずれも互いに異なっていてもよい。本開示における変異tRNA、tRNA-G、およびtRNA-U/Cに関して、上述のようなオルソゴナルな関係が成立している場合、本翻訳系においては、M₁M₂Aのコドンとアミノ酸-A、M₁M₂Gのコドンとアミノ酸-G、およびM₁M₂UまたはM₁M₂Cのコドンとアミノ酸-U/Cはいずれも一対一の対応関係にある。すなわち、本開示の翻訳系においては、同じコドンボックス内に存在する(i) M₁M₂A、(ii) M₁M₂G、および(iii) M₁M₂UまたはM₁M₂Cの3つのコドンから、3種類の異なるアミノ酸を翻訳することが可能である。あるいは、本開示の翻訳系においては、M₁M₂U、M₁M₂C、M₁M₂A、およびM₁M₂Gによって構成されるコドンボックスから、3種類の異なるアミノ酸を翻訳することが可能である。

　いくつかの態様において、本開示における変異tRNA、tRNA-G、およびtRNA-U/Cのうち、少なくとも一つに非天然アミノ酸が結合していてもよい。

　いくつかの態様において、遺伝暗号表における少なくとも１つのコドンボックスを構成するコドンに、本開示の変異tRNAが割り当てられていてもよい。さらなる態様において、遺伝暗号表における複数のコドンボックスを構成するコドンに、本開示の変異tRNAが割り当てられていてもよい。複数のコドンボックスとしては、例えば2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、または16個のコドンボックスであることができる。変異tRNAに加えて、tRNA-Gが同じコドンボックスを構成する他のコドン（変異tRNAが割り当てられるコドンとは異なるコドン）に割り当てられていてもよく、あるいは、さらにtRNA-U/Cが同じコドンボックスを構成する他のコドン（変異tRNAが割り当てられるコドンおよびtRNA-Gが割り当てられるコドンとは異なるコドン）に割り当てられていてもよい。それぞれのtRNAがどのコドンボックスを構成するコドンに割り当てられるかは、当該tRNAが有するアンチコドンの2文字目のヌクレオシド（N₂）および3文字目のヌクレオシド（N₃）によって決定される。異なるコドンボックスを構成するコドンに割り当てられるtRNAどうしであれば、互いに異なるN₂およびN₃を有している。また、異なるコドンボックスを構成するコドンに割り当てられるtRNAどうしは、アンチコドン以外の核酸配列が同一であってもよいし、互いに異なっていてもよい。アンチコドン以外の核酸配列が同一である場合、これらのtRNAの物理化学的性質が互いに類似したものになり得るため、反応性がより均質で安定した翻訳系を構築できる可能性がある。

　いくつかの態様において、本開示の翻訳系から、1種類、2種類、3種類、4種類、5種類、6種類、7種類、8種類、9種類、10種類、11種類、12種類、13種類、14種類、15種類、16種類、17種類、18種類、19種類、または20種類のアミノ酸を翻訳することができる。あるいは、本開示の変異tRNAを用いて、1つのコドンボックスにおけるM₁M₂AとM₁M₂Gのコドンの読み分けを行えば、20種類より多くのアミノ酸を翻訳することも可能である。さらなる態様において、本開示の翻訳系から、例えば21種類、22種類、23種類、24種類、25種類、26種類、27種類、28種類、29種類、30種類、31種類、32種類、33種類、34種類、35種類、36種類、37種類、38種類、39種類、40種類、41種類、42種類、43種類、44種類、45種類、46種類、47種類、または48種類のアミノ酸を翻訳することが可能である。

　いくつかの態様において、本開示の翻訳系は、無細胞翻訳系である。さらなる態様において、本開示の翻訳系は、再構成型の無細胞翻訳系である。無細胞翻訳系における細胞抽出液やペプチド翻訳に必要な因子（例えばリボソームなど）は、種々の生物材料に由来するものを利用することができる。そのような生物材料として、例えば、大腸菌、酵母、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球、HeLa細胞、あるいは昆虫細胞などを挙げることができる。

　一局面において、本開示は、ペプチドの製造方法であって、本開示に記載の翻訳系を用いて核酸を翻訳することを含む方法を提供する。2つ以上のアミノ酸がアミド結合によって結合した化合物が、本開示のペプチドに含まれ得る。また、アミノ酸の代わりにヒドロキシカルボン酸などのアミノ酸類縁体がエステル結合によって結合した化合物も、本開示のペプチドに含まれ得る。ペプチドに含まれるアミノ酸またはアミノ酸類縁体の数は2個以上であれば特に限定されないが、例えば2個以上、3個以上、4個以上、5個以上、6個以上、7個以上、8個以上、9個以上、10個以上、11個以上などが挙げられ、また、100個以下、80個以下、50個以下、30個以下、25個以下、20個以下、19個以下、18個以下、17個以下、16個以下、15個以下、14個以下、13個以下、12個以下などが挙げられる。あるいは、9個、10個、11個、12個の中から選択することもできる。

　一態様において、本開示のペプチドは、Ｎ置換アミノ酸を含んでいてもよく、ペプチドに含まれるＮ置換アミノ酸の数は、例えば2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個などであることができる。また、別の態様において、本開示のペプチドは、Ｎ置換されていないアミノ酸を含んでいてもよく、Ｎ置換されていないアミノ酸の数は、例えば1個、2個、3個、4個などであることができる。さらなる態様において、本開示のペプチドは、Ｎ置換アミノ酸とＮ置換されていないアミノ酸の両方を含んでいてもよい。

　いくつかの態様において、本開示のペプチドは、直鎖状のペプチドであってもよいし、環状部を有するペプチドであってもよい。環状部を有するペプチドとは、ペプチド鎖上に存在するあるアミノ酸またはアミノ酸類縁体の主鎖あるいは側鎖が、同じペプチド鎖上に存在する別のアミノ酸またはアミノ酸類縁体の主鎖あるいは側鎖と結合することによって、分子内に環状構造が形成されたペプチドを意味する。環状部を有するペプチドは、環状部のみから構成されていてもよいし、環状部と直鎖部をともに含んでいてもよい。環状部に含まれるアミノ酸またはアミノ酸類縁体の数は、例えば4個以上、5個以上、6個以上、7個以上、8個以上、9個以上などであり、また、14個以下、13個以下、12個以下、11個以下などであることができる。あるいは、9個、10個、11個の中から選択することもできる。また、直鎖部に含まれるアミノ酸またはアミノ酸類縁体の数は、例えば0個以上であり、また、8個以下、7個以下、6個以下、5個以下、4個以下などであることができる。あるいは、0個、1個、2個、3個の中から選択することもできる。

　環状部を形成するための結合としては、例えば、アミノ基とカルボキシル基から形成されるペプチド結合を利用することができる。それ以外にも、適切な官能基の組合せから形成されるアミド結合、ジスルフィド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、エステル結合、チオエステル結合、炭素－炭素結合、アルキル結合、アルケニル結合、ホスホネートエーテル結合、アゾ結合、アミン結合、C＝N－C結合、ラクタム架橋、カルバモイル結合、尿素結合、チオ尿素結合、チオアミド結合、スルフィニル結合、スルホニル結合、トリアゾール結合、ベンゾオキサゾール結合などを利用することができる。炭素－炭素結合は、鈴木（Suzuki）反応、ヘック（Heck）反応、薗頭（Sonogashira）反応などの遷移金属を触媒とした反応によって形成することができる。一態様において、本開示のペプチドは、分子内において上記の結合を形成することが可能な少なくとも1組の官能基を含んでいる。環状部の形成は、本開示の翻訳系を用いて直鎖状のペプチドが製造された後に、上記の官能基どうしを結合させるための反応を別途行うことによってなされてもよい。環状部を有するペプチドの合成については、WO2013/100132、WO2012/026566、WO2012/033154、WO2012/074130、WO2015/030014、WO2018/052002、Comb Chem High Throughput Screen (2010)13: 75-87、Nat Chem Biol (2009) 5: 502-507、Nat Chem Biol (2009) 5: 888-90、Bioconjug Chem (2007) 18: 469-476、ChemBioChem (2009) 10: 787-798、Chem Commun (Camb) (2011) 47: 9946-9958なども参照することができる。

　いくつかの態様において、本開示の翻訳系において翻訳される核酸はmRNAである。mRNAには、所望のアミノ酸配列を有するペプチドがコードされていてもよい。mRNAを本開示の翻訳系に添加することによって、当該mRNAのペプチドへの翻訳を行うことができる。一方、DNAをmRNAに転写するためのRNAポリメラーゼが翻訳系に含まれている場合、DNAを本開示の翻訳系に添加することによって、当該DNAのmRNAへの転写、および当該mRNAのペプチドへの翻訳を併せて行うことができる。

　翻訳されるペプチドのＮ末端には通常、開始アミノ酸としてメチオニンが存在しているが、メチオニン以外のアミノ酸をＮ末端に導入するための方法もいくつか報告されている。それらを本開示に記載のペプチドの製造方法と組み合わせて用いてもよい。そのような方法として、例えば、メチオニン以外のアミノ酸でアミノアシル化された開始tRNAを用いて、所望のアミノ酸から開始されるペプチドを翻訳する方法が挙げられる（Initiation suppression）。特に、外来性のアミノ酸を許容し得る程度としては、ペプチド鎖の伸長時よりも翻訳開始時の方が高いことから、Ｎ末端では、天然アミノ酸と大きく構造の異なるアミノ酸であっても利用できる可能性がある（Goto & Suga, J Am Chem Soc (2009) 131(14): 5040-5041）。他の方法として、翻訳系から開始メチオニルtRNAを除去することにより、あるいは、開始アミノ酸をメチオニン以外の翻訳効率の低いアミノ酸に置き換えることにより、２番目以降のコドンから翻訳を開始する方法が挙げられる（Initiation read-through；開始コドンの読み飛ばし）。さらに別法として、ペプチドデホルミラーゼ（peptide deformylase）およびメチオニンアミノペプチダーゼ（Methionine aminopeptidase）などの酵素を作用させることによって、ペプチドのＮ末端のメチオニンを削除する方法を挙げることもできる（Meinnel et al., Biochimie (1993) 75: 1061-1075）。メチオニンから開始されるペプチドライブラリーを用意し、これに上記の酵素を作用させることによって、Ｎ末端がランダムなアミノ酸から開始されるペプチドライブラリーを調製することができる。

　別の局面において、本開示は、本開示に記載のペプチドの製造方法によって製造されたペプチドを提供する。本開示に記載の方法により製造されたペプチドに対して、さらに化学修飾を行うなどして得られたペプチドもまた、本開示が提供するペプチドに含まれる。

　一局面において、本開示は、ペプチドライブラリーの製造方法であって、本開示に記載の翻訳系を用いて核酸ライブラリーを翻訳することを含む方法を提供する。ペプチドをそれぞれコードする核酸分子であって、核酸配列の多様性に富んだ複数の核酸分子を用意し、それらをそれぞれペプチドに翻訳することによって、アミノ酸配列の多様性に富んだ複数のペプチド分子を製造することができる。ライブラリーのサイズは特に限定されないが、例えば、10⁶以上、10⁷以上、10⁸以上、10⁹以上、10¹⁰以上、10¹¹以上、10¹²以上、10¹³以上、10¹⁴以上などであることができる。核酸はDNAであってもよいし、RNAであってもよい。RNAは通常mRNAである。DNAはmRNAへの転写を介してペプチドへの翻訳が行われる。そのような核酸ライブラリーは、当業者に公知の方法またはそれに準ずる方法によって調製することができる。核酸ライブラリーを合成する際、所望の位置に混合塩基を用いることによって、核酸配列の多様性に富んだ複数の核酸分子を容易に調製することができる。混合塩基を用いたコドンの例として、例えばNNN（ここで、NはA、T、G、Cの4塩基の混合を表す）やNNW（ここで、WはA、Tの2塩基の混合を表す）、NNM（ここで、WはA、Cの2塩基の混合を表す）、NNK（ここで、KはG、Tの2塩基の混合を表す）、NNS（ここで、SはC、Gの2塩基の混合を表す）などを挙げることができる。あるいは、コドンの3文字目で用いられる塩基を、A、T、G、Cのうちのいずれか1種類に限定することで、一部の特定のアミノ酸のみがコードされた核酸ライブラリーを合成することも可能である。さらに、混合塩基を含むコドンを作成する際、複数の塩基を等比ではなく異なる比率で混合することによって、そのコドンから得られるアミノ酸の出現頻度を任意に調節することも可能である。上記のようなコドンを１単位（ユニット）として、種類の異なるコドンユニットを複数用意し、それらを所望の順序で連結すれば、含まれるアミノ酸の出現位置や出現頻度が制御されたライブラリーをデザインすることも可能となる。

　いくつかの態様において、本開示に記載のペプチドライブラリーは、ペプチドが核酸上に提示されたライブラリー（核酸ディスプレイライブラリー、あるいは単にディスプレイライブラリー）である。ディスプレイライブラリーは、ペプチドとそれをコードする核酸が結合して1つの複合体を形成することによって、表現型と遺伝子型が対応付けられていることを特徴とするライブラリーである。主なディスプレイライブラリーの例として、mRNAディスプレイ法（Roberts and Szostak, Proc Natl Acad Sci USA (1997) 94: 12297-12302）、in vitroウィルス法（Nemoto et al., FEBS Lett (1997) 414: 405-408）、cDNAディスプレイ法（Yamaguchi et al., Nucleic Acids Res (2009) 37: e108）、リボソームディスプレイ法（Mattheakis et al, Proc Natl Acad Sci USA (1994) 91: 9022-9026）、covalentディスプレイ法（Reiersen et al., Nucleic Acids Res (2005) 33: e10）、CISディスプレイ法（Odegrip et al., Proc Natl Acad Sci USA (2004) 101: 2806-2810）などで作製されたライブラリーを挙げることができる。あるいは、in vitro compartmentalization法（Tawfik and Griffiths, Nat Biotechnol (1998) 16: 652-656）を用いて作製されたライブラリーも、ディスプレイライブラリーの一態様として挙げることができる。

　別の局面において、本開示は、本開示に記載のペプチドライブラリーの製造方法によって製造されたペプチドライブラリーを提供する。

　一局面において、本開示は、標的分子に対して結合活性を有するペプチドの同定方法であって、本開示に記載のペプチドライブラリーに標的分子を接触させることを含む方法を提供する。標的分子は特に限定されず、例えば低分子化合物、高分子化合物、核酸、ペプチド、タンパク質、糖、脂質などの中から適宜選択することができる。標的分子は細胞外に存在する分子であってもよく、細胞内に存在する分子であってもよい。あるいは細胞膜に存在する分子であってもよく、その場合、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内ドメインのいずれが標的となってもよい。ペプチドライブラリーと標的分子を接触させる工程において、通常、標的分子は何らかの固相担体（例えばマイクロタイタープレートやマイクロビーズなど）に固定される。その後、標的分子に結合していないペプチドを除去して、標的分子に結合しているペプチドのみを回収することによって、標的分子に対して結合活性を有するペプチドを選択的に濃縮することができる（パニング法）。用いたペプチドライブラリーが核酸ディスプレイライブラリーの場合、回収されたペプチドにその遺伝情報がコードされた核酸が結合しているので、それらを単離し解析することによって、回収されたペプチドをコードする核酸配列およびアミノ酸配列を容易に同定することができる。さらに、得られた核酸配列あるいはアミノ酸配列をもとに、化学合成あるいは遺伝子組み換え手法などにより、同定されたペプチドを個別に製造することもできる。

　一局面において、本開示は、ペプチドおよび該ペプチドをコードする核酸を含む核酸－ペプチド複合体であって、以下の特徴を有する複合体を提供する：
　(i) ペプチドをコードする核酸配列の中に、M₁M₂AおよびM₁M₂Gの2つのコドンが含まれていて、かつ、
　(ii) ペプチドのアミノ酸配列において、M₁M₂Aのコドンに対応するアミノ酸およびM₁M₂Gのコドンに対応するアミノ酸の種類が互いに異なる。
　ここで、M₁およびM₂は、ある特定のコドンの1文字目および2文字目をそれぞれ表す（ただし、M₁がAであり、かつM₂がUであるコドンは除く）。

　さらなる局面において、本開示は、ペプチドおよび該ペプチドをコードする核酸を含む核酸－ペプチド複合体であって、以下の特徴を有する複合体を提供する：
　(i) ペプチドをコードする核酸配列の中に、M₁M₂U、M₁M₂AおよびM₁M₂Gの3つのコドンが含まれていて、かつ、
　(ii) ペプチドのアミノ酸配列において、M₁M₂Uのコドンに対応するアミノ酸、M₁M₂Aのコドンに対応するアミノ酸、およびM₁M₂Gのコドンに対応するアミノ酸の種類がいずれも互いに異なる。
　ここで、M₁およびM₂は、ある特定のコドンの1文字目および2文字目をそれぞれ表す。

　別の局面において、本開示は、ペプチドおよび該ペプチドをコードする核酸を含む核酸－ペプチド複合体であって、以下の特徴を有する複合体を提供する：
　(i) ペプチドをコードする核酸配列の中に、M₁M₂C、M₁M₂AおよびM₁M₂Gの3つのコドンが含まれていて、かつ、
　(ii) ペプチドのアミノ酸配列において、M₁M₂Cのコドンに対応するアミノ酸、M₁M₂Aのコドンに対応するアミノ酸、およびM₁M₂Gのコドンに対応するアミノ酸の種類がいずれも互いに異なる。
　ここで、M₁およびM₂は、ある特定のコドンの1文字目および2文字目をそれぞれ表す。

　いくつかの態様において、上述の核酸－ペプチド複合体は、ペプチドライブラリー（特に核酸ディスプレイライブラリー）を構成する要素の１つとしてそこに含まれ得る。一態様において、本開示は、本開示に記載の核酸－ペプチド複合体を含むライブラリー（ペプチドライブラリーあるいは核酸ディスプレイライブラリー）を提供する。特定の態様において、上述の核酸－ペプチド複合体およびライブラリーは、本開示に記載の変異tRNA、あるいは本開示に記載の翻訳系を用いて作製され得る。

　一局面において、本開示は以下の化合物、即ちライシジン‐ジホスフェート(pLp)、またはその塩を提供する。

　このような化合物は、ライシジンが導入された変異tRNAの調製に用いることができる。したがって本開示は、ライシジン‐ジホスフェートを用いて、ライシジンが導入された変異tRNAを製造する方法、および当該方法によって製造される変異tRNAに関する。また本開示は、ライシジン‐ジホスフェートを用いて、ライシジンが導入された変異tRNAであって、アミノ酸またはアミノ酸類縁体が結合している変異tRNA（アミノアシル変異tRNA）を製造する方法、および当該方法によって製造されるアミノアシル変異tRNAに関する。このような変異tRNAおよび／またはアミノアシル変異tRNAは、本開示における翻訳系において使用することができる。したがって本開示は、このような変異tRNAおよび／またはアミノアシル変異tRNAを含む翻訳系に関する。さらに本開示は、当該翻訳系を使用してペプチドまたはペプチドライブラリーを製造する方法をも提供する。また本開示は、当該方法によって製造されるペプチドまたはペプチドライブラリーをも提供する。
　本開示においては、ライシジンはtRNAの34位（tRNAナンバリング則に基づく）に導入されていてもよい。一態様において、tRNAナンバリング則の34位にライシジンが導入された変異tRNAは、1または複数（例えば、2、3、4、5、またはそれ以上）のtRNAの核酸断片とライシジン‐ジホスフェートを調製し、これらを当業者に公知の手法によりライゲーションすることにより取得することができる。具体的には、一例として、tRNAの1位から33位の塩基からなる核酸断片、ライシジン‐ジホスフェート、tRNAの35位から76位（またはtRNAの35位から75位、tRNAの35位から74位）の塩基からなる核酸断片を、5’側からこれらの順にライゲーションすることが挙げられる。3’末端のCA配列は除去されていてもよい。

　一局面において、本開示は以下の化合物、即ちアグマチジン‐ジホスフェート(p(Agm)p)、またはその塩を提供する。

　このような化合物は、アグマチジンが導入された変異tRNAの調製に用いることができる。したがって本開示は、アグマチジン‐ジホスフェートを用いて、アグマチジンが導入された変異tRNAを製造する方法、および当該方法によって製造される変異tRNAに関する。また本開示は、アグマチジン‐ジホスフェートを用いて、アグマチジンが導入された変異tRNAであって、アミノ酸またはアミノ酸類縁体が結合している変異tRNA（アミノアシル変異tRNA）を製造する方法、および当該方法によって製造されるアミノアシル変異tRNAに関する。このような変異tRNAおよび／またはアミノアシル変異tRNAは、本開示における翻訳系において使用することができる。したがって本開示は、このような変異tRNAおよび／またはアミノアシル変異tRNAを含む翻訳系に関する。さらに本開示は、当該翻訳系を使用してペプチドまたはペプチドライブラリーを製造する方法をも提供する。また本開示は、当該方法によって製造されるペプチドまたはペプチドライブラリーをも提供する。
　本開示においては、アグマチジンはtRNAの34位（tRNAナンバリング則に基づく）に導入されていてもよい。一態様において、tRNAナンバリング則の34位にアグマチジンが導入された変異tRNAは、1または複数（例えば、2、3、4、5、またはそれ以上）のtRNAの核酸断片とアグマチジン‐ジホスフェートを調製し、これらを当業者に公知の手法によりライゲーションすることにより取得することができる。具体的には、一例として、tRNAの1位から33位の塩基からなる核酸断片、アグマチジン‐ジホスフェート、tRNAの35位から76位（またはtRNAの35位から75位、tRNAの35位から74位）の塩基からなる核酸断片を、5’側からこれらの順にライゲーションすることが挙げられる。3’末端のCA配列は除去されていてもよい。

　本開示の化合物は、遊離体であることも塩であることもできる。本開示の化合物の塩としては、例えば、塩酸塩；臭化水素酸塩；ヨウ化水素酸塩；リン酸塩；ホスホン酸塩；硫酸塩；メタンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩などのスルホン酸塩；酢酸塩、クエン酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、サリチル酸塩などのカルボン酸塩；ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩などのアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩、アルキルアンモニウム塩、ジアルキルアンモニウム塩、トリアルキルアンモニウム塩、テトラアルキルアンモニウム塩などのアンモニウム塩などが挙げられる。本開示の化合物の塩は、例えば、本開示の化合物を酸や塩基と接触させることにより製造される。本開示の化合物は、水和物となる場合があり、そのような水和物も本開示の化合物の塩に含まれる。また本開示の化合物は、溶媒和物となる場合があり、そのような溶媒和物も、本開示の化合物の塩に含まれる。

　一局面において、本発明は、下記式Ａで表されるライシジン二リン酸もしくはその誘導体、またはアグマチジン二リン酸もしくはその誘導体の製造方法に関する。

　式Ａ中、Ｒ_１およびＲ_２は、それぞれ独立してＨまたはＣ_１－Ｃ_３アルキルであり、Ｒ_１およびＲ_２が共にＨであることが好ましい。

　式Ａ中、Ｌは、ヒドロキシおよびＣ_１－Ｃ_３アルキルからなる群より選択される１つまたは複数の置換基によって置換されていてもよい、Ｃ_２－Ｃ_６直鎖アルキレンまたはＣ_２－Ｃ_６直鎖アルケニレンであり、該Ｃ_２－Ｃ_６直鎖アルキレンの炭素原子は、１個の酸素原子または硫黄原子によって置換されていてもよい。Ｃ_２－Ｃ_６直鎖アルキレンはＣ_４－Ｃ_５直鎖アルキレンであることが好ましく、またＣ_２－Ｃ_６直鎖アルケニレンは、Ｃ_４－Ｃ_５直鎖アルケニレンであることが好ましい。このようなＬとして具体的には、たとえば、－（ＣＨ_２）_３－、－（ＣＨ_２）_４－、－（ＣＨ_２）_５、－（ＣＨ_２）_２－Ｏ－ＣＨ_２－、－（ＣＨ_２）_２－Ｓ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ_２）_２－、または－ＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ－（シスまたはトランス）などが挙げられる。

　式Ａ中、Ｍは、単結合、

である。波線は炭素原子との結合点を示し、＊は、水素原子との結合点を示し、＊＊は窒素原子との結合点を示す。Ｍが単結合である場合、Ｍに結合したＨは存在しない。たとえば、Ｍが

である場合、式Ａの化合物は、以下：

のとおりに表すことができ、Ｍが

である場合、式Ａの化合物は、以下：

のとおりに表すことができ、Ｍが単結合である場合、式Ａの化合物は以下：

のとおりに表すことができる。

　式Ａで表される化合物として好ましくは、ライシジン二リン酸、アグマチジン二リン酸、またはこれらの塩である。

　ある態様において、式Ａで表される化合物は、以下のスキーム１に沿って製造することができる。
スキーム１：

　スキーム１の工程１は、式Ｂ１で表される化合物を分子内で環化して、式Ｃ１で表される化合物を得る工程である。この工程は、分子内環化試薬の存在下、溶媒中、－２０℃～溶媒の沸点付近の温度、好ましくは０℃～１８０℃の温度で、反応混合物を１５分～４８時間攪拌することで行うことができる。
　式Ｂ１で表される化合物は、商業的供給業者から入手するか、あるいは文献既知の方法を用いて製造することができる。式Ｂ１中のＰＧ_１１は、アミノ基の保護基であり、上記スキーム１に沿った反応の進行に支障がないかぎり、任意の保護基を使用することができ、たとえば、酸やフッ化物イオンによって脱保護されない保護基が好ましい。ＰＧ_１１として具体的には、たとえば、ｐ－ブロモベンゾイル、置換されていてもよいベンゾイル、ピリジンカルボニル、アセチルなどが例示される。
　分子内環化試薬は、特に限定されないが、アゾジカルボン酸ジイソプロピルおよびトリフェニルホスフィンを好ましく用いることができる。
　溶媒としては、ハロゲン化溶媒、エーテル系溶媒、ベンゼン系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒を挙げることができ、ジクロロメタンを好ましく用いることができる。

　スキーム１の工程２は、式Ｃ１で表される化合物に式Ｄ１で表されるアミンを導入して、式Ｅ１で表される化合物を得る工程である。この工程は、アミン導入試薬の存在下、溶媒中、－２０℃～溶媒の沸点付近の温度、好ましくは０℃～１８０℃の温度で、反応混合物を１５分～４８時間攪拌することで行うことができる。
　アミン導入試薬は、特に限定されないが、塩化リチウムおよびＤＢＵを好ましく用いることができる。
　溶媒としては、ハロゲン化溶媒、エーテル系溶媒、ベンゼン系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒を挙げることができ、本工程ではテトラヒドロフランが好ましく用いられる。

　スキーム１の工程３Ａおよび工程３Ｂは、式Ｅ１で表される化合物にＰＧ_１２および／またはＰＧ_１３を導入して、式Ｆ１Ａまたは式Ｆ１Ｂで表される化合物を得る工程である。式Ｅ１のＲ_２がアルキルである場合には、ＰＧ_１３のみが導入されて式Ｆ１Ａとなり、式Ｅ１のＲ_２が水素である場合には、ＰＧ_１２およびＰＧ_１３が導入されて、式Ｆ１Ｂとなる。この工程は、保護基導入試薬の存在下、溶媒中、－２０℃～溶媒の沸点付近の温度、好ましくは０℃～１８０℃の温度で、反応混合物を１５分～４８時間攪拌することで行うことができる。
　ＰＧ_１２はアミノ基の保護基であり、ＰＧ_１３はカルボキシル基またはイミノ基の保護基である。これらの保護基は、上記スキーム１に沿った反応の進行に支障がないかぎり、任意の保護基を使用することができ、たとえば、酸やフッ化物イオンによって脱保護されない保護基が好ましい。ＰＧ_１２としてはＦｍｏｃが好ましく用いられ、ＰＧ_１３としてはＭが

