KR20220121831A - 번역용 조성물 및 펩타이드의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
코돈의 읽기 오류에 의해 의도하지 않은 아미노산이 잘못되게 번역되어 버리는 비율을 저감하는 것을 가능하게 하는 새로운 수단을 제공하는 것을 과제의 하나로 한다. 몇몇 태양에 있어서, 본 개시는, tRNA의 32, 33, 37 및 38위(tRNA 넘버링 규칙)에 특정의 염기의 조합을 갖는 tRNA를 포함하는 번역용 조성물을 제공한다. 본 개시의 특정의 태양에 의하면, 코돈의 읽기 오류에 의해 의도하지 않은 아미노산이 도입되는 비율을 저감할 수 있다.
Description
본 개시는, 번역용 조성물 및 펩타이드의 제조 방법에 관한 것이다.
단백질 번역에 관련되는 인자만을 혼합함으로써 인공적으로 재구성한 무세포 번역계(비특허문헌 1)는, 생명 현상의 해명으로부터 신약 개발에 이르기까지 폭넓은 영역에서 이용되고 있다. 무세포 번역계는 미생물이나 세포를 사용하지 않기 때문에, 독성이 높은 단백질의 합성에 이용할 수 있다. 또한 아미노산, tRNA, 아미노아실 tRNA 합성 효소와 같은 구성 성분을 목적에 맞추어 제거 또는 첨가할 수 있기 때문에, 코돈과 아미노산의 대응부를 변경하는 것(유전 암호의 리프로그래밍)도 가능하다. 이러한 특징으로부터, 무세포 번역계는 비천연 아미노산 함유 단백질의 합성이나 다양한 빌딩 블록을 도입한 디스플레이 라이브러리의 구축에도 응용되고 있다. 이와 같이 무세포 번역계는 매우 유용한 기술이지만, 코돈의 읽기 오류에 의해 의도하고 있지 않은 펩타이드가 만들어지는 경우가 있다. 예를 들어, RF1을 비활화시키고, 앰버 코돈(UAG)에 비천연 아미노산을 할당했을 때에, 동 코돈에 대해서 일정한 비율로 티로신(UAU, UAC), 리신(AAG), 글루타민(GAG)이 잘못되게 도입되었던 것이 보고되어 있다(비특허문헌 2).
코돈 복스를 인공적으로 분할하여, 유전 암호의 리프로그래밍을 행했던 예가 보고되어 있다. 비특허문헌 3에서는, C-G-C/G, G-U-C/G 및 G-G-C/G에 대해서, 1개의 비천연 아미노산과 1개의 천연 아미노산을 할당하는 시도가 이루어지고 있다. 동 문헌에는, Gly가 결합한 tRNAGly CCC에 의한 GGC 코돈의 읽기 오류의 저감책으로서, GGC와 상보적인 안티코돈 GCC를 갖고 또한 아미노산이 프리차지(precharge)된 tRNA가 고갈되기 전에 번역 반응을 정지하는 것이 기재되어 있지만, 어떠한 번역용 조성물이면 코돈의 읽기 오류를 저감할 수 있는지는 기재되어 있지 않다. 또한, 비특허문헌 4∼7, 특허문헌 1 및 2에서도, 코돈 복스를 인공적으로 분할하는 시도가 이루어지고 있지만, 코돈의 읽기 오류를 저감하는 방법에 대한 기재는 없다.
tRNA의 안티코돈 루프에 위치하는 32 및 38위에는, 안티코돈의 트리플렛마다 특정의 염기가 보존되어 있음이 알려져 있다. 안티코돈 GGC를 갖는 tRNA(Ala)GGC를 이용한 보고에 의하면, 32 및 38위에 천연의 tRNA(Ala)GGC로 보존되어 있는 염기를 이용했을 경우에는, GUC 코돈의 읽기 오류가 일어나기 어렵고, 한편, 32 및 38위의 염기를 변경했을 경우에는, 동 tRNA에 의한 GUC 코돈의 읽기 오류가 생겨, 잘못되게 알라닌(GCC)이 번역 도입되었던 것이 나타나 있다(비특허문헌 8). 동 문헌은, 천연의 유전 암호표를 이용한, tRNA(Ala)GGC에 의한 GUC 코돈의 읽기 오류의 검증에 머물러, 유전 암호표를 리프로그래밍했을 때에 생길 수 있는 코돈의 읽기 오류에 대한 기재는 없다.
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본 발명은 이와 같은 상황에 비추어 이루어진 것으로, tRNA에 의한 코돈의 읽기 오류에 기인하여 의도하지 않은 아미노산이 잘못되게 번역되어 버리는 비율을 저감하는 것을 가능하게 하는 번역용 조성물 및 해당 번역용 조성물을 이용한 펩타이드의 제조 방법을 제공하는 것을 목적의 하나로 한다.
본 발명자들은, 번역에 사용하는 tRNA의 안티코돈 루프에 특정의 염기를 선택하는 것에 의해, 상기 과제를 해결할 수 있음을 발견했다. 본 개시는 이와 같은 지견에 기초하는 것으로, 구체적으로는 이하에 예시적으로 기재하는 실시태양을 포함하는 것이다.
〔1〕 제 1 아미노산이 결합한 제 1 tRNA와, 제 2 아미노산이 결합한 제 2 tRNA를 포함하는 번역용 조성물로서,
상기 제 1 tRNA의 32, 33, 37 및 38위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기의 조합이,
(1) 32U, 33U, 37G, 38A,
(2) 32A, 33U, 37G, 38U,
(3) 32A, 33U, 37A, 38U,
(4) 32U, 33U, 37G, 38U,
(5) 32U, 33U, 37A, 38U, 또는
(6) 32C, 33U, 37G, 38A
이고,
상기 제 1 tRNA 및 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 서로 상이하고,
상기 제 1 tRNA 및 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 2문자째의 염기가 동일하고,
상기 제 1 tRNA 및 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 3문자째의 염기가 동일하고,
상기 제 1 아미노산 및 상기 제 2 아미노산 중 적어도 1개가 비천연 아미노산이고,
여기에서, A는 아데닌, C는 사이토신, G는 구아닌, U는 우라실인,
상기 조성물.
〔2〕 상기 제 1 tRNA의 안티코돈이 N11N12N13(여기에서, N11, N12, 및 N13은, 서로 독립적으로 A, C, G 또는 U이다)인, 〔1〕에 기재된 조성물.
〔3〕 상기 제 2 tRNA의 안티코돈이 N21N22N23(여기에서, N21, N22, 및 N23은, 서로 독립적으로 A, C, G 또는 U이다)인, 〔1〕 또는 〔2〕에 기재된 조성물.
〔4〕 상기 제 1 tRNA의 tRNA 보디가 키메라 tRNA 보디인, 〔1〕∼〔3〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔5〕 상기 제 1 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 A 또는 G이고, 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 C 또는 U이거나,
상기 제 1 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 C 또는 U이고, 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 A 또는 G인,
〔1〕∼〔4〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔6〕 상기 제 1 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 A 또는 G이고, 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 C 또는 U인, 〔1〕∼〔5〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔7〕 상기 제 1 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 A이고, 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 C이거나,
상기 제 1 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 C이고, 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 A이거나,
상기 제 1 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 G이고, 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 C이거나,
상기 제 1 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 C이고, 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 G이거나,
상기 제 1 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 A이고, 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 U이거나,
상기 제 1 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 U이고, 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 A이거나,
상기 제 1 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 G이고, 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 U이거나, 또는
상기 제 1 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 U이고, 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 G인,
〔1〕∼〔6〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔8〕 상기 제 1 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 A이고, 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 C이거나,
상기 제 1 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 C이고, 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 A이거나,
상기 제 1 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 A이고, 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 U이거나,
상기 제 1 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 U이고, 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 A이거나,
상기 제 1 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 G이고, 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 U이거나, 또는
상기 제 1 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 U이고, 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 G인,
〔1〕∼〔7〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔9〕 상기 제 1 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 A이고, 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 C이거나,
상기 제 1 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 C이고, 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 A이거나,
상기 제 1 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 A이고, 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 U이거나,
상기 제 1 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 G이고, 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 U이거나, 또는
상기 제 1 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 G이고, 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 C인,
〔1〕∼〔7〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔10〕 상기 제 1 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 A이고, 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 C이거나,
상기 제 1 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 C이고, 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 A이거나,
상기 제 1 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 G이고, 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 C이거나, 또는,
상기 제 1 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 C이고, 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 G인,
〔1〕∼〔7〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔11〕 상기 제 1 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 A이고, 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 C이거나, 또는
상기 제 1 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 C이고, 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 A인,
〔1〕∼〔10〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔12〕 상기 제 1 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 G이고, 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 C이거나, 또는,
상기 제 1 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 C이고, 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 G인,
〔1〕∼〔7〕 및 〔10〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔13〕 상기 제 1 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 A이고, 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 U이거나, 또는
상기 제 1 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 U이고, 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 A인,
〔1〕∼〔8〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔14〕 상기 제 1 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 G이고, 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 U이거나, 또는
상기 제 1 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 U이고, 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 G인,
〔1〕∼〔8〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔15〕 상기 제 1 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 A이고, 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 C인, 〔1〕∼〔11〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔16〕 상기 제 1 및 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 2문자째 및 3문자째의 염기의 조합이,
(i) 2문자째에 G, 또한 3문자째에 G,
(ii) 2문자째에 A, 또한 3문자째에 G,
(iii) 2문자째에 C, 또한 3문자째에 C,
(iv) 2문자째에 G, 또한 3문자째에 C,
(v) 2문자째에 A, 또한 3문자째에 C,
(vi) 2문자째에 G, 또한 3문자째에 U,
(vii) 2문자째에 G, 또한 3문자째에 A, 또는
(viii) 2문자째에 C, 또한 3문자째에 G
인, 〔1〕∼〔15〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔17〕 상기 제 1 및 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 2문자째 및 3문자째의 염기의 조합이,
(i) 2문자째에 G, 또한 3문자째에 G,
(ii) 2문자째에 A, 또한 3문자째에 G,
(iii) 2문자째에 C, 또한 3문자째에 C,
(iv) 2문자째에 G, 또한 3문자째에 C,
(v) 2문자째에 A, 또한 3문자째에 C,
(vi) 2문자째에 G, 또한 3문자째에 U, 또는
(vii) 2문자째에 G, 또한 3문자째에 A
인, 〔1〕∼〔16〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔18〕 상기 제 1 및 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 2문자째 및 3문자째의 염기의 조합이,
(i) 2문자째에 G, 또한 3문자째에 G,
(ii) 2문자째에 A, 또한 3문자째에 G, 또는
(iii) 2문자째에 C, 또한 3문자째에 C
인, 〔1〕∼〔17〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔19〕 상기 제 1 및 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 2문자째의 염기가 G이고, 3문자째의 염기가 G인, 〔1〕∼〔18〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔20〕 상기 제 1 및 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 2문자째의 염기가 A이고, 3문자째의 염기가 G인, 〔1〕∼〔18〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔21〕 상기 제 1 및 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 2문자째의 염기가 C이고, 3문자째의 염기가 C인, 〔1〕∼〔18〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔22〕 상기 제 1 tRNA의 1∼31위 및 39∼74위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기 서열이, 서열 번호: 275, 294, 295, 296, 302, 303, 및 304로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 염기 서열을 갖는 tRNA에 있어서의 1∼31위 및 39∼74위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기 서열의 어느 것에서도 유래하지 않는, 〔1〕∼〔21〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔23〕 상기 제 1 tRNA의 1∼31위 및 39∼74위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기 서열이, (a) 서열 번호: 253, (b) 서열 번호: 255, 및 (c) 서열 번호: 254로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 염기 서열을 갖는 tRNA에 있어서의 1∼31위 및 39∼74위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기 서열에서 유래하는, 〔1〕∼〔22〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔24〕 상기 제 1 tRNA의 1∼31위 및 39∼74위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기 서열이, (a) 서열 번호: 253, (b) 서열 번호: 255, 및 (c) 서열 번호: 254로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개에 기재된 염기 서열을 갖는 tRNA에 있어서의 1∼31위 및 39∼74위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기 서열인, 〔1〕∼〔23〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔25〕 상기 제 1 tRNA의 1∼31위 및 39∼74위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기 서열이, 〔24〕의 (a)∼(c) 중 어느 하나에 기재된 염기 서열을 갖는 tRNA에 있어서의 1∼31위 및 39∼74위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기 서열과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는, 〔1〕∼〔24〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔26〕 상기 제 2 tRNA의 1∼31위 및 39∼74위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기 서열이, 서열 번호: 275, 294, 295, 296, 302, 303, 및 304로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 염기 서열을 갖는 tRNA에 있어서의 1∼31위 및 39∼74위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기 서열의 어느 것에서도 유래하지 않는, 〔1〕∼〔25〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔27〕 상기 제 2 tRNA의 1∼31위 및 39∼74위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기 서열이, (a) 서열 번호: 253, (b) 서열 번호: 255, 및 (c) 서열 번호: 254로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 염기 서열을 갖는 tRNA에 있어서의 1∼31위 및 39∼74위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기 서열에서 유래하는, 〔1〕∼〔26〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔28〕 상기 제 2 tRNA의 1∼31위 및 39∼74위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기 서열이, (a) 서열 번호: 253, (b) 서열 번호: 255, 및 (c) 서열 번호: 254로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 염기 서열을 갖는 tRNA에 있어서의 1∼31위 및 39∼74위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기 서열인, 〔1〕∼〔27〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔29〕 상기 제 2 tRNA의 1∼31위 및 39∼74위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기 서열이, 〔28〕의 (a)∼(c) 중 어느 하나에 기재된 염기 서열을 갖는 tRNA에 있어서의 1∼31위 및 39∼74위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기 서열과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는, 〔1〕∼〔28〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔30〕 상기 제 1 tRNA와 상기 제 2 tRNA에 있어서의 1∼31위, 및, 39∼74위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기 서열이 동일하거나, 또는 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는, 〔1〕∼〔29〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔31〕 상기 제 1 tRNA와 상기 제 2 tRNA에 있어서의 1∼31위, 및, 39∼74위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기 서열이 동일한, 〔1〕∼〔30〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔32〕 상기 키메라 tRNA 보디가, 32, 33, 37 및 38위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기의 조합과, 그것 이외의 부위의 염기 서열의 유래가 상이한 키메라 tRNA 보디인, 〔4〕∼〔31〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔33〕 상기 제 1 tRNA의 32∼38위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기 서열이, 대장균의 야생형 tRNA의 32∼38위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기 서열과는 상이한, 〔1〕∼〔32〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔34〕 상기 제 1 tRNA가 키메라 안티코돈 루프를 갖는 tRNA인, 〔1〕∼〔33〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔35〕 상기 제 2 아미노산이 비천연 아미노산인, 〔1〕∼〔34〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔36〕 상기 제 1 아미노산이 비천연 아미노산인, 〔1〕∼〔35〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔37〕 상기 제 1 아미노산 또는 상기 제 2 아미노산의 어느 것, 또는 양쪽이, N치환 아미노산인, 〔1〕∼〔36〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔38〕 상기 제 1 tRNA가 인공 tRNA인, 〔1〕∼〔37〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔39〕 상기 제 2 tRNA가 인공 tRNA인, 〔1〕∼〔38〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔40〕 상기 제 1 tRNA의 75, 76위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기 서열이 CA인, 〔1〕∼〔39〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔41〕 상기 제 2 tRNA의 75, 76위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기 서열이 CA인, 〔1〕∼〔40〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔42〕 상기 제 1 tRNA가, 수식 염기를 갖지 않는 tRNA인, 〔1〕∼〔41〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔43〕 상기 제 2 tRNA가, 수식 염기를 갖지 않는 tRNA인, 〔1〕∼〔42〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔44〕 상기 제 1 아미노산이, 상기 제 1 tRNA의 3＇ 말단에 결합하고 있는, 〔1〕∼〔43〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔45〕 상기 제 2 아미노산이, 상기 제 2 tRNA의 3＇ 말단에 결합하고 있는, 〔1〕∼〔44〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔46〕 상기 제 1 tRNA가, A, U, G, 및 C로 이루어지는 염기 서열을 갖는 tRNA인, 〔1〕∼〔45〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔47〕 상기 제 2 tRNA가, A, U, G, 및 C로 이루어지는 염기 서열을 갖는 tRNA인, 〔1〕∼〔46〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔48〕 상기 제 1 tRNA가, 번역계 외에서 아미노산이 결합된 tRNA인, 〔1〕∼〔47〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔49〕 상기 제 2 tRNA가, 번역계 외에서 아미노산이 결합된 tRNA인, 〔1〕∼〔48〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔50〕 상기 제 1 tRNA 및 상기 제 2 tRNA가 대장균 유래의 tRNA인, 〔1〕∼〔49〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔51〕 상기 제 1 tRNA의 32, 33, 37 및 38위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기의 조합이,
(1) 32U, 33U, 37G, 38A,
(2) 32A, 33U, 37G, 38U,
(3) 32A, 33U, 37A, 38U, 또는
(4) 32U, 33U, 37G, 38U
인, 〔1〕∼〔50〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔52〕 상기 제 1 tRNA의 32, 33, 37 및 38위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기의 조합이,
(1) 32U, 33U, 37G, 38A,
(2) 32A, 33U, 37G, 38U, 또는
(3) 32A, 33U, 37A, 38U
인, 〔1〕∼〔51〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔53〕 상기 제 1 tRNA의 32, 33, 37 및 38위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기의 조합이,
(1) 32U, 33U, 37G, 38A,
(3) 32A, 33U, 37A, 38U, 또는
(4) 32U, 33U, 37G, 38U
인, 〔1〕∼〔52〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔54〕 상기 제 1 tRNA의 32, 33, 37 및 38위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기의 조합이, 32U, 33U, 37G, 38A, 또는 32U, 33U, 37G, 38U인, 〔1〕∼〔53〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔55〕 상기 제 1 tRNA의 32, 33, 37 및 38위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기의 조합이, 32U, 33U, 37G, 38A인, 〔1〕∼〔54〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔56〕 상기 제 1 tRNA의 32, 33, 37 및 38위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기의 조합이, 32A, 33U, 37G, 38U인, 〔1〕∼〔52〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔57〕 상기 제 1 tRNA의 32, 33, 37 및 38위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기의 조합이, 32A, 33U, 37A, 38U인, 〔1〕∼〔53〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔58〕 상기 제 1 tRNA의 32, 33, 37 및 38위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기의 조합이, 32U, 33U, 37G, 38U인, 〔1〕∼〔51〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔59〕 상기 제 1 tRNA의 32, 33, 37 및 38위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기의 조합이, 32U, 33U, 37A, 38U인, 〔1〕∼〔50〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔60〕 상기 제 1 tRNA의 32, 33, 37 및 38위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기의 조합이, 32C, 33U, 37G, 38A인, 〔1〕∼〔50〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔61〕 상기 제 2 tRNA의 32, 33, 37 및 38위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기의 조합이,
(1) 32U, 33U, 37G, 38A,
(2) 32A, 33U, 37G, 38U,
(3) 32A, 33U, 37A, 38U,
(4) 32U, 33U, 37G, 38U,
(5) 32U, 33U, 37A, 38U, 또는
(6) 32C, 33U, 37G, 38A
인, 〔1〕∼〔60〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔62〕 상기 제 2 tRNA의 32, 33, 37 및 38위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기의 조합이,
(1) 32U, 33U, 37G, 38A,
(2) 32A, 33U, 37G, 38U,
(3) 32A, 33U, 37A, 38U, 또는
(4) 32U, 33U, 37G, 38U
인, 〔1〕∼〔61〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔63〕 상기 제 2 tRNA의 tRNA 보디가 키메라 tRNA 보디인, 〔1〕∼〔62〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔64〕 무세포 번역용 조성물인, 〔1〕∼〔63〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔65〕 재구성 무세포 번역용 조성물인, 〔1〕∼〔64〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔66〕 대장균 유래의 인자로 재구성된 무세포 번역용 조성물인, 〔1〕∼〔65〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔67〕대장균 유래의 리보솜을 포함하는, 〔1〕∼〔66〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔68〕 상기 제 2 tRNA의 안티코돈에 상보적인 코돈을 갖는 mRNA를 포함하는, 〔1〕∼〔67〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔69〕 상기 제 1 tRNA의 안티코돈에 상보적인 코돈 및 상기 제 2 tRNA의 안티코돈에 상보적인 코돈을 갖는 mRNA를 포함하고, 임의로, 상기 제 1 tRNA의 안티코돈에 상보적인 코돈 및 상기 제 2 tRNA의 안티코돈에 상보적인 코돈은, 동일한 mRNA에 포함되어 있어도, 상이한 mRNA에 포함되어 있어도 되는, 〔1〕∼〔68〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔70〕 상기 제 1 tRNA 또는 상기 제 2 tRNA에 아미노산을 결합시키는 것이 가능한 aaRS(amino acyl-tRNA synthetase)를 포함하지 않는, 〔1〕∼〔69〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔71〕 〔1〕∼〔70〕 중 어느 하나에 기재된 조성물(단, 상기 제 1 tRNA 및 상기 제 2 tRNA가 32, 33, 37 및 38위(tRNA 넘버링 규칙)에 상기 〔1〕 (4)에 있어서 특정되는 염기의 조합을 갖고, 1∼31위 및 39∼74위(tRNA 넘버링 규칙)에 서열 번호: 255에 기재된 염기 서열을 갖는 tRNA에 있어서의 1∼31위 및 39∼74위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기 서열을 갖는 키메라 tRNA 보디를 갖는 경우에 있어서, 상기 제 1 tRNA 및 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 조합이, GCG 및 CCG인 조성물, 및, CCG 및 GCG인 조성물을 제외한다).
〔72〕 〔1〕∼〔71〕 중 어느 하나에 기재된 조성물(단, 상기 제 1 tRNA 및 상기 제 2 tRNA가 32, 33, 37 및 38위(tRNA 넘버링 규칙)에 상기 〔1〕 (4)에 있어서 특정되는 염기의 조합을 갖는 키메라 tRNA 보디를 갖는 경우에 있어서, 상기 제 1 tRNA 및 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 조합이, GCG 및 CCG인 조성물, 및, CCG 및 GCG인 조성물을 제외한다).
〔73〕 〔1〕∼〔72〕 중 어느 하나에 기재된 조성물(단, 상기 제 1 tRNA 및 상기 제 2 tRNA가 32, 33, 37 및 38위(tRNA 넘버링 규칙)에 상기 〔1〕 (4)에 있어서 특정되는 염기의 조합을 갖는 키메라 tRNA 보디를 갖는 경우에 있어서, 상기 제 1 tRNA 및 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 조합이, AAG 및 UAG인 조성물, AAG 및 CAG인 조성물, 및 UAG 및 CAG인 조성물을 제외한다).
〔74〕 〔1〕∼〔73〕 중 어느 하나에 기재된 조성물(단, 상기 제 1 tRNA 및 상기 제 2 tRNA가 32, 33, 37 및 38위(tRNA 넘버링 규칙)에 상기 〔1〕 (4)에 있어서 특정되는 염기의 조합을 갖는 키메라 tRNA 보디를 갖는 경우에 있어서, 상기 제 1 tRNA 및 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 2문자째의 염기가 모두 C이고, 3문자째의 염기가 모두 G인 조성물을 제외한다).
〔75〕 〔1〕∼〔74〕 중 어느 하나에 기재된 조성물(단, 상기 제 1 tRNA 및 상기 제 2 tRNA가 32, 33, 37 및 38위(tRNA 넘버링 규칙)에 상기 〔1〕 (4)에 있어서 특정되는 염기의 조합을 갖는 키메라 tRNA 보디를 갖는 경우에 있어서, 상기 제 1 tRNA 및 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 2문자째의 염기가 모두 A이고, 3문자째의 염기가 모두 G인 조성물을 제외한다).
〔76〕 〔1〕∼〔75〕 중 어느 하나에 기재된 조성물(단, 상기 제 1 tRNA 및 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 2문자째의 염기가 모두 C이고, 3문자째의 염기가 모두 G인 조성물을 제외한다).
〔77〕 〔1〕∼〔76〕 중 어느 하나에 기재된 조성물(단, 상기 제 1 tRNA가 32, 33, 37 및 38위(tRNA 넘버링 규칙)에 상기 〔1〕 (4)에 있어서 특정되는 염기의 조합을 갖는 경우에 있어서, 상기 제 1 tRNA 안티코돈의 2문자째의 염기가 A이고, 3문자째의 염기가 G인 조성물을 제외한다).
〔78〕 〔1〕∼〔77〕 중 어느 하나에 기재된 조성물(단, 상기 제 1 tRNA가 32, 33, 37 및 38위(tRNA 넘버링 규칙)에 상기 〔1〕 (1)에 있어서 특정되는 염기의 조합을 갖는 경우에 있어서, 상기 제 1 tRNA의 안티코돈이 UGG 및 CGG인 조성물을 제외한다).
〔79〕 〔1〕∼〔78〕 중 어느 하나에 기재된 조성물(단, 상기 제 1 tRNA가 32, 33, 37 및 38위(tRNA 넘버링 규칙)에 상기 〔1〕 (2)에 있어서 특정되는 염기의 조합을 갖는 경우에 있어서, 상기 제 1 tRNA의 안티코돈이 AGG 및 GGG인 조성물을 제외한다).
〔80〕 〔1〕∼〔79〕 중 어느 하나에 기재된 조성물(단, 상기 제 1 tRNA가 32, 33, 37 및 38위(tRNA 넘버링 규칙)에 상기 〔1〕 (6)에 있어서 특정되는 염기의 조합을 갖는 키메라 tRNA 보디를 갖는 경우에 있어서, 상기 제 1 tRNA의 안티코돈이 GCG 및 CCG인 조성물을 제외한다).
〔81〕 〔1〕∼〔80〕 중 어느 하나에 기재된 조성물(단, 상기 제 1 tRNA가 32, 33, 37 및 38위(tRNA 넘버링 규칙)에 상기 〔1〕 (3)에 있어서 특정되는 염기의 조합을 갖는 키메라 tRNA 보디를 갖는 경우에 있어서, 상기 제 1 tRNA의 안티코돈이 AGC 및 GGC인 조성물을 제외한다).
〔82〕 상기 제 1 tRNA 및 상기 제 2 tRNA가 신장 tRNA인, 〔1〕∼〔81〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔83〕 상기 N치환 아미노산이, N-메틸아미노산인, 〔37〕∼〔82〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔84〕 상기 아미노산이, 번역 가능한 아미노산인, 〔1〕∼〔83〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔85〕 상기 제 2 tRNA가 키메라 안티코돈 루프를 갖는 tRNA인, 〔1〕∼〔84〕 중 어느 하나에 기재된 조성물.
〔86〕 상기 제 1 아미노산을 번역계 외에서 tRNA에 결합하는 것에 의해 상기 제 1 tRNA를 조제하는 공정, 및/또는, 상기 제 2 아미노산을 번역계 외에서 tRNA에 결합하는 것에 의해 상기 제 2 tRNA를 조제하는 공정을 포함하는, 〔1〕∼〔85〕 중 어느 하나에 기재된 번역용 조성물의 제조 방법.
〔87〕 상기 제 1 tRNA, 및/또는, 상기 제 2 tRNA를 조제하는 공정이, pCpA법, pdCpA법, 플렉시자임을 이용한 방법, 및 aaRS에 의한 방법으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 방법에 의해 행해지는, 〔86〕에 기재된 방법.
〔88〕 상기 제 1 tRNA를 in vitro 전사에 의해 조제하는 공정을 포함하는, 〔86〕 또는 〔87〕에 기재된 방법.
〔89〕 상기 제 2 tRNA를 in vitro 전사에 의해 조제하는 공정을 포함하는, 〔86〕∼〔88〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔A1〕 〔1〕∼〔85〕 중 어느 하나에 기재된 번역용 조성물 또는 〔86〕∼〔89〕 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 제조된 번역용 조성물을 이용하여 핵산을 번역하는 것을 포함하는, 펩타이드의 제조 방법.
〔A2〕 〔1〕∼〔85〕 중 어느 하나에 기재된 번역용 조성물 또는 〔86〕∼〔89〕 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 제조된 번역용 조성물을 이용하여 핵산을 번역하는 것을 포함하는, 상기 제 1 tRNA에 의한, 상기 제 2 tRNA의 안티코돈에 상보적인 코돈의 읽기 오류를 저감하는 방법.
〔A3〕 상기 핵산이, 상기 제 2 tRNA의 안티코돈에 상보적인 코돈을 갖는 mRNA인, 〔A1〕 또는 〔A2〕에 기재된 방법.
〔A4〕 상기 핵산이, 상기 제 1 tRNA의 안티코돈에 상보적인 코돈을 갖는 mRNA이고, 임의로, 상기 제 1 tRNA의 안티코돈에 상보적인 코돈 및 상기 제 2 tRNA의 안티코돈에 상보적인 코돈은, 동일한 mRNA에 포함되어 있어도, 상이한 mRNA에 포함되어 있어도 되는, 〔A3〕에 기재된 방법.
〔A5〕 상기 핵산이 포함되는 핵산 라이브러리를 번역하여 펩타이드 라이브러리를 얻는 것을 포함하는, 〔A1〕∼〔A4〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔A6〕 상기 제 1 tRNA의 안티코돈에 상보적인 코돈이, 해당 안티코돈과 3염기 모두에 있어서 왓슨-크릭형 염기쌍을 형성하는 코돈인, 〔A1〕∼〔A5〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔A7〕 상기 제 2 tRNA의 안티코돈에 상보적인 코돈이, 해당 안티코돈과 3염기 모두에 있어서 왓슨-크릭형 염기쌍을 형성하는 코돈인, 〔A1〕∼〔A6〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔A8〕 상기 제 1 tRNA의 안티코돈에 상보적인 코돈의 3문자째가, 해당 안티코돈의 1문자째와 wobble 염기쌍을 형성하는, 〔A1〕∼〔A5〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔A9〕 상기 제 2 tRNA의 안티코돈에 상보적인 코돈의 3문자째가, 해당 안티코돈의 1문자째와 wobble 염기쌍을 형성하는, 〔A1〕∼〔A6〕 또는 〔A8〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔A10〕 상기 핵산이 mRNA인, 〔A1〕∼〔A9〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔A11〕 〔A1〕∼〔A10〕 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 제조된 펩타이드 또는 펩타이드 라이브러리.
〔A12〕 〔1〕∼〔85〕 중 어느 하나에 기재된 번역용 조성물 또는 〔86〕∼〔89〕 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 제조된 번역용 조성물을 이용하여 제조된 펩타이드.
〔A13〕 〔1〕∼〔85〕 중 어느 하나에 기재된 번역용 조성물 또는 〔86〕∼〔89〕 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 제조된 번역용 조성물을 이용하여 제조된 펩타이드 라이브러리.
〔A14〕 〔A1〕∼〔A10〕 중 어느 하나에 기재된 방법을 이용하여 펩타이드 라이브러리를 제조하는 공정, 및, 해당 펩타이드 라이브러리에 표적 분자를 접촉시키는 공정을 포함하는, 해당 표적 분자에 결합하는 펩타이드의 동정 방법.
〔B1〕제 1 코돈과 상보적인 안티코돈을 갖는 tRNA의 32, 33, 37 및 38위(tRNA 넘버링 규칙)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 염기를 치환하는 것을 포함하는, 상기 tRNA에 의한 제 2 코돈의 읽기 오류를 저감하는 방법으로서,
상기 제 1 코돈과 상기 제 2 코돈의 1문자째는 동일한 염기이고,
상기 제 1 코돈과 상기 제 2 코돈의 2문자째는 동일한 염기이고,
상기 제 1 코돈과 상기 제 2 코돈의 3문자째는 서로 상이한 염기인, 상기 방법.
〔B2〕 상기 치환 후의 32, 33, 37 및 38위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기의 조합이,
(1) 32U, 33U, 37G, 38A,
(2) 32A, 33U, 37G, 38U,
(3) 32A, 33U, 37A, 38U,
(4) 32U, 33U, 37G, 38U,
(5) 32U, 33U, 37A, 38U, 또는
(6) 32C, 33U, 37G, 38A
이고, 여기에서, A는 아데닌, C는 사이토신, G는 구아닌, U는 우라실인, 〔B1〕에 기재된 방법.
〔B3〕 상기 제 1 코돈과 상보적인 안티코돈을 갖는 tRNA의 32, 37 및 38위(tRNA 넘버링 규칙)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 염기를 치환하는 것을 포함하는, 〔B1〕 또는 〔B2〕에 기재된 방법.
〔B4〕 상기 제 1 코돈이 M1M2X이고, 상기 제 2 코돈이 M1M2Y이고,
상기 M1 및 상기 M2는 각각 독립적으로 A, C, G 또는 U이고,
상기 X 및 상기 Y는 각각 A, C, G 및 U로부터 선택되는, 서로 상이한 염기인, 〔B1〕∼〔B3〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔B5〕 상기 X 및 상기 Y의 염기의 조합이, 이하의 군으로부터 선택되는 어느 것인, 〔B4〕에 기재된 방법:
(a1) U와 G; (a2) G와 U; (a3) U와 A; (a4) A와 U; (a5) C와 A; (a6) A와 C; (a7) C와 G; 및 (a8) G와 C.
〔B6〕 상기 X 및 상기 Y의 염기의 조합이, 이하의 군으로부터 선택되는 어느 것인〔B4〕 또는 〔B5〕에 기재된 방법:
(a1) U와 G; (a2) G와 U; (a3) U와 A; (a5) C와 A; 및 (a7) C와 G.
〔B7〕 상기 X 및 상기 Y의 염기의 조합이, (a1) U와 G, 또는, (a2) G와 U인, 〔B5〕에 기재된 방법.
〔B8〕 상기 X 및 상기 Y의 염기의 조합이 (a1) U와 G인, 〔B5〕∼〔B7〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔B9〕 상기 X 및 상기 Y의 염기의 조합이 (a2) G와 U인, 〔B5〕∼〔B7〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔B10〕 상기 X 및 상기 Y의 염기의 조합이 (a3) U와 A인, 〔B5〕 또는 〔B6〕에 기재된 방법.
〔B11〕 상기 X 및 상기 Y의 염기의 조합이 (a5) C와 A인, 〔B5〕 또는 〔B6〕에 기재된 방법.
〔B12〕 상기 X 및 상기 Y의 염기의 조합이 (a7) C와 G인, 〔B5〕 또는 〔B6〕에 기재된 방법.
〔B13〕 상기 M1M2가, 이하의 군으로부터 선택되는 어느 염기 서열인, 〔B4〕∼〔B12〕 중 어느 하나에 기재된 방법:
(b1) CC; (b2) CU; (b3) GG; (b4) GU; (b5) GC; (b6) UC; (b7) CG; 및 (b8) AC.
〔B14〕 상기 M1M2가, 이하의 군으로부터 선택되는 어느 염기 서열인 〔B13〕〔B13〕에 기재된 방법:
(b1) CC; (b2) CU; 및 (b3) GG.
〔B15〕 상기 M1M2의 염기 서열이 (b1) CC인, 〔B13〕 또는 〔B14〕에 기재된 방법.
〔B16〕 상기 M1M2의 염기 서열이 (b2) CU인, 〔B13〕 또는 〔B14〕에 기재된 방법.
〔B17〕 상기 M1M2의 염기 서열이 (b3) GG인, 〔B13〕 또는 〔B14〕에 기재된 방법.
〔B18〕 상기 제 1 코돈과 상기 tRNA의 안티코돈이, 3염기 모두에 있어서 왓슨-크릭형 염기쌍을 형성하는, 〔B1〕∼〔B17〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔B19〕 상기 제 1 코돈의 3문자째의 염기와 상기 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가, wobble 염기쌍을 형성하는, 〔B1〕∼〔B17〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔B20〕 상기 tRNA의 1∼31위 및 39∼74위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기 서열이, (a) 서열 번호: 253, (b) 서열 번호: 255, 및 (c) 서열 번호: 254로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개에 기재된 염기 서열을 갖는 tRNA에 있어서의 1∼31위 및 39∼74위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기 서열에서 유래하는, 〔B1〕∼〔B19〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔B21〕 상기 tRNA의 1∼31위 및 39∼74위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기 서열이, (a) 서열 번호: 253, (b) 서열 번호: 255, 및 (c) 서열 번호: 254로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개에 기재된 염기 서열을 갖는 tRNA에 있어서의 1∼31위 및 39∼74위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기 서열인, 〔B1〕∼〔B20〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔B22〕 상기 tRNA의 1∼31위 및 39∼74위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기 서열이, 〔B20〕의 (a)∼(c) 중 어느 하나에 기재된 염기 서열을 갖는 tRNA에 있어서의 1∼31위 및 39∼74위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기 서열과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는, 〔B1〕∼〔B21〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔B23〕 아미노산을 번역계 외에서 상기 tRNA에 결합하는 것을 포함하는, 〔B1〕∼〔B22〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔B24〕 상기 아미노산을 번역계 외에서 tRNA에 결합하는 것이, pCpA법, pdCpA법, 플렉시자임을 이용한 방법, 및 aaRS를 이용한 방법으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 방법에 의해 행해지는, 〔B23〕에 기재된 방법.
〔B25〕 상기 아미노산이 비천연 아미노산인, 〔B23〕 또는 〔B24〕에 기재된 방법.
〔B26〕 상기 비천연 아미노산이 N치환 아미노산인, 〔B23〕∼〔B25〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔B27〕 in vitro에서의 전사에 의해 주형 핵산으로부터 상기 tRNA를 합성하는 것을 추가로 포함하는, 〔B1〕∼〔B26〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔B28〕 상기 tRNA의 개변 전의 37위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기가 A인, 〔B1〕∼〔B27〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔B29〕 상기 tRNA의 개변 전의 33위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기가 U인, 〔B1〕∼〔B28〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔B30〕 상기 tRNA의 개변 전의 32위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기가 C 또는 U인, 〔B1〕∼〔B29〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔B31〕 상기 tRNA의 개변 전의 32위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기가 C인, 〔B1〕∼〔B30〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔B32〕 상기 tRNA의 개변 전의 32위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기가 U인, 〔B1〕∼〔B30〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔B33〕 상기 tRNA의 개변 전의 38위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기가 A 또는 C인, 〔B1〕∼〔B32〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔B34〕 상기 tRNA의 개변 전의 38위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기가 A인, 〔B1〕∼〔B33〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔B35〕 상기 tRNA의 개변 전의 38위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기가 C인, 〔B1〕∼〔B33〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔B36〕 상기 치환 후의 32, 33, 37 및 38위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기의 조합이,
(1) 32U, 33U, 37G, 38A,
(2) 32A, 33U, 37G, 38U,
(3) 32A, 33U, 37A, 38U, 또는
(4) 32U, 33U, 37G, 38U인
〔B1〕∼〔B35〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔B37〕 상기 치환 후의 32, 33, 37 및 38위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기의 조합이,
(1) 32U, 33U, 37G, 38A,
(2) 32A, 33U, 37G, 38U, 또는
(3) 32A, 33U, 37A, 38U인
〔B1〕∼〔B36〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔B38〕 〔B1〕∼〔B37〕 중 어느 하나에 기재된 방법(단, 상기 치환 후의 32, 33, 37 및 38위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기의 조합이 〔B2〕 (4)에 있어서 특정되는 조합이며, 상기 tRNA의 1∼31위 및 39∼74위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기 서열이 서열 번호: 255에 기재된 염기 서열을 갖는 tRNA에 있어서의 1∼31위 및 39∼74위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기 서열인 경우에 있어서, 상기 제 1 코돈 및 상기 제 2 코돈의 조합이, CGC 및 CGG인 방법, 및, CGG 및 CGC인 방법을 제외한다).
〔B39〕 염기가 치환된 tRNA를 포함하는 번역계에 있어서 핵산을 번역하는 것을 추가로 포함하는, 〔B1〕∼〔B38〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔B40〕 상기 N치환 아미노산이, N-메틸아미노산인, 〔B26〕∼〔B39〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔B41〕 상기 아미노산이, 번역 가능한 아미노산인 〔B23〕∼〔B40〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
본 개시에 있어서, 그의 32, 33, 37 및 38위(tRNA 넘버링 규칙)에 있어서 특정의 염기를 갖는 tRNA를 포함하는 번역용 조성물, 및, 당해 tRNA를 사용하여 핵산을 번역하는 것을 포함하는 펩타이드의 제조 방법 등이 제공되었다. 본 개시에 있어서의 조성물 및 방법 등을 사용하는 것에 의해, 펩타이드의 합성에 있어서, tRNA에 의한 코돈의 읽기 오류에 기인하여 의도하지 않은 아미노산이 잘못되게 번역되어 버리는 비율을 저감할 수 있다.
[도 1] tRNA(Glu2)의 32, 33, 37, 및 38위의 염기의 조합의 차이에 의한, 코돈 CCG의 읽기 오류의 비율을 나타내는 도면이다. 도 중의 값은 cgg 및 agg를 안티코돈으로서 갖는 tRNA의 공존하, CCG의 코돈을 가지는 mRNA를 번역한 결과(구체적인 번역량은 표 6을 참조)에 기초하고 있고, 세로축의 목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)이란 이하에 나타내는 식으로부터 산출된 것이다.
목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)=서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:SPh2Cl:Ile:Ile:Ala:Ile:Gly(서열 번호: 242)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)/서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:MeHph:Ile:Ile:Ala:Ile:Gly(서열 번호: 241)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)×100
[도 2] tRNA(Glu2)의 32, 33, 37, 및 38위의 염기의 조합의 차이에 의한, 코돈 CCU의 읽기 오류의 비율을 나타내는 도면이다. 도 중의 값은 agg 및 cgg를 안티코돈으로서 갖는 tRNA의 공존하, CCU의 코돈을 가지는 mRNA를 번역한 결과(구체적인 번역량은 표 7을 참조)에 기초하고 있고, 세로축의 목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)이란 이하에 나타내는 식으로부터 산출된 것이다.
목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)=서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:SPh2Cl:Ile:Ile:Ala:Ile:Gly(서열 번호: 242)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)/서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:MeHph:Ile:Ile:Ala:Ile:Gly(서열 번호: 241)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)×100
[도 3] tRNA(Glu2)의 32, 33, 37, 및 38위의 염기의 조합의 차이에 의한, 코돈 GGG의 읽기 오류의 비율을 나타내는 도면이다. 도 중의 값은 ccc 및 acc를 안티코돈으로서 갖는 tRNA의 공존하, GGG의 코돈을 가지는 mRNA를 번역한 결과(구체적인 번역량은 표 8을 참조)에 기초하고 있고, 세로축의 목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)이란 이하에 나타내는 식으로부터 산출된 것이다.
목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)=서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Leu:Phe:SPh2Cl:Ile:Ile:Pro:Ile:Leu(서열 번호: 244)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)/서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Leu:Phe:MeHph:Ile:Ile:Pro:Ile:Leu(서열 번호: 243)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)×100
[도 4] tRNA(Glu2)의 32, 33, 37, 및 38위의 염기의 조합의 차이에 의한, 코돈 GGU의 읽기 오류의 비율을 나타내는 도면이다. 도 중의 값은 acc 및 ccc를 안티코돈으로서 갖는 tRNA의 공존하, GGU의 코돈을 가지는 mRNA를 번역한 결과(구체적인 번역량은 표 9를 참조)에 기초하고 있고, 세로축의 목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)이란 이하에 나타내는 식으로부터 산출된 것이다.
목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)=서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Leu:Phe:SPh2Cl:Ile:Ile:Pro:Ile:Leu(서열 번호: 244)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)/서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Leu:Phe:MeHph:Ile:Ile:Pro:Ile:Leu(서열 번호: 243)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)×100
[도 5] tRNA(Glu2)의 32, 33, 37, 및 38위의 염기의 조합의 차이에 의한, 코돈 CUG의 읽기 오류의 비율을 나타내는 도면이다. 도 중의 값은 cag 및 aag를 안티코돈으로서 갖는 tRNA의 공존하, CUG의 코돈을 가지는 mRNA를 번역한 결과(구체적인 번역량은 표 10을 참조)에 기초하고 있고, 세로축의 목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)이란 이하에 나타내는 식으로부터 산출된 것이다.
목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)=서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:SPh2Cl:Ile:Ile:Pro:Ile:Gly(서열 번호: 240)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)/서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:MeHph:Ile:Ile:Pro:Ile:Gly(서열 번호: 239)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)×100
[도 6] tRNA(Glu2)의 32, 33, 37, 및 38위의 염기의 조합의 차이에 의한, 코돈 CUU의 읽기 오류의 비율을 나타내는 도면이다. 도 중의 값은 aag 및 cag를 안티코돈으로서 갖는 tRNA의 공존하, CUU의 코돈을 가지는 mRNA를 번역한 결과(구체적인 번역량은 표 11을 참조)에 기초하고 있고, 세로축의 목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)이란 이하에 나타내는 식으로부터 산출된 것이다.
목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)=서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:SPh2Cl:Ile:Ile:Pro:Ile:Gly(서열 번호: 240)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)/서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:MeHph:Ile:Ile:Pro:Ile:Gly(서열 번호: 239)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)×100
[도 7] tRNA(AsnE2)의 32, 33, 37, 및 38위의 염기의 조합의 차이에 의한, 코돈 CUG의 읽기 오류의 비율을 나타내는 도면이다. 도 중의 값은 cag 및 aag를 안티코돈으로서 갖는 tRNA의 공존하, CUG의 코돈을 가지는 mRNA를 번역한 결과(구체적인 번역량은 표 12를 참조)에 기초하고 있고, 세로축의 목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)이란 이하에 나타내는 식으로부터 산출된 것이다.
목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)=서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:SPh2Cl:Ile:Ile:Pro:Ile:Gly(서열 번호: 240)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)/서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:MeHph:Ile:Ile:Pro:Ile:Gly(서열 번호: 239)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)×100
[도 8] tRNA(AsnE2)의 32, 33, 37, 및 38위의 염기의 조합의 차이에 의한, 코돈 CUU의 읽기 오류의 비율을 나타내는 도면이다. 도 중의 값은 aag 및 cag를 안티코돈으로서 갖는 tRNA의 공존하, CUU의 코돈을 가지는 mRNA를 번역한 결과(구체적인 번역량은 표 13을 참조)에 기초하고 있고, 세로축의 목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)이란 이하에 나타내는 식으로부터 산출된 것이다.
