TWI713889B - 胜肽化合物之環化方法 - Google Patents

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Abstract

本發明之課題為提供以往對於以往開發新藥為困難之頑固標靶(tough target)有效的新藥開發手法。且課題為提供用於達成本目的之胜肽化合物之新穎環化方法、及新穎胜肽化合物及含有此等之資料庫。
本發明之胜肽化合物之製造方法係具有環狀部之胜肽化合物之製造方法，其特徵為包含以下步驟：1)將由胺基酸殘基及/或胺基酸類似物殘基、或胺基酸殘基及/或胺基酸類似物殘基、及N末端羧酸類似物構成之非環狀之胜肽化合物，從編碼為該胜肽化合物之核酸進行轉譯而合成；該非環狀之胜肽化合物包含於C末端側的1個側鏈具有反應點之胺基酸殘基或胺基酸類似物殘基、及在N末端側具有另1個反應點之胺基酸殘基、胺基酸類似物殘基或N末端羧酸類似物；2)使N末端側之胺基酸殘基、胺基酸類似物殘基或N末端羧酸類似物之反應點、與C末端側之側鏈具有之胺基酸殘基或胺基酸類似物殘基之反應點鍵結並形成醯胺鍵或碳-碳鍵。

Description

胜肽化合物之環化方法
本發明係關於胜肽化合物之新穎的環化方法、及新穎的胜肽化合物及含有此等的資料庫。
使用中分子化合物(分子量500~2000)，創製對於蛋白-蛋白交互作用抑制、致效劑、分子伴侶(chaperon)為代表之頑固標靶(tough target)的新藥之新藥技術開發近年來受到重視。(非專利文獻1)。據推測迄今為止抗體以外的新藥創制被認為係困難之對頑固標靶(tough target)之有效抑制，為分子量500~2000之化合物亦為可行(非專利文獻2)。又，Lipinski所倡議之rule of 5之範圍外(多為超過分子量500之分子量)，以天然物為中心據報告有可製成經口劑或對於細胞內標的抑制的例子(非專利文獻3)。中分子化合物，於能夠接近頑固標靶(tough target)之點，為低分子無法達成者、於能移到細胞內之點(可製成細胞內標的新藥、可經口化)，為抗體無法達成者，於此等觀點為高價值之分子種類。
以往的低分子新藥幾乎均在分子量低於500之範圍實施，所以使用人類具有之Tough target(HTS(高效篩選)之習知之低分子化合物以來，係活性化合物(Hit)之取得困難之藥效標的之總稱。其特徵為不具有低分子能結合之深孔 (cavity)。例如：IL-6與IL-6R之鍵結抑制為代表之蛋白-蛋白相互作用抑制。此外，能製作對於RNA-蛋白相互作用抑制、核酸-核酸相互作用抑制等。)之新藥的中分子，幾乎限於天然物。以天然物為來源之藥劑，到現在據分析仍佔First In Class(FIC)化合物之30%，為有效方法。但是既知化合物全部合併有約106化合物之多樣性，故獲得活性化合物之標的受限定。又，活化合物之透膜性或代謝安定性常有困難處之場況，據認為能在低分子、抗體均不能製作新藥的區域創製新藥之能穿膜之分子種類大幅低於106。又，為了提高天然物Hit之透膜性或代謝安定性之情況，也常因須要複雜化學合成，難以用化學修飾改良。所以，許多天然物醫藥品許多係以未化學修飾直接上市。
生物新藥已實用化之體外展示(in vitro display)技術若能活用，能於短期間創製具有高多樣性之新穎高分子化合物群，但該技術要在中分子化合物開展成對於頑固標靶(tough target)之新藥，現狀為有各種極限。其極限比起已實用化之生物新藥相比，即抗體新藥，係易理解。從大規模之資料庫能製作的對抗各種標的之分子的抗體，有巨大蛋白質支架且有長的可變區域，而且由於形成二次結構、三次結構，能形成立體的多樣結構的結合面。所以，能以約1010種類之資料庫創出對於許多細胞外蛋白能強力結合.抑制之化合物。另一方面，活用生物技術獲得之中分子環狀胜肽，由於要求抗體無法達成的透膜性，所以鏈長(分子量)有限制，現狀為生物技術受限於天然型胺基酸，故立體多樣性也有極限。
能簡便地合成、化學修飾，有透膜性或代謝安定 性，且結構上為多樣且能將多數中分子於短期間製作，且能對於此等評價藥效之技術創出，其價值高。如此之技術之一候選者，可列舉上述展示庫(Display library)(展示庫)技術(能一次合成1012種化合物並評價)。能以展示庫(Display library)獲得之化合物，現狀為限於胜肽，但胜肽醫藥品為已有40種以上上市之高價值之化學物質(非專利文獻4)。環孢素A為其代表例，其係由11個殘基構成的由微生物產生之胜肽，係可經口投予之抑制細胞內標的(cyclophilin)之胜肽。胜肽一般而言代謝安定性或透膜性低，但已明白由於胜肽之環化或N-甲基化等非天然化能夠改良(非專利文獻5)。
另一方面，藉由非天然胜肽化，尤其N-甲基化等主鏈變換，會使天然胜肽之結構改變，所以，以天然胜肽作為前導(lead)化合物，維持其藥效的狀態對胜肽兼顧賦予透膜性及代謝安定性兩者而獲得臨床候選者化合物極為困難。成功例，據報告有將黏合素(integrin)抑制胜肽環化再以非天然化製成經口劑而進入臨床試驗之例(非專利文獻6)，但如此之藥劑開發係經過長研究期間的極少數之例。例如：胰島素、GLP-1(升糖素狀胜肽-1)、PTH(副甲狀腺激素)、抑鈣素等高價值之醫藥品注射劑之經口劑開發尚未成功。
近年來，有人報告包含非天然型胺基酸或羥基羧酸衍生物(非專利文獻22)之胜肽能以核糖體(ribosome)合成，故含非天然型胺基酸之展示庫(Display library)實現出現實用化的感覺。尤其，含N-甲基胺基酸之胜肽藉由PureSystem(註冊商標)等無細胞轉譯系與使非天然胺基酸結合之tRNA之活 用，能以核糖體合成之情事陸續有人報告(非專利文獻7、8，9，10，11)。也有人報告對含有1個非天然型胺基酸之展示庫(Display library)之挑戰例(非專利文獻12、13)。又，也有人報告製作出含N-甲基胺基酸之胜肽之Display之例(非專利文獻23)。
也有人探討使中分子胜肽兼顧透膜性與代謝安定性之條件。Lokey等人實施由6個胺基酸構成之環狀胜肽之脯胺酸或N-甲基化，並使用PAMPA(Parallel Artificial Membrane Permeation Assay)測定法指明對透膜性影響之因子(非專利文獻14)，且以大鼠創製了BA(生體利用率(bioavalibility))28%之胜肽(非專利文獻15)。Kessler等人實施由5個或6個胺基酸構成之環狀胜肽之N-甲基化，報告發現對於穿膜性或代謝安定性為理想之條件的評論(非專利文獻16、17)。另一方面，就一般論而言，如何的胜肽才能兼顧透膜性與代謝安定性、又或為了使多樣性更高而提高Hit創出比例所依推測來尋找分子量大(胺基酸數7以上)之中分子胜肽之寬廣之類藥性(Druglikeness)條件之例，據吾人所知並無人報告。
為了於展示庫(Display library)獲得中分子Hit化合物，環化法尚有改良空間。例如：以往於Phage Display(噬菌體展示)環化時，限於2個Cys以S-S鍵結的情況(非專利文獻18)。利用S-S鍵結之環化方法所製作之環狀胜肽由於代謝不安定，不僅血中半減期短，且於細胞內之弱酸性會造成被還原‧切斷甚至分解，經口吸收困難，且切斷而生成之SH基會與體內蛋白無規地形成共價鍵結而有表現毒性之可能等，在作為 類藥(Druglikeness)之中分子胜肽的觀點尚需要各種改良。近年來作為改良的技術，有人報告藉由均三甲苯使2個Cys環化之方法(非專利文獻19)。若使此方法，能經由安定之硫醚環化，但其效果為部分的，尚有改良空間。例如：硫醚廣泛已知易受氧化代謝。據報告會由於細胞色素P450而分解：RSCH2R'→RSH+R'CHO、或由於含黃素之單氧化酶而代謝為亞碸(非專利文獻20)。前者若生成，會成為反應性代謝物(Reactive metabolite)，故與毒性表現有關。
另一方面，作為胜肽之環化方法，也有類藥之環化法醯胺環化能達成之劃時代的報告(非專利文獻21、非專利文獻25、非專利文獻26、非專利文獻27)，但此等均為使主鏈醯胺鍵切斷，結果獲得之活性物質與胺基酸主鏈胺基生成經化學反應之結構，所以本方法不能直接作為展示庫(Display library)之環化方法。該等方法，作為環孢素A等許多天然物之主鏈之羧酸與主鏈之胺基縮合環化方法為有用。另一方面，展示庫(Display library)中，由於主鏈羧酸末端須與mRNA鍵結，故無法使用如此藉由主鏈醯胺鍵之分解產生活性物質的方法。
mRNA display目前已有2種新的環化法被提出，但尚未確立上述點已改良之Display方法。N末端之甲硫胺酸之胺基與下游(C末端側)配置之離胺酸之胺基利用戊二酸二琥珀醯亞胺酯(DSG)使交聯所為之環化方法(非專利文獻12)、或作為N末端之轉譯開始胺基酸導入具有氯乙醯基之胺基酸衍生物並於下游配置Cys而利用分子內環化反應使硫醚形成所為環化方法(非專利文獻11、專利文獻1)之情形亦為上述點之 改善不足，需要開發取代該等之新的環化方法。例如：利用2個半胱胺酸之S-S環化法，2處之胺基酸須要特定者(半胱胺酸)，但使用DSG之交聯所為之環化法，包含離胺酸會有3處胺基酸為特定者，在一定殘基數之胜肽資料庫會使結構之多樣性減少。
又，若使環化部位之結構變化，據報告具有該環化部位之胜肽帶有的活性(藥效強度)會大幅下降(非專利文獻24)。於此例，取得具有環化部位胜肽後，為了製成透膜性與代謝安定性優異之胜肽，改變其環化部位係顯示為困難。
醫藥品之開發正尋求能利用之透膜性與代謝安定性優異之具環狀部位之胜肽庫，但如此之胜肽庫之確立尚於各方面有改善空間。
【先前技術文獻】 【專利文獻】
【專利文獻1】國際公開第2008/117833號
【非專利文獻】
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為了獲得具備藥效、透膜性、代謝安定性全部特性的胜肽臨床開發化合物，據認為設計具備透膜性與代謝安定性之胜肽，使此等化合物群展示，再從其中選擇有藥效之胜肽之展示庫(Display library)技術之實現係為有效。若預先能獲得具有某個程度之透膜性與代謝安定性之活性化合物(Hit化合物)，與天然物不同，可輕易合成、化學修飾，所以能與習知rule of 5內之低分子新藥同樣維持活性化合物(Hit化合物)之結構變化小而實施結構最適化，可期待較容易創製臨床開發化合物。為了確立如此的創藥技術、方法，據認為以下2點係為必要：掌握滿足rule of 5之範圍外之中分子胜肽之類藥性(Druglikeness)(像藥之程度：本說明書，較佳為代表透膜性與代謝安定性兼具。)之條件、及構建由滿足其條件之分子群構成之含非天然型胺基酸之展示庫。
另一方面，為了有效利用中分子胜肽display之有限規模(若考慮類藥性，指胜肽鏈長有限制)，使資料庫含有多數全部相異結構之胜肽(包含非天然型胺基酸之胜肽)係為重要。導入多種側鏈性質相異之胺基酸，減少在受限之分子量之中受固定之部位而使可變區域擴大、藉由含有主鏈結構不同之胜肽而使 對各種標的獲得結合胜肽之可能性提高，有其價值。從此觀點，有效方法可舉例如：使具有各種環化部位之胜肽、分支胜肽展示等。
本發明係有鑑如此之狀況而生，本發明之課題為提供胜肽展示庫建構用之胜肽化合物之新穎環化方法、分支胜肽合成法，又，提供使用此等之類藥的展示庫及類藥的胜肽化合物。
本案發明人等為了解決上述課題進行探討，結果首次明白：對於類藥環狀胜肽為必要之條件。又，發現由滿足該條件之高多樣性之具環化部之胜肽化合物構成之展示庫之合成法。亦即，發現使用新穎轉譯方法及轉譯後修飾以合成有環化部之胜肽化合物庫之方法、及為使取得具目的活性之類藥的胜肽之可能性更高，進一步具直鏈部之胜肽化合物之資料庫之合成法，而能取得對於標的分子顯示鍵結及抑制之化合物，乃完成本發明完成。
亦即，本發明包含以下。
[1]一種具有環狀部之胜肽化合物之製造方法，包含以下步驟：1)將由胺基酸殘基及/或胺基酸類似物殘基、或胺基酸殘基及/或胺基酸類似物殘基及N末端羧酸類似物構成之非環狀之胜肽化合物從編碼為該胜肽化合物之核酸進行轉譯而合成；該非環狀之胜肽化合物包含於C末端側的1個側鏈具有反應點之胺基酸殘基或胺基酸類似物殘基、及在N末端側具 有另1個反應點之胺基酸殘基、胺基酸類似物殘基或N末端羧酸類似物；2)使N末端側之胺基酸殘基、胺基酸類似物殘基或N末端羧酸類似物之反應點、與C末端側之側鏈具有之胺基酸殘基或胺基酸類似物殘基之反應點鍵結並形成醯胺鍵或碳-碳鍵。
[2]如[1]之具有環狀部之胜肽化合物之製造方法，包含以下步驟：1)將由胺基酸殘基及/或胺基酸類似物殘基、或胺基酸殘基及/或胺基酸類似物殘基及N末端羧酸類似物構成之非環狀之胜肽化合物從編碼為該胜肽化合物之核酸進行轉譯而合成；該非環狀之胜肽化合物包含於側鏈具有活性酯基之胺基酸殘基或胺基酸類似物殘基、及在胺附近具有反應輔助基之胺基酸殘基、胺基酸類似物殘基或N末端羧酸類似物；2)使該具有反應輔助基之胺基酸殘基、胺基酸類似物殘基或N末端羧酸類似物與側鏈具有活性酯基之胺基酸殘基或胺基酸類似物殘基予以醯胺鍵結而獲得環狀化合物。
[3]如[2]之具有環狀部之胜肽化合物之製造方法，其中，活性酯為硫酯。
[4]如[2]或[3]之具有環狀部之胜肽化合物之製造方法，其中，該反應輔助基為SH基。
[5]如[3]或[4]之具有環狀部之胜肽化合物之製造方法，其中，在獲得該環狀化合物之步驟之後具有去除反應輔助基 之步驟。
[6]如[2]至[5]中任一項之具有環狀部之胜肽化合物之製造方法，其中，該胺附近具有反應輔助基之胺基酸、胺基酸類似物或N末端羧酸類似物，係以下列通式表示之化合物N-1或化合物N-2；
Figure 107130626-A0101-12-0013-1
 (式中，R1表示氫原子、S-R23(R23表示可具有取代基之烷基、芳基或芳烷基)、或HS基之保護基；R2、R3各自獨立地表示氫原子、或可具有取代基之烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基或環烷基；或R2與R3表示形成環之取代基、或R2或R3表示與R4形成環之取代基；R4表示可具有取代基之伸烷基、可具有取代基之伸芳基或可具有取代基之2價之芳烷基；R11、R12各自獨立地表示單鍵、可具有取代基之伸烷基、可具有取代基之伸芳基或可具有取代基之2價芳烷基)。
[7]如[2]至[6]中任一項之具有環狀部之胜肽化合物之製造方法，其中，該於側鏈具有活性酯基之胺基酸或胺基酸類似物係下列通式表示之化合物C-1；
Figure 107130626-A0101-12-0014-2
 (式中，R25表示OH、鹵素原子、OR、或SR1(R表示Bt、At、NSu或Pfp，R1表示氫原子、可具有取代基之烷基、可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之環烷基、可具有取代基之雜芳基、可具有取代基之烯基、可具有取代基之伸烷基)；R26表示可具有取代基之伸烷基、可具有取代基之伸芳基或可具有取代基之2價之芳烷基；R2、R3各自獨立地表示氫原子或可具有取代基之烷基)。
[8]如[1]至[7]中任一項之具有環狀部之胜肽化合物之製造方法，其中，構成該具有環狀部之胜肽化合物之環狀部之胺基酸殘基及/或胺基酸類似物殘基、或胺基酸殘基及/或胺基酸類似物殘基及N末端羧酸類似物之總數為5~12。
[9]如[1]至[8]中任一項之具有環狀部之胜肽化合物之製造方法，其中，構成該具有環狀部之胜肽化合物之胺基酸殘基及/或胺基酸類似物殘基、或胺基酸殘基及/或胺基酸類似物殘基及N末端羧酸類似物之總數為9~13。
[10]如[1]之具有環狀部之胜肽化合物之製造方法，其係包含以下步驟： 1)將由胺基酸殘基及/或胺基酸類似物殘基、或胺基酸殘基及/或胺基酸類似物殘基及N末端羧酸類似物構成之非環狀之胜肽化合物從編碼為該胜肽化合物之核酸進行轉譯而合成；該非環狀之胜肽化合物包含於側鏈具有活性酯基之胺基酸殘基或胺基酸類似物殘基、及具有N末端側之主鏈胺基之胺基酸殘基、或於主鏈或側鏈具有胺基之胺基酸類似物殘基或N末端羧酸類似物；2)使N末端之胺基酸殘基、N末端之胺基酸類似物殘基或N末端羧酸類似物與側鏈具有活性酯基之胺基酸殘基或胺基酸類似物予以醯胺鍵結獲得環狀化合物。
[11]如[10]之具有環狀部之胜肽化合物之製造方法，其中，活性酯基係烷基硫酯基或芳烷基硫酯基，且包含於步驟1)之轉譯合成後添加活化劑以變換為更有活性之活性酯基之步驟。
[12]如[11]之具有環狀部之胜肽化合物之製造方法，其中，活性劑為芳基硫醇或N-羥基琥珀醯亞胺。
[13]如[12]之具有環狀部之胜肽化合物之製造方法，其中，包含以下步驟：添加與轉譯之硫酯之反應性高的活化劑、及與環化之胺之反應性高之活化劑，以變換為活性更高之活性酯基。
[14]如[13]之具有環狀部之胜肽化合物之製造方法，其中，包含以芳基硫酯變換為活性酯基後，以肟及其衍生物變換為活性更高之酯基之步驟。
[15]如[1]至[14]中任一項之具有環狀部之胜肽化合物之製造方法，其中，步驟1)之N末端部位之轉譯合成，係使用將甲醯基甲硫胺酸以外之可轉譯之胺基酸、可轉譯之胺基酸類似物或可轉譯之N末端羧酸類似物予以醯基化而得之轉譯開始tRNA導入之方法實施。
[16]如[10]至[14]中任一項之具有環狀部之胜肽化合物之製造方法，其中，步驟1)之N末端部位之轉譯合成，係以跳讀開始密碼子，並於N末端導入Met以外之可轉譯之胺基酸、可轉譯之胺基酸類似物或可轉譯之N末端羧酸類似物之方法實施。
[17]如[10]至[14]中任一項之具有環狀部之胜肽化合物之製造方法，其中，步驟1)之N末端部位之轉譯合成，使用以胺基肽酶將N末端之胺基酸、胺基酸類似物或羧酸類似物切斷之方法實施。
[18]如[17]之具有環狀部之胜肽化合物之製造方法，其中，該N末端部位之轉譯合成，係藉由以甲硫胺酸 胺基肽酶處理以去除N末端之甲醯基Met，並且於N末端導入其他可轉譯之胺基酸、可轉譯之胺基酸類似物或可轉譯之N末端羧酸類似物之方法實施。
[19]如[10]至[14]中任一項之具有環狀部之胜肽化合物之製造方法，其中，該N末端部位之轉譯合成，係以如下方法進行：以含有正白胺酸替換Met之轉譯系轉譯，並以甲硫胺酸 胺基肽酶處理以去除N末端之甲醯基正白胺酸，並於N末端導入其他可轉譯之胺基酸、可轉譯之胺基酸類似 物或可轉譯之N末端羧酸類似物。
[20]如[17]至[19]中任一項之具有環狀部之胜肽化合物之製造方法，其中，該N末端之胺基酸、胺基酸類似物或羧酸類似物之除去更使用胜肽去甲醯基酶。
[21]如[1]至[20]中任一項之具有環狀部之胜肽化合物之製造方法，其中，該具有環狀部之胜肽化合物更具有直鏈部。
[22]如[1]至[21]中任一項之具有環狀部之胜肽化合物之製造方法，其中，該非環狀胜肽化合物包含α-羥基羧酸、及於側鏈具有可經保護之胺基之胺基酸或胺基酸類似物，於步驟2)之形成環狀化合物之步驟後，包含步驟3)將α-羥基羧酸部位與側鏈具有可經保護之胺基之胺基酸或胺基酸類似物部位進行化學反應而形成分支部位之步驟。
[23]一種形成具有環狀部與直鏈部之胜肽化合物之製造方法，其特徵為包含以下步驟：1)將由胺基酸殘基及/或胺基酸類似物殘基、或胺基酸殘基及/或胺基酸類似物殘基及N末端羧酸類似物及α-羥基羧酸構成之非環狀之胜肽化合物從編碼為該胜肽化合物之核酸進行轉譯而合成，且該非環狀之胜肽化合物係i)包含於C末端側的1個側鏈具有反應點之胺基酸殘基或胺基酸類似物殘基、及在N末端側具有另1個反應點之胺基酸殘基、胺基酸類似物殘基或N末端羧酸類似物；ii)在該i)記載之2個反應點之間於α位具有Rf5之α-羥基羧酸(Rf5從氫原子、可經取代之烷基、芳烷基、雜芳基、 環烷基、烯基、炔基選擇)、及非環狀胜肽化合物中於側鏈具有可經保護之胺基之胺基酸殘基或胺基酸類似物殘基之非環狀之胜肽化合物；2)使N末端側之胺基酸殘基、胺基酸類似物殘基或N末端羧酸類似物之反應點與C末端側之側鏈具有之胺基酸殘基或胺基酸類似物殘基之反應點鍵結之環化反應步驟；3)將步驟1)之ii)記載之α-羥基羧酸之酯鍵切斷並使產生硫酯基；4)使步驟3)產生之硫酯基與步驟1)之ii)記載之胺基鍵結之環化反應步驟。
[24]如[23]之形成具有環狀部與直鏈部之胜肽化合物之製造方法，其中，在步驟1)之ii)記載之α-羥基羧酸與側鏈具有胺基之胺基酸殘基或胺基酸類似物殘基之間所含之胺基酸殘基及/或胺基酸類似物殘基之數為7個以下。
[25]如[23]或[24]之形成具有環狀部與直鏈部之胜肽化合物之製造方法，其中，步驟1)之ii)記載之α-羥基羧酸，包含於非環狀胜肽化合物中作為Cys-Pro-α-羥基羧酸。
[26]如[23]至[25]中任一項之形成具有環狀部與直鏈部之胜肽化合物之製造方法，其中，步驟1)之i)記載之N末端側具有另1個反應點之胺基酸殘基、胺基酸類似物殘基或N末端羧酸類似物具有反應輔助基。
[27]如[23]至[26]中任一項之形成具有環狀部與直鏈部之胜肽化合物之製造方法，其中，步驟1)之i)記載之N末端側具有另1個反應點之胺基酸殘基、胺基酸類似物殘基或N 末端羧酸類似物不具反應輔助基，ii)記載之於側鏈具有胺基之胺基酸殘基或胺基酸類似物殘基之胺基具有保護基，且藉由添加活化劑會進行步驟2)之環化反應，於步驟2)之環化反應後、步驟3)之環化反應前，包含將該ii)記載之於側鏈具有胺基之胺基酸殘基或胺基酸類似物殘基之胺基之保護基除去之步驟。
[28]如[1]之具有環狀部之胜肽化合物之製造方法，其特徵為包含以下步驟：1)將由胺基酸殘基及/或胺基酸類似物殘基、或胺基酸殘基及/或胺基酸類似物殘基及N末端羧酸類似物構成之非環狀之胜肽化合物從編碼為該胜肽化合物之核酸進行轉譯而合成；該非環狀之胜肽化合物包含於側鏈之1個具有反應點之胺基酸殘基或胺基酸類似物殘基、及於N末端具有另1個反應點之胺基酸、胺基酸類似物殘基或N末端羧酸類似物；2)使N末端之胺基酸殘基、N末端之胺基酸類似物殘基或N末端羧酸類似物之反應點與側鏈具有1個反應點之胺基酸殘基或胺基酸類似物之反應點以碳-碳鍵結。
[29]如[28]之具有環狀部之胜肽化合物之製造方法，其中，包含以下步驟：選擇碳-碳雙鍵作為N末端之胺基酸殘基、N末端之胺基酸類似物殘基或N末端羧酸類似物之反應點，並選擇芳基鹵化物作為於側鏈具有1個反應點之胺基酸殘基或胺基酸類似物殘基之反應點，利用以過渡金屬作為觸媒之碳-碳鍵反應實施環化反應。
[30]如[29]之具有環狀部之胜肽化合物之製造方法，其中，以過渡金屬作為觸媒之碳-碳鍵反應，係以Pd作為觸媒之Heck型之化學反應。
[31]如[1]至[30]中任一項之方法，其中，形成該具有環狀部之胜肽化合物之環狀部之胺基酸或胺基酸類似物之合計成為5~12之位置具有用以實施環化反應之反應點。
[32]如[31]之方法，其中，該具有環狀部之胜肽化合物之胺基酸及胺基酸類似物殘基之總數為9~13。
[33]如[1]至[32]中任一項之方法，其係製造胜肽化合物之C末端與轉譯合成使用之模板經由間隙子鍵結之胜肽化合物-核酸複合體。
[34]如[33]之方法，其中，胜肽化合物-核酸複合體係以將轉譯合成使用之編碼為非環狀胜肽化合物之核酸之3'末端經由連結子鍵結有嘌呤黴素之核酸而合成。
[35]如[33]或[34]之方法，其中，間隙子為胜肽、RNA、DNA、或六乙二醇之聚合物、或該等之組合。
[36]如[1]至[35]中任一項之方法，其中，胜肽化合物係將由具有彼此互異之序列之多數核酸構成的核酸庫進行轉譯而製造。
[37]一種胜肽化合物或胜肽化合物-核酸複合體，其係利用如[1]至[36]中任一項之製造方法製作。
[38]一種資料庫，其係由具有不同結構之多數如[37]之胜肽化合物或胜肽化合物-核酸複合體構成。