の場合にはメチル、エチル、または置換されていてもよいベンジルが、Ｍが

の場合には置換されていてもよいベンジル、Ｃｂｚまたは置換されていてもよいベンジルオキシカルボニルが好ましく用いられる。ＰＧ_１２とＰＧ_１３は同時に導入してもよく、順番に導入してもよい。順番に導入する場合には、ＰＧ_１２とＰＧ_１３のどちらを先に導入してもよいが、ＰＧ_１２を導入し、次いでＰＧ_１３を導入することが好ましい。保護基の導入には、例えば、「Greene’s,“Protective Groups in Organic Synthesis”（第５版，John Wiley & Sons 2014）」に記載の方法を利用することができるが、ＰＧ_１２がＦｍｏｃである場合には、その導入に、炭酸 (2,5-ジオキソピロリジン-1-イル) (9H-フルオレン-9-イル)メチルおよび炭酸ナトリウムを用いることが好ましく、ＰＧ_１３がメチルである場合には、その導入にN,N'-ジイソプロピルカルボジイミド、メタノール、およびN,N-ジメチル-4-アミノピリジンを用いることが好ましい。
　溶媒としては、例えば、ハロゲン化溶媒、エーテル系溶媒、ベンゼン系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒を挙げることができ、Ｆｍｏｃの導入にはジオキサンが、メチルの導入にはジクロロメタンがそれぞれ好ましく用いられる。

　スキーム１の工程４Ａおよび工程４Ｂは、式Ｆ１Ａまたは式Ｆ１Ｂで表される化合物からアセトニドを除去し、ＰＧ_１４およびＰＧ_１５を導入して式Ｇ１Ａまたは式Ｇ１Ｂで表される化合物を得る工程である。アセトニドの除去は酸の存在下で、保護基の導入は保護基導入試薬の存在下で、溶媒中、－２０℃～溶媒の沸点付近の温度、好ましくは０℃～１８０℃の温度で、反応混合物を１５分～４８時間攪拌することで行うことができる。
　ＰＧ_１４およびＰＧ_１５はそれぞれ独立して水酸基の保護基であり、上記スキーム１に沿った反応の進行に支障がないかぎり、任意の保護基を使用することができ、例えばフッ化物イオンによって脱保護されるシリル系の保護基を好ましく用いることができる。ＰＧ_１４およびＰＧ_１５としてはこれらが一緒になって二価の保護基を形成することが好ましく、そのような保護基として具体的には、たとえば、ジ－tert-ブチルシリルが挙げられる。アセトニドの除去、および保護基の導入には、例えば、「Greene’s,“Protective Groups in Organic Synthesis”（第５版，John Wiley & Sons 2014）」に記載の方法を利用することができるが、アセトニドの除去に用いる酸としてはＴＦＡが好ましい。またＰＧ_１４およびＰＧ_１５が一緒になってジ－tert-ブチルシリルを形成する場合には、その導入には、ビス(トリフルオロメタンスルホン酸)ジ-tert-ブチルシリルを用いることが好ましい。
　アセトニドの除去に用いる溶媒としては、水、カルボン酸系溶媒を挙げることができ、水とＴＦＡの混合溶媒を好ましく用いることができる。また、ＰＧ_１４およびＰＧ_１５の導入には、例えば、ハロゲン化溶媒、エーテル系溶媒、ベンゼン系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、アミド系溶媒を挙げることができ、ＤＭＦが好ましく用いられる。

　スキーム１の工程５Ａおよび工程５Ｂは、式Ｇ１Ａまたは式Ｇ１Ｂで表される化合物にＰＧ_１６を導入して式Ｈ１Ａまたは式Ｈ１Ｂで表される化合物を得る工程である。ＰＧ_１６の導入は保護基導入試薬の存在下で、溶媒中、－２０℃～溶媒の沸点付近の温度、好ましくは０℃～１８０℃の温度で、反応混合物を１５分～４８時間攪拌することで行うことができる。
　ＰＧ_１６は、水酸基および／またはアミノ基の保護基であり、上記スキーム１に沿った反応の進行に支障がないかぎり、任意の保護基を使用することができ、たとえば、フッ化物イオンによって脱保護されない保護基が好ましい。ＰＧ_１６としてはＴＯＭが好ましい。保護基の導入には、例えば、「Greene’s,“Protective Groups in Organic Synthesis”（第５版，John Wiley & Sons 2014）」に記載の方法を利用することができるが、ＰＧ_１６がＴＯＭである場合には、その導入に、ＤＩＰＥＡ、および塩化 (トリイソプロピルシロキシ)メチルを用いることが好ましい。
　溶媒としては、例えば、ハロゲン化溶媒、エーテル系溶媒、ベンゼン系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、アミド系溶媒を挙げることができ、ジクロロメタンが好ましく用いられる。

　スキーム１の工程６Ａおよび工程６Ｂは、式Ｇ１Ａまたは式Ｇ１Ｂで表される化合物からＰＧ_１４およびＰＧ_１５を除去して式Ｉ１Ａまたは式Ｉ１Ｂで表される化合物を得る工程である。ＰＧ_１４およびＰＧ_１５の除去は脱保護試薬の存在下で、溶媒中、－２０℃～溶媒の沸点付近の温度、好ましくは０℃～１８０℃の温度で、反応混合物を１５分～４８時間攪拌することで行うことができる。
　脱保護試薬は、ＰＧ_１４およびＰＧ_１５のみを選択的に除去することができれば、任意の試薬を用いることができるが、ＰＧ_１４およびＰＧ_１５が一緒になってジ－tert-ブチルシリルを形成する場合には、その除去にフッ化物イオンを生じる試薬、具体的には、たとえばフッ化水素ピリジンコンプレックスを用いることが好ましい。
　溶媒としては、例えば、ハロゲン化溶媒、エーテル系溶媒、ベンゼン系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、アミド系溶媒を挙げることができ、ＴＨＦが好ましく用いられる。

　スキーム１の工程７Ａおよび工程７Ｂは、式Ｉ１ＡまたはＩ１Ｂで表される化合物を亜リン酸エステル化し、次いで酸化して、式Ｊ１ＡまたはＪ１Ｂで表される化合物を得る工程である。亜リン酸エステル化は、亜リン酸エステル化試薬の存在下で、溶媒中、－２０℃～溶媒の沸点付近の温度、好ましくは０℃～１８０℃の温度で、反応混合物を１５分～４８時間攪拌することで行うことができる。酸化は、酸化試薬の存在下で、溶媒中、－２０℃～溶媒の沸点付近の温度、好ましくは０℃～１８０℃の温度で、反応混合物を１５分～４８時間攪拌することで行うことができる。亜リン酸エステル化後に化合物を単離してもよいが、亜リン酸エステル化反応と酸化反応をワンポットで行うことが好ましい。
　式Ｊ１ＡまたはＪ１Ｂ中、ＰＧ_１７は、水酸基の保護基であり、上記スキーム１に沿った反応の進行に支障がないかぎり、任意の保護基を使用することができ、ＰＧ_１１、ＰＧ_１２、ＰＧ_１３と同時に脱保護できる保護基が好ましい。ＰＧ_１７としては具体的には、たとえば、シアノエチルが挙げられる。水酸基が保護基で保護された亜リン酸エステル化試薬を用いてもよく、無保護の亜リン酸エステル化試薬を用いたのちに、水酸基に保護基を導入してもよい。保護基の導入には、例えば、「Greene’s,“Protective Groups in Organic Synthesis”（第５版，John Wiley & Sons 2014）」に記載の方法を利用することができる。水酸基がシアノエチル基で保護された亜リン酸エステル化試薬を用いる場合、亜リン酸エステル化試薬としては、ビス（２－シアノエチル）－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミノホスホルアミジットが好ましく用いられる。亜リン酸エステル化に続く酸化に用いる酸化剤は、特に限定されないが、ｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシドを好ましく用いることができる。
　溶媒としては、例えば、ハロゲン化溶媒、エーテル系溶媒、ベンゼン系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、ニトリル系溶媒を挙げることができ、アセトニトリルが好ましく用いられる。

　スキーム１の工程８Ａおよび工程８Ｂは、式Ｊ１Ａで表される化合物からＰＧ_１１、ＰＧ_１２、ＰＧ_１３、およびＰＧ_１７を除去して、あるいは式Ｊ１Ｂで表される化合物からＰＧ_１１、ＰＧ_１３、およびＰＧ_１７を除去して、式Ｋ１で表される化合物を得る工程である。これら保護基の除去は、脱保護試薬の存在下で、溶媒中、－２０℃～溶媒の沸点付近の温度、好ましくは０℃～１８０℃の温度で、反応混合物を１５分～４８時間攪拌することで行うことができる。
　脱保護試薬は、上記の保護基が選択的に除去することができれば任意の試薬を使用することができる。このような試薬として、具体的には、たとえば、ビス-(トリメチルシリル)アセトアミドおよびＤＢＵを組み合わせて用いることが挙げられる。
　溶媒としては、例えば、ハロゲン化溶媒、エーテル系溶媒、ベンゼン系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、ニトリル系溶媒、アミン系溶媒を挙げることができ、ピリジンが好ましく用いられる。

　スキーム１の工程９は、式Ｋ１で表される化合物からＰＧ_１６を除去して、式Ａで表される化合物を得る工程である。ＰＧ_１６の除去は、脱保護試薬の存在下で、溶媒中、－２０℃～溶媒の沸点付近の温度、好ましくは０℃～１８０℃の温度で、反応混合物を１５分～４８時間攪拌することで行うことができる。
　脱保護試薬は、ＰＧ_１６が選択的に除去することができれば任意の試薬を使用することができ、フッ化アンモニウムを好ましく用いることができる。
　溶媒としては、例えば、水、ハロゲン化溶媒、エーテル系溶媒、ベンゼン系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、ニトリル系溶媒を挙げることができ、水とアセトニトリルの混合溶媒を好ましく用いることができる。

　ある態様において、式Ａで表される化合物は、以下のスキーム２に沿って製造することができる。
スキーム２：

　スキーム２の工程１は、式Ｂ２で表される化合物を分子内で環化して、式Ｃ２で表される化合物を得る工程である。この工程は、分子内環化試薬の存在下、溶媒中、－２０℃～溶媒の沸点付近の温度、好ましくは０℃～１８０℃の温度で、反応混合物を１５分～４８時間攪拌することで行うことができる。
　式Ｂ２で表される化合物は、商業的供給業者から入手するか、あるいは文献既知の方法を用いて製造することができる。式Ｂ２中のＰＧ_２１は、アミノ基の保護基であり、上記スキーム２に沿った反応の進行に支障がないかぎり、任意の保護基を使用することができ、たとえば、酸やフッ化物イオンによって脱保護されない保護基が好ましい。ＰＧ_２１として具体的には、たとえば、Ｃｂｚ、置換されていてもよいベンジルオキシカルボニル、または置換されていてもよいベンジルなどが例示される。
　分子内環化試薬は、特に限定されないが、アゾジカルボン酸ジイソプロピルおよびトリフェニルホスフィンを好ましく用いることができる。
　溶媒としては、ハロゲン化溶媒、エーテル系溶媒、ベンゼン系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒を挙げることができ、ジクロロメタンを好ましく用いることができる。

　スキーム２の工程２は、式Ｃ２で表される化合物に式Ｄ２ＡまたはＤ２Ｂで表されるアミンを導入して、式Ｅ２ＡまたはＥ２Ｂで表される化合物を得る工程である。この工程は、アミン導入試薬の存在下、溶媒中、－２０℃～溶媒の沸点付近の温度、好ましくは０℃～１８０℃の温度で、反応混合物を１５分～４８時間攪拌することで行うことができる。
　アミン導入試薬は、特に限定されないが、塩化リチウムおよびＤＢＵを好ましく用いることができる。
　溶媒としては、ハロゲン化溶媒、エーテル系溶媒、ベンゼン系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒を挙げることができ、本工程ではＴＨＦが好ましく用いられる。

　スキーム２の工程３Ａおよび工程３Ｂは、式Ｅ２ＡまたはＥ２Ｂで表される化合物からアセトニドを除去し、ＰＧ_２４およびＰＧ_２５を導入して、式Ｆ２ＡまたはＦ２Ｂで表される化合物を得る工程である。アセトニドの除去は酸の存在下で、保護基の導入は保護基導入試薬の存在下で、溶媒中、－２０℃～溶媒の沸点付近の温度、好ましくは０℃～１８０℃の温度で、反応混合物を１５分～４８時間攪拌することで行うことができる。
　ＰＧ_２４およびＰＧ_２５はそれぞれ独立して水酸基の保護基であり、上記スキーム２に沿った反応の進行に支障がないかぎり、任意の保護基を使用することができ、例えばフッ化物イオンによって脱保護されるシリル系の保護基を好ましく用いることができる。ＰＧ_２４およびＰＧ_２５としてはこれらが一緒になって二価の保護基を形成することが好ましく、そのような保護基として具体的には、たとえば、ジ－tert-ブチルシリルが挙げられる。アセトニドの除去、および保護基の導入には、例えば、「Greene’s,“Protective Groups in Organic Synthesis”（第５版，John Wiley & Sons 2014）」に記載の方法を利用することができるが、アセトニドの除去に用いる酸としてはＴＦＡが好ましい。またＰＧ_２４およびＰＧ_２５が一緒になってジ－tert-ブチルシリルを形成する場合には、その導入には、ビス(トリフルオロメタンスルホン酸)ジ-tert-ブチルシリルを用いることが好ましい。
　アセトニドの除去に用いる溶媒としては、水、カルボン酸系溶媒を挙げることができ、水とＴＦＡの混合溶媒を好ましく用いることができ、ＰＧ_２４およびＰＧ_２５の導入には、例えば、ハロゲン化溶媒、エーテル系溶媒、ベンゼン系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、アミド系溶媒を挙げることができ、ＤＭＦが好ましく用いられる。

　スキーム２の工程４Ａおよび工程４Ｂは、式Ｆ２ＡまたはＦ２Ｂで表される化合物にＰＧ_２６を導入して、式Ｇ２ＡまたはＧ２Ｂで表される化合物を得る工程である。ＰＧ_２６の導入は保護基導入試薬の存在下で、溶媒中、－２０℃～溶媒の沸点付近の温度、好ましくは０℃～１８０℃の温度で、反応混合物を１５分～４８時間攪拌することで行うことができる。
　ＰＧ_２６は、水酸基の保護基であり、上記スキーム２に沿った反応の進行に支障がないかぎり、任意の保護基を使用することができ、たとえば、フッ化物イオンによって脱保護されない保護基が好ましい。ＰＧ_２６としてはテトラヒドロピラニル、テトラヒドロフラニル、またはメトキシメチルが好ましい。保護基の導入には、例えば、「Greene’s,“Protective Groups in Organic Synthesis”（第５版，John Wiley & Sons 2014）」に記載の方法を利用することができるが、ＰＧ_１６がテトラヒドロピラニルである場合には、その導入に、ＴＦＡ、および３，４－ジヒドロ－２Ｈ－ピランを用いることが好ましい。
　溶媒としては、例えば、ハロゲン化溶媒、エーテル系溶媒、ベンゼン系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、アミド系溶媒を挙げることができ、ジクロロメタンが好ましく用いられる。

　スキーム２の工程５Ａおよび工程５Ｂは、式Ｇ２ＡまたはＧ２Ｂで表される化合物からＰＧ_２４およびＰＧ_２５を除去して、式Ｈ２ＡまたはＨ２Ｂで表される化合物を得る工程である。ＰＧ_２４およびＰＧ_２５の除去は脱保護試薬の存在下で、溶媒中、－２０℃～溶媒の沸点付近の温度、好ましくは０℃～１８０℃の温度で、反応混合物を１５分～４８時間攪拌することで行うことができる。
　脱保護試薬は、ＰＧ_２４およびＰＧ_２５のみを選択的に除去することができれば、任意の試薬を用いることができるが、ＰＧ_２４およびＰＧ_２５が一緒になってジ－tert-ブチルシリルを形成する場合には、その除去にフッ化物イオンを生じる試薬、具体的には、たとえばテトラブチルアンモニウムフルオリドを用いることが好ましい。
　溶媒としては、例えば、ハロゲン化溶媒、エーテル系溶媒、ベンゼン系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、アミド系溶媒を挙げることができ、ＴＨＦが好ましく用いられる。

　スキーム２の工程６Ａおよび工程６Ｂは、式Ｈ２ＡまたはＨ２Ｂで表される化合物を亜リン酸エステル化し、次いで酸化して、式Ｉ２ＡまたはＩ２Ｂで表される化合物を得る工程である。亜リン酸エステル化は、亜リン酸エステル化試薬の存在下で、溶媒中、－２０℃～溶媒の沸点付近の温度、好ましくは０℃～１８０℃の温度で、反応混合物を１５分～４８時間攪拌することで行うことができる。酸化は、酸化試薬の存在下で、溶媒中、－２０℃～溶媒の沸点付近の温度、好ましくは０℃～１８０℃の温度で、反応混合物を１５分～４８時間攪拌することで行うことができる。亜リン酸エステル化後に化合物を単離してもよいが、亜リン酸エステル化反応と酸化反応をワンポットで行うことが好ましい。
　式Ｉ２ＡまたはＩ２Ｂ中、ＰＧ_２７は、水酸基の保護基であり、上記スキーム２に沿った反応の進行に支障がないかぎり、任意の保護基を使用することができ、ＰＧ_２１、ＰＧ_２２、ＰＧ_２３と同時に脱保護できる保護基が好ましい。ＰＧ_２７としては具体的には、たとえば、ベンジルが挙げられる。水酸基が保護基で保護された亜リン酸エステル化試薬を用いてもよく、無保護の亜リン酸エステル化試薬を用いたのちに、水酸基に保護基を導入してもよい。保護基の導入には、例えば、「Greene’s,“Protective Groups in Organic Synthesis”（第５版，John Wiley & Sons 2014）」に記載の方法を利用することができる。水酸基がベンジルで保護された亜リン酸エステル化試薬を用いる場合、亜リン酸エステル化試薬としては、ジベンジルＮ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイトが好ましく用いられる。亜リン酸エステル化に続く酸化に用いる酸化剤は、特に限定されないが、デス－マーチンペルヨージナンを好ましく用いることができる。
　溶媒としては、例えば、ハロゲン化溶媒、エーテル系溶媒、ベンゼン系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、ニトリル系溶媒を挙げることができ、アセトニトリルが好ましく用いられる。

　スキーム２の工程７Ａおよび工程７Ｂは、Ｉ２Ａで表される化合物からＰＧ_２１、ＰＧ_２２、ＰＧ_２３、およびＰＧ_２７を除去して、あるいは式Ｉ２Ｂで表される化合物からＰＧ_２１、ＰＧ_２３、およびＰＧ_２７を除去して、式Ｊ２で表される化合物を得る工程である。これら保護基の除去は、脱保護試薬の存在下で、溶媒中、－２０℃～溶媒の沸点付近の温度、好ましくは０℃～１８０℃の温度で、反応混合物を１５分～４８時間攪拌することで行うことができる。
　上記の保護基を選択的に除去することができれば、脱保護には任意の方法を使用することができる。このような方法として具体的には、たとえば、接触水素化が挙げられる。接触水素化には、Ｐｄ系触媒、例えばパラジウム／炭素を好ましく用いることができる。
　溶媒としては、例えば、水、アルコール系溶媒、ハロゲン化溶媒、エーテル系溶媒、ベンゼン系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、ニトリル系溶媒、アミン系溶媒を挙げることができ、水とメタノールの混合溶媒を好ましく用いることができる。

　スキーム２の工程８は、式Ｊ２で表される化合物からＰＧ_２６を除去して、式Ａで表される化合物を得る工程である。ＰＧ_２６の除去は、脱保護試薬の存在下で、溶媒中、－２０℃～溶媒の沸点付近の温度、好ましくは０℃～１８０℃の温度で、反応混合物を１５分～４８時間攪拌することで行うことができる。
　脱保護試薬は、ＰＧ_２６が選択的に除去することができれば任意の試薬を使用することができ、塩酸を好ましく用いることができる。
　溶媒としては、例えば、水、ハロゲン化溶媒、エーテル系溶媒、ベンゼン系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、ニトリル系溶媒を挙げることができ、水を好ましく用いることができる。
　なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。

　本発明は、以下の実施例によってさらに例示されるが、下記の実施例に限定されるものではない。
　なお、実施例中では以下の略号を使用した。
ＡＡ　　　　　　酢酸アンモニウム
ＣＨ_２ＣＮ　　　シアノメチル基
ＤＢＵ　　　　　１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン
ＤＣＭ　　　　　ジクロロメタン
ＤＩＣ　　　　　Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルカルボジイミド
ＤＩＰＥＡ　　　Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ　　　　　ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ　　　　ジメチルスルホキシド
ＦＡ　　　　　　ギ酸
Ｆｍｏｃ　　　　９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基
Ｆ－Ｐｎａｚ　　４－（２－（４－フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジルオキシカルボニル基：

ＨＦＩＰ　　　　１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノール
ＭｅＣＮ　　　　アセトニトリル
ＮＭＰ　　　　　Ｎ－メチル－２－ピロリドン
ＴＥＡ　　　　　トリエチルアミン
ＴＦＡ　　　　　トリフルオロ酢酸
ＴＦＥ　　　　　２，２，２－トリフルオロエタノール
ＴＨＦ　　　　　テトラヒドロフラン

　また、本実施例では、以下の略号を用いた。ＧｌｙまたはＧ（グリシン）、ＩｌｅまたはＩ（イソロイシン）、ＬｅｕまたはＬ（ロイシン）、ＰｈｅまたはＦ（フェニルアラニン）、ＰｒｏまたはＰ（プロリン）、ＴｈｒまたはＴ（トレオニン）。これらに加えて、表２に記載の略号を用いた。

　また、ＬＣＭＳの分析条件を、下記の表３に示す。

実施例１．ligation法によりtRNA断片の3’末端にUridineユニットを導入するためのUridine-diphosphateの合成
　tRNA断片の3’末端にUridineユニットをligation法により導入するために、文献（Nucleic Acids Research　２００３，　３１（２２），　e145）記載の方法を参考にしUridine-diphosphate（ＳＳ０１、ｐＵｐ）を合成した。

リン酸二水素 ((2R,3S,4R,5R)-5-(2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)-4-ヒドロキシ-3-(ホスホノオキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル（化合物ＳＳ０２）とリン酸二水素 ((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)-3-ヒドロキシ-4-(ホスホノオキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル（化合物ＳＳ０３）の混合物（化合物ＳＳ０１、ｐＵｐ）の合成

　1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル)ピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオン（１０ｍｇ、０．０４１ｍｍｏｌ）およびピロリン酸テトラクロリド（５６．６μＬ、０．４０９ｍｍｏｌ）を氷浴下で混合した。反応混合物を０℃で５時間撹拌後、氷冷した純水（３８ｍＬ）および重炭酸トリエチルアンモニウムバッファー（１Ｍ、２ｍＬ）を氷冷下で加えた。混合物をＤＥＡＥーＳｅｐｈａｄｅｘＡ－２５カラムクロマトグラフィー（０．０５Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウムバッファー⇒１Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウムバッファー）にて精製し、集めた溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１５ｍＭ　ＴＥＡと４００ｍＭ　ＨＦＩＰの水溶液／１５ｍＭ　ＴＥＡと４００ｍＭ　ＨＦＩＰのメタノール溶液）にて精製し、リン酸二水素 ((2R,3S,4R,5R)-5-(2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)-4-ヒドロキシ-3-(ホスホノオキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル（化合物ＳＳ０２）とリン酸二水素 ((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)-3-ヒドロキシ-4-(ホスホノオキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル（化合物ＳＳ０３）の混合物（化合物ＳＳ０１、ｐＵｐ）の水溶液（１００μＬ、４０．３０ｍＭ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　４０３　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：１．７９分、１．８９分（分析条件ＬＴＱＴＥＡ／ＨＦＩＰ０５＿０１）

実施例２．ligation法によりtRNA断片の3’末端にLysidineユニットを導入するためのLysidine-diphosphateの合成
　tRNA断片の3’末端にLysidineユニットをligation法により導入するために、Lysidineのdiphosphateを合成した。すなわち、以下のスキームに従い、Lysidine-diphosphate（ＳＳ０４、ｐＬｐ）を合成した。

N6-(4-(4-ブロモベンズアミド)-1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(ヒドロキシメチル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソール-4-イル)ピリミジン-2(1H)-イリデン)-L-リシン化合物 2,2,2-トリフルオロ酢酸塩（化合物ＳＳ０５）の合成

　窒素雰囲気下、(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)-L-リシン塩酸塩（８１３ｍｇ、２．０１ｍｍｏｌ）、塩化リチウム（２１３ｍｇ、５．０２ｍｍｏｌ）および文献（Org. Lett.　２０１２，　１４（１６），　4118-4121）記載の方法で合成したN4-p-ブロモベンゾイル-2',3'-O-イソプロピリデン-O2,5’-シクロシチジン（３００ｍｇ、０．６７ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＴＨＦ（６．７ｍＬ）を添加した。混合物を氷浴で冷却後、ＤＢＵ（１．５０ｍＬ、１０．０４ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を０℃で１時間撹拌後、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ＦＡ水溶液／０．１％ＦＡアセトニトリル溶液）にて精製し、N6-(4-(4-ブロモベンズアミド)-1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(ヒドロキシメチル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソール-4-イル)ピリミジン-2(1H)-イリデン)-L-リシン化合物 2,2,2-トリフルオロ酢酸塩（化合物ＳＳ０５）（３３５．６ｍｇ、７１％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　５９４　（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．４１分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０１）

N2-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)-N6-(4-(4-ブロモベンズアミド)-1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(ヒドロキシメチル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソール-4-イル)ピリミジン-2(1H)-イリデン)-L-リシン化合物 2,2,2-トリフルオロ酢酸塩（化合物ＳＳ０６）の合成

　N6-(4-(4-ブロモベンズアミド)-1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(ヒドロキシメチル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソール-4-イル)ピリミジン-2(1H)-イリデン)-L-リシン化合物 2,2,2-トリフルオロ酢酸塩（化合物ＳＳ０５）（３１１．１２ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）および炭酸 (2,5-ジオキソピロリジン-1-イル) (9H-フルオレン-9-イル)メチル（１４８．０９ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）を１，４－ジオキサン（２．７５ｍｌ）と超純水（１．６５ｍｌ）の混合溶媒に室温にて溶解し、混合物を氷浴で冷却後炭酸ナトリウム（１８６．２２ｍｇ、１．７６ｍｍｏｌ）を加えて室温に昇温後室温で２時間攪拌した。反応液を濃縮し、残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％ＴＦＡ水溶液／０．０５％ＴＦＡアセトニトリル溶液）にて精製し、N2-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)-N6-(4-(4-ブロモベンズアミド)-1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(ヒドロキシメチル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソール-4-イル)ピリミジン-2(1H)-イリデン)-L-リシン化合物 2,2,2-トリフルオロ酢酸塩（化合物ＳＳ０６）（３２８．７８ｍｇ、８０％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　８１６　（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．６８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０１）