목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)=서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:SPh2Cl:Ile:Ile:Pro:Ile:Gly(서열 번호: 240)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)/서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:MeHph:Ile:Ile:Pro:Ile:Gly(서열 번호: 239)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)×100
[도 9] tRNA(Asp1)의 32, 33, 37, 및 38위의 염기의 조합의 차이에 의한, 코돈 CUG의 읽기 오류의 비율을 나타내는 도면이다. 도 중의 값은 cag 및 aag를 안티코돈으로서 갖는 tRNA의 공존하, CUG의 코돈을 가지는 mRNA를 번역한 결과(구체적인 번역량은 표 14를 참조)에 기초하고 있고, 세로축의 목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)이란 이하에 나타내는 식으로부터 산출된 것이다.
목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)=서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:SPh2Cl:Ile:Ile:Pro:Ile:Gly(서열 번호: 240)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)/서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:MeHph:Ile:Ile:Pro:Ile:Gly(서열 번호: 239)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)×100
[도 10] tRNA(Asp1)의 32, 33, 37, 및 38위의 염기의 조합의 차이에 의한, 코돈 CUU의 읽기 오류의 비율을 나타내는 도면이다. 도 중의 값은 aag 및 cag를 안티코돈으로서 갖는 tRNA의 공존하, CUU의 코돈을 가지는 mRNA를 번역한 결과(구체적인 번역량은 표 15를 참조)에 기초하고 있고, 세로축의 목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)이란 이하에 나타내는 식으로부터 산출된 것이다.
목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)=서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:SPh2Cl:Ile:Ile:Pro:Ile:Gly(서열 번호: 240)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)/서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:MeHph:Ile:Ile:Pro:Ile:Gly(서열 번호: 239)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)×100
[도 11] tRNA(Glu2)의 32, 33, 37, 및 38위의 염기의 조합의 차이에 의한, 코돈 GGA의 읽기 오류의 비율을 나타내는 도면이다. 도 중의 값은 ucc 및 acc를 안티코돈으로서 갖는 tRNA의 공존하, GGA의 코돈을 가지는 mRNA를 번역한 결과(구체적인 번역량은 표 16을 참조)에 기초하고 있고, 세로축의 목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)이란 이하에 나타내는 식으로부터 산출된 것이다.
목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)=서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Leu:Phe:SPh2Cl:Ile:Ile:Pro:Ile:Leu(서열 번호: 244)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)/서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Leu:Phe:MeHph:Ile:Ile:Pro:Ile:Leu(서열 번호: 243)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)×100
[도 12] tRNA(Glu2)의 32, 33, 37, 및 38위의 염기의 조합의 차이에 의한, 코돈 GGA의 읽기 오류의 비율을 나타내는 도면이다. 도 중의 값은 ucc 및 gcc를 안티코돈으로서 갖는 tRNA의 공존하, GGA의 코돈을 가지는 mRNA를 번역한 결과(구체적인 번역량은 표 17을 참조)에 기초하고 있고, 세로축의 목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)이란 이하에 나타내는 식으로부터 산출된 것이다.
목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)=서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Leu:Phe:SPh2Cl:Ile:Ile:Pro:Ile:Leu(서열 번호: 244)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)/서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Leu:Phe:MeHph:Ile:Ile:Pro:Ile:Leu(서열 번호: 243)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)×100
[도 13] tRNA(Glu2)의 32, 33, 37, 및 38위의 염기의 조합의 차이에 의한, 코돈 GGG의 읽기 오류의 비율을 나타내는 도면이다. 도 중의 값은 ccc 및 gcc를 안티코돈으로서 갖는 tRNA의 공존하, GGG의 코돈을 가지는 mRNA를 번역한 결과(구체적인 번역량은 표 18을 참조)에 기초하고 있고, 세로축의 목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)이란 이하에 나타내는 식으로부터 산출된 것이다.
목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)=서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Leu:Phe:SPh2Cl:Ile:Ile:Pro:Ile:Leu(서열 번호: 244)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)/서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Leu:Phe:MeHph:Ile:Ile:Pro:Ile:Leu(서열 번호: 243)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)×100
[도 14] tRNA(Glu2)의 32, 33, 37, 및 38위의 염기의 조합의 차이에 의한, 코돈 GGG의 읽기 오류의 비율을 나타내는 도면이다. 도 중의 값은 acc 및 ccc를 안티코돈으로서 갖는 tRNA의 공존하, GGG의 코돈을 가지는 mRNA를 번역한 결과(구체적인 번역량은 표 21을 참조)에 기초하고 있고, 세로축의 목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)이란 이하에 나타내는 식으로부터 산출된 것이다.
목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)=서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Leu:Phe:Pic2:Ile:Ile:Pro:Ile:Leu(서열 번호: 245)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)/서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Leu:Phe:MeHph:Ile:Ile:Pro:Ile:Leu(서열 번호: 243)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)×100
[도 15] tRNA(Glu2)의 32, 33, 37, 및 38위의 염기의 조합의 차이에 의한, 코돈 GGG의 읽기 오류의 비율을 나타내는 도면이다. 도 중의 값은 acc 및 ccc를 안티코돈으로서 갖는 tRNA의 공존하, GGG의 코돈을 가지는 mRNA를 번역한 결과(구체적인 번역량은 표 22를 참조)에 기초하고 있고, 세로축의 목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)이란 이하에 나타내는 식으로부터 산출된 것이다.
목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)=서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Leu:Phe:MeG:Ile:Ile:Pro:Ile:Leu(서열 번호: 246)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)/서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Leu:Phe:MeHph:Ile:Ile:Pro:Ile:Leu(서열 번호: 243)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)×100
[도 16] tRNA(Glu2)의 32, 33, 37, 및 38위의 염기의 조합의 차이에 의한, 코돈 GGG의 읽기 오류의 비율을 나타내는 도면이다. 도 중의 값은 acc 및 ccc를 안티코돈으로서 갖는 tRNA의 공존하, GGG의 코돈을 가지는 mRNA를 번역한 결과(구체적인 번역량은 표 23을 참조)에 기초하고 있고, 세로축의 목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)이란 이하에 나타내는 식으로부터 산출된 것이다.
목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)=서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Leu:Phe:dA:Ile:Ile:Pro:Ile:Leu(서열 번호: 248)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)/서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Leu:Phe:nBuG:Ile:Ile:Pro:Ile:Leu(서열 번호: 247)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)×100
[도 17] tRNA(Glu2)의 32, 33, 37, 및 38위의 염기의 조합의 차이에 의한, 코돈 CCG의 읽기 오류의 비율을 나타내는 도면이다. 도 중의 값은 cgg 및 agg를 안티코돈으로서 갖는 tRNA의 공존하, CCG의 코돈을 가지는 mRNA를 번역한 결과(구체적인 번역량은 표 24를 참조)에 기초하고 있고, 세로축의 목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)이란 이하에 나타내는 식으로부터 산출된 것이다.
목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)=서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:SPh2Cl:Ile:Ile:Ala:Ile:Gly(서열 번호: 242)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)/서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:MeG:Ile:Ile:Ala:Ile:Gly(서열 번호: 249)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)×100
[도 18] tRNA(Glu2)의 32, 33, 37, 및 38위의 염기의 조합의 차이에 의한, 코돈 CCU의 읽기 오류의 비율을 나타내는 도면이다. 도 중의 값은 agg 및 cgg를 안티코돈으로서 갖는 tRNA의 공존하, CCU의 코돈을 가지는 mRNA를 번역한 결과(구체적인 번역량은 표 25를 참조)에 기초하고 있고, 세로축의 목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)이란 이하에 나타내는 식으로부터 산출된 것이다.
목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)=서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:SPh2Cl:Ile:Ile:Ala:Ile:Gly(서열 번호: 242)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)/서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:MeG:Ile:Ile:Ala:Ile:Gly(서열 번호: 249)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)×100
목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)=서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:SPh2Cl:Ile:Ile:Ala:Ile:Gly(서열 번호: 242)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)/서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:MeHph:Ile:Ile:Ala:Ile:Gly(서열 번호: 241)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)×100
[도 2] tRNA(Glu2)의 32, 33, 37, 및 38위의 염기의 조합의 차이에 의한, 코돈 CCU의 읽기 오류의 비율을 나타내는 도면이다. 도 중의 값은 agg 및 cgg를 안티코돈으로서 갖는 tRNA의 공존하, CCU의 코돈을 가지는 mRNA를 번역한 결과(구체적인 번역량은 표 7을 참조)에 기초하고 있고, 세로축의 목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)이란 이하에 나타내는 식으로부터 산출된 것이다.
목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)=서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:SPh2Cl:Ile:Ile:Ala:Ile:Gly(서열 번호: 242)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)/서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:MeHph:Ile:Ile:Ala:Ile:Gly(서열 번호: 241)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)×100
[도 3] tRNA(Glu2)의 32, 33, 37, 및 38위의 염기의 조합의 차이에 의한, 코돈 GGG의 읽기 오류의 비율을 나타내는 도면이다. 도 중의 값은 ccc 및 acc를 안티코돈으로서 갖는 tRNA의 공존하, GGG의 코돈을 가지는 mRNA를 번역한 결과(구체적인 번역량은 표 8을 참조)에 기초하고 있고, 세로축의 목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)이란 이하에 나타내는 식으로부터 산출된 것이다.
목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)=서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Leu:Phe:SPh2Cl:Ile:Ile:Pro:Ile:Leu(서열 번호: 244)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)/서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Leu:Phe:MeHph:Ile:Ile:Pro:Ile:Leu(서열 번호: 243)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)×100
[도 4] tRNA(Glu2)의 32, 33, 37, 및 38위의 염기의 조합의 차이에 의한, 코돈 GGU의 읽기 오류의 비율을 나타내는 도면이다. 도 중의 값은 acc 및 ccc를 안티코돈으로서 갖는 tRNA의 공존하, GGU의 코돈을 가지는 mRNA를 번역한 결과(구체적인 번역량은 표 9를 참조)에 기초하고 있고, 세로축의 목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)이란 이하에 나타내는 식으로부터 산출된 것이다.
목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)=서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Leu:Phe:SPh2Cl:Ile:Ile:Pro:Ile:Leu(서열 번호: 244)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)/서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Leu:Phe:MeHph:Ile:Ile:Pro:Ile:Leu(서열 번호: 243)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)×100
[도 5] tRNA(Glu2)의 32, 33, 37, 및 38위의 염기의 조합의 차이에 의한, 코돈 CUG의 읽기 오류의 비율을 나타내는 도면이다. 도 중의 값은 cag 및 aag를 안티코돈으로서 갖는 tRNA의 공존하, CUG의 코돈을 가지는 mRNA를 번역한 결과(구체적인 번역량은 표 10을 참조)에 기초하고 있고, 세로축의 목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)이란 이하에 나타내는 식으로부터 산출된 것이다.
목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)=서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:SPh2Cl:Ile:Ile:Pro:Ile:Gly(서열 번호: 240)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)/서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:MeHph:Ile:Ile:Pro:Ile:Gly(서열 번호: 239)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)×100
[도 6] tRNA(Glu2)의 32, 33, 37, 및 38위의 염기의 조합의 차이에 의한, 코돈 CUU의 읽기 오류의 비율을 나타내는 도면이다. 도 중의 값은 aag 및 cag를 안티코돈으로서 갖는 tRNA의 공존하, CUU의 코돈을 가지는 mRNA를 번역한 결과(구체적인 번역량은 표 11을 참조)에 기초하고 있고, 세로축의 목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)이란 이하에 나타내는 식으로부터 산출된 것이다.
목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)=서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:SPh2Cl:Ile:Ile:Pro:Ile:Gly(서열 번호: 240)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)/서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:MeHph:Ile:Ile:Pro:Ile:Gly(서열 번호: 239)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)×100
[도 7] tRNA(AsnE2)의 32, 33, 37, 및 38위의 염기의 조합의 차이에 의한, 코돈 CUG의 읽기 오류의 비율을 나타내는 도면이다. 도 중의 값은 cag 및 aag를 안티코돈으로서 갖는 tRNA의 공존하, CUG의 코돈을 가지는 mRNA를 번역한 결과(구체적인 번역량은 표 12를 참조)에 기초하고 있고, 세로축의 목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)이란 이하에 나타내는 식으로부터 산출된 것이다.
목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)=서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:SPh2Cl:Ile:Ile:Pro:Ile:Gly(서열 번호: 240)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)/서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:MeHph:Ile:Ile:Pro:Ile:Gly(서열 번호: 239)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)×100
[도 8] tRNA(AsnE2)의 32, 33, 37, 및 38위의 염기의 조합의 차이에 의한, 코돈 CUU의 읽기 오류의 비율을 나타내는 도면이다. 도 중의 값은 aag 및 cag를 안티코돈으로서 갖는 tRNA의 공존하, CUU의 코돈을 가지는 mRNA를 번역한 결과(구체적인 번역량은 표 13을 참조)에 기초하고 있고, 세로축의 목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)이란 이하에 나타내는 식으로부터 산출된 것이다.
목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)=서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:SPh2Cl:Ile:Ile:Pro:Ile:Gly(서열 번호: 240)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)/서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:MeHph:Ile:Ile:Pro:Ile:Gly(서열 번호: 239)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)×100
[도 9] tRNA(Asp1)의 32, 33, 37, 및 38위의 염기의 조합의 차이에 의한, 코돈 CUG의 읽기 오류의 비율을 나타내는 도면이다. 도 중의 값은 cag 및 aag를 안티코돈으로서 갖는 tRNA의 공존하, CUG의 코돈을 가지는 mRNA를 번역한 결과(구체적인 번역량은 표 14를 참조)에 기초하고 있고, 세로축의 목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)이란 이하에 나타내는 식으로부터 산출된 것이다.
목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)=서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:SPh2Cl:Ile:Ile:Pro:Ile:Gly(서열 번호: 240)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)/서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:MeHph:Ile:Ile:Pro:Ile:Gly(서열 번호: 239)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)×100
[도 10] tRNA(Asp1)의 32, 33, 37, 및 38위의 염기의 조합의 차이에 의한, 코돈 CUU의 읽기 오류의 비율을 나타내는 도면이다. 도 중의 값은 aag 및 cag를 안티코돈으로서 갖는 tRNA의 공존하, CUU의 코돈을 가지는 mRNA를 번역한 결과(구체적인 번역량은 표 15를 참조)에 기초하고 있고, 세로축의 목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)이란 이하에 나타내는 식으로부터 산출된 것이다.
목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)=서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:SPh2Cl:Ile:Ile:Pro:Ile:Gly(서열 번호: 240)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)/서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:MeHph:Ile:Ile:Pro:Ile:Gly(서열 번호: 239)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)×100
[도 11] tRNA(Glu2)의 32, 33, 37, 및 38위의 염기의 조합의 차이에 의한, 코돈 GGA의 읽기 오류의 비율을 나타내는 도면이다. 도 중의 값은 ucc 및 acc를 안티코돈으로서 갖는 tRNA의 공존하, GGA의 코돈을 가지는 mRNA를 번역한 결과(구체적인 번역량은 표 16을 참조)에 기초하고 있고, 세로축의 목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)이란 이하에 나타내는 식으로부터 산출된 것이다.
목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)=서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Leu:Phe:SPh2Cl:Ile:Ile:Pro:Ile:Leu(서열 번호: 244)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)/서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Leu:Phe:MeHph:Ile:Ile:Pro:Ile:Leu(서열 번호: 243)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)×100
[도 12] tRNA(Glu2)의 32, 33, 37, 및 38위의 염기의 조합의 차이에 의한, 코돈 GGA의 읽기 오류의 비율을 나타내는 도면이다. 도 중의 값은 ucc 및 gcc를 안티코돈으로서 갖는 tRNA의 공존하, GGA의 코돈을 가지는 mRNA를 번역한 결과(구체적인 번역량은 표 17을 참조)에 기초하고 있고, 세로축의 목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)이란 이하에 나타내는 식으로부터 산출된 것이다.
목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)=서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Leu:Phe:SPh2Cl:Ile:Ile:Pro:Ile:Leu(서열 번호: 244)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)/서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Leu:Phe:MeHph:Ile:Ile:Pro:Ile:Leu(서열 번호: 243)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)×100
[도 13] tRNA(Glu2)의 32, 33, 37, 및 38위의 염기의 조합의 차이에 의한, 코돈 GGG의 읽기 오류의 비율을 나타내는 도면이다. 도 중의 값은 ccc 및 gcc를 안티코돈으로서 갖는 tRNA의 공존하, GGG의 코돈을 가지는 mRNA를 번역한 결과(구체적인 번역량은 표 18을 참조)에 기초하고 있고, 세로축의 목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)이란 이하에 나타내는 식으로부터 산출된 것이다.
목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)=서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Leu:Phe:SPh2Cl:Ile:Ile:Pro:Ile:Leu(서열 번호: 244)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)/서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Leu:Phe:MeHph:Ile:Ile:Pro:Ile:Leu(서열 번호: 243)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)×100
[도 14] tRNA(Glu2)의 32, 33, 37, 및 38위의 염기의 조합의 차이에 의한, 코돈 GGG의 읽기 오류의 비율을 나타내는 도면이다. 도 중의 값은 acc 및 ccc를 안티코돈으로서 갖는 tRNA의 공존하, GGG의 코돈을 가지는 mRNA를 번역한 결과(구체적인 번역량은 표 21을 참조)에 기초하고 있고, 세로축의 목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)이란 이하에 나타내는 식으로부터 산출된 것이다.
목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)=서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Leu:Phe:Pic2:Ile:Ile:Pro:Ile:Leu(서열 번호: 245)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)/서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Leu:Phe:MeHph:Ile:Ile:Pro:Ile:Leu(서열 번호: 243)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)×100
[도 15] tRNA(Glu2)의 32, 33, 37, 및 38위의 염기의 조합의 차이에 의한, 코돈 GGG의 읽기 오류의 비율을 나타내는 도면이다. 도 중의 값은 acc 및 ccc를 안티코돈으로서 갖는 tRNA의 공존하, GGG의 코돈을 가지는 mRNA를 번역한 결과(구체적인 번역량은 표 22를 참조)에 기초하고 있고, 세로축의 목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)이란 이하에 나타내는 식으로부터 산출된 것이다.
목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)=서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Leu:Phe:MeG:Ile:Ile:Pro:Ile:Leu(서열 번호: 246)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)/서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Leu:Phe:MeHph:Ile:Ile:Pro:Ile:Leu(서열 번호: 243)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)×100
[도 16] tRNA(Glu2)의 32, 33, 37, 및 38위의 염기의 조합의 차이에 의한, 코돈 GGG의 읽기 오류의 비율을 나타내는 도면이다. 도 중의 값은 acc 및 ccc를 안티코돈으로서 갖는 tRNA의 공존하, GGG의 코돈을 가지는 mRNA를 번역한 결과(구체적인 번역량은 표 23을 참조)에 기초하고 있고, 세로축의 목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)이란 이하에 나타내는 식으로부터 산출된 것이다.
목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)=서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Leu:Phe:dA:Ile:Ile:Pro:Ile:Leu(서열 번호: 248)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)/서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Leu:Phe:nBuG:Ile:Ile:Pro:Ile:Leu(서열 번호: 247)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)×100
[도 17] tRNA(Glu2)의 32, 33, 37, 및 38위의 염기의 조합의 차이에 의한, 코돈 CCG의 읽기 오류의 비율을 나타내는 도면이다. 도 중의 값은 cgg 및 agg를 안티코돈으로서 갖는 tRNA의 공존하, CCG의 코돈을 가지는 mRNA를 번역한 결과(구체적인 번역량은 표 24를 참조)에 기초하고 있고, 세로축의 목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)이란 이하에 나타내는 식으로부터 산출된 것이다.
목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)=서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:SPh2Cl:Ile:Ile:Ala:Ile:Gly(서열 번호: 242)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)/서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:MeG:Ile:Ile:Ala:Ile:Gly(서열 번호: 249)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)×100
[도 18] tRNA(Glu2)의 32, 33, 37, 및 38위의 염기의 조합의 차이에 의한, 코돈 CCU의 읽기 오류의 비율을 나타내는 도면이다. 도 중의 값은 agg 및 cgg를 안티코돈으로서 갖는 tRNA의 공존하, CCU의 코돈을 가지는 mRNA를 번역한 결과(구체적인 번역량은 표 25를 참조)에 기초하고 있고, 세로축의 목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)이란 이하에 나타내는 식으로부터 산출된 것이다.
목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)=서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:SPh2Cl:Ile:Ile:Ala:Ile:Gly(서열 번호: 242)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)/서열 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:MeG:Ile:Ile:Ala:Ile:Gly(서열 번호: 249)에 상당하는 펩타이드의 번역량(μM)×100
본 명세서를 해석할 목적을 위해서, 이하의 정의가 적용되고, 해당하는 경우는 언제라도, 단수형으로 사용된 용어는 복수형도 포함하고, 그 반대도 또한 마찬가지이다. 본 명세서에서 사용되는 용어는, 특정의 태양을 설명하는 것만을 목적으로 하고 있고, 한정을 의도한 것이 아님이, 이해되는 것이 당연하다. 하기의 정의 어느 것인가가, 참조에 의해 본 명세서에 원용된 임의의 문서와 모순되는 경우에는, 하기의 정의가 우선하는 것으로 한다.
「코돈」이란, 생체 내의 유전 정보가 단백질로 번역될 때의, 각 아미노산에 대응하는 3개의 염기의 조합(트리플렛)이다. DNA의 경우는, 아데닌(A), 구아닌(G), 사이토신(C), 및 티민(T)의 4종류의 염기가 이용되고, mRNA의 경우는, 아데닌(A), 구아닌(G), 사이토신(C), 및 우라실(U)의 4종류의 염기가 이용된다. 각 코돈과 아미노산의 대응 관계를 나타낸 표는 유전 암호표 혹은 코돈표로 불리고, 종지 코돈을 제외한 61종류의 코돈에, 20종류의 아미노산을 할당되어 있다(표 1). 표 1에 기재된 유전 암호표는, 진핵생물 및 원핵생물(진정 세균 및 고세균)에 있어서의 거의 모든 생물에서 공통되게 사용되고 있으므로, 표준 유전 암호표 혹은 보편 유전 암호표라고도 불린다. 본 개시에 있어서는, 천연에 존재하는 생물에서 사용되고 있는 유전 암호표를 천연의 유전 암호표라고 칭하고, 인공적으로 리프로그래밍된(코돈과 아미노산의 대응 관계가 개변된) 유전 암호표와는 구별한다. 유전 암호표에 있어서는, 통상, 1문자째와 2문자째가 공통이고 3문자째만이 상이한 4개의 코돈이 하나의 복스에 정리되어 있고, 이들을 코돈 복스라고 부른다. 본 개시에 있어서, 코돈의 1문자째 및 2문자째의 염기 뒤에, A, C, G 및 U로부터 선택되는 임의의 염기를 의미하는 「M」을 늘어놓는 것에 의해, 특정의 코돈 복스를 나타내는 경우가 있다. 예를 들어, 천연의 유전 암호표에 있어서 Ser이 할당되어 있는, 코돈의 1문자째가 U, 2문자째가 C인 코돈 복스는, 「UCM」이라고 표기되고, Pro가 할당되어 있는 코돈 복스는 「CCM」이라고 표기된다.
본 개시에 있어서, mRNA에 있어서의 코돈은 「M1M2M3」로 표시되는 경우가 있다. 여기에서, M1, M2, 및 M3은 각각 코돈의 1문자째, 2문자째, 및 3문자째의 염기를 나타낸다.
「안티코돈」이란, mRNA 상의 코돈에 대응하는, tRNA 상의 3개의 연속된 염기이다. mRNA와 마찬가지로, 안티코돈에는, 아데닌(A), 구아닌(G), 사이토신(C), 및 우라실(U)의 4종류의 염기가 이용된다. 더욱이, 그들을 수식하여 얻어지는 수식 염기가 이용되는 경우도 있다. 코돈이 안티코돈에 의해 특이적으로 인식되는 것에 의해, mRNA 상의 유전 정보가 읽어내져, 단백질로 번역된다. mRNA 상의 5＇로부터 3＇ 방향의 코돈 서열과 tRNA 상의 5＇로부터 3＇ 방향의 안티코돈 서열은 상보적으로 결합하기 때문에, 코돈의 1문자째, 2문자째, 및 3문자째의 염기와, 안티코돈의 3문자째, 2문자째, 및 1문자째의 염기 사이에 각각 상보적인 염기쌍이 형성된다. 본 개시에 있어서, 「수식 염기」란, 염기의 구조의 일부가, A, C, G 및 U와는 상이한 구조의 염기를 말한다.
본 개시에 있어서, 제 1 tRNA에 있어서의 안티코돈은 「N11N12N13」으로 표시되는 경우가 있고, 제 2 tRNA에 있어서의 안티코돈은 「N21N22N23」으로 표시되는 경우가 있다. 여기에서, N11, N12, 및 N13 및 N21, N22, 및 N23은 각각 안티코돈의 1문자째, 2문자째, 및 3문자째의 염기를 나타낸다. 후술하는 tRNA 넘버링 규칙에 따르면, N11, N12, 및 N13 및 N21, N22, 및 N23은 각각 tRNA의 34위, 35위, 및 36위로 번호 붙여진다.
본 개시에 있어서, 염기A, C, G, U, 및 T를 소문자로 표기하는 경우가 있지만, 대문자와 소문자는 동의로 이용된다. 예를 들어, GGG와 ggg는 동의로 이용된다.
본 개시에 있어서는, 열역학적으로 안정된 염기쌍을 서로 「상보적」이라고 한다. 아데닌과 우라실(A-U), 구아닌과 사이토신(G-C)과 같은 왓슨-크릭형 염기쌍에 더하여, 구아닌과 우라실(G-U)에 의한 비왓슨-클릭형의 wobble 염기쌍도, 본 개시에 있어서의 「상보적」인 염기쌍에 포함된다. 특히, 코돈의 3문자째와 안티코돈의 1문자째 사이에는 공간적인 요동(wobble)이 존재하기 때문에, 상기와 같은 비왓슨-크릭형 염기쌍의 형성도 허용된다고 생각되고 있다(요동 가설).
본 개시에 있어서는, 코돈과 안티코돈의 일정한 관계를 「상보적」이라고 표현하는 경우가 있다. 코돈의 1문자째와 안티코돈의 3문자째, 코돈의 2문자째와 안티코돈의 2문자째 사이에는 왓슨-크릭형 염기쌍이 형성되고, 코돈의 3문자째와 안티코돈의 1문자째 사이에 왓슨-클릭형 또는 wobble 염기쌍이 형성되는 것과 같은, 코돈과 안티코돈의 관계를 「상보적」이라고 칭한다. 예를 들어, 코돈 UCU에 상보적인 안티코돈은 AGA 및 GGA이고, 안티코돈 GCG에 상보적인 코돈은 CGC 및 CGU이다.
「전령 RNA(messenger RNA; mRNA)」란, 단백질로 번역될 수 있는 유전 정보를 가진 RNA이다. 유전 정보는 코돈으로서 mRNA 상에 코딩되어 있고, 그들이 전체 20종류의 아미노산에 각각 대응하고 있다. 단백질의 번역은 개시 코돈으로부터 시작되어, 종지 코돈에서 종료한다. 진핵생물에 있어서의 개시 코돈은 원칙으로서 AUG이지만, 원핵생물(진정 세균 및 고세균)에서는 AUG 외에 GUG나 UUG 등도 개시 코돈으로서 사용되는 경우가 있다. AUG는 메티오닌(Met)을 코딩하는 코돈이며, 진핵생물 및 고세균에서는 그대로 메티오닌으로부터 번역이 개시된다. 한편, 진정 세균에서는, 개시 코돈의 AUG만 N-폼일메티오닌(fMet)에 대응하고 있기 때문에, 폼일메티오닌으로부터 번역이 개시된다. 종지 코돈에는, UAA(오커)·UAG(앰버)·UGA(오팔)의 3종이 있다. 종지 코돈이 번역 종결 인자(release factor; RF)로 불리는 단백질에 의해 인식되면, 그때까지 합성된 펩타이드쇄가 tRNA로부터 해리되어, 번역 공정은 종료된다.
「전이 RNA(transfer RNA; tRNA)」란, mRNA를 주형으로 한 펩타이드 합성을 중개하는 100염기 이하의 짧은 RNA이다. 2차 구조 상은, 3개의 스템 루프(D암(arm), 안티코돈암, T암)와 1개의 스템(억셉터 스템)으로 이루어지는, 클로버잎 모양의 구조를 갖고 있다. tRNA에 따라서는, 추가로 1개의 가변 루프가 포함되는 경우가 있다. 안티코돈암에는, 안티코돈으로 불리는 3개의 연속된 염기로 이루어지는 영역이 존재하고, 안티코돈이 mRNA 상의 코돈과 염기쌍을 형성하는 것에 의해 코돈이 인식된다. 한편, tRNA의 3＇ 말단에는, 사이티딘-사이티딘-아데노신으로 이루어지는 핵산 서열(CCA 서열)이 존재하고, 그 말단의 아데노신 잔기에 아미노산이 부가된다(구체적으로는, 아데노신 잔기의 리보스의 2위 또는 3위의 하이드록실기와, 아미노산의 카복실기가 에스터 결합한다). 아미노산이 결합한 tRNA는 「아미노아실 tRNA」라고 불린다. 본 개시에 있어서는, 아미노아실 tRNA도 tRNA의 정의에 포함된다. 또한, 후술과 같이, tRNA의 CCA 서열로부터 말단의 2잔기(C 및 A)를 제거하고, 그것을 아미노아실 tRNA의 합성에 이용하는 방법이 알려져 있다. 그와 같은 3＇ 말단의 CA 서열이 제거된 tRNA도, 본 개시에 있어서의 tRNA의 정의에 포함된다. 생체 내에 있어서, tRNA로의 아미노산의 부가는, 아미노아실 tRNA 합성 효소(aminoacyl-tRNA synthetase; aaRS 또는 ARS)라고 하는 효소에 의해 행해진다. 통상, 아미노산마다 1종류의 아미노아실 tRNA 합성 효소가 존재하고 있고, 게다가 또한 각각의 아미노아실 tRNA 합성 효소가 복수의 tRNA 중에서 특정의 tRNA만을 기질로서 특이적으로 인식하므로, tRNA와 아미노산의 대응 관계는 엄밀하게 제어되고 있다.
tRNA에 있어서의 각 염기는, tRNA 넘버링 규칙에 따라 번호 붙이기가 이루어져 있다(Sprinzl et al., Nucleic Acids Res (1998) 26: 148-153). 본 개시에 있어서, tRNA에 있어서의 염기의 번호 붙이기는, 동 넘버링 규칙에 따른 것이다. 예를 들어, 안티코돈은 34위∼36위에, 3＇ 말단의 CCA 서열은 74∼76위에 각각 번호 붙이기되어 있다.
본 개시에 있어서, tRNA의 특정의 위치의 염기를 나타내기 위해서, tRNA 넘버링 규칙(Sprinzl et al., Nucleic Acids Res (1998) 26: 148-153)과 염기의 약칭(A, C, G 또는 U)이 이용된다. 예를 들어 「32U」는, tRNA 넘버링 규칙에 따르는 32위의 염기가 U(우라실)인 것을 의미한다. 또한, 이들은 tRNA의 특정의 위치의 염기의 치환을 나타내기 위해서도 이용된다. 예를 들어 「C32U」는, tRNA 넘버링 규칙에 따르는 32위의 염기의 C(사이토신)로부터 U(우라실)로의 치환을 의미한다.
「안티코돈 루프」란, tRNA 중의 32∼38위의 염기, 즉 안티코돈의 3개의 연속된 염기를 포함하고, 안티코돈의 5＇측 및 3＇측의 2염기씩을 포함하는 7개의 연속된 염기이다. 안티코돈 루프에는 아데닌(A), 구아닌(G), 사이토신(C), 및 우라실(U)의 4종류의 염기가 이용된다. 더욱이, 그들을 수식하여 얻어지는 수식 염기가 이용되는 경우도 있다.
본 개시에 있어서의 「tRNA 보디(tRNA body)」란, 안티코돈(34∼36위)을 제외한 tRNA의 본체 부분(핵산으로 구성된 주요한 구조 부분)을 가리킨다. 몇몇 태양에 있어서, 본 개시의 tRNA 보디는, tRNA의 1∼33위 및 37∼76위를 가리킨다. 다른 태양에 있어서, 본 개시의 tRNA 보디는, tRNA의 1∼33위 및 37∼74위를 가리킨다. 「키메라 tRNA 보디」란, tRNA 보디의 일부분이 특정의 공급원 또는 종류의 tRNA에서 유래하는 한편으로, 나머지의 부분이 다른 공급원 또는 종류의 tRNA에서 유래하는 tRNA 보디를 말한다. 키메라 tRNA 보디는, 1종류만의 tRNA에서 유래하는 tRNA 보디를 포함하지 않는다. 키메라 tRNA 보디는, 2종류 이상의 tRNA에서 유래하는 tRNA 보디이면 되고, 3종류 이상의 tRNA에서 유래해도 된다. 본 개시의 키메라 tRNA 보디로서는, 32, 33, 37 및 38위의 염기의 조합과, 그것 이외의 부위의 염기 서열의 유래가 상이한 키메라 tRNA 보디여도 된다. 키메라 tRNA 보디로서는, 예를 들어, tRNA 보디의 32, 33, 37 및 38위의 염기의 조합이 tRNA Pro2에서 유래하고, 나머지의 부분의 염기 서열이 tRNA Glu2에서 유래하는 tRNA 보디를 들 수 있다. 본 개시에 있어서, 어느 tRNA의 32, 33, 37 및 38위의 염기의 조합의 유래를 결정하려면, 대장균에서 유래하는 tRNA의 염기 서열(서열 번호: 274∼319)의 32, 33, 37 및 38위의 염기의 조합을 참조하여, 32, 33, 37 및 38위에 동일한 염기의 조합을 갖는 tRNA에서 유래한다고 결정할 수 있다. 예를 들어, 32, 33, 37 및 38위의 염기의 조합 CUxxxAC에 대해서는, 서열 번호: 274∼319를 참조함으로써, tRNA Glu2 또는 tRNA Asp1에서 유래한다고 결정할 수 있다. 이 경우에 있어서, 32, 33, 37 및 38위 이외의 부분의 염기 서열이 tRNA Glu2 또는 tRNA Asp1에서 유래하는 tRNA 보디는, 1종류만의 tRNA에서 유래하는 tRNA 보디가 되기 때문에, 키메라 tRNA 보디에는 포함되지 않는다. tRNA의 32∼38위의 염기 서열 정보에 따라, 이하의 기준에 따라 유래하는 tRNA를 결정할 수 있다: UUxxxAC=Ala1B, AUxxxAU=Ala2, CUxxxGA=Arg3, CUxxxAC=Glu2 또는 Asp1, UUxxxGU=Leu2, Leu1 또는 Leu3, UUxxxAA=Phe, Cys, Gly1, Gly3, Leu4, Leu5, Thr1, Thr2 또는 Thr3, AUxxxGU=Pro2, UUxxxGA=Pro3 또는 Pro1, CUxxxAA=Ser5, Arg2, Arg4, Arg5, Asn, Gly2, Ile1, Ile2, Lys, Met, Ser1, Ser2, Ser3, Thr4, Trp, Tyr1, Tyr2 또는 Val1, UUxxxAU=Val2(Val2A 및 Val2B의 총칭), Gln1, Gln2, 또는 His(여기에서 xxx는 안티코돈의 3염기를 의미한다). 예를 들어, 32∼38위의 염기 서열이 UUxxxGU인 tRNA에 있어서의, 32, 33, 37 및 38위의 염기의 조합은 tRNA Leu2, tRNA Leu1 또는 tRNA Leu3에서 유래한다고 결정된다.
어느 염기, 어느 염기의 조합, 또는 염기 서열이 어느 기원에서 「유래하는」이란, 그의 염기, 어느 염기의 조합, 혹은 염기 서열, 또는 그의 염기, 어느 염기의 조합, 혹은 염기 서열과 고도로 유사한 서열이, 어느 기원으로부터 단리됨을 말한다. 예를 들어, 어느 tRNA를 구성하는 염기, 어느 염기의 조합, 또는 염기 서열이, 어느 특정의 종류의 tRNA로부터 단리되는 경우에, 그의 염기, 어느 염기의 조합, 또는 염기 서열은, 상기 특정의 종류의 tRNA에서 「유래하는」이라고 표현된다.
본 개시에 있어서, tRNA는 이하와 같이 표기되는 경우가 있다.
· 「tRNA Xxx」 또는 「tRNA(Xxx)」: Xxx로 식별되는 특정의 염기 서열을 갖는 tRNA 보디를 나타낸다. 예를 들어 tRNA Glu2 또는 tRNA(Glu2), tRNA Ser5 또는 tRNA(Ser5), tRNA AsnE2 또는 tRNA(AsnE2), tRNA Asp1 또는 tRNA(Asp1)를 들 수 있다.
· 「tRNA(Xxx)nnn」: Xxx로 식별되는 특정의 tRNA 보디를 갖는 tRNA로서, 안티코돈 서열이 nnn인 전장 tRNA를 나타낸다. 예를 들어 tRNA(Glu2)uga, tRNA(AsnE2)uga를 들 수 있다.
· 「tRNA(Xxx＋Yyy)」: 32, 33, 37 및 38위 이외에 Xxx로 식별되는 특정의 염기 서열을 갖고, 32, 33, 37 및 38위에 Yyy로 식별되는 특정의 염기의 조합을 가지는 키메라 tRNA 보디를 나타낸다. 예를 들어 tRNA(Glu2+Ser5), tRNA(AsnE2+Phe)를 들 수 있다.
· 「tRNA(Xxx＋Yyy)nnn」: 32, 33, 37 및 38위 이외에 Xxx로 식별되는 특정의 염기 서열을 갖고, 32, 33, 37 및 38위에 Yyy로 식별되는 특정의 염기의 조합을 갖는 키메라 tRNA 보디를 가지는 tRNA로서, 안티코돈 서열이 nnn인 전장 tRNA를 나타낸다. 예를 들어 tRNA(Glu2+Ser5)uga, tRNA(AsnE2+Phe)uga를 들 수 있다.
· 상기의 tRNA의 명칭의 최후에 「-CA」를 붙임으로써, tRNA의 3＇ 말단의 CA 서열이 제거되어 있음을 나타내는 경우가 있다. 예를 들어, tRNA(Glu2)-CA, tRNA(Glu2)uga-CA, tRNA(Glu2+Ser5)-CA, tRNA(Glu2+Ser5)uga-CA를 들 수 있다.
본 개시에 있어서, tRNA에 있어서의 32, 33, 37 및 38위의 염기의 특정의 조합을, 그것이 유래하는 tRNA의 명칭으로 표기하는 경우가 있다. 본 개시에 있어서 32∼38위의 염기 서열은 XXxxxXX로 표시되고, tRNA의 32, 33, 37 및 38위의 염기의 조합은 다음과 같이 명명된다: Ala1B 서열=UUxxxAC, Ala2 서열=AUxxxAU, Arg3 서열=CUxxxGA, Glu2 서열=CUxxxAC, Leu2 서열=UUxxxGU, Phe 서열=UUxxxAA, Pro2 서열=AUxxxGU, Pro3 서열=UUxxxGA, Ser5 서열=CUxxxAA, Val2 서열 =UUxxxAU.
「개시 tRNA(initiator tRNA)」란, mRNA의 번역의 개시 시에 사용되는 특정의 tRNA이다. 개시 아미노산을 결합한 개시 tRNA가, 번역 개시 인자(initiation factor; IF)로 촉매되어 리보솜에 도입되어, mRNA 상의 개시 코돈에 결합함으로써, 번역이 시작된다. 개시 코돈으로서, 일반적으로는 메티오닌의 코돈인 AUG가 이용되기 때문에, 개시 tRNA는 AUG에 대응하는 안티코돈을 갖고 있고, 또한, 개시 아미노산으로서 메티오닌(원핵생물에서는 폼일메티오닌)을 결합하고 있다. 개시 tRNA의 예로서 tRNA fMet(서열 번호: 283, 284)를 들 수 있다.
「신장 tRNA(elongator tRNA)」란, 번역 공정에 있어서의 펩타이드쇄의 신장 반응에 있어서 사용되는 tRNA이다. 펩타이드 합성에 있어서는, 아미노산을 결합한 신장 tRNA가, GTP화된 번역 신장 인자(elongation factor; EF) EF-Tu/eEF-1에 의해 리보솜으로 순차적으로 운반되는 것에 의해, 펩타이드쇄의 신장 반응이 진행된다. 신장 tRNA의 예로서, 각종 아미노산에 대응한 tRNA(서열 번호: 274∼282, 285∼319)를 들 수 있다.
본 개시에 있어서의 「번역계」란, 펩타이드를 번역하기 위한 조성물(본 개시에 있어서 「번역용 조성물」이라고 부르는 경우가 있다.)로서 정의된다. 한정되는 것은 아니지만, 전형적인 번역계에는, 리보솜, 번역 인자, tRNA, 아미노산, 아미노아실 tRNA 합성 효소(aaRS), 및 ATP나 GTP 등의 펩타이드의 번역 반응에 필요한 인자가 구성 성분으로서 포함된다. 번역계의 주된 종류로서는, 생 세포를 이용한 번역계나, 세포 추출액을 이용한 번역계(무세포 번역계(본 개시에 있어서 「무세포 번역용 조성물」과 동의로 사용된다.))가 있다. 생 세포를 이용한 번역계로서는, 예를 들어, 아프리카발톱개구리 난모세포나 포유동물 세포 등의 생 세포에, 소망의 아미노아실 tRNA 및 mRNA를 마이크로인젝션법이나 리포펙션법에 의해 도입하여 펩타이드 번역을 행하는 계가 알려져 있다(Nowak et al., Science (1995) 268: 439-442). 무세포 번역계의 예로서는, 대장균(Chen et al., Methods Enzymol (1983) 101: 674-690), 효모(Gasior et al., J Biol Chem (1979) 254: 3965-3969), 소맥 배아(Erickson et al., Methods Enzymol (1983) 96: 38-50), 토끼 망상 적혈구(Jackson et al., Methods Enzymol (1983) 96: 50-74), HeLa 세포(Barton et al., Methods Enzymol (1996) 275: 35-57), 혹은 곤충 세포(Swerdel et al., Comp Biochem Physiol B (1989) 93: 803-806) 등으로부터의 추출액을 이용한 번역계가 알려져 있다. 이와 같은 번역계는, 당업자에게 공지된 방법 또는 그것에 준하는 방법에 의해 적절히 조제할 수 있다. 무세포 번역계에는, 펩타이드 번역에 필요한 인자를 각각 단리·정제하고, 그들을 재구성하여 구축된 번역계(재구성형의 무세포 번역계)도 포함된다(Shimizu et al., Nat Biotech (2001) 19: 751-755). 한정되는 것은 아니지만, 재구성형의 무세포 번역계에는, 통상, 리보솜, 아미노산, tRNA, 아미노아실 tRNA 합성 효소(aaRS), 번역 개시 인자(예를 들어, IF1, IF2, IF3), 번역 신장 인자(예를 들어 EF-Tu, EF-Ts, EF-G), 번역 종결 인자(예를 들어 RF1, RF2, RF3), 리보솜 재생 인자(ribosome recycling factor; RRF), 에너지원으로서의 NTP류, 에너지 재생계, 및 번역에 필요한 그 외의 인자 등이 포함될 수 있다. DNA로부터의 전사 반응을 아울러 행하는 경우는, 추가로 RNA 폴리메라제 등이 포함될 수 있다. 무세포 번역계에 포함되는 여러 가지 인자는, 당업자에게 주지된 방법에 의해 단리·정제하는 것이 가능하고, 그들을 이용하여 재구성형의 무세포 번역계를 적절히 구축할 수 있다. 혹은, 진 프론티어사의 PUREfrex(등록상표)나, New England BioLabs사의 PURExpress(등록상표) 등의 시판되고 있는 재구성형의 무세포 번역계를 이용할 수도 있다. 재구성형의 무세포 번역계의 경우, 번역계의 구성 성분 중 필요한 성분만을 재구성하여, 소망의 번역계를 구축할 수 있다.
아미노산·tRNA·아미노아실 tRNA 합성 효소의 특이적인 조합을 번역계에 포함시키는 것에 의해, 번역계 중에서 아미노아실 tRNA가 합성되고, 그것이 펩타이드의 번역에 이용된다. 상기 대신에, 번역계 외에서 조제한 아미노아실 tRNA를 그대로 번역계의 구성 성분으로서 이용할 수도 있다(본 개시에 있어서, 「프리차지법」이라고 부르는 경우가 있다). 프리차지법으로서는, 번역계 외에서 aaRS에 의해 아미노산을 tRNA에 결합하는 방법, pdCpA법, pCpA법, 및 인공 RNA 촉매(플렉시자임)를 이용한 방법이 예시된다. 특히, 일부의 비천연 아미노산 등, aaRS로 아미노아실화하는 것이 곤란한 아미노산이 번역에 이용되는 경우는, pdCpA법, pCpA법 또는 플렉시자임을 이용한 방법 등에 의해, 미리 비천연 아미노산으로 아미노아실화된 tRNA를 구성 성분으로서 이용하는 프리차지법이 바람직하다.
번역계에 mRNA를 가하는 것에 의해, 그의 번역이 개시된다. mRNA에는, 통상, 목적하는 펩타이드를 코딩하는 서열이 포함되어 있고, 더욱이, 번역 반응의 효율을 상승시키기 위한 서열(예를 들어, 원핵생물에 있어서의 샤인·달가노(Shine-Dalgarno; SD) 서열, 진핵생물에 있어서의 코작(Kozac) 서열 등)이 포함되어 있어도 된다. 미리 전사된 mRNA를 계에 직접 가해도 되고, mRNA 대신에, 프로모터를 포함하는 주형 DNA와 그것에 적합한 RNA 폴리메라제(예를 들어 T7 프로모터와 T7 RNA 폴리메라제 등)를 계에 가하는 것에 의해, mRNA가 주형 DNA로부터 전사 되도록 해도 된다.