[39]一種具有環狀部之胜肽化合物，其特徵為具有以下 (i)~(iv)；(i)包含由胺基酸及胺基酸類似物殘基數之合計為5~12構成的環狀部，且胺基酸及胺基酸類似物之總數為9~13、(ii)具有至少2個N取代胺基酸，且未經N取代之胺基酸至少有1個、(iii)ClogP值為6以上、(iv)形成環狀部之胺基酸或胺基酸類似物之鍵結，具有由位於胺基酸或胺基酸類似物之側鏈之活性酯基與其他胺基酸或胺基酸類似物之胺基構成的鍵結至少1個。
[40]如[39]之具有環狀部之胜肽化合物，其中，胜肽化合物所含之胺基酸及胺基酸類似物，係從將可轉譯合成之胺基酸或胺基酸類似物、或可轉譯之胺基酸或胺基酸類似物之側鏈或N取代部位進行化學修飾而獲得之胺基酸或胺基酸衍生物選出的胺基酸或胺基酸類似物。
[41]如[39]或[40]之具有環狀部之胜肽化合物，更包含由胺基酸及胺基酸類似物殘基數合計為1~8構成的直鏈部至少1個。
[42]如[39]至[41]中任一項之具有環狀部之胜肽化合物，其中，形成環狀部之胺基酸或胺基酸類似物之鍵結為醯胺鍵或碳-碳鍵。
[43]如[39]至[42]中任一項之具有環狀部之胜肽化合物，其中，環狀部包含以下列通式(I)表示之交叉單元；
Figure 107130626-A0101-12-0022-3
 (式中之記號表示以下含意；R51為可具有取代基之C1-C6烷基、C5-C10芳基、芳烷基、酯基、或式1表示之醯胺，R52為可具有取代基之C1-C6烷基、芳基、或芳烷基，R53為可具有取代基之C1-C6烷基、或氫原子、或也可R53與R51彼此鍵結並形成C3-C5之伸烷基且形成含氮原子之5員~7員環，R54為由0-8個胺基酸殘基構成之胜肽，R55為可具有取代基之C1-C6烷基、C5-C10芳基、芳烷基、酯基、可具有取代基之醯胺基，＊表示在環狀部之鍵結部位)。
[44]一種醫藥組合物，其係包含如[39]至[43]中任一項之具有環狀部之胜肽化合物。
[45]如[44]之醫藥組合物，其中，該醫藥組合物為經口劑。
[46]一種如[39]至[45]中任一項之胜肽化合物之製造方法，包含步驟(i)~(v)：(i)將胺基酸及胺基酸類似物之總數為9~13之非環狀胜肽化合物轉譯合成，形成將該非環狀胜肽化合物與具有編碼為該非環狀胜肽化合物之核酸序列之複合體經由連結子 而鍵結之非環狀胜肽化合物-核酸複合體；(ii)將於步驟(i)轉譯合成之複合體之非環狀胜肽化合物以醯胺鍵或碳-碳鍵予以環化，形成環狀部之胺基酸及胺基酸類似物之殘基數之合計成為5~12之環狀化合物；及(iii)使步驟(ii)獲得之具有環狀部之胜肽化合物-核酸複合體庫與活體內分子接觸，選擇對於該活體內分子有結合活性之複合體。
[47]如[46]之製造方法，更包含以下步驟；(iv)從該步驟(iii)選擇之複合體之核酸序列獲得胜肽化合物之序列資訊，及(v)依據該步驟(iv)獲得之序列資訊將胜肽化合物予以化學合成。
[48]如[46]或[47]之方法，其中，該非環狀胜肽化合物包含α-羥基羧酸、及於側鏈具有可經保護之胺基之胺基酸或胺基酸類似物，且於步驟(ii)之形成環狀化合物之步驟後，包含使α-羥基羧酸部位與側鏈具有胺基之胺基酸或胺基酸類似物部位化學反應而形成分支部位之步驟。
[49]如[46]至[48]中任一項之製造方法，其中，活體內分子係不具有分子量低於500之化合物能結合之區域的分子。
[50]如[46]至[49]中任一項之製造方法，其中，對於活體內分子具有結合活性之複合體，更具有抑制該活體內分子與其他活體內分子之結合的活性。
[51]如[46]至[50]中任一項之製造方法，其中，環化反應之N末端側之胺基酸或胺基酸類似物係從以該化合物N-1或 化合物N-2表示之化合物選擇之胺基酸或胺基酸類似物，且C末端側之胺基酸或胺基酸類似物係從以該化合物C-1表示之化合物選擇之胺基酸或胺基酸類似物，且在步驟(ii)之獲得環狀化合物之步驟後包含去除反應輔助基之步驟。
[52]如[46]至[51]中任一項之製造方法，其中，核酸序列於3'末端具有間隙子，且轉譯合成之胜肽化合物之C末端經由該間隙子與該核酸序列形成複合體。
[53]如[52]之製造方法，其中，胜肽化合物-核酸複合體，係使用在轉譯合成使用之編碼為非環狀胜肽化合物之核酸之3'末端經由連結子鍵結有嘌呤黴素之核酸合成。
[54]如[52]或[53]之製造方法，其中，間隙子為胜肽、RNA、DNA、或六乙二醇之聚合物。
依照本發明，提供能轉譯合成之類藥(透膜性與代謝安定性優異之)具有環狀部之胜肽化合物或具有環狀部與直鏈部之胜肽化合物、及該化合物之展示庫。又，本發明之展示庫，係富有多樣性之資料庫，故能取得針對所望標的分子之活性化合物之機率高。再者，從本發明之展示庫獲得之該活性化合物，已具有優異之透膜性與代謝安定性，故不將結構大幅變換，即能與習知之低分子化合物之想法同樣有效率地實施作為醫藥品之最適化。如此，本發明提供與至今為止已之作為醫藥品之低分子化合物或抗體相異之新醫藥品用的支架(Scaffold)，並提供有效率的創製醫藥品之新的藥品開發系統。
圖1顯示側鏈羧酸經活性酯化之胺基醯基化pdCpA化合物群之一般合成法。
圖2顯示編碼為含Glu(SBn)之胜肽序列P-1之mRNA之轉譯產物之質譜解析圖。
圖3顯示編碼為含Asp(SMe)之胜肽序列P-2之mRNA之轉譯產物之質譜解析圖。於Asp(SMe)之轉譯，檢測到從轉譯之全長胜肽已脫MeSH之化合物作為主產物(轉譯胜肽P-3)。
圖4顯示利用轉譯胜肽P-6之水解反應所為之胜肽P-4之生成。
圖5顯示不含Tyr之含硫酯之胜肽序列之轉譯。
圖6顯示不具N末端胺基之含硫酯之胜肽之轉譯合成。
圖7顯示接續側鏈經硫酯化之胺基酸之C末端側胺基酸導入有經N-烷基化之胺基酸之示範胜肽之轉譯合成。
圖8-1至8-2顯示硫酯與甘胺酸衍生物或半胱胺酸衍生物之化學反應性之比較。
圖9顯示於咪唑添加條件利用硫酯5b-1與甘胺酸衍生物之反應所為之醯胺5d-1之合成。
圖10顯示半胱胺酸衍生物之胺基醯基化pdCpA之一般的合成法。
圖11顯示半胱胺酸衍生物之胺基醯基化pdCpA之合成例。
圖12顯示將Cys(StBu)作為N末端之胜肽轉譯合成。
圖13顯示於化合物2n-A及化合物2e-A於轉譯模擬液中之安定性。
圖14顯示積極活用開始密碼跳讀(Initiation read-through)之N末端Cys之有效率的轉譯導入。
圖15-1至15-2顯示Cys正後之第3位之密碼子所編碼之各種胺基酸而得之轉譯產物之質譜(P-15：Phe,P-16：Leu)。
圖16-1至16-2顯示Cys正後之第3位之密碼子所編碼之各種胺基酸而得之轉譯產物之質譜(P-17：Tyr,P-18：Cys)。
圖17-1至17-2顯示Cys正後之第3位之密碼子所編碼之各種胺基酸而得之轉譯產物之質譜(P-19：Trp,P-20：Leu)。
圖18-1至18-2顯示Cys正後之第3位之密碼子所編碼之各種胺基酸而得之轉譯產物之質譜(P-21：Leu,P-22：Pro)。
圖19-1至19-2顯示Cys正後之第3位之密碼子所編碼之各種胺基酸而得之轉譯產物之質譜(P-23：His,P-24：Gln)。
圖20-1至20-2顯示Cys正後之第3位之密碼子所編碼之各種胺基酸而得之轉譯產物之質譜(P-25：Arg,P-26：Arg)。
圖21-1至21-2顯示Cys正後之第3位之密碼子所編碼之各種胺基酸而得之轉譯產物之質譜(P-27：Ile,P-29：Asn)。
圖22顯示Cys正後之第3位之密碼子所編碼之各種胺基酸而得之轉譯產物之質譜(P-30：Ser)。
圖23-1至23-2顯示Cys正後之第3位之密碼子所編碼之各種胺基酸而得之轉譯產物之質譜(P-32：Val,P-33：Ala)。
圖24顯示半胱胺酸以外之附有SH基之非天然型胺基酸及其胺基醯基化pdCpA之一般的合成法。
圖25顯示使用含SH基之安定化胺基醯基化tRNA之轉譯胜肽之質譜(P-34：tBuSSEtGly,P-35：tBuSSEtβAla,P-36：tBuSSEtGABA、[M+H]為標的化合物、S脫保護係對於標的化合物之SH基賦予之保護基已脫離之化合物，代表標的化合物已轉譯，Read-through係從第2位之Thr開始之轉譯產物，為副產物)
圖26顯示使用含SH基之安定化胺基醯基化tRNA之轉譯胜肽之質譜(P-41：Cys(StBu),P-40：PenCys(StBu),P-38：NVOC-Cys(StBu))。
圖27顯示使用將甲硫胺酸以外之胺基酸、胺基酸類似物或N末端羧酸類似物導入N末端之方法之轉譯合成及醯胺環化胜肽之質譜。
圖28顯示使用Initiation read-through之轉譯及醯胺環化胜肽之質譜(NCL：標的化合物)。
圖29顯示使用Initiation read-through之轉譯及醯胺環化胜肽之質譜(NCL：標的化合物)。
圖30-1至30-2顯示使用Initiation read-through之轉譯及用於醯胺環化胜肽之結構決定之MS及MS/MS解析。
圖31顯示使用示範基質之自由基脫硫反應。
圖32顯示使用示範基質之自由基脫硫反應之條件探討。
圖33顯示轉譯胜肽P-50之脫硫反應條件、及獲得之胜肽P-51之質譜。
圖34顯示脫硫反應對於蛋白之影響評價。
圖35-1顯示代謝物之質譜層析圖。
圖35-2顯示Peak1之MS/MS光譜。
圖35-3顯示Peak2之MS/MS光譜。
圖35-4顯示Peak3之MS/MS光譜。
圖35-5顯示Peak4之MS/MS光譜。
圖36顯示環化反應所得之化合物P-136之生成反應液以LCMS分析而得之結果。
圖37顯示環化反應所得之化合物P-136之生成反應液以LCMS分析而得之結果。
圖38顯示環化反應所得之化合物P-137之生成反應液以LCMS分析而得之結果。
圖39顯示利用含經苄基硫酯化之天冬胺酸衍生物之胜肽之轉譯合成獲得之轉譯反應物之質譜所為之分析結果。
圖40顯示使用轉譯胜肽P141上之硫酯與N末端α-胺基之胜肽之醯胺環化實驗獲得之產物之質譜所為之分析結果圖。
圖41顯示化合物10之合成條件之對比圖。
圖42顯示化合物P-151之生成反應以LCMS分析而得之結果。
圖43顯示以環化反應後之mRNA-胜肽融合物分子作為模板之反轉錄反應之結果。
圖44顯示含有N末端Phe,Ala與經苄基硫酯化之天冬胺酸衍生物之胜肽之利用MALDI-MS所為之分析結果。
圖45顯示含有N末端Phe,Ala與經苄基硫酯化之天冬胺酸衍生物之胜肽之利用MALDI-MS所為之分析結果。
圖46顯示以電泳評價環化反應條件中之RNA安定性之 結果。
圖47顯示胜肽環化反應之反應產物理用電泳所為之解析結果。
圖48顯示使用於正白胺酸開始轉譯且於側鏈含有經苄基硫酯化之天冬胺酸衍生物之胜肽，於轉譯後開始胺基酸除去及不利用反應輔助基之胜肽環化所得之環化胜肽之MALDI-MS所為之分析結果。
圖49顯示化合物SP-606之生成反應液以LCMS分析而得之結果。
圖50顯示具有半胱胺醯基脯胺醯基酯序列及側鏈胺基之環狀胜肽(化合物P-H1)之利用MALDI-MS所為之分析結果。
圖51顯示使用轉譯胜肽P-H1之分子內分支胜肽(直鏈部2)生成反應中之產物之利用MALDI-MS所為之分析結果。
圖52顯示化合物SP-606之生成反應液以LCMS分析而得之結果。
圖53顯示化合物SP-606之生成反應液以LCMS分析而得之結果。
圖54顯示化合物SP-606之生成反應液以LCMS分析而得之結果。
圖55顯示化合物SP-607之生成反應液以LCMS分析而得之結果。
圖56顯示脫硫反應前(化合物SP606)之質譜層析圖(上段)與脫硫反應3小時後，累加保持時間0.34分至0.39分並平均化之質譜層析圖(下段)(分析條件SQD FA05)之圖。若於此範圍 累加，不僅目的化合物或反應原料，只要有具類似結構之副產物存在，應可觀測到其分子量，故能正確評價全體之反應選擇性。不限於圖56，以一定區域之質譜累加時間範圍者，均依循此意圖。
圖57顯示化合物SP-607之生成反應液以LCMS分析而得之結果。
圖58顯示脫硫反應前(化合物SP606)之質譜層析圖(上段)與脫硫反應3小時後，累加保持時間0.34分至0.39分並平均化之質譜層析圖(下段)(分析條件SQD FA05)之圖。
圖59顯示化合物SP618之生成反應液以LCMS分析而得之結果。
圖60顯示化合物SP619之生成反應液以LCMS分析而得之結果。
圖61顯示LCMS 0.3分至0.6分之質譜層析圖。又，胜肽成分在本分析條件於0.3分至0.6分完全溶出。因此為了評價反應之選擇性將0.3分至0.6分之質譜層析圖累加並平均化之結果，了解本反應係選擇性的新區。
圖62顯示包含N末端甲醯基甲硫胺酸且以側鏈硫醇基與羧酸予以硫酯環化而得之胜肽P-E1(峰部I)、及N末端甲醯基甲硫胺酸已除去，其以結果露出之N末端胺基之氮原子與Asp之側鏈羧酸予以醯胺環化得到之化合物P-E2(峰部II)之利用MALDI-MS所為之分析結果。
圖63顯示化合物SP618之生成反應液以LCMS分析而得之結果。
圖64顯示化合物SP619之生成反應液以LCMS分析而得之結果。
圖65顯示LCMS 0.3分至0.6分之質譜層析圖。又，胜肽成分在本分析條件，於0.3分至0.6分完全溶出。因此為了評價反應之選擇性，累加0.3分至0.6分之質譜層析圖並使平均化之圖。
圖66顯示累加LCMS全部範圍並平均化之質譜層析圖。
圖67顯示累加LCMS全部範圍並平均化之質譜層析圖。
圖68顯示累加LCMS全部範圍並平均化之質譜層析圖。
圖69顯示化合物SP664之生成反應液以LCMS分析而得之結果。
圖70顯示化合物SP672之生成反應液以LCMS分析而得之結果。
圖71顯示包含具有分子內分支胜肽(直鏈部2)之胜肽-RNA複合體之反應產物之利用電泳所為之解析結果。
圖72顯示轉譯反應物之利用MALDI-MS分析所為之結果。
圖73顯示轉譯反應物之質譜層析圖及利用質譜所為之分析結果。
圖74顯示轉譯反應物之質譜層析圖及利用質譜所為之分析結果。
圖75顯示轉譯反應物之質譜層析圖及利用質譜所為之分析結果。
圖76顯示轉譯反應物之質譜層析圖及利用質譜所為之分析結果。
圖77顯示以電泳評價於側鏈胺基脫保護條件之RNA安定性之結果。
圖78顯示將經RNase處理之樣本處理獲得之樣本之LC/MS分析之結果。
圖79-1顯示以10個胺基酸形成環狀，3個胺基酸分支之由13個殘基構成之胜肽與蛋白質之交互作用。
圖79-2顯示以10個胺基酸形成環狀，3個胺基酸分支之由13個殘基構成之胜肽與蛋白質之交互作用(左側)。以13個胺基酸之胺基酸形成環狀之胜肽與蛋白質之交互作用(右側)。
圖80顯示以電泳評價於側鏈胺基脫保護條件之RNA安定性之結果。
圖81-1顯示活用利用計算機模擬之假想庫推測CLOGP值、NMe胺基酸數、分子量之平均值及分布之推測圖。
圖81-2顯示活用利用計算機模擬之假想庫推測CLOGP值、NMe胺基酸數、分子量之平均值及分布之推測圖。
圖82顯示實施例26獲得之化合物(SP854、SP855、SP857、SP859)之利用hIL-6及shIL-6R所為之細胞增殖之抑制活性。
<胜肽化合物>
‧具有環狀部之胜肽化合物
本發明之具有環狀部之胜肽化合物，係胺基酸或胺基酸類似物形成醯胺鍵或酯鍵而得之化合物，係環狀部經由醯胺鍵或碳-碳鍵形成反應等共價鍵而環化之化合物。該化合物進一步 化學修飾而得之化合物也包括於本發明之胜肽化合物。本發明之胜肽化合物也可具有直鏈部，例如可如流程A(流程A-1、A-2)記載。具有環狀部之胜肽化合物，也可更具有直鏈部。醯胺鍵或酯鍵之數(胺基酸或胺基酸類似物之數.長度)不特別限定，當具有直鏈部時，環狀部與直鏈部共計30個殘基以內為較佳。為了獲得高透膜性，環化部位與直鏈部位共計總胺基酸數為13個殘基以下更佳。為了獲得高代謝安定性，總胺基酸數為9以上更佳。若考慮兼顧透膜性與代謝安定性(類藥性)，除了上述以外，構成環狀部之胺基酸及胺基酸類似物之數為5~12較佳。再者，上述記載以外，構成環狀部之胺基酸及胺基酸類似物之數更佳為5~11、又更佳為7~11個殘基。尤其9~11個殘基為較佳。直鏈部之胺基酸及胺基酸類似物之數(單元之數)為0~8較佳。再者，0~3為較佳。又，本申請案只要不特別限定時，有時胺基酸也含蓋胺基酸類似物。又，在此，「類藥性」或「類藥」，係指胜肽化合物至少為經口劑、或以細胞內蛋白、核酸、膜蛋白之細胞內區域或膜蛋白之膜貫通分域作為標的時，有能利用為醫藥品之程度之透膜性與代謝安定性。
本發明之具有環狀部之胜肽化合物之環狀部位，只要是形成環狀之胜肽即不特別限定，轉譯後環化部須為能形成兼顧透膜性與代謝安定性(Druglikeness)之官能基的環化單元。只要是如此之環化法即可，不特別限定。例如從羧酸與胺形成之醯胺鍵、或鈴木反應、Heck反應(Heck反應)、Sonogashira反應等以過渡金屬作為觸媒之碳-碳鍵反應等。因此，本發明之胜肽化合物，包括可為該等鍵結反應之至少1組官能基。尤 其從代謝安定性之觀點，宜包括以鍵結反應形成醯胺鍵之官能基。
本發明之胜肽化合物之環狀部，例如宜為利用如流程A記載之轉譯合成後之化學反應使環化而形成之環狀部為較佳。再者，在不影響轉譯後RNA或DNA等核酸之反應條件也能形成之環狀部為較佳。
環狀部之形成宜為類藥性的環化較佳。類藥性的環化，係指生成之鍵結為類藥鍵結。例如：有容易氧化之可能性之含雜原子之鍵結，且不含妨礙代謝安定性之鍵結較佳。能以環化生成之鍵結，例如：利用活性酯與胺之鍵結所得之醯胺鍵、利用碳-碳雙鍵與芳基鹵化物所為之Heck反應產物等生成之鍵結係包括在內。此等在流程A記載之三角單元(環化N端側單元)或交叉單元也要求反應性官能基，所以三角單元或交叉單元不一定可選出適於類藥之胺基酸。但是轉譯後修飾實施後，可變換為有類藥性官能基之化合物。本發明中，如此的鍵結也含蓋在類藥性環化之鍵結。
流程A之曲線部分係轉譯後環化之部位(轉譯後環化部)，此部分於醯胺鍵或Heck反應等碳-碳鍵形成反應為代表之各種轉譯後修飾化學反應鍵結並形成環狀部。又，本說明書中，「轉譯合成」代表從編碼為胜肽化合物之核酸(例如DNA、RNA)將該胜肽化合物轉譯合成。轉譯，係指利用核糖體之作用，以mRNA作為模板，反複醯胺鍵或酯鍵反應而獲得直鏈胜肽之步驟。
轉譯後修飾，係指轉譯後核糖體之作用以外自動的或添加 其他試藥而產生之化學反應，例如環化反應或脫保護反應。
轉譯後環化，係轉譯後修飾之中伴隨環形成反應者。(流程A：說明本發明之胜肽化合物之流程。白圓單元、黑圓單元、三角單元、四角單元各代表胺基酸或胺基酸類似物。又，各單元代表相同或分別的胺基酸或胺基酸類似物。三角單元有時為N末端羧酸類似物。例如：8個黑圓單元可各為不同種類之胺基酸或胺基酸類似物，其中一些或全部可為相同。又，利用轉譯後可實施之化學修飾，胺基酸或胺基酸類似物也可化學變換或骨架變換為具有其他骨架之化合物。在此，1單元，係在轉譯後修飾結束之時點時胺基酸或胺基酸類似物相當於此，但利用1個tRNA轉譯之胺基酸或胺基酸類似物利用轉譯後修飾而化學變換或骨架變換為具有其他骨架之化合物者也含蓋在內。針對單元之數，可同樣計算。又，只要本說明書未特別限定，胺基酸也包括胺基酸類似物。又，本說明書中，轉譯後環化有時簡單記載為環化。
例如：環狀部，係於流程A-1中，由1個三角(▲)單元(殘基)(環化N端側單元)與8個黑圓(●)單元(環狀部主鏈單元)及1個白圓(○)單元(交叉單元)形成的部位，直鏈部，係6個四角(■)單元(直鏈部主鏈單元)形成之部位。又，流程A-2中，環狀部係1個三角單元與8個黑圓單元及1個交叉單元形成之部位，直鏈部係4個四角及3個四角單元形成之部位。
本發明中，交叉單元，係轉譯後形成之環化前之胜肽化合物(非環化胜肽化合物)中，胺基酸側鏈具帶有該胜肽化合物中之三角單元之胺基酸或胺基酸類似物之官能基或N 末端羧酸類似物具有之官能基以化學反應予以環化之官能基的胺基酸或胺基酸類似物，只要具有與該三角單元之環化必要之官能基即可，不特別限定。流程A之白圓單元該當於此。交叉單元係從上述胺基酸或胺基酸類似物選擇，宜為可從核酸轉譯者為佳。又，即使其本身轉譯困難，當其衍生物轉譯時，其本身非必要轉譯。例如：Asp(SBn)轉譯時，交叉單元可容許是Asp之側鏈亞甲基鏈有自由取代之化合物(例如化合物C-3之R28或R29也可為未經轉譯者)。交叉單元中，主鏈之胺基、羧基使用於轉譯合成之共價鍵形成，且第三官能基對於轉譯後環化為必要，所以合計須有3個以上之官能基。其中，轉譯後環化部位利用交叉單元之側鏈部位之官能基環化。
在此，具有與交叉單元進行環化之官能基之胺基酸或胺基酸類似物、或N末端羧酸類似物，只要具有與交叉單元進行環化之官能基即不特別限定。流程A之三角單元該當於此。三角單元，例如：流程A中顯示配置於N末端之例。如此之例中，在選擇胺基酸三角單元時可將主鏈胺基作為環化官能基使用。例如：交叉單元活用活性酯時，可利用三角單元之主鏈胺基與醯胺鍵所為之轉譯後環化。如此，當主鏈胺基活用為反應性官能基的情形，三角單元之側鏈也可不具反應性官能基。側鏈也可導入SH基(硫醇基)等反應輔助基。又，三角單元係利用胺基酸類似物之情形，主鏈之羥基也可作為反應性官能基使用，又也可利用於側鏈配置之反應性官能基。又，利用N末端羧酸類似物之情形，也可與上述同樣利用胺基或羥基作為反應性官能基，但可導入各種官能基作為不具胺基或羥基之 自由的反應性單元。三角單元，宜為從上述胺基酸或胺基酸類似物、或N末端羧酸類似物選擇、轉譯者為較佳。又，即使本身轉譯困難，當其衍生物被轉譯之情形，其本身無須轉譯的情況，係與交叉單元相同。
交叉單元與三角單元，只要是可環化之位置即可，可納入環化前之胜肽化合物中之所望位置，但宜納入環化、或施以環化後之轉譯後修飾後之環狀部位之胺基酸或胺基酸類似物或N末端羧酸類似物之合計數成為5~12之位置較佳。再者，更佳為納入環化、或環化後之轉譯後修飾後之環狀部之胺基酸或胺基酸類似物或N末端羧酸類似物合計數成為5~11之位置較佳。
又，三角單元在流程A係配置在N末端，但也可配置於N末端以外之位置。於此情形，其位置須比起交叉單元配置於更靠N末端側。三角單元配置於N末端以外之位置之情形，三角單元係從胺基酸及胺基酸類似物選擇，且側鏈具有與交叉單元進行環化反應之官能基。
黑圓單元、四角單元，係從胺基酸或胺基酸類似物選擇。又，以胺基酸或胺基酸類似物轉譯後，由於轉譯後修飾可產生之化學結構也包括(例如直鏈部2之結構)。選擇胺基酸之情形，黑圓單元不特別限定，較佳為從類藥的胺基酸、或具有反應性官能基且於轉譯後修飾而化學反應變換為類藥的官能基之胺基酸選擇(例如直鏈部2之胺基酸殘基可列舉離胺酸。)。從胺基酸類似物選擇之情形，黑圓單元不特別限定，較佳為從類藥的胺基酸類似物或側鏈具有各種反應性官能基 之胺基酸類似物利用轉譯後之修飾使反應性官能基被化學修飾並變換為類藥的胺基酸類似物之胺基酸類似物選擇。
直鏈部之數(分支之數)不特別限定，可如流程A-1為1個，也可如流程A-2為2個以上。又，可為流程A-1之四角單元之數為0個之化合物，也可為流程A-2之四角單元之中之直鏈部1之數為0個之化合物。藉由具有直鏈部，可強化本發明之具有環狀部之胜肽化合物之機能。例如：為了抑制某受體與配體之結合而利用本發明之胜肽化合物之情形，該胜肽化合物藉由具有直鏈部，比起無直鏈部之情形，能使胜肽化合物對於受體或配體之結合活性提高。由於該結合活性之增強，可提高受體與配體之鍵結抑制效果。尤其，本發明之直鏈部，可依例如後述方法對於環狀部之所望位置賦予直鏈部，為了獲得更高機能，可獲得於最適位置賦予直鏈部之胜肽化合物(以後，稱為直鏈部2)。