メチル N2-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)-N6-(4-(4-ブロモベンズアミド)-1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(ヒドロキシメチル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソール-4-イル)ピリミジン-2(1H)-イリデン)-L-リシナート 2,2,2-トリフルオロアセタート(化合物ＳＳ０７)の合成

　窒素雰囲気下、N2-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)-N6-(4-(4-ブロモベンズアミド)-1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(ヒドロキシメチル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソール-4-イル)ピリミジン-2(1H)-イリデン)-L-リシン化合物 2,2,2-トリフルオロ酢酸塩（化合物ＳＳ０６）（４３８．６０ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（４．７１ｍｌ）に室温にて溶解し、混合物を氷浴で冷却後N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド（２２１．４０μｌ、１．４１ｍｍｏｌ）、メタノール（３８２．０７μｌ、９．４２ｍｍｏｌ）およびN,N-ジメチル-4-アミノピリジン（１１．５１ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）を加えて室温に昇温後室温で２時間攪拌した。反応液を濃縮し、残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％ＴＦＡ水溶液／０．０５％ＴＦＡアセトニトリル溶液）にて精製し、メチル N2-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)-N6-(4-(4-ブロモベンズアミド)-1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(ヒドロキシメチル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソール-4-イル)ピリミジン-2(1H)-イリデン)-L-リシナート 2,2,2-トリフルオロアセタート（化合物ＳＳ０７）（４０５．００ｍｇ、９１％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　８２８　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．７６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）

メチル N2-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)-N6-(4-(4-ブロモベンズアミド)-1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル)ピリミジン-2(1H)-イリデン)-L-リシナート 2,2,2-トリフルオロアセタート（化合物ＳＳ０８）の合成

　メチル N2-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)-N6-(4-(4-ブロモベンズアミド)-1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(ヒドロキシメチル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソール-4-イル)ピリミジン-2(1H)-イリデン)-L-リシナート 2,2,2-トリフルオロアセタート（化合物ＳＳ０７）（３０８．７０ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）をＴＦＡ（８．７１ｍｌ）と超純水（４．３６ｍｌ）の混合溶媒に氷浴で冷却しながら溶解し、混合物を室温で４５分間攪拌した。反応液を濃縮し、粗生成物メチル N2-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)-N6-(4-(4-ブロモベンズアミド)-1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル)ピリミジン-2(1H)-イリデン)-L-リシナート 2,2,2-トリフルオロアセタート（化合物ＳＳ０８）（２９６．００ｍｇ）を得た。得られた粗生成物メチル N2-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)-N6-(4-(4-ブロモベンズアミド)-1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル)ピリミジン-2(1H)-イリデン)-L-リシナート 2,2,2-トリフルオロアセタート（化合物ＳＳ０８）をそのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　７９０　（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）

メチル N2-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)-N6-(4-(4-ブロモベンズアミド)-1-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-ヒドロキシテトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)ピリミジン-2(1H)-イリデン)-L-リシナート（化合物ＳＳ０９）の合成

　窒素雰囲気下、前工程にて得られた粗生成物メチル N2-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)-N6-(4-(4-ブロモベンズアミド)-1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル)ピリミジン-2(1H)-イリデン)-L-リシナート 2,2,2-トリフルオロアセタート（化合物ＳＳ０８）（２９６．００ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（３．２７ｍｌ）に室温にて溶解し、混合物を氷浴で冷却後ビス(トリフルオロメタンスルホン酸)ジ-tert-ブチルシリル（２１１．８０μｌ、０．６５ｍｍｏｌ）を加えて氷浴下で１時間攪拌した。さらにビス(トリフルオロメタンスルホン酸)ジ-tert-ブチルシリル（１５８．８５μｌ、０．４９ｍｍｏｌ）を加え、氷浴下で３０分間攪拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ＤＣＭで得られた混合物の抽出操作を行い有機層を飽和食塩水で洗浄した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過後、減圧濃縮した。得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ノルマルヘキサン／酢酸エチル、ジクロロメタン／メタノール）にて精製し、メチル N2-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)-N6-(4-(4-ブロモベンズアミド)-1-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-ヒドロキシテトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)ピリミジン-2(1H)-イリデン)-L-リシナート（化合物ＳＳ０９）（２７３．８０ｍｇ、９０％、２ｓｔｅｐｓ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　９２８．５　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．９２分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）

メチル N2-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)-N6-(4-(4-ブロモ-N-(((トリイソプロピルシリル)オキシ)メチル)ベンズアミド)-1-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-(((トリイソプロピルシリル)オキシ)メトキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)ピリミジン-2(1H)-イリデン)-L-リシナート（化合物ＳＳ１０）の合成

　窒素雰囲気下、メチル N2-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)-N6-(4-(4-ブロモベンズアミド)-1-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-ヒドロキシテトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)ピリミジン-2(1H)-イリデン)-L-リシナート（化合物ＳＳ０９）（３８６．１５ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（８．３０ｍｌ）に室温にて溶解し、ＤＩＰＥＡ（７２２．８８μｌ、４．１５ｍｍｏｌ）および塩化 (トリイソプロピルシロキシ)メチル（４８１．４０μｌ、２．０７ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を４５℃で３時間撹拌後、室温に戻しＤＩＰＥＡ（７２２．８８μｌ、４．１５ｍｍｏｌ）および塩化 (トリイソプロピルシロキシ)メチル（４８１．４０μｌ、２．０７ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を４５℃で４時間攪拌した。室温に戻し、ＤＭＳＯを加えた後に窒素を吹き付けＤＣＭを除き、得られたＤＭＳＯ溶液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％ＴＦＡ水溶液／０．０５％ＴＦＡアセトニトリル溶液）にて精製した。得られたフラクションを飽和炭酸水素ナトリウムで中和し、酢酸エチルで目的化合物の抽出操作を行った。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過後、減圧濃縮し、メチル N2-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)-N6-(4-(4-ブロモ-N-(((トリイソプロピルシリル)オキシ)メチル)ベンズアミド)-1-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-(((トリイソプロピルシリル)オキシ)メトキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)ピリミジン-2(1H)-イリデン)-L-リシナート（化合物ＳＳ１０）（２９１．５５ｍｇ、５４％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　１３０３　（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．８４分（分析条件ＳＱＤＦＡ５０）

メチル N2-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)-N6-(4-(4-ブロモ-N-(((トリイソプロピルシリル)オキシ)メチル)ベンズアミド)-1-((2R,3R,4R,5R)-4-ヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)-3-(((トリイソプロピルシリル)オキシ)メトキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)ピリミジン-2(1H)-イリデン)-L-リシナート（化合物ＳＳ１１）の合成

　窒素雰囲気下、メチル N2-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)-N6-(4-(4-ブロモ-N-(((トリイソプロピルシリル)オキシ)メチル)ベンズアミド)-1-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-(((トリイソプロピルシリル)オキシ)メトキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)ピリミジン-2(1H)-イリデン)-L-リシナート（化合物ＳＳ１０）（１４１．５５ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２．１７ｍｌ）に室温にて溶解し、―８０℃に冷却した。フッ化水素ピリジンコンプレックス（～３０％ピリジン、～７０％フッ化水素）（９．８５μｌ）をピリジン（１３４．４１μｌ）で希釈したものを―８０℃で加え、反応混合物を―１５℃で１５分間撹拌した。―８０℃に冷却後、メトキシトリメチルシラン（７．０ｍｌ）を加え、得られた混合物を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％ＴＦＡ水溶液／０．０５％ＴＦＡアセトニトリル溶液）にて精製した。得られたフラクションを飽和炭酸水素ナトリウムで中和し、酢酸エチルで目的化合物の抽出操作を行った。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過後、トルエンを加えて減圧濃縮し、粗生成物メチル N2-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)-N6-(4-(4-ブロモ-N-(((トリイソプロピルシリル)オキシ)メチル)ベンズアミド)-1-((2R,3R,4R,5R)-4-ヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)-3-(((トリイソプロピルシリル)オキシ)メトキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)ピリミジン-2(1H)-イリデン)-L-リシナート（化合物ＳＳ１１）（６１．５３ｍｇ）を得た。得られた粗生成物メチル N2-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)-N6-(4-(4-ブロモ-N-(((トリイソプロピルシリル)オキシ)メチル)ベンズアミド)-1-((2R,3R,4R,5R)-4-ヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)-3-(((トリイソプロピルシリル)オキシ)メトキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)ピリミジン-2(1H)-イリデン)-L-リシナート（化合物ＳＳ１１）をそのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　１１６２．８　（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：３．６９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）

メチル N2-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)-N6-(1-((2R,3R,4R,5R)-4-((ビス(2-シアノエトキシ)ホスホリル)オキシ)-5-(((ビス(2-シアノエトキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-3-(((トリイソプロピルシリル)オキシ)メトキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)-4-(4-ブロモ-N-(((トリイソプロピルシリル)オキシ)メチル)ベンズアミド)ピリミジン-2(1H)-イリデン)-L-リシナート（化合物ＳＳ１２）の合成

　窒素雰囲気下、粗生成物メチル N2-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)-N6-(4-(4-ブロモ-N-(((トリイソプロピルシリル)オキシ)メチル)ベンズアミド)-1-((2R,3R,4R,5R)-4-ヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)-3-(((トリイソプロピルシリル)オキシ)メトキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)ピリミジン-2(1H)-イリデン)-L-リシナート（化合物ＳＳ１１）（６１．５３ｍｇ、０．０５３ｍｍｏｌ）および１Ｈ―テトラゾール（４４．４８ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（３．５３ｍｌ）に室温にて溶解し、混合物を氷浴で冷却後ビス(2-シアノエチル)-N,N-ジイソプロピルアミノホスホルアミジット（８２．７７μｌ、０．３２ｍｍｏｌ）を加えて室温に昇温後室温で３時間攪拌した。tert-ブチルヒドロペルオキシド, 5-6M in デカン（３０３．９２μｌ、３．１７ｍｍｏｌ）を加えて室温で１０分間攪拌した後に、反応液を濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ノルマルヘキサン／酢酸エチル、ジクロロメタン／メタノール）にて精製し、粗生成物メチル N2-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)-N6-(1-((2R,3R,4R,5R)-4-((ビス(2-シアノエトキシ)ホスホリル)オキシ)-5-(((ビス(2-シアノエトキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-3-(((トリイソプロピルシリル)オキシ)メトキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)-4-(4-ブロモ-N-(((トリイソプロピルシリル)オキシ)メチル)ベンズアミド)ピリミジン-2(1H)-イリデン)-L-リシナート（化合物ＳＳ１２）（５４．３３ｍｇ）を得た。得られた粗生成物メチル N2-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)-N6-(1-((2R,3R,4R,5R)-4-((ビス(2-シアノエトキシ)ホスホリル)オキシ)-5-(((ビス(2-シアノエトキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-3-(((トリイソプロピルシリル)オキシ)メトキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)-4-(4-ブロモ-N-(((トリイソプロピルシリル)オキシ)メチル)ベンズアミド)ピリミジン-2(1H)-イリデン)-L-リシナート（化合物ＳＳ１２）をそのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　１５３４．９　（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：３．６２分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）

N6-(1-((2R,3R,4R,5R)-4-(ホスホノオキシ)-5-((ホスホノオキシ)メチル)-3-(((トリイソプロピルシリル)オキシ)メトキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)-4-((((トリイソプロピルシリル)オキシ)メチル)アミノ)ピリミジン-2(1H)-イリデン)-L-リシン（化合物ＳＳ１３）の合成

　窒素雰囲気下、粗生成物メチル N2-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)-N6-(1-((2R,3R,4R,5R)-4-((ビス(2-シアノエトキシ)ホスホリル)オキシ)-5-(((ビス(2-シアノエトキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-3-(((トリイソプロピルシリル)オキシ)メトキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)-4-(4-ブロモ-N-(((トリイソプロピルシリル)オキシ)メチル)ベンズアミド)ピリミジン-2(1H)-イリデン)-L-リシナート（化合物ＳＳ１２）（５４．３３ｍｇ、０．０３５ｍｍｏｌ）をピリジン（２．３６ｍｌ）に室温にて溶解し、ビス-(トリメチルシリル)アセトアミド（３４５．９８μｌ、１．４２ｍｍｏｌ）およびＤＢＵ（８４．６４μｌ、０．５７ｍｍｏｌ）を加えて室温で４５分間攪拌した。反応液に超純水を加え、ジエチルエーテルおよびノルマルヘキサンで洗浄した。得られた水層にトルエンおよびアセトニトリルを加えて減圧濃縮し、粗生成物N6-(1-((2R,3R,4R,5R)-4-(ホスホノオキシ)-5-((ホスホノオキシ)メチル)-3-(((トリイソプロピルシリル)オキシ)メトキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)-4-((((トリイソプロピルシリル)オキシ)メチル)アミノ)ピリミジン-2(1H)-イリデン)-L-リシン（化合物ＳＳ１３）を得た。得られた粗生成物N6-(1-((2R,3R,4R,5R)-4-(ホスホノオキシ)-5-((ホスホノオキシ)メチル)-3-(((トリイソプロピルシリル)オキシ)メトキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)-4-((((トリイソプロピルシリル)オキシ)メチル)アミノ)ピリミジン-2(1H)-イリデン)-L-リシン（化合物ＳＳ１３）をそのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　９０４．７　（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）

N6-(4-アミノ-1-((2R,3R,4S,5R)-3-ヒドロキシ-4-(ホスホノオキシ)-5-((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-2-イル)ピリミジン-2(1H)-イリデン)-L-リシン（化合物ＳＳ０４、ｐＬｐ）の合成

　粗生成物メチルN6-(1-((2R,3R,4R,5R)-4-(ホスホノオキシ)-5-((ホスホノオキシ)メチル)-3-(((トリイソプロピルシリル)オキシ)メトキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)-4-((((トリイソプロピルシリル)オキシ)メチル)アミノ)ピリミジン-2(1H)-イリデン)-L-リシン（化合物ＳＳ１３）をアセトニトリル（８８５μｌ）と超純水（８８５μｌ）の混合溶媒に室温にて溶解し、フッ化アンモニウム（１５．７３ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）を加えて６０℃で２．５時間攪拌した。室温に戻し、フッ化アンモニウム（１５．７３ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）を追加し６０℃で１時間攪拌した。室温に戻し、窒素を吹き付けアセトニトリルを除き、得られた水溶液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１５ｍＭ　ＴＥＡと４００ｍＭ　ＨＦＩＰの水溶液／１５ｍＭ　ＴＥＡと４００ｍＭ　ＨＦＩＰのメタノール溶液）にて精製し、N6-(4-アミノ-1-((2R,3R,4S,5R)-3-ヒドロキシ-4-(ホスホノオキシ)-5-((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-2-イル)ピリミジン-2(1H)-イリデン)-L-リシン（化合物ＳＳ０４、ｐＬｐ）の水溶液（１００μｌ、１７．２０ｍＭ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　５３０　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：１．６４分（分析条件ＬＴＱＴＥＡ／ＨＦＩＰ０５＿０２）

実施例３．ligation法によりtRNA断片の3’末端にLysidineユニットを導入するためのLysidine-diphosphateの合成　別法
　tRNA断片の3’末端にLysidineユニットをligation法により導入するために用いるLysidineのdiphosphateの合成法を改良した。すなわち、以下のスキームに従い、Lysidine-diphosphate（ＳＳ０４、ｐＬｐ）を合成した。

((3aR,4R,12R,12aR)-2,2-ジメチル-3a,4,12,12a-テトラヒドロ-5H,8H-4,12-エポキシ[1,3]ジオキソロ[4,5-e]ピリミド[2,1-b][1,3]オキサゾシン-8-イリデン)カルバミン酸ベンジル（化合物ＳＳ２４）の合成

　窒素雰囲気下、文献（Antiviral Chemistry & Chemotherapy, 2003, 14(4), 183-194）既知化合物2’,3’-O-イソプロピリデン-4-N-(ベンジル-オキシ-カルボニル)-シチジン（７１８．２ｍｇ、１．７２ｍｍｏｌ）およびトリフェニルホスフィン（４７４ｍｇ、１．８１ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＣＭ（１７．２ｍＬ）を添加した。混合物を氷浴で冷却後、アゾジカルボン酸ジイソプロピル（３８５μＬ、１．９８ｍｍｏｌ）を加えて室温に昇温後室温で１．５時間攪拌した。反応液を濃縮し、トルエン（２０ｍＬ）を加えたのち、生じた沈殿物をろ過により回収した。トルエンを用いて得られた固体を３回洗浄し、((3aR,4R,12R,12aR)-2,2-ジメチル-3a,4,12,12a-テトラヒドロ-5H,8H-4,12-エポキシ[1,3]ジオキソロ[4,5-e]ピリミド[2,1-b][1,3]オキサゾシン-8-イリデン)カルバミン酸ベンジル（化合物ＳＳ２４）（５２５．７ｍｇ、７６％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　４００．３　（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．４８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）

ベンジル (2S)-6-[[1-[(3aR,4R,6R,6aR)-6-(ヒドロキシメチル)-2,2-ジメチル-3a,4,6,6a-テトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソール-4-イル]-4-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)ピリミジン-2-イリデン]アミノ]-2-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)ヘキサノアート;2,2,2-トリフルオロ酢酸（化合物ＳＳ２５）の合成

　窒素雰囲気下、((3aR,4R,12R,12aR)-2,2-ジメチル-3a,4,12,12a-テトラヒドロ-5H,8H-4,12-エポキシ[1,3]ジオキソロ[4,5-e]ピリミド[2,1-b][1,3]オキサゾシン-8-イリデン)カルバミン酸ベンジル（化合物ＳＳ２４）（３００ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ）および塩化リチウム（１５９ｍｇ、３．７６ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＴＨＦ（７．５ｍＬ）を添加し氷浴で冷却した。その混合物に、ベンジル ((ベンジルオキシ)カルボニル)-L-リシナートベンゼンスルホナート（８１３ｍｇ、２．０１ｍｍｏｌ）およびＤＢＵ（６７３μＬ、４．５１ｍｍｏｌ）の混合物にＴＨＦ（７．５ｍＬ）を加えたものを氷浴下で添加し、反応混合物を０℃で３０分間撹拌した。反応液に氷浴下でＤＭＳＯを加え、室温に昇温後反応液を濃縮しＴＨＦを留去した。残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％ＴＦＡ水溶液／０．０５％ＴＦＡアセトニトリル溶液）にて精製し、ベンジル (2S)-6-[[1-[(3aR,4R,6R,6aR)-6-(ヒドロキシメチル)-2,2-ジメチル-3a,4,6,6a-テトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソール-4-イル]-4-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)ピリミジン-2-イリデン]アミノ]-2-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)ヘキサノアート;2,2,2-トリフルオロ酢酸（化合物ＳＳ２５）（７２６．６ｍｇ）を定量的に得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　７６８．６　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．７４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）

ベンジル (2S)-2-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)-6-[[4-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)-1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル]ピリミジン-2-イリデン]アミノ]ヘキサノアート;2,2,2-トリフルオロ酢酸（化合物ＳＳ２６）の合成

　ベンジル (2S)-6-[[1-[(3aR,4R,6R,6aR)-6-(ヒドロキシメチル)-2,2-ジメチル-3a,4,6,6a-テトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソール-4-イル]-4-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)ピリミジン-2-イリデン]アミノ]-2-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)ヘキサノアート;2,2,2-トリフルオロ酢酸（化合物ＳＳ２５）（２８１．１ｍｇ、０．３１８ｍｍｏｌ）をＴＦＡ（４．２４ｍＬ）と超純水（２．１２ｍＬ）の混合溶媒に氷浴で冷却しながら溶解し、混合物を室温で５０分間攪拌した。トルエンおよびアセトニトリルを加え反応液を濃縮した。この操作を数回繰り返して水およびＴＦＡを留去し、粗生成物ベンジル (2S)-2-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)-6-[[4-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)-1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル]ピリミジン-2-イリデン]アミノ]ヘキサノアート;2,2,2-トリフルオロ酢酸（化合物ＳＳ２６）（２７２．６ｍｇ）を得た。得られた粗生成物ベンジル (2S)-2-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)-6-[[4-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)-1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル]ピリミジン-2-イリデン]アミノ]ヘキサノアート;2,2,2-トリフルオロ酢酸（化合物ＳＳ２６）をそのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　７２８．５　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．６９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）

ベンジル (2S)-6-[[1-[(4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジテルト-ブチル-7-ヒドロキシ-4a,6,7,7a-テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル]-4-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)ピリミジン-2-イリデン]アミノ]-2-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)ヘキサノアート;2,2,2-トリフルオロ酢酸（化合物ＳＳ２７）の合成

　窒素雰囲気下、前工程にて得られた粗生成物ベンジル (2S)-2-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)-6-[[4-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)-1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル]ピリミジン-2-イリデン]アミノ]ヘキサノアート;2,2,2-トリフルオロ酢酸（化合物ＳＳ２６）（２５８ｍｇ、０．３０６ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（３．０６ｍＬ）に溶解し、混合物を氷浴で冷却後ビス(トリフルオロメタンスルホン酸)ジ-tert-ブチルシリル（３９６μｌ、１．２２ｍｍｏｌ）を加えて氷浴下で２時間攪拌した。反応液に氷浴下で飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、得られた混合物を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％ＴＦＡ水溶液／０．０５％ＴＦＡアセトニトリル溶液）にて精製し、ベンジル (2S)-6-[[1-[(4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジテルト-ブチル-7-ヒドロキシ-4a,6,7,7a-テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル]-4-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)ピリミジン-2-イリデン]アミノ]-2-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)ヘキサノアート;2,2,2-トリフルオロ酢酸（化合物ＳＳ２７）（２３４．０ｍｇ、７８％、２ｓｔｅｐｓ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　８６８．８　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．８８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）

ベンジル (2S)-6-[[1-[(4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジテルト-ブチル-7-テトラヒドロピラン-2-イルオキシ-4a,6,7,7a-テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル]-4-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)ピリミジン-2-イリデン]アミノ]-2-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)ヘキサノアート;2,2,2-トリフルオロ酢酸（化合物ＳＳ２８）の合成

　窒素雰囲気下、ベンジル (2S)-6-[[1-[(4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジテルト-ブチル-7-ヒドロキシ-4a,6,7,7a-テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル]-4-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)ピリミジン-2-イリデン]アミノ]-2-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)ヘキサノアート;2,2,2-トリフルオロ酢酸（化合物ＳＳ２７）（３０ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）およびＴＦＡ（６．９８μＬ、０．０９ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（６１０μＬ）に室温にて溶解し、3,4-ジヒドロ-2H-ピラン（８３μＬ、０．９１５ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で１３時間撹拌後、トルエンを加え反応液を濃縮し、粗生成物ベンジル (2S)-6-[[1-[(4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジテルト-ブチル-7-テトラヒドロピラン-2-イルオキシ-4a,6,7,7a-テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル]-4-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)ピリミジン-2-イリデン]アミノ]-2-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)ヘキサノアート;2,2,2-トリフルオロ酢酸（化合物ＳＳ２８）をＴＨＰ保護上の不斉炭素に由来するジアステレオマー混合物として得た。得られた粗生成物ベンジル (2S)-6-[[1-[(4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジテルト-ブチル-7-テトラヒドロピラン-2-イルオキシ-4a,6,7,7a-テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル]-4-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)ピリミジン-2-イリデン]アミノ]-2-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)ヘキサノアート;2,2,2-トリフルオロ酢酸（化合物ＳＳ２８）をそのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　９５２．８　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：３．１７分、３．３８分（分析条件ＳＱＤＡＡ５０ｌｏｎｇ）

(2S)-2-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)-6-[[4-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)-1-[(2R,3R,4R,5R)-4-ヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)-3-テトラヒドロピラン-2-イルオキシ-テトラヒドロフラン-2-イル]ピリミジン-2-イリデン]アミノ]ヘキサン酸ベンジル（化合物ＳＳ２９）の合成

　窒素雰囲気下、前工程にて得られた粗生成物ベンジル (2S)-6-[[1-[(4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジテルト-ブチル-7-テトラヒドロピラン-2-イルオキシ-4a,6,7,7a-テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル]-4-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)ピリミジン-2-イリデン]アミノ]-2-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)ヘキサノアート;2,2,2-トリフルオロ酢酸（化合物ＳＳ２８）をＴＨＦ（６１０μＬ）に室温にて溶解し、テトラブチルアンモニウムフルオリド（～１ｍｏｌ／Ｌテトラヒドロフラン溶液）（３０５μＬ、～０．３０５ｍｍｏｌ）を室温で加え、反応混合物を室温で３０分間撹拌した。反応液にＤＭＳＯを加えて濃縮しＴＨＦを留去した。残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０ｍＭ　ＡＡ水溶液／１０ｍＭ　ＡＡアセトニトリル溶液）にて精製し、(2S)-2-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)-6-[[4-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)-1-[(2R,3R,4R,5R)-4-ヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)-3-テトラヒドロピラン-2-イルオキシ-テトラヒドロフラン-2-イル]ピリミジン-2-イリデン]アミノ]ヘキサン酸ベンジル（化合物ＳＳ２９）（２１．５１ｍｇ、８７％、２ｓｔｅｐｓ）をＴＨＰ保護上の不斉炭素に由来するジアステレオマー混合物として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　８１２．７　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：１．７４分（分析条件ＳＱＤＡＡ５０ｌｏｎｇ）

(2S)-2-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)-6-[[4-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)-1-[(2R,3R,4R,5R)-4-ジベンジルオキシホスホリルオキシ-5-(ジベンジルオキシホスホリルオキシメチル)-3-テトラヒドロピラン-2-イルオキシ-テトラヒドロフラン-2-イル]ピリミジン-2-イリデン]アミノ]ヘキサン酸ベンジル（化合物ＳＳ３０）の合成

　窒素雰囲気下、(2S)-2-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)-6-[[4-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)-1-[(2R,3R,4R,5R)-4-ヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)-3-テトラヒドロピラン-2-イルオキシ-テトラヒドロフラン-2-イル]ピリミジン-2-イリデン]アミノ]ヘキサン酸ベンジル（化合物ＳＳ２９）（２１．５１ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ）および１Ｈ―テトラゾール（２２．２２ｍｇ、０．３１７ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１．０６ｍＬ）に室温にて溶解し、ジベンジル N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト（５３．２μｌ、０．１５９ｍｍｏｌ）を加えて室温で１時間攪拌した。デス-マーチンペルヨージナン（１３５ｍｇ、０．３１７ｍｍｏｌ）を加えて室温で１５分間攪拌した後に、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０ｍＭ　ＡＡ水溶液／１０ｍＭ　ＡＡアセトニトリル溶液）にて精製し、(2S)-2-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)-6-[[4-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)-1-[(2R,3R,4R,5R)-4-ジベンジルオキシホスホリルオキシ-5-(ジベンジルオキシホスホリルオキシメチル)-3-テトラヒドロピラン-2-イルオキシ-テトラヒドロフラン-2-イル]ピリミジン-2-イリデン]アミノ]ヘキサン酸ベンジル（化合物ＳＳ３０）（３６．５９ｍｇ、２ｓｔｅｐｓ）をＴＨＰ保護上の不斉炭素に由来するジアステレオマー混合物として定量的に得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　１３３２．８　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：３．０８分、３．１１分（分析条件ＳＱＤＡＡ５０ｌｏｎｇ）