「코돈의 읽기 오류」란, 특정의 안티코돈을 갖는 아미노아실 tRNA가, 당해 안티코돈과 상보적이지는 않은 코돈을 인식하는 것에 의해, 의도하지 않은 아미노산이 번역 도입되어 버리는 것을 말한다. 예를 들어, 코돈 CCU에 상보적인 안티코돈 AGG를 갖는 아미노아실 tRNA가, 잘못되게 코돈 CCG를 인식하는 것에 의해, 당해 tRNA에 아실화된 아미노산이 의도하지 않게 번역 도입되어 버리는 것을 들 수 있다. 한편, 천연의 유전 암호표에서는, 코돈 CCG와 CCU의 어느 것에도 Pro가 할당되어 있기 때문에, 이와 같은 읽기 오류의 유무에 의해 번역 도입되는 아미노산에 차이는 없다. 그러나, 유전 암호표를 리프로그래밍하여, 코돈 CCG와 CCU에 다른 아미노산을 할당하는 경우에, 이 코돈의 읽기 오류가 문제가 될 수 있다.
본 개시에 있어서 「알킬」이란, 지방족 탄화수소로부터 임의의 수소 원자를 1개 제거하여 유도되는 1가의 기이며, 골격 중에 헤테로원자 또는 불포화의 탄소-탄소 결합을 함유하지 않고, 수소 및 탄소 원자를 함유하는 하이드로카빌 또는 탄화수소기 구조의 부분 집합을 갖는다. 탄소쇄의 길이 n은 1∼20개의 범위이며, 알킬로서는, 예를 들어 C1-C10 알킬, C1-C6 알킬, C1-C3 알킬 등을 들 수 있고, 구체적으로는, 메틸, 에틸, 프로필, 뷰틸, 펜틸, 헥실, 아이소프로필, t-뷰틸, sec-뷰틸, 1-메틸프로필, 1,1-다이메틸프로필, 2,2-다이메틸프로필, 1,2-다이메틸프로필, 1,1,2-트라이메틸프로필, 1,2,2-트라이메틸프로필, 1,1,2,2-테트라메틸프로필, 1-메틸뷰틸, 2-메틸뷰틸, 3-메틸뷰틸, 1,1-다이메틸뷰틸, 1,2-다이메틸뷰틸, 1,3-다이메틸뷰틸, 2,2-다이메틸뷰틸, 2,3-다이메틸뷰틸, 3,3-다이메틸뷰틸, 1-에틸뷰틸, 2-에틸뷰틸, 아이소펜틸, 네오펜틸 등을 들 수 있다.
본 개시에 있어서 「사이클로알킬」이란, 포화 또는 부분적으로 포화된 환상의 1가의 지방족 탄화수소기를 의미하고, 단환, 바이사이클로환, 스파이로환을 포함한다. 사이클로알킬로서는, 예를 들어 C3-C10 사이클로알킬을 들 수 있고, 구체적으로는, 사이클로프로필, 사이클로뷰틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸, 사이클로옥틸, 바이사이클로[2.2.1]헵틸 등을 들 수 있다.
본 개시에 있어서 「알켄일」이란, 적어도 1개의 이중 결합(2개의 인접 SP2 탄소 원자)을 갖는 1가의 기이다. 이중 결합 및 치환분(존재하는 경우)의 배치에 의해, 이중 결합의 기하학적 형태는, 엔트게겐(E) 또는 추잠멘(Z), 시스 또는 트랜스 배치를 취할 수 있다. 직쇄상 또는 분지쇄상의 알켄일을 들 수 있고, 내부 올레핀을 포함하는 직쇄 등을 포함한다. 알켄일로서는, 예를 들어 C2-C10 알켄일, C2-C6 알켄일 등을 들 수 있고, 구체적으로는, 바이닐, 알릴, 1-프로펜일, 2-프로펜일, 1-뷰텐일, 2-뷰텐일(시스, 트랜스를 포함한다), 3-뷰텐일, 펜텐일, 헥센일 등을 들 수 있다.
본 개시에 있어서 「알킨일」이란, 적어도 1개의 삼중 결합(2개의 인접 SP 탄소 원자)을 갖는, 1가의 기이다. 직쇄상 또는 분지쇄상의 알킨일을 들 수 있고, 내부 알킬렌을 포함한다. 알킨일로서는, 예를 들어 C2-C10 알킨일, C2-C6 알킨일 등을 들 수 있고, 구체적으로는, 에틴일, 1-프로핀일, 프로파길, 3-뷰틴일, 펜틴일, 헥신일, 3-페닐-2-프로핀일, 3-(2'-플루오로페닐)-2-프로핀일, 2-하이드록시-2-프로핀일, 3-(3-플루오로페닐)-2-프로핀일, 3-메틸-(5-페닐)-4-펜틴일 등을 들 수 있다.
본 개시에 있어서 「아릴」이란, 1가의 방향족 탄화수소환을 의미한다. 아릴로서는, 예를 들어 C6-C10 아릴을 들 수 있고, 구체적으로는, 페닐, 나프틸(예를 들어, 1-나프틸, 2-나프틸) 등을 들 수 있다.
본 개시에 있어서 「헤테로아릴」이란, 환을 구성하는 원자 중에 헤테로원자를 함유하는 방향족성의 환의 1가의 기를 의미하고, 부분적으로 포화되어 있어도 된다. 환은 단환, 또는 2개의 축합환(예를 들어, 벤젠 또는 단환 헤테로아릴과 축합된 2환식 헤테로아릴)이어도 된다. 환을 구성하는 원자의 수는 예를 들어 5-10개이다(5원-10원 헤테로아릴). 환을 구성하는 원자 중에 포함되는 헤테로원자의 수는 예를 들어 1-5개이다. 헤테로아릴로서는, 구체적으로는, 퓨릴, 싸이엔일, 피롤릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 싸이아졸릴, 아이소싸이아졸릴, 옥사졸릴, 아이속사졸릴, 옥사다이아졸릴, 싸이아다이아졸릴, 트라이아졸릴, 테트라졸릴, 피리딜, 피리미딜, 피리다진일, 피라진일, 트라이아진일, 벤조퓨란일, 벤조싸이엔일, 벤조싸이아다이아졸릴, 벤조싸이아졸릴, 벤즈옥사졸릴, 벤즈옥사다이아졸릴, 벤즈이미다졸릴, 인돌릴, 아이소인돌릴, 인다졸릴, 퀴놀릴, 아이소퀴놀릴, 신놀린일, 퀴나졸린일, 퀴녹살린일, 벤조다이옥솔릴, 인돌리진일, 이미다조피리딜 등을 들 수 있다.
본 개시에 있어서 「아릴알킬(아르알킬)」이란, 아릴과 알킬을 모두 포함하는 기이며, 예를 들어, 상기 알킬의 적어도 1개의 수소 원자가 아릴로 치환된 기를 의미한다. 아르알킬로서는, 예를 들어 C5-C10 아릴C1-C6 알킬을 들 수 있고, 구체적으로는, 벤질 등을 들 수 있다.
본 개시에 있어서 「알킬렌」이란, 상기 「알킬」로부터 추가로 임의의 수소 원자를 1개 제거하여 유도되는 2가의 기를 의미하고, 직쇄상의 것이어도 분지쇄상의 것이어도 된다. 직쇄 알킬렌으로서는, C2-C6 직쇄 알킬렌, C4-C5 직쇄 알킬렌 등을 들 수 있고, 구체적으로는, -CH2-, -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)4-, -(CH2)5-, -(CH2)6- 등을 들 수 있다. 분기 알킬렌으로서는, C2-C6 분기 알킬렌, C4-C5 분기 알킬렌 등을 들 수 있고, 구체적으로는, -CH(CH3)CH2-, -C(CH3)2-, -CH(CH3)CH2CH2-, -C(CH3)2CH2-, -CH2CH(CH3)CH2-, -CH2C(CH3)2-, -CH2CH2CH(CH3)- 등을 들 수 있다.
본 개시에 있어서 「알켄일렌」은, 상기 「알켄일」로부터 추가로 임의의 수소 원자를 1개 제거하여 유도되는 2가의 기를 의미하고, 직쇄상의 것이어도 분지쇄상의 것이어도 된다. 이중 결합 및 치환기(존재하는 경우)의 배치에 의해, 엔트게겐(E) 또는 추잠멘(Z), 시스 또는 트랜스 배치를 취할 수 있다. 직쇄 알켄일렌으로서는, C2-C6 직쇄 알켄일렌, C4-C5 직쇄 알켄일렌 등을 들 수 있고, 구체적으로는, -CH=CH-, -CH=CHCH2-, -CH2CH=CH-, -CH=CHCH2CH2-, -CH2CH=CHCH2-, -CH2CH2CH=CH-, -CH=CHCH2CH2CH2-, -CH2CH=CHCH2CH2-, -CH2CH2CH=CHCH2-, -CH2CH2CH2CH=CH- 등을 들 수 있다.
본 개시에 있어서 「아릴렌」이란, 상기 아릴로부터 추가로 임의의 수소 원자를 1개 제거하여 유도되는 2가의 기를 의미한다. 환은 단환이어도 축합환이어도 된다. 환을 구성하는 원자의 수는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 6-10개이다(C6-C10 아릴렌). 아릴렌으로서는, 구체적으로는, 페닐렌, 나프틸렌 등을 들 수 있다.
본 개시에 있어서 「헤테로아릴렌」이란, 상기 헤테로아릴로부터 추가로 임의의 수소 원자를 1개 제거하여 유도되는 2가의 기를 의미한다. 환은 단환이어도 축합환이어도 된다. 환을 구성하는 원자의 수는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 5-10개이다(5원∼10원 헤테로아릴렌). 헤테로아릴렌으로서는, 구체적으로는, 피롤다이일, 이미다졸다이일, 피라졸다이일, 피리딘다이일, 피리다진다이일, 피리미딘다이일, 피라진다이일, 트라이아졸다이일, 트라이아진다이일, 아이소옥사졸다이일, 옥사졸다이일, 옥사다이아졸다이일, 아이소싸이아졸다이일, 싸이아졸다이일, 싸이아다이아졸다이일, 퓨란다이일, 싸이오펜다이일 등을 들 수 있다.
＜조성물, 키트, 방법＞
일 국면에 있어서, 본 개시는, 제 1 아미노산이 결합한 제 1 tRNA와 제 2 아미노산이 결합한 제 2 tRNA를 포함하는 번역용 조성물 및 번역용 키트에 관한 것이다. 또한 일 국면에 있어서, 본 개시는, 제 1 아미노산이 결합한 제 1 tRNA와 제 2 아미노산이 결합한 제 2 tRNA를 사용하여, 핵산을 번역하는 방법에 관한 것이다. 당해 조성물, 키트 및 방법을 이용하는 것에 의해, tRNA에 의한 코돈의 읽기 오류에 기인하여 의도하지 않은 아미노산이 잘못되게 번역되는 것을 저감 또는 억제할 수 있다. 따라서, 일 국면에 있어서 본 개시는, tRNA에 의한 코돈의 읽기 오류를 저감 또는 억제하면서 펩타이드를 제조하는 방법, 및 당해 방법을 위해서 이용하기 위한 조성물 및 키트 등에 관한 것이다.
본 개시에 있어서의 조성물은, 본 개시에 있어서의 tRNA에 더하여, 핵산의 번역에 통상 이용되는 버퍼나 물질 등을 포함할 수 있다. 또한 일 국면에 있어서 본 개시에 있어서의 tRNA는, 펩타이드의 번역에 통상 이용되는 각종의 물질 등과 함께 미리 패키징하여 키트로서 공급할 수 있다. 추가적인 국면에 있어서, 본 개시에 있어서의 키트에 포함되는 각종의 물질은, 그 사용 태양에 따라서 분말상 혹은 액상으로 할 수 있다. 또한 이들을 적당한 용기에 수납하여, 적시에 사용할 수 있다.
＜tRNA 및 tRNA 보디＞
몇몇 태양에 있어서, 본 개시의 tRNA의 32, 33, 37, 및 38위의 염기의 조합은,
(1) 32U, 33U, 37G, 38A,
(2) 32A, 33U, 37G, 38U,
(3) 32A, 33U, 37A, 38U,
(4) 32U, 33U, 37G, 38U,
(5) 32U, 33U, 37A, 38U, 또는
(6) 32C, 33U, 37G, 38A여도 된다.
몇몇 태양에 있어서, 본 개시의 tRNA는, 32, 33, 37, 및 38위가 상기 (1)∼(4); 상기 (1)∼(3); 혹은, 상기 (1), (3) 및 (4)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 염기의 조합인 tRNA여도 되고, 또는, 상기 (1); 상기 (2); 상기 (3); 상기 (4); 상기 (5); 혹은, 상기 (6)의 염기의 조합인 tRNA여도 된다. 몇몇 태양에 있어서, 본 개시의 tRNA의 32, 33, 37 및 38위의 염기는, 어느 것도 수식 염기는 아니다.
본 개시에 있어서, 본 개시의 제 1 tRNA의 안티코돈을 N11N12N13으로 나타내는 경우가 있고, 본 개시의 제 2 tRNA의 안티코돈을 N21N22N23으로 나타내는 경우가 있다. 상기 N11, N12, 및 N13 및 N21N22N23은 각각 독립적으로, A, C, G, 또는 U여도 된다. 본 개시의 tRNA의 안티코돈의 1문자째, 2문자째, 및 3문자째는 각각 독립적으로, A, C, G, 또는 U여도 된다. 본 개시의 tRNA의 안티코돈의 2문자째와 3문자째의 염기 서열은, CC, GC, AC, GU, CG, GG, AG, 혹은 GA여도 되고, 또는, GG, AG, 혹은 CC여도 된다. 몇몇 태양에 있어서, 상기 안티코돈의 2문자째와 3문자째의 염기 서열은, CG는 아니다. 몇몇 태양에 있어서, 본 개시의 tRNA는, 안티코돈에 수식 염기를 갖지 않거나, 또는, 안티코돈의 1문자째가 수식 염기이거나 동 1문자째의 뉴클레오타이드에 후술하는 수식을 가져도 된다.
몇몇 태양에 있어서, 본 개시의 tRNA는, 원핵생물 유래의 tRNA 또는 진핵생물 유래의 tRNA이다. 원핵생물 유래의 tRNA 또는 진핵생물 유래의 tRNA를 개변하는 것에 의해 tRNA를 제작해도 되고, 개변에 의해 제작된 tRNA가, 원핵생물 유래의 tRNA 또는 진핵생물 유래의 tRNA와 가장 높은 염기 서열 동일성을 갖고 있어도 된다. 진핵생물은 추가로 동물, 식물, 균류 및 원생 생물로 분류된다. 본 개시의 tRNA는, 예를 들어 인간 유래의 tRNA여도 된다. 원핵생물은, 추가로 진정 세균과 고세균으로 분류된다. 진정 세균으로서는, 예를 들어 대장균, 고초균, 유산균, 또는 Desulfitobacterium hafniense 등을 들 수 있다. 고세균으로서는, 예를 들어 고도호염균, 호열균, 또는 메테인균(예를 들어 Methanosarcina mazei, Methanosarcina barkeri, Methanocaldococcus jannaschii) 등을 들 수 있다. 본 개시의 tRNA는, 예를 들어 대장균이나 Desulfitobacterium hafniense, Methanosarcina mazei 유래의 tRNA여도 된다.
몇몇 태양에 있어서, 본 개시의 tRNA는, 참조 tRNA의 염기 서열에 대해서, 1 또는 복수의 염기가 상이해도 되고, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 11 이상 또는 12 이상의 염기가 상이해도 되고, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 염기가 상이해도 되고, 15 이하, 14 이하, 13 이하, 12 이하, 11 이하, 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하, 6 이하, 5 이하, 4 이하, 3 이하, 또는 2 이하의 염기가 상이해도 된다. 몇몇 태양에 있어서, 본 개시의 tRNA는, 참조 tRNA의 염기 서열과 비교하여, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 혹은 98% 이상의 서열 동일성을 갖고 있어도 된다. 본 개시에 있어서, 어느 염기 서열에 대한 「퍼센트(%) 서열 동일성」은, 최대의 퍼센트 서열 동일성을 얻도록 서열을 정렬시키고 또한 필요하면 갭을 도입한 후의, 또한, 어떠한 보존적 치환도 서열 동일성의 일부라고 생각하지 않는다고 했을 때의, 참조 염기 서열 중의 염기와 동일한 후보 서열 중의 염기의, 백분율비로서 정의된다. 염기 서열의 퍼센트 서열 동일성을 결정할 목적의 얼라인먼트는, 당해 기술 분야에 있어서의 기술의 범위 내에 있는 여러 가지 방법, 예를 들어, BLAST, BLAST-2, ALIGN, Megalign (DNASTAR) 소프트웨어, 또는 GENETYX(등록상표)(주식회사 제네틱스) 등의, 공적으로 입수 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하는 것에 의해 달성할 수 있다. 당업자는, 비교되는 서열의 전장에 걸쳐서 최대의 얼라인먼트를 달성하기 위해서 필요한 임의의 알고리즘을 포함하는, 서열의 얼라인먼트를 취하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다.
몇몇 태양에 있어서, 본 개시의 tRNA는, 안티코돈 루프(32∼38위)의 염기 서열이, 참조 tRNA의 염기 서열과 상이해도 된다. 어느 태양에 있어서, 본 개시의 tRNA는, 키메라 안티코돈 루프를 갖고 있어도 된다. 본 개시에 있어서의 「키메라 안티코돈 루프」란, 32, 33, 37 및 38위의 염기와 안티코돈의 염기 서열의 유래하는 tRNA가 상이한 안티코돈 루프를 의미한다. 예를 들어, 안티코돈 UGA가 포함되는 안티코돈 루프가 키메라 안티코돈 루프에 해당하는지 여부는 다음과 같이 판정할 수 있다. 우선, 안티코돈 UGA를 갖는 tRNA로서, 대장균에서 유래하는 tRNA Ser1(서열 번호: 306)이 동정되기 때문에, 안티코돈 UGA는 tRNA Ser1에서 유래한다고 결정할 수 있다(안티코돈의 유래를 결정할 때에는, 서열 번호: 274∼319에 기재된 tRNA의 염기 서열을 참조해도 된다). 여기에서, 상기 tRNA Ser1의 안티코돈 루프의 염기 서열은 CUugaAA이다. 그 때문에, 안티코돈 루프에 포함되는 32, 33, 37 및 38위의 염기가 Ser5 서열(32C, 33U, 37A, 및 38A) 이외의 염기의 조합인 경우에, 동 안티코돈 루프는, 키메라 안티코돈 루프로 판정된다. 어느 태양에 있어서, 본 개시의 tRNA의 안티코돈 루프는, 서열 번호: 274∼282, 285∼304, 및 306∼319 중 어느 하나에 기재된 염기 서열을 갖는 tRNA에 포함되는 안티코돈 루프(tRNA 넘버링 규칙의 32∼38위)와 상이해도 된다. 몇몇 태양에 있어서, 본 개시의 tRNA의 보디는, 참조 tRNA의 보디의 염기 서열에 대해서, 1 또는 복수의 염기가 상이해도 되고, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 11 이상 또는 12 이상의 염기가 상이해도 되고, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 염기가 상이해도 되고, 15 이하, 14 이하, 13 이하, 12 이하, 11 이하, 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하, 6 이하, 5 이하, 4 이하, 3 이하, 또는 2 이하의 염기가 상이해도 된다. 몇몇 태양에 있어서, 본 개시의 tRNA 보디는, 참조 tRNA 보디의 염기 서열과 비교하여, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 혹은 98% 이상의 서열 동일성을 갖고 있어도 된다. 몇몇 태양에 있어서, 본 개시의 tRNA는, 그 32, 33, 37 및 38위로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개에 있어서, 참조 tRNA의 염기와 상이해도 된다. 몇몇 태양에 있어서, 본 개시의 tRNA 보디는, 32, 33, 37 및 38위로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개에 있어서, 참조 tRNA 보디의 염기와 상이해도 된다. 몇몇 태양에 있어서, 본 개시의 tRNA는, 천연에는 존재하지 않는 tRNA인 것을 특징으로 한다. 어느 태양에 있어서, 본 개시의 tRNA 보디는, 서열 번호: 275에 기재된 염기 서열을 갖는 tRNA에서 유래하지 않는 tRNA 보디 여도 되고, 및/또는, 서열 번호: 294, 295, 및 296에 기재된 염기 서열을 갖는 tRNA의 어느 것에서도 유래하지 않는 tRNA 보디여도 되고, 및/또는, 서열 번호: 302, 303, 및 304에 기재된 염기 서열을 갖는 tRNA의 어느 것에서도 유래하지 않는 tRNA 보디여도 된다. 어느 태양에 있어서, 본 개시의 tRNA 보디의 32, 33, 37 및 38위가 Leu2 서열인 경우에는, tRNA 보디는 서열 번호: 294, 295, 및 296에 기재된 염기 서열을 갖는 tRNA의 어느 것에서도 유래하지 않아도 되고, Ala2 서열인 경우에는, tRNA 보디는 서열 번호: 275에 기재된 염기 서열을 갖는 tRNA에서 유래하지 않아도 되고, Pro2 서열 또는 Pro3 서열인 경우에는, tRNA 보디는 서열 번호: 302, 303, 및 304에 기재된 염기 서열을 갖는 tRNA의 어느 것에서도 유래하지 않아도 된다.
본 개시에 있어서의 참조 tRNA 및 참조 tRNA 보디는, 각각 임의의 생물(예를 들어 대장균)에서 유래하는 천연 tRNA 또는 그의 보디여도 되고, 또는 천연 tRNA와는 상이한 서열을 인공적으로 합성한 비천연 tRNA 또는 그의 보디여도 되고, 혹은, 천연 tRNA 등의 서열을 인공적으로 합성한 tRNA(인공 tRNA) 또는 그의 보디여도 되고, 유래가 상이한 tRNA를 인공적으로 조합한 tRNA 키메라 또는 그의 보디여도 된다.
본 개시에 있어서의 참조 tRNA 또는 참조 tRNA 보디는, 각각 임의의 염기 서열을 갖는 tRNA 또는 tRNA 보디 중에서 적절히 선택할 수 있다. 몇몇 태양에 있어서, 참조 tRNA 또는 참조 tRNA 보디는, tRNA Ala, tRNA Arg, tRNA Asn, tRNA Asp, tRNA Cys, tRNA Gln, tRNA Glu, tRNA Gly, tRNA His, tRNA Ile, tRNA Leu, tRNA Lys, tRNA Met, tRNA Phe, tRNA Pro, tRNA Ser, tRNA Thr, tRNA Trp, tRNA Tyr, tRNA Val, 및 tRNA Sec(셀레노시스테인)(서열 번호: 274∼282, 285∼319), 및, tRNA Glu2, tRNA AsnE2, 및 tRNA Asp1(서열 번호: 322∼324)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 tRNA 또는 그의 보디여도 된다. tRNA fMet(서열 번호: 283, 284), tRNA Pyl(피롤리신), tRNA AsnE2(Ohta, A.; Murakami, H.; Higashimura, E.; Suga, H. Chem. Biol. 2007, 14, 1315-1322.를 참조)나 그의 보디 등도 참조로서 사용할 수 있다. 또한, tRNA Glu2의 T 스템을 tRNA Pro1에 이식하고, 추가로 변이를 가한 tRNA 키메라인 tRNA Pro1E2(WO2019/077887을 참조)나 그의 보디 등도 참조로서 사용할 수 있다. 특정의 태양에 있어서, 본 개시의 tRNA 또는 tRNA 보디는 tRNA Glu2, tRNA Asp1, 및 tRNA AsnE2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 tRNA 또는 그의 보디여도 된다. 몇몇 tRNA 보디에 대해, 1∼74위의 예시적인 염기 서열을 서열 번호: 253∼255, 320, 321에 나타낸다. 한편, 여기에서 예시한 참조 tRNA 보디는, 본 개시에 있어서의 키메라 tRNA 보디에 있어서의, 안티코돈 루프 이외의 부분의 유래원의 서열로서 사용해도 된다.
몇몇 태양에 있어서, 본 개시의 tRNA 또는 tRNA 보디가 갖는 참조 tRNA 또는 참조 tRNA 보디와의 차이는, 참조 tRNA 또는 참조 tRNA 보디의 서열 정보(예를 들어, 염기 서열 정보)에 기초하여, 당해 서열의 일부를 개변함으로써 생기게 해도 된다. 이 경우, 일단, 본 개시의 tRNA 또는 tRNA 보디의 서열 정보가 얻어지면, 그 후는 참조 서열 정보를 필요로 하지 않고, 본 개시의 tRNA 또는 tRNA 보디를 조제하는 것이 가능하다. 본 개시에 있어서 「개변」이란, 기존의 tRNA 또는 tRNA 보디의 염기 서열(기존 서열)에 대해서, 이하의 군으로부터 선택되는 적어도 1종류의 개변을, 적어도 1개, 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 혹은 12개 이상 도입하는 것을 의미한다: (i) 부가(기존 서열에 임의의 새로운 염기를 첨가하는 것), (ii) 결실(기존 서열로부터 임의의 뉴클레오타이드를 삭제하는 것), (iii) 치환(기존 서열에 있어서의 임의의 염기를 다른 임의의 염기로 치환하는 것), (iv) 삽입(기존 서열에 있어서의 임의의 2개의 뉴클레오타이드 사이에 새로운 임의의 뉴클레오타이드를 추가하는 것), (v) 수식(기존 서열에 있어서의 임의의 뉴클레오타이드의 구조의 일부(예를 들어 염기 부분이나 당 부분)를 다른 구조로 변화시키는 것). 개변은 tRNA 또는 tRNA 보디의 어느 구조(예를 들어 D암, 안티코돈암, T암, 억셉터 스템, 가변 루프 등)에 대해서 행해져도 된다. 특정의 태양에 있어서, 본 개시의 tRNA 또는 tRNA 보디의 개변은, tRNA의 32, 33, 37, 및 38위로 이루어지는 군, 또는 32, 37 및 38위로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개, 2개 이상, 3개 이상, 또는 4개의 염기에 대해 행해진다. 몇몇 태양에 있어서, 본 개시의 tRNA 및 tRNA 보디는, 실제로 참조 tRNA 또는 참조 tRNA 보디에 기초하여 개변된 것이 아니어도 된다. 참조 tRNA 또는 참조 tRNA 보디에 대해서 상기와 같은 개변이 되었을 경우에 얻어지는 염기 서열을 갖고 있는 tRNA 또는 tRNA 보디도, 본 개시의 tRNA 및 tRNA 보디에 포함된다.
본 개시에 있어서의 개변으로서는, 예를 들어, tRNA의 32, 33, 37 및 38위의 염기의 조합이, 본 개시의 tRNA의 해당 개소의 염기의 조합과 동일하게 되도록, 염기를 치환하는 것을 들 수 있다. 치환 전의 염기는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 치환 전의 32위의 염기는 C 또는 U여도 되고, 치환 전의 37위의 염기는 A여도 되고, 치환 전의 38위의 염기는 A 또는 C여도 되고, 및/또는, 치환 전의 33위의 염기는 U여도 된다. 몇몇 태양에 있어서, 32, 33, 37 또는 38위의 염기가 이미 소망의 염기인 경우에는, 치환을 필요로 하지 않는다. 예를 들어, 치환 전의 tRNA의 33위의 염기가 U이고, 33위의 소망하는 염기도 U인 경우에는, 33위의 염기의 치환을 필요로 하지 않는다.
몇몇 태양에 있어서, 본 개시의 tRNA는, 키메라 tRNA 보디를 가져도 된다. 키메라 tRNA 보디로서는, tRNA 보디의 안티코돈 루프 부분(즉, 32, 33, 37 및 38위)과 그 외의 부분이 상이한 tRNA 보디에서 유래하는 키메라 tRNA 보디가 예시된다. 키메라 tRNA 보디의 1∼74위의 염기 서열로서는, 이하가 예시된다.
몇몇 태양에 있어서, 본 개시의 tRNA의 32∼38위의 염기 서열은, 대장균의 야생형 tRNA, 또는 천연에 존재하는 tRNA의 32∼38위의 염기 서열과 상이해도 된다. 한정은 되지 않지만, 몇몇 태양에 있어서, 본 개시의 tRNA가 32U, 33U, 37G, 38A의 염기의 조합을 갖는 키메라 tRNA 보디를 갖는 경우, 안티코돈이 UGG 및/또는 CGG인 tRNA는, 본 개시의 tRNA로부터 제외되어도 된다. 몇몇 태양에 있어서, 본 개시의 tRNA가 32A, 33U, 37G, 38U의 염기의 조합을 갖는 키메라 tRNA 보디를 갖는 경우, 안티코돈이 AGG 및/또는 GGG인 tRNA는, 본 개시의 tRNA로부터 제외되어도 된다. 몇몇 태양에 있어서, 본 개시의 tRNA가 32A, 33U, 37A, 38U의 염기의 조합을 갖는 키메라 tRNA 보디를 갖는 경우, 안티코돈이 AGC 및/또는 GGC인 tRNA는, 본 개시의 tRNA로부터 제외되어도 된다. 몇몇 태양에 있어서, 본 개시의 tRNA가 32C, 33U, 37G, 38A의 염기의 조합을 갖는 키메라 tRNA 보디를 갖는 경우, 안티코돈이 UCG 및/또는 CCG인 tRNA는, 본 개시의 tRNA로부터 제외되어도 된다. 몇몇 태양에 있어서, 본 개시의 tRNA가 32U, 33U, 37G, 38U의 염기의 조합을 갖는 키메라 tRNA 보디를 갖는 경우, 안티코돈의 2문자째의 염기가 A이고, 또한 3문자째의 염기가 G인 tRNA는, 본 개시의 tRNA로부터 제외되어도 된다.
몇몇 태양에 있어서, 본 개시의 tRNA는, 그 안티코돈 루프 이외의 염기 서열은 특별히 한정되지 않지만, tRNA Ala, tRNA Pro 및 tRNA Leu 이외로부터 선택되어도 된다. 여기에서, 상기 안티코돈 루프 이외의 염기 서열이란, tRNA의 1∼31위 및 39∼76위의 염기 서열이어도 된다.
몇몇 태양에 있어서, 본 개시의 tRNA의 1∼31위 및 39∼74위의 염기 서열은, 특별히 한정되지 않지만, (a) 서열 번호: 253, (b) 서열 번호: 255, 및 (c) 서열 번호: 254로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개에 기재된 염기 서열을 갖는 tRNA에 있어서의 1∼31위 및 39∼74위의 염기 서열에서 유래해도 된다. 특정의 태양에 있어서, 본 개시의 tRNA의 1∼31위 및 39∼74위의 염기 서열은, 상기 (a)∼(c) 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개에 기재된 염기 서열을 갖는 tRNA에 있어서의 1∼31위 및 39∼74위의 염기 서열이어도 된다. 몇몇 태양에 있어서, 본 개시의 tRNA의 1∼31위 및 39∼74위의 염기 서열은, 상기 (a)∼(c) 중 어느 하나에 기재된 염기 서열을 갖는 tRNA에 있어서의 1∼31위 및 39∼74위의 염기 서열과 서열 동일성이 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 혹은 98% 이상이어도 된다.
몇몇 태양에 있어서, 본 개시의 tRNA의 75위의 염기는 C, 76위의 염기는 A여도 된다. 본 개시의 tRNA의 75 및 76위는, pCpA(사이티딘 및 아데노신을 포함하는 다이뉴클레오타이드)여도, pdCpA(데옥시사이티딘 및 아데노신을 포함하는 다이뉴클레오타이드)여도 된다. 몇몇 태양에 있어서, 본 개시의 tRNA는, 그 3＇ 말단에, 보다 구체적으로는, 3＇ 말단의 아데노신 잔기에, 보다 구체적으로는 3＇ 말단인 76위의 아데노신 잔기에 아미노산이 결합하고 있는 tRNA여도 된다.
본 개시에 있어서의 수식으로서는, tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기, 또는 뉴클레오타이드에 대해서 행해지는 수식(예를 들어, 라이시딘, 라이시딘 유도체, 아그마티딘, 또는 아그마티딘 유도체로의 치환)이 예시된다. 여기에서, 라이시딘 유도체란, 라이시딘의 구조의 일부(예를 들어 염기 부분)에 수식을 가하여 제작되어 있는 분자이며, 안티코돈의 일부로서 이용되었을 경우에, 라이시딘과 동등한 코돈 식별능(상보적 염기쌍의 형성능)을 갖고 있는 분자를 의미한다. 또한, 아그마티딘 유도체란, 아그마티딘의 구조의 일부(예를 들어 염기 부분)에 수식을 가하여 제작되어 있는 분자이며, 안티코돈의 일부로서 이용되었을 경우에, 아그마티딘과 동등한 코돈 식별능(상보적 염기쌍의 형성능)을 갖고 있는 분자를 의미한다. 본 개시에 있어서, 여기에 예시한 바와 같은 수식, 또는 그 외의 수식을 받고 있는 염기를 「수식 염기」라고 칭하는 경우가 있다. 본 개시에 있어서, 염기 서열 또는 핵산 서열 중의 「L」은 라이시딘을 의미한다.
천연 tRNA에 있어서의 라이시딘은, tRNA Ile-라이시딘 합성 효소(tRNA Ile-lysidine synthetase; TilS)라고 불리는 효소의 작용에 의해 합성된다. TilS는, 아이소류신에 대응한 tRNA(tRNA Ile2)를 기질로서 특이적으로 인식하여, 그 안티코돈의 1문자째(N1)에 있어서의 사이티딘(C)을 라이시딘(k2C)으로 개변(변환)하는 활성을 갖고 있다. 본 개시의 tRNA에 있어서의 라이시딘은, TilS를 개재시켜 합성된 것이어도 되고, TilS를 개재시켜 합성된 것이어도 된다.
몇몇 태양에 있어서, 본 개시의 tRNA는, 수식 염기를 포함하지 않는 tRNA여도 된다. 본 개시에 있어서, in vitro 전사에 의해 조제한 tRNA를 「전사 tRNA」라고 부르는 경우가 있다. 본 개시의 tRNA는 전사 tRNA여도 되고, 수식 염기를 포함하지 않는 전사 tRNA여도 된다. 본 개시에 있어서, 천연에 존재하는 천연 tRNA와 구별하기 위해서 「인공 tRNA」라고 하는 용어를 사용하는 경우가 있다. 본 개시의 tRNA는 인공 tRNA여도 되고, 수식 염기, 또는 수식 뉴클레오타이드를 포함하지 않는 인공 tRNA여도 된다. 수식 염기를 포함하지 않는 tRNA, 수식 뉴클레오타이드를 포함하지 않는 tRNA, 전사 tRNA 및 인공 tRNA의 조제 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 주형 DNA로부터, T7 RNA 폴리메라제 등의 RNA 폴리메라제를 이용한 in vitro 전사 반응에 의해 tRNA를 합성하고, 필요에 따라서 RNA를 정제하는 것에 의해 조제해도 된다. RNA의 정제에는 RNeasy kit(Qiagen사) 등을 사용할 수 있다. 몇몇 태양에 있어서, 본 개시의 tRNA의 염기는, A, C, G 및 U로 구성되어도 된다. 어느 태양에 있어서, 본 개시의 tRNA는 A, C, G, 및 U로 이루어지는 염기를 가져도 된다.
몇몇 태양에 있어서, 본 개시의 tRNA에는 아미노산이 결합하고 있어도 된다. 아미노산은, 통상, tRNA의 3＇ 말단에, 보다 구체적으로는, 3＇ 말단의 CCA 서열의 아데노신 잔기에 결합하고 있다. 어느 태양에 있어서, 상기 3＇ 말단의 아데노신 잔기는, tRNA 넘버링 규칙의 76위여도 된다. tRNA에 결합하고 있는 아미노산의 구체적인 종류는, 이하에 기재된 아미노산 중에서 각각 적절히 선택할 수 있지만, 예를 들어, 비천연 아미노산을 들 수 있다.
본 개시에 있어서의 아미노산에는, α-아미노산, β-아미노산, γ-아미노산 등이 포함된다. 입체 구조로서는, L형 아미노산, D형 아미노산의 어느 것도 포함된다. 또한, 본 개시에 있어서의 아미노산은, 천연 아미노산 및 비천연 아미노산을 포함한다. 천연 아미노산은, 이하의 20종류의 α-아미노산: 글리신(Gly), 알라닌(Ala), 세린(Ser), 트레오닌(Thr), 발린(Val), 류신(Leu), 아이소류신(Ile), 페닐알라닌(Phe), 티로신(Tyr), 트립토판(Trp), 히스티딘(His), 글루타민산(Glu), 아스파라긴산(Asp), 글루타민(Gln), 아스파라긴(Asn), 시스테인(Cys), 메티오닌(Met), 리신(Lys), 아르기닌(Arg), 및 프롤린(Pro)으로 이루어진다. 천연 아미노산은 통상, L형 아미노산이다.
본 개시에 있어서, 비천연 아미노산이란, 상기의 20종류의 α-아미노산으로 이루어지는 천연 아미노산을 제외한 모든 아미노산을 나타낸다. 비천연 아미노산의 예로서, β-아미노산, γ-아미노산, D형 아미노산, 천연 아미노산과는 측쇄가 상이한 α-아미노산, α,α-이치환 아미노산, 주쇄의 아미노기가 치환기를 갖는 아미노산(본 개시에 있어서, 「N치환 아미노산」이라고 부르는 경우가 있다.), 하이드록시카복실산(하이드록시산) 등을 들 수 있다. N치환 아미노산으로서는, N-메틸아미노산, N-에틸아미노산, N-프로필아미노산, N-뷰틸아미노산이 예시되지만, 이들로 한정되지 않는다. 비천연 아미노산의 측쇄는, 특별히 한정되지 않지만, 수소 원자 외에, 예를 들어 알킬, 알켄일, 알킨일, 아릴, 헤테로아릴, 아르알킬, 사이클로알킬 등을 갖고 있어도 된다. 또한, α,α-이치환 아미노산의 경우, 2개의 측쇄가 환을 형성하고 있어도 된다. 더욱이, 이들 측쇄는, 1개 이상의 치환기를 갖고 있어도 된다. 특정의 태양에 있어서, 치환기는, 할로젠 원자, O 원자, S 원자, N 원자, B 원자, Si 원자, 또는 P 원자를 포함하는 임의의 작용기 중에서 선택할 수 있다. 예를 들어, 본 개시에 있어서 「할로젠을 치환기에 갖는 C1-C6 알킬」이란, 알킬에 있어서의 적어도 1개의 수소 원자가 할로젠 원자로 치환된 「C1-C6 알킬」을 의미하고, 구체적으로는, 예를 들어, 트라이플루오로메틸, 다이플루오로메틸, 플루오로메틸, 펜타플루오로에틸, 테트라플루오로에틸, 트라이플루오로에틸, 다이플루오로에틸, 플루오로에틸, 트라이클로로메틸, 다이클로로메틸, 클로로메틸, 펜타클로로에틸, 테트라클로로에틸, 트라이클로로에틸, 다이클로로에틸, 클로로에틸 등을 포함한다. 또한, 예를 들어 「치환기를 갖는 C5-C10 아릴C1-C6 알킬」이란, 아릴 및/또는 알킬에 있어서의 적어도 1개의 수소 원자가 치환기에 의해 치환된 「C5-C10 아릴C1-C6 알킬」을 의미한다. 더욱이, 「치환기를 2개 이상 갖고 있는」이란, 어느 작용기(예를 들어 S 원자를 포함하는 작용기)를 치환기로서 갖고, 추가로 그 작용기가 별도의 치환기(예를 들어 아미노나 할로젠 등의 치환기)를 갖고 있는 것도 포함한다. 비천연 아미노산의 구체적인 예로서는, WO2013/100132나 WO2018/143145 등도 참조할 수 있다.
비천연 아미노산의 주쇄의 아미노기는, 비치환의 아미노기(-NH2기)여도 되고, 치환된 아미노기(-NHR기)여도 된다. 여기에서, R은, 치환기를 갖고 있어도 되는 알킬, 알켄일, 알킨일, 아릴, 헤테로아릴, 아르알킬, 사이클로알킬을 나타낸다. 또한, 프롤린과 같이 주쇄의 아미노기의 N 원자에 결합한 탄소쇄와 α위의 탄소 원자가 환을 형성하고 있어도 된다. 치환기는, 할로젠 원자, O 원자, S 원자, N 원자, B 원자, Si 원자, 또는 P 원자를 포함하는 임의의 작용기 중에서 선택할 수 있다. 아미노기의 알킬 치환의 예로서는, N-메틸화, N-에틸화, N-프로필화, N-뷰틸화 등을, 아르알킬 치환의 예로서는, N-벤질화 등을 들 수 있다. N-메틸아미노산의 구체적인 예로서는, N-메틸알라닌, N-메틸글리신, N-메틸페닐알라닌, N-메틸티로신, N-메틸-3-클로로페닐알라닌, N-메틸-4-클로로페닐알라닌, N-메틸-4-메톡시페닐알라닌, N-메틸-4-싸이아졸알라닌, N-메틸히스티딘, N-메틸세린, N-메틸아스파라긴산 등을 들 수 있다.
할로젠 원자를 포함하는 치환기의 예로서는, 플루오로(-F), 클로로(-Cl), 브로모(-Br), 아이오도(-I) 등을 들 수 있다.
O 원자를 포함하는 치환기의 예로서는, 하이드록실(-OH), 옥시(-OR), 카보닐(-C=O-R), 카복실(-CO2H), 옥시카보닐(-C=O-OR), 카보닐옥시(-O-C=O-R), 싸이오카보닐(-C=O-SR), 카보닐싸이오(-S-C=O-R), 아미노카보닐(-C=O-NHR), 카보닐아미노(-NH-C=O-R), 옥시카보닐아미노(-NH-C=O-OR), 설폰일아미노(-NH-SO2-R), 아미노설폰일(-SO2-NHR), 설팜오일아미노(-NH-SO2-NHR), 싸이오카복실(-C(=O)-SH), 카복실카보닐(-C(=O)-CO2H) 등을 들 수 있다.
옥시(-OR)의 예로서는, 알콕시, 사이클로알콕시, 알켄일옥시, 알킨일옥시, 아릴옥시, 헤테로아릴옥시, 아르알킬옥시 등을 들 수 있다.
카보닐(-C=O-R)의 예로서는, 폼일(-C=O-H), 알킬카보닐, 사이클로알킬카보닐, 알켄일카보닐, 알킨일카보닐, 아릴카보닐, 헤테로아릴카보닐, 아르알킬카보닐 등을 들 수 있다.
옥시카보닐(-C=O-OR)의 예로서는, 알킬옥시카보닐, 사이클로알킬옥시카보닐, 알켄일옥시카보닐, 알킨일옥시카보닐, 아릴옥시카보닐, 헤테로아릴옥시카보닐, 아르알킬옥시카보닐 등을 들 수 있다.
카보닐옥시(-O-C=O-R)의 예로서는, 알킬카보닐옥시, 사이클로알킬카보닐옥시, 알켄일카보닐옥시, 알킨일카보닐옥시, 아릴카보닐옥시, 헤테로아릴카보닐옥시, 아르알킬카보닐옥시 등을 들 수 있다.
싸이오카보닐(-C=O-SR)의 예로서는, 알킬싸이오카보닐, 사이클로알킬싸이오카보닐, 알켄일싸이오카보닐, 알킨일싸이오카보닐, 아릴싸이오카보닐, 헤테로아릴싸이오카보닐, 아르알킬싸이오카보닐 등을 들 수 있다.
카보닐싸이오(-S-C=O-R)의 예로서는, 알킬카보닐싸이오, 사이클로알킬카보닐싸이오, 알켄일카보닐싸이오, 알킨일카보닐싸이오, 아릴카보닐싸이오, 헤테로아릴카보닐싸이오, 아르알킬카보닐싸이오 등을 들 수 있다.
아미노카보닐(-C=O-NHR)의 예로서는, 알킬아미노카보닐, 사이클로알킬아미노카보닐, 알켄일아미노카보닐, 알킨일아미노카보닐, 아릴아미노카보닐, 헤테로아릴아미노카보닐, 아르알킬아미노카보닐 등을 들 수 있다. 더욱이, -C=O-NHR 중의 N 원자와 결합한 H 원자는, 알킬, 사이클로알킬, 알켄일, 알킨일, 아릴, 헤테로아릴, 및 아르알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되는 치환기로 치환되어 있어도 된다.
카보닐아미노(-NH-C=O-R)의 예로서는, 알킬카보닐아미노, 사이클로알킬카보닐아미노, 알켄일카보닐아미노, 알킨일카보닐아미노, 아릴카보닐아미노, 헤테로아릴카보닐아미노, 아르알킬카보닐아미노 등을 들 수 있다. 더욱이, -NH-C=O-R 중의 N 원자와 결합한 H 원자는, 알킬, 사이클로알킬, 알켄일, 알킨일, 아릴, 헤테로아릴, 및 아르알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되는 치환기로 치환되어 있어도 된다.
옥시카보닐아미노(-NH-C=O-OR)의 예로서는, 알콕시카보닐아미노, 사이클로알콕시카보닐아미노, 알켄일옥시카보닐아미노, 알킨일옥시카보닐아미노, 아릴옥시카보닐아미노, 헤테로아릴옥시카보닐아미노, 아르알킬옥시카보닐아미노 등을 들 수 있다. 더욱이, -NH-C=O-OR 중의 N 원자와 결합한 H 원자는, 알킬, 사이클로알킬, 알켄일, 알킨일, 아릴, 헤테로아릴, 및 아르알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되는 치환기로 치환되어 있어도 된다.