又，該等直鏈部，在從具有環狀部之胜肽化合物之資料庫以更良好效率獲得有所望活性之胜肽化合物方面亦為較理想。具有所望活性之胜肽化合物，可列舉對於標的物質有結合活性者、具有抑制標的物質之功能之作用者、或具有使標的物質之功能活化之作用者、具有改變標的物質之功能者等，可從該等之中因應目的選擇功能。本發明之具有環狀部之胜肽化合物對於標的物質有結合活性之情形，該等胜肽化合物由於透膜性與脂質安定性優異，例如可藉由標記該胜肽化合物，而不僅在活體內，也即時監測細胞內之標的物質之分布。又，標的物質係疾病之原因因子之情形，也可利用於該疾病之 診斷。又，本發明之具有環狀部之胜肽化合物具有抑制、活化或改變標的物質之功能之情形，例如：標的物質為疾病之原因因子之情形，可利用作為該疾病之治療藥。又，例如：本發明之具有環狀部之胜肽化合物係具有直鏈部2之情形，比起沒有之情形，能提高抑制化合物之取得比例。為與蛋白A結合，而抑制蛋白A與蛋白B之蛋白-蛋白交互作用之13個殘基之具有環狀部之胜肽化合物之情形，該胜肽化合物結合之蛋白A內之胜肽之接觸部位如圖79-2之右側所示。係環狀化合物，所以若將胜肽與蛋白A之接觸區域以圓近似，可判斷約3~5個殘基份量之直徑。蛋白B結合於此接觸區域之情形，能有效抑制蛋白A蛋白B之蛋白-蛋白交互作用，但於蛋白B與蛋白A在此接觸區域以外結合之情形，據認為可能無法有效抑制(所謂變構(allosteric)抑制例就蛋白-蛋白交互作用抑制例而言之報告例少)。
若以此方式思考，儘可能於廣區域獲得與蛋白鍵結之胜肽化合物係為重要。另一方面，可透膜之總胺基酸數有限定，故直鏈部係有效。例如：圖79-1與前面同樣為13個殘基之環狀胜肽，但是係顯示以10個殘基建構環狀，其餘3個分支之胜肽。尤其直鏈部2可依後述手法對於胜肽化合物之任意處賦予直鏈部，所以不僅在圖79-1之4個分支點，還可獲得更多分支點，假設重疊4個，可將接觸區域擴大到圖79-2之左所示之區域。儘管於相同處(孔)作用，但藉由重疊蛋白A與蛋白B之結合區域，可提高具有抑制劑等功能之胜肽化合物取得之比例。
又，本說明書中，構成胜肽化合物之「胺基酸」、「胺基酸類似物」，有時分別稱為「胺基酸殘基」、「胺基酸類似物殘基」。
胺基酸為α、β及γ胺基酸，不限於天然型胺基酸(本申請案中，天然型胺基酸係蛋白質包含之20種胺基酸。具體而言，指Gly、Ala、Ser、Thr、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、His、Glu、Asp、Gln、Asn、Cys、Met、Lys、Arg、Pro。)，也可為非天然型胺基酸。α-胺基酸的情形，可為L型胺基酸也可為D型胺基酸，也可為α，α-二烷胺基酸。胺基酸側鏈之選擇無特殊限制，可從氫原子、及其他例如烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基、環烷基自由選擇。也可個自賦予取代基，此等取代基也可從例如包含N原子、O原子、S原子、B原子、Si原子、P原子之任意官能基之中自由選擇(亦即，可經取代之烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基、環烷基等)。
構成胜肽化合物之「胺基酸」、「胺基酸類似物」，包含各自對應的所有同位體。「胺基酸」、「胺基酸類似物」之同位體，係至少1個原子以原子序(質子數)相同且質量數(質子與中子數之和)不同之原子取代者。構成本發明胜肽化合物之「胺基酸」、「胺基酸類似物」所含之同位體，例如氫原子、碳原子、氮原子、氧原子、磷原子、硫原子、氟原子、氯原子等，各包含2H、3H、13C、14C、15N、17O、18O、31P、32P、35S、18F、36Cl等。
取代基，例如：鹵素來源之取代基可列舉氟(-F)、氯(-Cl)、溴(-Br)、碘(-I)等。可列舉以此等1個以上取代而得 之可具有鹵素為取代基之烷基、環烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基等。
作為O原子來源之取代基之用於形成醚之取代基，例如烷氧基(-OR)，烷氧基可從烷基烷氧基、環烷基烷氧基、烯基烷氧基、炔基烷氧基、芳基烷氧基、雜芳基烷氧基、芳烷基烷氧基等中選擇。形成醇部位之取代基，例如羥基(-OH)，形成羰基之取代基，例如羰基(-C=O-R)，羰基可從氫羰基(-C=O-H，就化合物而言獲得醛)、烷羰基(就化合物而言獲得酮)、環烷羰基、烯羰基、炔羰基、芳羰基、雜芳羰基、芳烷羰基等中選擇。形成羧酸之取代基(-CO2H)，例如羧基，形成酯基之取代基例如氧羰基(-O-C=O-R)及羰基烷氧基(-C=O-OR)，羰基烷氧基可從烷基氧羰基、環烷基氧羰基、烯基氧羰基、炔基氧羰基、芳基氧羰基、雜芳基氧羰基、芳烷基氧羰基等中選擇，氧羰基可從烷羰氧基、環烷羰氧基、烯羰氧基、炔羰氧基、芳羰氧基、雜芳羰氧基、芳烷羰氧基等中選擇。
形成硫酯之取代基，例如巰羰基(-S-C=O-R)及羰基烷基巰基(-C=O-SR)等，可從巰基烷羰基、巰基環烷羰基、巰基烯羰基、巰基炔羰基、巰基芳羰基、巰基雜芳羰基、巰基芳烷羰基等中選擇，或例如羰基烷基巰基、羰基環烷基巰基、羰基烯基巰基、羰基炔基巰基、羰基芳基巰基、羰基雜芳基巰基、羰基芳烷基巰基。
形成醯胺基之取代基，例如胺基烷羰基(-NH-CO-R)、胺基環烷羰基、胺基烯羰基、胺基炔羰基、胺基環烷羰基、胺基芳羰基、胺基雜芳羰基、胺基芳烷羰基等，或 例如羰基烷胺基(-CO-NHR)、羰基環烷胺基、羰基烯胺基、羰基炔基胺基、羰基芳胺基、羰基雜芳胺基、羰基芳烷胺基等。再者，可列舉與N原子鍵結之H原子取代為烷基、環烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基而得之化合物。
形成胺甲酸酯基之取代基，例如胺基烷基胺甲酸酯基(-NH-CO-OR)、胺基環烷基胺甲酸酯基、胺基烯基胺甲酸酯基、胺基炔基胺甲酸酯基、胺基環烷基胺甲酸酯基、胺基芳基胺甲酸酯基、胺基雜芳基胺甲酸酯基、胺基芳烷基胺甲酸酯基等。再者，也可列舉與N原子鍵結之H原子取代為烷基、環烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基而得之化合物。
形成磺醯胺基之取代基，例如胺基烷基磺醯基(-NH-SO2-R)、胺基環烷基磺醯基、胺基烯基磺醯基、胺基炔基磺醯基、胺基環烷基磺醯基、胺基芳基磺醯基、胺基雜芳基磺醯基、胺基芳烷基磺醯基等，或例如磺醯基烷胺基(-SO2-NHR)、磺醯基環烷胺基、磺醯基烯胺基、磺醯基炔基胺基、磺醯基芳胺基、磺醯基雜芳胺基、磺醯基芳烷胺基等。再者，也可列舉與N原子鍵結之H原子取代為烷基、環烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基而得之化合物。
形成磺醯胺基之取代基，例如胺基烷基胺磺醯基(aminoalkylsulfamoyl)(-NH-SO2-NHR)、胺基環烷基胺磺醯基、胺基烯基胺磺醯基、胺基炔基胺磺醯基、胺基環烷基胺磺醯基、胺基芳基胺磺醯基、胺基雜芳基胺磺醯基、胺基芳烷基胺磺醯基等。再者，也可列舉與N原子鍵結之H原子取代為從烷基、環烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基之中的 相同或不同之任意2個、或此等也可形成環之取代基中選擇之取代基而得之化合物。
形成硫羧酸之取代基，例如硫羧酸基(-C(=O)-SH)，形成酮酸之官能基，例如酮酸基(-C(=O)-CO2H)。
再者，作為S原子來源之取代基的形成硫醇基之取代基，例如硫醇基(-SH)，會形成烷基硫醇、環烷基硫醇、烯基硫醇、炔基硫醇、芳基硫醇、雜芳基硫醇、芳烷基硫醇。形成硫醚(-S-R)之取代基，可從烷基巰基、環烷基巰基、烯基巰基、炔基巰基、芳基巰基、雜芳基巰基、芳烷基巰基等中選擇，形成亞碸基(-S=O-R)之取代基，可從烷基亞碸基、環烷基亞碸基、烯基亞碸基、炔基亞碸基、芳基亞碸基、雜芳基亞碸基、芳烷基亞碸基等中選擇，形成碸基(-S(O)2-R)之取代基，可從烷基碸基、環烷基碸基、烯基碸基、炔基碸基、芳基碸基、雜芳基碸基、芳烷基碸基等中選擇，形成磺酸之取代基，例如磺酸基(-SO3H)。
N原子來源之取代基，例如疊氮基(-N3)、腈(-CN)，形成1級胺之取代基例如胺基(-NH2)，形成2級胺(-NH-R)之取代基，例如烷胺基、環烷胺基、烯胺基、炔基胺基、芳胺基、雜芳胺基、芳烷胺基等，形成3級胺(-NR(R'))之取代基，可列舉從烷基(芳烷基)胺基等、烷基、環烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基等中選擇任意之2個或相同取代基2個、或此等也可形成環之取代基選擇之取代基等，形成脒基(-C(=NR)-NR'R")之取代基，例如脒基(-C(=NH)-NH2)、或N原子上之3個取代基取代為烷基、環烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳 基、芳烷基之相同或不同之任意3個而得之例如烷基(芳烷基)(芳基)脒基等，形成胍基(-NR-C(=NR''')-NR'R")之取代基，可列舉從胍基(-NH-C(=NH)-NH2)或R，R'，R"，R'''為烷基、環烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基之中選出相同或不同之任意4個、或此等也可形成環之取代基選擇之取代基等。
形成脲基之取代基，例如胺基胺甲醯基(-NR-CO-NR'R")。可列舉從R，R'，R"各為氫原子、烷基、環烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基之中相同或不同之任意3個、或此等也可形成環之取代基選擇之取代基等。
又，B原子來源之官能基，例如烷基硼烷(-BR(R'))或烷氧基硼烷(-B(OR)(OR'))等。該等2個取代基，例如從烷基、環烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基等中選出任意2個或相同取代基2個、或此等也可形成環之取代基選擇之取代基等。
如此，可以賦予包含鹵素基等通常低分子化合物利用之O原子、N原子、S原子、B原子、P原子、Si原子、鹵素原子之各種官能基1個或2個以上。亦即，可對此等取代基之1個所示之烷基、環烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基更賦予1個以上的其他的取代基。將滿足此等全部的官能基之條件，定義為自由選擇取代基。B或γ-胺基酸的情形，任意之立體配置與α-胺基酸的情形同樣可容許，其側鏈之選擇也無特殊限制，與α-胺基酸的情形相同。又，胺基酸之主鏈胺基部位也可游離(NH2基)，也可為N-甲基化等N-烷基化(NHR 基：R代表也可自由取代之烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基、環烷基，且也可如脯胺酸，從N原子伸出之碳原子與來自α位之碳原子形成環。取代基可自由選擇，例如鹵素基、醚基、羥基等。)。
本說明書中，「轉譯胺基酸」或「可轉譯之胺基酸」，係「胺基酸」中具有可轉譯之側鏈。如以下說明書所述，包括利用鹵素基、羥基(-OH)、烷氧基(-OR)、酯基(-C(=O)-OR)、硫酯基(-C(=O)-SR)、羧基(-CO2H)、醯胺基(-CO-NRR"或-NR-CO-R')、硫醇基(-SH)、烷基硫基(-SR)、亞碸基(-S(=O)-R)、碸基(-SO2-R)、胺基(-NH2)、單取代胺基(-NHR)、二取代胺基(-NRR')、疊氮基(-N3)、腈(-CN)、脒基(-N-C(=N)-NH2)等而具有1個以上可經取代之烷基、烯基、炔基、芳烷基、芳基、雜芳基、環烷基之L型α胺基酸、或經N-甲基化之L型α胺基酸、經N-乙基化或N-丙基化等C1~C4烷基取代或N-苄基化等N-芳烷基取代之甘胺酸衍生物、或具有硫醇基等反應輔助基之取代基或胺基等三角單元或交叉單元能活用之高反應性之各種官能基之L型α胺基酸等。又，D-酪胺酸等一部分D型α胺基酸或β-丙胺酸等β胺基酸、或α-甲基-丙胺酸(Aib)等α、α-二烷胺基酸等也包括在內。
本說明書中，「類藥的胺基酸」係與「胺基酸」有相同骨架，亦即，α、β及γ胺基酸，主鏈胺基(NH2基)之氫原子2個中的1個、及亞甲基(-CH2-基)之氫原子中的1個或2個也可取代為烷基、環烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基等。CH2基之氫原子由上述基取代而得之基作為側鏈。此等 取代基也包括進一步經作用為類藥的胜肽化合物之構成要素之取代基取代者。此等較佳為也可經另外從上述定義之取代基之中選擇，從例如：羥基(-OH)、烷氧基(-OR)、醯胺基(-NR-CO-R'或-CO-NRR')、碸基(-SO2-R)、亞碸基(-SO-R)、鹵素基、羥胺基(-NR-OR')、胺基羥基(-O-NRR')等中選擇之1個以上之取代基取代。又，L型胺基酸及D型胺基酸、α、α-二烷胺基酸對應者均可。類藥的胺基酸，不一定須可轉譯。包括從「轉譯胺基酸」獲得之胜肽之側鏈部分(例如以D-酪胺酸取得活性化合物之情形，為由此經化學修飾之D型胺基酸、於以β-丙胺酸取得活性化合物之情形，為由此經化學修飾之β-胺基酸)、或利用N甲胺基酸之化學變換使N取代部分之結構最適化而能化學合成之所有胺基酸。該等胺基酸為了作用為類藥的胜肽化合物之構成要素，係從藉由轉譯後實施之化學修飾獲得之胜肽化合物成為類藥之範圍選擇。如以下所述，例如具有胺基烷基之離胺酸，於胺基無關於轉譯後修飾之情形，不包括在類藥的胺基酸。但是離胺酸之胺基活用於作為轉譯後修飾之反應性官能基之情形(例如交叉單元)，包括離胺酸單元作為類藥的胺基酸之單元。如此，是否該當於「類藥的胺基酸」，係以轉譯後之修飾變換後之官能基判斷。能為如此之取代基之例，可列舉另外定義之取代基，例如酯基(-CO-OR)、硫酯基(-CO-SR)、硫醇基(-SH)、或經保護之硫醇基、胺基(-NH2)、單取代胺基(-NH-R)或二取代胺基(-NRR')、或經保護之胺基、取代磺醯基胺基(-NH-SO2-R)、烷基硼烷基(-BRR')、烷氧基硼烷基(-B(OR)(OR'))、疊氮基(-N3)、酮酸基(-CO-CO2H)、硫羧酸基 (-CO-SH)、磷氧基酯基(-CO-PO(R)(R'))、醯基羥胺基(-NH-O-CO-R)等。
本發明之胺基酸類似物，較佳為意指α-羥基羧酸。α-羥基羧酸之側鏈，與胺基酸同樣，除了氫原子以外也可具有各種取代基(可自由具有取代基)。α-羥基羧酸之立體結構，可對應於胺基酸之L型、D型均可，側鏈之選擇無特殊限制，例如從可自由取代之烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基、環烷基等中自由選擇。取代基之數不限於1個，也可為2個以上。例如：具有S原子，並更具有胺基或鹵素基等官能基亦可。
本說明書中，「轉譯胺基酸類似物」或「可轉譯之胺基酸類似物」，係指「胺基酸類似物」當中能轉譯之胺基酸類似物。具體而言，例如：L型胺基酸之主鏈胺基置換為羥基之化合物。例如L-乳酸、α-羥基乙酸、L或D-苯基乳酸等。又，「類藥的胺基酸類似物」，只要是「胺基酸類似物」當中作用為類藥的胜肽化合物之構成要素者即不特別限定。其範圍與上述類藥的胺基酸之側鏈或N取代部分之定義相同。具體而言，例如：L或D-乳酸、或於其側鏈甲基賦予各種類藥的取代基(例如：鹵素基、羥基、可經取代之烷基、烯基、炔基、環烷基、芳烷基、芳基、雜芳基等)之化合物、α-羥基乙酸、L或D-苯基乳酸、或於其側鏈苄基賦予各種類藥的取代基(例如：鹵素基、羥基、可經取代之烷基、烯基、炔基、環烷基、芳烷基、芳基、雜芳基等)之化合物等。又，類藥的胺基酸類似物，不一定須可轉譯。「轉譯胺基酸類似物」利用轉譯後化學修飾使 胜肽化合物成為類藥之情形，該胺基酸類似物也包括於「類藥的胺基酸類似物」。如此之胺基酸類似物，例如：側鏈已賦予SH基之α-羥基羧酸或側鏈賦予胺基、或經保護之胺部位之α-羥基羧酸。例如：SH基可利用轉譯後修飾後、脫硫反應除去，胺基可利用轉譯後修飾變換為醯胺等。個別例可列舉R-2-羥基-3-硫烷基丙酸(R-2-hydroxy-3-sulfanylpropanoic acid)等。
本發明之N末端羧酸類似物，係同時帶有胺基與羧基，且兩者之間之原子數為3個以上之化合物，也可為不帶胺基之各種羧酸衍生物、或由2個殘基~4個殘基形成之胜肽、主鏈胺基以與羧酸之醯胺鍵等化學修飾之胺基酸。又，也可具有能使用在曲線部之環化的硼酸或硼酸酯部位。又，也可為具有雙鍵部位或參鍵部位之羧酸，也可為具有酮或鹵化物之羧酸。又，該等化合物也規定之官能基以外之部分，可從可經取代之烷基、芳烷基、芳基、環烷基、雜芳基、烯基、炔基等中廣泛選擇(自由的取代基)。
本說明書中，「轉譯N末端羧酸類似物」或「可轉譯之N末端羧酸類似物」，係指「N末端羧酸類似物」當中能轉譯之N末端羧酸類似物。具體而言，例如：雙鍵與羧酸以烷基連接之化合物(丁-3-烯酸、戊-4-烯酸等)、N末端以乙醯基化等予以醯胺化之L型胺基酸(Ac-Phe,Ac-Ala，Ac-Leu等)、OH基經烷基化之α-羥基羧酸衍生物或二胜肽、三胜肽等。又，「類藥的N末端羧酸類似物」，只要「N末端羧酸類似物」當中作為類藥的胜肽化合物之構成要素者即不特別限定。該等取代基，包括於類藥的胺基酸之側鏈定義之取代基為相同者。具體 而言，例如：雙鍵與羧酸以烷基連接之化合物(丁-3-烯酸、戊-4-烯酸等)當中，從碳原子以類藥的範圍賦予取代基之化合物、N末端以乙醯基化等予以醯胺化而得之L型胺基酸(Ac-Phe,Ac-Ala，Ac-Leu等)當中，乙醯基或側鏈或α位之氫原子於類藥的範圍取代之化合物、OH基經烷基化之α-羥基羧酸衍生物當中，OH基之烷基或羥基羧酸之側鏈或α位之氫原子等於類藥的範圍取代而得之化合物、於類藥的範圍取代之二胜肽、三胜肽等。又，類藥的N末端羧酸類似物，不一定須可轉譯。「轉譯N末端羧酸類似物」藉由轉譯後化學修飾使胜肽化合物成為類藥之情形，該N末端羧酸類似物也包括在「類藥的N末端羧酸類似物」。如此之N末端羧酸類似物，例如：N末端維持胺基殘存之二胜肽、γ-胺基羧酸、δ-胺基羧酸等。
胜肽化合物之透膜性
本發明之胜肽化合物為了有良好透膜性，胜肽化合物中包含的總胺基酸數為13以下較佳。
各單元(胺基酸殘基)之選擇不特別限制，但重新考慮轉譯後化學修飾完全完成的形式的分子形式(主鏈結構)，形成之分子之CLogP(以電腦計算得到的分配係數，使用Daylight Chemical Information Systems,Inc.公司之Daylight Version 4.9計算)宜選擇使超過6較佳。為了確保特別良好透膜性，宜選擇使CLogP超過8、且不超過15較佳。
為了確保透膜性，更佳為胺基酸側鏈之選擇係從類藥的取代基之中選擇。例如：可經取代之烷基、環烷基、烯基、炔基、芳烷基、芳基、雜芳基之中，例如可賦予取代基例 如鹵素基、羥基(-OH)、醯胺基(-CO-NRR'或-NR-CO-R')、碸基(-SO2-R)、醚基(-OR)等(R、R'同樣地從也可經此等取代之烷基、環烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基之中選擇)。芳基、芳烷基之芳基部位，除了苯基之以外，也可容許吡啶基等鹼性基、噻唑基等含2個以上之雜原子之基、咪唑基等氫原子提供者、吲哚基等縮合芳香環。
另一方面，為了獲得透膜性之不理想極性官能基，可列舉在活體中(pH=7附近)會極度離子化之官能基烷胺基或烷基胍基等，不包含該等官能基較佳。
為了獲得透膜性，構成胜肽化合物之胺基酸或胺基酸類似物也可使用經N-甲基化或如脯胺酸之與α位碳原子環化等經N-烷基化者，其數為每1個胜肽分子存在2個以上較佳。又，每1個胜肽分子，存在未N-烷基化之醯胺鍵至少1個較佳。理想為每1個胜肽分子，存在N-烷基化者3個以上，未N-烷基化者3個以上較佳。此N-烷基化，係包括所有NH以外之化學修飾，因此可從可經取代之(取代基之選擇與上述為了確保透膜性之胺基酸側鏈之取代基相同)烷基、環烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基之中選擇。又，N-烷基化，也包括如脯胺酸，在N原子與α碳之間形成環結構者。
胜肽化合物之C末端部位宜不維持羧酸而是經化學修飾更佳。例如：羧酸部位變換為與哌啶等反應而得之哌啶醯胺等可經取代之烷基、烯基、炔基、環烷基、芳基、雜芳基、芳烷基醯胺化合物(-CO-NRR'：之R與R'之1個為氫原子、其餘以化學修飾亦可，也可R與R'之兩者均經化學修飾，也可R 與R'形成環而例如哌啶醯胺般經化學修飾。又，R與R'可同時為氫原子)、或羧酸基變換為甲基或三氟甲基等可經取代之烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基等各種非離子性官能基較佳。取代基之選擇，與為了確保上述透膜性之胺基酸側鏈之取代基相同。又，構成胜肽化合物之胺基酸，也可最適化轉譯合成之化合物。又，構成獲得之胜肽化合物之胺基酸，不限於被轉譯合成者。
在此，最適化係藉由變換從「轉譯胺基酸」轉譯合成之化合物中之各胺基酸之結構，而化學修飾成更類藥的胜肽化合物、化學修飾成對藥效標的有更強活性之胜肽化合物，及/或化學修飾成更避免毒性之胜肽化合物之意。在此，應避免、或避免較好的毒性，例如：hERG抑制(對心臓之毒性)、AMES試驗(癌原性試驗)、CYP抑制(藥物間交互作用試驗)、CYP誘導、GSH結合能力測定試驗(由於麩胱甘肽形成胜肽或胜肽代謝物之共價鍵形成試驗)等。該等試驗，據認為涉及藥效本體之胜肽化合物本身及其代謝產物兩者之情形，尤其為了在AMES試驗、CYP誘導、GSH結合能力測定試驗中確保陰性結果，宜避免有生成共價鍵之可能性的代謝產物較佳。所以，展示庫中所有胜肽化合物包含之環化部位宜不形成有如此之可能性之官能基，尤其以對氧化反應有某程度安定性之環化反應予以環化較佳。例如與在許多低分子化合物實施的，苯丙胺酸鑑定為作為轉譯胺基酸之情形，對於苯基可施以烷基取代、鹵素取代等各種化學修飾。如此之變換，於能不大幅損及經轉譯合成之化合物之3維結構而能實施之觀點，與習知之天然胜肽 之利用N-甲基化或環化所為之化學修飾大不相同。又，在天然胜肽有許多情形，極度離子化之精胺酸或離胺酸殘基常有助於活性，故將此等輕易變換為類藥的官能基有所困難，相對於此，若使用本技術，可獲得僅限類藥的官能基而限定之官能基對藥效標的之活性，且以類藥的環化法施以環化，所以實施於低分子化學通常實施之化學修飾，能與低分子化學以同樣機率及成功率獲得臨床候選者化合物。另一方面，脂溶性之指標CLogP值，能於最適化過程輕易調整。又，通常低分子化合物之最適化，可藉由實施之烷基化或鹵素化而提高對於標的結合活性。通常可期待10倍~50倍之活性提高。該等通常之變換，同時也可提高CLogP值。例如以氯化可提高約0.7、以甲基化可提高約0.5。具有極度離子化之官能基之情形，即使於最適化過程提高CLogP值也不能獲得足夠優良之透膜性，但不具有極度離子化之官能基之情形，在最適化過程能獲得透膜性令人滿意的CLogP值。因此例如從平均之CLogP值為6附近之展示庫獲得CLogP值為5之活性化合物之情形，可判斷提高CLogP值，並最適化為對透膜最適範圍之8~15之範圍係十分可能。
本發明之胜肽化合物之透膜性之確認，可使用公知方法、例如：大鼠腸管法、培養細胞(Caco-2,MDCK,HT-29,LLC-PK1等)單層膜法、Immobilized Artificial Membrane chromatography(固定化人工膜層析)法、使用分配係數之方法、核糖體膜法、PAMPA(Parallel Artificial Membrane Permeation Assay)法等確認。具體而言，例如使用PAMPA法 之情形，可依Holger Fischer等人之文獻(非專利文獻：H.Fischer et.al.Permeation of permanently positive charged molecules through artificial membranes-influence of physic-chemical properties.Eur J.Pharm.Sci.2007,31,32-42)之記載確認。更具體而言，可依實施例19-2記載之方法確認。