(2S)-2-アミノ-6-[[4-アミノ-1-[(2R,3R,4S,5R)-3-ヒドロキシ-4-ホスホノオキシ-5-(ホスホノオキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル]ピリミジン-2-イリデン]アミノ]ヘキサン酸（化合物ＳＳ０４、ｐＬｐ）の合成

　(2S)-2-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)-6-[[4-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)-1-[(2R,3R,4R,5R)-4-ジベンジルオキシホスホリルオキシ-5-(ジベンジルオキシホスホリルオキシメチル)-3-テトラヒドロピラン-2-イルオキシ-テトラヒドロフラン-2-イル]ピリミジン-2-イリデン]アミノ]ヘキサン酸ベンジル（化合物ＳＳ３０）（３６．５９ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）をメタノール（６４９μＬ）と超純水（１５２μＬ）の混合溶媒に室温にて溶解し、窒素雰囲気下でパラジウム / 炭素 (Pd 10%)（５．８４ｍｇ、５．４８μｍｏｌ）を加えた。水素雰囲気下、室温で１８時間攪拌した。反応液をセライトろ過し、超純水を用いて数回洗浄した。得られたろ液（２４．６６ｍＬ）に１ｍｏｌ／Ｌ塩酸（２．７４ｍＬ、２．７４ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１時間静置した。反応液をセライトろ過し、超純水を用いて数回洗浄した。ろ液を凍結乾燥したのち得られた粉体を再度超純水（１．５２ｍＬ）を用いて溶解し、遠心分離を行い上澄みを回収することで (2S)-2-アミノ-6-[[4-アミノ-1-[(2R,3R,4S,5R)-3-ヒドロキシ-4-ホスホノオキシ-5-(ホスホノオキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル]ピリミジン-2-イリデン]アミノ]ヘキサン酸（化合物ＳＳ０４、ｐＬｐ）の水溶液（１．３７ｍＬ、１７．４７ｍＭ、８７％、２ｓｔｅｐｓ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　５３０．１　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：１．６０分（分析条件ＬＴＱＴＥＡ／ＨＦＩＰ０５＿０２）
　実施例２にて合成した化合物ＳＳ０４を分析してから実施例３にて合成した化合物ＳＳ０４を分析するまでの間にカラムの交換を実施している。実施例２にて合成した化合物ＳＳ０４をカラム交換後に再分析し、実施例３にて合成した化合物ＳＳ０４と同一であることを確認した。その結果を以下に示す。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　５３０．１　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：１．６０分（分析条件ＬＴＱＴＥＡ／ＨＦＩＰ０５＿０２）

実施例４．ligation法によりtRNA断片の3’末端にAgmatidineユニットを導入するためのAgmatidine-diphosphateの合成
　tRNA断片の3’末端にAgmatidineユニットをligation法により導入するために、Agmatidineのdiphosphateを合成した。すなわち、以下のスキームに従い、Agmatidine-diphosphate（ＳＳ３１、ｐ（Ａｇｍ）ｐ）を合成した。

ベンジル N-[(4-アミノブチルアミノ)-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)メチレン]カルバマート;塩酸塩（化合物ＳＳ３２）の合成

　窒素雰囲気下、文献（Chemistry A European Journal, 2015, 21(26), 9370-9379）既知化合物N-[ベンジルオキシカルボニルアミノ-[4-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)ブチルアミノ]メチレン]カルバミン酸ベンジル（２４１ｍｇ、０．４８３ｍｍｏｌ）に氷浴下にて４Ｎ－ＨＣｌ／１，４－Ｄｉｏｘａｎｅ（３．６３ｍＬ）を添加し、室温に昇温後２０分間攪拌した。ｎ－ヘキサンを加えたのち、反応液を濃縮しベンジル N-[(4-アミノブチルアミノ)-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)メチレン]カルバマート;塩酸塩（化合物ＳＳ３２）（２５６．５ｍｇ）を定量的に得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　３９９．４　（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．６１分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）

ベンジル N-[[4-[[1-[(3aR,4R,6R,6aR)-6-(ヒドロキシメチル)-2,2-ジメチル-3a,4,6,6a-テトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソール-4-イル]-4-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)ピリミジン-2-イリデン]アミノ]ブチルアミノ]-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)メチレン]カルバマート;2,2,2-トリフルオロ酢酸（化合物ＳＳ３３）の合成

　窒素雰囲気下、ベンジル N-[(4-アミノブチルアミノ)-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)メチレン]カルバマート;塩酸塩（ＳＳ３２）（６５．１ｍｇ、０．１５０ｍｍｏｌ）およびＤＢＵ（１１２μＬ、０．７４８ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＴＨＦ（０．９９８ｍＬ）を添加し氷浴で冷却した。その混合物に、((3aR,4R,12R,12aR)-2,2-ジメチル-3a,4,12,12a-テトラヒドロ-5H,8H-4,12-エポキシ[1,3]ジオキソロ[4,5-e]ピリミド[2,1-b][1,3]オキサゾシン-8-イリデン)カルバミン酸ベンジル（化合物ＳＳ２４）（４９．８ｍｇ、０．１２５ｍｍｏｌ）および塩化リチウム（２６．４ｍｇ、０．６２４ｍｍｏｌ）の混合物にＴＨＦ（１．４９７ｍＬ）を加えたものを氷浴下で添加し、反応混合物を超音波洗浄機で粉砕後氷浴下で６０分間撹拌した。反応液に氷浴下でＤＭＳＯを加え、室温に昇温後反応液を濃縮しＴＨＦを留去した。残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％ＴＦＡ水溶液／０．０５％ＴＦＡアセトニトリル溶液）にて精製し、ベンジル N-[[4-[[1-[(3aR,4R,6R,6aR)-6-(ヒドロキシメチル)-2,2-ジメチル-3a,4,6,6a-テトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソール-4-イル]-4-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)ピリミジン-2-イリデン]アミノ]ブチルアミノ]-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)メチレン]カルバマート;2,2,2-トリフルオロ酢酸（化合物ＳＳ３３）（７４．０ｍｇ、６５％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　７９６．６　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．７８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）

ベンジル N-[ベンジルオキシカルボニルアミノ-[4-[[4-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)-1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル]ピリミジン-2-イリデン]アミノ]ブチルアミノ]メチレン]カルバマート;2,2,2-トリフルオロ酢酸（化合物ＳＳ３４）の合成

　ベンジル N-[[4-[[1-[(3aR,4R,6R,6aR)-6-(ヒドロキシメチル)-2,2-ジメチル-3a,4,6,6a-テトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソール-4-イル]-4-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)ピリミジン-2-イリデン]アミノ]ブチルアミノ]-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)メチレン]カルバマート;2,2,2-トリフルオロ酢酸（化合物ＳＳ３３）（１０９．５ｍｇ、０．１２０ｍｍｏｌ）をＴＦＡ（１．６０ｍＬ）と超純水（０．８０ｍＬ）の混合溶媒に氷浴で冷却しながら溶解し、混合物を室温で４５分間攪拌した。トルエンを加え反応液を濃縮する操作を数回繰り返して水およびＴＦＡを留去し、粗生成物ベンジル N-[ベンジルオキシカルボニルアミノ-[4-[[4-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)-1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル]ピリミジン-2-イリデン]アミノ]ブチルアミノ]メチレン]カルバマート;2,2,2-トリフルオロ酢酸（化合物ＳＳ３４）（１０５ｍｇ）を得た。得られた粗生成物ベンジル N-[ベンジルオキシカルボニルアミノ-[4-[[4-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)-1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル]ピリミジン-2-イリデン]アミノ]ブチルアミノ]メチレン]カルバマート;2,2,2-トリフルオロ酢酸（化合物ＳＳ３４）をそのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　７５６．５　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．７１分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）

ベンジル N-[[4-[[1-[(4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジテルト-ブチル-7-ヒドロキシ-4a,6,7,7a-テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル]-4-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)ピリミジン-2-イリデン]アミノ]ブチルアミノ]-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)メチレン]カルバマート;2,2,2-トリフルオロ酢酸（化合物ＳＳ３５）の合成

　窒素雰囲気下、前工程にて得られた粗生成物ベンジル N-[ベンジルオキシカルボニルアミノ-[4-[[4-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)-1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル]ピリミジン-2-イリデン]アミノ]ブチルアミノ]メチレン]カルバマート;2,2,2-トリフルオロ酢酸（化合物ＳＳ３４）（１０５ｍｇ、０．１２０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１．２０ｍＬ）に溶解し、混合物を氷浴で冷却後ビス(トリフルオロメタンスルホン酸)ジ-tert-ブチルシリル（７８μＬ、０．２４１ｍｍｏｌ）を加えて氷浴下で１時間攪拌した。さらにビス(トリフルオロメタンスルホン酸)ジ-tert-ブチルシリル（７８μＬ、０．２４１ｍｍｏｌ）を加え、氷浴下で３０分間攪拌した。さらにビス(トリフルオロメタンスルホン酸)ジ-tert-ブチルシリル（１９．５μＬ、０．０６０ｍｍｏｌ）を加え、氷浴下で１５分間攪拌した。反応液に氷浴下で飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、得られた混合物を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％ＴＦＡ水溶液／０．０５％ＴＦＡアセトニトリル溶液）にて精製し、ベンジル N-[[4-[[1-[(4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジテルト-ブチル-7-ヒドロキシ-4a,6,7,7a-テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル]-4-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)ピリミジン-2-イリデン]アミノ]ブチルアミノ]-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)メチレン]カルバマート;2,2,2-トリフルオロ酢酸（化合物ＳＳ３５）（１０８．０２ｍｇ、８９％、２ｓｔｅｐｓ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　８９６．７　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．９１分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）

ベンジル N-[[4-[[1-[(4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジテルト-ブチル-7-テトラヒドロピラン-2-イルオキシ-4a,6,7,7a-テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル]-4-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)ピリミジン-2-イリデン]アミノ]ブチルアミノ]-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)メチレン]カルバマート;2,2,2-トリフルオロ酢酸（化合物ＳＳ３６）の合成

　窒素雰囲気下、ベンジル N-[[4-[[1-[(4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジテルト-ブチル-7-ヒドロキシ-4a,6,7,7a-テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル]-4-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)ピリミジン-2-イリデン]アミノ]ブチルアミノ]-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)メチレン]カルバマート;2,2,2-トリフルオロ酢酸（化合物ＳＳ３５）（６４．５１ｍｇ、０．０６４ｍｍｏｌ）および3,4-ジヒドロ-2H-ピラン（１７３μＬ、１．９１２ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１．２８ｍＬ）に溶解し、混合物を氷浴で冷却後ＴＦＡ（１４．６０μＬ、０．１９１ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温に昇温し２２．５時間撹拌後、トルエンを加え反応液を濃縮し、粗生成物ベンジル N-[[4-[[1-[(4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジテルト-ブチル-7-テトラヒドロピラン-2-イルオキシ-4a,6,7,7a-テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル]-4-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)ピリミジン-2-イリデン]アミノ]ブチルアミノ]-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)メチレン]カルバマート;2,2,2-トリフルオロ酢酸（化合物ＳＳ３６）をＴＨＰ保護上の不斉炭素に由来するジアステレオマー混合物として得た。得られた粗生成物ベンジル N-[[4-[[1-[(4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジテルト-ブチル-7-テトラヒドロピラン-2-イルオキシ-4a,6,7,7a-テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル]-4-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)ピリミジン-2-イリデン]アミノ]ブチルアミノ]-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)メチレン]カルバマート;2,2,2-トリフルオロ酢酸（化合物ＳＳ３６）をそのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　９８０．９　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：３．５１分、３．７２分（分析条件ＳＱＤＡＡ５０ｌｏｎｇ）

N-[ベンジルオキシカルボニルアミノ-[4-[[4-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)-1-[(2R,3R,4R,5R)-4-ヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)-3-テトラヒドロピラン-2-イルオキシ-テトラヒドロフラン-2-イル]ピリミジン-2-イリデン]アミノ]ブチルアミノ]メチレン]カルバミン酸ベンジル（化合物ＳＳ３７）の合成

　窒素雰囲気下、前工程にて得られた粗生成物ベンジル N-[[4-[[1-[(4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジテルト-ブチル-7-テトラヒドロピラン-2-イルオキシ-4a,6,7,7a-テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル]-4-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)ピリミジン-2-イリデン]アミノ]ブチルアミノ]-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)メチレン]カルバマート;2,2,2-トリフルオロ酢酸（化合物ＳＳ３６）をＴＨＦ（１．２８ｍＬ）に室温にて溶解し、混合物を氷浴で冷却後テトラブチルアンモニウムフルオリド（～１ｍｏｌ／Ｌテトラヒドロフラン溶液）（６３８μＬ、～０．６３８ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温に昇温し３０分間撹拌後、反応液にＤＭＳＯを加えて濃縮しＴＨＦを留去した。残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０ｍＭ　ＡＡ水溶液／１０ｍＭ　ＡＡアセトニトリル溶液）にて精製し、N-[ベンジルオキシカルボニルアミノ-[4-[[4-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)-1-[(2R,3R,4R,5R)-4-ヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)-3-テトラヒドロピラン-2-イルオキシ-テトラヒドロフラン-2-イル]ピリミジン-2-イリデン]アミノ]ブチルアミノ]メチレン]カルバミン酸ベンジル（化合物ＳＳ３７）（４０．６２ｍｇ、７６％、２ｓｔｅｐｓ）をＴＨＰ保護上の不斉炭素に由来するジアステレオマー混合物として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　８４０．７　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：２．２７分（分析条件ＳＱＤＡＡ５０ｌｏｎｇ）

N-[ベンジルオキシカルボニルアミノ-[4-[[4-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)-1-[(2R,3R,4R,5R)-4-ジベンジルオキシホスホリルオキシ-5-(ジベンジルオキシホスホリルオキシメチル)-3-テトラヒドロピラン-2-イルオキシ-テトラヒドロフラン-2-イル]ピリミジン-2-イリデン]アミノ]ブチルアミノ]メチレン]カルバミン酸ベンジル（化合物ＳＳ３８）の合成

　窒素雰囲気下、N-[ベンジルオキシカルボニルアミノ-[4-[[4-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)-1-[(2R,3R,4R,5R)-4-ヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)-3-テトラヒドロピラン-2-イルオキシ-テトラヒドロフラン-2-イル]ピリミジン-2-イリデン]アミノ]ブチルアミノ]メチレン]カルバミン酸ベンジル（化合物ＳＳ３７）（４０．６２ｍｇ、０．０４８ｍｍｏｌ）および１Ｈ―テトラゾール（４０．６ｍｇ、０．５７９ｍｍｏｌ）をトルエンに溶解し濃縮した。その残渣をアセトニトリル（１．９３ｍＬ）に室温にて溶解し、混合物を氷浴で冷却後ジベンジル N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト（９７μｌ、０．２８９ｍｍｏｌ）を加えて反応混合物を室温に昇温し２．５時間撹拌した。デス-マーチンペルヨージナン（２４６ｍｇ、０．５７９ｍｍｏｌ）を加えて室温で１５分間攪拌した後に、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０ｍＭ　ＡＡ水溶液／１０ｍＭ　ＡＡアセトニトリル溶液）にて精製し、N-[ベンジルオキシカルボニルアミノ-[4-[[4-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)-1-[(2R,3R,4R,5R)-4-ジベンジルオキシホスホリルオキシ-5-(ジベンジルオキシホスホリルオキシメチル)-3-テトラヒドロピラン-2-イルオキシ-テトラヒドロフラン-2-イル]ピリミジン-2-イリデン]アミノ]ブチルアミノ]メチレン]カルバミン酸ベンジル（化合物ＳＳ３８）（５９．６６ｍｇ、９１％、２ｓｔｅｐｓ）をＴＨＰ保護上の不斉炭素に由来するジアステレオマー混合物として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　１３６３．０　（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：４．１１分、４．１４分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５ｌｏｎｇ）

リン酸二水素 [(2R,3S,4R,5R)-5-[4-アミノ-2-(4-グアニジノブチルイミノ)ピリミジン-1-イル]-4-ヒドロキシ-2-(ホスホノオキシメチル)テトラヒドロフラン-3-イル]（化合物ＳＳ３１、ｐ（Ａｇｍ）ｐ）の合成

　N-[ベンジルオキシカルボニルアミノ-[4-[[4-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)-1-[(2R,3R,4R,5R)-4-ジベンジルオキシホスホリルオキシ-5-(ジベンジルオキシホスホリルオキシメチル)-3-テトラヒドロピラン-2-イルオキシ-テトラヒドロフラン-2-イル]ピリミジン-2-イリデン]アミノ]ブチルアミノ]メチレン]カルバミン酸ベンジル（化合物ＳＳ３８）（３０．５９ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）をメタノール（７２７μＬ）と超純水（１７１μＬ）の混合溶媒に室温にて溶解し、窒素雰囲気下でパラジウム / 炭素 (Pd 10%)（４．７８ｍｇ、４．４９μｍｏｌ）を加えた。水素雰囲気下、室温で７時間攪拌した。反応液をセライトろ過し、超純水を用いて数回洗浄した。得られたろ液（２５ｍＬ）に１ｍｏｌ／Ｌ塩酸（２．７８ｍＬ、２．７８ｍｍｏｌ）を加え、室温にて４５分間静置した。反応液を凍結乾燥したのちに得られた粉体を超純水を用いて溶解し、セライトろ過し超純水を用いて数回洗浄した。ろ液を凍結乾燥したのちに得られた粉体を超純水（１．７ｍＬ）を用いて溶解し、遠心分離を行い上澄みを回収することでリン酸二水素 [(2R,3S,4R,5R)-5-[4-アミノ-2-(4-グアニジノブチルイミノ)ピリミジン-1-イル]-4-ヒドロキシ-2-(ホスホノオキシメチル)テトラヒドロフラン-3-イル]（化合物ＳＳ３１、ｐ（Ａｇｍ）ｐ）の水溶液（１．６１ｍＬ、１２．１１ｍＭ、８７％、２ｓｔｅｐｓ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　５１４．１　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：１．５８分（分析条件ＬＴＱＴＥＡ／ＨＦＩＰ０５＿０２）

実施例５．無細胞翻訳系に用いるｐＣｐＡ-アミノ酸の合成
　以下のスキームに従い、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１４、ＳＳ１５、ＳＳ１６、ＳＳ３９、ＳＳ４０）を合成した。

(S)-1-(((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)ピペリジン-2-カルボン酸（化合物ＳＳ１７、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｐｉｃ２－ＯＨ）の合成

　窒素雰囲気下、(S)-ピペリジン-2-カルボン酸（４２．６ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）、特許文献（ＷＯ２０１８１４３１４５Ａ１）記載の方法で合成した炭酸－（４－ニトロフェニル）－４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル（化合物ｔｓ１１）（１４０ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＦ（３３０μＬ）を添加した。室温で５分撹拌した後、トリエチルアミン（１０５．６μＬ、２．２５ｍｍｏｌ）を０℃にて添加した。反応混合物を室温において３０分間撹拌したのち、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、(S)-1-(((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)ピペリジン-2-カルボン酸（化合物ＳＳ１７、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｐｉｃ２－ＯＨ）（９２ｍｇ、６７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　４１３　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．７０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０１）

(S)-ピペリジン-1,2-ジカルボン酸 1-(4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル) 2-(シアノメチル)（化合物ＳＳ１８、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｐｉｃ２－ＯＣＨ _２ＣＮ）の合成

　窒素雰囲気下、（(S)-1-(((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)ピペリジン-2-カルボン酸（化合物ＳＳ１７、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｐｉｃ２－ＯＨ）（３０ｍｇ、０．０７２ｍｍｏｌ）およびＮ－エチル－イソプロピルプロパン－２－アミン（ＤＩＰＥＡ）（２０．２３μＬ、０．１１６ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（９０μＬ）に溶解し、２－ブロモアセトニトリル（５．３４μＬ、０．０８０ｍｍｏｌ）を０℃において加え、室温で２時間撹拌した。反応液を濃縮し、粗生成物(S)-ピペリジン-1,2-ジカルボン酸 1-(4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル) 2-(シアノメチル)（化合物ＳＳ１８、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｐｉｃ２－ＯＣＨ_２ＣＮ）を得た。得られた粗生成物をアセトニトリル（２．００ｍＬ）に溶解し、そのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　４５２　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．７９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０１）

(2S)-ピペリジン-1,2-ジカルボン酸 1-(4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル) 2-((2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-4-ヒドロキシ-2-((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル)（化合物ＳＳ１４、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｐｉｃ２－ｐＣｐＡ）の合成

　緩衝液Ａ（４０ｍＬ）に、文献（Helv. Chim. Acta, 90, 297-310）記載の方法で合成したリン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－４－（（テトラヒドロフラン－２－イル）オキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）メチル（化合物ｐｃ０１）（１１３ｍｇ、０．１５６ｍｍｏｌ）を溶解させ、(S)-ピペリジン-1,2-ジカルボン酸 1-(4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル) 2-(シアノメチル)（化合物ＳＳ１８、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｐｉｃ２－ＯＣＨ_２ＣＮ）（３５．４ｍｇ、０．０７８ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（２．００ｍＬ）を投与し、室温で１５０分撹拌した。反応液を０℃に冷却した後に、トリフルオロ酢酸（２．００ｍＬ）を加えた。反応液を０℃で４５分撹拌したのちに、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ＳＳ１４、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｐｉｃ２－ｐＣｐＡ）（６．０ｍｇ、７．３％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　１０４７．５　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．５０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０１）

　なお、緩衝液Ａは以下のように調製した。
　Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルヘキサデカン－１－アミニウム　塩化物（６．４０ｇ、２０ｍｍｏｌ）とイミダゾール（６．８１ｇ、１００ｍｍｏｌ）の水溶液に酢酸を添加し、ｐＨ８、２０ｍＭ　Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルヘキサデカン－１－アミニウム、１００ｍＭイミダゾールの緩衝液Ａ（１Ｌ）を得た。

O-(2-クロロフェニル)-N-(((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)-L-セリン（化合物ＳＳ１９、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＳＰｈ２Ｃｌ－ＯＨ）の合成

　窒素雰囲気下、特許文献（ＷＯ２０１８２２５８６４）記載の方法で合成したＯ－（２－クロロフェニル）－Ｌ－セリン（化合物ａａ６３）（１．２５ｇ、５．８０ｍｍｏｌ）、特許文献（ＷＯ２０１８１４３１４５Ａ１）記載の方法で合成した炭酸－（４－ニトロフェニル）－４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル（化合物ｔｓ１１）（２ｇ、４．７１ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＳＯ（１５ｍＬ）、トリエチルアミン（０．９５ｇ、９．４２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温において１６時間撹拌したのち、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、O-(2-クロロフェニル)-N-(((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)-L-セリン（化合物ＳＳ１９、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＳＰｈ２Ｃｌ－ＯＨ）（１．８ｇ、７３％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　５２３　（Ｍ＋Ｎａ）＋
保持時間：１．２６分（分析条件ＳＭＤ　ｍｅｔｈｏｄ１）

シアノメチル O-(2-クロロフェニル)-N-(((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)-L-セリナート（化合物ＳＳ２０、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＳＰｈ２Ｃｌ－ＯＣＨ _２ＣＮ）の合成

　窒素雰囲気下、O-(2-クロロフェニル)-N-(((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)-L-セリン（化合物ＳＳ１９、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＳＰｈ２Ｃｌ－ＯＨ）（８００ｍｇ、１．６０ｍｍｏｌ）およびＮ－エチル－イソプロピルプロパン－２－アミン（ＤＩＰＥＡ）（０．４１２ｇ、３．１９ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１５ｍＬ）に溶解し、２－ブロモアセトニトリル（７６０ｍｇ、６．３４ｍｍｏｌ）を室温において加え、室温で１６時間撹拌した。反応液を濃縮し、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、シアノメチル O-(2-クロロフェニル)-N-(((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)-L-セリナート（化合物ＳＳ２０、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＳＰｈ２Ｃｌ－ＯＣＨ_２ＣＮ）（２２０ｍｇ、２６％）を得た。得られた生成物をアセトニトリル（５ｍＬ）に溶解し、次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　５６２　（Ｍ＋Ｎａ）＋
保持時間：１．１５分（分析条件ＳＭＤ　ｍｅｔｈｏｄ２）

(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-4-ヒドロキシ-2-((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル O-(2-クロロフェニル)-N-(((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)-L-セリナート（化合物ＳＳ１５、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＳＰｈ２Ｃｌ－ｐＣｐＡ）の合成

　緩衝液Ａ（１００ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－４－（（テトラヒドロフラン－２－イル）オキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）メチル（化合物ｐｃ０１）（４００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）を溶解させ、シアノメチル O-(2-クロロフェニル)-N-(((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)-L-セリナート（化合物ＳＳ２０、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＳＰｈ２Ｃｌ－ＯＣＨ_２ＣＮ）（２２０ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（５ｍＬ）をシリンジポンプを使い１５分以上かけて滴下し、室温で５分撹拌した。続いて、反応液にトリフルオロ酢酸（２．３ｍＬ）を加えた。反応液を凍結乾燥した後に、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ＳＳ１５、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＳＰｈ２Ｃｌ－ｐＣｐＡ）（２０．７ｍｇ、２％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　１１３３．４　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．５５分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０１）

((S)-2-(メチルアミノ)-4-フェニルブタン酸（化合物ＳＳ２１、ＭｅＨｐｈ－ＯＨ）の合成

　特許文献（ＷＯ２０１８２２５８６４）記載の方法で合成した(S)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-4-フェニルブタン酸（化合物ａａ１１）（１５０ｍｇ、０．３６１ｍｍｏｌ）に室温にてＤＣＭ（９０３μＬ）、水（９０３μＬ）およびピペリジン（１７８μＬ、１．８０５ｍｍｏｌ）を室温にて添加した。反応混合物を室温において３０分間撹拌したのち、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、((S)-2-(メチルアミノ)-4-フェニルブタン酸（化合物ＳＳ２１、ＭｅＨｐｈ－ＯＨ）（５５ｍｇ、７９％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　１９２　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．１５分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）

(S)-2-((((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-4-フェニルブタン酸（化合物ＳＳ２２、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＭｅＨｐｈ－ＯＨ）の合成

　窒素雰囲気下、((S)-2-(メチルアミノ)-4-フェニルブタン酸（化合物ＳＳ２１、ＭｅＨｐｈ－ＯＨ）（３５．１ｍｇ、０．１８２ｍｍｏｌ）、特許文献（ＷＯ２０１８１４３１４５Ａ１）記載の方法で合成した炭酸－（４－ニトロフェニル）－４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル（化合物ｔｓ１１）（８５ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＳＯ（７２７μＬ）を添加した。トリエチルアミン（７６μＬ、０．５４５ｍｍｏｌ）を５０℃にて添加した。反応混合物を４０℃において１６時間撹拌したのち、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、(S)-2-((((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-4-フェニルブタン酸（化合物ＳＳ２２、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＭｅＨｐｈ－ＯＨ）（８０ｍｇ、９２％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　４７７　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．８５分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）