설폰일아미노(-NH-SO2-R)의 예로서는, 알킬설폰일아미노, 사이클로알킬설폰일아미노, 알켄일설폰일아미노, 알킨일설폰일아미노, 아릴설폰일아미노, 헤테로아릴설폰일아미노, 아르알킬설폰일아미노 등을 들 수 있다. 더욱이, -NH-SO2-R 중의 N 원자와 결합한 H 원자는, 알킬, 사이클로알킬, 알켄일, 알킨일, 아릴, 헤테로아릴, 및 아르알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되는 치환기로 치환되어 있어도 된다.
아미노설폰일(-SO2-NHR)의 예로서는, 알킬아미노설폰일, 사이클로알킬아미노설폰일, 알켄일아미노설폰일, 알킨일아미노설폰일, 아릴아미노설폰일, 헤테로아릴아미노설폰일, 아르알킬아미노설폰일 등을 들 수 있다. 더욱이, -SO2-NHR 중의 N 원자와 결합한 H 원자는, 알킬, 사이클로알킬, 알켄일, 알킨일, 아릴, 헤테로아릴, 및 아르알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되는 치환기로 치환되어 있어도 된다.
설팜오일아미노(-NH-SO2-NHR)의 예로서는, 알킬설팜오일아미노, 사이클로알킬설팜오일아미노, 알켄일설팜오일아미노, 알킨일설팜오일아미노, 아릴설팜오일아미노, 헤테로아릴설팜오일아미노, 아르알킬설팜오일아미노 등을 들 수 있다. 더욱이, -NH-SO2-NHR 중의 N 원자와 결합한 2개의 H 원자 중 적어도 1개는, 알킬, 사이클로알킬, 알켄일, 알킨일, 아릴, 헤테로아릴, 및 아르알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되는 치환기로 치환되어 있어도 된다. 2개의 H 원자가 함께 치환되어 있는 경우는, 각각 독립적으로 치환기를 선택해도 되고, 또한, 이들 2개의 치환기는 환을 형성하고 있어도 된다.
S 원자를 포함하는 치환기의 예로서는, 싸이올(-SH), 싸이오(-S-R), 설핀일(-S=O-R), 설폰일(-S(O)2-R), 설포(-SO3H) 등을 들 수 있다.
싸이오(-S-R)의 예로서는, 알킬싸이오, 사이클로알킬싸이오, 알켄일싸이오, 알킨일싸이오, 아릴싸이오, 헤테로아릴싸이오, 아르알킬싸이오 등을 들 수 있다.
설핀일(-S=O-R)의 예로서는, 알킬설핀일, 사이클로알킬설핀일, 알켄일설핀일, 알킨일설핀일, 아릴설핀일, 헤테로아릴설핀일, 아르알킬설핀일 등을 들 수 있다.
설폰일(-S(O)2-R)의 예로서는, 알킬설폰일, 사이클로알킬설폰일, 알켄일설폰일, 알킨일설폰일, 아릴설폰일, 헤테로아릴설폰일, 아르알킬설폰일 등을 들 수 있다.
N 원자를 포함하는 치환기의 예로서는, 아자이도(-N3), 사이아노(-CN), 1급 아미노(-NH2), 2급 아미노(-NH-R), 3급 아미노(-NR(R')), 아미디노(-C(=NH)-NH2), 치환 아미디노(-C(=NR)-NR'R''), 구아니디노(-NH-C(=NH)-NH2), 치환 구아니디노(-NR-C(=NR''')-NR'R''), 아미노카보닐아미노(-NR-CO-NR'R'') 등을 들 수 있다.
2급 아미노(-NH-R)의 예로서는, 알킬아미노, 사이클로알킬아미노, 알켄일아미노, 알킨일아미노, 아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 아르알킬아미노 등을 들 수 있다.
3급 아미노(-NR(R'))에 있어서의 N 원자 상의 2개의 치환기 R 및 R'는, 알킬, 사이클로알킬, 알켄일, 알킨일, 아릴, 헤테로아릴, 및 아르알킬로 이루어지는 군으로부터 각각 독립적으로 선택할 수 있다. 3급 아미노의 예로서는, 예를 들어 알킬(아르알킬)아미노 등을 들 수 있다. 이들 2개의 치환기는 환을 형성하고 있어도 된다.
치환 아미디노(-C(=NR)-NR'R'')에 있어서의 N 원자 상의 3개의 치환기 R, R', 및 R''는, 수소 원자, 알킬, 사이클로알킬, 알켄일, 알킨일, 아릴, 헤테로아릴, 및 아르알킬로 이루어지는 군으로부터 각각 독립적으로 선택할 수 있다. 치환 아미디노의 예로서는, 예를 들어 알킬(아르알킬)(아릴)아미디노 등을 들 수 있다. 이들 치환기는 서로 환을 형성하고 있어도 된다.
치환 구아니디노(-NR-C(=NR''')-NR'R'')에 있어서의 N 원자 상의 4개의 치환기 R, R', R'', 및 R'''는, 수소 원자, 알킬, 사이클로알킬, 알켄일, 알킨일, 아릴, 헤테로아릴, 및 아르알킬로 이루어지는 군으로부터 각각 독립적으로 선택할 수 있다. 이들 치환기는 서로 환을 형성하고 있어도 된다.
아미노카보닐아미노(-NR-CO-NR'R'')에 있어서의 N 원자 상의 3개의 치환기 R, R', 및 R''는, 수소 원자, 알킬, 사이클로알킬, 알켄일, 알킨일, 아릴, 헤테로아릴, 및 아르알킬로 이루어지는 군으로부터 각각 독립적으로 선택할 수 있다. 이들 치환기는 서로 환을 형성하고 있어도 된다.
B 원자를 포함하는 치환기의 예로서는, 보릴(-BR(R'))이나 다이옥시보릴(-B(OR)(OR')) 등을 들 수 있다. B 원자 상의 2개의 치환기 R 및 R'는, 수소 원자, 알킬, 사이클로알킬, 알켄일, 알킨일, 아릴, 헤테로아릴, 및 아르알킬로 이루어지는 군으로부터 각각 독립적으로 선택할 수 있다. 이들 치환기는 서로 환을 형성하고 있어도 된다.
본 개시에 있어서의 하이드록시카복실산에는, α-하이드록시카복실산, β-하이드록시카복실산, γ-하이드록시카복실산 등이 포함된다. 하이드록시카복실산에 있어서의 α위의 탄소에는, 아미노산과 마찬가지로, 수소 원자 이외의 측쇄가 결합하고 있어도 된다. 입체 구조로서는, L형 및 D형의 어느 것도 포함될 수 있다. 측쇄의 구조는, 전술한 천연 아미노산 또는 비천연 아미노산의 측쇄와 마찬가지로 정의할 수 있다. 하이드록시카복실산의 예로서, 하이드록시아세트산, 락트산, 페닐락트산 등을 들 수 있다.
본 개시에 있어서의 아미노산은, 번역 가능한 아미노산이어도 된다. 본 개시에 있어서 「번역 가능한」 아미노산이란, 번역 합성에 의해(예를 들어, 본 개시에 기재된 번역계를 이용하여) 펩타이드에 짜넣는 것이 가능한 아미노산을 의미한다. 어느 아미노산이 번역 가능한지 여부는, 당해 아미노산을 결합시킨 tRNA를 이용한 번역 합성 실험에 의해 확인할 수 있다. 번역 합성 실험에는 재구성의 무세포 번역계를 이용해도 된다(예를 들어, WO2013100132를 참조).
몇몇 태양에 있어서, 본 개시에 있어서의 아미노산으로서, Pic2((2S)-piperidine-2-carboxylic acid), dA((2R)-2-aminopropanoic acid), MeHph((2S)-2-(methylamino)-4-phenyl-butanoic acid), SPh2Cl((2S)-2-amino-3-(2-chlorophenoxy)propanoic acid), MeG(2-(methylamino)acetic acid), nBuG(2-(butylamino)acetic acid) 등을 예시할 수 있다.
본 개시에 있어서의 비천연 아미노산은, 종래 공지된 화학적인 합성법이나, 후술하는 실시예에 기재된 합성법, 그들에 준하는 합성법에 의해 조제할 수 있다.
＜tRNA의 조제＞
tRNA는, 예를 들어, 소망의 tRNA 유전자를 코딩하는 DNA를 준비하고, 그 상류에 T7, T3, 혹은 SP6 등의 적절한 프로모터를 배치하고, 당해 DNA를 주형으로 각 프로모터에 적응한 RNA 폴리메라제를 이용하여 전사 반응을 행하는 것에 의해 합성할 수 있다. 또한, tRNA는 생물학적 재료로부터의 정제에 의해서도 조제할 수 있다. 예를 들어, 세포 등의 tRNA를 포함하는 재료로부터 추출액을 조제하고, 거기에 tRNA의 염기 서열에 상보적인 서열을 포함하는 프로브를 첨가하는 것에 의해 tRNA를 회수할 수 있다. 이 때, 소망의 tRNA를 발현 가능한 발현 벡터를 준비하고, 당해 발현 벡터로 형질 전환한 세포를 재료로 조제를 행할 수도 있다. in vitro의 전사에 의해 합성된 tRNA에는, 통상, 4개의 전형적인 염기인 아데닌, 구아닌, 사이토신, 및 우라실만이 포함되어 있다. 한편, 세포 내에서 합성된 tRNA에는, 그들을 수식하여 얻어진 수식 염기 등도 포함되어 있는 경우가 있다. 천연 tRNA에 있어서의 수식 염기(예를 들어 라이시딘 등)는, tRNA가 전사에 의해 합성된 후에, 그 수식을 행하기 위한 효소(예를 들어 TilS 등)의 작용에 의해, 당해 tRNA에 특이적으로 도입된다고 생각되고 있다.
아미노아실 tRNA도 화학적 및/또는 생물학적인 합성법에 의해 조제할 수 있다. 예를 들어, 아미노아실 tRNA 합성 효소(ARS)를 이용하여, tRNA에 아미노산을 결합시키는 것에 의해 아미노아실 tRNA를 합성할 수 있다. 아미노산은 ARS의 기질이 될 수 있는 것이면, 천연 아미노산이어도, 비천연 아미노산이어도 된다. 혹은, 천연 아미노산을 tRNA에 결합시킨 후에, 아미노산에 화학적인 수식을 가해도 된다. 또한, ARS에 아미노산 변이를 도입하는 것에 의해, 비천연 아미노산에 대한 작용이 높여진 예도 다수 보고되어 있고(예를 들어 WO2006/135096, WO2007/061136, WO2007/103307, WO2008/001947, WO2010/141851, WO2015/120287 등을 참조), 그와 같은 변이 ARS를 이용하여, tRNA에 아미노산을 결합시켜도 된다. ARS를 이용하는 방법 이외에도, 예를 들어, tRNA의 3＇ 말단으로부터 CA 서열을 제거하고, 거기에 아미노아실화된 pdCpA(뉴클레오타이드로서 데옥시사이티딘 및 아데노신을 포함하는 다이뉴클레오타이드)를 RNA 리가제를 이용하여 결합시키는 것에 의해 아미노아실 tRNA를 합성할 수 있다(pdCpA법; Hecht et al., J Biol Chem (1978) 253: 4517-4520). pdCpA 대신에 pCpA(뉴클레오타이드로서 사이티딘 및 아데노신을 포함하는 다이뉴클레오타이드)를 이용하는 방법도 알려져 있다(pCpA법; Wang et al., ACS Chem Biol (2015) 10: 2187-2192). 또한, 미리 에스터화에 의해 활성화한 비천연형 아미노산을 인공 RNA 촉매인 플렉시자임을 이용하여 tRNA에 결합시키는 것에 의해서도 아미노아실 tRNA를 합성할 수 있다(WO2007/066627, WO2012/026566, H. Murakami et al., Chemistry & Biology, Vol. 10, 2003, 655-662; H. Murakami et al., Chemistry & Biology, Vol. 10, 2003, 1077-1084; H. Murakami et al., Nature Methods 3, 2006, 357-359; N. Niwa et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 19, 2009, 3892-3894). 플렉시자임은, tRNA에 아미노산 또는 하이드록시산을 연결할 수 있는 인공 RNA 촉매이다. 본 개시에 있어서의 플렉시자임에는, 원형의 플렉시자임(Fx), 및, 이로부터 개변된 다이나이트로벤질 플렉시자임(dFx), 인핸스드 플렉시자임(eFx), 아미노 플렉시자임(aFx) 등도 포함된다.
일 국면에 있어서, 본 개시는, 펩타이드 번역에 적합한 한 벌의 tRNA를 제공한다. 한 벌의 tRNA에는, 복수의 상이한 종류의 tRNA가 포함되고, 그들 tRNA로부터 복수의 상이한 종류의 아미노산을 번역할 수 있다. 일 국면에 있어서, 본 개시는, 펩타이드 번역에 적절한 복수의 상이한 종류의 tRNA를 포함하는 번역용 조성물을 제공한다. 다른 국면에 있어서, 본 개시는, 상기 번역용 조성물의 제조 방법을 제공한다. 다른 국면에 있어서, 본 개시는, 펩타이드 번역에 적절한 복수의 상이한 종류의 tRNA를 제공하는 것을 포함하는, 펩타이드의 제조 방법을 제공한다. 일 국면에 있어서, 상기의 복수의 상이한 종류의 tRNA 중에, 본 개시의 tRNA가 포함된다. 이하의 기재는, 이들 펩타이드 번역에 적합한 한 벌의 tRNA, 번역용 조성물, 번역용 조성물의 제조 방법, 코돈의 읽기 오류를 저감하는 방법, 및 펩타이드의 제조 방법에 관한 것이다.
몇몇 태양에 있어서, 본 개시에 있어서의 한 벌의 tRNA는, 전술한 본 개시의 tRNA(본 개시에 있어서 「제 1 tRNA」라고 부르는 경우가 있다.)와, 제 2 tRNA를 포함해도 된다. 상기 제 2 tRNA로서는 임의의 tRNA를 사용해도 되지만, 상기 제 1 tRNA와는 독립적으로, 전술한 본 개시의 tRNA여도 된다.
몇몇 태양에 있어서, 본 개시에 있어서의 한 벌의 tRNA에 포함되는 제 1 tRNA와 제 2 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기는 서로 상이해도 된다. 상기 제 1 tRNA와 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 2문자째의 염기가 동일하고, 또한, 상기 제 1 tRNA와 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 3문자째의 염기가 동일해도 된다. 몇몇 태양에 있어서, 상기 제 1 tRNA의 안티코돈에 상보적인 코돈과 상기 제 2 tRNA의 안티코돈에 상보적인 코돈은, 동일 코돈 복스 내에 존재해도 된다. 몇몇 태양에 있어서, 본 개시의 제 1 tRNA 및 본 개시의 제 2 tRNA를 이용함으로써, 하나의 코돈 복스로부터 적어도 2종류의 아미노산을 번역할 수 있다. 몇몇 태양에 있어서, 상기 제 1 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 A 또는 G이고, 또한, 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 C 또는 U여도 된다. 몇몇 태양에 있어서, 상기 제 1 tRNA와 상기 제 2 tRNA의 각 안티코돈의 1문자째의 염기로서는, 이하의 조합이 예시된다: (A, C); (C, A); (G, C); (C, G); (A, U); (U, A); (G, U); (U, G). 여기에서, (A, C)는, 제 1 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 A이고, 제 2 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 C임을 나타낸다.
몇몇 태양에 있어서, 본 개시에 있어서의 한 벌의 tRNA에 포함되는 제 1 tRNA와 제 2 tRNA의 각각의 tRNA 보디는, 서로 상이해도 되고, 동일해도 된다. 몇몇 태양에 있어서, 제 1 tRNA와 제 2 tRNA의 1∼31위 및 39∼74위의 염기 서열이 동일하거나, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 혹은 98% 이상의 서열 동일성을 갖고 있어도 된다.
몇몇 태양에 있어서, 본 개시에 있어서의 한 벌의 tRNA에 포함되는 제 1 tRNA와 제 2 tRNA에는, 서로 상이한 아미노산이 결합하고 있어도 된다. 본 개시에 있어서, 제 1 tRNA에 결합하고 있는 아미노산을 제 1 아미노산이라고 칭하고, 제 2 tRNA에 결합하고 있는 아미노산을 제 2 아미노산이라고 칭하는 경우가 있다. 어느 태양에 있어서, 본 개시에 있어서의 제 1 아미노산 및 제 2 아미노산으로부터 선택되는 적어도 1개가 비천연 아미노산이어도 된다. 즉, 본 개시에 있어서의 한 벌의 tRNA의 적어도 1개, 또는 양쪽이 비천연 아미노산을 결합하고 있어도 된다. 몇몇 태양에 있어서, 제 1 tRNA 및 제 2 tRNA의 한쪽, 또는 양쪽이, 비천연 아미노산이 번역계 외에서 tRNA에 결합된 tRNA여도 된다.
한정은 되지 않지만, 몇몇 태양에 있어서, 제 1 tRNA 및 제 2 tRNA 중 어느 것, 또는 양쪽이, 32U, 33U, 37G, 및 38U의 염기의 조합을 갖는 키메라 tRNA 보디를 갖는 경우, 이하의 (L1)∼(L4)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 안티코돈의 조합을 갖는 상기 제 1 tRNA 및 상기 제 2 tRNA를 포함하는 한 벌의 tRNA는, 본 개시의 한 벌의 tRNA로부터 제외되어도 된다:
(L1) GCG 및 CCG, 및, CCG 및 GCG;
(L2) AAG 및 UAG, AAG 및 CAG, 및, UAG 및 CAG;
(L3) 안티코돈의 2문자째의 염기가 모두 C이고, 3문자째의 염기가 모두 G이다; 및
(L4) 안티코돈의 2문자째의 염기가 모두 A이고, 3문자째의 염기가 모두 G이다.
본 개시에 있어서의 번역용 조성물은, 본 개시의 tRNA를 포함하는 한 한정되지 않지만, 번역에 필요한 구성 성분을 포함해도 되고, 본 개시에 있어서의 번역계와 동일한 구성 성분을 포함해도 된다. 본 개시에 있어서의 번역용 조성물은, 무세포 번역계이면 되고, 재구성형의 무세포 번역계여도 된다. 한정을 의도하지 않지만, 몇몇 태양에 있어서, 본 개시에 있어서의 번역용 조성물은, 대장균 유래의 인자로 재구성된 무세포 번역계이면 되고, 리보솜, 번역 개시 인자, 번역 종결 인자, 번역 신장 인자, 아미노산, 아미노아실 tRNA 합성 효소(aaRS) 등을 포함해도 된다. 몇몇 태양에 있어서, 본 개시의 번역용 조성물은, 대장균 유래의 리보솜을 포함하고 있어도 된다. 몇몇 태양에 있어서, 본 개시의 tRNA는 대장균 유래의 tRNA여도 된다.
몇몇 태양에 있어서, 본 개시에 있어서의 번역용 조성물에는, 본 개시에 있어서의 한 벌의 tRNA가 포함되어 있어도 된다. 본 개시에 있어서의 번역용 조성물에는, 본 개시에 있어서의 한 벌의 tRNA가 1세트, 2세트, 3세트, 4세트, 5세트, 6세트, 7세트 혹은 8세트 포함되어 있어도 되고, 또는, 1세트 이상, 2세트 이상, 3세트 이상, 4세트 이상, 5세트 이상, 혹은 6세트 이상 포함되어 있어도 되고, 또는, 8세트 이하, 7세트 이하, 6세트 이하, 5세트 이하, 4세트 이하, 3세트 이하, 혹은 2세트 이하 포함되어 있어도 된다. 추가적인 태양에 있어서, 본 개시의 번역용 조성물에는 상기 이외의 tRNA가 포함되어 있어도 된다.
몇몇 태양에 있어서, 본 개시에 있어서의 번역용 조성물에 포함되는 본 개시에 있어서의 한 벌의 tRNA는, 당해 번역용 조성물에 aaRS가 포함되는 경우에는, 당해 aaRS와 오쏘고날(orthogonal)한 관계에 있는 tRNA여도 된다. aaRS와 오쏘고날한 관계에 있는 tRNA란, 번역용 조성물 중에 존재하는 aaRS에 의해서는 아미노아실화되지 않지만, 리보솜에는 흡수되어 아미노산을 번역 도입할 수 있는 tRNA를 의미한다. 이와 같은 tRNA로서는, tRNA Glu2, tRNA AsnE2, tRNA Asp1, tRNA Pro1E2 등의 tRNA 또는 이들에서 유래하는 tRNA가 예시된다. 필요에 따라서, 이들 tRNA를 인식하는 aaRS가 번역용 조성물 중으로부터 제거된다. 몇몇 태양에 있어서, 본 개시의 번역용 조성물은, 한 벌의 tRNA의 어느 것인가에 아미노산을 결합하는 것이 가능한 aaRS를 포함하지 않아도 된다.
몇몇 태양에 있어서, 본 개시의 번역용 조성물 및 번역용 키트에 의하면, 코돈의 읽기 오류를 저감할 수 있다. 본 개시의 번역용 조성물 및 번역용 키트는, 코돈의 읽기 오류에 의해 의도하지 않은 아미노산이 번역 도입되는 비율을 저감할 수 있다. 본 개시의 번역용 조성물 및 번역용 키트는, 주형 mRNA에 포함되는 코돈이, 동 코돈과 상보적이지 않은 안티코돈을 갖는 tRNA에 의해 번역되어 버리는 비율을 저감할 수 있다. 몇몇 태양에 있어서, 본 개시의 번역용 조성물 및 번역용 키트는, 안티코돈의 2문자째와 3문자째가, 각각 코돈의 2문자째와 1문자째에 상보적이고, 또한 왓슨-클릭형의 염기쌍을 형성할 수 있는 관계에 있으며, 더욱이, 상기 안티코돈의 1문자째가, 상기 코돈의 3문자째에 대해서 상보적이지 않은 tRNA에 의한, 상기 코돈의 읽기 오류를 저감할 수 있다. 몇몇 태양에 있어서는, 이 읽기 오류의 저감에 의해, 본 개시의 번역용 조성물 및 번역용 키트를 이용함으로써, 동일 코돈 복스 내에 2종 이상의 아미노산을 할당하는 것이 가능해진다. 특정의 태양에 있어서는, 동일 코돈 복스 내에 2종 이상의 비천연 아미노산을 할당하는 것이 가능해진다. 예를 들어, 안티코돈 AGG를 갖는 tRNA에 의한 코돈 CCG의 읽기 오류를 저감하는 것에 의해, 코돈 CCG에 아미노산을 할당한 채로, 안티코돈 AGG에 상보적인 코돈(예를 들어 CCU)에 다른 아미노산을 할당하는 것, 즉 동일 코돈 복스(이 경우 CCM 복스)에 상이한 2종류의 아미노산을 할당하는 것이 가능해진다.
이와 같이, 동일 코돈 복스에 2종 이상의 아미노산을 할당했을 때에 생길 수 있는 코돈의 읽기 오류에 기인하는, 잘못된 아미노산의 번역 도입 빈도를 저감하는 것에 의해, 유전 암호표에 할당하는 아미노산의 수를 늘리면서, 정확한 펩타이드 번역을 실현하는 것이 가능해진다.
몇몇 태양에 있어서, 본 개시에 의하면 tRNA 자체의 특성을 바꿀 수 있기 때문에, 번역용 조성물 중에 포함되는 또는 번역용 키트를 구성하는 아미노아실 tRNA량의 조정이나 번역 반응을 도중에 정지하는 등의 방법과 비교하여 편리성이 높다. 특정의 이론에 구속되는 것을 의도하지 않지만, 예를 들어 아미노아실 tRNA가 고갈되는 것에 의한 코돈의 읽기 오류를 막기 위해서, 번역계 중의 아미노아실 tRNA량을 늘리는 것을 시도했을 경우, 역방향의 읽기 오류가 생기는 것도 생각된다. 본 개시에 있어서의 번역용 조성물 및 번역용 키트는, 번역계 중의 아미노아실 tRNA량을 늘리지 않고 정확한 펩타이드 번역을 실현할 수 있는 점에서도 유용하다. 어느 태양에 있어서는, 본 개시에 있어서의 번역용 조성물 및 번역용 키트를, 상기의 아미노아실 tRNA량의 조정이나 번역 반응을 도중에 정지하는 등의 수법과 아울러 이용함으로써, 보다 높은, 코돈의 읽기 오류 저감 효과가 얻어질 수 있다. 일 태양에 있어서, 본 개시의 번역용 조성물 및 번역용 키트에 있어서는, 동일 코돈 복스의 상이한 코돈에 할당된 상이한 아미노산을 결합하는 복수종의 tRNA가, 서로 읽기 오류를 일으키지 않는 독립된 관계, 즉 직교성을 갖는(오쏘고날한) 관계에 있다고 할 수 있다. 천연에 존재하는 생물의 번역계에 있어서는, 본래, 코돈과 아미노산 사이에 엄밀한 대응 관계가 확립되어 있기 때문에, 직교성이 없는 tRNA가 거기에 가해지는 것에 의해, 그 대응 관계가 무너져, 번역계의 기능에 치명적인 영향이 나올 우려가 있다. 따라서, 본 개시의 일 태양에 있어서, 상기 복수종의 tRNA 사이에 직교성이 확립되어 있는 것은, 중요한 특징의 하나가 될 수 있다.
몇몇 태양에 있어서, 본 개시의 번역용 조성물 및 번역용 키트는, 코돈의 읽기 오류를 저감 하면서, UCM, CUM, CCM, CGM, ACM, GUM, GCM, GGM와 같은, 천연의 유전 암호표에 있어서 1종의 아미노산만이 할당되어 있는 코돈 복스에, 복수종의 아미노산, 특히 비천연 아미노산을 포함하는 복수종의 아미노산을 할당하는 것을 가능하게 한다. 아미노산의 할당하는 방법은 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 1종류째의 아미노산을 M1M2U 혹은 M1M2C의 코돈에 할당하고, 2종류째의 아미노산을 M1M2A 혹은 M1M2G의 코돈에 할당해도 되고, 또는 1 종류째의 아미노산을 M1M2U의 코돈에 할당하고, 2종류째의 아미노산을 M1M2G의 코돈에 할당해도 된다.
몇몇 태양에 있어서, 본 개시의 번역용 조성물 및 번역용 키트는, 제 2 tRNA의 안티코돈에 상보적인 코돈을 갖는 적어도 1종류의 mRNA, 및/또는, 제 1 tRNA의 안티코돈에 상보적인 코돈을 갖는 적어도 1종류의 mRNA를 포함해도 된다. 어느 태양에 있어서, 상기 2개의 코돈은, 동일 mRNA 상에 존재해도, 상이한 mRNA 상에 존재해도 된다. 몇몇 태양에 있어서, 본 개시의 번역용 조성물은, 서로 서열이 상이한 복수 종류의 mRNA를 포함하고 있어도 되고, mRNA 라이브러리를 포함하고 있어도 된다.
몇몇 태양에 있어서, 본 개시의 번역용 조성물 및 번역용 키트의 제조 방법은, 제 1 및/또는 제 2 tRNA를 in vitro 전사로 조제하는 공정을 포함하고 있어도 된다. 몇몇 태양에 있어서, 본 개시의 번역용 조성물 및 번역용 키트의 제조 방법은, 아미노산을 번역계 외에서 tRNA에 결합하는 것에 의해 본 개시의 tRNA를 조제하는 것을 포함해도 된다. 아미노산을 번역계 외에서 tRNA에 결합하는 것에 의해, 제 1 tRNA 및 제 2 tRNA를 조제하는 것을 포함해도 된다. 몇몇 태양에 있어서, 본 개시의 번역용 조성물 및 번역용 키트의 제조 방법은, 전술한 본 개시의 tRNA의 조제 방법을 포함해도 된다. 몇몇 태양에 있어서, 상기 아미노산은 비천연 아미노산이어도 된다.
몇몇 태양에 있어서, 본 개시의 펩타이드의 제조 방법은, 본 개시의 번역용 조성물 또는 번역용 키트를 이용하여 주형이 되는 핵산을 번역하는 것을 포함해도 된다. 번역 방법은 한정되지 않지만, 무세포 번역(in vitro translation), 예를 들어, 재구성 무세포 번역계를 이용한 번역을 들 수 있고, 보다 구체적으로는, 대장균 유래의 재구성 무세포 번역계를 이용한 번역이 예시된다.
몇몇 태양에 있어서, 본 개시의 펩타이드의 제조 방법은, 본 개시의 번역용 조성물 또는 번역용 키트를 이용하여, 제 2 tRNA의 안티코돈에 상보적인 코돈을 갖는 mRNA, 및/또는, 제 1 tRNA의 안티코돈에 상보적인 코돈을 갖는 mRNA를 번역하는 것을 포함해도 된다. 어느 태양에 있어서, 상기 2개의 코돈은, 동일 mRNA에 포함되어 있어도, 상이한 mRNA에 포함되어 있어도 된다. 몇몇 태양에 있어서, 본 개시의 펩타이드의 제조 방법은, 본 개시의 번역용 조성물을 이용하여, 서로 서열이 상이한 복수 종류의 핵산을 번역하는 것을 포함해도 되고, 핵산 라이브러리를 번역하는 것을 포함해도 되고, mRNA 라이브러리를 번역하는 것을 포함해도 된다. mRNA에는, 소망의 또는 랜덤한 아미노산 서열을 갖는 펩타이드가 코딩되어 있어도 된다. mRNA를 본 개시의 번역계에 첨가하는 것에 의해, 당해 mRNA의 펩타이드로의 번역을 행할 수 있다. 한편, DNA를 mRNA에 전사하기 위한 RNA 폴리메라제가 번역계에 포함되어 있는 경우, DNA를 본 개시의 번역계에 첨가하는 것에 의해, 당해 DNA의 mRNA로의 전사, 및 당해 mRNA의 펩타이드로의 번역을 아울러 행할 수 있다.
몇몇 태양에 있어서, 상기의 안티코돈에 상보적인 코돈은, 상기 안티코돈의 3염기 모두에 있어서 왓슨-크릭형 염기쌍을 형성하는 코돈이어도 되고, 또는, 코돈의 3문자째가 상기 안티코돈의 1문자째와 wobble 염기쌍을 형성하는 코돈이어도 된다.
몇몇 태양에 있어서, 본 개시의 펩타이드의 제조 방법은, UCM, CUM, CCM, CGM, ACM, GUM, GCM, 및 GGM으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 또는 6개 이상의 코돈 복스에 복수 종류의 아미노산을 할당하는 것을 포함해도 된다. 이와 같은 경우에도, 정확한 펩타이드 번역이 가능해질 수 있다.
몇몇 태양에 있어서, 본 개시의 펩타이드의 제조 방법에 의하면, 동일 코돈 복스 내에 존재하고, 또한, 3문자째가 이하 (i)∼(iv)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 조합인 코돈에 상이한 종류의 아미노산을 할당하면서, 코돈의 읽기 오류를 저감할 수 있다: (i) U와 G, (ii) C와 G, (iii) U와 A, 및 (iv) C와 A. 몇몇 태양에 있어서, 본 개시의 번역 방법에 의하면, UCM3, CUM3, CCM3, CGM3, ACM3, GUM3, GCM3 또는 GGM3의 코돈으로서, 상기 M3이 상기 (i)∼(iv)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 조합인 코돈에 상이한 종류의 아미노산을 할당하면서, 코돈의 읽기 오류를 저감할 수 있다.
본 개시에 있어서, tRNA에 의한 코돈의 읽기 오류의 저감은, 상이한 아미노산이 결합한, 상이한 안티코돈을 갖는 복수의 tRNA를 이용하여, 1종류의 주형 mRNA를 번역하는 것에 의해, 평가해도 된다. 상기 복수의 tRNA로서는, 번역 대상이 되는 특정의 코돈에 상보적인 안티코돈을 갖는 tRNA, 및 상기 코돈과 동일한 코돈 복스에 존재하는 코돈과 상보적이고, 상기 안티코돈과 상이한 안티코돈을 갖는 tRNA를 선택해도 된다.
예를 들어, 안티코돈 AGG를 갖는 tRNA에 의한, 코돈 CCG의 읽기 오류를 평가하기 위해서, 안티코돈 AGG를 갖고 아미노산 AA1이 결합한 tRNA, 및 안티코돈 CGG를 갖고 아미노산 AA2가 결합한 tRNA를 포함하는 번역계를 이용하여, 코돈 CCG를 포함하는 주형 mRNA를 번역한다. 이 경우, 코돈 CCG와 상보적인 CGG를 안티코돈에 갖는 tRNA에 의해 번역 도입되는 AA2가 목적으로 하는 번역 아미노산이며, 코돈 CCG와 상보적이지 않은 AGG를 안티코돈에 갖는 tRNA에 의해 번역 도입되는 AA1이 읽기 오류에 의해 생긴 번역 아미노산이다. 이와 같은 번역 산물의 비율을 지표로, 읽기 오류의 저감을 평가해도 된다.
상기 평가에 이용하는 주형 mRNA로서는, 실시예에 기재된 MR-1∼MR-7로부터 선택하여 사용해도 되고, 평가 대상으로 하는 코돈에 맞추어 다른 mRNA를 사용해도 된다. 상기 주형 mRNA를 번역하기 위한 번역계는, 원핵생물 유래의 재구성 무세포 단백질 합성계(예를 들어 PURE system)를 사용해도 된다. 또한, 번역 조건으로서는, 본 개시에 있어서의 「번역 조건 1」을 사용해도 된다. 보다 상세한 번역 방법, 및 평가 방법은 실시예에 기재되어 있다.
본 개시에 있어서, tRNA에 의한 코돈의 읽기 오류의 저감은, 목적물(target molecule)에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)에 의해 평가할 수 있다. 상기 비율은 이하의 식을 이용하여 산출된다. 32, 33, 37 및 38위의 염기의 조합을 개변하고 있지 않는 대조의 tRNA와 비교하여, 상기 비율이 낮은 경우에, 평가 대상의 tRNA가 코돈의 읽기 오류의 저감 효과를 갖는다고 판단한다. 상기 비율의 저하율은 특별히 한정되지 않지만, 본 개시의 tRNA는, 대조와 비교하여, 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 또는 50% 이상의 상기 비율의 저하를 나타내도 된다. 본 개시에 있어서, 올바르게 읽혀졌을 때에 얻어지는 펩타이드를, 올바르게 읽혀졌을 때의 번역 산물이나 목적물이라고 칭하는 경우가 있다.
펩타이드의 번역량은, 다음의 방법에 의해 구해도 된다. 즉, 번역 반응 종료 후에 얻어진 번역 산물 용액을 희석하고, LC-FLR-MS의 장치를 이용하여 분석한다. 희석 배율로서는 10배가 예시된다. 얻어진 MS 데이터로부터 대상이 되는 번역 펩타이드의 유지 시간을 동정하여, 해당 유지 시간의 형광 피크를 정량함으로써, 펩타이드 번역량을 평가한다. 정량은, 표품을 이용하여 검량선을 작성하여, 상대 정량에 의해 함유량을 산출함으로써 행한다. 상기 표품으로서는, LCT-67 혹은 LCT-12를 이용해도 된다.
LCT-67의 서열은, BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:Ile:Ile:Ile:Pro:Ile:Gly(서열 번호: 237), LCT-12의 서열은, BdpF:Thr:Ile:Phe:Pro:Gly:Phe:Ile:Ile:Thr:Thr:Gly:Thr:Gly:Thr:Gly:Thr:Gly:Ala(서열 번호: 238)로 표시된다.
일 국면에 있어서, 본 개시는, 본 개시에 있어서의 번역용 조성물을 이용하여 제조된 펩타이드, 및 펩타이드 라이브러리를 제공한다. 본 개시에 있어서의 펩타이드에는, 번역 후에 화학 수식을 행하는 등을 하여 얻어진 펩타이드도 포함되고, 또한, 핵산이 연결된 펩타이드-핵산 복합체가 포함된다.
번역 후 화학 수식의 예로서는, 직쇄 펩타이드의 환상화를 들 수 있다. 환상부를 형성하기 위한 결합으로서는, 예를 들어, 아미노기와 카복실기로부터 형성되는 펩타이드 결합을 이용할 수 있다. 그것 이외에도, 적절한 작용기의 조합으로부터 형성되는 아마이드 결합, 다이설파이드 결합, 에터 결합, 싸이오에터 결합, 에스터 결합, 싸이오에스터 결합, 탄소-탄소 결합, 알킬 결합, 알켄일 결합, 포스포네이트 에터 결합, 아조 결합, 아민 결합, C=N-C 결합, 락탐 가교, 카밤오일 결합, 요소 결합, 싸이오요소 결합, 싸이오아마이드 결합, 설핀일 결합, 설폰일 결합, 트라이아졸 결합, 벤즈옥사졸 결합 등을 이용할 수 있다. 탄소-탄소 결합은, 스즈키(Suzuki) 반응, 헥(Heck) 반응, 소노가시라(Sonogashira) 반응 등의 전이 금속을 촉매로 한 반응에 의해 형성할 수 있다. 일 태양에 있어서, 본 개시의 펩타이드는, 분자 내에 있어서 상기의 결합을 형성하는 것이 가능한 적어도 1조의 작용기를 포함하고 있다. 환상부의 형성은, 본 개시의 번역계를 이용하여 직쇄상의 펩타이드가 제조된 후에, 상기의 작용기끼리를 결합시키기 위한 반응을 별도 행하는 것에 의해 이루어져도 된다. 환상부를 갖는 펩타이드의 합성에 대해서는, WO2013/100132, WO2012/026566, WO2012/033154, WO2012/074130, WO2015/030014, WO2018/052002, Comb Chem High Throughput Screen (2010)13: 75-87, Nat Chem Biol (2009) 5: 502-507, Nat Chem Biol (2009) 5: 888-90, Bioconjug Chem (2007) 18: 469-476, ChemBioChem (2009) 10: 787-798, Chem Commun (Camb) (2011) 47: 9946-9958 등도 참조할 수 있다.
펩타이드-핵산 복합체를 이용한 펩타이드 라이브러리(디스플레이 라이브러리)로부터 표적 분자에 결합할 수 있는 펩타이드를 동정하는 방법이 알려져 있다. 디스플레이 라이브러리는, 펩타이드와 그것을 코딩하는 핵산이 결합하여 하나의 복합체를 형성하는 것에 의해, 표현형과 유전자형이 대응되어져 있는 것을 특징으로 하는 라이브러리이다. 주된 디스플레이 라이브러리의 예로서, mRNA 디스플레이법(Roberts and Szostak, Proc Natl Acad Sci USA (1997) 94: 12297-12302), in vitro 바이러스법(Nemoto et al., FEBS Lett (1997) 414: 405-408), cDNA 디스플레이법(Yamaguchi et al., Nucleic Acids Res (2009) 37: e108), 리보솜 디스플레이법(Mattheakis et al, Proc Natl Acad Sci USA (1994) 91: 9022-9026), covalent 디스플레이법(Reiersen et al., Nucleic Acids Res (2005) 33: e10), CIS 디스플레이법(Odegrip et al., Proc Natl Acad Sci USA (2004) 101: 2806-2810) 등으로 제작된 라이브러리를 들 수 있다. 혹은, in vitro compartmentalization법(Tawfik and Griffiths, Nat Biotechnol (1998) 16: 652-656)을 이용하여 제작된 라이브러리도, 디스플레이 라이브러리의 일 태양으로서 들 수 있다.
일 국면에 있어서, 본 개시는, 표적 분자에 대해서 결합 활성을 갖는 펩타이드의 동정 방법으로서, 본 개시에 기재된 펩타이드 라이브러리에 표적 분자를 접촉시키는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 표적 분자는 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 저분자 화합물, 고분자 화합물, 핵산, 펩타이드, 단백질, 당, 지질 등 중으로부터 적절히 선택할 수 있다. 표적 분자는 세포 외에 존재하는 분자여도 되고, 세포 내에 존재하는 분자여도 된다. 혹은 세포막에 존재하는 분자여도 되고, 그 경우, 세포외 도메인, 막관통 도메인, 세포내 도메인의 어느 것이 표적이 되어도 된다. 펩타이드 라이브러리와 표적 분자를 접촉시키는 공정에 있어서, 통상, 표적 분자는 어떠한 고상 담체(예를 들어 마이크로타이터 플레이트나 마이크로비즈 등)에 고정된다. 그 후, 표적 분자에 결합하고 있지 않은 펩타이드를 제거하고, 표적 분자에 결합하고 있는 펩타이드만을 회수하는 것에 의해, 표적 분자에 대해서 결합 활성을 갖는 펩타이드를 선택적으로 농축할 수 있다(패닝법). 이용한 펩타이드 라이브러리가 핵산 디스플레이 라이브러리인 경우, 회수된 펩타이드에 그 유전 정보가 코딩된 핵산이 결합하고 있으므로, 그들을 단리하여 해석하는 것에 의해, 회수된 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열 및 아미노산 서열을 용이하게 동정할 수 있다. 더욱이, 얻어진 핵산 서열 혹은 아미노산 서열을 기초로, 화학 합성 혹은 유전자 조작 수법 등에 의해, 동정된 펩타이드를 개별적으로 제조할 수도 있다.
일 국면에 있어서, 본 개시는, tRNA에 의한 코돈의 읽기 오류를 저감하는 방법, tRNA에 의한 코돈의 읽기 오류를 저감하기 위한 조성물 및 키트를 제공한다. 이와 같은 조성물 및 키트는, 본 개시에 있어서의 tRNA를 포함해도 된다. 또한 이 방법은, tRNA를 개변하는 것에 의해 본 개시의 tRNA를 얻는 것을 포함해도 된다. 구체적으로는, 제 1 코돈과 상보적인 안티코돈을 갖는 tRNA의 32, 33, 37 및 38위로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 염기를 치환하는 것을 포함하는, 상기 tRNA에 의한 제 2 코돈의 읽기 오류를 저감하는 방법으로서, 여기에서, 상기 치환 후의 tRNA가 본 개시의 tRNA이고, 상기 제 1 코돈과 상기 제 2 코돈의 1문자째는 동일한 염기이고, 상기 제 1 코돈과 상기 제 2 코돈의 2문자째는 동일한 염기이고, 상기 제 1 코돈과 상기 제 2 코돈의 3문자째는 서로 상이한 염기여도 된다.
몇몇 태양에 있어서, 본 개시의 코돈의 읽기 오류를 저감하는 방법에 있어서는, 상기 제 1 코돈이 M1M2X이고, 제 2 코돈이 M1M2Y이고, 상기 M1 및 상기 M2는 각각 독립적으로 A, C, G 또는 U이고, 상기 X 및 상기 Y는 각각 A, C, G 및 U로부터 선택되는, 서로 상이한 염기여도 된다. 상기 X 및 상기 Y의 염기의 조합이, 이하의 (a1)∼(a8)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 것이어도 된다: (a1) U와 G; (a2) G와 U; (a3) U와 A; (a4) A와 U; (a5) C와 A; (a6) A와 C; (a7) C와 G; 및 (a8) G와 C. 본 개시에 있어서, 상기 X 및 상기 Y의 염기의 조합이 M31과 M32라는 것은, 상기 X가 염기 M31이고, 또한 상기 Y가 염기 M32인 것을 의미한다. 어느 태양에 있어서는, 상기 X 및 상기 Y의 염기의 조합이, 상기 (a1)∼(a3), (a5) 및 (a7)로 이루어지는 군, 또는 상기 (a1) 및 (a2)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 것이어도 된다. 몇몇 태양에 있어서는, 상기 M1M2가, 이하의 (b1)∼(b8)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 염기 서열이어도 된다: (b1) CC; (b2) CU; (b3) GG; (b4) GU; (b5) GC; (b6) UC; (b7) CG; 및 (b8) AC. 어느 태양에 있어서는, 상기 M1M2가, 상기 (b1)∼(b3)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 염기 서열이어도 된다.
몇몇 태양에 있어서, 본 개시의 코돈의 읽기 오류를 저감하는 방법에서는, 상기 제 1 코돈과 상기 tRNA의 안티코돈이, 3염기 모두에 있어서 왓슨-크릭형 염기쌍을 형성해도 되고, 또는, 상기 제 1 코돈의 3문자째의 염기와 상기 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 wobble 염기쌍을 형성해도 된다.
몇몇 태양에 있어서, 본 개시의 코돈의 읽기 오류를 저감하는 방법은, 본 개시의 제 1 tRNA에 의한, 본 개시의 제 2 tRNA의 안티코돈에 상보적인 코돈의 읽기 오류를 저감하는 방법이어도 된다. 몇몇 태양에 있어서, 본 개시의 코돈의 읽기 오류를 저감하는 방법은, 전술한 본 개시의 tRNA의 조제 방법을 포함해도 된다.
실시예
본 발명은, 이하의 실시예에 의해 더 예시되지만, 하기의 실시예로 한정되는 것은 아니다. 한편, 실시예 중에서는 이하의 약호를 사용했다.
AA 아세트산 암모늄
CH2CN 사이아노메틸기
DBU 1,8-다이아자바이사이클로[5.4.0]-7-운데센
DCM 다이클로로메테인
DIC N,N-다이아이소프로필카보다이이미드
DIPEA N,N-다이아이소프로필에틸아민
DMF 다이메틸폼아마이드
DMSO 다이메틸설폭사이드
FA 폼산
Fmoc 9-플루오렌일메틸옥시카보닐기
F-Pnaz 4-(2-(4-플루오로페닐)아세트아마이드)벤질옥시카보닐기:
HFIP 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올
MeCN 아세토나이트릴
NMP N-메틸-2-피롤리돈
TEA 트라이에틸아민
TFA 트라이플루오로아세트산
TFE 2,2,2-트라이플루오로에탄올
THF 테트라하이드로퓨란
또한, 본 실시예에서는, 이하의 약호를 이용했다. Gly 또는 G(글리신), Ile 또는 I(아이소류신), Leu 또는 L(류신), Phe 또는 F(페닐알라닌), Pro 또는 P(프롤린), Thr 또는 T(트레오닌). 이들에 더하여, 본 개시에 있어서, 표 3에 기재된 약호를 이용했다. 본 개시에 있어서의 아미노산 서열에서는, BdpFL-Phe를 「BdpF」라고 표기하는 경우가 있다.
또한, LCMS의 분석 조건을, 하기의 표 4에 나타낸다.
실시예 1. 아미노아실 pCpA의 합성
이하의 스킴에 따라, 아미노아실 pCpA(SS14, SS15, SS16, SS45)를 합성했다.