作為經口醫藥品之具透膜性之氫氯二疊氮化物、Furosemide及metoprolol之透膜性以PAMPA法測定時之iPAMPA Pe值，各為0.6X10-6、1.5X10-6及2.9X10-5。本發明之胜肽化合物之透膜性，例如當以PAMPA法測定時之iPAMPA Pe之值為通常1.0 x 10-6以上之情形，可認為可獲得作為醫藥品能使用之透膜性，1.0x 10-6以上較佳，1.0X10-5以上更佳，1.5X10-5以上尤佳，2.0X10-5以上更佳。
‧胜肽化合物之代謝安定性
本發明之胜肽化合物為了具有良好的代謝安定性，胜肽化合物中所含之總胺基酸數為9以上較佳，11以上更佳。若為總胺基酸數為9以上之胜肽化合物，為了具有上述透膜性之條件不影響該胜肽化合物之代謝安定性。
本發明之胜肽化合物之代謝安定性之確認，可使用公知方法，例如：肝細胞、小腸細胞、肝微體、小腸微體、肝S9等確認。具體而言，例如：肝微體中之胜肽化合物之安定性，可依LL von Moltke等人之文獻(Midazolam hydroxylation by human liver microsomes in vitro：inhibition by fluoxetine,norfluoxetine,and by azole antifungal agents.J Clin Pharmacol,1996,36(9),783-791)之記載測定。更具體而言，可依實施例 18-2記載之方法確認。
代謝安定性，例如肝微體中之安定性依上述方法測定時之肝固有廓清(CLh int(μL/min/mg protein))之值為150以下之情形，可認為能獲得作為經口劑之醫藥品使用之代謝安定性，較佳為100以下。利用CYP3A4代謝之藥物之情形，為了避免人類的小腸代謝，宜為78以下(非專利文獻：M.Kato et al.The intestinal first-pass metabolism of substances of CYP3A4 and P-glycoprotein-quantitative analysis based on information from the literature.Drug Metab.Pharmacokinet.2003,18(6),365-372.)較佳，為了於人類顯示約30%以上之生體可用率，較佳為35以下(假定FaFg=1、蛋白結合率0%)。
Figure 107130626-A0101-12-0054-4
具有環狀部之胜肽化合物之製造方法
本發明之具有環狀部之胜肽化合物可依以下記載方法製造。
例如：包含以下之製造方法之製造方法。包含以下步驟1)將中胺基酸殘基及/或胺基酸類似物殘基、或胺基酸殘基及/或胺基酸類似物殘基及N末端羧酸類似物構成之非環狀胜肽 化合物，從編碼為該胜肽化合物之核酸轉譯並合成，該非環狀胜肽化合物包含在C末端側的1個側鏈具有反應點之胺基酸殘基或胺基酸類似物殘基、及在N末端側具有另1個反應點之胺基酸殘基、胺基酸類似物殘基或N末端羧酸類似物；2)使N末端側之胺基酸殘基、胺基酸類似物殘基或N末端羧酸類似物之反應點、與C末端側之側鏈具有之胺基酸殘基或胺基酸類似物殘基之反應點鍵結而形成醯胺鍵或碳-碳鍵。
本發明之轉譯合成可利用公知方法。
可轉譯之胺基酸、可轉譯之胺基酸類似物或可轉譯之N末端羧酸類似物之N末端導入
原本，一般而言，轉譯開始胺基酸係將甲硫胺酸作為N末端胺基酸轉譯，但也已知有使用將其所望之胺基酸予以胺基醯基化而得之轉譯開始tRNA轉譯而將N末端轉譯為所望胺基酸之方法。非天然胺基酸之N末端導入，已知胺基酸之容許度比伸長時為高、可利用與天然型胺基酸的結構大為不同之胺基酸、胺基酸類似物(非專利文獻：J Am Chem Soc.2009 Apr 15；131(14)：5040-1.Translation initiation with initiator tRNA charged with exotic peptides.Goto Y,Suga H.)。例如：本發明中，作為將甲硫胺酸以外之可轉譯之胺基酸、可轉譯之胺基酸類似物或可轉譯之N末端羧酸衍生物導入N末端之方法，有以下之方法。作為轉譯開始tRNA，將三角單元已醯基化之tRNA導入不含甲硫胺酸、甲醯基提供者或甲硫胺醯基轉移酶之轉譯系，以轉譯開始密碼子(例如ATG)將三角單元編碼並轉 譯，而建構末端為三角單元之環化前之胜肽化合物或胜肽化合物資料庫。若將反密碼子不是CAU之轉譯開始tRNA與該反密碼子對應之密碼子之各種組合當作轉譯開始tRNA及開始密碼子之組合利用，可對於N末端賦予多樣性。亦即，可對於反密碼子不同之多種轉譯開始tRNA將所望之胺基酸、胺基酸類似物或N末端羧酸類似物分別胺基醯基化，並將以與其對應之密碼子作為開始密碼子之mRNA或mRNA資料庫轉譯，可製作N末端殘基不限於一種之環化前之胜肽化合物或胜肽化合物之資料庫。具體而言可使用例如：Mayer C,et al.Anticodon sequence mutants of Escherichia coli initiator tRNA：effects of overproduction of aminoacyl-tRNA synthetases,methionyl-tRNA formyltransferase,and initiation factor 2 on activity in initiation.Biochemistry.2003,42,4787-99.(利用具有CAU以外之反密碼子之開始tRNA變異的大腸菌，從f-Met以外之胺基酸開始轉譯，並且表現在中途具有同密碼子之蛋白。)記載之方法，製作環化前之胜肽化合物或胜肽化合物資料庫。
又，使N末端側之胺基酸殘基、胺基酸類似物殘基或N末端羧酸類似物之反應點、與C末端側之側鏈具有之胺基酸殘基或胺基酸類似物殘基之反應點鍵結之方法，例如：使N末端側之側鏈具有胺基與反應輔助基之胺基酸殘基、胺基酸類似物殘基或N末端羧酸類似物、與側鏈具有活性酯基之胺基酸殘基或胺基酸類似物殘基予以醯胺鍵結獲得環狀化合物之方法、使N末端胺基酸殘基、胺基酸類似物殘基或N末端 羧酸類似物具有胺基且使其與側鏈具有活性酯基之胺基酸殘基或胺基酸殘基予以醯胺鍵而獲得環狀化合物之方法、使N末端之胺基酸殘基、N末端之胺基酸類似物殘基或N末端羧酸類似物之反應點與側鏈具有1個反應點之胺基酸殘基或胺基酸類似物之反應點予以碳-碳鍵結之方法等。又，不限於上述例，也可例如：N末端側之胺基酸殘基、N末端側之胺基酸類似物或N末端羧酸側具有活性酯基且C末端側之側鏈使胺基(也可具有反應輔助基)醯胺鍵結等與上述官能基做相反配置。
以下以利用醯胺環化之情形為例敘述反應設計。為了獲得三角單元之欲使反應之胺基及不欲使反應之鹼性官能基間的反應選擇性，可能須使欲使反應之胺之反應性對於其他官能基提高。通常利用胺活化之手法，例如可對胺附近導入反應輔助基。反應輔助基只要是RNA不反應之程度使胺活化即不特別限定，例如可從末端胺導入巰基乙基或巰基丙基，又，也可如半胱胺酸，使硫醇部位位在從胺之α位(參照流程C)。該等硫醇基在轉譯導入之過程，可經保護、未保護均可，在反應時或事前視需要以脫保護反應使生成硫醇基。依此方式，可利用經活化之胺與羧酸活性酯之反應而獲得於所望位置經醯胺環化之胜肽。使獲得之環狀胜肽之SH基，於加有TCEP(參(2-羧基乙基)膦)與VA-044(2,2'-偶氮雙-2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷)等試藥之RNA不反應之溫和反應條件，能使脫硫。
於利用轉譯實施展示庫之情形，作為轉譯導入之交叉單元之活性酯，宜為硫酯較佳。反應輔助基使用SH基之情形，例如可依以下組合進行。使SH基於無保護狀態轉譯合 成之情形，交叉單元硫酯使用天冬胺酸衍生物較佳。於此情形，全部黑圓單元與四角單元，可從轉譯胺基酸或轉譯胺基酸類似物之中任意選擇。另一方面，於SH基有保護基之狀態使轉譯合成之情形，成為天冬胺酸硫酯之C末端側之四角單元，宜從經N-烷基化之胺基酸(例如脯胺酸、或N-甲基 丙胺酸等)之中選擇較佳。
Figure 107130626-A0101-12-0058-7
Figure 107130626-A0101-12-0058-6
就通式而言，作為三角單元之在胺附近有反應輔助基之胺基酸、N末端羧酸類似物、例如N末端胺基酸之例，可記載如化合物N-1或N-2。此等化合物N-1及N-2之取代基，較佳為該等R表示之取代基之中，保護基(R1、R23或三苯甲基等)以外使用之取代基與上述定義之類藥的胺基酸之側鏈之定義為相同。又，導入此等而獲得之化合物為能轉譯合成者較 佳，但此衍生物本身即使未轉譯合成，其類似物經轉譯合成者也包括在內(參照後述段落(例如3個段落後的段落))。
R1係從氫原子、或S-R23基、或C(Phe)3基(三苯甲基)等表示之SH基之保護基之中選擇。R23係從甲基、乙基、異丙基、第三丁基等烷基、苯基、對三氟甲基苯基、對氟苯基之類的芳基、苄基、苯乙基等芳烷基、雜芳基、烯基、炔基等選擇。該等基，係從結果獲得之化合物N-1或N-2能轉譯合成的取代基之中選擇。例如可為以二甲胺基取代R23之乙基而得之N,N-二甲胺基乙基巰基等。R1具有保護基之情形(H原子以外的情形)，選擇之保護基若從能轉譯合成之保護基之中選擇、且於轉譯合成液中脫保護並於環化前成為氫原子即可，可不特別限定選擇。S-R23基之類之保護基，會在轉譯合成液中緩慢脫保護，所以可不須積極另外制定脫保護條件而使脫保護。視需要，可於本說明書記載之各種反應條件添加脫保護劑。(SH基之保護基記載。)
R2、R3與類藥的胺基酸之側鏈之定義同樣地定義。例如R2、R3，較佳為氫原子、可具有取代基之烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基、或環烷基，或R2與R3形成環之取代基、或R2或R3與R4形成環之取代基。更佳為從氫原子、或C1-C4烷基、也可經烷氧基、鹵素基等取代之C1-C4烷基等選擇。又，R3基之立體可容許L型胺基酸、D型胺基酸對應者兩者。較佳為R3基之立體，係R3基假定為氫原子之情形之L型胺基酸所對應者。
R4係將S(硫)原子與胺基酸部位連結之單元。以下 顯示其代表結構。兩單元能以可經取代之亞甲基(次結構N-3、C1單元)、可經取代之伸乙基(次結構N-4、C2單元)、可經取代之伸丙基(次結構N-5、C3單元)等C1~C6單元連結。可經取代之亞甲基、伸乙基、伸丙基中之取代基之例，例如R13經甲基化(R14=H)之化合物N-1、或如R13=R14=Me之經二甲基化之化合物N-1等。該等之中，其衍生物之某些轉譯合成之情形，其他衍生物假定即便未轉譯合成也均包括在此定義。例如：R13=R14=H被轉譯合成之情形，如R13=R14=Me之衍生物，假定未轉譯合成之情形，該等取代基包括在類藥胺基酸側鏈之定義，所以含蓋作為三角單元。R13、R14、R15、R16、R17、R18、R19、R20、R21、R22等亦與R4為同樣定義，例如：從氫原子、C1~C4烷基、也可經烷氧基、鹵素原子等經取代之C1~C4烷基選擇。該等之間也可成為環化結構。尤佳為從氫原子、甲基選擇。又也可從芳香族化合物之芳基碳直接連結(次結構N-6)。又，也可以芳烷基結構連結(次結構N-7、N-8)。次結構N-7中，2價者當中，哪一個可為氮原子側、硫原子側均可。以下流程，連結位置限定為鄰位，但不限於鄰位，可為間位、對位等。芳基係以苯基表示，但苯基也可由鹵素基或烷氧基或三氟甲基等取代基取代，又，也可使用苯基以外之芳基(亦即，包括雜芳基之各種芳香環)。
Figure 107130626-A0101-12-0061-8
R11、R12也與R4從同樣次結構選擇。例如可從次結構N-3、N-4、N-5、N-6、N-7、N-8之中選擇。R12也可包括C0單元(連結部位係直接鍵結之情形)。
化合物結構N-1及化合物結構N-2之理想結構式，以化合物結構N-9、N-10、N-11、N-12表示。化合物N-9中，化合物N-1之R12部位以C0單元與連結部位直接連結。化合物N-10中，化合物N-2之R11部位以C1單元(對應於次結構N-3)連結。化合物N-11中，化合物N-2之R11部位以C2單元(對應於次結構N-4)連結。化合物N-12中，化合物N-2之R11部位以C3單元(對應於部分鍵結N-5)連結。
Figure 107130626-A0101-12-0061-9
R5~R10與前述R13~R18之定義相同。
再者，該等理想的結構式，如以下化合物N-13、N-14、N-15、N-16、N-17、N-18、N-19、N-20所示。化合物 N-13中，化合物N-9之R4部位以C1單元(對應於次結構N-3)連結。化合物N-14中，化合物N-10之R4部位以C2單元(對應於次結構N-4)連結。化合物N-15中，化合物N-11之R4部位以C2單元(對應於次結構N-4)連結。化合物N-16中，化合物N-12之R4部位以C2單元(對應於次結構N-4)連結。化合物N-17中，化合物N-9之R4部位以C2單元(次結構N-4)連結。化合物N-18中，化合物N-10之R4部位以C3單元(次結構N-5)連結。化合物N-19中，化合物N-11之R4部位以C3單元(次結構N-5)連結。化合物N-20中，化合物N-12之R4部位以C3單元(次結構N-5)連結。
Figure 107130626-A0101-12-0062-10
到目前已針對通式化合物N-1及化合物N-2表示之化學結構敘述，但含有反應輔助基SH之三角單元之定義，不限於此等。亦即，可從具有與交叉單元反應之單元即胺基及反應輔助基且可轉譯合成之結構之中選擇任意之結構。胺基可為主鏈來源也可為側鏈來源。三角單元不一定要於N末端存在，也可於比三角單元更N末端側存在四角單元(直鏈部)。SH基與胺基之位置關係宜為有β(2個官能基之間有2個連結原子)、γ(連結原子3個)等連結原子2~6之範圍存在之化學結構為較佳。更佳為，SH基與胺基之位置關係為β或γ較佳。又， 三角單元可配置有活性酯官能基之單元，也可配置於交叉單元側含有胺之單元。
側鏈具有活性酯基之胺基酸殘基之通式，可如化合物C-1記載。較佳為該等活性酯部位已排除之取代基與上述定義之類藥的胺基酸之側鏈之定義相同。此衍生物本身未轉譯合成，而其類似物被轉譯合成者也包括。本案中，活性酯係指，能與胺基部位直接或經由反應輔助基而反應之羧酸衍生物，只要是具有如此性質之活性酯或活性硫酯即不特別限制。R25，係從氫原子或活性酯基之中選擇者。活性酯，例如廣為一般使用的，N-羥基琥珀醯亞胺(ONSu)基、OAt基、OBt基等、或甲硫酯或芳基硫酯、芳烷基硫酯等為代表。該等活性酯部位已賦予通常廣為利用之化合物取代基(例如取代基，可列舉為提高反應性常使用之鹵素基、硝基、三氟甲基、腈等電子吸引基、或為使反應更減低而提高反應選擇性常使用之甲氧基等烷氧基、甲基等烷基之類的電子提供基、第三丁基或異丙基代表之大體積之取代基、考慮於水中實施且與水之親和性之磺酸基、二甲胺基之類的二取代胺基等，反之，考慮與親脂性之親和性，可列舉長鏈烷基等高脂溶性基等)而得之衍生物且顯示同樣反應性者，均包括。
R2及R3如上述胺部位所定義。
R26與R4之定義相同，以下顯示其代表的結構。兩單元能以亞甲基(次結構N-3)、伸乙基(次結構N-4)、伸丙基(次結構N-5)等C1~C6單元連結。R13、R14、R15、R16、R17、R18、R19、R20、R21、R22，較佳為此等取代基與在上述所定 義之類藥的胺基酸之側鏈之定義相同。其衍生物本身未經轉譯合成、其類似物被轉譯合成者也包括。例如從氫原子、C1~C4烷基、也可經鹵素原子等取代之C1~C4烷基選擇。該等間也可成為環化結構。更佳為亞甲基(C1單元、次結構N-3)以外，從C4單元、C5單元C-6單元選擇。更佳為從C1單元(次結構N-3)選擇。又，能從芳香族化合物之芳基碳直接連結(次結構N-6)。又，也可以芳烷基結構連結(次結構N-7、N-8)。以下流程限定連結位置為鄰位，但不限於鄰位，也可為間位、對位等。芳基以苯基表示，但苯基也可利用鹵素基或烷氧基等取代基取代，也可使用苯基以外之芳基。
化合物C-1之中，理想結構如化合物C-2。R27從氫原子、可經取代之烷基、可經取代之烯基、可經取代之炔基、、可經取代之芳基、可經取代之雜芳基、可經取代之環烷基、也可賦予可經取代之烷基之芳烷基之中選擇。此等取代基，其取代基選擇之結果獲得之化合物C-2只要能轉譯合成即不特別限定。例如取代基，可從為了提高反應性常使用之鹵素基、硝基、三氟甲基、腈等電子吸引基、或使反應更低而提高反應選擇性常使用甲氧基等烷氧基、甲基等烷基之類的電子提供基、第三丁基為異丙基代表之體積大的取代基、於水中實施考慮與水之親和性之磺酸基、二甲胺基之類的二取代胺基、反之考慮親脂性之長鏈烷基等高脂溶性基等選擇。較佳為從可經取代之烷基、可經取代之環烷基、可經取代之芳烷基選擇。更佳為從烷基、芳基部位可經取代之芳烷基選擇。
R3與類藥的胺基酸之側鏈之定義同樣定義，例如從C1-C4 烷基、也可經鹵素等取代之C1-C4烷基選擇，但尤其氫原子為較佳。又，R3基之立體，假定R3基為氫原子之情形之L型、D型胺基酸所對應者兩者均可容許，但宜為L型胺基酸對應者為較佳。
再者，理想結構如化合物C-3。R28及R29各與類藥的胺基酸之側鏈之定義同樣定義，例如從氫原子、可經取代之C1~C6烷基、可經取代之C2~C6烯基、可經取代之C2~C6炔基、、可經取代之芳基、可經取代之雜芳基、也可賦予可經取代之C1~C6烷基之芳烷基、可經取代之環烷基之中選擇。此等取代基，例如單甲基化(R28=Me、R29=H)或二甲基化(R28=R29=Me)、單三氟甲基化(R28=CF3、R29=H)等。
R3從氫原子、C1-C4烷基、也可經鹵素等取代之C1-C4烷基等選擇，但尤其氫原子為較佳。又，R3基之立體，於假定R3基為氫原子之情形之L型、D型胺基酸對應者兩者均可容許，但L型胺基酸對應者較佳。
與化合物C-1、化合物C-2、化合物C-3同樣，可從化合物COH-1、化合物COH-2、化合物COH-3選擇。
Figure 107130626-A0101-12-0066-11
使用化合物C-2或化合物C-3之情形，與化合物N-1或化合物N-2之反應可溫和且選擇性地進行。轉譯液中(例如：37℃、pH7.3附近)也能順利使反應進行。反應輔助基之除去也能於RNA安定之反應條件輕易進行。
N末端側(三角單元)配置活性酯之情形，C末端側(交叉單元)也可配置有反應輔助基之胺單元。於此情形，在交叉單元之側鏈配置胺基與硫醇基。轉譯階段，此等可經保護，但於即將反應時脫保護。胺基與硫醇基只要是在附近存在即可，不特別限定，兩者之關係為β位或γ位較佳。
亦即，三角單元之側鏈具有硫酯等活性酯，且與另一(交叉單元)之側鏈之胺基(附近有硫醇等反應輔助基)之醯胺縮合反應予以類藥環化之手法也均包括在本案，哪一官能基配置於三角單元或交叉單元都可以。
以下就具有反應輔助基之胺部位，顯示與化合物N-1及化合物N-2為不同結構之具體例。均可將胺基、硫醇基視需要保護。保護基及脫保護反應條件之選擇，可利用本說明書記載之方法。化合物Na-10，如圖記載，可選擇胺基與硫醇基之間配置2個碳原子之結構。化合物Na-11，如圖記載，可選擇在胺基與硫醇基之間配置3個碳原子之結構。Ra20~Ra25某些配置Na-7基、Na-8基或Na-9基作為取代基。又，Ra7之定義已記載，但限於化合物Na-10或化合物Na-11的情形，Ra7也可選擇Na-7基、Na-8基、Na-9基。Na-7基、Na-8基、Na-9基，僅限Ra-7或Ra20~Ra25之中某1處而選擇。Na-7基或Na-8基、Na-9基為選擇之取代基以外之Ra20~Ra25，除氫原子以外，能從也可經類藥的官能基經取代之烷基、芳基、雜芳基、芳烷基等選擇。較佳為從氫原子、烷基選擇。
選擇三角單元(N末端側)具硫酯基等活性酯之單元之情形，此等從例如化合物C-1、化合物C-2、化合物C-3、此外化合物Ca-1、化合物COH-1、化合物COH-2、化合物COH-3選擇。化合物C-1等在環化後會保留主鏈胺基，相對於此，化合物Ca-1、化合物COH-1、化合物COH-2、化合物COH-3不存在胺基，能成為更類藥，故較理想。於此情形，交叉單元可從化合物Na-10(Na-7基或Na-8基)或化合物Na-11(Na-7基或Na-8基)等選擇。該等化合物也可從經保護之狀態轉譯。可轉譯之保護基、及於RNA安定之反應條件之脫保護條件，可使用本說明書記載之方法。更佳為，從代謝安定性更高之觀點，利用化合物Na-7基，又更佳為利用Na-8基。
又，選擇交叉單元(C末端側)具有活性酯基之化合物C-1、化合物C-2、化合物C-3、或化合物COH-1、化合物COH-2、化合物COH-3等之情形，三角單元(N末端側)可選擇已述化合物N-1或化合物N-2，此外也可選擇化合物Na-10及化合物Na-11。以三角單元作為N末端之情形，化合物N-1、化合物N-2以外，選擇化合物Na-10(Na-8基、及Na-9基)或Na-11(Na-8基、及Na-9基)亦較佳。原因為若利用Na-7基，主鏈胺保留，類藥性下降。另一方面，三角單元不為N末端之情形，可使用化合物Na-10(Na-7基及Na-8基)及化合物Na-11(Na-7基及Na-8基)。於此情形，N末端宜使用胺基酸衍生物或N末端羧酸衍生物更佳。原因為N末端不會保留主鏈胺基。
又，對於化合物Na-10及化合物Na-11賦予者不限定於Na-7基、Na-8基、Na-9基。例如：Na-7基為α胺基酸骨架來源，但其也可為β胺基酸骨架。
Figure 107130626-A0101-12-0068-12
Figure 107130626-A0101-12-0069-13
通常使胺活化之手法，不限定於含有SH基作為前述反應輔助基。通常使胺活化之手法，也可直接導入雜原子而使胺之反應性提高。例如羥基胺(化合物F-1、化合物F-4、化合物F-5、化合物F-7)或烷氧胺(化合物F-2、化合物F-14、化合物F-15、化合物F-16)、疊氮化物(化合物F-3、化合物F-9、化合物F-10、化合物F-11)等。以此方式，藉由於胺基直接或伴隨連結子而在附近導入能成為反應輔助基之雜原子，使胺基活化之手法均包括在本案。與羥基胺之反應中，活性酯部可選擇化合物F-7或化合物F-8等。與烷氧胺之反應中，可選擇化合物F-17或化合物F-18等。與疊氮化物之反應中，可選擇化合物F-12或化合物F-13等。
R101、R102、R103、R104、R105、R106、R107為通常使用之胺基酸側鏈，係不限於天然型胺基酸之取代基。亦即，可從氫原子、可經取代之烷基、可經取代之烯基、可經取代之炔基、可經取代之芳基、可經取代之雜芳基、可經取代之芳烷基選擇。
R101、R102中之1個為氫原子、R103、R104中之1個為 氫原子、R106、R107中之1個為氫原子更佳。又，氫原子之配置宜為配置成使此等與L型胺基酸成為相同立體配置較佳。
R105從可經取代之烷基、可經取代之烯基、可經取代之炔基、可經取代之芳基、可經取代之芳烷基之中選擇。
Figure 107130626-A0101-12-0070-16
Figure 107130626-A0101-12-0071-2177
Figure 107130626-A0101-12-0072-18
與選擇如上述活化胺之情形對應之交叉單元候選者之活性酯的組合，可考慮例如硫酯與附近有硫醇之胺、α酮基酯與疊氮化物等的組合。
Figure 107130626-A0101-12-0073-19