(S)-2-((((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-4-フェニルブタン酸シアノメチル（化合物ＳＳ２３、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＭｅＨｐｈ－ＯＣＨ _２ＣＮ）の合成

　窒素雰囲気下、(S)-2-((((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-4-フェニルブタン酸（化合物ＳＳ２２、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＭｅＨｐｈ－ＯＨ）（７７ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）およびＮ－エチル－イソプロピルプロパン－２－アミン（ＤＩＰＥＡ）（３１μＬ、０．１７６ｍｍｏｌ）の混合物にアセトニトリル（５３３μＬ）を室温にて加えた。その後、２－ブロモアセトニトリル（８６μＬ、１．２８０ｍｍｏｌ）を室温において加え、反応混合物を４０℃において１時間撹拌した。反応液を濃縮し、粗生成物(S)-2-((((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-4-フェニルブタン酸シアノメチル（化合物ＳＳ２３、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＭｅＨｐｈ－ＯＣＨ_２ＣＮ）を得た。得られた粗生成物をアセトニトリル（５．００ｍＬ）に溶解し、そのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　５１６　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．９２分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）

(2S)-2-((((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-4-フェニルブタン酸 (2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-4-ヒドロキシ-2-((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル（化合物ＳＳ１６、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＭｅＨｐｈ－ｐＣｐＡ）の合成

　緩衝液Ａ（１００ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－４－（（テトラヒドロフラン－２－イル）オキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）メチル（化合物ｐｃ０１）（１２７ｍｇ、０．１７６ｍｍｏｌ）を溶解させ、(S)-2-((((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-4-フェニルブタン酸シアノメチル（化合物ＳＳ２３、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＭｅＨｐｈ－ＯＣＨ_２ＣＮ）（８３ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（５．００ｍＬ）を投与し、室温で１時間撹拌した。反応液を０℃に冷却した後に、トリフルオロ酢酸（５．００ｍＬ）を加えた。反応液を０℃で１時間撹拌したのちに、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、その後さらに逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ＳＳ１６、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＭｅＨｐｈ－ｐＣｐＡ）（２６ｍｇ、１４．６％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　１１１１．５　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．６４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）

(S)-3-(3-クロロフェニル)-2-((((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)アミノ)プロパン酸（化合物ＳＳ４１、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｆ３Ｃｌ－ＯＨ）の合成

　窒素雰囲気下、特許文献（ＷＯ２０１８２２５８６４）記載の方法で合成した（Ｓ）－２－アミノ－３－（３－クロロフェニル）プロパン酸（Ｈ－Ｐｈｅ（３－Ｃｌ）－ＯＨ）（２．１７ｇ、１０．８７ｍｍｏｌ）、特許文献（ＷＯ２０１８１４３１４５Ａ１）記載の方法で合成した炭酸－（４－ニトロフェニル）－４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル（化合物ｔｓ１１）（３.０ｇ、７．０７ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＳＯ（１５ｍＬ）、トリエチルアミン（１．４３ｇ、１４．１３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温において１６時間撹拌したのち、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、(S)-3-(3-クロロフェニル)-2-((((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)アミノ)プロパン酸（化合物ＳＳ４１、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｆ３Ｃｌ－ＯＨ）（０．７ｇ、２０％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　５０７　（Ｍ＋Ｎａ）＋
保持時間：１．０６分（分析条件ＳＭＤ　ｍｅｔｈｏｄ３）

(S)-3-(3-クロロフェニル)-2-((((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)アミノ)プロパン酸シアノメチル（化合物ＳＳ４２、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｆ３Ｃｌ－ＯＣＨ _２ＣＮ）の合成

　窒素雰囲気下、(S)-3-(3-クロロフェニル)-2-((((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)アミノ)プロパン酸（化合物ＳＳ４１、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｆ３Ｃｌ－ＯＨ）（６５０ｍｇ、１．３４ｍｍｏｌ）およびＮ－エチル－イソプロピルプロパン－２－アミン（ＤＩＰＥＡ）（０．３４６ｇ、２．６８ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２８ｍＬ）に溶解し、２－ブロモアセトニトリル（６４０ｍｇ、５．３４ｍｍｏｌ）を室温において加え、室温で４８時間撹拌した。反応液を濃縮し、順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／石油エーテル）にて精製し、(S)-3-(3-クロロフェニル)-2-((((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)アミノ)プロパン酸シアノメチル（化合物ＳＳ４２、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｆ３Ｃｌ－ＯＣＨ２ＣＮ）（３３０ｍｇ、４７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　５４６　（Ｍ＋Ｎａ）＋
保持時間：１．１３分（分析条件ＳＭＤ　ｍｅｔｈｏｄ３）

(2S)-3-(3-クロロフェニル)-2-((((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)アミノ)プロパン酸 (2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-4-ヒドロキシ-2-((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル（化合物ＳＳ３９、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｆ３Ｃｌ－ｐＣｐＡ）の合成

　緩衝液Ａ（１００ｍＬ）に、文献（Helv. Chim. Acta, 90, 297-310）記載の方法で合成したリン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－４－（（テトラヒドロフラン－２－イル）オキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）メチル（化合物ｐｃ０１）（５５２ｍｇ、０．７６ｍｍｏｌ）を溶解させ、(S)-3-(3-クロロフェニル)-2-((((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)アミノ)プロパン酸シアノメチル（化合物ＳＳ４２、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｆ３Ｃｌ－ＯＣＨ２ＣＮ）（２００ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（５ｍＬ）をシリンジポンプを用いて１５分以上かけて滴下し、室温で３０分撹拌した。反応液にトリフルオロ酢酸（２．３ｍＬ）を加えた。反応液を凍結乾燥したのちに、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ＳＳ３９、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｆ３Ｃｌ－ｐＣｐＡ）（２５．３ｍｇ、１％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　１１１７．４　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．５５分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０１）

N-(((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)-O-イソペンチル-L-セリン（化合物ＳＳ４３、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＳｉＰｅｎ－ＯＨ）の合成

　窒素雰囲気下、特許文献（ＷＯ２０１８２２５８６４）記載の化合物Ｏ－イソペンチル－Ｌ－セリン（Ｈ－Ｓｅｒ（ｉＰｅｎ）－ＯＨ）（１ｇ、５．７１ｍｍｏｌ）、特許文献（ＷＯ２０１８１４３１４５Ａ１）記載の方法で合成した炭酸－（４－ニトロフェニル）－４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル（化合物ｔｓ１１）（２ｇ、４．７１ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＳＯ（１５ｍＬ）、トリエチルアミン（１．３ｍＬ、９．４２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温において１６時間撹拌したのち、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、N-(((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)-O-イソペンチル-L-セリン（化合物ＳＳ４３、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＳｉＰｅｎ－ＯＨ）（１．８ｇ、８３％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　４８３　（Ｍ＋Ｎａ）＋
保持時間：１．０４分（分析条件ＳＭＤ　ｍｅｔｈｏｄ３）

シアノメチル N-(((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)-O-イソペンチル-L-セリナート（化合物ＳＳ４４、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＳｉＰｅｎ－ＯＣＨ _２ＣＮ）の合成

　窒素雰囲気下、N-(((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)-O-イソペンチル-L-セリン（化合物ＳＳ４３、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＳｉＰｅｎ－ＯＨ）（１．８ｇ、３．９１ｍｍｏｌ）およびＮ－エチル－イソプロピルプロパン－２－アミン（ＤＩＰＥＡ）（１ｇ、７．７４ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（４０ｍＬ）に溶解し、２－ブロモアセトニトリル（１．９ｇ、１５．８４ｍｍｏｌ）を室温において加え、室温で４８時間撹拌した。反応液を濃縮し、順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／石油エーテル）にて精製し、シアノメチル N-(((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)-O-イソペンチル-L-セリナート（化合物ＳＳ４４、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＳｉＰｅｎ－ＯＣＨ_２ＣＮ）（１．６ｇ、８２％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　５２２　（Ｍ＋Ｎａ）＋
保持時間：１．３５分（分析条件ＳＭＤ　ｍｅｔｈｏｄ４）

(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-4-ヒドロキシ-2-((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル N-(((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)-O-イソペンチル-L-セリナート（化合物ＳＳ４０、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＳｉＰｅｎ－ｐＣｐＡ）の合成

　緩衝液Ａ（１００ｍＬ）に、文献（Helv. Chim. Acta, 90, 297-310）記載の方法で合成したリン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－４－（（テトラヒドロフラン－２－イル）オキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）メチル（化合物ｐｃ０１）（４００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）を溶解させ、シアノメチル N-(((4-(2-(4-フルオロフェニル)アセトアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)-O-イソペンチル-L-セリナート（化合物ＳＳ４４、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＳｉＰｅｎ－ＯＣＨ_２ＣＮ）（１３９ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（５ｍＬ）をシリンジポンプを用いて１５分以上かけて滴下し、室温で３時間撹拌した。反応液にトリフルオロ酢酸（２．３ｍＬ）を加えた。反応液を凍結乾燥したのちに、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ＳＳ４０、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＳｉＰｅｎ－ｐＣｐＡ）（３９．５ｍｇ、３％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　１０９３．５　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．５５分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０１）

実施例６．ＢｄｐＦＬ－Ｐｈｅ－ｐＣｐＡ（ＭＴ０１）の合成
（３－（５，５－ジフルオロ－７，９－ジメチル－５Ｈ－４λ４，５λ４－ジピロロ［１，２－ｃ：２'，１'－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパノイル）－Ｌ－フェニルアラニン（化合物ＭＴ０２、ＢｄｐＦＬ－Ｐｈｅ－ＯＨ）の合成

　窒素雰囲気下、３－（２－カルボキシエチル）－５，５－ジフルオロ－７，９－ジメチル－５Ｈ－５λ４－ジピロロ［１，２－ｃ：２'，１'－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム（２００ｍｇ，０．６８５　ｍｍｏｌ）と１－ヒドロキシピロリジン－２，５－ジオン（８７　ｍｇ，０．７５３　ｍｍｏｌ）　のＮＭＰ（４．５ｍｌ）溶液にＤＩＣ（０．１２８　ｍｌ，０．８２２　ｍｍｏｌ）を室温で加えたのち、４０℃で終夜撹拌した。室温に戻したのち、反応液にＬ－フェニルアラニン（１１３　ｍｇ，　０．６８５　ｍｍｏｌ）とＴＥＡ（０．１９１　ｍｌ，１．３６９　ｍｍｏｌ）を加え、４０℃で終夜撹拌した。反応液を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ＦＡ　ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ）にて精製し、（３－（５，５－ジフルオロ－７，９－ジメチル－５Ｈ－４λ４，５λ４－ジピロロ［１，２－ｃ：２'，１'－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパノイル）－Ｌ－フェニルアラニン（化合物ＭＴ０２、ＢｄｐＦＬ－Ｐｈｅ－ＯＨ）（１０２　ｍｇ，　３４％収率）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　４３８．３　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．７８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）

（３－（５，５－ジフルオロ－７，９－ジメチル－５Ｈ－４λ４，５λ４－ジピロロ［１，２－ｃ：２'，１'－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパノイル）－Ｌ－フェニルアラニン　シアノメチルエステル（化合物ＭＴ０３、ＢｄｐＦＬ－Ｐｈｅ－ＯＣＨ _２ＣＮ）の合成

　窒素雰囲気下、（３－（５，５－ジフルオロ－７，９－ジメチル－５Ｈ－４λ４，５λ４－ジピロロ［１，２－ｃ：２'，１'－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパノイル）－Ｌ－フェニルアラニン（５０ｍｇ、０．１１４ｍｍｏｌ）およびＮ－エチル－イソプロピルプロパン－２－アミン（ＤＩＰＥＡ）（３１．０　μＬ，　０．１７７　ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（５００μＬ）に溶解し、２－ブロモアセトニトリル（１２　μＬ，　０．１７７　ｍｍｏｌ）を０℃で加えたのち、４０℃で３時間撹拌した。反応液を濃縮し、（３－（５，５－ジフルオロ－７，９－ジメチル－５Ｈ－４λ４，５λ４－ジピロロ［１，２－ｃ：２'，１'－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパノイル）－Ｌ－フェニルアラニン　シアノメチルエステル（化合物ＭＴ０２、ＢｄｐＦＬ－Ｐｈｅ－ＯＣＨ_２ＣＮ）を粗生成物として得た。得られた粗生成物は、そのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　４７７．３（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．８６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０１）

３－（３－（（（２Ｓ）－１－（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－２－（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－４－ヒドロキシ－２－（（フォスフォノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン－３－イル）オキシ）（ヒドロキシ）フォスフォリル）オキシ）メチル）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－ヒドロキシテトラヒドロフラン－３－イル）オキシ）－１－オキソ－３－フェニルプロパン－２－イル）アミノ）－３－オキソプロピル）－５，５－ジフルオロ－７，９－ジメチル－５Ｈ－５λ４－ジピロロ　［１，２－ｃ：２'，１'－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム（化合物ＭＴ０１、ＢｄｐＦＬ－Ｐｈｅ－ｐＣｐＡ）の合成

　緩衝液Ａ（１１．３ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－４－（（テトラヒドロフラン－２－イル）オキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）メチル（化合物ｐｃ０１）（３３．２ｍｇ、０．０４６ｍｍｏｌ）を溶解させ、（３－（５，５－ジフルオロ－７，９－ジメチル－５Ｈ－４λ４，５λ４－ジピロロ［１，２－ｃ：２'，１'－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパノイル）－Ｌ－フェニルアラニン　シアノメチルエステル（化合物ＭＴ０３、ＢｄｐＦＬ－Ｐｈｅ－ＯＣＨ_２ＣＮ）（１１ｍｇ、０．０２３ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（０．１３ｍＬ）を加えたのち、室温で４５分撹拌した。反応液に０℃でＴＦＡ（０．５６ｍＬ）を加え、５分撹拌したのち、室温にて１０分撹拌した。反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％　ＴＦＡ　ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ）にて精製し、表題化合物（化合物ＭＴ０１、ＢｄｐＦＬ－Ｐｈｅ－ｐＣｐＡ）（２．１ｍｇ、８．５％収率）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　１０７２．５　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．５６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）

実施例７．ＬＣＴ－１２のペプチド合成機によるペプチド合成に用いる（２Ｓ，３Ｒ）－２－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）－３－（（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）ブタン酸（Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ＴＨＰ）－ＯＨ）の合成

　（２Ｓ，３Ｒ）－２－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）－３－ヒドロキシブタン酸一水和物（Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ－ＯＨの一水和物、東京化成より購入、５．０ｇ、１３．９ｍｍｏｌ）とｐ－トルエンスルホン酸ピリジニウム（ＰＰＴＳ、０．１７５ｇ、０．７０ｍｍｏｌ）の混合物にトルエン（５０ｍＬ）を加えて、減圧下トルエンを留去することで共沸により含まれている水分を除去した。得られた残渣に超脱水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ、２８ｍＬ）と３，４－ジヒドロ－２Ｈ－ピラン（８．８ｍＬ、９７ｍｍｏｌ）を加え、窒素雰囲気下、５０℃にて４時間攪拌した。ＬＣＭＳ（ＳＱＤＦＡ０５）にて原料の消失を確認後、混合物を２５℃まで冷却し、酢酸エチル（３０ｍＬ）を加えた。続いて飽和塩化ナトリウム水溶液（３０ｍＬ）を加えて有機層を洗浄し、水層を酢酸エチル（３０ｍＬ）で抽出した。得られた全ての有機層を混合し、これをさらに飽和塩化ナトリウム水溶液（３０ｍＬ）にて２度洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムにて乾燥し、溶媒を減圧下留去し、粗生成物（９．３ｇ）を得た。

　得られた粗生成物のうち、４．６５ｇをテトラヒドロフラン（ＴＨＦ、３０ｍＬ）に溶解させ、次いでｐＨ８．０に調整した１．０Ｍリン酸緩衝液（３０ｍＬ）を加えた。この混合物を５０℃で４時間攪拌した。２５℃まで冷却した後、酢酸エチル（３０ｍＬ）を加え、有機層と水層を分離した。水層に酢酸エチル（３０ｍＬ）を加えて抽出を行った後、得られた全ての有機層を混合し、飽和塩化ナトリウム水溶液（３０ｍＬ）で２度洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらにポンプにて減圧下、２５℃で３０分乾燥させた。

　得られた残渣をジエチルエーテル（５０ｍＬ）に溶解させ、次いでヘプタン（５０ｍＬ）を加えた。制御した減圧下（～１００ｈＰａ）、ジエチルエーテルのみを留去し、得られた混合物をろ過して固体を得た。このヘプタンでの洗浄操作を２度繰り返した。得られた固体をポンプにて減圧下、２５℃で２時間乾燥させ、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ＴＨＰ）－ＯＨのナトリウム塩（２．８０ｇ、６．２６ｍｍｏｌ）を得た。

　得られた全量のＦｍｏｃ－Ｔｈｒ（ＴＨＰ）－ＯＨのナトリウム塩に酢酸エチル（５０ｍＬ）とｐＨ２．１の０．０５Ｍリン酸水溶液（１４０ｍＬ）を加えて、２５℃にて５分間攪拌した後、有機層と水層を分離した。水層に酢酸エチル（５０ｍＬ）を加えて抽出した後、得られた全ての有機層を混合し、飽和塩化ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）にて２度洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムにて乾燥させ、減圧下溶媒を留去した。残渣をポンプにて減圧下、２５℃で２時間乾燥させた後、得られた固体をｔ－ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ、５０ｍＬ）に溶解させ、溶媒を減圧下留去した。さらにポンプにて減圧下、２５℃で１時間乾燥させることで、（２Ｓ，３Ｒ）－２－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）－３－（（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）ブタン酸（Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ＴＨＰ）－ＯＨ、２．７０ｇ、３０ｍｏｌ％のｔ－ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）が残留）をＴＨＰ保護上の不斉炭素に由来するジアステレオマー混合物として得た。得られたＦｍｏｃ－Ｔｈｒ（ＴＨＰ）－ＯＨは－２５℃の冷凍庫にて保存した。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝４２４．２（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．８４分、０．８５分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０１）

実施例８．ＬＣ／ＭＳの標品として用いるＮ末端にＢｄｐＦＬを持つペプチド（ＬＣＴ－１２）の合成

　Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨを担持させた２－ク口口卜リチルレジン（１００ｍｇ）を用い、Ｆｍｏｃアミノ酸としてＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ＴＨＰ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ－ＯＨを用いてペプチド合成機にてペプチドの伸長を行った（アミノ酸の略号については本明細書中に別途記載）。Ｆｍｏｃ法によるペプチド合成法に従い、ペプチドの伸長を行った（ＷＯ２０１３１００１３２Ｂ２）。ペプチドの伸長後、Ｎ末端のＦｍｏｃ基の除去をペプチド合成機上にて行った後、レジンをＤＣＭにて洗浄した。
　レジンにＴＦＥ／ＤＣＭ（１：１、ｖ／ｖ、２ｍＬ）を加えて１時間振とうし、ペプチドのレジンからの切り出しを行った。反応終了後、チューブ内の溶液を合成用カラムでろ過することによりレジンを除き、レジンをＴＦＥ／ＤＣＭ（１：１、ｖ／ｖ、１ｍＬ）にて２回洗浄した。全ての抽出液を混合し、ＤＭＦ（２ｍＬ）を加えた後、減圧下濃縮した。得られた残査をＮＭＰ（０．５ｍＬ）に溶解し、そのうち１／４（１２５μＬ）を次の反応に使用した。ペプチドのＮＭＰ溶液に７６．５ｍＭに調製したＢｄｐＦＬスクシンイミドエステル（１４０μＬ）を室温にて加え、４０℃で終夜撹拌した後、減圧下濃縮した。得られた残査を０．０５Ｍ　テトラメチルアンモニウム硫酸水素塩　ｉｎ　ＨＦＩＰ（１．２　ｍｌ，　０．０６０　ｍｍｏｌ）に溶解し、室温で２時間撹拌した。反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ＦＡ　ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ）にて精製し、表題化合物（ＬＣＴ－１２）（０．３ｍｇ）を得た。ＬＣＴ－１２のアミノ酸配列を配列番号：５３に示す。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　１９７２．９　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．７４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０１）

実施例９　ライゲーション反応によるtRNA-CAの作製
　tRNA5’断片、pNp（pUp、pLp、あるいはp(Agm)p）、およびtRNA3’断片を以下に記載の手順により、ライゲーション反応を用いて連結することで各種tRNA-CAを作製した。tRNA5’断片およびtRNA3’断片は化学合成品（株式会社ジーンデザイン）を用いた。各tRNA断片および全長の配列と、ライゲーションに用いたサンプルの組み合わせ（表４）を下記に示す。
配列番号：５４（ＦＲ－１）
tRNA(Glu)5’ RNA配列
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCU
配列番号：５５（ＦＲ－２）
tRNA(Glu)3’ga RNA配列
GAACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
配列番号：５６（ＵＲ－１）
lig-tRNA(Glu)uga-CA　RNA配列
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUUGAACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
配列番号：５７（ＬＲ－１）
tRNA(Glu)Lga-CA　RNA配列
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCULGAACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
配列番号：５８（ＦＲ－３）
tRNA(Glu)3’ag RNA配列
AGACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
配列番号：５９（ＬＲ－２）
tRNA(Glu)Lag-CA　RNA配列
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCULAGACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
配列番号：６０（ＦＲ－４）
tRNA(Glu)3’ac RNA配列
ACACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
配列番号：６１（ＬＲ－３）
tRNA(Glu)Lac-CA　RNA配列
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCULACACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
配列番号：６２（ＦＲ－５）
tRNA(Glu)3’cc RNA配列
CCACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
配列番号：６３（ＬＲ－４）
tRNA(Glu)Lcc-CA　RNA配列
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCULCCACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
配列番号：１３２（ＦＲ－６）
tRNA(Asp)5’ RNA配列
GGAGCGGUAGUUCAGUCGGUUAGAAUACCUGCUU
配列番号：１３３（ＦＲ－７）
tRNA(Asp)3’ag RNA配列
AGGUGCAGGGGGUCGCGGGUUCGAGUCCCGUCCGUUCCGC
配列番号：１３４（ＬＲ－５）
tRNA(Asp)Lag-CA　RNA配列
GGAGCGGUAGUUCAGUCGGUUAGAAUACCUGCUULAGGUGCAGGGGGUCGCGGGUUCGAGUCCCGUCCGUUCCGC
配列番号：１３５（ＦＲ－８）
tRNA(AsnE2)5’ RNA配列
GGCUCUGUAGUUCAGUCGGUAGAACGGCGGAUU
配列番号：１３６（ＦＲ－９）
tRNA(AsnE2)3’ag RNA配列
AGGUUCCGUAUGUCACUGGUUCGAGUCCAGUCAGAGCCGC
配列番号：１３７（ＬＲ－６）
tRNA(AsnE2)Lag-CA　RNA配列
GGCUCUGUAGUUCAGUCGGUAGAACGGCGGAUULAGGUUCCGUAUGUCACUGGUUCGAGUCCAGUCAGAGCCGC
配列番号：１３９（ＦＲ－１０）
tRNA(Glu)3’cg RNA配列
CGACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
配列番号：１４０（ＬＲ－７）
tRNA(Glu)Lcg-CA　RNA配列
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCULCGACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
配列番号：１４１（ＦＲ－１１）
tRNA(Glu)3’au RNA配列
AUACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
配列番号：１４２（ＬＲ－８）
tRNA(Glu)Lau-CA　RNA配列
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCULAUACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC配列番号：１３８（ＡＲ－１）
tRNA(Glu)(Agm)ag-CA　RNA配列
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCU(Agm)AGACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC

　50 mM HEPES-KOH (pH 7.5)、20 mM MgCl₂、1 mM ATP、0.125～0.25 mM pNp（pUp、pLp、あるいはp(Agm)p）、25 μM tRNA5’断片、0.6 U/μL T4 RNA ligase (New England Biolabs)、10% DMSOの組成の反応溶液を15℃にて一晩静置する事によりtRNA断片5’とpNp（pUp、pLp、あるいはp(Agm)p）とのライゲーション反応を行った。ライゲーション産物は、フェノール・クロロホルム抽出を行い、エタノール沈殿によって回収した。

　未反応のtRNA5’断片が次のライゲーション反応に持ち越されないようにするため、過ヨウ素酸ナトリウム(NaIO₄)により、tRNA5’断片の3’末端のリボースを開裂させた。具体的には、10 μM　ライゲーション産物、10 mM　過ヨウ素酸ナトリウム存在下で、氷上、暗所で30分静置することにより開裂反応を行った。反応後、100 mMグルコースを1/10体積量加え、氷上、暗所で30分静置することにより過剰な過ヨウ素酸ナトリウムを分解した。反応産物は、エタノール沈殿によって回収した。

　過ヨウ素酸処理後のライゲーション産物の5’末端をリン酸化、3’末端を脱リン酸化するためT4 PNK(T4 polynucleotide kinase)処理を行った。10 μMの過ヨウ素酸処理後のライゲーション産物、50 mM Tris-HCl (pH 8.0)、10 mM MgCl₂、5 mM DTT、300 μM ATP、0.5 U/μL T4 PNK(TaKaRa)の組成の反応溶液を37℃にて30分から60分静置することにより反応を行った。反応産物は、フェノール・クロロホルム抽出を行い、エタノール沈殿によって回収した。

　PNK処理後の反応産物とtRNA3’断片とのライゲーション反応を行った。まず、10 μMのPNK処理後の反応産物、10 μM tRNA3’断片、50 mM HEPES-KOH (pH 7.5)、15 mM MgCl₂の組成の溶液を65℃にて7分間加熱後、室温で３０分から1時間静置することでPNK処理後の反応産物とtRNA3’断片とのアニーリングを行った。次に、tRNA3’断片の5’末端をリン酸化するためT4 PNK処理を行った。T4 PNK処理は、アニーリングを行った溶液に、DTT(終濃度3.5 mM)、ATP(終濃度300 μM)、T4 PNK(終濃度0.5 U/μL)を加え、37℃にて30分静置する事で行った。続いて、この溶液に、T4 RNA ligase(New England Biolabs)を終濃度0.9 U/μLとなるよう加え、37℃にて30分から40分静置することでライゲーション反応を行った。ライゲーション産物は、フェノール・クロロホルム抽出を行い、エタノール沈殿によって回収した。

　ライゲーション法により作製したtRNA-CAは、高速逆相クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（１５ｍＭ　ＴＥＡと４００ｍＭ　ＨＦＩＰの水溶液／１５ｍＭ　ＴＥＡと４００ｍＭ　ＨＦＩＰのメタノール溶液）にて分取精製を行った後、変性尿素１０％ポリアクリルアミド電気泳動にて目的の長さを有していることを確認した。