(S)-1-(((4-(2-(4-플루오로페닐)아세트아마이드)벤질)옥시)카보닐)피페리딘-2-카복실산(화합물 SS17, F-Pnaz-Pic2-OH)의 합성
질소 분위기하, (S)-피페리딘-2-카복실산(42.6mg, 0.33mmol), 특허문헌(WO2018143145A1)에 기재된 방법으로 합성한 탄산-(4-나이트로페닐)-4-(2-(4-플루오로페닐)아세트아마이드)벤질(화합물 ts11)(140mg, 0.44mmol)의 혼합물에 실온에서 DMF(330μL)를 첨가했다. 실온에서 5분 교반한 후, 트라이에틸아민(105.6μL, 2.25mmol)을 0℃에서 첨가했다. 반응 혼합물을 실온에 있어서 30분간 교반한 후, 역상 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(0.1% 폼산 수용액/0.1% 폼산 아세토나이트릴 용액)로 정제하여, (S)-1-(((4-(2-(4-플루오로페닐)아세트아마이드)벤질)옥시)카보닐)피페리딘-2-카복실산(화합물 SS17, F-Pnaz-Pic2-OH)(92mg, 67%)을 얻었다.
LCMS(ESI) m/z = 413 (M-H)-
유지 시간: 0.70분 (분석 조건 SQDFA05＿01)
(S)-피페리딘-1,2-다이카복실산 1-(4-(2-(4-플루오로페닐)아세트아마이드)벤질) 2-(사이아노메틸)(화합물 SS18, F-Pnaz-Pic2-OCH
2
CN)의 합성
질소 분위기하, ((S)-1-(((4-(2-(4-플루오로페닐)아세트아마이드)벤질)옥시)카보닐)피페리딘-2-카복실산(화합물 SS17, F-Pnaz-Pic2-OH)(30mg, 0.072mmol) 및 N-에틸-아이소프로필프로페인-2-아민(DIPEA)(20.23μL, 0.116mmol)을 아세토나이트릴(90μL)에 용해하고, 2-브로모아세토나이트릴(5.34μL, 0.080mmol)을 0℃에 있어서 가하고, 실온에서 2시간 교반했다. 반응액을 농축하여, 조생성물 (S)-피페리딘-1,2-다이카복실산 1-(4-(2-(4-플루오로페닐)아세트아마이드)벤질) 2-(사이아노메틸)(화합물 SS18, F-Pnaz-Pic2-OCH2CN)을 얻었다. 얻어진 조생성물을 아세토나이트릴(2.00mL)에 용해하고, 그대로 다음 공정에 이용했다.
LCMS(ESI) m/z = 452 (M-H)-
유지 시간: 0.79분 (분석 조건 SQDFA05＿01)
(2S)-피페리딘-1,2-다이카복실산 1-(4-(2-(4-플루오로페닐)아세트아마이드)벤질) 2-((2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-아미노-2-옥소피리미딘-1(2H)-일)-4-하이드록시-2-((포스포노옥시)메틸)테트라하이드로퓨란-3-일)옥시)(하이드록시)포스포릴)옥시)메틸)-5-(6-아미노-9H-퓨린-9-일)-4-하이드록시테트라하이드로퓨란-3-일)(화합물 SS14, F-Pnaz-Pic2-pCpA)의 합성
완충액 A(40mL)에, 문헌(Helv. Chim. Acta, 90, 297-310)에 기재된 방법으로 합성한 인산이수소 ((2R,3R,4R,5R)-5-(4-아미노-2-옥소피리미딘-1(2H)-일)-3-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-아미노-9H-퓨린-9-일)-3,4-다이하이드록시테트라하이드로퓨란-2-일)메톡시)(하이드록시)포스포릴)옥시)-4-((테트라하이드로퓨란-2-일)옥시)테트라하이드로퓨란-2-일)메틸(화합물 pc01)(113mg, 0.156mmol)을 용해시키고, (S)-피페리딘-1,2-다이카복실산 1-(4-(2-(4-플루오로페닐)아세트아마이드)벤질) 2-(사이아노메틸)(화합물 SS18, F-Pnaz-Pic2-OCH2CN)(35.4mg, 0.078mmol)의 아세토나이트릴 용액(2.00mL)을 투여하고, 실온에서 150분 교반했다. 반응액을 0℃로 냉각한 후에, 트라이플루오로아세트산(2.00mL)을 가했다. 반응액을 0℃에서 45분 교반한 후에, 반응액을 역상 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(0.05% 트라이플루오로아세트산 수용액/0.05% 트라이플루오로아세트산 아세토나이트릴)로 정제하여, 표제 화합물(화합물 SS14, F-Pnaz-Pic2-pCpA)(6.0mg, 7.3%)을 얻었다.
LCMS(ESI) m/z = 1047.5 (M-H)-
유지 시간: 0.50분 (분석 조건 SQDFA05＿01)
한편, 완충액 A는 이하와 같이 조제했다.
N,N,N-트라이메틸헥사데케인-1-아미늄 염화물(6.40g, 20mmol)과 이미다졸(6.81g, 100mmol)의 수용액에 아세트산을 첨가하여, pH 8, 20mM N,N,N-트라이메틸헥사데케인-1-아미늄, 100mM 이미다졸의 완충액 A(1L)를 얻었다.
O-(2-클로로페닐)-N-(((4-(2-(4-플루오로페닐)아세트아마이드)벤질)옥시)카보닐)-L-세린(화합물 SS19, F-Pnaz-SPh2Cl-OH)의 합성
질소 분위기하, 특허문헌(WO2018225864)에 기재된 방법으로 합성한 O-(2-클로로페닐)-L-세린(화합물 aa63)(1.25g, 5.80mmol), 특허문헌(WO2018143145A1)에 기재된 방법으로 합성한 탄산-(4-나이트로페닐)-4-(2-(4-플루오로페닐)아세트아마이드)벤질(화합물 ts11)(2g, 4.71mmol)의 혼합물에 실온에서 DMSO(15mL), 트라이에틸아민(0.95g, 9.42mmol)을 첨가했다. 반응 혼합물을 실온에 있어서 16시간 교반한 후, 역상 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(0.1% 폼산 수용액/0.1% 폼산 아세토나이트릴 용액)로 정제하여, O-(2-클로로페닐)-N-(((4-(2-(4-플루오로페닐)아세트아마이드)벤질)옥시)카보닐)-L-세린(화합물 SS19, F-Pnaz-SPh2Cl-OH)(1.8g, 73%)을 얻었다.
LCMS(ESI) m/z = 523 (M＋Na)＋
유지 시간: 1.26분 (분석 조건 SMD method1)
사이아노메틸 O-(2-클로로페닐)-N-(((4-(2-(4-플루오로페닐)아세트아마이드)벤질)옥시)카보닐)-L-세리네이트(화합물 SS20, F-Pnaz-SPh2Cl-OCH
2
CN)의 합성
질소 분위기하, O-(2-클로로페닐)-N-(((4-(2-(4-플루오로페닐)아세트아마이드)벤질)옥시)카보닐)-L-세린(화합물 SS19, F-Pnaz-SPh2Cl-OH)(800mg, 1.60mmol) 및 N-에틸-아이소프로필프로페인-2-아민(DIPEA)(0.412g, 3.19mmol)을 DCM(15mL)에 용해하고, 2-브로모아세토나이트릴(760mg, 6.34mmol)을 실온에 있어서 가하고, 실온에서 16시간 교반했다. 반응액을 농축하고, 역상 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(0.1% 폼산 수용액/0.1% 폼산 아세토나이트릴 용액)로 정제하여, 사이아노메틸 O-(2-클로로페닐)-N-(((4-(2-(4-플루오로페닐)아세트아마이드)벤질)옥시)카보닐)-L-세리네이트(화합물 SS20, F-Pnaz-SPh2Cl-OCH2CN)(220mg, 26%)를 얻었다. 얻어진 생성물을 아세토나이트릴(5mL)에 용해하여, 다음 공정에 이용했다.
LCMS(ESI) m/z = 562 (M＋Na)＋
유지 시간: 1.15분 (분석 조건 SMD method2)
(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-아미노-2-옥소피리미딘-1(2H)-일)-4-하이드록시-2-((포스포노옥시)메틸)테트라하이드로퓨란-3-일)옥시)(하이드록시)포스포릴)옥시)메틸)-5-(6-아미노-9H-퓨린-9-일)-4-하이드록시테트라하이드로퓨란-3-일 O-(2-클로로페닐)-N-(((4-(2-(4-플루오로페닐)아세트아마이드)벤질)옥시)카보닐)-L-세리네이트(화합물 SS15, F-Pnaz-SPh2Cl-pCpA)의 합성
완충액 A(100mL)에, 인산이수소 ((2R,3R,4R,5R)-5-(4-아미노-2-옥소피리미딘-1(2H)-일)-3-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-아미노-9H-퓨린-9-일)-3,4-다이하이드록시테트라하이드로퓨란-2-일)메톡시)(하이드록시)포스포릴)옥시)-4-((테트라하이드로퓨란-2-일)옥시)테트라하이드로퓨란-2-일)메틸(화합물 pc01)(400mg, 0.55mmol)을 용해시키고, 사이아노메틸 O-(2-클로로페닐)-N-(((4-(2-(4-플루오로페닐)아세트아마이드)벤질)옥시)카보닐)-L-세리네이트(화합물 SS20, F-Pnaz-SPh2Cl-OCH2CN)(220mg, 0.41mmol)의 아세토나이트릴 용액(5mL)을 시린지 펌프를 사용하여 15분 이상에 걸쳐 적하하고, 실온에서 5분 교반했다. 계속해서, 반응액에 트라이플루오로아세트산(2.3mL)을 가했다. 반응액을 동결건조한 후에, 역상 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(0.05% 트라이플루오로아세트산 수용액/0.05% 트라이플루오로아세트산 아세토나이트릴)로 정제하여, 표제 화합물(화합물 SS15, F-Pnaz-SPh2Cl-pCpA)(20.7mg, 2%)을 얻었다.
LCMS(ESI) m/z = 1133.4 (M-H)-
유지 시간: 0.55분 (분석 조건 SQDFA05＿01)
((S)-2-(메틸아미노)-4-페닐뷰탄산(화합물 SS21, MeHph-OH)의 합성
특허문헌(WO2018225864)에 기재된 방법으로 합성한 (S)-2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)(메틸)아미노)-4-페닐뷰탄산(화합물 aa11)(150mg, 0.361mmol)에 실온에서 DCM(903μL), 물(903μL) 및 피페리딘(178μL, 1.805mmol)을 실온에서 첨가했다. 반응 혼합물을 실온에 있어서 30분간 교반한 후, 역상 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(0.1% 폼산 수용액/0.1% 폼산 아세토나이트릴 용액)로 정제하여, ((S)-2-(메틸아미노)-4-페닐뷰탄산(화합물 SS21, MeHph-OH)(55mg, 79%)을 얻었다.
LCMS(ESI) m/z = 192 (M-H)-
유지 시간: 0.15분 (분석 조건 SQDFA05＿02)
(S)-2-((((4-(2-(4-플루오로페닐)아세트아마이드)벤질)옥시)카보닐)(메틸)아미노)-4-페닐뷰탄산(화합물 SS22, F-Pnaz-MeHph-OH)의 합성
질소 분위기하, ((S)-2-(메틸아미노)-4-페닐뷰탄산(화합물 SS21, MeHph-OH)(35.1mg, 0.182mmol), 특허문헌(WO2018143145A1)에 기재된 방법으로 합성한 탄산-(4-나이트로페닐)-4-(2-(4-플루오로페닐)아세트아마이드)벤질(화합물 ts11)(85mg, 0.20mmol)의 혼합물에 실온에서 DMSO(727μL)를 첨가했다. 트라이에틸아민(76μL, 0.545mmol)을 50℃에서 첨가했다. 반응 혼합물을 40℃에 있어서 16시간 교반한 후, 역상 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(0.1% 폼산 수용액/0.1% 폼산 아세토나이트릴 용액)로 정제하여, (S)-2-((((4-(2-(4-플루오로페닐)아세트아마이드)벤질)옥시)카보닐)(메틸)아미노)-4-페닐뷰탄산(화합물 SS22, F-Pnaz-MeHph-OH)(80mg, 92%)을 얻었다.
LCMS(ESI) m/z = 477 (M-H)-
유지 시간: 0.85분 (분석 조건 SQDFA05＿02)
(S)-2-((((4-(2-(4-플루오로페닐)아세트아마이드)벤질)옥시)카보닐)(메틸)아미노)-4-페닐뷰탄산 사이아노메틸(화합물 SS23, F-Pnaz-MeHph-OCH
2
CN)의 합성
질소 분위기하, (S)-2-((((4-(2-(4-플루오로페닐)아세트아마이드)벤질)옥시)카보닐)(메틸)아미노)-4-페닐뷰탄산(화합물 SS22, F-Pnaz-MeHph-OH)(77mg, 0.16mmol) 및 N-에틸-아이소프로필프로페인-2-아민(DIPEA)(31μL, 0.176mmol)의 혼합물에 아세토나이트릴(533μL)을 실온에서 가했다. 그 후, 2-브로모아세토나이트릴(86μL, 1.280mmol)을 실온에 있어서 가하고, 반응 혼합물을 40℃에 있어서 1시간 교반했다. 반응액을 농축하여, 조생성물 (S)-2-((((4-(2-(4-플루오로페닐)아세트아마이드)벤질)옥시)카보닐)(메틸)아미노)-4-페닐뷰탄산 사이아노메틸(화합물 SS23, F-Pnaz-MeHph-OCH2CN)을 얻었다. 얻어진 조생성물을 아세토나이트릴(5.00mL)에 용해하고, 그대로 다음 공정에 이용했다.
LCMS(ESI) m/z = 516 (M-H)-
유지 시간: 0.92분 (분석 조건 SQDFA05＿02)
(2S)-2-((((4-(2-(4-플루오로페닐)아세트아마이드)벤질)옥시)카보닐)(메틸)아미노)-4-페닐뷰탄산 (2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-아미노-2-옥소피리미딘-1(2H)-일)-4-하이드록시-2-((포스포노옥시)메틸)테트라하이드로퓨란-3-일)옥시)(하이드록시)포스포릴)옥시)메틸)-5-(6-아미노-9H-퓨린-9-일)-4-하이드록시테트라하이드로퓨란-3-일(화합물 SS16, F-Pnaz-MeHph-pCpA)의 합성
완충액 A(100mL)에, 인산이수소 ((2R,3R,4R,5R)-5-(4-아미노-2-옥소피리미딘-1(2H)-일)-3-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-아미노-9H-퓨린-9-일)-3,4-다이하이드록시테트라하이드로퓨란-2-일)메톡시)(하이드록시)포스포릴)옥시)-4-((테트라하이드로퓨란-2-일)옥시)테트라하이드로퓨란-2-일)메틸(화합물 pc01)(127mg, 0.176mmol)을 용해시키고, (S)-2-((((4-(2-(4-플루오로페닐)아세트아마이드)벤질)옥시)카보닐)(메틸)아미노)-4-페닐뷰탄산 사이아노메틸(화합물 SS23, F-Pnaz-MeHph-OCH2CN)(83mg, 0.16mmol)의 아세토나이트릴 용액(5.00mL)을 투여하고, 실온에서 1시간 교반했다. 반응액을 0℃로 냉각한 후에, 트라이플루오로아세트산(5.00mL)을 가했다. 반응액을 0℃에서 1시간 교반한 후에, 반응액을 역상 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(0.05% 트라이플루오로아세트산 수용액/0.05% 트라이플루오로아세트산 아세토나이트릴)로 정제하고, 그 후 추가로 역상 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(0.1% 폼산 수용액/0.1% 폼산 아세토나이트릴 용액)로 정제하여, 표제 화합물(화합물 SS16, F-Pnaz-MeHph-pCpA)(26mg, 14.6%)을 얻었다.
LCMS(ESI) m/z = 1111.5 (M-H)-
유지 시간: 0.64분 (분석 조건 SQDFA05＿02)
N-(((4-(2-(4-플루오로페닐)아세트아마이드)벤질)옥시)카보닐)-N-메틸 글리신(화합물 SS46, F-Pnaz-MeG-OH)의 합성
질소 분위기하, 사르코신(483mg, 5.42mmol), 특허문헌(WO2018143145A1)에 기재된 방법으로 합성한 탄산-(4-나이트로페닐)-4-(2-(4-플루오로페닐)아세트아마이드)벤질(화합물 ts11)(2.0g, 4.71mmol)의 혼합물에 실온에서 DMSO(15mL), 트라이 에틸아민(953.4mg, 9.42mmol)을 첨가했다. 반응 혼합물을 실온에 있어서 16시간 교반한 후, 역상 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(0.1% 폼산 수용액/0.1% 폼산 아세토나이트릴 용액)로 정제하여, N-(((4-(2-(4-플루오로페닐)아세트아마이드)벤질)옥시)카보닐)-N-메틸 글리신(화합물 SS46, F-Pnaz-MeG-OH)(1.4g, 79%)을 얻었다.
LCMS(ESI) m/z = 397 (M＋Na)＋
유지 시간: 0.88분 (분석 조건 SMD method3)
사이아노메틸 N-(((4-(2-(4-플루오로페닐)아세트아마이드)벤질)옥시)카보닐)-N-메틸글리시네이트(화합물 SS47, F-Pnaz-MeG-OCH
2
CN)의 합성
질소 분위기하, N-(((4-(2-(4-플루오로페닐)아세트아마이드)벤질)옥시)카보닐)-N-메틸글리신(화합물 SS46, F-Pnaz-MeG-OH)(1.38g, 3.69mmol) 및 N-에틸-아이소프로필프로페인-2-아민(DIPEA)(0.95g, 7.38mmol)을 DMF(28mL)에 용해하고, 2-브로모아세토나이트릴(1.74g, 14.75mmol)를 실온에 있어서 가하고, 실온에서 16시간 교반했다. 반응액을 농축하고, 순상 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(아세트산 에틸/석유 에터)로 정제하여, 사이아노메틸 N-(((4-(2-(4-플루오로페닐)아세트아마이드)벤질)옥시)카보닐)-N-메틸글리시네이트(화합물 SS47, F-Pnaz-MeG-OCH2CN)(1.2g, 79%)를 얻었다.
LCMS(ESI) m/z = 436 (M＋Na)＋
유지 시간: 0.70분 (분석 조건 SMD method4)
(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-아미노-2-옥소피리미딘-1(2H)-일)-4-하이드록시-2-((포스포노옥시)메틸)테트라하이드로퓨란-3-일)옥시)(하이드록시)포스포릴)옥시)메틸)-5-(6-아미노-9H-퓨린-9-일)-4-하이드록시테트라하이드로퓨란-3-일 N-(((4-(2-(4-플루오로페닐)아세트아마이드)벤질)옥시)카보닐)-N-메틸글리시네이트(화합물 SS45, F-Pnaz-MeG-pCpA)의 합성
완충액 A(100mL)에, 문헌(Helv. Chim. Acta, 90, 297-310)에 기재된 방법으로 합성한 인산이수소 ((2R,3R,4R,5R)-5-(4-아미노-2-옥소피리미딘-1(2H)-일)-3-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-아미노-9H-퓨린-9-일)-3,4-다이하이드록시테트라하이드로퓨란-2-일)메톡시)(하이드록시)포스포릴)옥시)-4-((테트라하이드로퓨란-2-일)옥시)테트라하이드로퓨란-2-일)메틸(화합물 pc01)(422mg, 0.58mmol)을 용해시키고, 사이아노메틸 N-(((4-(2-(4-플루오로페닐)아세트아마이드)벤질)옥시)카보닐)-N-메틸글리시네이트(화합물 SS47, F-Pnaz-MeG-OCH2CN)(120.7mg, 0.29mmol)의 아세토나이트릴 용액(5mL)을 시린지 펌프를 이용하여 15분 이상에 걸쳐 적하하고, 실온에서 5시간 교반했다. 반응액에 트라이플루오로아세트산(2.3mL)을 가하고, 반응액을 동결건조한 후에, 역상 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(0.05% 트라이플루오로아세트산 수용액/0.05% 트라이플루오로아세트산 아세토나이트릴)로 정제하여, 표제 화합물(화합물 SS45, F-Pnaz-MeG-pCpA)(76.7mg, 26%)을 얻었다.
LCMS(ESI) m/z = 1007.5 (M-H)-
유지 시간: 0.48분 (분석 조건 SQDFA05＿02)
실시예 2. BdpFL-Phe-pCpA(MT01)의 합성
(3-(5,5-다이플루오로-7,9-다이메틸-5H-4λ4,5λ4-다이피롤로［1,2-c:2',1'-f］［1,3,2］다이아자보리닌-3-일)프로판오일)-L-페닐알라닌(화합물 MT02, BdpFL-Phe-OH)의 합성
질소 분위기하, 3-(2-카복시에틸)-5,5-다이플루오로-7,9-다이메틸-5H-5λ4-다이피롤로［1,2-c:2',1'-f］［1,3,2］다이아자보리닌-4-윰(200mg, 0.685mmol)과 1-하이드록시피롤리딘-2,5-다이온(87mg, 0.753mmol)의 NMP(4.5ml) 용액에 DIC(0.128ml, 0.822mmol)를 실온에서 가한 후, 40℃에서 철야 교반했다. 실온으로 되돌린 후, 반응액에 L-페닐알라닌(113mg,0.685mmol)과 TEA(0.191ml, 1.369mmol)를 가하고, 40℃에서 철야 교반했다. 반응액을 역상 컬럼 크로마토그래피(0.1% FA MeCN/H2O)로 정제하여, (3-(5,5-다이플루오로-7,9-다이메틸-5H-4λ4,5λ4-다이피롤로［1,2-c:2',1'-f］［1,3,2］다이아자보리닌-3-일)프로판오일)-L-페닐알라닌(화합물 MT02, BdpFL-Phe-OH)(102mg, 34% 수율)을 얻었다.
LCMS(ESI) m/z = 438.3 (M-H)-
유지 시간: 0.78분 (분석 조건 SQDFA05＿02)
(3-(5,5-다이플루오로-7,9-다이메틸-5H-4λ4,5λ4-다이피롤로［1,2-c:2',1'-f］［1,3,2］다이아자보리닌-3-일)프로판오일)-L-페닐알라닌 사이아노메틸 에스터(화합물 MT03, BdpFL-Phe-OCH
2
CN)의 합성
질소 분위기하, (3-(5,5-다이플루오로-7,9-다이메틸-5H-4λ4,5λ4-다이피롤로［1,2-c:2',1'-f］［1,3,2］다이아자보리닌-3-일)프로판오일)-L-페닐알라닌(50mg, 0.114mmol) 및 N-에틸-아이소프로필프로페인-2-아민(DIPEA)(31.0μL, 0.177mmol)을 아세토나이트릴(500μL)에 용해하고, 2-브로모아세토나이트릴(12μL, 0.177mmol)을 0℃에서 가한 후, 40℃에서 3시간 교반했다. 반응액을 농축하여, (3-(5,5-다이플루오로-7,9-다이메틸-5H-4λ4,5λ4-다이피롤로［1,2-c:2',1'-f］［1,3,2］다이아자보리닌-3-일)프로판오일)-L-페닐알라닌 사이아노메틸 에스터(화합물 MT03, BdpFL-Phe-OCH2CN)를 조생성물로서 얻었다. 얻어진 조생성물은, 그대로 다음 공정에 이용했다.
LCMS(ESI) m/z = 477.3 (M-H)-
유지 시간: 0.86분 (분석 조건 SQDFA05＿01)
3-(3-(((2S)-1-(((2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-아미노-2-옥소피리미딘-1(2H)-일)-4-하이드록시-2-((포스포노옥시)메틸)테트라하이드로퓨란-3-일)옥시)(하이드록시)포스포릴)옥시)메틸)-5-(6-아미노-9H-퓨린-9-일)-4-하이드록시테트라하이드로퓨란-3-일)옥시)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-3-옥소프로필)-5,5-다이플루오로-7,9-다이메틸-5H-5λ4-다이피롤로［1,2-c:2',1'-f］［1,3,2］다이아자보리닌-4-윰(화합물 MT01, BdpFL-Phe-pCpA)의 합성
완충액 A(11.3mL)에, 인산이수소 ((2R,3R,4R,5R)-5-(4-아미노-2-옥소피리미딘-1(2H)-일)-3-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-아미노-9H-퓨린-9-일)-3,4-다이하이드록시테트라하이드로퓨란-2-일)메톡시)(하이드록시)포스포릴)옥시)-4-((테트라하이드로퓨란-2-일)옥시)테트라하이드로퓨란-2-일)메틸(화합물 pc01)(33.2mg, 0.046mmol)을 용해시키고, (3-(5,5-다이플루오로-7,9-다이메틸-5H-4λ4,5λ4-다이피롤로［1,2-c:2',1'-f］［1,3,2］다이아자보리닌-3-일)프로판오일)-L-페닐알라닌 사이아노메틸 에스터(화합물 MT03, BdpFL-Phe-OCH2CN)(11mg, 0.023mmol)의 아세토나이트릴 용액(0.13mL)을 가한 후, 실온에서 45분 교반했다. 반응액에 0℃에서 TFA(0.56mL)를 가하고, 5분 교반한 후, 실온에서 10분 교반했다. 반응액을 역상 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(0.05% TFAMeCN/H2O)로 정제하여, 표제 화합물(화합물 MT01, BdpFL-Phe-pCpA)(2.1mg, 8.5% 수율)을 얻었다.
LCMS(ESI) m/z = 1072.5 (M-H)-
유지 시간: 0.56분 (분석 조건 SQDFA05＿02)
ligation법에 의해 tRNA 단편의 3＇ 말단에 Lysidine 유닛을 도입하기 위한 Lysidine-diphosphate의 합성
tRNA 단편의 3＇ 말단에 Lysidine 유닛을 ligation법에 의해 도입하기 위해서 이용하는 Lysidine의 diphosphate의 합성법을 개량했다. 즉, 이하의 스킴에 따라, Lysidine-diphosphate(SS04, pLp)를 합성했다.
((3aR,4R,12R,12aR)-2,2-다이메틸-3a,4,12,12a-테트라하이드로-5H, 8H-4,12-에폭시[1,3]다이옥솔로[4,5-e]피리미도[2,1-b][1,3]옥사조신-8-일리덴)카밤산 벤질(화합물 SS24)의 합성
질소 분위기하, 문헌(Antiviral Chemistry & Chemotherapy, 2003, 14(4), 183-194) 기지 화합물 2＇,3＇-O-아이소프로필리덴-4-N-(벤질-옥시-카보닐)-사이티딘(718.2mg, 1.72mmol) 및 트라이페닐포스핀(474mg, 1.81mmol)의 혼합물에 실온에서 DCM(17.2mL)을 첨가했다. 혼합물을 빙욕으로 냉각 후, 아조다이카복실산 다이아이소프로필(385μL, 1.98mmol)을 가하고 실온으로 승온 후 실온에서 1.5시간 교반했다. 반응액을 농축하고, 톨루엔(20mL)을 가한 후, 생긴 침전물을 여과에 의해 회수했다. 톨루엔을 이용하여 얻어진 고체를 3회 세정하여, ((3aR,4R,12R,12aR)-2,2-다이메틸-3a,4,12,12a-테트라하이드로-5H,8H-4,12-에폭시[1,3]다이옥솔로[4,5-e]피리미도[2,1-b][1,3]옥사조신-8-일리덴)카밤산 벤질(화합물 SS24)(525.7mg, 76%)을 얻었다.
LCMS(ESI) m/z = 400.3 (M＋H)＋
유지 시간: 0.48분 (분석 조건 SQDFA05＿02)
벤질 (2S)-6-[[1-[(3aR,4R,6R,6aR)-6-(하이드록시메틸)-2,2-다이메틸-3a,4,6,6a-테트라하이드로퓨로[3,4-d][1,3]다이옥솔-4-일]-4-(벤질옥시카보닐아미노)피리미딘-2-일리덴]아미노]-2-(벤질옥시카보닐아미노)헥사노에이트; 2,2,2-트라이플루오로아세트산(화합물 SS25)의 합성
질소 분위기하, ((3aR,4R,12R,12aR)-2,2-다이메틸-3a,4,12,12a-테트라하이드로-5H,8H-4,12-에폭시[1,3]다이옥솔로[4,5-e]피리미도[2,1-b][1,3]옥사조신-8-일리덴)카밤산 벤질(화합물 SS24)(300mg, 0.75mmol) 및 염화 리튬(159mg, 3.76mmol)의 혼합물에 실온에서 THF(7.5mL)를 첨가하고 빙욕으로 냉각했다. 그 혼합물에, 벤질 ((벤질옥시)카보닐)-L-리시네이트 벤젠설포네이트(813mg, 2.01mmol) 및 DBU(673μL, 4.51mmol)의 혼합물에 THF(7.5mL)를 가한 것을 빙욕하에서 첨가하고, 반응 혼합물을 0℃에서 30분간 교반했다. 반응액에 빙욕하에서 DMSO를 가하고 실온으로 승온 후 반응액을 농축하고 THF를 증류제거했다. 잔사를 역상 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(0.05% TFA 수용액/0.05% TFA 아세토나이트릴 용액)로 정제하여, 벤질 (2S)-6-[[1-[(3aR,4R,6R,6aR)-6-(하이드록시메틸)-2,2-다이메틸-3a,4,6,6a-테트라하이드로퓨로[3,4-d][1,3]다이옥솔-4-일]-4-(벤질옥시카보닐아미노)피리미딘-2-일리덴]아미노]-2-(벤질옥시카보닐아미노)헥사노에이트; 2,2,2-트라이플루오로아세트산(화합물 SS25)(726.6mg)을 정량적으로 얻었다.
LCMS(ESI) m/z = 768.6 (M-H)-
유지 시간: 0.74분 (분석 조건 SQDFA05＿02)
벤질 (2S)-2-(벤질옥시카보닐아미노)-6-[[4-(벤질옥시카보닐아미노)-1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-다이하이드록시-5-(하이드록시메틸)테트라하이드로퓨란-2-일]피리미딘-2-일리덴]아미노]헥사노에이트; 2,2,2-트라이플루오로아세트산(화합물 SS26)의 합성
벤질 (2S)-6-[[1-[(3aR,4R,6R,6aR)-6-(하이드록시메틸)-2,2-다이메틸-3a,4,6,6a-테트라하이드로퓨로[3,4-d][1,3]다이옥솔-4-일]-4-(벤질옥시카보닐아미노)피리미딘-2-일리덴]아미노]-2-(벤질옥시카보닐아미노)헥사노에이트; 2,2,2-트라이플루오로아세트산(화합물 SS25)(281.1mg, 0.318mmol)을 TFA(4.24mL)와 초순수(2.12mL)의 혼합 용매에 빙욕으로 냉각하면서 용해하고, 혼합물을 실온에서 50분간 교반했다. 톨루엔 및 아세토나이트릴을 가하고 반응액을 농축했다. 이 조작을 수회 반복하고 물 및 TFA를 증류제거하여, 조생성물 벤질 (2S)-2-(벤질옥시카보닐아미노)-6-[[4-(벤질옥시카보닐아미노)-1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-다이하이드록시-5-(하이드록시메틸)테트라하이드로퓨란-2-일]피리미딘-2-일리덴]아미노]헥사노에이트; 2,2,2-트라이플루오로아세트산(화합물 SS26)(272.6mg)을 얻었다. 얻어진 조생성물 벤질 (2S)-2-(벤질옥시카보닐아미노)-6-[[4-(벤질옥시카보닐아미노)-1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-다이하이드록시-5-(하이드록시메틸)테트라하이드로퓨란-2-일]피리미딘-2-일리덴]아미노]헥사노에이트; 2,2,2-트라이플루오로아세트산(화합물 SS26)을 그대로 다음 공정에 이용했다.
LCMS(ESI) m/z = 728.5 (M-H)-
유지 시간: 0.69분 (분석 조건 SQDFA05＿02)
벤질 (2S)-6-[[1-[(4aR,6R,7R,7aS)-2,2-다이터트-뷰틸-7-하이드록시-4a,6,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,2-d][1,3,2]다이옥사실린-6-일]-4-(벤질옥시카보닐아미노)피리미딘-2-일리덴]아미노]-2-(벤질옥시카보닐아미노)헥사노에이트; 2,2,2-트라이플루오로아세트산(화합물 SS27)의 합성
질소 분위기하, 전(前) 공정에서 얻어진 조생성물 벤질 (2S)-2-(벤질옥시카보닐아미노)-6-[[4-(벤질옥시카보닐아미노)-1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-다이하이드록시-5-(하이드록시메틸)테트라하이드로퓨란-2-일]피리미딘-2-일리덴]아미노]헥사노에이트; 2,2,2-트라이플루오로아세트산(화합물 SS26)(258mg, 0.306mmol)을 DMF(3.06mL)에 용해하고, 혼합물을 빙욕으로 냉각 후 비스(트라이플루오로메테인설폰산)다이-tert-뷰틸실릴(396μl, 1.22mmol)을 가하고 빙욕하에서 2시간 교반했다. 반응액에 빙욕하에서 포화 탄산수소나트륨 수용액을 가하고, 얻어진 혼합물을 역상 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(0.05% TFA 수용액/0.05% TFA 아세토나이트릴 용액)로 정제하여, 벤질 (2S)-6-[[1-[(4aR,6R,7R,7aS)-2,2-다이터트-뷰틸-7-하이드록시-4a,6,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,2-d][1,3,2]다이옥사실린-6-일]-4-(벤질옥시카보닐아미노)피리미딘-2-일리덴]아미노]-2-(벤질옥시카보닐아미노)헥사노에이트; 2,2,2-트라이플루오로아세트산(화합물 SS27)(234.0mg, 78%, 2 steps)을 얻었다.
LCMS(ESI) m/z = 868.8 (M-H)-
유지 시간: 0.88분 (분석 조건 SQDFA05＿02)
벤질 (2S)-6-[[1-[(4aR,6R,7R,7aR)-2,2-다이터트-뷰틸-7-테트라하이드로피란-2-일옥시-4a,6,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,2-d][1,3,2]다이옥사실린-6-일]-4-(벤질옥시카보닐아미노)피리미딘-2-일리덴]아미노]-2-(벤질옥시카보닐아미노)헥사노에이트; 2,2,2-트라이플루오로아세트산(화합물 SS28)의 합성
질소 분위기하, 벤질 (2S)-6-[[1-[(4aR,6R,7R,7aS)-2,2-다이터트-뷰틸-7-하이드록시-4a,6,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,2-d][1,3,2]다이옥사실린-6-일]-4-(벤질옥시카보닐아미노)피리미딘-2-일리덴]아미노]-2-(벤질옥시카보닐아미노)헥사노에이트; 2,2,2-트라이플루오로아세트산(화합물 SS27)(30mg, 0.03mmol) 및 TFA(6.98μL, 0.09mmol)를 DCM(610μL)에 실온에서 용해하고, 3,4-다이하이드로-2H-피란(83μL, 0.915mmol)을 가했다. 반응 혼합물을 실온에서 13시간 교반 후, 톨루엔을 가하고 반응액을 농축하여, 조생성물 벤질 (2S)-6-[[1-[(4aR,6R,7R,7aR)-2,2-다이터트-뷰틸-7-테트라하이드로피란-2-일옥시-4a,6,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,2-d][1,3,2]다이옥사실린-6-일]-4-(벤질옥시카보닐아미노)피리미딘-2-일리덴]아미노]-2-(벤질옥시카보닐아미노)헥사노에이트; 2,2,2-트라이플루오로아세트산(화합물 SS28)을 THP 보호 상의 비대칭 탄소에서 유래하는 다이아스테레오머 혼합물로서 얻었다. 얻어진 조생성물 벤질 (2S)-6-[[1-[(4aR,6R,7R,7aR)-2,2-다이터트-뷰틸-7-테트라하이드로피란-2-일옥시-4a,6,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,2-d][1,3,2]다이옥사실린-6-일]-4-(벤질옥시카보닐아미노)피리미딘-2-일리덴]아미노]-2-(벤질옥시카보닐아미노)헥사노에이트; 2,2,2-트라이플루오로아세트산(화합물 SS28)을 그대로 다음 공정에 이용했다.
LCMS(ESI) m/z = 952.8 (M-H)-
유지 시간: 3.17분 , 3.38분 (분석 조건 SQDAA50long)
(2S)-2-(벤질옥시카보닐아미노)-6-[[4-(벤질옥시카보닐아미노)-1-[(2R,3R,4R,5R)-4-하이드록시-5-(하이드록시메틸)-3-테트라하이드로피란-2-일옥시-테트라하이드로퓨란-2-일]피리미딘-2-일리덴]아미노]헥산산 벤질(화합물 SS29)의 합성
질소 분위기하, 전 공정에서 얻어진 조생성물 벤질 (2S)-6-[[1-[(4aR,6R,7R,7aR)-2,2-다이터트-뷰틸-7-테트라하이드로피란-2-일옥시-4a,6,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,2-d][1,3,2]다이옥사실린-6-일]-4-(벤질옥시카보닐아미노)피리미딘-2-일리덴]아미노]-2-(벤질옥시카보닐아미노)헥사노에이트; 2,2,2-트라이플루오로아세트산(화합물 SS28)을 THF(610μL)에 실온에서 용해하고, 테트라뷰틸암모늄 플루오라이드(∼1mol/L 테트라하이드로퓨란 용액)(305μL, ∼0.305mmol)를 실온에서 가하고, 반응 혼합물을 실온에서 30분간 교반했다. 반응액에 DMSO를 가하고 농축하고 THF를 증류제거했다. 잔사를 역상 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(10mM AA 수용액/10mM AA 아세토나이트릴 용액)로 정제하여, (2S)-2-(벤질옥시카보닐아미노)-6-[[4-(벤질옥시카보닐아미노)-1-[(2R,3R,4R,5R)-4-하이드록시-5-(하이드록시메틸)-3-테트라하이드로피란-2-일옥시-테트라하이드로퓨란-2-일]피리미딘-2-일리덴]아미노]헥산산 벤질(화합물 SS29)(21.51mg, 87%, 2 steps)를 THP 보호 상의 비대칭 탄소에서 유래하는 다이아스테레오머 혼합물로서 얻었다.
LCMS(ESI) m/z = 812.7 (M-H)-
유지 시간: 1.74분 (분석 조건 SQDAA50long)
(2S)-2-(벤질옥시카보닐아미노)-6-[[4-(벤질옥시카보닐아미노)-1-[(2R,3R,4R,5R)-4-다이벤질옥시포스포릴옥시-5-(다이벤질옥시포스포릴옥시메틸)-3-테트라하이드로피란-2-일옥시-테트라하이드로퓨란-2-일]피리미딘-2-일리덴]아미노]헥산산 벤질(화합물 SS30)의 합성
질소 분위기하, (2S)-2-(벤질옥시카보닐아미노)-6-[[4-(벤질옥시카보닐아미노)-1-[(2R,3R,4R,5R)-4-하이드록시-5-(하이드록시메틸)-3-테트라하이드로피란-2-일옥시-테트라하이드로퓨란-2-일]피리미딘-2-일리덴]아미노]헥산산 벤질(화합물 SS29)(21.51mg, 0.026mmol) 및 1H-테트라졸(22.22mg, 0.317mmol)을 아세토나이트릴(1.06mL)에 실온에서 용해하고, 다이벤질 N,N-다이아이소프로필포스포로아미다이트(53.2μl, 0.159mmol)를 가하고 실온에서 1시간 교반했다. 데스마틴 퍼아이오디네인(135mg, 0.317mmol)을 가하고 실온에서 15분간 교반한 후에, 반응액을 역상 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(10 mM AA 수용액/10mM AA 아세토나이트릴 용액)로 정제하여, (2S)-2-(벤질옥시카보닐아미노)-6-[[4-(벤질옥시카보닐아미노)-1-[(2R,3R,4R,5R)-4-다이벤질옥시포스포릴옥시-5-(다이벤질옥시포스포릴옥시메틸)-3-테트라하이드로피란-2-일옥시-테트라하이드로퓨란-2-일]피리미딘-2-일리덴]아미노]헥산산 벤질(화합물 SS30)(36.59mg, 2 steps)을 THP 보호 상의 비대칭 탄소에서 유래하는 다이아스테레오머 혼합물로서 정량적으로 얻었다.
LCMS(ESI) m/z = 1332.8 (M-H)-
유지 시간: 3.08분 , 3.11분 (분석 조건 SQDAA50long)
(2S)-2-아미노-6-[[4-아미노-1-[(2R,3R,4S,5R)-3-하이드록시-4-포스포노옥시-5-(포스포노옥시메틸)테트라하이드로퓨란-2-일]피리미딘-2-일리덴]아미노]헥산산(화합물 SS04, pLp)의 합성
(2S)-2-(벤질옥시카보닐아미노)-6-[[4-(벤질옥시카보닐아미노)-1-[(2R,3R,4R,5R)-4-다이벤질옥시포스포릴옥시-5-(다이벤질옥시포스포릴옥시메틸)-3-테트라하이드로피란-2-일옥시-테트라하이드로퓨란-2-일]피리미딘-2-일리덴]아미노]헥산산 벤질(화합물 SS30)(36.59mg, 0.027mmol)을 메탄올(649μL)과 초순수(152μL)의 혼합 용매에 실온에서 용해하고, 질소 분위기하에서 팔라듐/탄소(Pd 10%)(5.84mg, 5.48μmol)를 가했다. 수소 분위기하, 실온에서 18시간 교반했다. 반응액을 셀라이트 여과하고, 초순수를 이용하여 수회 세정했다. 얻어진 여과액(24.66mL)에 1mol/L 염산(2.74mL, 2.74mmol)을 가하고, 실온에서 1시간 정치했다. 반응액을 셀라이트 여과하고, 초순수를 이용하여 수회 세정했다. 여과액을 동결건조한 후 얻어진 분체를 재차 초순수(1.52mL)를 이용하여 용해하고, 원심분리를 행하고 상청을 회수함으로써 (2S)-2-아미노-6-[[4-아미노-1-[(2R,3R,4S,5R)-3-하이드록시-4-포스포노옥시-5-(포스포노옥시메틸)테트라하이드로퓨란-2-일]피리미딘-2-일리덴]아미노]헥산산(화합물 SS04, pLp)의 수용액(1.37mL, 17.47mM, 87%, 2steps)을 얻었다.
LCMS(ESI) m/z = 530.1 (M-H)-
유지 시간: 1.60분 (분석 조건 LTQTEA/HFIP05＿02)
실시예 3
실시예 3-1. N말단에 BdpFL를 가지는 펩타이드(LCT-67)의 합성
Fmoc-Gly-OH를 담지시킨 2-클로로트라이틸 레진(100mg)을 이용하고, Fmoc 아미노산으로서 Fmoc-Gly-OH, 특허문헌(WO2018225864)에 기재된 방법으로 합성한 Fmoc-Thr(THP)-OH(aa01), Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-MePhe-OH, Fmoc-Pro-OH를 이용하여 펩타이드 합성기로 펩타이드의 신장을 행했다(아미노산의 약호에 대해서는 본 명세서 중에 별도 기재). Fmoc법에 의한 펩타이드 합성법에 따라, 펩타이드의 신장을 행했다(WO2013100132B2). 펩타이드의 신장 후, N말단의 Fmoc기의 제거를 펩타이드 합성기 상에서 행한 후, 레진을 DCM으로 세정했다.
레진에 TFE/DCM(1:1, v/v, 2mL)을 가하고 1시간 진탕하여, 펩타이드의 레진으로부터의 절출을 행했다. 반응 종료 후, 튜브 내의 용액을 합성용 컬럼으로 여과하는 것에 의해 레진을 제거하고, 레진을 TFE/DCM(1:1, v/v, 1mL)으로 2회 세정했다. 모든 추출액을 혼합하고, DMF(2mL)를 가한 후, 감압하 농축했다. 얻어진 잔사를 NMP(1mL)에 용해하고, 4, 4-다이플루오로-5,7-다이메틸-4-보라-3a,4a-다이아자-s-인다센-3-프로피온산 N-석신이미딜 에스터(5mg, 0.013mmol)를 실온에서 가하고, 19시간 교반한 후, 반응액을 역상 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(0.1% FA MeCN/H2O)에 통과시키고, 중간체를 포함하는 프랙션을 감압하 농축했다. 얻어진 잔사를 5% TFA in DCM(2mL)에 용해하고, 실온에서 2시간 교반했다. 반응액을 감압하 농축한 후, 얻어진 잔사를 역상 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(0.1% FA MeCN/H2O)로 정제하여, 표제 화합물(LCT-67)(13mg)을 얻었다. LCT-67의 아미노산 서열을 서열 번호: 237에 나타낸다.
LCMS(ESI) m/z = 1751.2 (M-H)-
유지 시간: 0.97분 (분석 조건 SQDFA05＿02)
실시예 3-2 N말단에 BdpFL를 가지는 펩타이드(LCT-12)의 합성
Fmoc-Ala-OH를 담지시킨 2-클로로트라이틸 레진(100mg)을 이용하고, Fmoc 아미노산으로서 Fmoc-Gly-OH, 특허문헌(WO2018225864)에 기재된 방법으로 합성한 Fmoc-Thr(THP)-OH(aa01), Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Pro-OH를 이용하여 펩타이드 합성기로 펩타이드의 신장을 행했다(아미노산의 약호에 대해서는 본 명세서 중에 별도 기재). Fmoc법에 의한 펩타이드 합성법에 따라, 펩타이드의 신장을 행했다(WO2013100132B2). 펩타이드의 신장 후, N말단의 Fmoc기의 제거를 펩타이드 합성기 상에서 행한 후, 레진을 DCM으로 세정했다.