有藉由利用initiation read through(開始跳讀：開始密碼子之跳讀)，而不須準備上述甲硫胺酸以外之胺基酸、胺基酸類似物或N末端羧酸類似物之N末端導入所為之末端為多樣化之胜肽化合物或胜肽化合物資料庫之合成法中的多種胺基醯基轉譯開始tRNA之方法。initiation read through，係指：一般而言，蛋白或胜肽從係以AUC密碼子編碼之轉譯開始胺基酸即甲硫胺酸開始轉譯，但無細胞轉譯系中不含轉譯開始甲硫胺醯基tRNA之情形或欲從轉譯效率低之非天然胺基酸附加到轉譯開始tRNA者開始轉譯時，從第2位後的密碼子編碼的胺基酸開始產生轉譯產物之現象。
利用Initiation read through之方法，可使用使編碼為胜肽之mRNA之開始密碼子後的第2位密碼子編碼為三角單元，並以不含甲硫胺酸或轉譯開始甲硫胺酸tRNA之轉譯系轉譯而製作N末端為三角單元之胜肽或胜肽資料庫之方法。其他方法，已知有使酵素，例如：peptide deformylase(胜肽 去甲醯基酶)與Methionine aminopeptidase(甲硫胺酸 胺基肽酶)作用而去除胜肽之N末端之甲硫胺酸之方法(非專利文獻：Meinnel,T.,et al.Biochimie(1993)75,1061-1075,Methionine as translation start signal：A review of the enzymes of the pathway in Escherichia coli.)。也可準備從轉譯開始甲硫胺酸開始的胜肽之資料庫，使甲硫胺酸胺基肽酶(Methionine aminopeptidase)作用以將N末端之甲硫胺酸除去，並製備N末端為無規之資料庫。又，利用轉譯開始甲硫胺酸等接續之第2位胺基酸並環化後以胺基肽酶處理，顯示能去除甲硫胺酸等N末端胺基酸。藉由此等，甲硫胺酸殘基不含於流程A之單元(單元數以全部轉譯後修飾已結束化學結構判斷者已定義)，且三角單元對應之胺基酸殘基成為第2位被編碼之胺基酸，結果可由多數密碼子編碼三角單元，所以自由度擴大為2種以上，可變處增加一個。三角單元可利用2種以上之胺基酸或胺基酸類似物，所以製作本發明之胜肽化合物或胜肽化合物資料庫時，可製作多樣性更增大之胜肽化合物或胜肽化合物資料庫。最大可使用與無規區域為同數之胺基酸或胺基酸類似物，能擴大至與無規區域為同數之自由度。在此，無規區域，係指本發明之胜肽化合物中能自由選擇胺基酸或胺基酸類似物之區域，本法 以外，指流程A之交叉單元及三角單元以外之區域(亦即黑圓單元與四角單元)，但本法中，三角單元也成為無規區域。能維持與三角單元帶有之交叉單元之反應性，並確保黑圓單元或四角單元帶有的結構多樣性。亦即，若使用本方法，為了轉譯後環化，在展示庫中以往須固定2個胺基酸(相當於三角單元與交叉單元)，相對於此，固定可減少成1個胺基酸(交叉單元)。例如：無規區域選擇之胺基酸及胺基酸類似物幾乎都具有主鏈胺基，所以若也將其應用於三角單元，N末端會配置有胺基之無規胺基酸序列。其中，能與共通存在之主鏈胺基以選擇性的醯胺鍵形成來進行醯胺環化。例如：在建構未導入離胺酸或精胺酸等鹼性胺基酸之展示庫之情形特別有用。從吾人的探討結果，具有類藥性之殘基數為13個殘基以下，所以待固定之單元之數從2減為1，意指無規區域之單元數從11增為12。能無規化之殘基數增加1個的價值，係指在為了維持類藥性之受限條件下將自由度活用的最大限度，價值非常高。
具體而言，能於交叉單元(直鏈部與環狀部與三角單元交叉之胺基酸)側鏈使羧酸或羧酸活性酯轉譯導入，故在固定之交叉單元與從無規的胺基酸選擇三角單元之間，可生成醯胺鍵(流程B)。建構資料庫時，交叉單元不須為1種，也可從2種以上選擇。具體而言，準備編碼為各交叉單元之密碼子、(胺基)醯基化tRNA，以於所望位置配置有交叉單元密碼子之mRNA為模板，可建構資料庫。
流程B
Figure 107130626-A0101-12-0076-20
作為不固定N末端(三角單元)而環化之資料庫建構之手法，例如醯胺環化之例(本手法，也利用於N末端固定之情形)。交叉單元可舉天冬胺酸衍生物為例，但此外也不限，例如可從化合物C-1、化合物C-2、化合物C-3表示化合物群之中選擇。只要是N-甲基天冬胺酸等N-烷基化體、麩胺酸衍生物等側鏈帶有羧酸之胺基酸或胺基酸類似物均可。(i)可導入於側鏈具有羧酸之胺基酸並使轉譯後活性酯化。例如：可如化合物E-1所示，將天冬胺酸本身轉譯導入。對於獲得之轉譯胜肽，利用羧酸與N末端胺之縮合反應可使醯胺環化。例如：可變換為如化合物E-2所示之N-羥基琥珀醯亞胺活性酯或HOBt、HOAt等活性酯。由於能使獲得之活性酯輕易與胺反應，因此可達成使N末端無規化之醯胺環化反應。本手法之達成，關鍵為選擇僅羧酸部位活性酯化，RNA(等核酸部位)不反應之手法。(ii)可導入於側鏈具有羧酸活性酯之胺基酸，並使其活性酯與胺反應。係預先使如化合物E-2之活性酯轉譯合成之手法。化合物E-2以外，也可將如化合物E-3之苄基硫酯、化合物E-4的芳基硫酯、烷基硫酯等轉譯導入。化合物E-4或化合物E-3的情形，係以苯基為例，但只要是芳基或雜芳基則不限制。又，芳基或雜芳基也可具有例如作為取代基之如鹵素 基、硝基、三氟甲基、腈等電子吸引基、或甲氧基等烷氧基、甲基等烷基之類的電子提供基等。考慮此等硫酯交換反應之速度及交換反應後之硫酯與胺之反應性或與水之副反應之選擇性，宜為該等均衡性良好之取代基為較佳。又，取代基，可從第三丁基或異丙基代表之大體積之取代基、於水中實施考慮與水之親和性之磺酸基、二甲胺基之類之二取代胺基、反之考慮親脂性之長鏈烷基等高脂溶性基等選擇。硝基、三氟甲基、鹵素等多種取代基也可同時導入。也可預先將如化合物E-4，比化合物E-3更有活性之硫芳基活性酯轉譯導入。硫酯，除了如此之芳烷基或芳基硫酯以外，也可從烷基硫酯選擇。本手法之達成，關鍵為轉譯合成中為安定且與無反應輔助基之胺有足夠反應性之2個性質同時兼具。(iii)也可將從硫酯等中轉譯合成時能確保充分安定性之活性酯轉譯導入後，添加轉譯後添加劑，使系中產生更有活性之活性酯並與無反應輔助基之胺予以環化反應。例如：對於經轉譯導入之硫酯從外部加入電子更缺乏的硫醇，使系中產生更有活性之硫酯並與胺環化反應。例如：化合物E-3等硫酯之例的情形，也可於轉譯後直接與胺基反應，但是也可將如三氟甲基苯基硫醇之反應性更高之硫醇加到轉譯系中，取代為更活化之活性酯E-4後與胺基反應。此外，也可添加例如：HOBt、HOAt、HONSu等已知形成活性酯之各種原料。添加劑可從該等中選擇1種，或選擇2種以上亦可。添加2種以上之添加劑的好處是比如反應性之提高。由於係在轉譯液中能充分安定地可轉譯之活性酯，故回到與各種胺基的反應性充分高之活性酯在能量方面係不利，如此之反應有時難 以1階段進行。如此之情形，也可從可轉譯之安定活性酯先回到能交換之活性較高之活性酯後，再回到與各種胺基的反應性充分高之活性酯。如此之多階段活化活性酯，連與反應性低之胺基也可進行醯胺化反應。該等活性酯等添加劑中也可導入取代基，例如，取代基，可具有鹵素基、硝基、三氟甲基、腈等電子吸引基、或甲氧基等烷氧基、甲基等烷基之類之電子提供基等。可從第三丁基或異丙基代表之大體積之取代基、於水中之實施，考慮與水之親和性之磺酸基、或羧基、羥基、二甲胺基之類之二取代胺基、反之考慮親脂性之長鏈烷基等高脂溶性基等選擇。(iv)將安定的活性酯與(iii)同樣先轉譯導入，實施轉譯後化學反應(例如脫保護反應)，以分子內反應活化後與不帶有反應輔助基之胺進行環化反應亦可。例如也可將如化合物E-5較安定之硫酯先轉譯導入，轉譯後進行S-S鍵結之脫保護，伴隨於此以分子內反應變換為反應性較高之芳基硫苯酚等後，再與胺反應亦可。又，也可藉由將(i)~(iv)之概念中的2個以上組合，達成本課題。如此，就有效活用Initiation read through法之1個手法，使N末端共通存在之胺基與交叉單元反應，能建構具有類藥(Druglike)環化部位，更富多樣性之展示庫。
Figure 107130626-A0101-12-0078-21
其中，(iii)之使用烷基硫酯或苄基硫酯等轉譯合成 中能確保足夠安定性且可轉譯導入之活性酯，添加轉譯後添加劑，使系中產生更有活性之活性酯，並使與無反應輔助基胺進行環化反應之情形，轉譯合成使用之活性酯，例如天冬胺酸之側鏈羧酸使用甲硫酯(Asp(SMe))等烷基硫酯或苄基硫酯(Asp(SBn))等芳烷基硫酯。
此等作為交叉單元轉譯合成後與不具反應輔助基之三角單元進行化學反應而加入之添加劑，例如4-(三氟甲基)苯硫醇等芳基硫醇或雜芳基硫醇，此等電子吸引基或電子提供基、脂溶性基或水溶性基等可經取代，較佳為電子吸引基。電子吸引基，例如三氟甲基或硝基或氟基等，較佳為三氟甲基程度之電子吸引基。
該等硫醇之添加量不特別限定，為了使反應性充分提高，比10mM多較佳，為了使添加劑溶解，比10M少較佳。更佳為50mM~5M之範圍，又更佳為200mM~2M。添加劑可直接以硫醇(酸性)之形式加入，但宜將酸性部以三乙胺等鹼以當量數加入並中和，於中性條件添加較佳。
活性較高之活性酯會有與轉譯反應系內存在之各種試藥反應之情形。例如：通常利用之Tris緩衝液中之胺成分(參羥基甲胺基乙烷)也能成為其中1個，所以宜於不含反應性胺成分之緩衝液中進行轉譯合成及追加用於化學反應之緩衝液較佳。如此之緩衝液例如HEPES緩衝液、磷酸緩衝液等。
又，為了避免在反應進行的同時伴隨副反應即空氣中之氧化反應(S-S形成反應)使得反應進行必要之硫醇量之減少，且為避免鹼性增高成為水解之生成之優良條件，也可於 反應轉譯液中追加緩衝液。又，也可添加如參(2-羧基乙基)膦之還原劑。又，環化反應儘可能不接觸空氣中之氧亦為有效。
化學反應中之溶劑之pH為了使RNA安定存在，宜為2~10較佳。為了使化學反應順利進行，為7.8以上較佳，為了抑制水解之生成，維持9.2以下較佳。就反應條件而言，可於PureSystem等反應轉譯液中單獨實施，也可於其中添加DMF或NMP等有機溶劑。又，也可將轉譯液以管柱精製等精製後變更溶劑再實施。反應溫度，只要是通常化學反應能實施之範圍即可，不特別限定，較佳為15℃~80℃，更佳為25℃~50℃。
使環化反應順利進行之三角單元，不特別限制，胺基為1級胺、2級胺(例如N-甲基等N-烷基)均可容許，胺基酸側鏈部位之取代基也不限定。尤其，胺基旁邊的碳原子為無取代(CH2)的情形，1級胺、2級胺均可容許。2級胺之中，甲基較佳。胺基旁邊的碳原子存在取代基之情形，1級胺較佳。取代基部分，如Ala或Phe，β位為CH2者，優於Val或Thr等。又，如脯胺酸之氮原子與α位之碳原子形成了5員環之胺基酸、或同樣為4員環或6員環等之環狀2級胺亦較理想。
以上已敘述未固定N末端(三角單元)而環化之資料庫建構之手法之例，但該不使用反應輔助基之胺基與活性酯基之縮合反應所為之醯胺環化反應之利用，不限於與N末端之主鏈胺基之反應。可將胺基酸、胺基酸類似物之側鏈之胺基、或N末端羧酸衍生物之胺基、與胺基酸、胺基酸類似物之側鏈之活性酯或N末端羧酸衍生物之活性酯以任意組合實施。
又，本手法，與流程C的情形同樣，可於三角單元配置有活性酯之單元，於交叉單元側配置胺側鏈，也可活性酯與胺基配置在三角單元與交叉單元之其中之一。
如此之組合之例如下。
在選擇交叉單元具有活性酯基之單元之情形，交叉單元可從化合物C-1、或化合物C-2、化合物C-3或化合物COH-1、化合物COH-2、化合物COH-3選擇。選擇此等6種化合物之情形，總是C末端側正後之胺基酸從經N-烷基化之單元之中選擇較佳。該限制係為了避免天冬醯亞胺形成之副反應，為此等6種化合物被選擇之情形之共通理想選擇。從代謝安定性之觀點，化合物C-1、或化合物C-2、化合物C-3較佳。如此之情形，三角單元也可從化合物Na-1、化合物Na-2、化合物Na-3之中選擇。三角單元為N末端(三角單元)未固定之情形，也可從該等化合物同時選擇多個。
化合物Na-1及化合物Na-2、化合物Na-3中的任意者也可將側鏈胺基予以保護。有保護之情形，係與環化反應同時或事前脫保護後進行環化反應。保護基或脫保護之條件，可利用本說明書記載之方法。
化合物Na-1之Ra13可從氫原子或C1-C6烷基或芳烷基等選擇。此等羥基或氟基、醚基等也可經於類藥定義之官能基取代。較佳為氫原子、或甲基、乙基、正丙基、苄基。
化合物Na-2之Ra1，可以與Ra13同樣選擇。尤佳為自氫原子或甲基選擇。Ra2也可與Ra13同樣選擇，但較佳為氫原子或甲基。尤佳為氫原子。選擇氫原子之情形，其立體 配置就胺基酸而言為L型與D型均可。更佳為L型之立體配置為較佳。Ra3可以與R13同樣選擇。Ra3與Ra4也可形成環。尤佳為氫原子。Ra4可從氫原子、烷基、環烷基、芳烷基、雜芳基、芳基選擇。此等也可經類藥定義之官能基取代。又，Ra4也可與Ra1同時形成環。例如：脯胺酸等相當於該環。
化合物Na-3之Ra11，可以與Ra13同樣選擇，尤佳為氫原子、或甲基、乙基、正丙基、苄基。尤佳為氫原子。Ra9可以與Ra4同樣地選擇。從氫原子或C1-C6烷基或芳烷基選擇較佳。此等也可經類藥定義之官能基取代。又，Ra9與Ra11也可形成環。環之尺寸為3~8員環為較佳。環形成，尤以5員環及6員環為佳。Ra9之取代基，尤佳為氫原子。Ra10及Ra12，可以與Ra4同樣選擇。較佳為與Ra13同樣選擇。更佳為Ra10或Ra12之中任意者為氫原子。尤佳為Ra10及Ra12均為氫原子。於此情形，N末端從胺基酸衍生物或N末端羧酸衍生物選擇較佳。N末端之主鏈若存在胺基，從反應選擇性之觀點為不利，原因為，轉譯修飾結束後仍保留胺基，類藥性下降。
交叉單元從化合物C-1、或化合物C-2、化合物C-3選擇之情形，作為三角單元，係使三角單元配置於N末端以外，固定三角單元之情形，三角單元可從化合物Na-4或化合物Na-5選擇。
化合物Na-4之Ra5，可以與Ra1同樣地選擇。Ra6，可以與Ra2同樣地選擇。Ra7，可以與Ra4同樣地選擇。更佳為氫原子或甲基。尤佳為氫原子。Ra8，可以與R4同樣從次結構N-3、N-4,N-5等C1~C6單元之伸烷基、N-6、N-7、N-8(不 僅包括鄰位取代，也包括間位取代、對位取代)選擇。又，在此，R13~R22之取代基可從於類藥選擇之官能基之中，不與活性酯或胺基反應之官能基之中選擇。較佳為從具有可具有取代基之C4~C6伸烷基單元或芳基之次結構N-6、N-7、N-8等選擇。
化合物Na-5之Ra5，可與Ra1同樣地選擇。Ra6，可與Ra2同樣地選擇。Ra7，可與Ra4同樣地選擇。更佳為氫原子或甲基。尤佳為氫原子。Ra8，可與R4同樣從次結構N-3、N-4,N-5等C1~C6單元之伸烷基、N-6、N-7、N-8(不僅包括鄰位，也包括間位取代、對位取代)選擇。又，在此，R13~R22之取代基可從於類藥選擇之官能基之中，不與活性酯或胺基反應之官能基之中選擇。較佳為從具有可具有取代基之C4~C6伸烷基單元或芳基之次結構N-6、N-7、N-8等選擇。
化合物Na-4及化合物Na-5之任意者之側鏈胺基可經保護。有保護之情形，與環化反應同時或事前脫保護後進行環化反應。保護基或脫保護之條件可利用本說明書記載之方法。
交叉單元係從化合物C-1、或化合物C-2、化合物C-3選擇之情形，作為三角單元，使三角單元配置於N末端、於與側鏈之胺基環化之情形，三角單元除了化合物Na-4、化合物Na-5以外，也可從具有胺基與羧基之廣泛化合物群之中選擇。轉譯合成時，可使各種單元轉譯合成作為N末端羧酸類似物。只要具有能醯胺環化之胺基與能胜肽轉譯之羧酸即不特別限定。較佳為具有使胺基與羧酸基接合之2價單元之官能基， 係從類藥的官能基之中選擇。如此之化合物之一例，例如化合物Na-6。化合物Na-6之Ra9，也可從也可經類藥的官能基經取代之烷基、環烷基、芳基、雜芳基、芳烷基選擇。以外，也容許-NRCOR'基(R及R'為類藥的取代基)或-OR(R為類藥的取代基)或NR基(R部分包括胺基酸或二胜肽、三胜肽等)等。
另一方面，交叉單元也可能存在胺基側之單元。例如選擇化合物Na-4或化合物Na-5之情形，三角單元可選擇化合物C-1、化合物C-2、化合物C-3、化合物COH-1、化合物COH-2、化合物COH-3等。於此情形，比起三角單元更N末端側也有直鏈部存在而且N末端係從N末端羧酸衍生物選擇時，從類藥之觀點較為理想。
例如選擇化合物Na-4或化合物Na-5之情形，三角單元可選擇化合物COH-1、化合物COH-2、化合物COH-3等。於此情形，比起三角單元更N末端側也有直鏈部存在而且N末端係從N末端羧酸衍生物選擇時，從類藥之觀點較為理想。
又，交叉單元選擇化合物Na-4、化合物Na-5等之情形，三角單元也可選擇化合物Ca-1。
Figure 107130626-A0101-12-0084-22
Figure 107130626-A0101-12-0085-23
‧直鏈部2(分支部位)之賦予
使直鏈部2產生之手法，可使用將α-羥基羧酸等主鏈不帶有胺基而將酯鍵轉譯合成而能形成之胺基酸類似物及具有可經保護之胺基側鏈(保護基係作為胺基之保護基作用，只要能提供受轉譯合成之胺基酸則不特別限定)之胺基酸兩者予以轉譯導入後進行轉譯後修飾之手法(流程E)。應用於展示庫時，係從被轉譯之單元選擇。但是利用之後之最適化獲得之胜肽化合物中，包括即使該胜肽化合物本身未被轉譯合成，由轉譯合成後之轉譯後修飾獲得者。α-羥基羧酸部位之側鏈不特別限定，於流程E記載之手法中，尤於轉譯合成之觀點，Re1具有氫原子(甘醇酸(HOGly)本身)或側鏈有硫醇基(SH基)或經保護之硫醇基為較佳。側鏈之立體配置也不特別限定，於α位有氫原子存在之情形，與L型胺基酸採取同樣立體配置更佳。硫醇基或經保護之硫醇基之配置也不特別限定，宜配置於OH基之β位、或γ位(亦即，Re1可經保護之巰基甲基或巰基乙基)尤佳。該等硫醇基或經保護之硫醇基，係從α-羥基羧酸側鏈之可經取代之烷基、烯基、炔基、環烷基、芳烷基、芳基、雜芳基配置(加成)。此等α-羥基羧酸側鏈之取代基，若去除已加成之硫醇基或經保護之硫醇基，則以類藥的胺基酸之側鏈定義之取 代基更佳。
具有胺基側鏈之胺基酸之種類，只要有胺基即可，可為可經取代之烷胺基、烯胺基、炔基胺基、芳烷胺基、芳胺基、雜芳胺基、環烷胺基任意者，不特別限定，側鏈可同時具有硫醇基(SH基)或經保護之硫醇基。該等取代基若去除反應輔助基(例如SH基)，宜以類藥的胺基酸之側鏈定義之取代基較佳。再者，從可轉譯合成之取代基選擇更佳。又，流程中NH2表示之部位之氫原子其中1個指定為氫原子，但也可更多1個氫原子以可經取代之烷基、烯基、炔基、芳烷基、芳基、雜芳基、環烷基取代，也可對此等賦予反應輔助基，但較佳為NH2基。該等取代基亦若去除反應輔助基(例如SH基)，宜以類藥的胺基酸之側鏈定義之取代基較佳。再者，從可轉譯合成之取代基選擇更佳。準備將編碼為α-羥基羧酸等不帶胺基而能形成酯鍵之胺基酸類似物之密碼子(A)、將其醯基化而得之tRNA、編碼為具有胺基側鏈之胺基酸之密碼子(B)、將其予以胺基醯基化而得之tRNA，以密碼子(A)與密碼子(B)之間配置所望之數(較佳為0~7個，更佳為0~2個)之無規密碼子之mRNA作為模板而得之胜肽，先以上述方法或他法環化。將密碼子A配置於較密碼子B更為N末端側。獲得之環化胜肽(例如可使用流程B或流程C之手法)，視需要於側鏈胺基存在保護基之情形予以脫保護，水解或從外部加入添加劑使酯部位活化，則醯胺鍵能不水解而將酯鍵予以水解或活化(活性酯化、活性硫酯化)。獲得之主鏈羧酸或活性(硫)酯與側鏈胺進行分子內環化反應，能獲得所望之分支胜肽即直鏈部2之胜肽。例如：從外 部加入之添加劑，可列舉能形成硫醇化合物、HONSu、HOBt、HOAt等各種活性酯之化合物群、或該等之2種以上之混合物。流程E中舉密碼子A使用經Re1取代之羥基羧酸、密碼子B使用離胺酸之例。
Re1為氫原子的情形，第1次之環化(三角單元與交叉單元之環化)反應中，三角單元可選擇在胺部位具有反應輔助基者，但也可選擇不帶有反應輔助基者。選擇具有反應輔助基之單元作為三角單元之情形(例如化合物N-1或化合物N-2)，第1次之環化反應能輕易進行。與可轉譯合成之側鏈具有硫酯之交叉單元之反應，可在pH7附近(轉譯條件)加入反應添加物，也可不加入。另一方面，選擇不具反應輔助基之單元當作三角單元之情形(例如選擇化合物Na-2所含之Ala或Phe之情形)，為了使第1次之反應進行，宜加入如三氟甲硫基苯酚之添加劑更佳。將pH升高到7.8附近，於37℃~50℃附近之反應溫度施以約6~10小時之反應時間更佳。又，進行第2次之分支化反應時，胺部位可無反應輔助基，但胺部位具有反應輔助基更佳，於此情形，NH基經保護較佳。此情形之酯之活化劑，宜添加硫醇較佳。硫醇宜為烷基硫醇較佳，尤其從添加劑之溶解性之觀點，具有水溶性取代基之烷基硫醇較佳，其中，2-二甲胺基乙烷硫醇、2-巰基乙烷磺酸為較佳。此等硫醇之添加量不特別限定，從充分提高反應性之目的，比10mM多較佳，從使添加劑溶解之目的，比10M少較佳。更佳為100mM~5M之範圍，又更佳為500mM~4M。胺部位之選擇不特別限定，於具有脫保護之情形之反應條件，與流程F2記載者 相同。
Figure 107130626-A0101-12-0088-24
作為流程E之方法之變法可有各種手法。例如：將使用Re1部位具有SH基、或經保護之SH基之羥基羧酸，在胺側鏈部位或經保護之胺側鏈部位之胺附近導入SH基、或經保護之SH基等反應輔助基而得之胺基酸等予以轉譯導入亦可。於此情形，對轉譯獲得之胜肽之SH基賦予之保護基、及視需要經保護之情形之胺部位若脫保護，可輕易地產生流程F所示之酯→硫酯交換。獲得之硫酯由於可輕易地與具有反應輔助基之胺反應，所以能獲得具有所望之分支胜肽(直鏈部2)之胜肽。獲得之含SH基之分支胜肽之SH基，可於RNA不涉及化學反應之程度之溫和反應條件輕易地脫硫。於此情形亦為，為了使(硫)酯更活化，可從外部加入添加劑。流程F之手法中， 轉譯後環化部之環化反應可在本直鏈部2形成反應之前後均可進行。
如上述，羥基羧酸與胺側鏈部位之兩者可具有SH基或經保護之SH基等反應輔助基，或只有其中任一具有反應輔助基，或兩者均不具反應輔助基亦可。又，胺側鏈部位可具有保護基也可不具保護基。
又，任一情形均為可加入使反應加速之添加劑。添加劑，例如可經取代之烷基硫醇、可經取代之烯基硫醇基、可經取代之炔基硫醇基、可經取代之芳烷基硫醇、可經取代之芳基硫醇、可經取代之雜芳基硫醇基、可經取代之環烷基硫醇基。又，HOBt、HONSu、HOAt、對硝基苯酚等通常使活性酯化之試藥、或其衍生物亦可。加入添加劑之情形，轉譯後環化部之環化反應實施後實施本直鏈部2形成反應較佳。添加劑之取代基，與前述"胺基酸"之側鏈定義者同樣，可選擇自由取代基。
又，使產生直鏈部2之手法，與將α-羥基羧酸等的酯官能基導入而使產生硫酯之點為相同，但也可使用從在α-羥基羧酸之N末端側正前之2個序列配置Cys與Pro之例如Cys-Pro-HOGly序列產生硫酯之手法(參照流程F2)。流程F2中，顯示為了使分支之活性硫酯產生序列，係具有連接Cys-Pro而在側鏈具有Rf5之α-羥基羧酸，且作為與其反應之胺基酸，使用側鏈具有胺基之離胺酸之例。準備將編碼為α-羥基羧酸等不帶胺基而能形成酯鍵之胺基酸類似物之密碼子(A)、將其醯基化而得之tRNA、編碼為具有胺基側鏈之胺基酸之密碼子(B)、將其予以胺基醯基化而得之tRNA，以密碼子(A)與密碼 子(B)之間配置所望之數(較佳為0~7個，更佳為0~2個)之無規密碼子之mRNA作為模板而得之胜肽，先以上述方法或他法環化。例如流程B或流程C。將密碼子A配置於較密碼子B更為N末端側。Cys-Pro-HOGly等分支產生部位，係於第1次之環化反應條件中穩定地不產生化學反應而存在，之後，視需要在加入4-三氟甲基苯基硫醇等硫醇作為添加劑的同時，將pH調整為鹼性側(例如9)並重新產生活性硫酯後，經由更有活性之三氟甲基苯基硫酯，而生成與離胺酸之側鏈胺基等形成有醯胺鍵之分支胜肽(側鏈胺基有保護基存在之情形，先行實施脫保護反應)。之後，視需要也可實施脫SH反應等去除反應輔助基之反應。此反應，在分支胜肽生成前的Cys-Pro-HOGly結構當中Cys與Pro脫離並生成分支胜肽(所有轉譯後修飾結束時)不包括。因此此等不包括黑圓單元也不包括四角單元。因此依分支胜肽生成時之單元數，也計算類藥的單元數。