実施例１０　RNaseT ₁ により切断したtRNA断片の分析
　ライゲーション反応を利用して調製した各種tRNA-CAをRNaseで断片化し分析することで、pUp、pLp、あるいはp(Agm)p で導入したU、L、あるいは(Agm)がそれぞれ目的の部位に導入されていることを確認した。
各tRNA-CAの配列番号と、pUp、pLp、あるいはp(Agm)pで導入したU、L、あるいは(Agm)を含むRNA断片の配列の組み合わせを下記の表５に示す。

　10 μM tRNA-CA、5 U/μL RNaseT₁（EpicentreまたはThermoFisher Scientific）、10 mM酢酸アンモニウム（pH 5.3）を含む反応溶液を37℃にて1時間静置する事によりRNAをG塩基の3’側で特異的に切断し、pUp、pLp、あるいはp(Agm)pで導入したU、L、あるいは(Agm)を含むRNA断片を分析した。

CCCUUGp
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　９４４　（（Ｍ－２Ｈ）／２）－
保持時間：４．２２分（分析条件ＬＴＱＴＥＡ／ＨＦＩＰ０５＿０３）
　pUpがligationされていない場合に想定される断片（CCCUGp）のマスクロマトグラムと比較し、大部分pUpのligationが進行したことを確認した（図１）。

CCCULGp
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　１００８　（（Ｍ－２Ｈ）／２）－
保持時間：２．３４分（分析条件ＬＴＱＴＥＡ／ＨＦＩＰ０５＿０３）
　pLpがligationされていない場合に想定される断片（CCCUGp）およびLysidineの代わりにUridineが入っていた場合に想定される断片（CCCUUGp）のマスクロマトグラムと比較し、大部分pLpのligationが進行したことを確認した（図２）。

CCCULAGp
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　１１７２　（（Ｍ－２Ｈ）／２）－
保持時間：３．８１分（分析条件ＬＴＱＴＥＡ／ＨＦＩＰ０５＿０３）
　pLpがligationされていない場合に想定される断片（CCCUAGp）およびLysidineの代わりにUridineが入っていた場合に想定される断片（CCCUUAGp）のマスクロマトグラムと比較し、大部分pLpのligationが進行したことを確認した（図３）。

CCCULACACGp（配列番号：１９７）
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　１６４２　（（Ｍ－２Ｈ）／２）－
保持時間：５．７８分（分析条件ＬＴＱＴＥＡ／ＨＦＩＰ０５＿０３）
　pLpがligationされていない場合に想定される断片（CCCUACACGp）およびLysidineの代わりにUridineが入っていた場合に想定される断片（CCCUUACACGp／配列番号：１９８）のマスクロマトグラムと比較し、大部分pLpのligationが進行したことを確認した（図４）。

CCCULCCACGp（配列番号：１９９）
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　１６３０　（（Ｍ－２Ｈ）／２）－
保持時間：５．６４分（分析条件ＬＴＱＴＥＡ／ＨＦＩＰ０５＿０３）
　pLpがligationされていない場合に想定される断片（CCCUCCACGp）およびLysidineの代わりにUridineが入っていた場合に想定される断片（CCCUUCCACGp／配列番号：２００）のマスクロマトグラムと比較し、大部分pLpのligationが進行したことを確認した（図５）。

CUULAGp
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　１０２０　（（Ｍ－２Ｈ）／２）－
保持時間：３．８４分（分析条件ＬＴＱＴＥＡ／ＨＦＩＰ０５＿０３）
　pLpがligationされていない場合に想定される断片（CUUAGp）とRNAの他の部分由来の断片（UUCAGp）の分子量が等しいため、断片化していない状態のRNAの分析も併せて行った。
pGGAGCGGUAGUUCAGUCGGUUAGAAUACCUGCUULAGGUGCAGGGGGUCGCGGGUUCGAGUCCCGUCCGUUCCGC（配列番号：１３４）
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　１１０９　（（Ｍ－２２Ｈ）／２２）－
保持時間：３．９２分（分析条件ＬＴＱＴＥＡ／ＨＦＩＰ０５＿０１）
　pLpがligationされていない場合に想定されるRNAおよびLysidineの代わりにUridineが入っていた場合に想定されるRNAのマスクロマトグラムと比較し、大部分pLpのligationが進行したことを確認した（図６）。

AUULAGp
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　１０３２　（（Ｍ－２Ｈ）／２）－
保持時間：４．１６分（分析条件ＬＴＱＴＥＡ／ＨＦＩＰ０５＿０３）
　pLpがligationされていない場合に想定される断片（AUUAGp）およびLysidineの代わりにUridineが入っていた場合に想定される断片（AUUUAGp）のマスクロマトグラムと比較し、大部分pLpのligationが進行したことを確認した（図７）。

CCCULCGp
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　１１６０　（（Ｍ－２Ｈ）／２）－
保持時間：４．２１分（分析条件ＬＴＱＴＥＡ／ＨＦＩＰ０５＿０３）
　pLpがligationされていない場合に想定される断片（CCCUCGp）およびLysidineの代わりにUridineが入っていた場合に想定される断片（CCCUUCGp）のマスクロマトグラムと比較し、大部分pLpのligationが進行したことを確認した（図８）。

CCCULAUACGp（配列番号：２０２）
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　１６４２　（（Ｍ－２Ｈ）／２）－
保持時間：５．９５分（分析条件ＬＴＱＴＥＡ／ＨＦＩＰ０５＿０３）
　pLpがligationされていない場合に想定される断片（CCCUAUACGp）およびLysidineの代わりにUridineが入っていた場合に想定される断片（CCCUUAUACGp／配列番号：２０３）のマスクロマトグラムと比較し、大部分pLpのligationが進行したことを確認した（図９）。

CCCU(Agm)AGp
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　１１６４　（（Ｍ－２Ｈ）／２）－
保持時間：４．０２分（分析条件ＬＴＱＴＥＡ／ＨＦＩＰ０５＿０３）
　p(Agm)pがligationされていない場合に想定される断片（CCCUAGp）およびAgmatidineの代わりにUridineが入っていた場合に想定される断片（CCCUUAGp）のマスクロマトグラムと比較し、大部分p(Agm)pのligationが進行したことを確認した（図１０）。

実施例１１　アミノアシルｔＲＮＡの合成
　鋳型ＤＮＡ（配列番号：６４（Ｄ－１）～配列番号：７６（Ｄ－１３）、配列番号：１４３（Ｄ－２６）～配列番号：１５２（Ｄ－３５））から、T7 RNA polymeraseを用いたin vitro 転写反応によりｔＲＮＡ（配列番号：７７（ＴＲ－１）～配列番号：８９（ＴＲ－１３）、配列番号：１５３（ＴＲ－１４）～配列番号：１６２（ＴＲ－２３））を合成し、RNeasy kit（Qiagen社）により精製した。

鋳型ＤＮＡ　配列番号：６４（Ｄ－１）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTAGAACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：６５（Ｄ－２）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTTGAACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：６６（Ｄ－３）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTCGAACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：６７（Ｄ－４）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTAAGACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：６８（Ｄ－５）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTTAGACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：６９（Ｄ－６）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTCAGACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：７０（Ｄ－７）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTAACACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：７１（Ｄ－８）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTTACACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：７２（Ｄ－９）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTCACACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：７３（Ｄ－１０）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTGCCACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：７４（Ｄ－１１）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTTCCACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：７５（Ｄ－１２）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTCCCACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：７６（Ｄ－１３）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGCGGGGTGGAGCAGCCTGGTAGCTCGTCGGGCTCATAACCCGAAGATCGTCGGTTCAAATCCGGCCCCCGCAAC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１４３（Ｄ－２６）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGAGCGGTAGTTCAGTCGGTTAGAATACCTGCTTaagGTGCAGGGGGTCGCGGGTTCGAGTCCCGTCCGTTCCGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１４４（Ｄ－２７）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGAGCGGTAGTTCAGTCGGTTAGAATACCTGCTTTagGTGCAGGGGGTCGCGGGTTCGAGTCCCGTCCGTTCCGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１４５（Ｄ－２８）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGAGCGGTAGTTCAGTCGGTTAGAATACCTGCTTcagGTGCAGGGGGTCGCGGGTTCGAGTCCCGTCCGTTCCGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１４６（Ｄ－２９）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGCTCTGTAGTTCAGTCGGTAGAACGGCGGATTaagGTTCCGTATGTCACTGGTTCGAGTCCAGTCAGAGCCGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１４７（Ｄ－３０）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGCTCTGTAGTTCAGTCGGTAGAACGGCGGATTtagGTTCCGTATGTCACTGGTTCGAGTCCAGTCAGAGCCGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１４８（Ｄ－３１）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGCTCTGTAGTTCAGTCGGTAGAACGGCGGATTcagGTTCCGTATGTCACTGGTTCGAGTCCAGTCAGAGCCGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１４９（Ｄ－３２）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTgcgACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１５０（Ｄ－３３）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTccgACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１５１（Ｄ－３４）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTaauACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１５２（Ｄ－３５）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTcauACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC

ｔＲＮＡ　配列番号：７７（ＴＲ－１）
tRNA(Glu)aga-CA　RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUAGAACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
ｔＲＮＡ　配列番号：７８（ＴＲ－２）
tRNA(Glu)uga-CA　RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUUGAACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
ｔＲＮＡ　配列番号：７９（ＴＲ－３）
tRNA(Glu)cga-CA　RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUCGAACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
ｔＲＮＡ　配列番号：８０（ＴＲ－４）
tRNA(Glu)aag-CA　RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUAAGACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
ｔＲＮＡ　配列番号：８１（ＴＲ－５）
tRNA(Glu)uag-CA　RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUUAGACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
ｔＲＮＡ　配列番号：８２（ＴＲ－６）
tRNA(Glu)cag-CA　RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUCAGACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
ｔＲＮＡ　配列番号：８３（ＴＲ－７）
tRNA(Glu)aac-CA　RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUAACACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
ｔＲＮＡ　配列番号：８４（ＴＲ－８）
tRNA(Glu)uac-CA　RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUUACACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
ｔＲＮＡ　配列番号：８５（ＴＲ－９）
tRNA(Glu)cac-CA　RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUCACACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
ｔＲＮＡ　配列番号：８６（ＴＲ－１０）
tRNA(Glu)gcc-CA　RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUGCCACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
ｔＲＮＡ　配列番号：８７（ＴＲ－１１）
tRNA(Glu)ucc-CA　RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUUCCACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
ｔＲＮＡ　配列番号：８８（ＴＲ－１２）
tRNA(Glu)ccc-CA　RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUCCCACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
ｔＲＮＡ　配列番号：８９（ＴＲ－１３）
tRNA(fMet)cau-CA　RNA配列：
GGCGGGGUGGAGCAGCCUGGUAGCUCGUCGGGCUCAUAACCCGAAGAUCGUCGGUUCAAAUCCGGCCCCCGCAA
ｔＲＮＡ　配列番号：１５３（ＴＲ－１４）
tRNA(Asp)aag-CA 　RNA配列：
GGAGCGGUAGUUCAGUCGGUUAGAAUACCUGCUUaagGUGCAGGGGGUCGCGGGUUCGAGUCCCGUCCGUUCCGC
ｔＲＮＡ　配列番号：１５４（ＴＲ－１５）
tRNA(Asp)uag-CA　RNA配列：
GGAGCGGUAGUUCAGUCGGUUAGAAUACCUGCUUuagGUGCAGGGGGUCGCGGGUUCGAGUCCCGUCCGUUCCGC
ｔＲＮＡ　配列番号：１５５（ＴＲ－１６）
tRNA(Asp)cag-CA　RNA配列：
GGAGCGGUAGUUCAGUCGGUUAGAAUACCUGCUUcagGUGCAGGGGGUCGCGGGUUCGAGUCCCGUCCGUUCCGC
ｔＲＮＡ　配列番号：１５６（ＴＲ－１７）
tRNA(AsnE2)aag-CA　RNA配列：
GGCUCUGUAGUUCAGUCGGUAGAACGGCGGAUUaagGUUCCGUAUGUCACUGGUUCGAGUCCAGUCAGAGCCGC
ｔＲＮＡ　配列番号：１５７（ＴＲ－１８）
tRNA(AsnE2)uag-CA　RNA配列：
GGCUCUGUAGUUCAGUCGGUAGAACGGCGGAUUuagGUUCCGUAUGUCACUGGUUCGAGUCCAGUCAGAGCCGC
ｔＲＮＡ　配列番号：１５８（ＴＲ－１９）
tRNA(AsnE2)cag-CA　RNA配列：
GGCUCUGUAGUUCAGUCGGUAGAACGGCGGAUUcagGUUCCGUAUGUCACUGGUUCGAGUCCAGUCAGAGCCGC
ｔＲＮＡ　配列番号：１５９（ＴＲ－２０）
tRNA(Glu)gcg-CA 　RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUgcgACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
ｔＲＮＡ　配列番号：１６０（ＴＲ－２１）
tRNA(Glu)ccg-CA　RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUccgACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
ｔＲＮＡ　配列番号：１６１（ＴＲ－２２）
tRNA(Glu)aau-CA 　RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUaauACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
ｔＲＮＡ　配列番号：１６２（ＴＲ－２３）
tRNA(Glu)cau-CA　RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUcauACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC

アミノアシルｐＣｐＡを用いたアミノアシルｔＲＮＡ混合液の調製
　２５μＭ　転写tRNA(Glu)aga-CA（配列番号：７７（ＴＲ－１））、５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．５、２０ｍＭ　ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ　ＡＴＰ、０．６ｕｎｉｔ／μｌ　Ｔ４　ＲＮＡリガーゼ（New england bio lab.社）、０．２５ｍＭ　アミノアシル化ｐＣｐＡ（特許文献（ＷＯ２０１８１４３１４５Ａ１）記載の方法で合成した化合物ＴＳ２４のＤＭＳＯ溶液）となるように、Ｎｕｃｌｅａｓｅ　ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒでメスアップした反応液を調製し、１５℃で４５分間ライゲーション反応を行った。ただし、Ｔ４　ＲＮＡリガーゼおよびアミノアシル化ｐＣｐＡを加える前の反応液は、９５℃で２分間加熱後、室温で５分間放置し、予めｔＲＮＡのリフォールディングを行った。
　ライゲーション反応液に、酢酸ナトリウムを０．３Ｍになるように加え、フェノール・クロロホルム抽出を行い、化合物ＡＡｔＲ－１を調製した。
　同様に、転写tRNA(Glu)uga-CA（配列番号：７８（ＴＲ－２））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１５）を前述の方法でライゲーション反応を行った。ライゲーション反応液に、酢酸ナトリウムを０．３Ｍになるように加え、フェノール・クロロホルム抽出を行い、化合物ＡＡｔＲ－２を調製した。
　同様に、lig-tRNA(Glu)uga-CA（配列番号：５６（ＵＲ－１））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１５）を前述の方法でライゲーション反応を行った。ライゲーション反応液に、酢酸ナトリウムを０．３Ｍになるように加え、フェノール・クロロホルム抽出を行い、化合物ＡＡｔＲ－３を調製した。
　同様に、tRNA(Glu)Lga-CA（配列番号：５７（ＬＲ－１））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１５）を前述の方法でライゲーション反応を行った。ライゲーション反応液に、酢酸ナトリウムを０．３Ｍになるように加え、フェノール・クロロホルム抽出を行い、化合物ＡＡｔＲ－４を調製した。
　同様に、転写tRNA(Glu)cga-CA（配列番号：７９（ＴＲ－３））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ｔｓ１４；特許文献（ＷＯ２０１８１４３１４５Ａ１）に記載の方法により合成）を前述の方法でライゲーション反応を行った。ライゲーション反応液に、酢酸ナトリウムを０．３Ｍになるように加え、フェノール・クロロホルム抽出を行い、化合物ＡＡｔＲ－５を調製した。

　化合物ＡＡｔＲ－１、化合物ＡＡｔＲ－２、化合物ＡＡｔＲ－５の3種類のフェノール・クロロホルム抽出液を等量で混合し、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－１、化合物ＡＡｔＲ－２、化合物ＡＡｔＲ－５の混合液）をエタノール沈殿により回収した。

　化合物ＡＡｔＲ－１、化合物ＡＡｔＲ－３、化合物ＡＡｔＲ－５の3種類のフェノール・クロロホルム抽出液を等量で混合し、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－１、化合物ＡＡｔＲ－３、化合物ＡＡｔＲ－５の混合液）をエタノール沈殿により回収した。

　化合物ＡＡｔＲ－１、化合物ＡＡｔＲ－４、化合物ＡＡｔＲ－５の3種類のフェノール・クロロホルム抽出液を等量で混合し、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－１、化合物ＡＡｔＲ－４、化合物ＡＡｔＲ－５の混合液）をエタノール沈殿により回収した。

　２５μＭ　転写tRNA(Glu)aag-CA（配列番号：８０（ＴＲ－４））、５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．５、２０ｍＭ　ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ　ＡＴＰ、０．６ｕｎｉｔ／μｌ　Ｔ４　ＲＮＡリガーゼ（New england bio lab.社）、０．２５ｍＭ　アミノアシル化ｐＣｐＡ(ｔｓ１４のＤＭＳＯ溶液）となるように、Ｎｕｃｌｅａｓｅ　ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒでメスアップした反応液を調製し、１５℃で４５分間ライゲーション反応を行った。ただし、Ｔ４　ＲＮＡリガーゼおよびアミノアシル化ｐＣｐＡを加える前の反応液は、９５℃で２分間加熱後、室温で５分間放置し、予めｔＲＮＡのリフォールディングを行った。
　ライゲーション反応液に、酢酸ナトリウムを０．３Ｍになるように加え、フェノール・クロロホルム抽出を行い、化合物ＡＡｔＲ－６を調製した。
　同様に、転写tRNA(Glu)uag-CA（配列番号：８１（ＴＲ－５））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。ライゲーション反応液に、酢酸ナトリウムを０．３Ｍになるように加え、フェノール・クロロホルム抽出を行い、化合物ＡＡｔＲ－７を調製した。
　同様に、tRNA(Glu)Lag-CA（配列番号：５９（ＬＲ－２））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。ライゲーション反応液に、酢酸ナトリウムを０．３Ｍになるように加え、フェノール・クロロホルム抽出を行い、化合物ＡＡｔＲ－８を調製した。
　同様に、転写tRNA(Glu)cag-CA（配列番号：８２（ＴＲ－６））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＴＳ２４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。ライゲーション反応液に、酢酸ナトリウムを０．３Ｍになるように加え、フェノール・クロロホルム抽出を行い、化合物ＡＡｔＲ－９を調製した。

　化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－７、化合物ＡＡｔＲ－９の3種類のフェノール・クロロホルム抽出液を等量で混合し、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－７、化合物ＡＡｔＲ－９の混合液）をエタノール沈殿により回収した。

　化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－８、化合物ＡＡｔＲ－９の3種類のフェノール・クロロホルム抽出液を等量で混合し、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－８、化合物ＡＡｔＲ－９の混合液）をエタノール沈殿により回収した。

　２５μＭ　転写tRNA(Glu)aac-CA（配列番号：８３（ＴＲ－７））、５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．５、２０ｍＭ　ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ　ＡＴＰ、０．６ｕｎｉｔ／μｌ　Ｔ４　ＲＮＡリガーゼ（New england bio lab.社）、０．２５ｍＭ　アミノアシル化ｐＣｐＡ（ｔｓ１４のＤＭＳＯ溶液）となるように、Ｎｕｃｌｅａｓｅ　ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒでメスアップした反応液を調製し、１５℃で４５分間ライゲーション反応を行った。ただし、Ｔ４　ＲＮＡリガーゼおよびアミノアシル化ｐＣｐＡを加える前の反応液は、９５℃で２分間加熱後、室温で５分間放置し、予めｔＲＮＡのリフォールディングを行った。
　ライゲーション反応液に、酢酸ナトリウムを０．３Ｍになるように加え、フェノール・クロロホルム抽出を行い、化合物ＡＡｔＲ－１０を調製した。
　同様に、転写tRNA(Glu)uac-CA（配列番号：８４（ＴＲ－８））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。ライゲーション反応液に、酢酸ナトリウムを０．３Ｍになるように加え、フェノール・クロロホルム抽出を行い、化合物ＡＡｔＲ－１１を調製した。
　同様に、tRNA(Glu)Lac-CA（配列番号：６１（ＬＲ－３））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。ライゲーション反応液に、酢酸ナトリウムを０．３Ｍになるように加え、フェノール・クロロホルム抽出を行い、化合物ＡＡｔＲ－１２を調製した。
　同様に、転写tRNA(Glu)cac-CA（配列番号：８５（ＴＲ－９））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＴＳ２４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。ライゲーション反応液に、酢酸ナトリウムを０．３Ｍになるように加え、フェノール・クロロホルム抽出を行い、化合物ＡＡｔＲ－１３を調製した。

　化合物ＡＡｔＲ－１０、化合物ＡＡｔＲ－１１、化合物ＡＡｔＲ－１３の3種類のフェノール・クロロホルム抽出液を等量で混合し、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－１０、化合物ＡＡｔＲ－１１、化合物ＡＡｔＲ－１３の混合液）をエタノール沈殿により回収した。

　化合物ＡＡｔＲ－１０、化合物ＡＡｔＲ－１２、化合物ＡＡｔＲ－１３の3種類のフェノール・クロロホルム抽出液を等量で混合し、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－１０、化合物ＡＡｔＲ－１２、化合物ＡＡｔＲ－１３の混合液）をエタノール沈殿により回収した。

　２５μＭ　転写tRNA(Glu)gcc-CA（配列番号：８６（ＴＲ－１０））、５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．５、２０ｍＭ　ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ　ＡＴＰ、０．６ｕｎｉｔ／μｌ　Ｔ４　ＲＮＡリガーゼ（New england bio lab.社）、０．２５ｍＭ　アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＴＳ２４のＤＭＳＯ溶液）となるように、Ｎｕｃｌｅａｓｅ　ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒでメスアップした反応液を調製し、１５℃で４５分間ライゲーション反応を行った。ただし、Ｔ４　ＲＮＡリガーゼおよびアミノアシル化ｐＣｐＡを加える前の反応液は、９５℃で２分間加熱後、室温で５分間放置し、予めｔＲＮＡのリフォールディングを行った。
　ライゲーション反応液に、酢酸ナトリウムを０．３Ｍになるように加え、フェノール・クロロホルム抽出を行い、化合物ＡＡｔＲ－１４を調製した。
　同様に、転写tRNA(Glu)ucc-CA（配列番号：８７（ＴＲ－１１））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。ライゲーション反応液に、酢酸ナトリウムを０．３Ｍになるように加え、フェノール・クロロホルム抽出を行い、化合物ＡＡｔＲ－１５を調製した。
　同様に、tRNA(Glu)Lcc-CA（配列番号：６３（ＬＲ－４））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。ライゲーション反応液に、酢酸ナトリウムを０．３Ｍになるように加え、フェノール・クロロホルム抽出を行い、化合物ＡＡｔＲ－１６を調製した。
　同様に、転写tRNA(Glu)ccc-CA（配列番号：８８（ＴＲ－１２））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１６）を前述の方法でライゲーション反応を行った。ライゲーション反応液に、酢酸ナトリウムを０．３Ｍになるように加え、フェノール・クロロホルム抽出を行い、化合物ＡＡｔＲ－１７を調製した。

　化合物ＡＡｔＲ－１４、化合物ＡＡｔＲ－１５、化合物ＡＡｔＲ－１７の3種類のフェノール・クロロホルム抽出液を１：２：１の比率になるように混合し、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－１４、化合物ＡＡｔＲ－１５、化合物ＡＡｔＲ－１７の混合液）をエタノール沈殿により回収した。

　化合物ＡＡｔＲ－１４、化合物ＡＡｔＲ－１６、化合物ＡＡｔＲ－１７の3種類のフェノール・クロロホルム抽出液を１：２：１で混合し、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－１４、化合物ＡＡｔＲ－１６、化合物ＡＡｔＲ－１７の混合液）をエタノール沈殿により回収した。

　アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液は、翻訳混合物に添加する直前に１ｍＭ酢酸ナトリウムに溶解した。

　化合物ＡＡｔＲ－１９を調製するために、２５μＭ　転写tRNA(Asp)aag-CA（配列番号：１５３（ＴＲ－１４））、５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．５、２０ｍＭ　ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ　ＡＴＰ、０．６ｕｎｉｔ／μｌ　Ｔ４　ＲＮＡリガーゼ（New england bio lab.社）、０．２５ｍＭ　アミノアシル化ｐＣｐＡ（特許記載（ＷＯ２０１８１４３１４５Ａ１）の方法で合成した化合物ｔｓ１４のＤＭＳＯ溶液）となるように、Ｎｕｃｌｅａｓｅ　ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒでメスアップした反応液を調製し、１５℃で４５分間ライゲーション反応を行った。ただし、Ｔ４　ＲＮＡリガーゼおよびアミノアシル化ｐＣｐＡを加える前の反応液は、９５℃で２分間加熱後、室温で５分間放置し、予めｔＲＮＡのリフォールディングを行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－２０を調製するために、転写tRNA(Asp)uag-CA（配列番号：１５４（ＴＲ－１５））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１５）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－２１を調製するために、tRNA(Asp)Lag-CA（配列番号：１３４（ＬＲ－５））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１５）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－２２を調製するために、転写tRNA(Asp)cag-CA（配列番号：１５５（ＴＲ－１６））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＴＳ２４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　それぞれのligation反応後の溶液に０．３Ｍ酢酸ナトリウムを加えたあと、フェノール・クロロホルム溶液を加えた段階で、各ligation産物を混合し、混合物の状態でフェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、回収した。
　具体的には、化合物ＡＡｔＲ－１９、化合物ＡＡｔＲ－２０、化合物ＡＡｔＲ－２２の3種類のligation産物に0.3M酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、等量で混合し、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－１９、化合物ＡＡｔＲ－２０、化合物ＡＡｔＲ－２２の混合液）を調製した。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－１９、化合物ＡＡｔＲ－２１、化合物ＡＡｔＲ－２２の3種類のligation産物に0.3M酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、等量で混合し、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－１９、化合物ＡＡｔＲ－２１、化合物ＡＡｔＲ－２２の混合液）を調製した。

　化合物ＡＡｔＲ－２３を調製するために、２５μＭ　転写tRNA(AsnE2)aag-CA（配列番号：１５６（ＴＲ－１７））、５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．５、２０ｍＭ　ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ　ＡＴＰ、０．６ｕｎｉｔ／μｌ　Ｔ４　ＲＮＡリガーゼ（New england bio lab.社）、０．２５ｍＭ　アミノアシル化ｐＣｐＡ（特許記載（ＷＯ２０１８１４３１４５Ａ１）の方法で合成した化合物ｔｓ１４のＤＭＳＯ溶液）となるように、Ｎｕｃｌｅａｓｅ　ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒでメスアップした反応液を調製し、１５℃で４５分間ライゲーション反応を行った。ただし、Ｔ４　ＲＮＡリガーゼおよびアミノアシル化ｐＣｐＡを加える前の反応液は、９５℃で２分間加熱後、室温で５分間放置し、予めｔＲＮＡのリフォールディングを行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－２４を調製するために、転写tRNA(AsnE2)uag-CA（配列番号：１５７（ＴＲ－１８））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１５）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－２５を調製するために、tRNA(AsnE2)Lag-CA（配列番号：１３７（ＬＲ－６））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１５）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－２６を調製するために、転写tRNA(AsnE2)cag-CA（配列番号：１５８（ＴＲ－１９））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＴＳ２４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　それぞれのligation反応後の溶液に０．３Ｍ酢酸ナトリウムを加えたあと、フェノール・クロロホルム溶液を加えた段階で、各ligation産物を混合し、混合物の状態でフェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、回収した。
　具体的には、化合物ＡＡｔＲ－２３、化合物ＡＡｔＲ－２４、化合物ＡＡｔＲ－２６の3種類のligation産物に0.3M酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、等量で混合し、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－２３、化合物ＡＡｔＲ－２４、化合物ＡＡｔＲ－２６の混合液）を調製した。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－２３、化合物ＡＡｔＲ－２５、化合物ＡＡｔＲ－２６の3種類のligation産物に0.3M酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、等量で混合し、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－２３、化合物ＡＡｔＲ－２５、化合物ＡＡｔＲ－２６の混合液）を調製した。