레진에 TFE/DCM(1:1, v/v, 2mL)을 가하고 1시간 진탕하여, 펩타이드의 레진으로부터의 절출을 행했다. 반응 종료 후, 튜브 내의 용액을 합성용 컬럼으로 여과하는 것에 의해 레진을 제거하고, 레진을 TFE/DCM(1:1, v/v, 1mL)으로 2회 세정했다. 모든 추출액을 혼합하고, DMF(2mL)를 가한 후, 감압하 농축했다. 얻어진 잔사를 NMP(0.5mL)에 용해하고, 그 중 1/4(125μL)을 다음의 반응에 사용했다. 펩타이드의 NMP 용액에 76.5mM로 조제한 4,4-다이플루오로-5,7-다이메틸-4-보라-3a,4a-다이아자-s-인다센-3-프로피온산 N-석신이미딜 에스터(140μL)를 실온에서 가하고, 40℃에서 철야 교반한 후, 감압하 농축했다. 얻어진 잔사를 0.05M 테트라메틸암모늄 황산수소염 in HFIP(1.2ml, 0.060mmol)에 용해하고, 실온에서 2시간 교반했다. 반응액을 역상 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(0.1% FA MeCN/H2O)로 정제하여, 표제 화합물(LCT-12)(0.3mg)을 얻었다. LCT-12의 아미노산 서열을 서열 번호: 238에 나타낸다.
LCMS(ESI) m/z = 1972.9 (M-H)-
유지 시간: 0.74분 (분석 조건 SQDFA05＿01)
실시예 4 아미노아실 tRNA의 합성
실시예 4-1 tRNA의 조제
주형 DNA(TD-1∼TD-107)로부터, T7 RNA polymerase를 이용한 in vitro 전사 반응에 의해 tRNA(TR-1∼TR-107)를 합성하고, RNeasy kit(Qiagen사)에 의해 정제했다.
주형 DNA 서열 번호: 1(TD-1)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTaagAAGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 2(TD-2)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCTTaagACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 3(TD-3)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCTTaagAAGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 4(TD-4)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTaagACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 5(TD-5)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTaagGAGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 6(TD-6)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCTTaagATGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 7(TD-7)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCTTaagGTGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 8(TD-8)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCTTaagGAGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 9(TD-9)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCATaagGTGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 10(TD-10)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCATaagATGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 11(TD-11)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTcagAAGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 12(TD-12)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCTTcagACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 13(TD-13)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCTTcagAAGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 14(TD-14)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTcagACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 15(TD-15)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTcagGAGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 16(TD-16)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCTTcagATGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 17(TD-17)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCTTcagGTGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 18(TD-18)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCTTcagGAGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 19(TD-19)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCATcagGTGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 20(TD-20)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCATcagATGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 21(TD-21)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTaggAAGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 22(TD-22)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCTTaggACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 23(TD-23)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCTTaggAAGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 24(TD-24)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTaggACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 25(TD-25)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTaggGAGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 26(TD-26)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCTTaggATGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 27(TD-27)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCTTaggGTGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 28(TD-28)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCTTaggGAGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 29(TD-29)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCATaggGTGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 30(TD-30)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCATaggATGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 31(TD-31)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTcggAAGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 32(TD-32)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCTTcggACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 33(TD-33)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCTTcggAAGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 34(TD-34)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTcggACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 35(TD-35)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTcggGAGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 36(TD-36)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCTTcggATGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 37(TD-37)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCTTcggGTGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 38(TD-38)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCTTcggGAGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 39(TD-39)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCATcggGTGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 40(TD-40)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCATcggATGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 41(TD-41)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTaccAAGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 42(TD-42)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCTTaccACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 43(TD-43)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCTTaccAAGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 44(TD-44)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTaccACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 45(TD-45)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTaccGAGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 46(TD-46)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCTTaccATGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 47(TD-47)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCTTaccGTGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 48(TD-48)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCTTaccGAGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 49(TD-49)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCATaccGTGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 50(TD-50)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCATaccATGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 51(TD-51)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTcccAAGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 52(TD-52)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCTTcccACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 53(TD-53)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCTTcccAAGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 54(TD-54)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTcccACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 55(TD-55)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTcccGAGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 56(TD-56)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCTTcccATGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 57(TD-57)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCTTcccGTGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 58(TD-58)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCTTcccGAGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 59(TD-59)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCATcccGTGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 60(TD-60)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCATcccATGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 61(TD-61)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGGAGCGGTAGTTCAGTCGGTTAGAATACCTGCCTaagAAGCAGGGGGTCGCGGGTTCGAGTCCCGTCCGTTCCGC
주형 DNA 서열 번호: 62(TD-62)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGGAGCGGTAGTTCAGTCGGTTAGAATACCTGCTTaagACGCAGGGGGTCGCGGGTTCGAGTCCCGTCCGTTCCGC
주형 DNA 서열 번호: 63(TD-63)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGGAGCGGTAGTTCAGTCGGTTAGAATACCTGCTTaagAAGCAGGGGGTCGCGGGTTCGAGTCCCGTCCGTTCCGC
주형 DNA 서열 번호: 64(TD-64)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGGAGCGGTAGTTCAGTCGGTTAGAATACCTGCCTaagACGCAGGGGGTCGCGGGTTCGAGTCCCGTCCGTTCCGC
주형 DNA 서열 번호: 65(TD-65)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGGAGCGGTAGTTCAGTCGGTTAGAATACCTGCCTaagGAGCAGGGGGTCGCGGGTTCGAGTCCCGTCCGTTCCGC
주형 DNA 서열 번호: 66(TD-66)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGGAGCGGTAGTTCAGTCGGTTAGAATACCTGCTTaagATGCAGGGGGTCGCGGGTTCGAGTCCCGTCCGTTCCGC
주형 DNA 서열 번호: 67(TD-67)
DNA 서열:
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주형 DNA 서열 번호: 68(TD-68)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGGAGCGGTAGTTCAGTCGGTTAGAATACCTGCTTaagGAGCAGGGGGTCGCGGGTTCGAGTCCCGTCCGTTCCGC
주형 DNA 서열 번호: 69(TD-69)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGGAGCGGTAGTTCAGTCGGTTAGAATACCTGCATaagGTGCAGGGGGTCGCGGGTTCGAGTCCCGTCCGTTCCGC
주형 DNA 서열 번호: 70(TD-70)
DNA 서열:
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주형 DNA 서열 번호: 71(TD-71)
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주형 DNA 서열 번호: 72(TD-72)
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주형 DNA 서열 번호: 79(TD-79)
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GGCGTAATACGACTCACTATAGGCTCTGTAGTTCAGTCGGTAGAACGGCGGACTaagACTCCGTATGTCACTGGTTCGAGTCCAGTCAGAGCCGC
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주형 DNA 서열 번호: 100(TD-100)
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GGCGTAATACGACTCACTATAGGCTCTGTAGTTCAGTCGGTAGAACGGCGGAATcagATTCCGTATGTCACTGGTTCGAGTCCAGTCAGAGCCGC
주형 DNA 서열 번호: 101(TD-101)
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GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTgccACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 102(TD-102)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCTTgccGTGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 103(TD-103)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCTTgccGAGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 104(TD-104)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTtccACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
주형 DNA 서열 번호: 105(TD-105)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGGCGGGGTGGAGCAGCCTGGTAGCTCGTCGGGCTcatAACCCGAAGATCGTCGGTTCAAATCCGGCCCCCGCAAC
주형 DNA 서열 번호: 106(TD-106)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGGAGCGGTAGTTCAGTCGGTTAGAATACCTGCTTtagGTGCAGGGGGTCGCGGGTTCGAGTCCCGTCCGTTCCGC
주형 DNA 서열 번호: 107(TD-107)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGGCTCTGTAGTTCAGTCGGTAGAACGGCGGATTtagGTTCCGTATGTCACTGGTTCGAGTCCAGTCAGAGCCGC
tRNA 서열 번호: 108(TR-1)
tRNA(Glu2+Ser5)aag-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUaagAAGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 109(TR-2)
tRNA(Glu2+Ala1B)aag-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCUUaagACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 110(TR-3)
tRNA(Glu2+Phe)aag-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCUUaagAAGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 111(TR-4)
tRNA(Glu2)aag-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUaagACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 112(TR-5)
tRNA(Glu2+Arg3)aag-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUaagGAGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 113(TR-6)
tRNA(Glu2+Val2)aag-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCUUaagAUGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 114(TR-7)
tRNA(Glu2+Leu2)aag-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCUUaagGUGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 115(TR-8)
tRNA(Glu2+Pro3)aag-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCUUaagGAGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 116(TR-9)
tRNA(Glu2+Pro2)aag-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCAUaagGUGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 117(TR-10)
tRNA(Glu2+Ala2)aag-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCAUaagAUGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 118(TR-11)
tRNA(Glu2+Ser5)cag-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUcagAAGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 119(TR-12)
tRNA(Glu2+Ala1B)cag-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCUUcagACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 120(TR-13)
tRNA(Glu2+Phe)cag-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCUUcagAAGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 121(TR-14)
tRNA(Glu2)cag-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUcagACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 122(TR-15)
tRNA(Glu2+Arg3)cag-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUcagGAGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 123(TR-16)
tRNA(Glu2+Val2)cag-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCUUcagAUGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 124(TR-17)
tRNA(Glu2+Leu2)cag-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCUUcagGUGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 125(TR-18)
tRNA(Glu2+Pro3)cag-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCUUcagGAGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 126(TR-19)
tRNA(Glu2+Pro2)cag-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCAUcagGUGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 127(TR-20)
tRNA(Glu2+Ala2)cag-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCAUcagAUGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 128(TR-21)
tRNA(Glu2+Ser5)agg-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUaggAAGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 129(TR-22)
tRNA(Glu2+Ala1B)agg-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCUUaggACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 130(TR-23)
tRNA(Glu2+Phe)agg-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCUUaggAAGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 131(TR-24)
tRNA(Glu2)agg-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUaggACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 132(TR-25)
tRNA(Glu2+Arg3)agg-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUaggGAGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 133(TR-26)
tRNA(Glu2+Val2)agg-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCUUaggAUGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 134(TR-27)
tRNA(Glu2+Leu2)agg-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCUUaggGUGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 135(TR-28)
tRNA(Glu2+Pro3)agg-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCUUaggGAGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 136(TR-29)
tRNA(Glu2+Pro2)agg-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCAUaggGUGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 137(TR-30)
tRNA(Glu2+Ala2)agg-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCAUaggAUGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 138(TR-31)
tRNA(Glu2+Ser5)cgg-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUcggAAGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 139(TR-32)
tRNA(Glu2+Ala1B)cgg-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCUUcggACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 140(TR-33)
tRNA(Glu2+Phe)cgg-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCUUcggAAGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 141(TR-34)
tRNA(Glu2)cgg-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUcggACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 142(TR-35)
tRNA(Glu2+Arg3)cgg-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUcggGAGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 143(TR-36)
tRNA(Glu2+Val2)cgg-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCUUcggAUGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 144(TR-37)
tRNA(Glu2+Leu2)cgg-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCUUcggGUGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 145(TR-38)
tRNA(Glu2+Pro3)cgg-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCUUcggGAGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 146(TR-39)
tRNA(Glu2+Pro2)cgg-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCAUcggGUGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 147(TR-40)
tRNA(Glu2+Ala2)cgg-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCAUcggAUGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 148(TR-41)
tRNA(Glu2+Ser5)acc-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUaccAAGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 149(TR-42)
tRNA(Glu2+Ala1B)acc-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCUUaccACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 150(TR-43)
tRNA(Glu2+Phe)acc-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCUUaccAAGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 151(TR-44)
tRNA(Glu2)acc-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUaccACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 152(TR-45)
tRNA(Glu2+Arg3)acc-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUaccGAGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 153(TR-46)
tRNA(Glu2+Val2)acc-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCUUaccAUGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 154(TR-47)
tRNA(Glu2+Leu2)acc-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCUUaccGUGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 155(TR-48)
tRNA(Glu2+Pro3)acc-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCUUaccGAGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 156(TR-49)
tRNA(Glu2+Pro2)acc-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCAUaccGUGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 157(TR-50)
tRNA(Glu2+Ala2)acc-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCAUaccAUGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 158(TR-51)
tRNA(Glu2+Ser5)ccc-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUcccAAGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 159(TR-52)
tRNA(Glu2+Ala1B)ccc-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCUUcccACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 160(TR-53)
tRNA(Glu2+Phe)ccc-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCUUcccAAGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 161(TR-54)
tRNA(Glu2)ccc-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUcccACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 162(TR-55)
tRNA(Glu2+Arg3)ccc-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUcccGAGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 163(TR-56)
tRNA(Glu2+Val2)ccc-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCUUcccAUGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 164(TR-57)
tRNA(Glu2+Leu2)ccc-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCUUcccGUGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 165(TR-58)
tRNA(Glu2+Pro3)ccc-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCUUcccGAGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 166(TR-59)
tRNA(Glu2+Pro2)ccc-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCAUcccGUGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 167(TR-60)
tRNA(Glu2+Ala2)ccc-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCAUcccAUGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 168(TR-61)
tRNA(Asp1+Ser5)aag-CA RNA 서열:
GGAGCGGUAGUUCAGUCGGUUAGAAUACCUGCCUaagAAGCAGGGGGUCGCGGGUUCGAGUCCCGUCCGUUCCGC
tRNA 서열 번호: 169(TR-62)
tRNA(Asp1+Ala1B)aag-CA RNA 서열:
GGAGCGGUAGUUCAGUCGGUUAGAAUACCUGCUUaagACGCAGGGGGUCGCGGGUUCGAGUCCCGUCCGUUCCGC
tRNA 서열 번호: 170(TR-63)
tRNA(Asp1+Phe)aag-CA RNA 서열:
GGAGCGGUAGUUCAGUCGGUUAGAAUACCUGCUUaagAAGCAGGGGGUCGCGGGUUCGAGUCCCGUCCGUUCCGC
tRNA 서열 번호: 171(TR-64)
tRNA(Asp1)aag-CA RNA 서열:
GGAGCGGUAGUUCAGUCGGUUAGAAUACCUGCCUaagACGCAGGGGGUCGCGGGUUCGAGUCCCGUCCGUUCCGC
tRNA 서열 번호: 172(TR-65)
tRNA(Asp1+Arg3)aag-CA RNA 서열:
GGAGCGGUAGUUCAGUCGGUUAGAAUACCUGCCUaagGAGCAGGGGGUCGCGGGUUCGAGUCCCGUCCGUUCCGC
tRNA 서열 번호: 173(TR-66)
tRNA(Asp1+Val2)aag-CA RNA 서열:
GGAGCGGUAGUUCAGUCGGUUAGAAUACCUGCUUaagAUGCAGGGGGUCGCGGGUUCGAGUCCCGUCCGUUCCGC
tRNA 서열 번호: 174(TR-67)
tRNA(Asp1+Leu2)aag-CA RNA 서열:
GGAGCGGUAGUUCAGUCGGUUAGAAUACCUGCUUaagGUGCAGGGGGUCGCGGGUUCGAGUCCCGUCCGUUCCGC
tRNA 서열 번호: 175(TR-68)
tRNA(Asp1+Pro3)aag-CA RNA 서열:
GGAGCGGUAGUUCAGUCGGUUAGAAUACCUGCUUaagGAGCAGGGGGUCGCGGGUUCGAGUCCCGUCCGUUCCGC
tRNA 서열 번호: 176(TR-69)
tRNA(Asp1+Pro2)aag-CA RNA 서열:
GGAGCGGUAGUUCAGUCGGUUAGAAUACCUGCAUaagGUGCAGGGGGUCGCGGGUUCGAGUCCCGUCCGUUCCGC
tRNA 서열 번호: 177(TR-70)
tRNA(Asp1+Ala2)aag-CA RNA 서열:
GGAGCGGUAGUUCAGUCGGUUAGAAUACCUGCAUaagAUGCAGGGGGUCGCGGGUUCGAGUCCCGUCCGUUCCGC
tRNA 서열 번호: 178(TR-71)
tRNA(Asp1+Ser5)cag-CA RNA 서열:
GGAGCGGUAGUUCAGUCGGUUAGAAUACCUGCCUcagAAGCAGGGGGUCGCGGGUUCGAGUCCCGUCCGUUCCGC
tRNA 서열 번호: 179(TR-72)
tRNA(Asp1+Ala1B)cag-CA RNA 서열:
GGAGCGGUAGUUCAGUCGGUUAGAAUACCUGCUUcagACGCAGGGGGUCGCGGGUUCGAGUCCCGUCCGUUCCGC
tRNA 서열 번호: 180(TR-73)
tRNA(Asp1+Ph2)cag-CA RNA 서열:
GGAGCGGUAGUUCAGUCGGUUAGAAUACCUGCUUcagAAGCAGGGGGUCGCGGGUUCGAGUCCCGUCCGUUCCGC
tRNA 서열 번호: 181(TR-74)
tRNA(Asp1)cag-CA RNA 서열:
GGAGCGGUAGUUCAGUCGGUUAGAAUACCUGCCUcagACGCAGGGGGUCGCGGGUUCGAGUCCCGUCCGUUCCGC
tRNA 서열 번호: 182(TR-75)
tRNA(Asp1+Arg3)cag-CA RNA 서열:
GGAGCGGUAGUUCAGUCGGUUAGAAUACCUGCCUcagGAGCAGGGGGUCGCGGGUUCGAGUCCCGUCCGUUCCGC
tRNA 서열 번호: 183(TR-76)
tRNA(Asp1+Val2)cag-CA RNA 서열:
GGAGCGGUAGUUCAGUCGGUUAGAAUACCUGCUUcagAUGCAGGGGGUCGCGGGUUCGAGUCCCGUCCGUUCCGC
tRNA 서열 번호: 184(TR-77)
tRNA(Asp1+Leu2)cag-CA RNA 서열:
GGAGCGGUAGUUCAGUCGGUUAGAAUACCUGCUUcagGUGCAGGGGGUCGCGGGUUCGAGUCCCGUCCGUUCCGC
tRNA 서열 번호: 185(TR-78)
tRNA(Asp1+Pro3)cag-CA RNA 서열:
GGAGCGGUAGUUCAGUCGGUUAGAAUACCUGCUUcagGAGCAGGGGGUCGCGGGUUCGAGUCCCGUCCGUUCCGC
tRNA 서열 번호: 186(TR-79)
tRNA(Asp1+Pro2)cag-CA RNA 서열:
GGAGCGGUAGUUCAGUCGGUUAGAAUACCUGCAUcagGUGCAGGGGGUCGCGGGUUCGAGUCCCGUCCGUUCCGC
tRNA 서열 번호: 187(TR-80)
tRNA(Asp1+Ala2)cag-CA RNA 서열:
GGAGCGGUAGUUCAGUCGGUUAGAAUACCUGCAUcagAUGCAGGGGGUCGCGGGUUCGAGUCCCGUCCGUUCCGC
tRNA 서열 번호: 188(TR-81)
tRNA(AsnE2)aag-CA RNA 서열:
GGCUCUGUAGUUCAGUCGGUAGAACGGCGGACUaagAAUCCGUAUGUCACUGGUUCGAGUCCAGUCAGAGCCGC
tRNA 서열 번호: 189(TR-82)
tRNA(AsnE2+Ala1B)aag-CA RNA 서열:
GGCUCUGUAGUUCAGUCGGUAGAACGGCGGAUUaagACUCCGUAUGUCACUGGUUCGAGUCCAGUCAGAGCCGC
tRNA 서열 번호: 190(TR-83)
tRNA(AsnE2+Phe)aag-CA RNA 서열:
GGCUCUGUAGUUCAGUCGGUAGAACGGCGGAUUaagAAUCCGUAUGUCACUGGUUCGAGUCCAGUCAGAGCCGC
tRNA 서열 번호: 191(TR-84)
tRNA(AsnE2+Glu2)aag-CA RNA 서열:
GGCUCUGUAGUUCAGUCGGUAGAACGGCGGACUaagACUCCGUAUGUCACUGGUUCGAGUCCAGUCAGAGCCGC
tRNA 서열 번호: 192(TR-85)
tRNA(AsnE2+Arg3)aag-CA RNA 서열:
GGCUCUGUAGUUCAGUCGGUAGAACGGCGGACUaagGAUCCGUAUGUCACUGGUUCGAGUCCAGUCAGAGCCGC
tRNA 서열 번호: 193(TR-86)
tRNA(AsnE2+Val2)aag-CA RNA 서열:
GGCUCUGUAGUUCAGUCGGUAGAACGGCGGAUUaagAUUCCGUAUGUCACUGGUUCGAGUCCAGUCAGAGCCGC
tRNA 서열 번호: 194(TR-87)
tRNA(AsnE2+Leu2)aag-CA RNA 서열:
GGCUCUGUAGUUCAGUCGGUAGAACGGCGGAUUaagGUUCCGUAUGUCACUGGUUCGAGUCCAGUCAGAGCCGC
tRNA 서열 번호: 195(TR-88)
tRNA(AsnE2+Pro3)aag-CA RNA 서열:
GGCUCUGUAGUUCAGUCGGUAGAACGGCGGAUUaagGAUCCGUAUGUCACUGGUUCGAGUCCAGUCAGAGCCGC
tRNA 서열 번호: 196(TR-89)
tRNA(AsnE2+Pro2)aag-CA RNA 서열:
GGCUCUGUAGUUCAGUCGGUAGAACGGCGGAAUaagGUUCCGUAUGUCACUGGUUCGAGUCCAGUCAGAGCCGC
tRNA 서열 번호: 197(TR-90)
tRNA(AsnE2+Ala2)aag-CA RNA 서열:
GGCUCUGUAGUUCAGUCGGUAGAACGGCGGAAUaagAUUCCGUAUGUCACUGGUUCGAGUCCAGUCAGAGCCGC
tRNA 서열 번호: 198(TR-91)
tRNA(AsnE2)cag-CA RNA 서열:
GGCUCUGUAGUUCAGUCGGUAGAACGGCGGACUcagAAUCCGUAUGUCACUGGUUCGAGUCCAGUCAGAGCCGC
tRNA 서열 번호: 199(TR-92)
tRNA(AsnE2+Ala1B)cag-CA RNA 서열:
GGCUCUGUAGUUCAGUCGGUAGAACGGCGGAUUcagACUCCGUAUGUCACUGGUUCGAGUCCAGUCAGAGCCGC
tRNA 서열 번호: 200(TR-93)
tRNA(AsnE2+Phe)cag-CA RNA 서열:
GGCUCUGUAGUUCAGUCGGUAGAACGGCGGAUUcagAAUCCGUAUGUCACUGGUUCGAGUCCAGUCAGAGCCGC
tRNA 서열 번호: 201(TR-94)
tRNA(AsnE2+Glu2)cag-CA RNA 서열:
GGCUCUGUAGUUCAGUCGGUAGAACGGCGGACUcagACUCCGUAUGUCACUGGUUCGAGUCCAGUCAGAGCCGC
tRNA 서열 번호: 202(TR-95)
tRNA(AsnE2+Arg3)cag-CA RNA 서열:
GGCUCUGUAGUUCAGUCGGUAGAACGGCGGACUcagGAUCCGUAUGUCACUGGUUCGAGUCCAGUCAGAGCCGC
tRNA 서열 번호: 203(TR-96)
tRNA(AsnE2+Val2)cag-CA RNA 서열:
GGCUCUGUAGUUCAGUCGGUAGAACGGCGGAUUcagAUUCCGUAUGUCACUGGUUCGAGUCCAGUCAGAGCCGC
tRNA 서열 번호: 204(TR-97)
tRNA(AsnE2+Leu2)cag-CA RNA 서열:
GGCUCUGUAGUUCAGUCGGUAGAACGGCGGAUUcagGUUCCGUAUGUCACUGGUUCGAGUCCAGUCAGAGCCGC
tRNA 서열 번호: 205(TR-98)
tRNA(AsnE2+Pro3)cag-CA RNA 서열:
GGCUCUGUAGUUCAGUCGGUAGAACGGCGGAUUcagGAUCCGUAUGUCACUGGUUCGAGUCCAGUCAGAGCCGC
tRNA 서열 번호: 206(TR-99)
tRNA(AsnE2+Pro2)cag-CA RNA 서열:
GGCUCUGUAGUUCAGUCGGUAGAACGGCGGAAUcagGUUCCGUAUGUCACUGGUUCGAGUCCAGUCAGAGCCGC
tRNA 서열 번호: 207(TR-100)
tRNA(AsnE2+Ala2)cag-CA RNA 서열:
GGCUCUGUAGUUCAGUCGGUAGAACGGCGGAAUcagAUUCCGUAUGUCACUGGUUCGAGUCCAGUCAGAGCCGC
tRNA 서열 번호: 208(TR-101)
tRNA(Glu2)gcc-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUgccACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 209(TR-102)
tRNA(Glu2+Leu2)gcc-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCUUgccGUGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 210(TR-103)
tRNA(Glu2+Pro3)gcc-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCUUgccGAGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 211(TR-104)
tRNA(Glu2) ucc-CA RNA 서열:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUuccACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNA 서열 번호: 212(TR-105)
tRNA(fMet) cau-CA RNA 서열:
GGCGGGGUGGAGCAGCCUGGUAGCUCGUCGGGCUcauAACCCGAAGAUCGUCGGUUCAAAUCCGGCCCCCGCAAC
tRNA 서열 번호: 213(TR-106)
tRNA(Asp1+Leu2)_uag-CA RNA 서열:
GGAGCGGUAGUUCAGUCGGUUAGAAUACCUGCUUuagGUGCAGGGGGUCGCGGGUUCGAGUCCCGUCCGUUCCGC
tRNA 서열 번호: 214(TR-107)
tRNA(AsnE2+Leu2)_uag-CA RNA 서열:
GGCUCUGUAGUUCAGUCGGUAGAACGGCGGAUUuagGUUCCGUAUGUCACUGGUUCGAGUCCAGUCAGAGCCGC
실시예 4-2 라이게이션 반응에 의한 tRNA-CA의 제작
tRNA 5＇ 단편, pLp, 및 tRNA 3＇ 단편을 이하에 기재된 수순에 의해, 라이게이션 반응을 이용하여 연결함으로써 각종 tRNA-CA를 제작했다. tRNA 5＇ 단편 및 tRNA 3＇ 단편은 화학 합성품(주식회사 진 디자인)을 이용했다. 각 tRNA 단편 및 전장의 서열을 이하에 나타낸다. 한편, TR-108의 제작을 위해서는 FR-1 및 FR-2를, TR-109의 제작을 위해서는 FR-3 및 FR-4를, 각각 tRNA 5＇ 단편 및 tRNA 3＇ 단편으로서 이용했다.
서열 번호: 217(FR-1)
tRNA(Asp1) 5＇ RNA 서열
GGAGCGGUAGUUCAGUCGGUUAGAAUACCUGCUU
서열 번호: 218(FR-2)
tRNA(Asp1) 3＇ag RNA 서열
AGGUGCAGGGGGUCGCGGGUUCGAGUCCCGUCCGUUCCGC
tRNA 서열 번호: 215(TR-108)
tRNA(Asp1+Leu2) Lag-CA RNA 서열:
GGAGCGGUAGUUCAGUCGGUUAGAAUACCUGCUULagGUGCAGGGGGUCGCGGGUUCGAGUCCCGUCCGUUCCGC
서열 번호: 219(FR-3)
tRNA(AsnE2) 5＇ RNA 서열
GGCUCUGUAGUUCAGUCGGUAGAACGGCGGAUU
서열 번호: 220(FR-4)
tRNA(AsnE2) 3＇ag RNA 서열
AGGUUCCGUAUGUCACUGGUUCGAGUCCAGUCAGAGCCGC
tRNA 서열 번호: 216(TR-109)
tRNA(AsnE2+Leu2) Lag-CA RNA 서열
GGCUCUGUAGUUCAGUCGGUAGAACGGCGGAUULagGUUCCGUAUGUCACUGGUUCGAGUCCAGUCAGAGCCGC
50mM HEPES-KOH(pH 7.5), 20mM MgCl2, 1mM ATP, 0.125∼0.25mM pLp, 25μM tRNA 5＇ 단편, 0.6U/μL T4 RNA ligase(New England Biolabs), 10% DMSO의 조성의 반응 용액을 15℃에서 하룻밤 정치하는 것에 의해 tRNA 단편 5＇와 pLp의 라이게이션 반응을 행했다. 라이게이션 산물은, 페놀·클로로폼 추출을 행하고, 에탄올 침전에 의해 회수했다.
미반응의 tRNA 5＇ 단편이 다음의 라이게이션 반응으로 미뤄지지 않도록 하기 위해, 과아이오딘산 나트륨(NaIO4)에 의해, tRNA 5＇ 단편의 3＇ 말단의 리보스를 개렬시켰다. 구체적으로는, 10μM 라이게이션 산물, 10mM 과아이오딘산 나트륨 존재하에서, 빙상, 암소에서 30분 정치하는 것에 의해 개렬 반응을 행했다. 반응 후, 100mM 글루코스를 1/10체적량 가하고, 빙상, 암소에서 30분 정치하는 것에 의해 과잉한 과아이오딘산 나트륨을 분해했다. 반응 산물은, 에탄올 침전에 의해 회수했다.
과아이오딘산 처리 후의 라이게이션 산물의 5＇ 말단을 인산화, 3＇ 말단을 탈인산화하기 위해 T4 PNK(T4 polynucleotide kinase) 처리를 행했다. 10μM의 과아이오딘산 처리 후의 라이게이션 산물, 50mM Tris-HCl(pH 8.0), 10mM MgCl2, 5mM DTT, 300μM ATP, 0.5U/μL T4 PNK(TaKaRa)의 조성의 반응 용액을 37℃에서 30분 내지 60분 정치하는 것에 의해 반응을 행했다. 반응 산물은, 페놀·클로로폼 추출을 행하고, 에탄올 침전에 의해 회수했다.
PNK 처리 후의 반응 산물과 tRNA 3＇ 단편의 라이게이션 반응을 행했다. 우선, 10μM의 PNK 처리 후의 반응 산물, 10μM tRNA 3＇ 단편, 50mM HEPES-KOH(pH 7.5), 15mM MgCl2의 조성의 용액을 65℃에서 7분간 가열 후, 실온에서 30분 내지 1시간 정치함으로써 PNK 처리 후의 반응 산물과 tRNA 3＇ 단편의 어닐링을 행했다. 다음에, tRNA 3＇ 단편의 5＇ 말단을 인산화하기 위해 T4 PNK 처리를 행했다. T4 PNK 처리는, 어닐링을 행한 용액에, DTT(종(終)농도 3.5mM), ATP(종농도 300μM), T4 PNK(종농도 0.5 U/μL)를 가하고, 37℃에서 30분 정치함으로써 행했다. 계속해서, 이 용액에, T4 RNA ligase(New England Biolabs)를 종농도 0.9U/μL가 되도록 가하고, 37℃에서 30분 내지 40분 정치함으로써 라이게이션 반응을 행했다. 라이게이션 산물은, 페놀·클로로폼 추출을 행하고, 에탄올 침전에 의해 회수했다.
라이게이션법에 의해 제작한 tRNA-CA는, 고속 역상 크로마토그래피(HPLC)(15mM TEA와 400mM HFIP의 수용액/15mM TEA와 400mM HFIP의 메탄올 용액)로 분취 정제를 행한 후, 변성 요소 10% 폴리아크릴아마이드 전기 영동으로 목적하는 길이를 갖고 있음을 확인했다.
RNaseT
1
에 의해 절단한 tRNA 단편의 분석
라이게이션 반응을 이용하여 조제한 tRNA-CA를 RNase로 단편화하여 분석함으로써, pLp로 도입한 라이시딘(L)이 목적하는 부위에 도입되고 있음을 확인했다.
10μM tRNA-CA, 5U/μL RNaseT1(Epicentre 또는 ThermoFisher Scientific), 10mM 아세트산 암모늄(pH 5.3)을 포함하는 반응 용액을 37℃에서 1시간 정치하는 것에 의해 RNA를 G 염기의 3＇측에서 특이적으로 절단하고, pLp로 도입한 라이시딘(L)을 포함하는 RNA 단편을 분석했다.
CUULAGp
LCMS(ESI) m/z = 1020 ((M-2H)/2)-
유지 시간: 3.84분 (분석 조건 LTQTEA/HFIP05＿03)
pLp가 ligation되어 있지 않은 경우에 상정되는 단편(CUUAGp)과 RNA의 다른 부분 유래의 단편(UUCAGp)의 분자량이 동일하기 때문에, 단편화되어 있지 않은 상태의 RNA(TR-108)의 분석도 아울러 행했다.
LCMS(ESI) m/z = 1109 ((M-22H)/22)-
유지 시간: 3.92분 (분석 조건 LTQTEA/HFIP05＿01)
pLp가 ligation되어 있지 않은 경우에 상정되는 RNA 및 라이시딘 대신에 우리딘이 들어가 있었을 경우에 상정되는 RNA의 매스 크로마토그램과 비교하여, 대부분 pLp의 라이게이션이 진행되었음을 확인했다.
AUULAGp
LCMS(ESI) m/z = 1032 ((M-2H)/2)-
유지 시간: 4.16분 (분석 조건 LTQTEA/HFIP05＿03)
pLp가 라이게이션되어 있지 않은 경우에 상정되는 단편(AUUAGp) 및 라이시딘 대신에 우리딘이 들어가 있었을 경우에 상정되는 단편(AUUUAGp)의 매스 크로마토그램과 비교하여, 대부분 pLp의 라이게이션이 진행되었음을 확인했다.
아미노아실 pCpA를 이용한 신장 아미노아실 tRNA의 조제
25μM 전사 tRNA(Glu2+Ser5)aag-CA(TR-1), 50mM HEPES-KOH pH7.5, 20mM MgCl2, 1mM ATP, 0.6Unit/μL T4 RNA 리가제(New England bio lab사), 0.25mM 아미노아실 pCpA(SS15의 DMSO 용액)가 되도록, 뉴클레아제 프리수(free水)로 메스업한 반응액을 조제하고, 15℃에서 45분간 라이게이션 반응을 행했다. T4 RNA 리가제 및 아미노아실 pCpA를 가하기 전의 반응액은, 95℃에서 2분간 가열 후, 실온에서 5분 방치하여, 미리 tRNA의 리폴딩을 행했다.
라이게이션 반응액에, 아세트산 나트륨을 0.3M이 되도록 가하고, 페놀·클로로폼 추출을 행하여, 신장 아미노아실 tRNA(AAtR-1)를 조제했다. AAtR-1은 에탄올 침전에 의해 회수하고, 번역 혼합물에 첨가하기 전에 1mM 아세트산 나트륨 수용액에 용해했다.
마찬가지로, 전사 tRNA(TR-2∼TR-103, TR-106∼TR-109)에 대해서, 아미노아실 pCpA(SS15)를 전술한 방법으로 라이게이션 반응, 페놀·클로로폼 추출, 에탄올 침전을 행하여, 신장 아미노아실 tRNA(AAtR-2∼AAtR-103, AAtR-132, AAtR-133, AAtR-136, AAtR-137)를 조제했다. 이들 아미노아실 tRNA는 번역 혼합물에 첨가하기 전에 1mM 아세트산 나트륨 수용액에 용해했다.
마찬가지로, 전사 tRNA(TR-4, TR-14, TR-24, TR-34, TR-44, TR-54, TR-64, TR-74, TR-81, TR-91, TR-104)에 대해서, 아미노아실 pCpA(SS16)를 전술한 방법으로 라이게이션 반응, 페놀·클로로폼 추출, 에탄올 침전을 행하여, 신장 아미노아실 tRNA(AAtR-104∼AAtR-114)를 조제했다. 이들 아미노아실 tRNA는 번역 혼합물에 첨가하기 전에 1mM 아세트산 나트륨 수용액에 용해했다.
마찬가지로, 전사 tRNA(TR-44, TR-47, TR-48, TR-50)에 대해서, 아미노아실 pCpA(SS14)를 전술한 방법으로 라이게이션 반응, 페놀·클로로폼 추출, 에탄올 침전을 행하여, 신장 아미노아실 tRNA(AAtR-115∼AAtR-118)를 조제했다. 이들 아미노아실 tRNA는 번역 혼합물에 첨가하기 전에 1mM 아세트산 나트륨 수용액에 용해했다.
마찬가지로, 전사 tRNA(TR-44, TR-47, TR-48, TR-50, TR-24, TR-34)에 대해서, 아미노아실 pCpA(SS45)를 전술한 방법으로 라이게이션 반응, 페놀·클로로폼 추출, 에탄올 침전을 행하여, 신장 아미노아실 tRNA(AAtR-119∼AAtR-122, AAtR-129, AAtR-130)를 조제했다. 이들 아미노아실 tRNA는 번역 혼합물에 첨가하기 전에 1mM 아세트산 나트륨 수용액에 용해했다.
마찬가지로, 전사 tRNA(TR-44, TR-47, TR-48, TR-50, TR-77, TR-97)에 대해서, 아미노아실 pCpA(특허문헌(WO2018143145A1)에 기재된 방법으로 합성한 화합물 TS24)을 전술한 방법으로 라이게이션 반응, 페놀·클로로폼 추출, 에탄올 침전을 행하여, 신장 아미노아실 tRNA(AAtR-123∼AAtR-126, AAtR-134, AAtR-138)를 조제했다. 이들 아미노아실 tRNA는 번역 혼합물에 첨가하기 전에 1mM 아세트산 나트륨 수용액에 용해했다.
마찬가지로, 전사 tRNA(TR-54, TR-67, TR-87)에 대해서, 아미노아실 pCpA(특허문헌(WO2018143145A1)에 기재된 방법으로 합성한 화합물 ts14)를 전술한 방법으로 라이게이션 반응, 페놀·클로로폼 추출, 에탄올 침전을 행하여, 신장 아미노아실 tRNA(AAtR-127, AAtR-131, AAtR-135)를 조제했다. 이 아미노아실 tRNA는 번역 혼합물에 첨가하기 전에 1mM 아세트산 나트륨 수용액에 용해했다.
AAtR-1 SPh2Cl-tRNA(Glu2+Ser5)aag
AAtR-2 SPh2Cl-tRNA(Glu2+Ala1B)aag
AAtR-3 SPh2Cl-tRNA(Glu2+Phe)aag
AAtR-4 SPh2Cl-tRNA(Glu2)aag
AAtR-5 SPh2Cl-tRNA(Glu2+Arg3)aag
AAtR-6 SPh2Cl-tRNA(Glu2+Val2)aag
AAtR-7 SPh2Cl-tRNA(Glu2+Leu2)aag
AAtR-8 SPh2Cl-tRNA(Glu2+Pro3)aag
AAtR-9 SPh2Cl-tRNA(Glu2+Pro2)aag
AAtR-10 SPh2Cl-tRNA(Glu2+Ala2)aag
AAtR-11 SPh2Cl-tRNA(Glu2+Ser5)cag
AAtR-12 SPh2Cl-tRNA(Glu2+Ala1B)cag
AAtR-13 SPh2Cl-tRNA(Glu2+Phe)cag
AAtR-14 SPh2Cl-tRNA(Glu2)cag
AAtR-15 SPh2Cl-tRNA(Glu2+Arg3)cag
AAtR-16 SPh2Cl-tRNA(Glu2+Val2)cag
AAtR-17 SPh2Cl-tRNA(Glu2+Leu2)cag
AAtR-18 SPh2Cl-tRNA(Glu2+Pro3)cag
AAtR-19 SPh2Cl-tRNA(Glu2+Pro2)cag
AAtR-20 SPh2Cl-tRNA(Glu2+Ala2)cag
AAtR-21 SPh2Cl-tRNA(Glu2+Ser5)agg
AAtR-22 SPh2Cl-tRNA(Glu2+Ala1B)agg
AAtR-23 SPh2Cl-tRNA(Glu2+Phe)agg
AAtR-24 SPh2Cl-tRNA(Glu2)agg
AAtR-25 SPh2Cl-tRNA(Glu2+Arg3)agg
AAtR-26 SPh2Cl-tRNA(Glu2+Val2)agg
AAtR-27 SPh2Cl-tRNA(Glu2+Leu2)agg
AAtR-28 SPh2Cl-tRNA(Glu2+Pro3)agg
AAtR-29 SPh2Cl-tRNA(Glu2+Pro2)agg
AAtR-30 SPh2Cl-tRNA(Glu2+Ala2)agg
AAtR-31 SPh2Cl-tRNA(Glu2+Ser5)cgg
AAtR-3 2SPh2Cl-tRNA(Glu2+Ala1B)cgg
AAtR-33 SPh2Cl-tRNA(Glu2+Phe)cgg
AAtR-34 SPh2Cl-tRNA(Glu2)cgg
AAtR-35 SPh2Cl-tRNA(Glu2+Arg3)cgg
AAtR-36 SPh2Cl-tRNA(Glu2+Val2)cgg
AAtR-37 SPh2Cl-tRNA(Glu2+Leu2)cgg
AAtR-38 SPh2Cl-tRNA(Glu2+Pro3)cgg
AAtR-39 SPh2Cl-tRNA(Glu2+Pro2)cgg
AAtR-40 SPh2Cl-tRNA(Glu2+Ala2)cgg
AAtR-41 SPh2Cl-tRNA(Glu2+Ser5)acc
AAtR-42 SPh2Cl-tRNA(Glu2+Ala1B)acc
AAtR-43 SPh2Cl-tRNA(Glu2+Phe)acc
AAtR-44 SPh2Cl-tRNA(Glu2)acc
AAtR-45 SPh2Cl-tRNA(Glu2+Arg3)acc
AAtR-46 SPh2Cl-tRNA(Glu2+Val2)acc
AAtR-47 SPh2Cl-tRNA(Glu2+Leu2)acc
AAtR-48 SPh2Cl-tRNA(Glu2+Pro3)acc
AAtR-49 SPh2Cl-tRNA(Glu2+Pro2)acc
AAtR-50 SPh2Cl-tRNA(Glu2+Ala2)acc
AAtR-51 SPh2Cl-tRNA(Glu2+Ser5)ccc
AAtR-52 SPh2Cl-tRNA(Glu2+Ala1B)ccc
AAtR-53 SPh2Cl-tRNA(Glu2+Phe)ccc
AAtR-54 SPh2Cl-tRNA(Glu2)ccc
AAtR-55 SPh2Cl-tRNA(Glu2+Arg3)ccc
AAtR-56 SPh2Cl-tRNA(Glu2+Val2)ccc
AAtR-57 SPh2Cl-tRNA(Glu2+Leu2)ccc
AAtR-58 SPh2Cl-tRNA(Glu2+Pro3)ccc
AAtR-59 SPh2Cl-tRNA(Glu2+Pro2)ccc
AAtR-60 SPh2Cl-tRNA(Glu2+Ala2)ccc
AAtR-61 SPh2Cl-tRNA(Asp1+Ser5)aag
AAtR-62 SPh2Cl-tRNA(Asp1+Ala1B)aag
AAtR-63 SPh2Cl-tRNA(Asp1+Phe)aag
AAtR-64 SPh2Cl-tRNA(Asp1)aag
AAtR-65 SPh2Cl-tRNA(Asp1+Arg3)aag
AAtR-66 SPh2Cl-tRNA(Asp1+Val2)aag
AAtR-67 SPh2Cl-tRNA(Asp1+Leu2)aag
AAtR-68 SPh2Cl-tRNA(Asp1+Pro3)aag
AAtR-69 SPh2Cl-tRNA(Asp1+Pro2)aag
AAtR-70 SPh2Cl-tRNA(Asp1+Ala2)aag
AAtR-71 SPh2Cl-tRNA(Asp1+Ser5)cag
AAtR-72 SPh2Cl-tRNA(Asp1+Ala1B)cag
AAtR-73 SPh2Cl-tRNA(Asp1+Phe)cag
AAtR-74 SPh2Cl-tRNA(Asp1)cag
AAtR-75 SPh2Cl-tRNA(Asp1+Arg3)cag
AAtR-76 SPh2Cl-tRNA(Asp1+Val2)cag
AAtR-77 SPh2Cl-tRNA(Asp1+Leu2)cag
AAtR-78 SPh2Cl-tRNA(Asp1+Pro3)cag
AAtR-79 SPh2Cl-tRNA(Asp1+Pro2)cag
AAtR-80 SPh2Cl-tRNA(Asp1+Ala2)cag
AAtR-81 SPh2Cl-tRNA(AsnE2)aag
AAtR-82 SPh2Cl-tRNA(AsnE2+Ala1B)aag
AAtR-83 SPh2Cl-tRNA(AsnE2+Phe)aag
AAtR-84 SPh2Cl-tRNA(AsnE2+Glu2)aag
AAtR-85 SPh2Cl-tRNA(AsnE2+Arg3)aag
AAtR-86 SPh2Cl-tRNA(AsnE2+Val2)aag
AAtR-87 SPh2Cl-tRNA(AsnE2+Leu2)aag
AAtR-88 SPh2Cl-tRNA(AsnE2+Pro3)aag
AAtR-89 SPh2Cl-tRNA(AsnE2+Pro2)aag
AAtR-90 SPh2Cl-tRNA(AsnE2+Ala2)aag
AAtR-91 SPh2Cl-tRNA(AsnE2)cag
AAtR-92 SPh2Cl-tRNA(AsnE2+Ala1B)cag
AAtR-93 SPh2Cl-tRNA(AsnE2+Phe)cag
AAtR-94 SPh2Cl-tRNA(AsnE2+Glu2)cag
AAtR-95 SPh2Cl-tRNA(AsnE2+Arg3)cag
AAtR-96 SPh2Cl-tRNA(AsnE2+Val2)cag
AAtR-97 SPh2Cl-tRNA(AsnE2+Leu2)cag
AAtR-98 SPh2Cl-tRNA(AsnE2+Pro3)cag
AAtR-99 SPh2Cl-tRNA(AsnE2+Pro2)cag
AAtR-100 SPh2Cl-tRNA(AsnE2+Ala2)cag
AAtR-101 SPh2Cl-tRNA(Glu2)gcc
AAtR-102 SPh2Cl-tRNA(Glu2+Leu2)gcc
AAtR-103 SPh2Cl-tRNA(Glu2+Pro3)gcc
AAtR-104 MeHph-tRNA(Glu2)aag
AAtR-105 MeHph-tRNA(Glu2)cag
AAtR-106 MeHph-tRNA(Glu2)agg
AAtR-107 MeHph-tRNA(Glu2)cgg
AAtR-108 MeHph-tRNA(Glu2)acc
AAtR-109 MeHph-tRNA(Glu2)ccc
AAtR-110 MeHph-tRNA(Asp1)aag
AAtR-111 MeHph-tRNA(Asp1)cag
AAtR-112 MeHph-tRNA(AsnE2)aag
AAtR-113 MeHph-tRNA(AsnE2)cag
AAtR-114 MeHph-tRNA(Glu2) ucc
AAtR-115 Pic2-tRNA(Glu2)acc
AAtR-116 Pic2-tRNA(Glu2+Leu2)acc
AAtR-117 Pic2-tRNA(Glu2+Pro3)acc
AAtR-118 Pic2-tRNA(Glu2+Ala2)acc
AAtR-119 MeG-tRNA(Glu2)acc
AAtR-120 MeG-tRNA(Glu2+Leu2)acc
AAtR-121 MeG-tRNA(Glu2+Pro3)acc
AAtR-122 MeG-tRNA(Glu2+Ala2)acc
AAtR-123 dA-tRNA(Glu2)acc
AAtR-124 dA-tRNA(Glu2+Leu2)acc
AAtR-125 dA-tRNA(Glu2+Pro3)acc
AAtR-126 dA-tRNA(Glu2+Ala2)acc
AAtR-127 nBuG-tRNA(Glu2)ccc
AAtR-129 MeG-tRNA(Glu2)agg
AAtR-130 MeG-tRNA(Glu2)cgg
AAtR-131 nBuG-tRNA(Asp1+Leu2)aag
AAtR-132 SPh2Cl-tRNA(Asp1+Leu2)uag
AAtR-133 SPh2Cl-tRNA(Asp1+Leu2) Lag
AAtR-134 dA-tRNA(Asp1+Leu2)cag
AAtR-135 nBuG-tRNA(AsnE2+Leu2)aag
AAtR-136 SPh2Cl-tRNA(AsnE2+Leu2)uag
AAtR-137 SPh2Cl-tRNA(AsnE2+Leu2)Lag
AAtR-138 dA-tRNA(AsnE2+Leu2)cag
아미노아실 pCpA를 이용한 개시 아미노아실 tRNA의 조제
25μM 전사 tRNA(fMet)cau-CA(TR-105), 50mM HEPES-KOH pH7.5, 20mM MgCl2, 1mM ATP, 0.6Unit/μL T4 RNA 리가제(New England bio lab사), 0.25mM 아미노아실 pCpA(MT01)가 되도록, 뉴클레아제 프리수로 메스업한 반응액을 조제하고, 15℃에서 45분간 라이게이션 반응을 행했다. T4 RNA 리가제 및 아미노아실 pCpA를 가하기 전의 반응액은, 95℃에서 2분간 가열 후, 실온에서 5분 방치하여, 미리 tRNA의 리폴딩을 행했다.