α-羥基羧酸部位之α位(Rf5)，從氫原子、可經取代之烷基、芳烷基、雜芳基、環烷基、芳基等中選擇。取代基宜為類藥的官能基為較佳。尤其，該硫酯產生部位，宜在第1次之環化之反應條件為安定且維持前驅體(例如Cys-Pro-HOGly)結構較佳，氫原子、甲基等烷基或苄基等芳烷基為較佳。
又，該部分之Rf5之取代基，於將主鏈OH基替換為胺基之情形之立體結構，為L型及D型胺基酸對應者均可容許，但從轉譯效率之觀點，尤以L型之立體結構對應者較佳。尤其，若為能從ARS(autonomous replication sequence)轉譯之單元，能提高轉譯效率，故為較理想。如此之例，可列舉Lac 等。該具有與硫酯反應而形成分支之胺基側鏈的胺基酸之側鏈，只要具有胺基及可經保護之胺基即可，不特別限定，當利用未經保護之胺基之情形，須比起第1次之環化使用之胺基反應性更低足夠低。胺基可為2級胺、1級胺均可，但為了使分支化反應以良好效率進行，1級胺更良好。胺基或可經保護之胺基之附近，可存在如SH基等之反應輔助基，也可將此等予以保護。具有胺基側鏈之胺基酸之種類，只要是有胺基即可，可為可經取代之烷胺基、芳烷胺基、芳胺基、雜芳胺基、環烷胺基之任意者，不特別限定，側鏈也可同時具有硫醇基(SH基)或經保護之硫醇基。該等取代基若去除反應輔助基(例如SH基)，宜以類藥的胺基酸之側鏈定義之取代基較佳。再者，從可轉譯合成之取代基選擇更佳。又，流程中NH2表示之部位之氫原子之1個係指定為氫原子，但也可有另1個氫原子取代為可經取代之烷基、烯基、炔基、芳烷基、芳基、雜芳基、環烷基，對此等也可賦予反應輔助基，但較佳為NH2基。該等取代基若去除反應輔助基(例如SH基)，宜為以類藥的胺基酸之側鏈定義之取代基較佳。再者，從可轉譯合成之取代基選擇更佳。
第1次之環化與分支化均為醯胺鍵結之反應例，如流程F3。為了獲得本分支胜肽，三角單元，係從化合物N-1或化合物N-2代表之具有反應輔助基之胺基酸或胺基酸衍生物或N末端羧酸衍生物、或不具反應輔助基之化合物Na-1、化合物Na-2、化合物Na-3、或化合物Na-4、Na-5、Na-6等選擇。交叉單元，從化合物C-1代表之活性酯之中選擇。第2次 之分支化反應時作為受活性酯化之部位，從化合物e1代表之α-羥基羧酸衍生物、或化合物F5表示之由Cys-Pro-α-羥基羧酸之3個構成要素構成之部位、或化合物C-1代表之活性酯等選擇(Cys、Pro、α-羥基羧酸，各從分別之單元由tRNA轉譯，但由於轉譯修飾後Cys與Pro脫離，所以其2個不屬於黑圓單元亦不屬於四角單元。α-羥基羧酸成為四角單元)。又，在該分支化反應具有胺基之部位，係從化合物Na-4或化合物Na-10、化合物Na-11(又，該等NH表示之H原子在轉譯合成中也可受保護)代表之化合物選擇。如此之例，可列舉離胺酸等無保護胺，此外化合物tk100、tk101、tk102、tk103、tk104、tk34、tk7、tk14、tk105、tk106、tk107、tk108等。
本概念中，利用分支化能較以往以展示庫展示多樣之結構體。藉此，可期待取得以往困難之對藥效標的結合之分子或抑制之分子等有各種功能之化合物之可能性更為提高。為了能使如此之分支化為可能，本手法之價值係第1次之環化反應不僅限於類藥的環化的情況，若能以第2次之環化反應形成類藥的環化，則第1次之環化反應可為任意環化反應。於能形成多樣結構體之觀點，第1次之環化反應不拘於類藥的環化反應之本方法係有用。如此之情形，從轉譯物產生活性酯之所有手法都包括在本手法之範疇。例如：化合物F5、化合物e1、化合物C-1、化合物C-2、化合物C-3等。又，第2次胺基部位，可列舉可經保護之化合物Na-4、化合物Na-5、化合物Na-10(Na-7基與Na-8基之情形)、化合物Na-11(Na-7基與Na-8基之情形)等。
選擇具有反應輔助基之單元作為三角單元之情形(例如化合物N-1或化合物N-2)，第1次之環化反應能輕易進行。與可轉譯合成之側鏈具有硫酯之交叉單元之反應，係於pH7附近(轉譯條件)，可加入反應添加物也可不加。於此情形，第2次之分支化使用之部位之選擇多。亦即，能使化合物e1安定存在，化合物F5中，Rf5為氫原子以外為較佳，但也能容許氫原子能安定存在之情況。胺基側之單元，可容許胺基未經保護之單元，如不具例如Lys之反應輔助基之胺基。又，胺基可經保護，具有反應輔助基之胺可經保護。此等所有的情形可利用。視需要將保護基除去後，經由分支反應，接著經由去除反應輔助基之步驟，可獲得所望之分支胜肽。
化合物e1之Rf1基之選擇已於前述，更佳為從氫原子、可經保護之巰基烷基(被保護的為SH基)選擇。尤佳為從氫原子、或可經保護之巰基甲基或2-巰基乙基選擇。
化合物F5之Rf2基從可經保護之巰基烷基選擇。含Rf2之胺基酸之立體配置為L型為較佳。更佳為從可經保護之巰基甲基或2-巰基乙基選擇。Rt3基，可與Ra13同樣地選擇。較佳為與Ra1同樣地選擇。尤佳為甲基或與Rf4形成環。環之尺寸為3~8員環較佳，更佳為4~6員環。形成此等環之碳原子，也可經以類藥的胺基酸之側鏈定義之取代基經取代。5員環之代表例，為脯胺酸等為較佳。Rf4，也可與Ra4同樣地選擇。
另一方面，選擇不具反應輔助基之單元作為三角單元之情形(例如選擇化合物Na-2含有之Ala或Phe之情形)，為了進行第1次之反應，添加如三氟甲硫基苯酚之添加劑更 佳。使pH升到7.8附近，於37℃~50℃附近之反應溫度施以約6~10小時之反應時間更佳。為此，分支化部位於於如此之反應條件不會化學反應，而安定存在較佳。因此宜選擇在分支反應涉及醯胺鍵生成之胺基部位具有如Lys之未經保護之胺基之單元較佳。亦即，化合物Na-4或化合物Na-10或化合物Na-11之NH基(反應輔助基也是)經保護較佳。若具有經保護之胺基，則即使具有可經保護之反應輔助基(例如化合物tk100)或不具有(例如tk104)亦可。該等保護基，在轉譯中及第1次之環化反應中須安定存在。如此之保護基，例如三氟乙醯基、4-疊氮化苄基氧羰基、3-硝基-2-吡啶硫基(sulfenyl)、噻唑烷(thiazolidine)環所形成的保護基。三氟乙醯基於pH大於8之情形，先會選擇性脫保護。4-疊氮化苄基氧羰基會在加入還原劑即參(2-羧基乙基)膦之情形才選擇性脫保護。3-硝基-2-吡啶硫基(sulfenyl)，於pH4且加入添加劑2-巰基吡啶之情形才選擇性脫保護。利用噻唑烷環形成的保護基，在pH4且加入添加劑二硫二吡啶並使噻唑烷環開環後，加入參(2-羧基乙基)膦才選擇性脫保護。如此，可從能轉譯合成之胺基之保護基且轉譯合成中及第1次之環化反應中為安定且於RNA為安定之反應條件在第1次之環化後能選擇性脫保護之保護基中選擇。又，第2次之分支化時產生之硫酯之前驅體部位係從化合物e1選擇之情形，Rf1部位為氫原子或Rf1部位存在反應輔助基(例如SH基)較佳，但其反應輔助基宜經保護較佳。從化合物F5選擇之情形，Rf5為氫原子以外為較佳。例如如此之例，Rf5可列舉甲基或苄基等。羥基部位之α位(Rf5)為氫原子之情形，不 能避免硫酯生成，第1次之環化反應不能選擇性進行，相對於此，於此位置配置1個以上之碳原子之情形，可抑制在第1次之環化反應條件生成硫酯。如此，於選擇分支化部位之情形，係視須要實施胺部位或硫酯部位之脫保護反應後，將pH升到8.2以上使分支化。如此，在第1次之環化反應中使安定存在，經過脫保護步驟實施分支化反應，最後視需要將反應輔助基除去，可獲得分支胜肽。
具有於分支化反應形成醯胺鍵之胺基之化學結構及關於其保護基之記載如下。
由轉譯合成獲得之胜肽化合物-核酸複合體之化學修飾使用之胺基之保護基及其之脫保護方法
在此記載之胺基之保護基，定義為不僅是使單一之1級胺或2級胺之反應性失活或活性下降之官能基，而也包括以1個官能基使多數胺基或其他雜原子同時鈍化之結構。例如：噻唑烷環、噻嗪烷(thiazinane)環、噁唑烷環、咪唑烷環也包括在胺基之保護基的定義。形成該等保護基之碳原子可經取代。
Figure 107130626-A0101-12-0095-25
上述保護基，係指藉由以下1)至6)之任意者、或1)至6)的多數組合而能脫保護之保護基：1)於酸性條件脫離之保護基、2)於鹼性條件脫離之保護基、3)於氧化的條件脫離之保護基、4)於還原的條件脫離之保護基、5)因光照射脫離之保護基、6)親核劑之添加脫離之保護基。
於酸性條件脫離之保護基，係於pH1至pH7之範圍脫離之保護基，較佳為於pH2至pH6之範圍可脫保護之保護基，例如以下所示之三苯甲基(Tr)、N-(4-甲氧基苯基)二苯基甲基(MMTr)、3、5-二甲氧基苯基異丙氧羰基(Ddz)、2-(4-聯苯)異丙氧羰基(Bpoc)。(非專利文獻i)Greene's Protective Groups in Organic Synthesis，Fourth Edition，ii)Chemical Reviews，2009，109(6)，2455-2504)。形成該等保護基之碳原子可經取代。
Figure 107130626-A0101-12-0096-26
於鹼性條件脫離之保護基，係於pH7至pH14之範圍脫離之保護基，較佳為pH7至pH10之範圍可脫保護之保護基，例如：賦予極度電子吸引基之2-[苯基(甲基)二氫硫基(sulfonio)]乙氧羰基等。例如導入有鹵素基或硝基、三氟基等1個或多個導入之三氯乙醯基等。具體而言以下所示之三氟乙醯基(Tfa)。(非專利文獻i)Greene's Protective Groups in 0rganic Synthesis，Fourth Edition，ii)Chemical Reviews，2009，109(6)，2455-2504)
Figure 107130626-A0101-12-0096-2178
於氧化的條件脫離之保護基，係如碘存在下可脫保護之以下所示之戊烯醯基(pentenoyl)Greene's Protective Groups in Organic Synthesis，Fourth Edition，ii)The Journal of Organic Chemistry，1997，62，778-779，iii)Method，2005，36，245-251)
Figure 107130626-A0101-12-0097-28
於還原的條件脫離之保護基，如於參(2-羧基乙基)膦(TCEP)，或二硫蘇糖醇(DTT)存在下可脫保護之保護基，如疊氮基(非專利文獻ChemBioChem，2009，10，1186-1192)、4-疊氮化苄基氧羰基(p-Acbz)(非專利文獻Journal of the Chemical Society，Perkin Transactions 1，1996，1205-1211)、2-疊氮化苄基氧羰基(o-Acbz)、疊氮化物甲氧羰基(Azoc)(非專利文獻Organic Letters，2007，9(11)，2223-2225)、苯基二硫烷基乙基氧羰基(Phdec)、2-吡啶基二硫烷基乙基氧羰基(Pydec)(非專利文獻Chemical Reviews，2009，109(6)，2455-2504)。形成該等保護基之碳原子可經取代。
Figure 107130626-A0101-12-0097-29
因光照射脫離之保護基，如鄰硝基苄基氧羰基(oNz)、4,5-二甲氧基-2-硝基苯氧基)羰基(Nvoc)、2-(2-硝基苯基)丙基氧羰基(Nppoc)。(非專利文獻i)Chemical Reviews，2009，109(6)，2455-2504、ii)The Journal of Organic Chemistry，1997，62，778-779、iii)Bioorganic & Medicinal Chemistry，2012，20， 2679-2689)。形成該等保護基之碳原子可經取代。
Figure 107130626-A0101-12-0098-30
由於親核劑之添加脫離之保護基，例如於硫醇存在下脫保護之保護基，例如：鄰硝基苯磺醯基(o-NBS)、2、4-二硝基苯磺醯基(dNBS)、二硫琥珀醯基(Dts)。(非專利文獻Chemical Reviews，2009，109(6)，2455-2504)。形成該等保護基之碳原子可經取代。
Figure 107130626-A0101-12-0098-31
藉由組合前述1)至6)多種而可脫保護之保護基，例如就組合1)與6)之脫保護方法，於pH2至pH6之範圍添加硫醇可脫保護之保護基，例如3-硝基-2-吡啶硫基(sulfenyl)(Npys)(非專利文獻i)International Journal of Peptide and Protein Research，1990，35，545-549、ii)International Journal of Peptide and Protein Research，1980，16，392-401)、2-硝基苯基硫基(sulfenyl)(Nps)(非專利文獻Chemical Reviews，2009，109(6)，2455-2504)。。形成該等保護基之碳原子可經取代。
Figure 107130626-A0101-12-0098-32
又，適用組合1)與3)之脫保護方法之保護基，例 如於pH2至pH6之範圍添加二硫醚化合物可脫保護之保護基、例如噻唑啉環、噻
Figure 107130626-A0101-12-0099-39
烷環。形成該等保護基之碳原子可經取代。
Figure 107130626-A0101-12-0099-33
利用噻唑烷環及噻
Figure 107130626-A0101-12-0099-40
烷環之開環所為之胺基之脫保護方法
利用硫醇之親核性之Native Chemical Ligation(NCL)所為之醯胺化反應，為胜肽及蛋白質之化學合成有用之手法。於以連續醯胺化反應或任意時點進行NCL之情形，先保護胺基及硫醇基係有用手段，例如非專利文獻v1記載之利用胜肽鏈之多階段醯胺化所為之蛋白質合成、或非專利文獻v2記載之蛋白質之化學修飾，報告了使用噻唑烷環作為同時保護半胱胺酸之胺基及硫醇基之結構。
胜肽結構中之噻唑烷環之胺基、硫醇基之脫保護方法，已有公知方法即於pH4至pH7之緩衝液中添加甲氧胺之方法(例如非專利文獻v1(Angewandte Chemie,International Edition,2006,45(24),3985-3988)及非專利文獻v2(Journal of the American Chemical Society,2011,133,11418-11421))，例如本案記載之胜肽化合物中，含酯、或硫酯之結構當進行脫保護反應時或以同一容器(one pot)進行下一反應時，會有作為副反應之生成甲氧胺與酯部分反應而得之烷氧基醯胺之危險。
本案發明人等就不使用甲氧胺之噻唑烷環及噻
Figure 107130626-A0101-12-0100-42
烷環之脫保護方法，開發出添加二硫醚化合物之方法。
本手法，特徵為於酸性條件下將噻唑烷環及噻
Figure 107130626-A0101-12-0100-41
烷環開環，並衍生為胺基二硫醚結構，且接續可藉由添加還原劑衍生為胺基硫醇。
本手法，係於水中，緩衝液中，或與水混合之有機溶劑中進行。使用之有機溶劑，選擇能與水混合、且不與基質反應或不析出者。例如使用N,N-二甲基乙醯胺、N、N-二甲基甲醯胺、乙腈。水與有機溶劑之比例，取決於基質及二硫醚化合物之溶解性，例如以10mM之二硫二吡啶進行反應之情形，從二硫二吡啶之溶解性之觀點，使用5%以上之N,N-二甲基乙醯胺較佳。
為了將噻唑烷環開環之pH範圍，於使反應於12小時以內結束為目的之情形，pH1~5為較佳。又，操作具有於酸性不安定之噻唑烷環之化合物之情形，pH4~5為較佳。
為了將噻唑烷環開環之反應溫度，於使反應於12小時以內結束為目的之情形，15℃以上為較佳。操作具有對熱不安定之噻唑烷環之化合物之情形，15~50℃之範圍為較佳。
添加之二硫醚化合物，例如二烷基二硫醚或二芳基二硫醚，二芳基二硫醚較佳，又二硫二吡啶更好。
二硫二吡啶之使用量，取決於噻唑烷衍生物之使用量決定，若對於例如1.0mM之噻唑烷衍生物使用30mM之二硫二吡啶並於pH4.2、36℃進行反應，能於12小時以內完成噻唑烷環之開環。
從胺基二硫醚結構變換為胺基硫醇之還原劑，可 使用烷基膦、芳基膦、有還原力之硫醇化合物，例如使用TCEP、DTT。於對於胺基硫醇之變換快速進行之情形，TCEP為較佳。
TCEP之使用量取決於使用之噻唑烷衍生物與二硫二吡啶之使用量決定，將例如1mM之噻唑烷衍生物利用30mM之二硫二吡啶衍生成2-(2-吡啶基二硫)乙胺體之情形，若使用40mM之TCEP並於pH4.5、24℃反應，能於1小時以內完成衍生為胺基乙烷硫醇體。
如此，從mRNA之一次序列資訊轉譯之直鏈胜肽序列使分支結構形成之技術，可建構習知技術無法做到之具有分支結構之結構多樣性高之胜肽群之mRNA展示庫。
如上已敘述關聯羥基羧酸之Chemical Space擴大胜肽合成法，但本概念不限於流程E及流程F、流程F2、流程F3之手法。第1次之環化反應不限於上述環化反應，能分支化反應(第1次之環化反應中安定存在，且於RNA安定之反應條件分支化之活化為可能)之反應條件可適用之所有環化反應都可適用。可以活用第2次之活性酯產生部位使用化合物F5或化合物E1，第2次胺基部位使用化合物Na-4、化合物Na-5、化合物Na-10(Na-7基或Na-8基)或化合物Na-11(Na-7基或Na-8基)之任意方法。使羥基羧酸具有胺部位之胺基酸配置於所望位置，實施適當化學反應，則可獲得所望之分支胜肽(直鏈部2)。羥基羧酸與胺、各胺基酸或胺基酸類似物之選擇，只要具有必要之官能基即為自由，但羥基羧酸部位配置於N末端側較佳。羥基羧酸不限於α-羥基羧酸，可採取β或γ-羥基羧 酸代表之各種羥基羧酸。又，也可不為羥基羧酸、而將硫羧酸轉譯導入，不為酯而關連硫酯進行分支胜肽形成反應。本手法，能在胺基酸數受限之中，達成以分子創出活性化合物不可欠缺之Chemical space擴大。
Figure 107130626-A0101-12-0102-34
Figure 107130626-A0101-12-0103-35
Figure 107130626-A0101-12-0103-36
其次以利用C-C鍵結環化之情形為例記述反應設計。例如：三角單元可將為N末端羧酸類似物之具雙鍵之羧酸轉譯導入，交叉單元(○單元)可將側鏈具有碘苯基之胺基酸轉 譯導入(流程C-2)。如此，當對於三角單元與交叉單元分別利用使用Pd之Heck反應導入縮合反應之官能基之情形，會獲得利用使用Pd之反應之C-C鍵結環化產物。Pd之配位子可有各種選項。作為通常之Pd觸媒反應使用之配位子，可使用膦配位子、氧化膦配位子、包含氮原子之配位子、包含砷原子之配位子、碳烯(carbene)型配位子等。此等分子內可配位之官能基有1個之單座配位子、此等可配位於Pd之官能基之中的2個組合而得之二座配位子亦可。反應須在水中進行，故也可使用有水溶性官能基之配位子。在此，轉譯液中含有RNA成分、GTP、ATP等核酸成分會與Pd形成錯體而導致失活化，所以宜為與Pd形成牢固之配位鍵結之配位子較佳，例如1,1'-雙(二苯基膦基)二茂鐵、2,2'-雙(二苯基膦基)-1,1'-聯苯、2,2'-雙(二苯基膦基)-1,1'-聯萘、4,5-雙(二苯基膦基)-9,9-二甲基咕噸、1,3-雙(二苯基膦基)丙烷之類之二座膦配位子，從對於含水系溶劑之溶解性之觀點，2,2'-雙(二苯基膦基)-1,1'-聯苯較佳。通常有機合成化學反應中，Pd以觸媒量(常為1mol%以下)使用即已足夠，但於轉譯合成後之展示庫使用時，由於Pd會與轉譯合成所必要之RNA部分形成錯體，所以若不過量使用Pd，所望之化學反應不會以足夠速度進行，另一方面，若太過量使用Pd，與RNA之錯體之溶解度下降，所望化學反應不能以足夠速度進行。Pd使用量，宜對於含m-RNA為1pmol之轉譯合成物，使用1nmol以上較佳，60nmol較佳。如後述實施例記載，若利用微胞，反應能加速，故較理想。
可使用之微胞，可為陰離子性、陽離子性、雙性、 非離子性任意者，尤其非離子性微胞，即癸二酸聚氧乙烷-α--Tocopheryl(PTS)較佳。癸二酸聚氧乙烷-α-Tocopheryl之使用濃度，可為任意濃度，但最終濃度1%以上較佳，最終濃度7.5%以上更佳。反應進行須使用鹼，使用由不配位於Pd成分構成之緩衝液較佳，可使用磷酸緩衝液、碳酸鹽緩衝液等。反應溶劑之pH宜調整為m-RNA可安定且環化反應可進行之範圍較佳，7以上、10以下更佳，7.5以上、8.5以下又更佳。反應溫度於m-RNA能安定存在且通常化學反應能實施之範圍即可，不特別限定，較佳為15℃~80℃，更佳為40℃~60℃。
Figure 107130626-A0101-12-0105-37
1C-C鍵結反應，已記述利用Pd之Heck反應之例，但本案就C-C鍵結環化反應而言，不限於利用Pd之Heck反應。Suzuki反應或Sonogashira反應等使用Pd之各種反應也可同樣實施。於此情形，有時配位子或鹼之選擇係為重要。又，過渡金屬也不限於Pd，能以Ni,Ru,Co等各種金屬實施C-C鍵結反應(非專利文獻Matthew S.Sigman等人，Advances in Transition Metal(Pd,Ni,Fe)-Catalyzed Cross-Coupling Reactions Using Alkyl-organometallics as Reaction Partners.Chem.Rev.,2011,111,1417-1492,Lutz Ackermann等人之Ruthenium-Catalyzed Direct Arylations Through C-H Bond Cleavages.Top Curr Chem.2010,292,21.Paul Knochel等人，Pd-,Ni-,Fe-,and Co-Catalyzed Cross-Couplings Using Functionalized Zn-,Mg-,Fe-,and In-Organometallics.Isr.J.Chem.2010,50,547.Gwilherm Evano等人，Copper-Mediated Coupling Reactions and Their Applications in Natural Products and Designed Biomolecules Synthesis.Chem.Rev.2008,108,3054)。
構成流程C-2之三角單元即胺基酸、胺基酸類似物、N末端羧酸類似物，只要具有反應性官能基即可，不特別限定。但是若選擇胺基酸，N末端有胺殘存，相較於不殘存的情形，透膜性較不利。所以，三角單元宜為雜原子之數少者較佳。如此之N末端羧酸類似物之例，可列舉化合物CC-1~CC-4記載之化合物。化合物CC-1中，碳-碳雙鍵成為反應點。化合物CC-2中，碳-碳參鍵成為反應點。化合物CC-3中，X成為反應點。X以鹵素較佳，可從Cl,Br,I,F之中選擇。從反應性之觀點，Br與I較佳，I最好。化合物CC-4中，硼酸酯部分成為反應點。R301,R302,R303除了氫原子以外，亦可從可經取代之烷基、烯基、炔基、環烷基、芳基、雜芳基、芳烷基之中選擇。此等取代基，只要是取代之結果獲得之化合物CC-1~CC-4為可轉譯合成者即可，不特別限定。如此之取代 基，例如鹵素基、烷氧基等。