　化合物ＡＡｔＲ－６を調製するために、２５μＭ　転写tRNA(Glu)aag-CA（配列番号：８０（ＴＲ－４））、５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．５、２０ｍＭ　ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ　ＡＴＰ、０．６ｕｎｉｔ／μｌ　Ｔ４　ＲＮＡリガーゼ（New england bio lab.社）、０．２５ｍＭ　アミノアシル化ｐＣｐＡ（ｔｓ１４のＤＭＳＯ溶液）となるように、Ｎｕｃｌｅａｓｅ　ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒでメスアップした反応液を調製し、１５℃で４５分間ライゲーション反応を行った。ただし、Ｔ４　ＲＮＡリガーゼおよびアミノアシル化ｐＣｐＡを加える前の反応液は、９５℃で２分間加熱後、室温で５分間放置し、予めｔＲＮＡのリフォールディングを行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－９を調製するために、転写tRNA(Glu)cag-CA（配列番号：８２（ＴＲ－６））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＴＳ２４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－２７を調製するために、転写tRNA(Glu)uag-CA（配列番号：８１（ＴＲ－５））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１６）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－２８を調製するために、tRNA(Glu)Lag-CA（配列番号：５９（ＬＲ－２））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１６）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－２９を調製するために、転写tRNA(Glu)uag-CA（配列番号：８１（ＴＲ－５））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ３９）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－３０を調製するために、tRNA(Glu)Lag-CA（配列番号：５９（ＬＲ－２））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ３９）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－３１を調製するために、転写tRNA(Glu)uag-CA（配列番号：８１（ＴＲ－５））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ４０）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－３２を調製するために、tRNA(Glu)Lag-CA（配列番号：５９（ＬＲ－２））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ４０）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　それぞれのligation反応後の溶液に０．３Ｍ酢酸ナトリウムを加えたあと、フェノール・クロロホルム溶液を加えた段階で、各ligation産物を混合し、混合物の状態で、もしくは単一の状態のまま、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、回収した。
　具体的には、化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－２７、化合物ＡＡｔＲ－９の3種類のligation産物に0.3M酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、等量で混合し、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－２７、化合物ＡＡｔＲ－９の混合液）を調製した。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－２８、化合物ＡＡｔＲ－９の3種類のligation産物に0.3M酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、等量で混合し、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－２８、化合物ＡＡｔＲ－９の混合液）を調製した。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－２９、化合物ＡＡｔＲ－９の3種類のligation産物に0.3M酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、等量で混合し、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－２９、化合物ＡＡｔＲ－９の混合液）を調製した。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－３０、化合物ＡＡｔＲ－９の3種類のligation産物に0.3M酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、等量で混合し、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－３０、化合物ＡＡｔＲ－９の混合液）を調製した。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－３１、化合物ＡＡｔＲ－９の3種類のligation産物に0.3M酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、等量で混合し、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－３１、化合物ＡＡｔＲ－９の混合液）を調製した。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－３２、化合物ＡＡｔＲ－９の3種類のligation産物に0.3M酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、等量で混合し、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－３２、化合物ＡＡｔＲ－９の混合液）を調製した。
　化合物ＡＡｔＲ－９のligation産物に0.3M酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡを調製した。

　化合物ＡＡｔＲ－３３を調製するために、２５μＭ　転写tRNA(Glu)gcg-CA（配列番号：１５９（ＴＲ－２０））、５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．５、２０ｍＭ　ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ　ＡＴＰ、０．６ｕｎｉｔ／μｌ　Ｔ４　ＲＮＡリガーゼ（New england bio lab.社）、０．２５ｍＭ　アミノアシル化ｐＣｐＡ（特許記載（ＷＯ２０１８１４３１４５Ａ１）の方法で合成した化合物ＴＳ２４のＤＭＳＯ溶液）となるように、Ｎｕｃｌｅａｓｅ　ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒでメスアップした反応液を調製し、１５℃で４５分間ライゲーション反応を行った。ただし、Ｔ４　ＲＮＡリガーゼおよびアミノアシル化ｐＣｐＡを加える前の反応液は、９５℃で２分間加熱後、室温で５分間放置し、予めｔＲＮＡのリフォールディングを行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－３４を調製するために、tRNA(Glu)Lcg-CA（配列番号：１４０（ＬＲ－７））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－３５を調製するために、転写tRNA(Glu)ccg-CA（配列番号：１６０（ＴＲ－２１））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ｔｓ１４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－３６を調製するために、転写tRNA(Glu)aau-CA（配列番号：１６１（ＴＲ－２２））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ｔｓ１４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－３７を調製するために、tRNA(Glu)Lau-CA（配列番号：１４２（ＬＲ－８））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－３８を調製するために、転写tRNA(Glu)cau-CA（配列番号：１６２（ＴＲ－２３））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＴＳ２４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　それぞれのligation反応後の溶液に０．３Ｍ酢酸ナトリウムを加えたあと、フェノール・クロロホルム溶液を加えた段階で、各ligation産物を混合し、混合物の状態で、もしくは単一の状態のまま、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、回収した。
　具体的には、化合物ＡＡｔＲ－３３、化合物ＡＡｔＲ－３５の2種類のligation産物に0.3M酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、等量で混合し、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－３３、化合物ＡＡｔＲ－３５の混合液）を調製した。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－３６、化合物ＡＡｔＲ－３８の2種類のligation産物に0.3M酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、等量で混合し、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－３６、化合物ＡＡｔＲ－３８の混合液）を調製した。
　化合物ＡＡｔＲ－３４、化合物ＡＡｔＲ－３７のそれぞれのligation産物に0.3M酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡを調製した。

　化合物ＡＡｔＲ－６を調製するために、転写tRNA(Glu)aag-CA（配列番号：８０（ＴＲ－４））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ｔｓ１４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－９を調製するために、tRNA(Glu)cag-CA（配列番号：８２（ＴＲ－６））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＴＳ２４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　それぞれのligation反応後の溶液に０．３Ｍ酢酸ナトリウムを加えたあと、フェノール・クロロホルム溶液を加えた段階で、各ligation産物を１：２になるように混合し、混合物の状態でフェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、回収した。
　具体的には、化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－９の2種類のligation産物に0.3M酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、１：２となるように混合し、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－９の混合液）を調製した。

　化合物ＡＡｔＲ－３９を調製するために、転写tRNA(Glu)uag-CA（配列番号：８１（ＴＲ－５））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１５）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　同様に、化合物ＡＡｔＲ－４０を調製するために、tRNA(Glu)(Agm)ag-CA（配列番号：１３８（ＡＲ－１））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１５）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
　それぞれのligation反応後の溶液に０．３Ｍ酢酸ナトリウムを加えたあと、フェノール・クロロホルム溶液を加えた後、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、回収した。

アミノアシルｐＣｐＡを用いたｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシルｔＲＮＡの調製
　２５μＭ　転写tRNA(fMet)cau-CA（配列番号：８９（ＴＲ－１３））、５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．５、２０ｍＭ　ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ　ＡＴＰ、０．６ｕｎｉｔ／μｌ　Ｔ４　ＲＮＡリガーゼ（New england bio lab.社）、０．２５ｍＭ　アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＭＴ０１のＤＭＳＯ溶液）となるように、Ｎｕｃｌｅａｓｅ　ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒでメスアップした反応液を調製し、１５℃で４５分間ライゲーション反応を行った。ただし、Ｔ４　ＲＮＡリガーゼおよびアミノアシル化ｐＣｐＡを加える前の反応液は、９５℃で２分間加熱後、室温で５分間放置し、予めｔＲＮＡのリフォールディングを行った。
　ライゲーション反応液に、酢酸ナトリウムを０．３Ｍになるように加え、フェノール・クロロホルム抽出し、ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシルｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－１８）をエタノール沈殿により回収した。
　ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡは、翻訳混合物に添加する直前に１ｍＭ酢酸ナトリウムに溶解した。

化合物ＡＡｔＲ－１　配列番号：９０
dA-tRNA(Glu)aga

化合物ＡＡｔＲ－２　配列番号：９１
SPh2Cl-tRNA(Glu)uga

化合物ＡＡｔＲ－３　配列番号：９２
SPh2Cl-lig-tRNA(Glu)uga

化合物ＡＡｔＲ－４　配列番号：９３
SPh2Cl-tRNA(Glu)Lga

化合物ＡＡｔＲ－５　配列番号：９４
nBuG-tRNA(Glu)cga

化合物ＡＡｔＲ－６　配列番号：９５
nBuG-tRNA(Glu)aag

化合物ＡＡｔＲ－７　配列番号：９６
Pic2-tRNA(Glu)uag

化合物ＡＡｔＲ－８　配列番号：９７
Pic2-tRNA(Glu)Lag

化合物ＡＡｔＲ－９　配列番号：９８
dA-tRNA(Glu)cag

化合物ＡＡｔＲ－１０　配列番号：９９
nBuG-tRNA(Glu)aac

化合物ＡＡｔＲ－１１　配列番号：１００
Pic2-tRNA(Glu)uac

化合物ＡＡｔＲ－１２　配列番号：１０１
Pic2-tRNA(Glu)Lac

化合物ＡＡｔＲ－１３　配列番号：１０２
dA-tRNA(Glu)cac

化合物ＡＡｔＲ－１４　配列番号：１０３
dA-tRNA(Glu)gcc

化合物ＡＡｔＲ－１５　配列番号：１０４
Pic2-tRNA(Glu)ucc

化合物ＡＡｔＲ－１６　配列番号：１０５
Pic2-tRNA(Glu)Lcc

化合物ＡＡｔＲ－１７　配列番号：１０６
MeHph-tRNA(Glu)ccc

化合物ＡＡｔＲ－１８　配列番号：１０７
BdpFL-Phe-tRNA(fMet)cau

化合物ＡＡｔＲ－１９　配列番号：１７５
nBuG-tRNA(Asp)aag　

化合物ＡＡｔＲ－２０　配列番号：１７６
SPh2Cl-tRNA(Asp)uag

化合物ＡＡｔＲ－２１　配列番号：１７７
SPh2Cl-tRNA(Asp)Lag

化合物ＡＡｔＲ－２２　配列番号：１７８
dA-tRNA(Asp)cag

化合物ＡＡｔＲ－２３　配列番号：１７９
nBuG-tRNA(AsnE2)aag

化合物ＡＡｔＲ－２４　配列番号：１８０
SPh2Cl-tRNA(AsnE2)uag

化合物ＡＡｔＲ－２５　配列番号：１８１
SPh2Cl-tRNA(AsnE2)Lag

化合物ＡＡｔＲ－２６　配列番号：１８２
dA-tRNA(AsnE2)cag

化合物ＡＡｔＲ－２７　配列番号：１８３
MeHph-tRNA(Glu)uag

化合物ＡＡｔＲ－２８　配列番号：１８４
MeHph-tRNA(Glu)Lag

化合物ＡＡｔＲ－２９　配列番号：１８５
F3Cl-tRNA(Glu)uag

化合物ＡＡｔＲ－３０　配列番号：１８６
F3Cl-tRNA(Glu)Lag

化合物ＡＡｔＲ－３１　配列番号：１８７
SiPen-tRNA(Glu)uag

化合物ＡＡｔＲ－３２　配列番号：１８８
SiPen-tRNA(Glu)Lag

化合物ＡＡｔＲ－３３　配列番号：１８９
dA-tRNA(Glu)gcg

化合物ＡＡｔＲ－３４　配列番号：１９０
Pic2-tRNA(Glu)Lcg

化合物ＡＡｔＲ－３５　配列番号：１９１
nBuG-tRNA(Glu)ccg

化合物ＡＡｔＲ－３６　配列番号：１９２
nBuG-tRNA(Glu)aau

化合物ＡＡｔＲ－３７　配列番号：１９３
Pic2-tRNA(Glu)Lau

化合物ＡＡｔＲ－３８　配列番号：１９４
dA-tRNA(Glu)cau

化合物ＡＡｔＲ－３９　配列番号：１９５
SPh2Cl-tRNA(Glu)uag

化合物ＡＡｔＲ－４０　配列番号：１９６
SPh2Cl-tRNA(Glu)(Agm)ag

実施例１２　ペプチドの翻訳合成
　次に、３種類のアミノアシル化ｔＲＮＡが存在する状況で、１つのコドンボックスにおける３種類のアミノ酸の読み分けを確認するための実験を実施した。具体的には、同一コドンボックス内の3種類のコドンのうちいずれか１つを含み、それ以外は同一配列の鋳型ｍＲＮＡ（鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：１２０（ｍＲ－１）～配列番号：１３１（ｍＲ－１２））を、Ｌｙｓｉｄｉｎｅ修飾ｔＲＮＡを含まないアミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－１、化合物ＡＡｔＲ－２、化合物ＡＡｔＲ－５の混合液、化合物ＡＡｔＲ－１、化合物ＡＡｔＲ－３、化合物ＡＡｔＲ－５の混合液、化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－７、化合物ＡＡｔＲ－９の混合液、化合物ＡＡｔＲ－１０、化合物ＡＡｔＲ－１１、化合物ＡＡｔＲ－１３の混合液、化合物ＡＡｔＲ－１４、化合物ＡＡｔＲ－１５、化合物ＡＡｔＲ－１７の混合液）、もしくはＬｙｓｉｄｉｎｅ修飾ｔＲＮＡを含むアミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－１、化合物ＡＡｔＲ－４、化合物ＡＡｔＲ－５の混合液、化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－８、化合物ＡＡｔＲ－９の混合液、化合物ＡＡｔＲ－１０、化合物ＡＡｔＲ－１２、化合物ＡＡｔＲ－１３の混合液、化合物ＡＡｔＲ－１４、化合物ＡＡｔＲ－１６、化合物ＡＡｔＲ－１７の混合液）を用いて翻訳し、ペプチド化合物を翻訳合成した。

　翻訳系は、原核生物由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるＰＵＲＥ　ｓｙｓｔｅｍを用いた。具体的には、翻訳液（１ｍＭ　ＧＴＰ，１ｍＭ　ＡＴＰ，２０ｍＭ　クレアチンリン酸，５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．６，１００ｍＭ　酢酸カリウム，１０ｍＭ　酢酸マグネシウム，２ｍＭ　スペルミジン，１ｍＭ　ジチオスレイトール，１．５ｍｇ／ｍｌ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．２６μＭ　ＥＦ－Ｇ，０．２４μＭ　ＲＦ２，０．１７μＭ　ＲＦ３，０．５μＭ　ＲＲＦ，４μｇ／ｍｌ　クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ　ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ　無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ　ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，２．７μＭ　ＩＦ１，０．４μＭ　ＩＦ２，１．５μＭ　ＩＦ３，４０μＭ　ＥＦ－Ｔｕ，５４μＭ　ＥＦ－Ｔｓ，１μＭ　ＥＦ－Ｐ－Ｌｙｓ，０．４ｕｎｉｔ／μｌ　RNasein Ribonuclease inhibitor(Promega社，Ｎ２１１１），１．２μＭ　リボソーム，０．５ｍＭ　ＰＧＡ，０．０９μＭ　ＧｌｙＲＳ，０．４μＭ　ＩｌｅＲＳ，０．６８μＭ　ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ　ＰｒｏＲＳ，０．０９μＭ　ＴｈｒＲＳ）に、１μＭ　鋳型ｍＲＮＡ（配列番号：１２０（ｍＲ－１）、配列番号：１２１（ｍＲ－２）、もしくは配列番号：１２２（ｍＲ－３））、それぞれの鋳型ｍＲＮＡにコードされている天然アミノ酸群をそれぞれ０．２５ｍＭずつ、ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－１８）を１０μＭ、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－１、化合物ＡＡｔＲ－２、化合物ＡＡｔＲ－５の混合液、化合物ＡＡｔＲ－１、化合物ＡＡｔＲ－３、化合物ＡＡｔＲ－５の混合液、もしくは化合物ＡＡｔＲ－１、化合物ＡＡｔＲ－４、化合物ＡＡｔＲ－５の混合液）を３０μＭになるように翻訳反応混合物に添加し、３７℃で１時間静置することで行った。

　そのほかの配列（配列番号：１２３（ｍＲ－４），配列番号：１２４（ｍＲ－５），配列番号：１２５（ｍＲ－６））に関しても無細胞翻訳を行った。
　具体的には、翻訳液（１ｍＭ　ＧＴＰ，１ｍＭ　ＡＴＰ，２０ｍＭ　クレアチンリン酸，５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．６，１００ｍＭ　酢酸カリウム，１０ｍＭ　酢酸マグネシウム，２ｍＭ　スペルミジン，１ｍＭ　ジチオスレイトール，１．５ｍｇ／ｍｌ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．２６μＭ　ＥＦ－Ｇ，０．２４μＭ　ＲＦ２，０．１７μＭ　ＲＦ３，０．５μＭ　ＲＲＦ，４μｇ／ｍｌ　クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ　ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ　無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ　ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，２．７μＭ　ＩＦ１，０．４μＭ　ＩＦ２，１．５μＭ　ＩＦ３，４０μＭ　ＥＦ－Ｔｕ，３５μＭ　ＥＦ－Ｔｓ，１μＭ　ＥＦ－Ｐ－Ｌｙｓ，０．４ｕｎｉｔ／μｌ　RNasein Ribonuclease inhibitor(Promega社，Ｎ２１１１），１．２μＭ　リボソーム，０．５ｍＭ　ＰＧＡ，０．０９μＭ　ＧｌｙＲＳ，０．４μＭ　ＩｌｅＲＳ，０．６８μＭ　ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ　ＰｒｏＲＳ，０．０９μＭ　ＴｈｒＲＳ）に、１μＭ　鋳型ｍＲＮＡ（配列番号：１２３（ｍＲ－４）、配列番号：１２４（ｍＲ－５）、もしくは配列番号：１２５（ｍＲ－６））、それぞれの鋳型ｍＲＮＡにコードされている天然アミノ酸群をそれぞれ０．２５ｍＭずつ、ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－１８）を１０μＭ、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－７、化合物ＡＡｔＲ－９の混合液、もしくは化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－８、化合物ＡＡｔＲ－９の混合液）を３０μＭになるように翻訳反応混合物に添加し、３７℃で１時間静置することで行った。

　そのほかの配列（配列番号：１２６（ｍＲ－７），配列番号：１２７（ｍＲ－８），配列番号：１２８（ｍＲ－９））に関しても無細胞翻訳を行った。
　具体的には、翻訳液（１ｍＭ　ＧＴＰ，１ｍＭ　ＡＴＰ，２０ｍＭ　クレアチンリン酸，５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．６，１００ｍＭ　酢酸カリウム，１０ｍＭ　酢酸マグネシウム，２ｍＭ　スペルミジン，１ｍＭ　ジチオスレイトール，１．５ｍｇ／ｍｌ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．２６μＭ　ＥＦ－Ｇ，０．２４μＭ　ＲＦ２，０．１７μＭ　ＲＦ３，０．５μＭ　ＲＲＦ，４μｇ／ｍｌ　クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ　ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ　無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ　ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，２．７μＭ　ＩＦ１，０．４μＭ　ＩＦ２，１．５μＭ　ＩＦ３，４０μＭ　ＥＦ－Ｔｕ，３５μＭ　ＥＦ－Ｔｓ，１μＭ　ＥＦ－Ｐ－Ｌｙｓ，０．４ｕｎｉｔ／μｌ　RNasein Ribonuclease inhibitor(Promega社，Ｎ２１１１），１．２μＭ　リボソーム，０．５ｍＭ　ＰＧＡ，０．０９μＭ　ＧｌｙＲＳ，０．４μＭ　ＩｌｅＲＳ，０．６８μＭ　ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ　ＰｒｏＲＳ，０．０９μＭ　ＴｈｒＲＳ）に、１μＭ　鋳型ｍＲＮＡ（配列番号：１２６（ｍＲ－７）、配列番号：１２７（ｍＲ－８）、もしくは配列番号：１２８（ｍＲ－９））、それぞれの鋳型ｍＲＮＡにコードされている天然アミノ酸群をそれぞれ０．２５ｍＭずつ、ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－１８）を１０μＭ、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－１０、化合物ＡＡｔＲ－１１、化合物ＡＡｔＲ－１３の混合液、もしくは化合物ＡＡｔＲ－１０、化合物ＡＡｔＲ－１２、化合物ＡＡｔＲ－１３の混合液）を３０μＭになるように翻訳反応混合物に添加し、３７℃で１時間静置することで行った。

　そのほかの配列（配列番号：１２９（ｍＲ－１０），配列番号：１３０（ｍＲ－１１），配列番号：１３１（ｍＲ－１２））に関しても無細胞翻訳を行った。
　具体的には、翻訳液（１ｍＭ　ＧＴＰ，１ｍＭ　ＡＴＰ，２０ｍＭ　クレアチンリン酸，５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．６，１００ｍＭ　酢酸カリウム，１０ｍＭ　酢酸マグネシウム，２ｍＭ　スペルミジン，１ｍＭ　ジチオスレイトール，１．５ｍｇ／ｍｌ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．２６μＭ　ＥＦ－Ｇ，０．２４μＭ　ＲＦ２，０．１７μＭ　ＲＦ３，０．５μＭ　ＲＲＦ，４μｇ／ｍｌ　クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ　ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ　無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ　ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，２．７μＭ　ＩＦ１，０．４μＭ　ＩＦ２，１．５μＭ　ＩＦ３，４０μＭ　ＥＦ－Ｔｕ，５４μＭ　ＥＦ－Ｔｓ，１μＭ　ＥＦ－Ｐ－Ｌｙｓ，０．４ｕｎｉｔ／μｌ　RNasein Ribonuclease inhibitor(Promega社，Ｎ２１１１），１．２μＭ　リボソーム，０．５ｍＭ　ＰＧＡ，０．４μＭ　ＩｌｅＲＳ，０．０４μＭ　ＬｅｕＲＳ，０．６８μＭ　ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ　ＰｒｏＲＳ，０．０９μＭ　ＴｈｒＲＳ）に、１μＭ　鋳型ｍＲＮＡ（配列番号：１２９（ｍＲ－１０）、配列番号：１３０（ｍＲ－１１）、もしくは配列番号：１３１（ｍＲ－１２））、それぞれの鋳型ｍＲＮＡにコードされている天然アミノ酸群をそれぞれ０．２５ｍＭずつ、ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－１８）を１０μＭ、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－１４、化合物ＡＡｔＲ－１５、化合物ＡＡｔＲ－１７の混合液、もしくは化合物ＡＡｔＲ－１４、化合物ＡＡｔＲ－１６、化合物ＡＡｔＲ－１７の混合液）を４０μＭになるように翻訳反応混合物に添加し、３７℃で１時間静置することで行った。
　鋳型ｍＲＮＡと期待される翻訳ペプチド化合物、その分子量（計算値）に関しては、以下の表６に記載した。

　次に、前項で実施したｔＲＮＡｂｏｄｙ配列と異なるｂｏｄｙ配列のｔＲＮＡを使用し、３種類のアミノアシル化ｔＲＮＡが存在する状況で、１つのコドンボックスにおける３種類のアミノ酸の読み分けを確認するための実験を実施した。具体的には、同一コドンボックス内の3種類のコドンのうちいずれか１つを含み、それ以外は同一配列の鋳型ｍＲＮＡ（鋳型ｍＲＮＡ配列番号：１２３（ｍＲ－４）、配列番号：１２４（ｍＲ－５）、配列番号：１２５（ｍＲ－６））を、Ｌｙｓｉｄｉｎｅ修飾ｔＲＮＡを含まないアミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－１９、化合物ＡＡｔＲ－２０、化合物ＡＡｔＲ－２２の混合液、化合物ＡＡｔＲ－２３、化合物ＡＡｔＲ－２４、化合物ＡＡｔＲ－２６の混合液、）、もしくはＬｙｓｉｄｉｎｅ修飾ｔＲＮＡを含むアミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－１９、化合物ＡＡｔＲ－２１、化合物ＡＡｔＲ－２２の混合液、化合物ＡＡｔＲ－２３、化合物ＡＡｔＲ－２５、化合物ＡＡｔＲ－２６の混合液）を用いて翻訳し、ペプチド化合物を翻訳合成した。

　翻訳系は、原核生物由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるＰＵＲＥ　ｓｙｓｔｅｍを用いた。具体的には、翻訳液（１ｍＭ　ＧＴＰ，１ｍＭ　ＡＴＰ，２０ｍＭ　クレアチンリン酸，５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．６，１００ｍＭ　酢酸カリウム，１０ｍＭ　酢酸マグネシウム，２ｍＭスペルミジン，１ｍＭ　ジチオスレイトール，１．５ｍｇ／ｍｌ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．２６μＭ　ＥＦ－Ｇ，０．２４μＭ　ＲＦ２，０．１７μＭ　ＲＦ３，０．５μＭ　ＲＲＦ，４μｇ／ｍｌ　クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ　ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ　無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ　ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，２．７μＭ　ＩＦ１，０．４μＭ　ＩＦ２，１．５μＭ　ＩＦ３，４０μＭ　ＥＦ－Ｔｕ，５４μＭ　ＥＦ－Ｔｓ，１μＭ　ＥＦ－Ｐ－Ｌｙｓ，０．４ｕｎｉｔ／μｌ　RNasein Ribonuclease inhibitor（Promega社，Ｎ２１１１），１．２μＭ　リボソーム，０．５ｍＭ　ＰＧＡ，０．０９μＭ　ＧｌｙＲＳ，０．４μＭ　ＩｌｅＲＳ，０．６８μＭ　ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ　ＰｒｏＲＳ，０．０９μＭ　ＴｈｒＲＳ）に、１μＭ　鋳型ｍＲＮＡ（配列番号：１２３（ｍＲ－４）、配列番号：１２４（ｍＲ－５）、もしくは配列番号：１２５（ｍＲ－６））、それぞれの鋳型ｍＲＮＡにコードされている天然アミノ酸群をそれぞれ０．２５ｍＭずつ、ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－１８）を１０μＭ、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－１９、化合物ＡＡｔＲ－２０、化合物ＡＡｔＲ－２２の混合液、化合物ＡＡｔＲ－１９、化合物ＡＡｔＲ－２１、化合物ＡＡｔＲ－２２の混合液、化合物ＡＡｔＲ－２３、化合物ＡＡｔＲ－２４、化合物ＡＡｔＲ－２６の混合液、もしくは、化合物ＡＡｔＲ－２３、化合物ＡＡｔＲ－２５、化合物ＡＡｔＲ－２６の混合液）を３０μＭになるように翻訳反応混合物に添加し、３７℃で１時間静置することで行った。