라이게이션 반응액에, 아세트산 나트륨을 0.3M이 되도록 가하고, 페놀·클로로폼 추출을 행하여, 개시 아미노아실 tRNA(AAtR-128)를 조제했다. AAtR-128은 에탄올 침전에 의해 회수하고, 번역 혼합물에 첨가하기 전에 1mM 아세트산 나트륨 수용액에 용해했다.
AAtR-128 BdpFL-Phe-tRNA(fMet)cau
실시예 5 mRNA의 조제
주형 DNA(MD-1∼MD-8)로부터, RiboMAX Large Scale RNA production System T7(Promega사, P1300)을 이용한 in vitro 전사 반응에 의해 주형 mRNA(MR-1∼MR-8)를 합성하고, RNeasy mini kit(Qiagen사)에 의해 정제했다.
주형 DNA 서열 번호: 221(MD-1)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTTTTATTATTGGTTTTcttATTATTCCGATTGGTTAAGCTTCG
주형 DNA 서열 번호: 222(MD-2)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTTTTATTATTGGTTTTctgATTATTCCGATTGGTTAAGCTTCG
주형 DNA 서열 번호: 223(MD-3)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTTTTATTATTGGTTTTcctATTATTGCTATTGGTTAAGCTTCG
주형 DNA 서열 번호: 224(MD-4)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTTTTATTATTGGTTTTccgATTATTGCTATTGGTTAAGCTTCG
주형 DNA 서열 번호: 225(MD-5)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTTTTATTATTCTATTTggtATTATTCCGATTCTATAAGCTTCG
주형 DNA 서열 번호: 226(MD-6)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTTTTATTATTCTATTTgggATTATTCCGATTCTATAAGCTTCG
주형 DNA 서열 번호: 227(MD-7)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTTTTATTATTCTATTTggaATTATTCCGATTCTATAAGCTTCG
주형 DNA 서열 번호: 228(MD-8)
DNA 서열:
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTTTTATTATTGGTTTTctaATTATTCCGATTGGTTAAGCTTCG
주형 mRNA 서열 번호: 229(MR-1)
RNA 서열:
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGACUUUUAUUAUUGGUUUUcuuAUUAUUCCGAUUGGUUAAGCUUCG
주형 mRNA 서열 번호: 230(MR-2)
RNA 서열:
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGACUUUUAUUAUUGGUUUUcugAUUAUUCCGAUUGGUUAAGCUUCG
주형 mRNA 서열 번호: 231(MR-3)
RNA 서열:
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGACUUUUAUUAUUGGUUUUccuAUUAUUGCUAUUGGUUAAGCUUCG
주형 mRNA 서열 번호: 232(MR-4)
RNA 서열:
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGACUUUUAUUAUUGGUUUUccgAUUAUUGCUAUUGGUUAAGCUUCG
주형 mRNA 서열 번호: 233(MR-5)
RNA 서열:
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGACUUUUAUUAUUCUAUUUgguAUUAUUCCGAUUCUAUAAGCUUCG
주형 mRNA 서열 번호: 234(MR-6)
RNA 서열:
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGACUUUUAUUAUUCUAUUUgggAUUAUUCCGAUUCUAUAAGCUUCG
주형 mRNA 서열 번호: 235(MR-7)
RNA 서열
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGACUUUUAUUAUUCUAUUUggaAUUAUUCCGAUUCUAUAAGCUUCG
주형 mRNA 서열 번호: 236(MR-8)
RNA 서열:
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGACUUUUAUUAUUGGUUUUcuaAUUAUUCCGAUUGGUUAAGCUUCG
실시예 6 펩타이드의 번역 합성
실시예 6-1
tRNA의 32, 33, 37, 및 38위의 염기의 조합이 번역의 정확성에 주는 영향을 평가하기 위해서, 동일 코돈 복스 내의 상이한 코돈에 대응하는 안티코돈을 갖는 2종류의 신장 아미노아실 tRNA의 존재하에서 번역 실험을 행했다.
구체적으로는, 주형 mRNA(MR-2)를 아미노아실 tRNA(AAtR-1∼AAtR-10의 어느 것과 AAtR-105)를 이용하여, 주형 mRNA(MR-1)을 아미노아실 tRNA(AAtR-11∼AAtR-20의 어느 것과 AAtR-104)를 이용하여, 주형 mRNA(MR-4)를 아미노아실 tRNA(AAtR-21∼AAtR-30의 어느 것과 AAtR-107)를 이용하여, 주형 mRNA(MR-3)을 아미노아실 tRNA(AAtR-31∼AAtR-40의 어느 것과 AAtR-106)를 이용하여, 주형 mRNA(MR-6)을 아미노아실 tRNA(AAtR-41∼AAtR-50의 어느 것과 AAtR-109)를 이용하여, 주형 mRNA(MR-5)를 아미노아실 tRNA(AAtR-51∼AAtR-60의 어느 것과 AAtR-108)를 이용하여 번역하여, 펩타이드를 번역 합성했다. 한편, 본 명세서에 있어서, 「AAtR」과 「AATR」은 동의로 이용된다. 즉, 「AAtR-105」와 「AATR-105」는 동일한 tRNA를 나타낸다.
번역 조건 1
안티코돈 agg를 가지는 tRNA에 의한 코돈 CCG의 읽기 오류의 양을 평가하는 번역 실험을 행했다. 번역계는, 원핵생물 유래의 재구성 무세포 단백질 합성계인 PURE system을 이용했다. 구체적으로는, 번역액(1mM GTP, 1mM ATP, 20mM 크레아틴 인산, 50mM HEPES-KOH pH 7.6、100mM 아세트산 칼륨, 10mM 아세트산 마그네슘, 2mM 스페르미딘, 1mM 다이싸이오트레이톨, 1.5mg/mL E. coli MRE600(RNase 네거티브) 유래 tRNA(Roche사), 0.24μM 혹은 0.26μM EF-G, 0.24μM RF2, 0.17μM RF3, 0.5μM RRF, 3.7μM 혹은 4μg/mL 크레아틴 키나제, 2.8μM 혹은 3μg/mL 미오 키나제, 1.9unit/mL 혹은 2unit/mL 무기 피로포스파타제, 1.0μg/mL 혹은 1.1μg/mL 뉴클레오타이드이인산 키나제, 2.5μM 혹은 2.7μM IF1, 0.37μM 혹은 0.4μM IF2, 1.4μM 혹은 1.5μM IF3, 37.2μM 혹은 40μM EF-Tu, 49μM 혹은 54.1μM 혹은 54.9μM 혹은 59μM EF-Ts, 0.93μM 혹은 1μM EF-P-Lys, 0.4unit/μL RNasin(등록상표) Ribonuclease inhibitor(Promega사, N2111), 1.1μM 혹은 1.2μM 리보솜, 0.5mM PGA)에, ARS mix(0.09μM GlyRS, 0.4μM 혹은 0.97μM IleRS, 0.68μM 혹은 1.64μM PheRS, 0.16μM 혹은 0.39μM ProRS, 0.09μM 혹은 0.22μM ThrRS, 2.73μM AlaRS, 0.04μM 혹은 0.097μM LeuRS, 0.04μM SerRS, 0.02μM ValRS 중으로부터 mRNA로 코딩되어 있는 아미노산의 ARS를 선택한 것), 1μM 주형 mRNA(MR-4), 주형 mRNA에 코딩되어 있는 천연 아미노산군을 각각 0.25mM씩, 개시 아미노아실 tRNA(AAtR-128)를 10μM, 신장 아미노아실 tRNA(AAtR-21∼AAtR-30 중으로부터 어느 1개, 및 AAtR-107)를 각각 10μM이 되도록 번역 반응 혼합물에 첨가하고, 37℃에서 1시간 정치하여 번역을 행했다. 이하, 이 번역 조건을 「번역 조건 1」이라고 부르는 경우가 있다.
번역 산물로서 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:MeHph:Ile:Ile:Ala:Ile:Gly(서열 번호: 241(Pep-3) 본 명세서에 있어서, 이와 같이 아미노산을 구두점으로 단락지어 아미노산 서열을 표기하는 경우가 있다)가 번역되도록 상기 주형 mRNA를 설계했다. 아미노아실 tRNA에 의한 코돈의 읽기 오류가 일어나면 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:SPh2Cl:Ile:Ile:Ala:Ile:Gly(서열 번호: 242(Pep-4))가 번역된다.
안티코돈 cgg를 가지는 tRNA에 의한 코돈 CCU의 읽기 오류의 양을 평가하는 번역 실험을 행했다. 주형 mRNA(MR-3), 및 신장 아미노아실 tRNA(AAtR-31∼AAtR-40 중으로부터 어느 1개, 및 AAtR-106)를 사용한 것 이외에는, 상기 번역 조건 1에 따라 번역을 행했다.
올바르게 읽혀졌을 때의 번역 산물로서는, BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:MeHph:Ile:Ile:Ala:Ile:Gly(서열 번호: 241(Pep-3))가 번역되도록 상기 주형 mRNA를 설계했다. 아미노아실 tRNA에 의한 읽기 오류가 일어나면 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:SPh2Cl:Ile:Ile:Ala:Ile:Gly(서열 번호: 242(Pep-4))가 번역된다.
안티코돈 acc를 가지는 tRNA에 의한 코돈 GGG의 읽기 오류의 양을 평가하는 번역 실험을 행했다. 주형 mRNA(MR-6), 및 신장 아미노아실 tRNA(AAtR-41∼AAtR-50 중으로부터 어느 1개, 및 AAtR-109)를 사용한 것 이외에는, 상기 번역 조건 1에 따라 번역을 행했다.
올바르게 읽혀졌을 때의 번역 산물로서, BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Leu:Phe:MeHph:Ile:Ile:Pro:Ile:Leu(서열 번호: 243(Pep-5))가 번역되도록 상기 주형 mRNA를 설계했다. 아미노아실 tRNA에 의한 읽기 오류가 일어나면 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Leu:Phe:SPh2Cl:Ile:Ile:Pro:Ile:Leu(서열 번호: 244(Pep-6))가 번역된다.
안티코돈 ccc를 가지는 tRNA에 의한 코돈 GGU의 읽기 오류의 양을 평가하는 번역 실험을 행했다. 주형 mRNA(MR-5), 및 신장 아미노아실 tRNA(AAtR-51∼AAtR-60 중으로부터 어느 1개, 및 AAtR-108)를 사용한 것 이외에는, 상기 번역 조건 1에 따라 번역을 행했다.
올바르게 읽혀졌을 때의 번역 산물로서, BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Leu:Phe:MeHph:Ile:Ile:Pro:Ile:Leu(서열 번호: 243(Pep-5))가 번역되도록 상기 주형 mRNA를 설계했다. 아미노아실 tRNA에 의한 읽기 오류가 일어나면 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Leu:Phe:SPh2Cl:Ile:Ile:Pro:Ile:Leu(서열 번호: 244(Pep-6))가 번역된다.
안티코돈 aag를 가지는 tRNA에 의한 코돈 CUG의 읽기 오류의 양을 평가하는 번역 실험을 행했다. 주형 mRNA(MR-2), 및 신장 아미노아실 tRNA(AAtR-1∼AAtR-10 중으로부터 어느 1개, 및 AAtR-105)를 사용한 것 이외에는, 상기 번역 조건 1에 따라 번역을 행했다.
올바르게 읽혀졌을 때의 번역 산물로서, BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:MeHph:Ile:Ile:Pro:Ile:Gly(서열 번호: 239(Pep-1))가 번역되도록 상기 주형 mRNA를 설계했다. 아미노아실 tRNA에 의한 읽기 오류가 일어나면 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:SPh2Cl:Ile:Ile:Pro:Ile:Gly(서열 번호: 240(Pep-2))가 번역된다.
안티코돈 cag를 가지는 tRNA에 의한 코돈 CUU의 읽기 오류의 양을 평가하는 번역 실험을 행했다. 주형 mRNA(MR-1), 신장 아미노아실 tRNA(AAtR-11∼AAtR-20 중으로부터 어느 1개, 및 AAtR-104)를 사용한 것 이외에는, 상기 번역 조건 1에 따라 번역을 행했다.
올바르게 읽혀졌을 때의 번역 산물로서, BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:MeHph:Ile:Ile:Pro:Ile:Gly(서열 번호: 239(Pep-1))가 번역되도록 상기 주형 mRNA를 설계했다. 아미노아실 tRNA에 의한 읽기 오류가 일어나면 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:SPh2Cl:Ile:Ile:Pro:Ile:Gly(서열 번호: 240(Pep-2))가 번역된다.
실시예 6-2
tRNA 보디를 변경하여 실시예 6-1과 마찬가지의 실험을 행했다. 구체적으로는, 주형 mRNA(MR-2)를 아미노아실 tRNA(AAtR-61∼AAtR-70의 어느 것과 AAtR111)를 이용하여, 주형 mRNA(MR-1)을 아미노아실 tRNA(AAtR-71∼AAtR-80의 어느 것과 AAtR-110)를 이용하여, 주형 mRNA(MR-2)를 아미노아실 tRNA(AAtR-81∼AAtR-90의 어느 것과 AAtR-113)를 이용하여, 주형 mRNA(MR-1)을 아미노아실 tRNA(AAtR-91∼AAtR-100의 어느 것과 AAtR-112)를 이용하여 번역하여, 펩타이드를 번역 합성했다.
번역 조건
안티코돈 aag를 가지는 tRNA에 의한 코돈 CUG의 읽기 오류의 양을 평가하는 번역 실험을 행했다. 주형 mRNA(MR-2), 및 신장 아미노아실 tRNA(AAtR-81∼AAtR-90 중으로부터 어느 1개, 및 AAtR-113)를 사용한 것 이외에는, 상기 번역 조건 1에 따라 번역을 행했다.
올바르게 읽혀졌을 때의 번역 산물로서, BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:MeHph:Ile:Ile:Pro:Ile:Gly(서열 번호: 239(Pep-1))가 번역되도록 상기 주형 mRNA를 설계했다. 아미노아실 tRNA에 의한 읽기 오류가 일어나면 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:SPh2Cl:Ile:Ile:Pro:Ile:Gly(서열 번호: 240(Pep-2))가 번역된다.
안티코돈 cag를 가지는 tRNA에 의한 코돈 CUU의 읽기 오류의 양을 평가하는 번역 실험을 행했다. 주형 mRNA(MR-1), 및 신장 아미노아실 tRNA(AAtR-91∼AAtR-100 중으로부터 어느 1개, 및 AAtR-112)를 사용한 것 이외에는, 상기 번역 조건 1에 따라 번역을 행했다.
올바르게 읽혀졌을 때의 번역 산물로서, BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:MeHph:Ile:Ile:Pro:Ile:Gly(서열 번호: 239(Pep-1))가 번역되도록 상기 주형 mRNA를 설계했다. 아미노아실 tRNA에 의한 읽기 오류가 일어나면 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:SPh2Cl:Ile:Ile:Pro:Ile:Gly(서열 번호: 240(Pep-2))가 번역된다.
안티코돈 aag를 가지는 tRNA에 의한 코돈 CUG의 읽기 오류의 양을 평가하는 번역 실험을 행했다. 주형 mRNA(MR-2), 및 신장 아미노아실 tRNA(AAtR-61∼AAtR-70 중으로부터 어느 1개, 및 AAtR-111)를 사용한 것 이외에는, 상기 번역 조건 1에 따라 번역을 행했다.
올바르게 읽혀졌을 때의 번역 산물로서, BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:MeHph:Ile:Ile:Pro:Ile:Gly(서열 번호: 239(Pep-1))가 번역되도록 상기 주형 mRNA를 설계했다. 아미노아실 tRNA에 의한 읽기 오류가 일어나면 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:SPh2Cl:Ile:Ile:Pro:Ile:Gly(서열 번호: 240(Pep-2))가 번역된다.
안티코돈 cag를 가지는 tRNA에 의한 코돈 CUU의 읽기 오류의 양을 평가하는 번역 실험을 행했다. 주형 mRNA(MR-1), 및 신장 아미노아실 tRNA(AAtR-71∼AAtR-80 중으로부터 어느 1개, 및 AAtR-110)를 사용한 것 이외에는, 상기 번역 조건 1에 따라 번역을 행했다.
올바르게 읽혀졌을 때의 번역 산물로서, BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:MeHph:Ile:Ile:Pro:Ile:Gly(서열 번호: 239(Pep-1))가 번역되도록 상기 주형 mRNA를 설계했다. 아미노아실 tRNA에 의한 읽기 오류가 일어나면 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:SPh2Cl:Ile:Ile:Pro:Ile:Gly(서열 번호: 240(Pep-2))가 번역된다.
실시예 6-3
사용하는 코돈을 변경하여 실시예 6-1 및 6-2와 마찬가지의 실험을 행했다. 구체적으로는, 주형 mRNA(MR-7)을 아미노아실 tRNA(AAtR-44, AAtR-47 또는 AAtR-48의 어느 것과 AAtR-114)를 이용하여, 주형 mRNA(MR-7)을 아미노아실 tRNA(AAtR-101∼AAtR-103의 어느 것과 AAtR-114)를 이용하여, 주형 mRNA(MR-6)을 아미노아실 tRNA(AAtR-101∼AAtR-103의 어느 것과 AAtR-109)를 이용하여 번역하여, 펩타이드를 번역 합성했다.
번역 조건
안티코돈 acc를 가지는 tRNA에 의한 코돈 GGA의 읽기 오류의 양을 평가하는 번역 실험을 행했다. 주형 mRNA(MR-7), 및 신장 아미노아실 tRNA(AAtR-44, AAtR-47 및 AAtR-48 중으로부터 어느 1개, 및 AAtR-114)를 사용한 것 이외에는, 상기 번역 조건 1에 따라 번역을 행했다.
올바르게 읽혀졌을 때의 번역 산물로서, BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Leu:Phe:MeHph:Ile:Ile:Pro:Ile:Leu(서열 번호: 243(Pep-5))가 번역되도록 상기 주형 mRNA를 설계했다. 아미노아실 tRNA에 의한 읽기 오류가 일어나면 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Leu:Phe:SPh2Cl:Ile:Ile:Pro:Ile:Leu(서열 번호: 244(Pep-6))가 번역된다.
안티코돈 gcc를 가지는 tRNA에 의한 코돈 GGA의 읽기 오류의 양을 평가하는 번역 실험을 행했다. 주형 mRNA(MR-7), 및 신장 아미노아실 tRNA(AAtR-101∼AAtR-103 중으로부터 어느 1개, 및 AAtR-114)를 사용한 것 이외에는, 상기 번역 조건 1에 따라 번역을 행했다.
올바르게 읽혀졌을 때의 번역 산물로서, BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Leu:Phe:MeHph:Ile:Ile:Pro:Ile:Leu(서열 번호: 243(Pep-5))가 번역되도록 상기 주형 mRNA를 설계했다. 아미노아실 tRNA에 의한 읽기 오류가 일어나면 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Leu:Phe:SPh2Cl:Ile:Ile:Pro:Ile:Leu(서열 번호: 244(Pep-6))가 번역된다.
안티코돈 gcc를 가지는 tRNA에 의한 코돈 GGG의 읽기 오류의 양을 평가하는 번역 실험을 행했다. 주형 mRNA(MR-6), 및 신장 아미노아실 tRNA(AAtR-101∼AAtR-103 중으로부터 어느 1개, 및 AAtR-109)를 사용한 것 이외에는, 상기 번역 조건 1에 따라 번역을 행했다.
올바르게 읽혀졌을 때의 번역 산물로서, BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Leu:Phe:MeHph:Ile:Ile:Pro:Ile:Leu(서열 번호: 243(Pep-5))가 번역되도록 상기 주형 mRNA를 설계했다. 아미노아실 tRNA에 의한 읽기 오류가 일어나면 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Leu:Phe:SPh2Cl:Ile:Ile:Pro:Ile:Leu(서열 번호: 244(Pep-6))가 번역된다.
실시예 6-4
안티코돈의 1문자째가 수식된 tRNA(안티코돈의 1문자째의 뉴클레오타이드가 라이시딘인 tRNA)를 이용하여 실시예 6-1∼6-3과 마찬가지의 실험을 행했다. 구체적으로는, 주형 mRNA(MR-1, MR-8, 또는 MR-2)를 아미노아실 tRNA(AAtR-132 혹은 AAtR-133의 어느 것과, AAtR-131 및 AAtR-134), 또는 아미노아실 tRNA(AAtR-136 혹은 AAtR-137의 어느 것과, AAtR-135 및 AAtR-138)를 이용한 것 이외에는, 상기 번역 조건 1에 따라 번역하여, 펩타이드를 번역 합성했다. 이하의 번역 산물의 번역량을 비교했다.
BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:nBuG:Ile:Ile:Pro:Ile:Gly(서열 번호: 250(Pep-12))
BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:SPh2Cl:Ile:Ile:Pro:Ile:Gly(서열 번호: 251(Pep-13))
BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:dA:Ile:Ile:Pro:Ile:Gly(서열 번호: 252(Pep-14))
실시예 6-5
아미노산을 변경하여 실시예 6-1∼6-4와 마찬가지의 실험을 행했다. 구체적으로는, 주형 mRNA(MR-6)을 아미노아실 tRNA(AAtR-115∼AAtR-118의 어느 것과 AAtR-109, 혹은 AAtR-119∼AAtR-122의 어느 것과 AAtR-109, 혹은 AAtR-123∼AAtR-126의 어느 것과 AAtR-127)를 이용하여, 주형 mRNA(MR-4)를 아미노아실 tRNA(AAtR-21∼AAtR-30의 어느 것과 AAtR-130)를 이용하여, 주형 mRNA(MR-3)을 아미노아실 tRNA(AAtR-31∼AAtR-40의 어느 것과 AAtR-129)를 이용하여 번역하여, 펩타이드를 번역 합성했다.
번역 조건
안티코돈 acc를 가지는 tRNA에 의한 코돈 GGG의 읽기 오류의 양을 평가하는 번역 실험을 행했다. 주형 mRNA(MR-6), 및 신장 아미노아실 tRNA(AAtR-115∼AAtR-118 중으로부터 어느 1개, 및 AAtR-109)를 사용한 것 이외에는, 상기 번역 조건 1에 따라 번역을 행했다.
올바르게 읽혀졌을 때의 번역 산물로서, BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Leu:Phe:MeHph:Ile:Ile:Pro:Ile:Leu(서열 번호: 243(Pep-5))가 번역되도록 상기 주형 mRNA를 설계했다. 아미노아실 tRNA에 의한 읽기 오류가 일어나면 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Leu:Phe:Pic2:Ile:Ile:Pro:Ile:Leu(서열 번호: 245(Pep-7))가 번역된다.
안티코돈 acc를 가지는 tRNA에 의한 코돈 GGG의 읽기 오류의 양을 평가하는 번역 실험을 행했다. 주형 mRNA(MR-6), 및 신장 아미노아실 tRNA(AAtR-119∼AAtR-122 중으로부터 어느 1개, 및 AAtR-109)를 사용한 것 이외에는, 상기 번역 조건 1에 따라 번역을 행했다.
올바르게 읽혀졌을 때의 번역 산물로서, BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Leu:Phe:MeHph:Ile:Ile:Pro:Ile:Leu(서열 번호: 243(Pep-5))가 번역되도록 상기 주형 mRNA를 설계했다. 아미노아실 tRNA에 의한 읽기 오류가 일어나면 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Leu:Phe:MeG:Ile:Ile:Pro:Ile:Leu(서열 번호: 246(Pep-8))가 번역된다.
안티코돈 acc를 가지는 tRNA에 의한 코돈 GGG의 읽기 오류의 양을 평가하는 번역 실험을 행했다. 주형 mRNA(MR-6), 및 신장 아미노아실 tRNA(AAtR-123∼AAtR-126 중으로부터 어느 1개, 및 AAtR-127)를 사용한 것 이외에는, 상기 번역 조건 1에 따라 번역을 행했다.
올바르게 읽혀졌을 때의 번역 산물로서, BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Leu:Phe:nBuG:Ile:Ile:Pro:Ile:Leu(서열 번호: 247(Pep-9))가 번역되도록 상기 주형 mRNA를 설계했다. 아미노아실 tRNA에 의한 읽기 오류가 일어나면 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Leu:Phe:dA:Ile:Ile:Pro:Ile:Leu(서열 번호: 248(Pep-10))가 번역된다.
안티코돈 agg를 가지는 tRNA에 의한 코돈 CCG의 읽기 오류의 양을 평가하는 번역 실험을 행했다. 주형 mRNA(MR-4), 및 신장 아미노아실 tRNA(AAtR-21∼AAtR-30 중으로부터 어느 1개, 및 AAtR-130)를 사용한 것 이외에는, 상기 번역 조건 1에 따라 번역을 행했다.
올바르게 읽혀졌을 때의 번역 산물로서, BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:MeG:Ile:Ile:Ala:Ile:Gly(서열 번호: 249(Pep-11))가 번역되도록 상기 주형 mRNA를 설계했다. 아미노아실 tRNA에 의한 읽기 오류가 일어나면 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:SPh2Cl:Ile:Ile:Ala:Ile:Gly(서열 번호: 242(Pep-4))가 번역된다.
안티코돈 cgg를 가지는 tRNA에 의한 코돈 CCU의 읽기 오류의 양을 평가하는 번역 실험을 행했다. 주형 mRNA(MR-3), 및 신장 아미노아실 tRNA(AAtR-31∼AAtR-40 중으로부터 어느 1개, 및 AAtR-129)를 사용한 것 이외에는, 상기 번역 조건 1에 따라 번역을 행했다.
올바르게 읽혀졌을 때의 번역 산물로서, BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:MeG:Ile:Ile:Ala:Ile:Gly(서열 번호: 249(Pep-11))가 번역되도록 상기 주형 mRNA를 설계했다. 아미노아실 tRNA에 의한 읽기 오류가 일어나면 BdpF:Thr:Phe:Ile:Ile:Gly:Phe:SPh2Cl:Ile:Ile:Ala:Ile:Gly(서열 번호: 242(Pep-4))가 번역된다.
실시예 7 번역 펩타이드의 분석
실시예 6-1∼6-5의 번역 반응에 의해 얻어진 번역 산물 용액을 10배 희석하고, LC-FLR-MS의 장치를 이용하여 분석했다. 얻어진 MS 데이터로부터 대상이 되는 번역 펩타이드의 유지 시간을 동정하고, 해당 유지 시간의 형광 피크를 정량함으로써, 펩타이드 번역량을 평가했다. 한편, 별도 기재가 없는 한 정량 평가는 실시예 3에서 합성한 LCT-67을 표품으로 한 검량선을 작성하고, 상대 정량에 의해 함유량을 산출했다. 별도 기재가 없는 한 LC-MS는 하기 표 5의 Method1의 조건에 따라 분석했다. 또한, 구한 펩타이드 번역량에 기초하여, 목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율(%)을 이하의 식을 이용하여 산출했다. 본 명세서에 있어서, 올바르게 읽혀졌을 때에 얻어지는 펩타이드를, 올바르게 읽혀졌을 때의 번역 산물이나 목적물이라고 칭하는 경우가 있다.
[수학식 1]
분석 조건
결과
평가한 결과, 32, 33, 37, 및 38위의 염기의 조합을 개변한 tRNA에 의한 코돈의 읽기 오류의 비율은, 32, 33, 37 및 38위의 염기의 조합이, Ser5 서열, Ala1B 서열, 및 Phe 서열인 경우에 증가하고, Pro3 서열, Pro2 서열, Ala2 서열, Leu2 서열, Arg3 서열 및 Val2 서열인 경우에 감소한다고 하는 경향이 있었다(도 1∼도 6, 표 6∼표 11). 그 중에서도, Pro3 서열, Pro2 서열, Ala2 서열 및 Leu2 서열인 경우에 감소하는 경향이 컸다. tRNA 보디를 변경했을 경우에 대해서도, 읽기 오류의 순위에 영향은 없었다(도 7∼도 10, 표 12∼표 15). 평가하는 코돈, 및 안티코돈의 조합을 변경했을 경우에 대해서도, tRNA의 32, 33, 37 및 38위의 염기의 조합을 특정의 것으로 개변하는 것에 의한 코돈의 읽기 오류의 저감 효과가 확인되었다(도 11∼도 13, 표 16∼표 18). 아미노아실화하는 아미노산을 변경했을 경우에 대해서도, tRNA의 32, 33, 37 및 38위의 염기의 조합을 특정의 것으로 개변하는 것에 의한 읽기 오류의 저감 효과가 확인되었다(도 14∼도 18, 표 21∼표 25). 이것으로부터, tRNA의 32, 33, 37 및 38위의 염기의 조합을 개변하는 것에 의해, 코돈의 읽기 오류를 저감할 수 있음이 나타났다. 또한, tRNA의 32, 33, 37 및 38위에 관한 복수의 염기의 조합에 대해, 코돈의 읽기 오류가 일어나기 쉬움이 밝혀짐으로써, 사용하는 tRNA에 맞추어, 아미노산의 번역량을 일정 이상으로 유지하면서, 코돈의 읽기 오류를 저감하는 것과 같은 tRNA 서열의 커스터마이즈가 가능해졌다.
32, 33, 37, 및 38위의 염기의 조합이 개변되어, 안티코돈에 agg 또는 cgg를 가지는 tRNA에 의한, CCG 코돈의 나눠 읽기의 번역 결과를 아래 표에 나타냈다. 32, 33, 37 및 38위의 염기의 조합을 개변하고 있지 않는 tRNA Glu2(AAtR-24)와 비교하여, 상기 염기의 조합을 Pro2 서열, Leu2 서열, Ala2 서열, 또는 Pro3 서열로 개변한 tRNA(AAtR-27∼30)에 있어서, 코돈의 읽기 오류의 저감이 나타났다(도 1).
32, 33, 37, 및 38위의 염기의 조합이 개변되어, 안티코돈에 cgg 또는 agg를 가지는 tRNA에 의한, CCU 코돈의 나눠 읽기의 번역 결과를 아래 표에 나타냈다. 32, 33, 37 및 38위의 염기의 조합을 개변하고 있지 않는 tRNA Glu2(AAtR-34)와 비교하여, 상기 염기의 조합을 Phe 서열, Arg3 서열, Val2 서열, Pro2 서열, Leu2 서열, Ala2 서열, 또는 Pro3 서열로 개변한 tRNA(AAtR33 및 AAtR35∼40)에 있어서, 코돈의 읽기 오류의 저감이 나타나고, 특히 Pro2 서열, Leu2 서열, Ala2 서열, 또는 Pro3 서열로 개변한 tRNA에 있어서, 코돈의 읽기 오류의 저감 효과가 높았다(도 2).
32, 33, 37, 및 38위의 염기의 조합이 개변되어, 안티코돈에 acc 또는 ccc를 가지는 tRNA에 의한, GGG 코돈의 나눠 읽기의 번역 결과를 아래 표에 나타냈다. 32, 33, 37 및 38위의 염기의 조합을 개변하고 있지 않는 tRNA Glu2(AAtR-44)와 비교하여, 상기 염기의 조합을 Arg3 서열, Phe 서열, Val2 서열, Pro2 서열, Leu2 서열, Ala2 서열, 또는 Pro3 서열로 개변한 tRNA(AAtR-43 및 AAtR45∼50)에 있어서, 코돈의 읽기 오류의 저감이 나타나고, 특히 Pro2 서열, Leu2 서열, Ala2 서열, 또는 Pro3 서열로 개변한 tRNA에 있어서, 코돈의 읽기 오류의 저감 효과가 높았다(도 3).
32, 33, 37, 및 38위의 염기의 조합이 개변되어, 안티코돈에 ccc 또는 acc를 가지는 tRNA에 의한, GGU 코돈의 나눠 읽기의 번역 결과를 아래 표에 나타냈다. 32, 33, 37 및 38위의 염기의 조합을 개변하고 있지 않는 tRNA Glu2(AAtR-54)에 있어서도 코돈의 읽기 오류에 의한 펩타이드 번역량은 낮기는 했지만, 상기 염기의 조합을 Phe 서열, Ala1B 서열, Pro2 서열, Leu2 서열, Ala2 서열, Pro3 서열, Arg3 서열, 또는 Val2 서열로 개변한 tRNA(AAtR-52, AAtR-53 및, AAtR-55∼60)에 있어서도, 코돈의 읽기 오류에 의한 펩타이드 번역량은 낮게 유지되고 있어, 상기 실시예와 마찬가지의 경향이 나타났다(도 4).
32, 33, 37, 및 38위의 염기의 조합이 개변되어, 안티코돈에 cag 또는 aag를 가지는 tRNA에 의한, CUG 코돈의 번역 결과를 아래 표에 나타냈다. 32, 33, 37 및 38위의 염기의 조합을 개변하고 있지 않는 tRNA Glu2(AAtR-4)와 비교하여, 상기 염기 유래의 조합을 Pro2 서열, 또는 Pro3 서열로 개변한 tRNA(AAtR-8 및 9)에 있어서, 코돈의 읽기 오류의 저감이 나타나고, Ala2 서열에 있어서도 코돈의 읽기 오류에 의한 펩타이드 번역량은 낮게 유지되었다(도 5).
32, 33, 37, 및 38위의 염기의 조합이 개변되어, 안티코돈에 aag 또는 cag를 가지는 tRNA에 의한, CUU 코돈의 나눠 읽기의 번역 결과를 아래 표에 나타냈다. 32, 33, 37 및 38위의 염기의 조합을 개변하고 있지 않는 tRNA Glu2(AAtR-14)에 있어서도 코돈의 읽기 오류에 의한 펩타이드 번역량은 낮기는 했지만, 상기 염기 유래의 조합을 Phe 서열, Pro2 서열, Leu2 서열, Ala2 서열, Pro3 서열, Arg3 서열, 또는 Val2 서열로 개변한 tRNA(AAtR-13 및, AAtR-15∼20)에 있어서도, 코돈의 읽기 오류에 의한 펩타이드 번역량은 낮게 유지되고 있어, 상기 실시예와 마찬가지의 경향이 나타났다(도 6).
이들 결과로부터, tRNA의 32, 33, 37 및 38위의 염기의 조합이 Ser5 서열이나 Ala1B 서열인 경우에, 목적물에 대한 읽기 오류 펩타이드의 비율이 높음이 나타났다. 상기 염기의 조합으로서 Ser5 서열을 갖는 tRNA에 대해서, 32, 33, 37 및 38위의 염기의 조합을 개변하는 것에 의해, 코돈의 읽기 오류를 저감할 수 있는지를 검증하기 위해서 이하의 실험을 행했다.
32, 33, 37 및 38위의 염기의 조합이 Ser5 서열인 tRNA로서, tRNA AsnE2를 선택했다. tRNA(AsnE2) 보디를 가지고, 32, 33, 37, 및 38위의 염기의 조합이 개변되어, 안티코돈에 aag 또는 cag를 가지는 tRNA에 의한, CUG 코돈의 나눠 읽기의 번역 결과를 아래 표에 나타냈다. 32, 33, 37 및 38위의 염기의 조합을 개변하고 있지 않는 tRNA(AsnE2)(AAtR-81)와 비교하여, 상기 염기 유래의 조합을 Arg3 서열, Val2 서열, Pro2 서열, Leu2 서열, Ala2 서열, 또는 Pro3 서열로 개변한 tRNA(AAtR-85∼90)에 있어서, 코돈의 읽기 오류의 저감이 나타나고, 특히 Pro2 서열, Leu2 서열, Ala2 서열, 또는 Pro3 서열로 개변한 tRNA에 있어서, 코돈의 읽기 오류의 저감 효과가 높았다(도 7).
tRNA(AsnE2) 보디를 가지고, 32, 33, 37, 및 38위의 염기의 조합이 개변되어, 안티코돈에 cag 또는 aag를 가지는 tRNA에 의한, CUU 코돈의 나눠 읽기의 번역 결과를 아래 표에 나타냈다. 32, 33, 37 및 38위의 염기의 조합을 개변하고 있지 않는 tRNA(AsnE2)(AAtR-91)와 비교하여, 상기 염기 유래의 조합을 Arg3 서열, Val2 서열, Pro2 서열, Leu2 서열, Ala2 서열, 또는 Pro3 서열로 개변한 tRNA(AAtR-95∼100)에 있어서, 코돈의 읽기 오류의 저감이 나타나고, 특히 Pro2 서열, Leu2 서열, Ala2 서열, 또는 Pro3 서열로 개변한 tRNA에 있어서, 코돈의 읽기 오류의 저감 효과가 높았다(도 8).
이상의 결과로부터, 코돈의 읽기 오류를 일으키기 쉬운 tRNA여도, 32, 33, 37 및 38위의 염기의 조합을 개변함으로써, 코돈의 읽기 오류를 저감할 수 있음이 나타났다.
다른 tRNA 보디에 있어서의 코돈의 읽기 오류 저감 효과를 검증했다. tRNA(Asp1) 보디를 가지고, 32, 33, 37, 및 38위의 염기의 조합이 개변되어, 안티코돈에 aag 또는 cag를 가지는 tRNA에 의한, CUG 코돈의 나눠 읽기의 번역 결과를 아래 표에 나타냈다. 32, 33, 37 및 38위의 염기의 조합을 개변하고 있지 않는 tRNA(Asp1)(AAtR-64)와 비교하여, 상기 염기 유래의 조합을 Arg3 서열, Val2 서열, Pro2 서열, Leu2 서열, Ala2 서열, 또는 Pro3 서열로 개변한 tRNA(AAtR-65∼70)에 있어서, 코돈의 읽기 오류의 저감이 나타났다(도 9).
tRNA(Asp1) 보디를 가지고, 32, 33, 37, 및 38위의 염기의 조합이 개변되어, 안티코돈에 cag 또는 aag를 가지는 tRNA에 의한, CUU 코돈의 나눠 읽기의 번역 결과를 아래 표에 나타냈다. 32, 33, 37 및 38위의 염기의 조합을 개변하고 있지 않는 tRNA(Asp1)(AAtR-74)에 있어서도 코돈의 읽기 오류에 의한 펩타이드 번역량은 낮기는 했지만, 상기 염기 유래의 조합을 Phe 서열, Val2 서열, Pro2 서열, Leu2 서열, Ala2 서열, 또는 Pro3 서열로 개변한 tRNA(AAtR-76∼80)에 있어서도 코돈의 읽기 오류가 저감되고 있어, 상기 실시예와 마찬가지의 경향이 나타났다(도 10).
상기의 실시예에서 이용한 코돈과는 3문자째의 염기가 상이한 코돈을 사용했을 경우의 읽기 오류 저감 효과를 검증했다. 32, 33, 37, 및 38위의 염기의 조합이 개변되어, 안티코돈에 ucc 또는 acc를 가지는 tRNA에 의한, GGA 코돈의 나눠 읽기의 번역 결과를 아래 표에 나타냈다. 안티코돈 acc를 가지는 tRNA의 32, 33, 37 및 38위의 염기의 조합을 Leu2 서열 또는 Pro3 서열로 개변한 바, 코돈 GGA의 읽기 오류가 저감되었다(도 11).
32, 33, 37, 및 38위의 염기의 조합이 개변되어, 안티코돈에 ucc 또는 gcc를 가지는 tRNA에 의한, GGA 코돈의 나눠 읽기의 번역 결과를 아래 표에 나타냈다. 안티코돈 gcc를 가지는 tRNA의 32, 33, 37 및 38위의 염기의 조합을 Leu2 서열 또는 Pro3 서열로 개변한 바, 코돈 GGA의 읽기 오류가 저감되었다(도 12).
32, 33, 37, 및 38위의 염기의 조합이 개변되어, 안티코돈에 ccc 또는 gcc를 가지는 tRNA에 의한, GGG 코돈의 나눠 읽기의 번역 결과를 아래 표에 나타냈다. 안티코돈 gcc를 가지는 tRNA의 32, 33, 37 및 38위의 염기의 조합을 Leu2 서열 또는 Pro3 서열로 개변한 바, 코돈 GGG의 읽기 오류가 저감되었다(도 13).
이상의 결과로부터, 코돈의 3문자째의 염기의 종류에 상관 없이, 코돈의 읽기 오류 저감 효과가 인정됨이 나타났다. 이것은, 코돈 복스 내의 어느 코돈을 채용하는 경우에도, 본 개시에 의한 코돈의 읽기 오류 저감 효과가 얻어짐을 나타내는 것이다. 상이한 종류의 아미노산을 동일 코돈 복스 내에 복수 할당하도록 코돈을 리프로그래밍할 때, 사용하는 코돈에 관계 없이 본 개시에 있어서의 효과가 얻어지는 것은, 리프로그래밍의 자유도를 높일 수 있어 유익하다.
32, 33, 37, 및 38위의 염기의 조합이 개변되어, 안티코돈에 aag, uag 또는 cag를 가지는 tRNA에 의한, CUU, CUA 또는 CUG 코돈의 나눠 읽기 평가를 라이시딘 수식 유무의 조건에서 행했다. tRNA 보디로서 tRNA(Asp1+Leu2) 및 tRNA(AsnE2+Leu2)를 사용했다. 번역 결과를 아래 표에 나타냈다. tRNA에 대한 수식 기술과 조합 가능함이 나타났다. 한편, 정량 평가는 LCT-12를 표품으로 한 검량선을 작성하고, 상대 정량에 의해 함유량을 산출했다. LC-MS는 표 5의 Method2 조건에 따라 분석했다.
아미노산의 종류를 바꾸어, 코돈의 읽기 오류 저감 효과를 검증했다. 32, 33, 37, 및 38위의 염기의 조합이 개변되어, 안티코돈에 acc 또는 ccc를 가지는 tRNA에 의한, GGG 코돈의 나눠 읽기의 번역 결과를 아래 표에 나타냈다. 32, 33, 37 및 38위의 염기의 조합을 Leu2 서열, Ala2 서열, 또는 Pro3 서열로 개변한 tRNA에 있어서, 코돈의 읽기 오류의 저감이 나타났다(도 14).
32, 33, 37, 및 38위의 염기의 조합이 개변되어, 안티코돈에 acc 또는 ccc를 가지는 tRNA에 의한, GGG 코돈의 나눠 읽기의 번역 결과를 아래 표에 나타냈다. 32, 33, 37 및 38위의 염기의 조합을 Leu2 서열, Ala2 서열, 또는 Pro3 서열로 개변한 tRNA에 있어서, 코돈의 읽기 오류의 저감이 나타났다(도 15).
32, 33, 37, 및 38위의 염기의 조합이 개변되어, 안티코돈에 acc 또는 ccc를 가지는 tRNA에 의한, GGG 코돈의 나눠 읽기의 번역 결과를 아래 표에 나타냈다. 32, 33, 37 및 38위의 염기의 조합을 Leu2 서열, Ala2 서열, 또는 Pro3 서열로 개변한 tRNA에 있어서, 코돈의 읽기 오류의 저감이 나타났다(도 16).
32, 33, 37, 및 38위의 염기의 조합이 개변되어, 안티코돈에 cgg 또는 agg를 가지는 tRNA에 의한, CCG 코돈의 나눠 읽기의 번역 결과를 아래 표에 나타냈다. 32, 33, 37 및 38위의 염기의 조합을 Pro2 서열, Leu2 서열, Ala2 서열, 또는 Pro3 서열로 개변한 tRNA에 있어서, 코돈의 읽기 오류의 저감이 나타났다(도 17).