R304係將反應點與轉譯點(羧酸部位)連結之單元。以下舉其代表的結構。能將兩單元以亞甲基(次結構N-3)、伸乙基(次結構N-4)、伸丙基(次結構N-5)等C1~C6單元連結。又，也可從芳香族化合物之芳基碳直接連結(次結構N-6)。又，也可以芳烷基結構連結(次結構N-7、N-8)。又，連結位置不限於鄰位，也可為間位、對位，且也可為苯基以外之取代芳基或取代芳烷基。取代基，例如鹵素基、烷氧基等。
又，構成流程C-2之三角單元之胺基酸之例，只要是側鏈有雙鍵、參鍵、鹵素、硼酸酯之胺基酸即可，不特別限定。L型胺基酸或D型胺基酸、α-α-二烷胺基酸亦可，尤其L型胺基酸為較佳。在取得類藥的胜肽方面，、N末端之胺基經取代較佳。也可以N-甲基等烷基化，但醯基化等醯胺化等使氮原子之鹼性喪失之取代基之導入為較佳。
又，構成流程C-2之三角單元之胺基酸類似物或N末端羧酸類似物，也可為於側鏈具有雙鍵、參鍵、鹵素、硼酸酯之羥基羧酸。與胺基酸的情形同樣，側鏈之選擇不特別限定。α-羥基羧酸以外，也可為β或γ-羥基羧酸。又，側鏈具有雙鍵、參鍵、鹵素、硼酸酯之二胜肽或三胜肽亦可。
Figure 107130626-A0101-12-0107-38
構成流程C-2之交叉單元(○單元)，例如於側鏈具有雙鍵、參鍵、鹵素、硼酸酯之胺基酸或α-羥基羧酸。胺基酸 或α-羥基羧酸之側鏈，只要有該等反應性官能基存在即可，其他不特別限定。從以各反應性官能基取代之可經取代之烷基、烯基、炔基、環烷基、芳基、雜芳基、芳烷基等中選擇。此等取代基，例如鹵素基、烷氧基等。
L型、D型、α-α-二烷基型任意者均可容許，但α位存在氫原子之情形，L型胺基酸或胺基酸類似物為較佳。
三角單元與交叉單元(○)單元之組合，只要是以Pd等過渡金屬能縮合反應之組合即不特別限定。
‧胜肽化合物之化學合成
本發明之胜肽化合物也可利用化學合成製造。
例如：可列舉稱為Fmoc合成之方法及稱為Boc合成之方法。Fmoc合成中，利用將主鏈胺基以Fmoc基保護，側鏈官能基視需要以哌啶等鹼不會切斷之保護基保護，主鏈羧酸不保護之胺基酸作為基本單位。此外，只要是經Fmoc保護之胺基與羧酸基之組合即可，不特別限定。例如也可為二胜肽作為基本單位。配置於N末端之基本單位，也可為Fmoc胺基酸以外。例如：也可為Boc胺基酸，也可為不具胺基之羧酸類似物。藉由主鏈羧酸基與固相擔體之官能基之化學反應而載持於固相。然後，以哌啶或DBU等鹼將Fmoc基脫保護，使新產生之胺基與接著添加之基本單位之具羧酸之保護胺基酸縮合反應，使胜肽鍵生成。縮合反應中，可為DIC與HOBt之組合、DIC與HOAt之組合、HATU與DIPEA之組合等各種組合。藉由反複脫Fmoc基及接續之胜肽鍵生成反應，能生成所望之胜肽序列。獲得所望序列後，進行從固相切出及視需要導入之側 鏈官能基之保護基之脫保護。又，從固相之切出進行前，也可進行胜肽之結構變換或環化。從固相之切出與脫保護，可在相同條件，例如90：10之TFA/H2O實施，但視需要也可以不同條件脫保護。從固相之切出，有能以1% TFA等弱酸切出之情形，作為保護基可利用Pd等並利用兩者之化學反應之直行性。該等步驟之間或最後可實施環化等步驟。例如：使側鏈羧酸與N末端主鏈之胺基縮合、或使側鏈胺基與C末端主鏈之羧酸縮合。此時，與C末端側之羧酸環化之側鏈羧酸之間、或與N末端側之主鏈胺基或羥基環化之側鏈胺基之間須要有反應直行性，如前述考慮保護基之直行性來選擇保護基。如此方式獲得之反應物，可使用逆相管柱、分子篩管柱等精製。該等之細節，記載於例如Merck(股)公司在平成14年(2002)5月1日發行的固相合成手冊等。
‧類藥的胜肽化合物或胜肽化合物-核酸複合體之製作
又，本發明提供具有所望活性之類藥的胜肽化合物或胜肽化合物-核酸複合體之製造方法。
製造具有所望活性之類藥的胜肽化合物-核酸複合體之方法，例如包含以下步驟之製造方法：
(i)將胺基酸及胺基酸類似物之總數為9~13個殘基之非環狀胜肽化合物予以轉譯合成，形成包含該非環狀胜肽化合物及編碼為其之核酸序列經由連結子鍵結之複合體的非環狀胜肽化合物-核酸複合體
(ii)將步驟(i)轉譯合成之複合體之非環狀胜肽化合物以醯胺鍵 或碳-碳鍵環化，形成環狀部之胺基酸及胺基酸類似物之殘基數之合計為5~12之環狀化合物
(iii)使步驟(ii)獲得之具有環狀部之胜肽化合物-核酸複合體資料庫與活體內分子接觸，選擇對該活體內分子有結合活性之複合體。
再者，從上述步驟選擇之複合體，可製造具有所望活性之類藥的胜肽化合物。
例如可列舉包含以下步驟之製造方法：
(iv)從前述步驟(iii)選擇之複合體之核酸序列獲得胜肽化合物之序列資訊、及、
(v)依據前述步驟(iv)獲得之序列資訊將胜肽化合物予以化學合成
再者，於上述製造步驟中，前述非環狀胜肽化合物，包括α-羥基羧酸、及於可經保護之側鏈具有胺基之胺基酸或胺基酸類似物，在步驟(ii)之環狀化合物形成之步驟之前或後，也可包含使α-羥基羧酸部位與側鏈具有胺基之胺基酸或胺基酸類似物部位化學反應而形成分支部位之步驟。利用該步驟，能製作於環狀部之各種位置具有上述直鏈部2之胜肽化合物。
在此，上述步驟(i)記載之胺基酸及胺基酸類似物之總數、及步驟(ii)記載之環狀部之胺基酸及胺基酸類似物之殘基數之合計，不包括以轉譯後修飾去除之胺基酸或胺基酸類似物。例如：上述流程F3中，具有直鏈部2之胜肽化合物之製造中，於轉譯後修飾從該胜肽脫離之Cys-Pro序列，不包括在步驟(i)及(ii)之胺基酸及胺基酸類似物之數，此外，例如：利用 含有作為胜肽化合物及RNA之連結子部位使用之Gly-Ser之重複結構部之情形，該Gly-Ser之重複結構部、或固定之胺基酸區域、本發明之具有環狀部之胜肽化合物、尤其為使類藥的胜肽化合物部分與核酸鍵結之部分含於連結子，不包括步驟(i)及(ii)之胺基酸及胺基酸類似物之數。於此情形，步驟(ii)之環化後之環部之殘基數不為5~11，為更長之殘基數，生成直鏈部2之反應後環部之殘基數為5~11即可。
又，本製造方法中，在步驟(ii)或步驟(v)，也可進行為製成上述類藥的胜肽化合物之化學修飾、為了最適化之化學修飾。又，本發明中，標的物質為活體內分子為較佳。本發明中，「活體內分子」，只要是活體內之分子即不特別限定，成為疾病治療之標靶之分子較佳，尤其宜為不具習知之分子量低於500之低分子化合物能結合之孔(cavity)之分子、或抗體等高分子化合物無法接近之細胞內蛋白、核酸、膜蛋白之細胞內區域或膜蛋白之膜貫通分域等為較佳。
具體而言例如：STAT,AP1,CREB,SREBP等轉錄因子、毒蕈鹼(muscarine)性乙醯基膽鹼接受體，大麻素(cannabinoid)接受體、GLP-1接受體、PTH接受體等G蛋白質共軛型接受體(GPCR)、TNF、TNFR、IL-6、IL-6R等細胞素或其受體、P2X接受體、尼古丁性乙醯基膽鹼接受體等離子通道型接受體、離子通道、運送蛋白(transporter)、miR-21,miR206等microRNA等。
又，環狀部之形成，例如可利用上述環化反應形成，取決於該環化反應，可形成醯胺鍵或碳-碳鍵。
又，胜肽化合物-核酸複合體之合成步驟中，可使用無細胞轉譯系等公知技術。具體而言，可使用如以下方法製作。
轉移RNA(tRNA)，係分子量25000至30000且含3'末端之CCA序列之鏈長73~93個鹼基的RNA，作為經由3'末端而與胺基酸之羧基末端形成酯鍵而得之胺基醯基化tRNA，與多胜肽伸長因子(EF-Tu)、GTP形成三元複合體並運送到核糖體，在利用核糖體所為之mRNA之鹼基序列資訊轉譯到胺基酸序列時，與tRNA之序列中的反密碼子和mRNA之密碼子形成鹼基對，且係涉及密碼子識別之RNA。在細胞內生合成之tRNA中，包含經共價鍵修飾的鹼基，影響tRNA之構形或反密碼子之鹼基對形成，有時有助於tRNA之密碼子識別。一般的試管內轉錄合成的tRNA，係由所謂核酸鹽基腺嘌呤、尿嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶構成，但是從細胞內製備者或化學合成者，有時也會有其他甲基化體、含硫衍生物、脫胺基衍生物、含異戊烯基或蘇胺酸之腺苷衍生物等修飾鹼基，利用pdCpA法等之情形，有時會含有去氧鹼基。
準備編碼為所望tRNA序列且於上游配置了T7,T3或SP6啟動子之模板DNA，利用T7 RNA聚合酶或T3,SP6RNA聚合酶等適應啟動子之RNA聚合酶進行轉錄可合成RNA。從細胞將tRNA萃取精製，並使用tRNA之序列之互補序列之探針，也可萃取目的之生成tRNA。此時也可以經過目的tRNA之表現載體轉形的細胞作為來源。也可利用化學合成合成目的之序列之RNA。例如：可藉由將以此方式獲得之3'末 端之CCA序列去除CA後得到的tRNA與另外製備之經胺基醯基化之pdCpA以RNA接合酶鍵結來獲得胺基醯基tRNA(pdCpA法)。也可準備全長tRNA，將利用各種非天然胺基酸之活性酯載持於tRNA之ribozymeflexizyme進行胺基醯基化。此外，使用後述方法也可獲得醯基化tRNA。
於混合有大腸菌之轉譯所必要之蛋白因子類(從甲硫胺醯基tRNA轉甲醯基酶、EF-G、RF1、RF2、RF3、RRF、IF1、IF2、IF3、EF-Tu、EF-Ts、ARS(AlaRS、ArgRS、AsnRS、AspRS、CysRS、GlnRS、GluRS、GlyRS、HisRS、IleRS、LeuRS、LysRS、MetRS、PheRS、ProRS、SerRS、ThrRS、TrpRS、TyrRS、ValRS選出必要者))、核糖體、胺基酸、肌酸激酶、肌激酶、無機焦磷解酶、核苷二磷酸激酶、E.coli來源tRNA、肌酸磷酸、麩胺酸鉀、HEPES-KOH pH7.6、乙酸鎂、亞精胺(spermidine)、二硫蘇糖醇、GTP、ATP、CTP、UTP等之PUREsystem中將mRNA加入，可轉譯為胜肽。又，若加入T7RNA聚合酶，也可從含T7啟動子之模板DNA將轉錄、轉譯成對進行。此時藉由將所望之醯基化tRNA群或ARS可容許之非天然胺基酸群(例如F-Tyr)加到系中，可將含非天然胺基酸群之胜肽予以轉譯合成(Kawakami T,et al.Ribosomal synthesis of polypeptoids and peptoid-peptide hybrids.J Am Chem Soc.2008,130,16861-3.,Kawakami T,et al.Diverse backbone-cyclized peptides via codon reprogramming.Nat Chem Biol.2009,5,888-90.)。或也可利用核糖體或EF-Tu等變異體以提高非天然胺基酸之轉譯導入之效率(Dedkova LM, et al.Construction of modified ribosomes for incorporation of D-amino acids into proteins.Biochemistry.2006,45,15541-51.,Doi Y,et al.Elongation factor Tu mutants expand amino acid tolerance of protein biosynthesis system.J Am Chem Soc.2007,129,14458-62.,Park HS,et al.Expanding the genetic code of Escherichia coli with phosphoserine.Science.2011,333,1151-4.)。
mRNA展示庫，係首先在T7啟動子等啟動子之下游將配置有所望序列之DNA之資料庫予以化學合成，將其作為模板以引子伸長反應製成雙股DNA。以其作為模板，使用T7 RNA聚合酶等RNA聚合酶轉錄為mRNA。在該RNA之3'末端連接連有胺基醯基tRNA之類似物即抗生物質嘌呤黴素等之連結子(間隙子)。將其加到上述PUREsystem等公知之無細胞轉譯系並保溫，使mRNA轉譯，並將mRNA與其所編碼之胜肽經由嘌呤黴素連結。以此方式可建構mRNA及其產物對應而成之由mRNA與其產物之複合體構成之展示庫。
再者，使所望之經固定之標的與該資料庫接觸，洗去未與標的結合之分子，可將與標的結合之分子濃縮(淘選)。針對以此方式選擇之分子，從含有已有基因資訊之附標籤的mRNA合成cDNA並進行PCR，解析鹼基序列，可明白為係已結合之胜肽之序列。
本發明中，環化胜肽化合物-核酸複合體展示庫之建構，及從已建構築之展示庫取得與標的鍵結之環化胜肽化合物(具有環狀部之胜肽化合物)或環化分支胜肽(環狀部更具有直鏈部2之胜肽化合物)，具體而言可利用例如以下態樣所示之方法〔I〕~〔XVII〕進行。
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〔I〕本發明之具有環狀部之胜肽化合物之製造方法，可包含以下之1或多數步驟。
A)提供將化合物C-1予以胺基醯基化而得之pdCpA
B)提供3'末端之CA欠缺之tRNA
C)使步驟A)之pdCpA與前述步驟B)之tRNA連結，提供化合物C-1經胺基醯基化之開始tRNA
D)提供包含步驟C)之tRNA不包含甲硫胺酸、甲硫胺醯基tRNA合成酵素(MetRS)、甲硫胺酸用轉譯開始tRNA、甲醯基提供者、甲硫胺醯基tRNA轉移酶中之任一者之無細胞轉譯系
E)提供包含於啟動子之下游接續於轉譯開始ATG之半胱胺酸密碼子UGU或UGC、於其下游為步驟C)之tRNA之反密碼子對應之密碼子之之編碼為胜肽序列的模板的DNA庫
F)從步驟E)之模板DNA庫提供mRNA庫
G)使步驟F)之mRNA庫之3'末端與間隙子鍵結
H)於步驟D)之無細胞轉譯系，加入步驟G)之間隙子鍵結之mRNA庫並轉譯，而提供環化前胜肽化合物-mRNA複合體展示庫
I)形成環狀結構之步驟
環狀結構之形成，可視需要進行脫硫反應。又，本發明中，在步驟G)之後，可包含以黏合於mRNA庫之3'區域的引子合成cDNA之步驟。
又，本發明之方法可包含以下步驟。
J)以淘選濃縮與標的物質鍵結之mRNA庫
K)以反轉錄酶合成cDNA
L)解析鹼基序列之步驟
〔II〕又，本發明之具有環狀部之胜肽化合物之製造方法，可包含以下之1或多數步驟。
A)提供將化合物C-1予以胺基醯基化而得之pdCpA
B)提供3'末端之CA欠缺之tRNA
C)使步驟A)之pdCpA與前述步驟B)之tRNA連結，提供化合物C-1經胺基醯基化之開始tRNA
D)提供包含步驟C)之tRNA之無細胞轉譯系
E)提供包含於啟動子之下游接續於轉譯開始ATG之半胱胺酸密碼子UGU或UGC、於其下游為步驟C)之tRNA之反密碼子對應之密碼子之編碼為胜肽序列的模板的DNA庫
F)從步驟E)之模板DNA庫提供mRNA庫
G)使步驟F)之mRNA庫之3'末端與間隙子鍵結
H)於步驟D)之無細胞轉譯系，加入步驟G)之間隙子鍵結之mRNA庫並轉譯，而提供環化前胜肽化合物-mRNA複合體展示庫
I)使胜肽去甲醯基酶、甲硫胺酸 胺基肽酶作用於步驟H)之資料庫
H，I之步驟，也可藉由於轉譯時將胜肽去甲醯基酶、甲硫胺酸 胺基肽酶加到系中以同時實施。
J)形成環狀結構之步驟
環狀結構之形成，可視需要進行脫硫反應。又，本發明中，在步驟H)或步驟I)之後，可包含以黏合於mRNA庫之3'區域的引子合成cDNA之步驟。
又，本發明之方法可包含以下步驟。
J)以淘選濃縮與標的物質鍵結之mRNA庫
K)以反轉錄酶合成cDNA
L)解析鹼基序列之步驟
〔III〕或本發明之具有環狀部之胜肽化合物之製造方法，可包含以下之1或多數步驟。
A)提供化合物C-3(R2=R3=R28=R29=H、L-天冬胺酸衍生物)予以胺基醯基化而得之pdCpA
B)提供3'末端之CA欠缺之tRNA
C)使步驟A)之pdCpA與前述步驟B)之tRNA連結，提供化合物C-3經胺基醯基化之開始tRNA
D)提供包含步驟C)之tRNA不包含甲硫胺酸、甲硫胺醯基tRNA合成酵素(MetRS)、甲硫胺酸用轉譯開始tRNA、甲醯基提供者、甲硫胺醯基tRNA轉移酶中之任一者之無細胞轉譯系
E)提供於啟動子之下游，在轉譯開始密碼子ATG之後有半胱胺酸密碼子且於其下游具有與步驟C)之tRNA之反密碼子對應之密碼子的模板DNA庫，且係編碼為胜肽序列之模板DNA庫
F)從步驟E)之模板DNA庫提供mRNA庫
G)使步驟F)之mRNA庫之3'末端與間隙子鍵結
H)於步驟D)之無細胞轉譯系，加入步驟G)之間隙子鍵結之 mRNA庫並轉譯，而提供環化前胜肽化合物-mRNA複合體展示庫
I)形成環狀結構後進行脫硫反應之步驟
本發明中，在步驟G)之後，可包含以黏合於mRNA庫之3'區域的引子合成cDNA之步驟。又，本發明之方法，可包含以下步驟。
J)以淘選濃縮與標的物質鍵結之mRNA庫
K)以反轉錄酶合成cDNA
L)解析鹼基序列之步驟
〔IV〕或本發明之具有環狀部之胜肽化合物之製造方法，可包含以下之1或多數步驟。
A)提供將化合物C-3(R2=R3=R28=R29=H、L-天冬胺酸衍生物)予以胺基醯基化而得之pdCpA
B)提供3'末端之CA欠缺之tRNA
C)使步驟A)之pdCpA與前述步驟B)之tRNA連結，提供化合物C-3經胺基醯基化之開始tRNA
D)提供包含步驟C)之tRNA之無細胞轉譯系
E)提供於啟動子之下游，在轉譯開始密碼子ATG之後有半胱胺酸密碼子且於其下游具有與步驟C)之tRNA之反密碼子對應之密碼子的模板DNA庫，且係編碼為胜肽序列之模板DNA庫
F)從步驟E)之模板DNA庫提供mRNA庫
G)使步驟F)之mRNA庫之3'末端與間隙子鍵結
H)於步驟D)之無細胞轉譯系，加入步驟G)之間隙子鍵結之mRNA庫並轉譯，而提供環化前胜肽化合物-mRNA複合體展示庫
I)使胜肽去甲醯基酶、甲硫胺酸胺基肽酶作用於步驟H)之資料庫
H，I之步驟，可藉由於轉譯時加入胜肽去甲醯基酶、甲硫胺酸胺基肽酶到系中以同時實施。
I)形成環狀結構後進行脫硫反應之步驟
本發明在步驟G)之後，可包含以黏合於mRNA庫之3'區域的引子合成cDNA之步驟。又，本發明之方法，可包含以下步驟。
J)以淘選濃縮與標的物質鍵結之mRNA庫
K)以反轉錄酶合成cDNA
L)解析鹼基序列之步驟
〔V-1〕甲硫胺酸以外之胺基酸、胺基酸類似物或N末端羧酸類似物之N末端導入
或本發明之具有環狀部之胜肽化合物之製造方法，係關於建構藉由將轉譯伸長反應不易容許之tBSSEtGABA、tBSSEtβAla作為N末端而能實施之醯胺環化胜肽化合物資料庫之方法，包含以下之1或多數步驟。
A)提供tBSSEtGABA或tBSSEtβAla予以胺基醯基化而得之pdCpA
B)提供3'末端之CA欠缺之開始tRNA
C)使步驟A)之pdCpA與前述步驟B)之tRNA連結，提供tBSSEtGABA或tBSSEtβAla經胺基醯基化之開始tRNA、
D)提供將化合物C-1予以胺基醯基化而得之pdCpA
E)提供3'末端之CA欠缺之tRNA
F)使步驟D)之pdCpA與前述步驟E)之3'末端之tRNA連結，提供化合物C-1經胺基醯基化之tRNA、
G)提供包含步驟C)之開始tRNA與步驟F)之tRNA不包含甲硫胺酸、甲硫胺醯基tRNA合成酵素(MetRS)、甲硫胺酸用轉譯開始tRNA、甲醯基提供者、甲硫胺醯基tRNA轉移酶中之任一者之無細胞轉譯系
H)提供於啟動子之下游具有ATG作為第1位密碼子，並於其下游包含步驟F)之tRNA之反密碼子對應之密碼子，於其3'側包含成為脯胺酸或其他ARS之基質之N-甲基胺基酸之密碼子的編碼為胜肽序列的模板DNA庫
I)從步驟H)之模板DNA庫提供mRNA庫
J)使步驟I)之mRNA庫之3'末端與間隙子鍵結
K)於步驟G)之無細胞轉譯系，加入步驟J)之間隙子鍵結之mRNA庫並轉譯，而提供環化前胜肽化合物-mRNA複合體展示庫
L)形成環狀部位及直鏈部位2之步驟
本發明中，步驟J)之後，可包含以黏合於mRNA庫之3'區域的引子合成cDNA之步驟。又，本發明之方法，可包含以下步驟。
M)以淘選濃縮與標的物質鍵結之mRNA庫
N)以反轉錄酶合成cDNA
O)解析鹼基序列之步驟
〔V-2〕甲硫胺酸以外之胺基酸、胺基酸類似物或N末端羧酸類似物之N末端導入
或本發明之具有環狀部之胜肽化合物之製造方法，係關於建構藉由將轉譯伸長反應不易容許之tBSSEtGABA、tBSSEtβAla作為N末端而能實施之醯胺環化胜肽化合物資料庫之方法，包含以下之1或多數步驟。
A)提供tBSSEtGABA或tBSSEtβAla予以胺基醯基化而得之pdCpA
B)提供3'末端之CA欠缺之開始tRNA
C)使步驟A)之pdCpA與步驟B)之開始tRNA連結，提供將tBSSEtGABA或tBSSEtβAla予以胺基醯基化而得之開始tRNA
D)提供將化合物C-1予以胺基醯基化而得之pdCpA
E)提供3'末端之CA欠缺之tRNA
F)使步驟D)之pdCpA與步驟E)之3'末端之tRNA連結，提供將化合物C-1予以胺基醯基化而得之tRNA，並提供將任意之N-甲基胺基酸予以胺基醯基化而得之pdCpA後，提供3'末端之CA欠缺之tRNA，使此等pdCpA與tRNA連結，提供將N-甲基胺基酸予以胺基醯基化而得之tRNA
G)提供包含步驟C)之開始tRNA與步驟F)之tRNA不包含甲硫胺酸、甲硫胺醯基tRNA合成酵素(MetRS)、甲硫胺酸用轉譯開始tRNA、甲醯基提供者、甲硫胺醯基tRNA轉移酶中之任一者之無細胞轉譯系
H)提供於啟動子之下游具有ATG作為第1位密碼子，並於其下游包含步驟F)之tRNA之反密碼子對應之密碼子，於其3' 側包含步驟F)之N-甲胺基醯基化tRNA對應之密碼子的編碼為胜肽序列的模板DNA庫
I)從步驟H)之模板DNA庫提供mRNA庫
J)使步驟I)之mRNA庫之3'末端與間隙子鍵結
K)於步驟G)之無細胞轉譯系加入步驟J)之間隙子鍵結之 mRNA庫並轉譯，而提供環化前胜肽化合物-mRNA複合體展示庫
L)形成環狀部位及直鏈部位2之步驟
本發明中，步驟J)之後，可包含以黏合於mRNA庫之3'區域的引子合成cDNA之步驟。又，本發明之方法，可包含以下步驟。
M)以淘選濃縮與標的物質鍵結之mRNA庫
N)以反轉錄酶合成cDNA
O)解析鹼基序列之步驟
〔VI-1〕甲硫胺酸以外之胺基酸、胺基酸類似物或N末端羧酸類似物之N末端導入
或本發明之具有環狀部之胜肽化合物之製造方法，係關於建構藉由將轉譯伸長反應不易容許之tBSSEtGABA、tBSSEtβAla作為N末端而能實施之醯胺環化胜肽化合物資料庫之方法，包含以下之1或多數步驟。
A)提供tBSSEtGABA或tBSSEtβAla予以胺基醯基化而得之pdCpA
B)提供3'末端之CA欠缺之開始tRNA
C)使步驟A)之pdCpA與步驟B)之開始tRNA連結，提供將 tBSSEtGABA或tBSSEtβAla予以胺基醯基化而得之開始tRNA
D)提供將Asp(SBn)予以胺基醯基化而得之pdCpA
E)提供3'末端之CA欠缺之tRNA
F)使步驟D)之pdCpA與步驟E)之3’末端之tRNA連結，提供將Asp(SBn)予以胺基醯基化而得之tRNA、
G)提供包含步驟C)之開始tRNA與步驟F)之tRNA不包含甲硫胺酸、甲硫胺醯基tRNA合成酵素(MetRS)、甲硫胺酸用轉譯開始tRNA、甲醯基提供者、甲硫胺醯基tRNA轉移酶中之任一者之無細胞轉譯系
H)提供於啟動子之下游具有ATG作為第1位密碼子，並於其下游包含步驟F)之tRNA之反密碼子對應之密碼子，於其3'側包含成為脯胺酸或其他ARS之基質之N-甲基胺基酸之密碼子的編碼為胜肽序列的模板DNA庫
I)從步驟H)之模板DNA庫提供mRNA庫
J)使步驟I)之mRNA庫之3’末端與間隙子鍵結
K)於步驟G)之無細胞轉譯系，加入步驟J)之間隙子鍵結之mRNA庫並轉譯，而提供環化前胜肽化合物-mRNA複合體展示庫
L)形成環狀部位及直鏈部位2之步驟
本發明中，步驟J)之後，可包含以黏合於mRNA庫之3’區域的引子合成cDNA之步驟。又，本發明之方法，可包含以下步驟。
M)以淘選濃縮與標的物質鍵結之mRNA庫
N)以反轉錄酶合成cDNA