　鋳型ｍＲＮＡと期待される翻訳ペプチド化合物、その分子量（計算値）に関しては、以下の表７に記載した。

　次に、前項でＬｙｓｉｄｉｎｅ修飾ｔＲＮＡにアミノアシル化したアミノ酸以外のアミノ酸を、Ｌｙｓｉｄｉｎｅ修飾ｔＲＮＡにアミノアシル化し、３種類のアミノアシル化ｔＲＮＡが存在する状況で、１つのコドンボックスにおける３種類のアミノ酸の読み分けを確認するための翻訳実験を実施した。具体的には、同一コドンボックス内の3種類のコドンのうちいずれか１つを含み、それ以外は同一配列の鋳型ｍＲＮＡ（鋳型ｍＲＮＡ配列番号：１２３（ｍＲ－４）、配列番号：１２４（ｍＲ－５）、配列番号：１２５（ｍＲ－６））を、Ｌｙｓｉｄｉｎｅ修飾ｔＲＮＡを含まないアミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－２７、化合物ＡＡｔＲ－９の混合液、化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－２９、化合物ＡＡｔＲ－９の混合液、化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－３１、化合物ＡＡｔＲ－９の混合液）、もしくはＬｙｓｉｄｉｎｅ修飾ｔＲＮＡを含むアミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－２８、化合物ＡＡｔＲ－９の混合液、化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－３０、化合物ＡＡｔＲ－９の混合液、化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－３２、化合物ＡＡｔＲ－９の混合液）を用いて翻訳し、ペプチド化合物を翻訳合成した。

　翻訳系は、原核生物由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるＰＵＲＥ　ｓｙｓｔｅｍを用いた。具体的には、翻訳液（１ｍＭ　ＧＴＰ，１ｍＭ　ＡＴＰ，２０ｍＭ　クレアチンリン酸，５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．６，１００ｍＭ　酢酸カリウム，１０ｍＭ　酢酸マグネシウム，２ｍＭスペルミジン，１ｍＭ　ジチオスレイトール，１．５ｍｇ／ｍｌ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．２６μＭ　ＥＦ－Ｇ，０．２４μＭ　ＲＦ２，０．１７μＭ　ＲＦ３，０．５μＭ　ＲＲＦ，４μｇ／ｍｌ　クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ　ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ　無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ　ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，２．７μＭ　ＩＦ１，０．４μＭ　ＩＦ２，１．５μＭ　ＩＦ３，４０μＭ　ＥＦ－Ｔｕ，４９．３μＭ　ＥＦ－Ｔｓ，１μＭ　ＥＦ－Ｐ－Ｌｙｓ，０．４ｕｎｉｔ／μｌ　RNasein Ribonuclease inhibitor（Promega社，Ｎ２１１１），１．２μＭ　リボソーム，０．５ｍＭ　ＰＧＡ，０．０９μＭ　ＧｌｙＲＳ，０．４μＭ　ＩｌｅＲＳ，０．６８μＭ　ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ　ＰｒｏＲＳ，０．０９μＭ　ＴｈｒＲＳ）に、１μＭ　鋳型ｍＲＮＡ（配列番号：１２３（ｍＲ－４）、配列番号：１２４（ｍＲ－５）、もしくは配列番号：１２５（ｍＲ－６））、それぞれの鋳型ｍＲＮＡにコードされている天然アミノ酸群をそれぞれ０．２５ｍＭずつ、ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－１８）を１０μＭ、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－２７、化合物ＡＡｔＲ－９の混合液、もしくは、化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－２８、化合物ＡＡｔＲ－９の混合液）を３０μＭになるように翻訳反応混合物に添加し、３７℃で１時間静置することで行った。
　同様に、上述のｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡまでの翻訳反応混合物に対して、化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－２９、化合物ＡＡｔＲ－９の混合液、もしくは、化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－３０、化合物ＡＡｔＲ－９の混合液を３０μＭ、化合物ＡＡｔＲ－９を１０μＭになるように添加し、３７℃で１時間静置することで行った。
　同様に、上述のｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡまでの翻訳反応混合物に対して、化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－３１、化合物ＡＡｔＲ－９の混合液、もしくは、化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－３２、化合物ＡＡｔＲ－９の混合液を３０μＭ、化合物ＡＡｔＲ－９を１０μＭになるように添加し、３７℃で１時間静置することで行った。

　鋳型ｍＲＮＡと期待される翻訳ペプチド化合物、その分子量（計算値）に関しては、以下の表８に記載した。

　更に対象のコドンボックスを広げて、Ｌｙｓｉｄｉｎｅ修飾ｔＲＮＡによる読み分け効果を評価するための実験を実施した。
　具体的には、同一コドンボックス内の3種類のコドンのうちいずれか１つを含み、それ以外は同一配列の鋳型ｍＲＮＡ（鋳型ｍＲＮＡ配列番号：１６９（ｍＲ－１３）、配列番号：１７０（ｍＲ－１４）、配列番号：１７１（ｍＲ－１５）、もしくは配列番号：１７２（ｍＲ－１６）、配列番号：１７３（ｍＲ－１７）、配列番号：１７４（ｍＲ－１８））を、Ｌｙｓｉｄｉｎｅ修飾ｔＲＮＡを含むアミノアシル化ｔＲＮＡ混合液と、Ｌｙｓｉｄｉｎｅ修飾ｔＲＮＡを含まないアミノアシル化ｔＲＮＡ混合液を用いて翻訳し、ペプチド化合物を翻訳合成した。

　翻訳系は、原核生物由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるＰＵＲＥ　ｓｙｓｔｅｍを用いた。具体的には、翻訳液（１ｍＭ　ＧＴＰ，１ｍＭ　ＡＴＰ，２０ｍＭ　クレアチンリン酸，５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．６，１００ｍＭ　酢酸カリウム，１０ｍＭ　酢酸マグネシウム，２ｍＭスペルミジン，１ｍＭ　ジチオスレイトール，１．５ｍｇ／ｍｌ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．２６μＭ　ＥＦ－Ｇ，０．２４μＭ　ＲＦ２，０．１７μＭ　ＲＦ３，０．５μＭ　ＲＲＦ，４μｇ／ｍｌ　クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ　ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ　無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ　ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，２．７μＭ　ＩＦ１，０．４μＭ　ＩＦ２，１．５μＭ　ＩＦ３，４０μＭ　ＥＦ－Ｔｕ，４９．３μＭ　ＥＦ－Ｔｓ，１μＭ　ＥＦ－Ｐ－Ｌｙｓ，０．４ｕｎｉｔ／μｌ　RNasein Ribonuclease inhibitor（Promega社，Ｎ２１１１），１．２μＭ　リボソーム，０．５ｍＭ　ＰＧＡ，０．０９μＭ　ＧｌｙＲＳ，０．４μＭ　ＩｌｅＲＳ，０．６８μＭ　ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ　ＰｒｏＲＳ，０．０９μＭ　ＴｈｒＲＳ）に、１μＭ　鋳型ｍＲＮＡ（配列番号：１６９（ｍＲ－１３）、配列番号：１７０（ｍＲ－１４）、もしくは配列番号：１７１（ｍＲ－１５））、それぞれの鋳型ｍＲＮＡにコードされている天然アミノ酸群をそれぞれ０．２５ｍＭずつ、ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－１８）を１０μＭ、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－３３、化合物ＡＡｔＲ－３５の混合液）を３０μＭ、アミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－３４）を１０μＭになるように翻訳反応混合物に添加し、３７℃で１時間静置することで行った。
　もう一つのコドンボックスにおいても同様に、翻訳系は、原核生物由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるＰＵＲＥ　ｓｙｓｔｅｍを用いた。具体的には、翻訳液（１ｍＭ　ＧＴＰ，１ｍＭ　ＡＴＰ，２０ｍＭ　クレアチンリン酸，５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．６，１００ｍＭ　酢酸カリウム，１０ｍＭ　酢酸マグネシウム，２ｍＭスペルミジン，１ｍＭ　ジチオスレイトール，１．５ｍｇ／ｍｌ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．２６μＭ　ＥＦ－Ｇ，０．２４μＭ　ＲＦ２，０．１７μＭ　ＲＦ３，０．５μＭ　ＲＲＦ，４μｇ／ｍｌ　クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ　ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ　無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ　ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，２．７μＭ　ＩＦ１，０．４μＭ　ＩＦ２，１．５μＭ　ＩＦ３，４０μＭ　ＥＦ－Ｔｕ，４９．３μＭ　ＥＦ－Ｔｓ，１μＭ　ＥＦ－Ｐ－Ｌｙｓ，０．４ｕｎｉｔ／μｌ　RNasein Ribonuclease inhibitor（Promega社，Ｎ２１１１），１．２μＭ　リボソーム，０．５ｍＭ　ＰＧＡ，０．０９μＭ　ＧｌｙＲＳ，０．４μＭ　ＩｌｅＲＳ，０．６８μＭ　ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ　ＰｒｏＲＳ，０．０９μＭ　ＴｈｒＲＳ，０．０２μＭ　ＶａｌＲＳ，２．７３μＭ　ＡｌａＲＳ，０．０４μＭ　ＬｅｕＲＳ，０．０４μＭ　ＳｅｒＲＳ）に、１μＭ　鋳型ｍＲＮＡ（配列番号：１７２（ｍＲ－１６）、配列番号：１７３（ｍＲ－１７）、もしくは配列番号：１７４（ｍＲ－１８））、それぞれの鋳型ｍＲＮＡにコードされている天然アミノ酸群をそれぞれ０．２５ｍＭずつ、ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－１８）を１０μＭ、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－３６、化合物ＡＡｔＲ－３８の混合液）を３０μＭ、アミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－３７）を１０μＭになるように翻訳反応混合物に添加し、３７℃で１時間静置することで行った。

　鋳型ｍＲＮＡと期待される翻訳ペプチド化合物、その分子量（計算値）に関しては、以下の表９に記載した。

　次に、Ａｇｍａｔｉｄｉｎｅ修飾の効果を確認するために、調製した３種類のアミノアシル化ｔＲＮＡが存在する状況で、１つのコドンボックスにおける３種類のアミノ酸の読み分けを確認するための実験を行った。具体的には、同一コドンボックス内の3種類のコドンのうちいずれか１つを含み、それ以外は同一配列の鋳型ｍＲＮＡ（鋳型ｍＲＮＡ配列番号：１２３（ｍＲ－４）、配列番号：１２４（ｍＲ－５）、配列番号：１２５（ｍＲ－６））を、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－９の混合液）に対し、アミノアシル化ｔＲＮＡ（ＡＡｔＲ－３９）、もしくはアミノアシル化Ａｇｍａｔｉｄｉｎｅ修飾ｔＲＮＡ（ＡＡｔＲ－４０）を加えた翻訳系で反応させ、ペプチド化合物を翻訳合成した。

　翻訳系は、原核生物由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるＰＵＲＥ　ｓｙｓｔｅｍを用いた。具体的には、翻訳液（１ｍＭ　ＧＴＰ，１ｍＭ　ＡＴＰ，２０ｍＭ　クレアチンリン酸，５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．６，１００ｍＭ　酢酸カリウム，１０ｍＭ　酢酸マグネシウム，２ｍＭスペルミジン，１ｍＭ　ジチオスレイトール，１．５ｍｇ／ｍｌ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．２６μＭ　ＥＦ－Ｇ，０．２４μＭ　ＲＦ２，０．１７μＭ　ＲＦ３，０．５μＭ　ＲＲＦ，４μｇ／ｍｌ　クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ　ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ　無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ　ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，２．７μＭ　ＩＦ１，０．４μＭ　ＩＦ２，１．５μＭ　ＩＦ３，４０μＭ　ＥＦ－Ｔｕ，４９．３μＭ　ＥＦ－Ｔｓ，１μＭ　ＥＦ－Ｐ－Ｌｙｓ，０．４ｕｎｉｔ／μｌ　RNasein Ribonuclease inhibitor（Promega社，Ｎ２１１１），１．２μＭ　リボソーム，０．５ｍＭ　ＰＧＡ，０．０９μＭ　ＧｌｙＲＳ，０．４μＭ　ＩｌｅＲＳ，０．６８μＭ　ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ　ＰｒｏＲＳ，０．０９μＭ　ＴｈｒＲＳ）に、１μＭ　鋳型ｍＲＮＡ（配列番号：１２３（ｍＲ－４）、配列番号：１２４（ｍＲ－５）、もしくは配列番号：１２５（ｍＲ－６））、それぞれの鋳型ｍＲＮＡにコードされている天然アミノ酸群をそれぞれ０．２５ｍＭずつ、ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－１８）を１０μＭ、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－９の混合液）を３０μＭ、アミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－３９もしくは化合物ＡＡｔＲ－４０）を２０μＭになるように翻訳反応混合物に添加し、３７℃で１時間静置することで行った。

　鋳型ｍＲＮＡと期待される翻訳ペプチド化合物、その分子量（計算値）に関しては、以下の表１０に記載した。

　鋳型ＤＮＡ（配列番号：１０８（Ｄ－１４）～配列番号：１１９（Ｄ－２５）、配列番号：１６３（Ｄ－３６）～配列番号：１６８（Ｄ－４１））から、RiboMAX Large Scale RNA production System T7（Promega社，Ｐ１３００）を用いたin vitro 転写反応により鋳型ｍＲＮＡ（配列番号：１２０（ｍＲ－１）～配列番号：１３１（ｍＲ－１２）、配列番号：１６９（ｍＲ－１３）～配列番号：１７４（ｍＲ－１８））を合成し、RNeasy Mini kit（Qiagen社）により精製した。

鋳型ＤＮＡ　配列番号：１０８（Ｄ－１４）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTTTTATTATTGGTTTTTCTATTATTCCGATTGGTTAAGCTTCG
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１０９（Ｄ－１５）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTTTTATTATTGGTTTTTCAATTATTCCGATTGGTTAAGCTTCG
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１１０（Ｄ－１６）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTTTTATTATTGGTTTTTCGATTATTCCGATTGGTTAAGCTTCG
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１１１（Ｄ－１７）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTTTTATTATTGGTTTTCTTATTATTCCGATTGGTTAAGCTTCG
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１１２（Ｄ－１８）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTTTTATTATTGGTTTTCTAATTATTCCGATTGGTTAAGCTTCG
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１１３（Ｄ－１９）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTTTTATTATTGGTTTTCTGATTATTCCGATTGGTTAAGCTTCG
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１１４（Ｄ－２０）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTTTTATTATTGGTTTTGTTATTATTCCGATTGGTTAAGCTTCG
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１１５（Ｄ－２１）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTTTTATTATTGGTTTTGTAATTATTCCGATTGGTTAAGCTTCG
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１１６（Ｄ－２２）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTTTTATTATTGGTTTTGTGATTATTCCGATTGGTTAAGCTTCG
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１１７（Ｄ－２３）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTTTTATTATTCTATTTGGTATTATTCCGATTCTATAAGCTTCG
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１１８（Ｄ－２４）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTTTTATTATTCTATTTGGAATTATTCCGATTCTATAAGCTTCG
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１１９（Ｄ－２５）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTTTTATTATTCTATTTGGGATTATTCCGATTCTATAAGCTTCG
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１６３（Ｄ－３６）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTTTTATTATTGGTTTTCGTATTATTCCGATTGGTTAAGCTTCG
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１６４（Ｄ－３７）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTTTTATTATTGGTTTTCGAATTATTCCGATTGGTTAAGCTTCG
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１６５（Ｄ－３８）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTTTTATTATTGGTTTTCGGATTATTCCGATTGGTTAAGCTTCG
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１６６（Ｄ－３９）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTTTTCTACTAGGTTTTATTCTACTACCGCTAGGTTAAGCTTCG
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１６７（Ｄ－４０）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTTTTCTACTAGGTTTTATACTACTACCGCTAGGTTAAGCTTCG
鋳型ＤＮＡ　配列番号：１６８（Ｄ－４１）
ＤＮＡ配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTTTTCTACTAGGTTTTATGCTACTACCGCTAGGTTAAGCTTCG

鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：１２０（ｍＲ－１）
ＲＮＡ配列：
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGACUUUUAUUAUUGGUUUUUCUAUUAUUCCGAUUGGUUAAGCUUCG
鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：１２１（ｍＲ－２）
ＲＮＡ配列：
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGACUUUUAUUAUUGGUUUUUCAAUUAUUCCGAUUGGUUAAGCUUCG
鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：１２２（ｍＲ－３）
ＲＮＡ配列：
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGACUUUUAUUAUUGGUUUUUCGAUUAUUCCGAUUGGUUAAGCUUCG
鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：１２３（ｍＲ－４）
ＲＮＡ配列：
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGACUUUUAUUAUUGGUUUUCUUAUUAUUCCGAUUGGUUAAGCUUCG
鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：１２４（ｍＲ－５）
ＲＮＡ配列：
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGACUUUUAUUAUUGGUUUUCUAAUUAUUCCGAUUGGUUAAGCUUCG
鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：１２５（ｍＲ－６）
ＲＮＡ配列：
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGACUUUUAUUAUUGGUUUUCUGAUUAUUCCGAUUGGUUAAGCUUCG
鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：１２６（ｍＲ－７）
ＲＮＡ配列：
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGACUUUUAUUAUUGGUUUUGUUAUUAUUCCGAUUGGUUAAGCUUCG
鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：１２７（ｍＲ－８）
ＲＮＡ配列：
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGACUUUUAUUAUUGGUUUUGUAAUUAUUCCGAUUGGUUAAGCUUCG
鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：１２８（ｍＲ－９）
ＲＮＡ配列：
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGACUUUUAUUAUUGGUUUUGUGAUUAUUCCGAUUGGUUAAGCUUCG
鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：１２９（ｍＲ－１０）
ＲＮＡ配列：
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGACUUUUAUUAUUCUAUUUGGUAUUAUUCCGAUUCUAUAAGCUUCG
鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：１３０（ｍＲ－１１）
ＲＮＡ配列：
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGACUUUUAUUAUUCUAUUUGGAAUUAUUCCGAUUCUAUAAGCUUCG
鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：１３１（ｍＲ－１２）
ＲＮＡ配列：
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGACUUUUAUUAUUCUAUUUGGGAUUAUUCCGAUUCUAUAAGCUUCG
鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：１６９（ｍＲ－１３）
ＲＮＡ配列：
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGACUUUUAUUAUUGGUUUUCGUAUUAUUCCGAUUGGUUAAGCUUCG
鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：１７０（ｍＲ－１４）
ＲＮＡ配列：
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGACUUUUAUUAUUGGUUUUCGAAUUAUUCCGAUUGGUUAAGCUUCG
鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：１７１（ｍＲ－１５）
ＲＮＡ配列：
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGACUUUUAUUAUUGGUUUUCGGAUUAUUCCGAUUGGUUAAGCUUCG
鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：１７２（ｍＲ－１６）
ＲＮＡ配列：
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGACUUUUCUACUAGGUUUUAUUCUACUACCGCUAGGUUAAGCUUCG
鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：１７３（ｍＲ－１７）
ＲＮＡ配列：
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGACUUUUCUACUAGGUUUUAUACUACUACCGCUAGGUUAAGCUUCG
鋳型ｍＲＮＡ　配列番号：１７４（ｍＲ－１８）
ＲＮＡ配列：
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGACUUUUCUACUAGGUUUUAUGCUACUACCGCUAGGUUAAGCUUCG

実施例１３　翻訳ペプチドの分析
　実施例１２にて調製した非天然ペプチド翻訳溶液を10倍希釈し、LC-FLR-MSの装置を用いて分析した。分析データはMSデータより対象となる翻訳ペプチドの保持時間を同定し、該当保持時時間の蛍光ピークを定量することで、ペプチド翻訳量を評価した。なお、定量評価は実施例８にて合成したLCT12を標品により検量線を作成し、相対定量により含有量を算出した。LC-MSは下記の表１１の条件に従い、対象となるサンプルに応じて最適な条件を選択して分析した。

　評価した結果、lysidineまたはagmatidine修飾tRNAを含むアミノアシル化ｔRNA混合液を用いた翻訳条件でのみ、１コドンボックスで３アミノ酸を読み分けられた。複数のコドンボックスでlysidine修飾の読み分け効果が示された（図１１～図１４、図２０、図２１、表１２～表１５、表２１、表２２）。読み分けの効果は、tRNA bodyの塩基配列を他のものに置き換えた場合でも確認することができた（図１５、図１６、表１６、表１７）。また、tRNAに連結されているアミノ酸を他の種類のものに置き換えた場合でも同様の効果が確認することができた（図１７～図１９、表１８～表２０）。agmatidine修飾されたtRNAによってもlysidine修飾tRNAと同様の読み分け効果が得られることが確認された（図２２、表２３）。

Lysidine修飾の有無による、１コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価結果の表である（評価したコドン：ＵＣＵ，ＵＣＡ，ＵＣＧ）。

Lysidine修飾の有無による、１コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価結果の表である（評価したコドン：ＣＵＵ，ＣＵＡ，ＣＵＧ）。

Lysidine修飾の有無による、１コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価結果の表である（評価したコドン：ＧＵＵ，ＧＵＡ，ＧＵＧ）。

Lysidine修飾の有無による、１コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価結果の表である（評価したコドン：ＧＧＵ，ＧＧＡ，ＧＧＧ）。

Asp-tRNA body配列を用いた、Lysidine修飾の有無による、１コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価結果の表である（評価したコドン：ＣＵＵ，ＣＵＡ，ＣＵＧ）。

AsnE2-tRNA body配列を用いた、Lysidine修飾の有無による、１コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価結果の表である（評価したコドン：ＣＵＵ，ＣＵＡ，ＣＵＧ）。

Lysidine修飾による、１コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価結果の表である（評価したコドン：ＣＧＵ，ＣＧＡ，ＣＧＧ）。

Lysidine修飾による、１コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価結果の表である（評価したコドン：ＡＵＵ，ＡＵＡ，ＡＵＧ）。

Agmatidine修飾の有無による、１コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価結果の表である（評価したコドン：ＣＵＵ，ＣＵＡ，ＣＵＧ）。

　前述の発明は、明確な理解を助ける目的のもと、実例および例示を用いて詳細に記載したが、本明細書における記載および例示は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書で引用したすべての特許文献および科学文献の開示は、その全体にわたって、参照により明示的に本明細書に組み入れられる。

　一態様において、本開示の変異tRNAは、天然の遺伝暗号表では読み分けられていないNNAのコドンとNNGのコドンの読み分けが可能である点で有用である。一態様において、本開示の翻訳系は、天然の遺伝暗号表を用いた翻訳系よりも多くの種類のアミノ酸を翻訳すること（コドン拡張）が可能である点で有用である。

Claims

tRNAを改変することにより作製されている変異tRNAであって、当該改変が、N₁N₂N₃で表されるアンチコドンの改変後の1文字目のヌクレオシドN₁がライシジン(k2C)、ライシジン誘導体、アグマチジン(agm2C)、またはアグマチジン誘導体のいずれかである改変を含み、N₂およびN₃はそれぞれ、該アンチコドンの2文字目および3文字目の任意のヌクレオシドである、変異tRNA。
改変前のN₁がシチジン(C)であって、かつ当該シチジン(C)からライシジン(k2C)への改変が、配列番号：５１のアミノ酸配列を有するライシジン合成酵素（tRNA^Ile-lysidine synthetase; TilS）では触媒され得ない、請求項１に記載の変異tRNA。
改変前のN₁がシチジン(C)であって、かつ当該シチジン(C)からアグマチジン(agm2C)への改変が、配列番号：５２のアミノ酸配列を有するアグマチジン合成酵素（tRNA^Ile-agmatidine synthetase; TiaS）では触媒され得ない、請求項１に記載の変異tRNA。
M₁M₂Aで表されるコドン（ここで、M₁およびM₂はそれぞれコドンの1文字目および2文字目のヌクレオシドを表し、M₁およびM₂はそれぞれアデノシン(A)、グアノシン(G)、シチジン(C)、ウリジン(U)のいずれかから選択され、3文字目のヌクレオシドはアデノシンである）に相補的なアンチコドンを有する、請求項１から３のいずれかに記載の変異tRNA。
アンチコドンがk2CN₂N₃またはagm2CN₂N₃（ここで、アンチコドンの1文字目のヌクレオシドはライシジン(k2C)またはアグマチジン(agm2C)であり、2文字目のヌクレオシド(N₂)、3文字目のヌクレオシド(N₃)はそれぞれM₂、M₁に相補的である）で表される、請求項４に記載の変異tRNA。
天然の遺伝暗号表において、3文字目のヌクレオシドがAであるコドンとGであるコドンがともに同じアミノ酸をコードしているコドンボックスを構成するコドンから、M₁およびM₂が選択される、請求項４または５に記載の変異tRNA。
天然の遺伝暗号表において、3文字目のヌクレオシドがUであるコドン、Cであるコドン、Aであるコドン、およびGであるコドンがいずれも同じアミノ酸をコードしているコドンボックスを構成するコドンから、M₁およびM₂が選択される、請求項４または５に記載の変異tRNA。
M₁およびM₂が以下（ｉ）から（ｖｉ）からなる群より選択される、請求項４または５に記載の変異tRNA；
（ｉ） M₁がウリジン(U)であり、M₂がシチジン(C)である、
（ｉｉ） M₁がシチジン(C)であり、M₂がウリジン(U)である、
（ｉｉｉ） M₁がシチジン(C)であり、M₂がシチジン(C)である、
（ｉｖ） M₁がシチジン(C)であり、M₂がグアノシン(G)である、
（ｖ） M₁がアデノシン(A)であり、M₂がウリジン(U)である、
（ｖｉ） M₁がグアノシン(G)であり、M₂がウリジン(U)である、
（ｖｉｉ） M₁がグアノシン(G)であり、M₂がシチジン(C)である、および
（ｖｉｉｉ） M₁がグアノシン(G)であり、M₂がグアノシン(G)である。
3’末端にアミノ酸またはアミノ酸類縁体が結合している、請求項１から８のいずれかに記載の変異tRNA。
複数の異なる種類のtRNAを含む翻訳系であって、請求項１から９のいずれかに記載の変異tRNAを含む、翻訳系。
（ａ）請求項１から９のいずれかに記載の変異tRNA、および（ｂ）M₁M₂Gで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAを含む、請求項１０に記載の翻訳系。
さらに、（ｃ）M₁M₂UまたはM₁M₂Cで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAを含む、請求項１０または１１に記載の翻訳系。
請求項１１（ａ）、請求項１１（ｂ）、および請求項１２（ｃ）に記載のtRNAに結合しているアミノ酸またはアミノ酸類縁体がいずれも互いに異なる、請求項１２に記載の翻訳系。
請求項１０から１３のいずれかに記載の翻訳系を用いて核酸を翻訳することを含む、ペプチドの製造方法。
ペプチドおよび該ペプチドをコードする核酸を含む核酸－ペプチド複合体であって、前記ペプチドをコードする核酸は以下の（Ａ）または（Ｂ）のいずれかに記載の３種類のコドンを含み：
（Ａ）M₁M₂U、M₁M₂A、およびM₁M₂G；
（Ｂ）M₁M₂C、M₁M₂A、およびM₁M₂G、
前記ペプチド上において、前記３種類のコドンに対応するアミノ酸の種類がいずれも異なる、前記核酸－ペプチド複合体。