32, 33, 37, 및 38위의 염기의 조합이 개변되어, 안티코돈에 agg 또는 cgg를 가지는 tRNA에 의한, CCU 코돈의 나눠 읽기의 번역 결과를 아래 표에 나타냈다. 32, 33, 37 및 38위의 염기의 조합을 Phe 서열, Pro2 서열, Leu2 서열, Ala2 서열, Pro3 서열, Arg3 서열 또는 Val2 서열로 개변한 tRNA에 있어서, 코돈의 읽기 오류의 저감이 나타나고, 그 중에서도 Pro2 서열, Leu2 서열, Ala2 서열, 및 Pro3 서열에 있어서 그 효과가 현저했다(도 18).
이상의 결과로부터, tRNA에 결합하고 있는 아미노산의 종류를 바꾸어도 마찬가지의 효과가 얻어짐이 나타났다. 따라서, tRNA에 결합하고 있는 아미노산의 종류에 상관 없이, 또한, 아미노산의 조합에 상관 없이, 코돈의 읽기 오류 저감 효과가 얻어짐이 나타났다.
전술한 발명은, 명확한 이해를 돕는 목적 아래, 실례 및 예시를 이용하여 상세히 기재했지만, 본 명세서에 있어서의 기재 및 예시는, 본 발명의 범위를 한정하는 것이라고 해석되어서는 안 된다. 본 명세서에서 인용한 모든 특허문헌 및 과학 문헌의 개시는, 그 전체에 걸쳐서, 참조에 의해 명시적으로 본 명세서에 원용할 수 있다.
본 개시에 있어서의 번역용 조성물 및 펩타이드의 제조 방법 등을 사용하는 것에 의해, 펩타이드를 핵산으로부터 번역하여 합성할 때에, tRNA에 의한 코돈의 읽기 오류에 기인하여 의도하지 않은 아미노산이 잘못되게 번역되어 버리는 비율을 저감할 수 있다. 본 개시에 있어서의 조성물 및 방법 등은, 특히 펩타이드의 번역 합성의 분야에 있어서 유용하다.
SEQUENCE LISTING
<110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA
<120> Composition for translation, and method for producing peptide
<130> C1-A2016P
<150> PCT/JP2019/051241
<151> 2019-12-26
<150> JP 2020-109292
<151> 2020-06-25
<160> 324
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 95
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 1
ggcgtaatac gactcactat agtccccttc gtctagaggc ccaggacacc gccctaagaa 60
ggcggtaaca ggggttcgaa tcccctaggg gacgc 95
<210> 2
<211> 95
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 2
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<210> 3
<211> 95
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 3
ggcgtaatac gactcactat agtccccttc gtctagaggc ccaggacacc gccttaagaa 60
ggcggtaaca ggggttcgaa tcccctaggg gacgc 95
<210> 4
<211> 95
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 4
ggcgtaatac gactcactat agtccccttc gtctagaggc ccaggacacc gccctaagac 60
ggcggtaaca ggggttcgaa tcccctaggg gacgc 95
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<211> 95
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 5
ggcgtaatac gactcactat agtccccttc gtctagaggc ccaggacacc gccctaagga 60
ggcggtaaca ggggttcgaa tcccctaggg gacgc 95
<210> 6
<211> 95
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 6
ggcgtaatac gactcactat agtccccttc gtctagaggc ccaggacacc gccttaagat 60
ggcggtaaca ggggttcgaa tcccctaggg gacgc 95
<210> 7
<211> 95
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
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<223> an artificially synthesized sequence
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<223> an artificially synthesized sequence
<400> 73
ggcgtaatac gactcactat aggagcggta gttcagtcgg ttagaatacc tgcttcagaa 60
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 74
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ggcgtaatac gactcactat aggagcggta gttcagtcgg ttagaatacc tgcctcagga 60
gcagggggtc gcgggttcga gtcccgtccg ttccgc 96
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<211> 96
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 76
ggcgtaatac gactcactat aggagcggta gttcagtcgg ttagaatacc tgcttcagat 60
gcagggggtc gcgggttcga gtcccgtccg ttccgc 96
<210> 77
<211> 96
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 77
ggcgtaatac gactcactat aggagcggta gttcagtcgg ttagaatacc tgcttcaggt 60
gcagggggtc gcgggttcga gtcccgtccg ttccgc 96
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<211> 96
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 78
ggcgtaatac gactcactat aggagcggta gttcagtcgg ttagaatacc tgcttcagga 60
gcagggggtc gcgggttcga gtcccgtccg ttccgc 96
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<212> DNA
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<223> an artificially synthesized sequence
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ggcgtaatac gactcactat aggagcggta gttcagtcgg ttagaatacc tgcatcaggt 60
gcagggggtc gcgggttcga gtcccgtccg ttccgc 96
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<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 80
ggcgtaatac gactcactat aggagcggta gttcagtcgg ttagaatacc tgcatcagat 60
gcagggggtc gcgggttcga gtcccgtccg ttccgc 96
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<211> 95
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 81
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<211> 95
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<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 82
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 83
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ccgtatgtca ctggttcgag tccagtcaga gccgc 95
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<211> 95
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 84
ggcgtaatac gactcactat aggctctgta gttcagtcgg tagaacggcg gactaagact 60
ccgtatgtca ctggttcgag tccagtcaga gccgc 95
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<211> 95
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 85
ggcgtaatac gactcactat aggctctgta gttcagtcgg tagaacggcg gactaaggat 60
ccgtatgtca ctggttcgag tccagtcaga gccgc 95
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<211> 95
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<223> an artificially synthesized sequence
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ccgtatgtca ctggttcgag tccagtcaga gccgc 95
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<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 88
ggcgtaatac gactcactat aggctctgta gttcagtcgg tagaacggcg gattaaggat 60
ccgtatgtca ctggttcgag tccagtcaga gccgc 95
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 89
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ccgtatgtca ctggttcgag tccagtcaga gccgc 95
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<220>
<223> an artificially synthesized sequence
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ggcgtaatac gactcactat aggctctgta gttcagtcgg tagaacggcg gaataagatt 60
ccgtatgtca ctggttcgag tccagtcaga gccgc 95
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<211> 95
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
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ggcgtaatac gactcactat aggctctgta gttcagtcgg tagaacggcg gattcagact 60
ccgtatgtca ctggttcgag tccagtcaga gccgc 95
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<211> 95
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 93
ggcgtaatac gactcactat aggctctgta gttcagtcgg tagaacggcg gattcagaat 60
ccgtatgtca ctggttcgag tccagtcaga gccgc 95
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<211> 95
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 94
ggcgtaatac gactcactat aggctctgta gttcagtcgg tagaacggcg gactcagact 60
ccgtatgtca ctggttcgag tccagtcaga gccgc 95
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
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ggcgtaatac gactcactat aggctctgta gttcagtcgg tagaacggcg gactcaggat 60
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<223> an artificially synthesized sequence
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<223> an artificially synthesized sequence
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ccgtatgtca ctggttcgag tccagtcaga gccgc 95
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<223> an artificially synthesized sequence
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ggcgtaatac gactcactat aggctctgta gttcagtcgg tagaacggcg gaatcagatt 60
ccgtatgtca ctggttcgag tccagtcaga gccgc 95
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 101
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ggcggtaaca ggggttcgaa tcccctaggg gacgc 95
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 102
ggcgtaatac gactcactat agtccccttc gtctagaggc ccaggacacc gccttgccgt 60
ggcggtaaca ggggttcgaa tcccctaggg gacgc 95
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<211> 95
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 103
ggcgtaatac gactcactat agtccccttc gtctagaggc ccaggacacc gccttgccga 60
ggcggtaaca ggggttcgaa tcccctaggg gacgc 95
<210> 104
<211> 95
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 104
ggcgtaatac gactcactat agtccccttc gtctagaggc ccaggacacc gcccttccac 60
ggcggtaaca ggggttcgaa tcccctaggg gacgc 95
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 105
ggcgtaatac gactcactat aggcggggtg gagcagcctg gtagctcgtc gggctcataa 60
cccgaagatc gtcggttcaa atccggcccc cgcaac 96
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<211> 96
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 106
ggcgtaatac gactcactat aggagcggta gttcagtcgg ttagaatacc tgctttaggt 60
gcagggggtc gcgggttcga gtcccgtccg ttccgc 96
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<211> 95
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 107
ggcgtaatac gactcactat aggctctgta gttcagtcgg tagaacggcg gatttaggtt 60
ccgtatgtca ctggttcgag tccagtcaga gccgc 95
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 108
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<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 109
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg ccuuaagacg gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
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<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 110
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg ccuuaagaag gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
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<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 111
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg cccuaagacg gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
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<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 112
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg cccuaaggag gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
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<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 113
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg ccuuaagaug gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 114
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 114
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg ccuuaaggug gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 115
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 115
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg ccuuaaggag gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
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<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 116
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg ccauaaggug gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
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<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 117
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg ccauaagaug gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 118
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 118
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg cccucagaag gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
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<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 119
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg ccuucagacg gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 120
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 120
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg ccuucagaag gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 121
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 121
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg cccucagacg gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
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<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 122
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg cccucaggag gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 123
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 123
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg ccuucagaug gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 124
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 124
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg ccuucaggug gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 125
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 125
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg ccuucaggag gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
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<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 126
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg ccaucaggug gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 127
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 127
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg ccaucagaug gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 128
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 128
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg cccuaggaag gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 129
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 129
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg ccuuaggacg gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 130
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 130
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg ccuuaggaag gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 131
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 131
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg cccuaggacg gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 132
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 132
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg cccuagggag gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 133
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 133
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg ccuuaggaug gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 134
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 134
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg ccuuagggug gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 135
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 135
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg ccuuagggag gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 136
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 136
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg ccauagggug gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 137
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 137
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg ccauaggaug gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 138
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 138
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg cccucggaag gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 139
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 139
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg ccuucggacg gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 140
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 140
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg ccuucggaag gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 141
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 141
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg cccucggacg gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 142
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 142
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg cccucgggag gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 143
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 143
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg ccuucggaug gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 144
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 144
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg ccuucgggug gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 145
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 145
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg ccuucgggag gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 146
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 146
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg ccaucgggug gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 147
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 147
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg ccaucggaug gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 148
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 148
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg cccuaccaag gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 149
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 149
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg ccuuaccacg gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 150
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 150
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg ccuuaccaag gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 151
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 151
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg cccuaccacg gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 152
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 152
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg cccuaccgag gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 153
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 153
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg ccuuaccaug gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 154
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 154
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg ccuuaccgug gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 155
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 155
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg ccuuaccgag gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 156
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 156
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg ccauaccgug gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 157
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 157
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg ccauaccaug gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 158
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 158
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg cccucccaag gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 159
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 159
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg ccuucccacg gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 160
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 160
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg ccuucccaag gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 161
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 161
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg cccucccacg gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 162
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 162
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg cccucccgag gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 163
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 163
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg ccuucccaug gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 164
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 164
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg ccuucccgug gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 165
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 165
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg ccuucccgag gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 166
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 166
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg ccaucccgug gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 167
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 167
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg ccaucccaug gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 168
<211> 75
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 168
ggagcgguag uucagucggu uagaauaccu gccuaagaag cagggggucg cggguucgag 60
ucccguccgu uccgc 75
<210> 169
<211> 75
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 169
ggagcgguag uucagucggu uagaauaccu gcuuaagacg cagggggucg cggguucgag 60
ucccguccgu uccgc 75
<210> 170
<211> 75
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 170
ggagcgguag uucagucggu uagaauaccu gcuuaagaag cagggggucg cggguucgag 60
ucccguccgu uccgc 75
<210> 171
<211> 75
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 171
ggagcgguag uucagucggu uagaauaccu gccuaagacg cagggggucg cggguucgag 60
ucccguccgu uccgc 75
<210> 172
<211> 75
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 172
ggagcgguag uucagucggu uagaauaccu gccuaaggag cagggggucg cggguucgag 60
ucccguccgu uccgc 75
<210> 173
<211> 75
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 173
ggagcgguag uucagucggu uagaauaccu gcuuaagaug cagggggucg cggguucgag 60
ucccguccgu uccgc 75
<210> 174
<211> 75
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 174
ggagcgguag uucagucggu uagaauaccu gcuuaaggug cagggggucg cggguucgag 60
ucccguccgu uccgc 75
<210> 175
<211> 75
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 175
ggagcgguag uucagucggu uagaauaccu gcuuaaggag cagggggucg cggguucgag 60
ucccguccgu uccgc 75
<210> 176
<211> 75
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 176
ggagcgguag uucagucggu uagaauaccu gcauaaggug cagggggucg cggguucgag 60
ucccguccgu uccgc 75
<210> 177
<211> 75
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 177
ggagcgguag uucagucggu uagaauaccu gcauaagaug cagggggucg cggguucgag 60
ucccguccgu uccgc 75
<210> 178
<211> 75
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 178
ggagcgguag uucagucggu uagaauaccu gccucagaag cagggggucg cggguucgag 60
ucccguccgu uccgc 75
<210> 179
<211> 75
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 179
ggagcgguag uucagucggu uagaauaccu gcuucagacg cagggggucg cggguucgag 60
ucccguccgu uccgc 75
<210> 180
<211> 75
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 180
ggagcgguag uucagucggu uagaauaccu gcuucagaag cagggggucg cggguucgag 60
ucccguccgu uccgc 75
<210> 181
<211> 75
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 181
ggagcgguag uucagucggu uagaauaccu gccucagacg cagggggucg cggguucgag 60
ucccguccgu uccgc 75
<210> 182
<211> 75
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 182
ggagcgguag uucagucggu uagaauaccu gccucaggag cagggggucg cggguucgag 60
ucccguccgu uccgc 75
<210> 183
<211> 75
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 183
ggagcgguag uucagucggu uagaauaccu gcuucagaug cagggggucg cggguucgag 60
ucccguccgu uccgc 75
<210> 184
<211> 75
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 184
ggagcgguag uucagucggu uagaauaccu gcuucaggug cagggggucg cggguucgag 60
ucccguccgu uccgc 75
<210> 185
<211> 75
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 185
ggagcgguag uucagucggu uagaauaccu gcuucaggag cagggggucg cggguucgag 60
ucccguccgu uccgc 75
<210> 186
<211> 75
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 186
ggagcgguag uucagucggu uagaauaccu gcaucaggug cagggggucg cggguucgag 60
ucccguccgu uccgc 75
<210> 187
<211> 75
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 187
ggagcgguag uucagucggu uagaauaccu gcaucagaug cagggggucg cggguucgag 60
ucccguccgu uccgc 75
<210> 188
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 188
ggcucuguag uucagucggu agaacggcgg acuaagaauc cguaugucac ugguucgagu 60
ccagucagag ccgc 74
<210> 189
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 189
ggcucuguag uucagucggu agaacggcgg auuaagacuc cguaugucac ugguucgagu 60
ccagucagag ccgc 74
<210> 190
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 190
ggcucuguag uucagucggu agaacggcgg auuaagaauc cguaugucac ugguucgagu 60
ccagucagag ccgc 74
<210> 191
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 191
ggcucuguag uucagucggu agaacggcgg acuaagacuc cguaugucac ugguucgagu 60
ccagucagag ccgc 74
<210> 192
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 192
ggcucuguag uucagucggu agaacggcgg acuaaggauc cguaugucac ugguucgagu 60
ccagucagag ccgc 74
<210> 193
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 193
ggcucuguag uucagucggu agaacggcgg auuaagauuc cguaugucac ugguucgagu 60
ccagucagag ccgc 74
<210> 194
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 194
ggcucuguag uucagucggu agaacggcgg auuaagguuc cguaugucac ugguucgagu 60
ccagucagag ccgc 74
<210> 195
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 195
ggcucuguag uucagucggu agaacggcgg auuaaggauc cguaugucac ugguucgagu 60
ccagucagag ccgc 74
<210> 196
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 196
ggcucuguag uucagucggu agaacggcgg aauaagguuc cguaugucac ugguucgagu 60
ccagucagag ccgc 74
<210> 197
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 197
ggcucuguag uucagucggu agaacggcgg aauaagauuc cguaugucac ugguucgagu 60
ccagucagag ccgc 74
<210> 198
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 198
ggcucuguag uucagucggu agaacggcgg acucagaauc cguaugucac ugguucgagu 60
ccagucagag ccgc 74
<210> 199
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 199
ggcucuguag uucagucggu agaacggcgg auucagacuc cguaugucac ugguucgagu 60
ccagucagag ccgc 74
<210> 200
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 200
ggcucuguag uucagucggu agaacggcgg auucagaauc cguaugucac ugguucgagu 60
ccagucagag ccgc 74
<210> 201
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 201
ggcucuguag uucagucggu agaacggcgg acucagacuc cguaugucac ugguucgagu 60
ccagucagag ccgc 74
<210> 202
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 202
ggcucuguag uucagucggu agaacggcgg acucaggauc cguaugucac ugguucgagu 60
ccagucagag ccgc 74
<210> 203
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 203
ggcucuguag uucagucggu agaacggcgg auucagauuc cguaugucac ugguucgagu 60
ccagucagag ccgc 74
<210> 204
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 204
ggcucuguag uucagucggu agaacggcgg auucagguuc cguaugucac ugguucgagu 60
ccagucagag ccgc 74
<210> 205
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 205
ggcucuguag uucagucggu agaacggcgg auucaggauc cguaugucac ugguucgagu 60
ccagucagag ccgc 74
<210> 206
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 206
ggcucuguag uucagucggu agaacggcgg aaucagguuc cguaugucac ugguucgagu 60
ccagucagag ccgc 74
<210> 207
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 207
ggcucuguag uucagucggu agaacggcgg aaucagauuc cguaugucac ugguucgagu 60
ccagucagag ccgc 74
<210> 208
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 208
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg cccugccacg gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 209
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 209
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg ccuugccgug gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 210
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 210
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg ccuugccgag gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 211
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 211
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg cccuuccacg gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 212
<211> 75
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 212
ggcggggugg agcagccugg uagcucgucg ggcucauaac ccgaagaucg ucgguucaaa 60
uccggccccc gcaac 75
<210> 213
<211> 75
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 213
ggagcgguag uucagucggu uagaauaccu gcuuuaggug cagggggucg cggguucgag 60
ucccguccgu uccgc 75
<210> 214
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 214
ggcucuguag uucagucggu agaacggcgg auuuagguuc cguaugucac ugguucgagu 60
ccagucagag ccgc 74
<210> 215
<211> 75
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (35)..(35)
<223> n = lysidine (2-lysylcytidine)
<400> 215
ggagcgguag uucagucggu uagaauaccu gcuunaggug cagggggucg cggguucgag 60
ucccguccgu uccgc 75
<210> 216
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(34)
<223> n = lysidine (2-lysylcytidine)
<400> 216
ggcucuguag uucagucggu agaacggcgg auunagguuc cguaugucac ugguucgagu 60
ccagucagag ccgc 74
<210> 217
<211> 34
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 217
ggagcgguag uucagucggu uagaauaccu gcuu 34
<210> 218
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 218
aggugcaggg ggucgcgggu ucgagucccg uccguuccgc 40
<210> 219
<211> 33
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 219
ggcucuguag uucagucggu agaacggcgg auu 33
<210> 220
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 220
agguuccgua ugucacuggu ucgaguccag ucagagccgc 40
<210> 221
<211> 97
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 221
ggcgtaatac gactcactat agggttaact ttaagaagga gatatacata tgacttttat 60
tattggtttt cttattattc cgattggtta agcttcg 97
<210> 222
<211> 97
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 222
ggcgtaatac gactcactat agggttaact ttaagaagga gatatacata tgacttttat 60
tattggtttt ctgattattc cgattggtta agcttcg 97
<210> 223
<211> 97
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 223
ggcgtaatac gactcactat agggttaact ttaagaagga gatatacata tgacttttat 60
tattggtttt cctattattg ctattggtta agcttcg 97
<210> 224
<211> 97
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 224
ggcgtaatac gactcactat agggttaact ttaagaagga gatatacata tgacttttat 60
tattggtttt ccgattattg ctattggtta agcttcg 97
<210> 225
<211> 97
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 225
ggcgtaatac gactcactat agggttaact ttaagaagga gatatacata tgacttttat 60
tattctattt ggtattattc cgattctata agcttcg 97
<210> 226
<211> 97
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 226
ggcgtaatac gactcactat agggttaact ttaagaagga gatatacata tgacttttat 60
tattctattt gggattattc cgattctata agcttcg 97
<210> 227
<211> 97
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 227
ggcgtaatac gactcactat agggttaact ttaagaagga gatatacata tgacttttat 60
tattctattt ggaattattc cgattctata agcttcg 97
<210> 228
<211> 97
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 228
ggcgtaatac gactcactat agggttaact ttaagaagga gatatacata tgacttttat 60
tattggtttt ctaattattc cgattggtta agcttcg 97
<210> 229
<211> 76
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 229
ggguuaacuu uaagaaggag auauacauau gacuuuuauu auugguuuuc uuauuauucc 60
gauugguuaa gcuucg 76
<210> 230
<211> 76
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 230
ggguuaacuu uaagaaggag auauacauau gacuuuuauu auugguuuuc ugauuauucc 60
gauugguuaa gcuucg 76
<210> 231
<211> 76
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 231
ggguuaacuu uaagaaggag auauacauau gacuuuuauu auugguuuuc cuauuauugc 60
uauugguuaa gcuucg 76
<210> 232
<211> 76
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 232
ggguuaacuu uaagaaggag auauacauau gacuuuuauu auugguuuuc cgauuauugc 60
uauugguuaa gcuucg 76
<210> 233
<211> 76
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 233
ggguuaacuu uaagaaggag auauacauau gacuuuuauu auucuauuug guauuauucc 60
gauucuauaa gcuucg 76
<210> 234
<211> 76
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 234
ggguuaacuu uaagaaggag auauacauau gacuuuuauu auucuauuug ggauuauucc 60
gauucuauaa gcuucg 76
<210> 235
<211> 76
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 235
ggguuaacuu uaagaaggag auauacauau gacuuuuauu auucuauuug gaauuauucc 60
gauucuauaa gcuucg 76
<210> 236
<211> 76
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 236
ggguuaacuu uaagaaggag auauacauau gacuuuuauu auugguuuuc uaauuauucc 60
gauugguuaa gcuucg 76
<210> 237
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = BdpF
<400> 237
Xaa Thr Phe Ile Ile Gly Phe Ile Ile Ile Pro Ile Gly
1 5 10
<210> 238
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = BdpF
<400> 238
Xaa Thr Ile Phe Pro Gly Phe Ile Ile Thr Thr Gly Thr Gly Thr Gly
1 5 10 15
Thr Gly Ala
<210> 239
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = BdpF
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Xaa = MeHph
<400> 239
Xaa Thr Phe Ile Ile Gly Phe Xaa Ile Ile Pro Ile Gly
1 5 10
<210> 240
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = BdpF
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Xaa = SPh2Cl
<400> 240
Xaa Thr Phe Ile Ile Gly Phe Xaa Ile Ile Pro Ile Gly
1 5 10
<210> 241
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = BdpF
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Xaa = MeHph
<400> 241
Xaa Thr Phe Ile Ile Gly Phe Xaa Ile Ile Ala Ile Gly
1 5 10
<210> 242
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = BdpF
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Xaa = SPh2Cl
<400> 242
Xaa Thr Phe Ile Ile Gly Phe Xaa Ile Ile Ala Ile Gly
1 5 10
<210> 243
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = BdpF
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Xaa = MeHPh
<400> 243
Xaa Thr Phe Ile Ile Leu Phe Xaa Ile Ile Pro Ile Leu
1 5 10
<210> 244
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = BdpF
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Xaa = SPh2Cl
<400> 244
Xaa Thr Phe Ile Ile Leu Phe Xaa Ile Ile Pro Ile Leu
1 5 10
<210> 245
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = BdpF
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Xaa = Pic2
<400> 245
Xaa Thr Phe Ile Ile Leu Phe Xaa Ile Ile Pro Ile Leu
1 5 10
<210> 246
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = BdpF
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Xaa = MeG
<400> 246
Xaa Thr Phe Ile Ile Leu Phe Xaa Ile Ile Pro Ile Leu
1 5 10
<210> 247
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = BdpF
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Xaa = nBuG
<400> 247
Xaa Thr Phe Ile Ile Leu Phe Xaa Ile Ile Pro Ile Leu
1 5 10
<210> 248
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = BdpF
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Xaa = dA
<400> 248
Xaa Thr Phe Ile Ile Leu Phe Xaa Ile Ile Pro Ile Leu
1 5 10
<210> 249
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = BdpF
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Xaa = MeG
<400> 249
Xaa Thr Phe Ile Ile Gly Phe Xaa Ile Ile Ala Ile Gly
1 5 10
<210> 250
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = BdpF
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Xaa = nBuG
<400> 250
Xaa Thr Phe Ile Ile Gly Phe Xaa Ile Ile Pro Ile Gly
1 5 10
<210> 251
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = BdpF
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Xaa = SPh2Cl
<400> 251
Xaa Thr Phe Ile Ile Gly Phe Xaa Ile Ile Pro Ile Gly
1 5 10
<210> 252
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = BdpF
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Xaa = dA
<400> 252
Xaa Thr Phe Ile Ile Gly Phe Xaa Ile Ile Pro Ile Gly
1 5 10
<210> 253
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA Glu2 body (-CA) (32-38 = n)
<220>
<221> misc_feature
<222> (33)..(39)
<223> n is a, c, g, or u
<400> 253
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg ccnnnnnnng gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 254
<211> 75
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA Asp1 body (-CA) (32-38 = n)
<220>
<221> misc_feature
<222> (33)..(39)
<223> n is a, c, g, or u
<400> 254
ggagcgguag uucagucggu uagaauaccu gcnnnnnnng cagggggucg cggguucgag 60
ucccguccgu uccgc 75
<210> 255
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA AsnE2 body (-CA) (32-38 = n)
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(38)
<223> n is a, c, g, or u
<400> 255
ggcucuguag uucagucggu agaacggcgg annnnnnnuc cguaugucac ugguucgagu 60
ccagucagag ccgc 74
<210> 256
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA(Glu2+Leu2) body -CA
<220>
<221> misc_feature
<222> (35)..(37)
<223> n is a, c, g, or u
<400> 256
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg ccuunnngug gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 257
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA(Glu2+Pro3) body -CA
<220>
<221> misc_feature
<222> (35)..(37)
<223> n is a, c, g, or u
<400> 257
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg ccuunnngag gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 258
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA(Glu2+Pro2) body -CA
<220>
<221> misc_feature
<222> (35)..(37)
<223> n is a, c, g, or u
<400> 258
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg ccaunnngug gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 259
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA(Glu2+Ala2) body -CA
<220>
<221> misc_feature
<222> (35)..(37)
<223> n is a, c, g, or u
<400> 259
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg ccaunnnaug gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 260
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA(Glu2+Val2) body -CA
<220>
<221> misc_feature
<222> (35)..(37)
<223> n is a, c, g, or u
<400> 260
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg ccuunnnaug gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 261
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA(Glu2+Arg3) body -CA
<220>
<221> misc_feature
<222> (35)..(37)
<223> n is a, c, g, or u
<400> 261
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg cccunnngag gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgc 74
<210> 262
<211> 75
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA(Asp1+Leu2) body -CA
<220>
<221> misc_feature
<222> (35)..(37)
<223> n is a, c, g, or u
<400> 262
ggagcgguag uucagucggu uagaauaccu gcuunnngug cagggggucg cggguucgag 60
ucccguccgu uccgc 75
<210> 263
<211> 75
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA(Asp1+Pro3) body -CA
<220>
<221> misc_feature
<222> (35)..(37)
<223> n is a, c, g, or u
<400> 263
ggagcgguag uucagucggu uagaauaccu gcuunnngag cagggggucg cggguucgag 60
ucccguccgu uccgc 75
<210> 264
<211> 75
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA(Asp1+Pro2) body -CA
<220>
<221> misc_feature
<222> (35)..(37)
<223> n is a, c, g, or u
<400> 264
ggagcgguag uucagucggu uagaauaccu gcaunnngug cagggggucg cggguucgag 60
ucccguccgu uccgc 75
<210> 265
<211> 75
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA(Asp1+Ala2) body -CA
<220>
<221> misc_feature
<222> (35)..(37)
<223> n is a, c, g, or u
<400> 265
ggagcgguag uucagucggu uagaauaccu gcaunnnaug cagggggucg cggguucgag 60
ucccguccgu uccgc 75
<210> 266
<211> 75
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA(Asp1+Val2) body -CA
<220>
<221> misc_feature
<222> (35)..(37)
<223> n is a, c, g, or u
<400> 266
ggagcgguag uucagucggu uagaauaccu gcuunnnaug cagggggucg cggguucgag 60
ucccguccgu uccgc 75
<210> 267
<211> 75
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA(Asp1+Arg3) body -CA
<220>
<221> misc_feature
<222> (35)..(37)
<223> n is a, c, g, or u
<400> 267
ggagcgguag uucagucggu uagaauaccu gccunnngag cagggggucg cggguucgag 60
ucccguccgu uccgc 75
<210> 268
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA(AsnE2+Leu2) body -CA
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(36)
<223> n is a, c, g, or u
<400> 268
ggcucuguag uucagucggu agaacggcgg auunnnguuc cguaugucac ugguucgagu 60
ccagucagag ccgc 74
<210> 269
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA(AsnE2+Pro3) body -CA
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(36)
<223> n is a, c, g, or u
<400> 269
ggcucuguag uucagucggu agaacggcgg auunnngauc cguaugucac ugguucgagu 60
ccagucagag ccgc 74
<210> 270
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA(AsnE2+Pro2) body -CA
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(36)
<223> n is a, c, g, or u
<400> 270
ggcucuguag uucagucggu agaacggcgg aaunnnguuc cguaugucac ugguucgagu 60
ccagucagag ccgc 74
<210> 271
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA(AsnE2+Ala2) body -CA
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(36)
<223> n is a, c, g, or u
<400> 271
ggcucuguag uucagucggu agaacggcgg aaunnnauuc cguaugucac ugguucgagu 60
ccagucagag ccgc 74
<210> 272
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA(AsnE2+Val2) body -CA
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(36)
<223> n is a, c, g, or u
<400> 272
ggcucuguag uucagucggu agaacggcgg auunnnauuc cguaugucac ugguucgagu 60
ccagucagag ccgc 74
<210> 273
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA(AsnE2+Arg3) body -CA
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(36)
<223> n is a, c, g, or u
<400> 273
ggcucuguag uucagucggu agaacggcgg acunnngauc cguaugucac ugguucgagu 60
ccagucagag ccgc 74
<210> 274
<211> 76
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA Ala1B
<400> 274
ggggcuauag cucagcuggg agagcgccug cuuugcacgc aggaggucug cgguucgauc 60
ccgcauagcu ccacca 76
<210> 275
<211> 76
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA Ala2
<400> 275
ggggcuauag cucagcuggg agagcgcuug cauggcaugc aagaggucag cgguucgauc 60
ccgcuuagcu ccacca 76
<210> 276
<211> 77
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA Arg2
<400> 276
gcauccguag cucagcugga uagaguacuc ggcuacgaac cgagcggucg gagguucgaa 60
uccucccgga ugcacca 77
<210> 277
<211> 77
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA Arg3
<400> 277
gcgcccguag cucagcugga uagagcgcug cccuccggag gcagaggucu cagguucgaa 60
uccugucggg cgcgcca 77
<210> 278
<211> 77
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA Arg4
<400> 278
gcgcccuuag cucaguugga uagagcaacg accuucuaag ucgugggccg cagguucgaa 60
uccugcaggg cgcgcca 77
<210> 279
<211> 75
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA Arg5
<400> 279
guccucuuag uuaaauggau auaacgagcc ccuccuaagg gcuaauugca gguucgauuc 60
cugcagggga cacca 75
<210> 280
<211> 76
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA Asn
<400> 280
uccucuguag uucagucggu agaacggcgg acuguuaauc cguaugucac ugguucgagu 60
ccagucagag gagcca 76
<210> 281
<211> 77
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA Asp1
<400> 281
ggagcgguag uucagucggu uagaauaccu gccugucacg cagggggucg cggguucgag 60
ucccguccgu uccgcca 77
<210> 282
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA Cys
<400> 282
ggcgcguuaa caaagcgguu auguagcgga uugcaaaucc gucuaguccg guucgacucc 60
ggaacgcgcc ucca 74
<210> 283
<211> 77
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA fMet1
<400> 283
cgcggggugg agcagccugg uagcucgucg ggcucauaac ccgaaggucg ucgguucaaa 60
uccggccccc gcaacca 77
<210> 284
<211> 77
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA fMet2
<400> 284
cgcggggugg agcagccugg uagcucgucg ggcucauaac ccgaagaucg ucgguucaaa 60
uccggccccc gcaacca 77
<210> 285
<211> 75
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA Gln1
<400> 285
ugggguaucg ccaagcggua aggcaccggu uuuugauacc ggcauucccu gguucgaauc 60
cagguacccc agcca 75
<210> 286
<211> 75
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA Gln2
<400> 286
ugggguaucg ccaagcggua aggcaccgga uucugauucc ggcauuccga gguucgaauc 60
cucguacccc agcca 75
<210> 287
<211> 76
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA Glu2
<400> 287
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg cccuuucacg gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgcca 76
<210> 288
<211> 74
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA Gly1
<400> 288
gcgggcguag uucaauggua gaacgagagc uucccaagcu cuauacgagg guucgauucc 60
cuucgcccgc ucca 74
<210> 289
<211> 75
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA Gly2
<400> 289
gcgggcaucg uauaauggcu auuaccucag ccuuccaagc ugaugaugcg gguucgauuc 60
ccgcugcccg cucca 75
<210> 290
<211> 76
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA Gly3
<400> 290
gcgggaauag cucaguuggu agagcacgac cuugccaagg ucggggucgc gaguucgagu 60
cucguuuccc gcucca 76
<210> 291
<211> 76
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA His
<400> 291
guggcuauag cucaguuggu agagcccugg auugugauuc caguugucgu ggguucgaau 60
cccauuagcc acccca 76
<210> 292
<211> 77
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA Ile1
<400> 292
aggcuuguag cucagguggu uagagcgcac cccugauaag ggugaggucg gugguucaag 60
uccacucagg ccuacca 77
<210> 293
<211> 76
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA Ile2
<400> 293
ggccccuuag cucagugguu agagcaggcg acucauaauc gcuuggucgc ugguucaagu 60
ccagcagggg ccacca 76
<210> 294
<211> 87
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA Leu1
<400> 294
gcgaaggugg cggaauuggu agacgcgcua gcuucaggug uuaguguucu uacggacgug 60
gggguucaag uccccccccu cgcacca 87
<210> 295
<211> 87
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA Leu2
<400> 295
gccgaggugg uggaauuggu agacacgcua ccuugaggug guagugccca auagggcuua 60
cggguucaag ucccguccuc gguacca 87
<210> 296
<211> 85
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA Leu3
<400> 296
gcgggagugg cgaaauuggu agacgcacca gauuuagguu cuggcgccgc aaggugugcg 60
aguucaaguc ucgccucccg cacca 85
<210> 297
<211> 87
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA Leu4
<400> 297
gcccggaugg uggaaucggu agacacaagg gauuuaaaau cccucggcgu ucgcgcugug 60
cggguucaag ucccgcuccg gguacca 87
<210> 298
<211> 85
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA Leu5
<400> 298
gccgaagugg cgaaaucggu agacgcaguu gauucaaaau caaccguaga aauacgugcc 60
gguucgaguc cggccuucgg cacca 85
<210> 299
<211> 76
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA Lys
<400> 299
gggucguuag cucaguuggu agagcaguug acuuuuaauc aauuggucgc agguucgaau 60
ccugcacgac ccacca 76
<210> 300
<211> 77
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA Met
<400> 300
ggcuacguag cucaguuggu uagagcacau cacucauaau gaugggguca cagguucgaa 60
ucccgucgua gccacca 77
<210> 301
<211> 76
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA Phe
<400> 301
gcccggauag cucagucggu agagcagggg auugaaaauc cccguguccu ugguucgauu 60
ccgaguccgg gcacca 76
<210> 302
<211> 77
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA Pro1
<400> 302
cggugauugg cgcagccugg uagcgcacuu cguucgggac gaaggggucg gagguucgaa 60
uccucuauca ccgacca 77
<210> 303
<211> 77
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA Pro2
<400> 303
cggcacguag cgcagccugg uagcgcaccg ucauggggug ucgggggucg gagguucaaa 60
uccucucgug ccgacca 77
<210> 304
<211> 77
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA Pro3
<400> 304
cggcgaguag cgcagcuugg uagcgcaacu gguuugggac cagugggucg gagguucgaa 60
uccucucucg ccgacca 77
<210> 305
<211> 95
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA Sec
<400> 305
ggaagaucgu cgucuccggu gaggcggcug gacuucaaau ccaguugggg ccgccagcgg 60
ucccgggcag guucgacucc ugugaucuuc cgcca 95
<210> 306
<211> 88
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA Ser1
<400> 306
ggaagugugg ccgagcgguu gaaggcaccg gucuugaaaa ccggcgaccc gaaaggguuc 60
cagaguucga aucucugcgc uuccgcca 88
<210> 307
<211> 90
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA Ser2
<400> 307
ggagagaugc cggagcggcu gaacggaccg gucucgaaaa ccggaguagg ggcaacucua 60
ccggggguuc aaaucccccu cucuccgcca 90
<210> 308
<211> 93
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA Ser3
<400> 308
ggugaggugg ccgagaggcu gaaggcgcuc cccugcuaag ggaguaugcg gucaaaagcu 60
gcauccgggg uucgaauccc cgccucaccg cca 93
<210> 309
<211> 88
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA Ser5
<400> 309
ggugaggugu ccgaguggcu gaaggagcac gccuggaaag uguguauacg gcaacguauc 60
ggggguucga aucccccccu caccgcca 88
<210> 310
<211> 76
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA Thr1
<400> 310
gcugauaugg cucaguuggu agagcgcacc cuugguaagg gugagguccc caguucgacu 60
cuggguauca gcacca 76
<210> 311
<211> 76
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA Thr2
<400> 311
gccgauauag cucaguuggu agagcagcgc auucguaaug cgaaggucgu agguucgacu 60
ccuauuaucg gcacca 76
<210> 312
<211> 76
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA Thr3
<400> 312
gcugauauag cucaguuggu agagcgcacc cuugguaagg gugaggucgg caguucgaau 60
cugccuauca gcacca 76
<210> 313
<211> 76
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA Thr4
<400> 313
gccgacuuag cucaguaggu agagcaacug acuuguaauc aguaggucac caguucgauu 60
ccgguagucg gcacca 76
<210> 314
<211> 76
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA Trp
<400> 314
aggggcguag uucaauuggu agagcaccgg ucuccaaaac cggguguugg gaguucgagu 60
cucuccgccc cugcca 76
<210> 315
<211> 85
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA Tyr1
<400> 315
ggugggguuc ccgagcggcc aaagggagca gacuguaaau cugccgucau cgacuucgaa 60
gguucgaauc cuucccccac cacca 85
<210> 316
<211> 85
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA Tyr2
<400> 316
ggugggguuc ccgagcggcc aaagggagca gacuguaaau cugccgucac agacuucgaa 60
gguucgaauc cuucccccac cacca 85
<210> 317
<211> 76
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA Val1
<400> 317
gggugauuag cucagcuggg agagcaccuc ccuuacaagg agggggucgg cgguucgauc 60
ccgucaucac ccacca 76
<210> 318
<211> 77
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA Val2A
<400> 318
gcguccguag cucaguuggu uagagcacca ccuugacaug gugggggucg gugguucgag 60
uccacucgga cgcacca 77
<210> 319
<211> 77
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA Val2B
<400> 319
gcguucauag cucaguuggu uagagcacca ccuugacaug gugggggucg uugguucgag 60
uccaauugaa cgcacca 77
<210> 320
<211> 75
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNAPro1E2 body (-CA) (32-38 = n)
<220>
<221> misc_feature
<222> (33)..(39)
<223> n is a, c, g, or u
<400> 320
gggugauugg cgcagccugg uagcgcacuu cgnnnnnnnc gaagggguca gggguucgaa 60
uccccuauca cccgc 75
<210> 321
<211> 75
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNAPro1E1 body (-CA) (32-38 = n)
<220>
<221> misc_feature
<222> (33)..(39)
<223> n is a, c, g, or u
<400> 321
cggugauugg cgcagccugg uagcgcacuu cgnnnnnnnc gaagggguca gggguucgaa 60
uccccuauca ccgac 75
<210> 322
<211> 76
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA Glu2 body
<220>
<221> misc_feature
<222> (35)..(37)
<223> n is a, c, g, or u
<400> 322
guccccuucg ucuagaggcc caggacaccg cccunnnacg gcgguaacag ggguucgaau 60
ccccuagggg acgcca 76
<210> 323
<211> 76
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA AsnE2 body
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(36)
<223> n is a, c, g, or u
<400> 323
ggcucuguag uucagucggu agaacggcgg acunnnaauc cguaugucac ugguucgagu 60
ccagucagag ccgcca 76
<210> 324
<211> 77
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tRNA Asp1 body
<220>
<221> misc_feature
<222> (35)..(37)
<223> n is a, c, g, or u
<400> 324
ggagcgguag uucagucggu uagaauaccu gccunnnacg cagggggucg cggguucgag 60
ucccguccgu uccgcca 77
Claims (15)
- 제 1 아미노산이 결합한 제 1 tRNA와, 제 2 아미노산이 결합한 제 2 tRNA를 포함하는 번역용 조성물로서,
상기 제 1 tRNA의 32, 33, 37 및 38위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기의 조합이,
(1) 32U, 33U, 37G, 38A,
(2) 32A, 33U, 37G, 38U,
(3) 32A, 33U, 37A, 38U,
(4) 32U, 33U, 37G, 38U,
(5) 32U, 33U, 37A, 38U, 또는
(6) 32C, 33U, 37G, 38A
이고,
상기 제 1 tRNA 및 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 서로 상이하고,
상기 제 1 tRNA 및 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 2문자째의 염기가 동일하고,
상기 제 1 tRNA 및 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 3문자째의 염기가 동일하고,
상기 제 1 아미노산 및 상기 제 2 아미노산으로부터 선택되는 적어도 1개가 비천연 아미노산이고,
여기에서, A는 아데닌, C는 사이토신, G는 구아닌, U는 우라실인,
상기 조성물. - 제 1 항에 있어서,
상기 제 1 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 A 또는 G이고, 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 C 또는 U이거나,
상기 제 1 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 C 또는 U이고, 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 1문자째의 염기가 A 또는 G인,
조성물. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 제 1 및 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 2문자째 및 3문자째의 염기의 조합이,
(i) 2문자째에 G, 또한 3문자째에 G,
(ii) 2문자째에 A, 또한 3문자째에 G,
(iii) 2문자째에 C, 또한 3문자째에 C,
(iv) 2문자째에 G, 또한 3문자째에 C,
(v) 2문자째에 A, 또한 3문자째에 C,
(vi) 2문자째에 G, 또한 3문자째에 U,
(vii) 2문자째에 G, 또한 3문자째에 A, 또는
(viii) 2문자째에 C, 또한 3문자째에 G
인, 조성물. - 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제 1 tRNA의 tRNA 보디가 키메라 tRNA 보디인, 조성물. - 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
무세포 번역용 조성물인, 조성물. - 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 키메라 tRNA 보디가, 32, 33, 37 및 38위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기와, 그것 이외의 부위의 염기 서열의 유래가 상이한 키메라 tRNA 보디인, 조성물. - 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제 1 tRNA가 인공 tRNA인, 조성물. - 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 기재된 조성물(단, 상기 제 1 tRNA 및 상기 제 2 tRNA가 32, 33, 37 및 38위(tRNA 넘버링 규칙)에 제 1 항의 (4)에 있어서 특정되는 염기를 갖고, 1∼31위 및 39∼74위(tRNA 넘버링 규칙)에 있어서 서열 번호: 255에 기재된 염기 서열을 갖는 tRNA에 있어서의 1∼31위 및 39∼74위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기 서열을 갖는 키메라 tRNA 보디를 갖는 경우에 있어서, 상기 제 1 tRNA 및 상기 제 2 tRNA의 안티코돈의 조합이, GCG 및 CCG인 조성물, 및, CCG 및 GCG인 조성물을 제외한다).
- 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제 1 tRNA가 키메라 안티코돈 루프를 갖는 tRNA인, 조성물. - 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제 1 tRNA의 32, 33, 37 및 38위(tRNA 넘버링 규칙)의 염기의 조합이,
(1) 32U, 33U, 37G, 38A,
(2) 32A, 33U, 37G, 38U,
(3) 32A, 33U, 37A, 38U, 또는
(4) 32U, 33U, 37G, 38U
인, 조성물. - 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제 2 아미노산이 비천연 아미노산인, 조성물. - 상기 제 1 아미노산을 번역계 외에서 tRNA에 결합하는 것에 의해 상기 제 1 tRNA를 조제하는 공정, 및/또는, 상기 제 2 아미노산을 번역계 외에서 tRNA에 결합하는 것에 의해 상기 제 2 tRNA를 조제하는 공정을 포함하는, 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 기재된 조성물의 제조 방법.
- 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 기재된 조성물을 이용하여 핵산을 번역하는 것을 포함하는, 펩타이드의 제조 방법.
- 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 기재된 조성물을 이용하여 핵산을 번역하는 것을 포함하는, 상기 제 1 tRNA에 의한, 상기 제 2 tRNA의 안티코돈에 상보적인 코돈의 읽기 오류를 저감하는 방법.
- 제 1 코돈과 상보적인 안티코돈을 갖는 tRNA의 32, 33, 37 및 38위(tRNA 넘버링 규칙)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 염기를 치환하는 것을 포함하는, 상기 tRNA에 의한 제 2 코돈의 읽기 오류를 저감하는 방법으로서,
상기 제 1 코돈과 상기 제 2 코돈의 1문자째는 동일한 염기이고,
상기 제 1 코돈과 상기 제 2 코돈의 2문자째는 동일한 염기이고,
상기 제 1 코돈과 상기 제 2 코돈의 3문자째는 서로 상이한 염기인, 상기 방법.
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