O)解析鹼基序列之步驟
〔VI-2〕甲硫胺酸以外之胺基酸、胺基酸類似物或N末端羧酸類似物之N末端導入
或本發明之具有環狀部之胜肽化合物之製造方法，係關於建構藉由將轉譯伸長反應不易容許之tBSSEtGABA、tBSSEtβAla作為N末端而能實施之醯胺環化胜肽化合物資料庫之方法，包含以下之1或多數步驟。
A)提供tBSSEtGABA或tBSSEtβAla予以胺基醯基化而得之pdCpA
B)提供3’末端之CA欠缺之開始tRNA
C)使步驟A)之pdCpA與步驟B)之開始tRNA連結，提供將tBSSEtGABA或tBSSEtβAla予以胺基醯基化而得之開始tRNA
D)提供將Asp(SBn)予以胺基醯基化而得之pdCpA
E)提供3’末端之CA欠缺之tRNA
F)使步驟D)之pdCpA與步驟E)之3’末端之tRNA連結，提供將Asp(SBn)予以胺基醯基化而得之tRNA，並提供將任意之N-甲基胺基酸予以胺基醯基化而得之pdCpA後，提供3'末端之CA欠缺之tRNA，使此等pdCpA與tRNA連結，提供將N-甲基胺基酸予以胺基醯基化而得之tRNA、
G)提供包含步驟C)之開始tRNA與步驟F)之tRNA、不含甲硫胺酸、甲硫胺醯基tRNA合成酵素(MetRS)、甲硫胺酸用轉譯開始tRNA、甲醯基提供者、甲硫胺醯基tRNA轉移酶中之任一者之無細胞轉譯系
H)提供於啟動子之下游具有ATG作為第1位密碼子，並於 其下游包含步驟F)之tRNA之反密碼子對應之密碼子，於其3'側包含步驟F)之N-甲胺基醯基化tRNA對應之密碼子的編碼為胜肽序列的模板DNA庫
I)從步驟H)之模板DNA庫提供mRNA庫
J)使步驟I)之mRNA庫之3’末端與間隙子鍵結
K)於步驟G)之無細胞轉譯系，加入步驟J)之間隙子鍵結之mRNA庫並轉譯，而提供環化前胜肽化合物-mRNA複合體展示庫
L)形成環狀部位及直鏈部位2之步驟
本發明中，步驟J)之後，可包含以黏合於mRNA庫之3’區域的引子合成cDNA之步驟。又，本發明之方法，可包含以下步驟。
M)以淘選濃縮與標的物質鍵結之mRNA庫
N)以反轉錄酶合成cDNA
O)解析鹼基序列之步驟
〔VII-1〕甲硫胺酸以外之胺基酸、胺基酸類似物或N末端羧酸類似物之N末端導入
或本發明之具有環狀部之胜肽化合物之製造方法，係關於建構藉由將於轉譯伸長反應不易容許之胺基酸作為N末端而能實施之醯胺環化胜肽資料庫之方法，包含以下1或多數步驟。
A)提供將化合物N-1予以胺基醯基化而得之pdCpA
B)提供3’末端之CA欠缺之開始tRNA
C)使步驟A)之pdCpA與步驟B)之開始tRNA連結，提供將化合物N-1或化合物N-2予以胺基醯基化之開始tRNA、
D)提供將化合物C-1予以胺基醯基化而得之pdCpA
E)提供3’末端之CA欠缺之tRNA
F)使步驟D)之pdCpA與步驟E)之tRNA連結，提供化合物C-1予以胺基醯基化而得之tRNA
G)提供包含步驟C)之開始tRNA與步驟F)之tRNA、不含甲硫胺酸、甲硫胺醯基tRNA合成酵素(MetRS)、甲硫胺酸用轉譯開始tRNA、甲醯基提供者、甲硫胺醯基tRNA轉移酶中之任一者之無細胞轉譯系
H)提供於啟動子之下游具有步驟C)之轉譯開始tRNA之反密碼子對應之密碼子作為第1位密碼子，並於其下游包含步驟F)之tRNA之反密碼子對應之密碼子，於其3'側包含步驟F)之tRNA之反密碼子對應之密碼子的編碼為胜肽序列的模板DNA庫
I)從步驟H)之模板DNA庫提供mRNA庫
J)使步驟I)之mRNA庫之3’末端與間隙子鍵結
K)於步驟G)之無細胞轉譯系，加入步驟J)之間隙子鍵結之mRNA庫並轉譯，而提供環化前胜肽化合物-mRNA複合體展示庫
L)形成環狀部位之步驟
本發明中，步驟J)之後，可包含以黏合於mRNA庫之3’區域的引子合成cDNA之步驟。又，本發明之方法，可包含以下步驟。
M)以淘選濃縮與標的物質鍵結之mRNA庫
N)以反轉錄酶合成cDNA
O)解析鹼基序列之步驟
〔VII-2〕甲硫胺酸以外之胺基酸、胺基酸類似物或N末端羧酸類似物之N末端導入
或本發明之具有環狀部之胜肽化合物之製造方法係關於建構藉由將於轉譯伸長反應不易容許之胺基酸作為N末端而能實施之醯胺環化胜肽資料庫之方法，包含以下1或多數步驟。
A)提供將化合物N-2予以胺基醯基化而得之pdCpA
B)提供3’末端之CA欠缺之開始tRNA
C)使步驟A)之pdCpA與步驟B)之開始tRNA連結，提供將化合物N-1或化合物N-2予以胺基醯基化而得之開始tRNA、
D)提供將化合物C-1予以胺基醯基化而得之pdCpA
E)提供3’末端之CA欠缺之tRNA
F)使步驟D)之pdCpA與步驟E)之tRNA連結，提供將化合物C-1予以胺基醯基化而得之tRNA
G)提供包含步驟C)之開始tRNA與步驟F)之tRNA、不含甲硫胺酸、甲硫胺醯基tRNA合成酵素(MetRS)、甲硫胺酸用轉譯開始tRNA、甲醯基提供者、甲硫胺醯基tRNA轉移酶中之任一者之無細胞轉譯系
H)提供於啟動子之下游具有步驟C)之轉譯開始tRNA之反密碼子對應之密碼子作為第1位密碼子，並於其下游包含步驟F)之tRNA之反密碼子對應之密碼子，於其3'側包含成為脯胺酸或其他ARS之基質之N-甲基胺基酸之密碼子的編碼為胜肽序列的模板DNA庫
I)從步驟H)之模板DNA庫提供mRNA庫
J)使步驟I)之mRNA庫之3’末端與間隙子鍵結
K)於步驟G)之無細胞轉譯系，加入步驟J)之間隙子鍵結之mRNA庫並轉譯，而提供環化前胜肽化合物-mRNA複合體展示庫
L)形成環狀部位之步驟
本發明中，步驟J)之後，可包含以黏合於mRNA庫之3’區域的引子合成cDNA之步驟。又，本發明之方法，可包含以下步驟。
M)以淘選濃縮與標的物質鍵結之mRNA庫
N)以反轉錄酶合成cDNA
O)解析鹼基序列之步驟
〔VII-3〕甲硫胺酸以外之胺基酸、胺基酸類似物或N末端羧酸類似物之N末端導入
或本發明之具有環狀部之胜肽化合物之製造方法係關於建構藉由將於轉譯伸長反應不易容許之胺基酸作為N末端而能實施之醯胺環化胜肽庫之方法，包含以下1或多數步驟。
A)提供將化合物N-2予以胺基醯基化而得之pdCpA
B)提供3’末端之CA欠缺之開始tRNA
C)使步驟A)之pdCpA與步驟B)之開始tRNA連結，提供將化合物N-1或化合物N-2予以胺基醯基化而得之開始tRNA
D)提供將化合物C-1予以胺基醯基化而得之pdCpA
E)提供3’末端之CA欠缺之tRNA
F)使步驟D)之pdCpA與步驟E)之tRNA連結，提供將化合物C-1予以胺基醯基化而得之tRNA，再者提供將任意之N-甲 基胺基酸予以胺基醯基化而得之pdCpA，並提供3’末端之CA欠缺之tRNA，再使此等pdCpA與tRNA連結，提供將N-甲基胺基酸予以胺基醯基化而得之tRNA
G)提供包含步驟C)之開始tRNA與步驟F)之tRNA、不含甲硫胺酸、甲硫胺醯基tRNA合成酵素(MetRS)、甲硫胺酸用轉譯開始tRNA、甲醯基提供者、甲硫胺醯基tRNA轉移酶中之任一者之無細胞轉譯系
H)提供於啟動子之下游具有步驟C)之轉譯開始tRNA之反密碼子對應之密碼子作為第1位密碼子，並於其下游包含步驟F)之tRNA之反密碼子對應之密碼子，於其3'側包含步驟F)之tRNA之反密碼子對應之密碼子的編碼為胜肽序列的模板DNA庫
I)從步驟H)之模板DNA庫提供mRNA庫
J)使步驟I)之mRNA庫之3’末端與間隙子鍵結
K)於步驟G)之無細胞轉譯系，加入步驟J)之間隙子鍵結之mRNA庫並轉譯，而提供環化前胜肽化合物-mRNA複合體展示庫
L)形成環狀部位之步驟
本發明中，步驟J)之後，可包含以黏合於mRNA庫之3’區域的引子合成cDNA之步驟。又，本發明之方法，可包含以下步驟。
M)以淘選濃縮與標的物質鍵結之mRNA庫
N)以反轉錄酶合成cDNA
O)解析鹼基序列之步驟
〔VIII-1〕N末端具有甲硫胺酸以外之胺基酸之胜肽之環化
或本發明之具有環狀部之胜肽化合物之製造方法，係建構藉由將N末端胺基酸不同之多種胜肽同時轉譯而能實施之環化部位之結構不同之醯胺環化胜肽資料庫之方法，係包含以下1或多數步驟。
A)提供將化合物C-X(本說明書中，「化合物C-X」係指從化合物C-1、化合物C-2及化合物C-3選出之任意化合物。本說明書中以下相同)予以胺基醯基化而得之pdCpA
B)提供3’末端之CA欠缺之tRNA
C)使步驟A)之pdCpA與前述步驟B)之tRNA連結，提供將化合物C-X予以胺基醯基化而得之開始tRNA
D)提供包含步驟C)之tRNA之無細胞轉譯系
E)提供於啟動子之下游具有步驟C)之tRNA之反密碼子對應之密碼子，於其3'側在中途含有成為脯胺酸或其他ARS之基質之N-甲基胺基酸之密碼子的編碼為胜肽序列的模板DNA庫
F)從步驟E)之模板DNA庫提供mRNA庫
G)使步驟F)之mRNA庫之3'末端與間隙子鍵結
H)於步驟D)之無細胞轉譯系，加入步驟G)之間隙子鍵結之mRNA庫並轉譯，而提供環化前胜肽化合物-mRNA複合體展示庫
I)使胜肽去甲醯基酶、甲硫胺酸胺基肽酶作用於步驟H)之資料庫
H，I之步驟也可於轉譯時將胜肽去甲醯基酶、甲硫胺酸 胺 基肽酶加到系中而同時實施。
J)形成環狀結構
環狀結構形成時，視需要也可進行脫硫反應。又，本發明中，步驟H)或步驟I)之後，可包含以黏合於mRNA庫之3’區域的引子合成cDNA之步驟。又，本發明之方法，可包含以下步驟。
又，本發明之方法可包含以下步驟。
J)以淘選濃縮與標的物質鍵結之mRNA庫
K)以反轉錄酶合成cDNA
L)解析鹼基序列之步驟
〔IX〕N末端具有甘胺酸、丙胺酸、苯丙胺酸之胜肽之環化
或本發明之具有環狀部之胜肽化合物之製造方法，係建構藉由將N末端胺基酸不同之多種胜肽同時轉譯而能實施之環化部位之結構不同之醯胺環化胜肽資料庫之方法，係包含以下1或多數步驟。
A)提供將化合物C-X予以胺基醯基化而得之pdCpA
B)提供3’末端之CA欠缺之tRNA
C)使步驟A)之pdCpA與前述步驟B)之tRNA連結，提供將化合物C-X予以胺基醯基化而得之開始tRNA
D)提供包含步驟C)之tRNA之無細胞轉譯系
E)提供於啟動子之下游具有轉譯開始ATG之正後的甘胺酸、丙胺酸、苯丙胺酸中任意者的密碼子、步驟C)之tRNA之反密碼子對應之密碼子，其3'側具有在中途包含成為脯胺酸或 其他ARS之基質之N-甲基胺基酸之密碼子之編碼為胜肽序列之模板DNA庫
F)從步驟E)之模板DNA庫提供mRNA庫
G)使步驟F)之mRNA庫之3'末端與間隙子鍵結
H)於步驟D)之無細胞轉譯系，加入步驟G)之間隙子鍵結之mRNA庫並轉譯，而提供環化前胜肽化合物-mRNA複合體展示庫
I)使胜肽去甲醯基酶、甲硫胺酸 胺基肽酶作用於步驟H)之資料庫
H，I之步驟也可於轉譯時將胜肽去甲醯基酶、甲硫胺酸 胺基肽酶加到系中而同時實施。
J)形成環狀結構
環狀結構形成時，視需要也可進行脫硫反應。又，本發明中，步驟H)或步驟I)之後，可包含以黏合於mRNA庫之3’區域的引子合成cDNA之步驟。又，本發明之方法，可包含以下步驟。
又，本發明之方法可包含以下步驟。
J)以淘選濃縮與標的物質鍵結之mRNA庫
K)以反轉錄酶合成cDNA
L)解析鹼基序列之步驟
〔X〕N末端具有甲硫胺酸以外之胺基酸之胜肽之環化
或本發明之具有環狀部之胜肽化合物之製造方法，係建構藉由將N末端胺基酸不同之多種胜肽同時轉譯而能實施之環 化部位之結構不同之醯胺環化胜肽資料庫之方法，係包含以下1或多數步驟。
A)提供將Asp(SBn)予以胺基醯基化而得之pdCpA
B)提供3’末端之CA欠缺之tRNA
C)使步驟A)之pdCpA與前述步驟B)之tRNA連結，提供將Asp(SBn)予以胺基醯基化而得之開始tRNA
D)提供包含步驟C)之tRNA之無細胞轉譯系
E)提供於啟動子之下游具有步驟C)之tRNA之反密碼子對應之密碼子、其3'側在中途含有成為脯胺酸或其他ARS之基質之N-甲基胺基酸之密碼子之編碼為胜肽序列的模板DNA庫
F)從步驟E)之模板DNA庫提供mRNA庫
G)使步驟F)之mRNA庫之3'末端與間隙子鍵結
H)於步驟D)之無細胞轉譯系，加入步驟G)之間隙子鍵結之mRNA庫並轉譯，而提供環化前胜肽化合物-mRNA複合體展示庫
I)使胜肽去甲醯基酶、甲硫胺酸 胺基肽酶作用於步驟H)之資料庫
H，I之步驟也可於轉譯時將胜肽去甲醯基酶、甲硫胺酸 胺基肽酶加到系中而同時實施。
J)形成環狀結構
環狀結構形成時，視需要也可進行脫硫反應。又，本發明中，步驟H)或步驟I)之後，可包含以黏合於mRNA庫之3’區域的引子合成cDNA之步驟。又，本發明之方法，可包含以下步驟。
又，本發明之方法，可包含以下步驟。
J)以淘選濃縮與標的物質鍵結之mRNA庫
K)以反轉錄酶合成cDNA
L)解析鹼基序列之步驟
〔XI〕或本發明之具有環狀部之胜肽化合物之製造方法，係建構環狀分支胜肽庫之方法，包含以下1或多數步驟。
A)提供將化合物N-1或化合物N-2予以胺基醯基化而得之pdCpA
B)提供3’末端之CA欠缺之開始tRNA
C)使步驟A)之pdCpA與步驟B)之開始tRNA連結，提供將化合物N-1或化合物N-2予以胺基醯基化而得之開始tRNA
D)提供將化合物C-1予以胺基醯基化而得之pdCpA
E)提供3’末端之CA欠缺之tRNA
F)使步驟D)之pdCpA與步驟E)之tRNA連結，提供將化合物C-1予以胺基醯基化而得之tRNA
G)提供包含步驟C)之開始tRNA與步驟F)之tRNA、不含甲硫胺酸、甲硫胺醯基tRNA合成酵素(MetRS)、甲硫胺酸用轉譯開始tRNA、甲醯基提供者、甲硫胺醯基tRNA轉移酶中之任一者之無細胞轉譯系
H)提供於啟動子之下游具有步驟C)之轉譯開始tRNA之反密碼子對應之密碼子作為第1位密碼子，且於其下游具有以HOGly之密碼子與離胺酸之密碼子夾持的0個至2個任意之密碼子(丙胺酸較N末端側)，又，其下游之步驟F)之tRNA之反 密碼子對應之密碼子、化合物N-1或化合物N-2之SH基受保護之情形，其3'側包含成為脯胺酸或其他ARS之基質之N-甲基胺基酸之密碼子的編碼為胜肽序列之模板DNA庫
I)從步驟H)之模板DNA庫提供mRNA庫
J)使步驟I)之mRNA庫之3’末端與間隙子鍵結
K)於步驟J)之無細胞轉譯系，加入步驟J)之間隙子鍵結之mRNA庫並轉譯，而提供環化前胜肽化合物-mRNA複合體展示庫
L)形成環
M)使由HOGly及正前之N末端側之胺基酸形成之酯活化而生成硫酯
N)使與離胺酸側鏈胺基形成醯胺鍵而生成直鏈部位2
本發明中，步驟J)之後，可包含以黏合於mRNA庫之3’區域的引子合成cDNA之步驟。又，本發明之方法，可包含以下步驟。
O)以淘選濃縮與標的物質鍵結之mRNA庫
P)以反轉錄酶合成cDNA
Q)解析鹼基序列之步驟
〔XII〕或本發明之具有環狀部之胜肽化合物之製造方法，係關於建構環狀分支胜肽庫之方法，包含以下1或多數步驟。
A)提供將化合物N-1或化合物N-2予以胺基醯基化而得之pdCpA
B)提供3’末端之CA欠缺之tRNA
C)使步驟A)之pdCpA與步驟B)之tRNA連結，提供將化合物N-1或化合物N-2予以胺基醯基化而得之tRNA
D)提供將化合物C-1予以胺基醯基化而得之pdCpA
E)提供3’末端之CA欠缺之tRNA
F)使步驟D)之pdCpA與步驟E)之tRNA連結，提供將化合物C-1予以胺基醯基化而得之tRNA
G)提供包含步驟C)之tRNA與步驟F)之tRNA與乳酸之無細胞轉譯系
H)提供編碼為胜肽序列之模板DNA庫，其於啟動子之下游，具有步驟C)之tRNA之反密碼子對應之密碼子作為第2位密碼子，並於其下游具有半胱胺酸、脯胺酸、與乳酸相應之密碼子，並於其下游包含離胺酸之密碼子，再於其下游具有與步驟F)之tRNA之反密碼子對應之密碼子，化合物N-1或化合物N-2之SH基經保護之情形，其3'側包含成為脯胺酸或其他ARS之基質之N-甲基胺基酸之密碼子
I)從步驟H)之模板DNA庫提供mRNA庫
J)使步驟I)之mRNA庫之3’末端與間隙子鍵結
K)於步驟J)之無細胞轉譯系，加入步驟J)之間隙子鍵結之mRNA庫並轉譯，而提供環化前胜肽化合物-mRNA複合體展示庫
L)形成環
M)從半胱胺酸、脯胺酸、乳酸部位產生活性硫酯
N)使生成之活性硫酯與離胺酸側鏈胺基形成醯胺鍵，並生成直鏈部位2，再實施脫硫反應
本發明中，步驟J)之後，可包含以黏合於mRNA庫之3’區域的引子合成cDNA之步驟。又，本發明之方法，可包含以下步驟。
O)以淘選濃縮與標的物質鍵結之mRNA庫
P)以反轉錄酶合成cDNA
Q)解析鹼基序列之步驟
〔XIII〕或本發明之具有環狀部之胜肽化合物之製造方法，係關於建構環狀分支胜肽庫之方法，包含以下1或多數步驟。
A)提供將化合物N-1或化合物N-2予以胺基醯基化而得之pdCpA
B)提供3’末端之CA欠缺之tRNA
C)使步驟A)之pdCpA與步驟B)之tRNA連結，提供將化合物N-1或化合物N-2予以胺基醯基化而得之tRNA
D)提供將化合物C-1予以胺基醯基化而得之pdCpA
E)提供3’末端之CA欠缺之tRNA
F)使步驟D)之pdCpA與步驟E)之tRNA連結，提供將化合物C-1予以胺基醯基化而得之tRNA
G)提供包含步驟C)之tRNA與步驟F)之tRNA與乳酸之無細胞轉譯系
H)提供編碼為胜肽序列之模板DNA庫，其於啟動子之下游具有步驟C)之tRNA之反密碼子對應之密碼子作為第2位密碼子，並於其下游具有半胱胺酸、脯胺酸、與乳酸相連之密碼子，於其下游具有離胺酸之密碼子，再於其下游具有步驟F)之tRNA之反密碼子對應之密碼子、其3'側具有成為脯胺酸或其他ARS之基質之N-甲基胺基酸之密碼子
I)從步驟H)之模板DNA庫提供mRNA庫
J)使步驟I)之mRNA庫之3’末端與間隙子鍵結
K)於步驟J)之無細胞轉譯系，加入步驟J)之間隙子鍵結之mRNA庫並轉譯，而提供環化前胜肽化合物-mRNA複合體展示庫
L)使胜肽去甲醯基酶、甲硫胺酸 胺基肽酶作用於步驟K)之資料庫
K,L之步驟，也可藉由於轉譯時將胜肽去甲醯基酶、甲硫胺酸胺基肽酶加到系中而同時實施。
M)形成環狀結構
環狀結構形成時，視需要可進行脫硫反應。
N)從半胱胺酸、脯胺酸、乳酸單元產生活性硫酯
O)將生成之羧酸活性酯化，使與離胺酸側鏈胺基形成醯胺鍵，而生成直鏈部位2，再視需要進行脫硫反應
本發明中，步驟J)之後，可包含以黏合於mRNA庫之3’區域的引子合成cDNA之步驟。又，本發明之方法，可包含以下步驟。
P)以淘選濃縮與標的物質鍵結之mRNA庫
P)以反轉錄酶合成cDNA
Q)解析鹼基序列之步驟
〔XIV〕或本發明之具有環狀部之胜肽化合物之製造方法，係關於建構環狀分支胜肽庫之方法，包含以下1或 多數步驟。
A)提供化合物C-1予以胺基醯基化而得之pdCpA
E)提供3’末端之CA欠缺之tRNA
F)使步驟A)之pdCpA與步驟E)之tRNA連結，提供將化合物C-1予以胺基醯基化而得之tRNA
G)提供包含步驟E)之tRNA與步驟F)之tRNA與乳酸之無細胞轉譯系
H)提供編碼為胜肽序列之模板DNA庫，其於啟動子之下游，具有半胱胺酸密碼子作為第2番位密碼子，並於其下游具有半胱胺酸、脯胺酸、與乳酸相連之密碼子、及經保護之胺化合物Na-4之密碼子，並於其下游具有步驟F)之tRNA之反密碼子對應之密碼子、其3'側包含成為脯胺酸或其他ARS之基質之N-甲基胺基酸之密碼子
I)從步驟H)之模板DNA庫提供mRNA庫
J)使步驟I)之mRNA庫之3’末端與間隙子鍵結
K)於步驟J)之無細胞轉譯系，加入步驟J)之間隙子鍵結之mRNA庫並轉譯，而提供環化前胜肽化合物-mRNA複合體展示庫
L)形成環
M)使化合物Na-4之側鏈胺基脫保護、及從半胱胺酸、脯胺酸、乳酸單元產生活性硫酯
N)使生成之活性硫酯與化合物Na-4之側鏈胺基形成醯胺鍵，使直鏈部位2生成
本發明中，步驟J)之後，，可包含以黏合於mRNA庫之3’區域的引子合成cDNA之步驟。又，本發明之方法，可包含以下步驟。
O)以淘選濃縮與標的物質鍵結之mRNA庫
P)以反轉錄酶合成cDNA
Q)解析鹼基序列之步驟
〔XV〕或本發明之具有環狀部之胜肽化合物之製造方法，係關於建構環狀分支胜肽庫之方法，包含以下1或多數步驟。
A)提供將化合物N-1或化合物N-2予以胺基醯基化而得之pdCpA
B)提供3’末端之CA欠缺之tRNA
C)使步驟A)之pdCpA與步驟B)之tRNA連結，提供將化合物N-1或化合物N-2予以胺基醯基化而得之tRNA
D)提供將化合物C-1予以胺基醯基化而得之pdCpA
E)提供3’末端之CA欠缺之tRNA
F)使步驟D)之pdCpA與步驟E)之tRNA連結，提供將化合物C-1予以胺基醯基化而得之tRNA
G)提供將胺基及視需要硫醇基經保護之化合物Na-4或化合物Na-10(Na-7基)或化合物Na-11(Na-7基)予以胺基醯基化而得之pdCpA
H)提供3’末端之CA欠缺之tRNA
I)使步驟G)之pdCpA與步驟H)之tRNA連結，提供將胺基及視需要硫醇基亦經保護之化合物Na-4或化合物Na-10(Na-7基)或化合物Na-11(Na-7基)予以胺基醯基化而得之tRNA
J)提供包含步驟C)之tRNA與步驟F)之tRNA與步驟I)之tRNA之無細胞轉譯系
K)提供編碼為胜肽序列之模板DNA庫，其在啟動子之下游，具有步驟C)之tRNA之反密碼子對應之密碼子作為第2位密碼子，及其下游之Cys、Pro、乳酸之tRNA之反密碼子對應之密碼子、於其下游具有步驟G)之tRNA之反密碼子對應之密碼子，再於其下游包含步驟D)之tRNA之反密碼子對應之密碼子、其3'側包含成為脯胺酸或其他ARS之基質之N-甲基胺基酸之密碼子
L)從步驟K)之模板DNA庫提供mRNA庫
M)使步驟L)之mRNA庫之3’末端與間隙子鍵結
N)於步驟M)之無細胞轉譯系，加入步驟J)之間隙子鍵結之mRNA庫並轉譯，而提供環化前胜肽化合物-mRNA複合體展示庫
O)使胜肽去甲醯基酶、甲硫胺酸 胺基肽酶作用於步驟K)之資料庫
K,L之步驟，也可藉由於轉譯時將胜肽去甲醯基酶、甲硫胺酸胺基肽酶加到系中而同時實施。
P)形成環狀結構
Q)將胺基及視需要硫醇基亦經保護之化合物Na-4或化合物Na-10(Na-7基)或化合物Na-11(Na-7基)予以脫保護
R)生成直鏈部位2
環狀結構形成時，視需要可進行脫硫反應。
本發明中，步驟J)之後，可包含以黏合於mRNA庫之3’區域的引子合成cDNA之步驟。又，本發明之方法，可包含以下步驟。
S)以淘選濃縮與標的物質鍵結之mRNA庫
T)以反轉錄酶合成cDNA
U)解析鹼基序列之步驟
前述〔XIII〕、〔XV〕中，N-1,2作為N末端之胜肽，可以與前述〔XII〕以同樣方法製備。
〔XVI〕係關於利用在N末端具有甲硫胺酸以外之胺基酸之胜肽之環化建構環狀分支胜肽庫之方法，包含以下1或多數步驟。本發明之具有環狀部之胜肽化合物之製造方法，係可藉由將N末端胺基酸不同之多種胜肽同時轉譯而實施之建構環化部位之結構不同之醯胺環化胜肽資料庫之方法，包含以下1或多數步驟。
A)提供將化合物C-1予以胺基醯基化而得之pdCpA
B)提供3’末端之CA欠缺之tRNA
C)使步驟A)之pdCpA與步驟B)之tRNA連結，提供將化合物C-1予以胺基醯基化而得之tRNA
D)提供將化合物之胺基及視需要硫醇基亦經保護之化合物Na-4或化合物Na-10(Na-7基)或化合物Na-11(Na-7基)予以胺基醯基化而得之pdCpA
E)提供3’末端之CA欠缺之tRNA
F)使步驟D)之pdCpA與步驟E)之tRNA連結，提供將胺基及視需要硫醇基亦經保護之化合物Na-4或化合物Na-10(Na-7基)或化合物Na-11(Na-7基)予以胺基醯基化而得之tRNA、
G)提供包含步驟C)之tRNA與步驟F)之tRNA與步驟I)之tRNA之無細胞轉譯系
H)提供編碼為胜肽序列之模板DNA庫，其於啟動子之下游，具有步驟F)之tRNA之反密碼子對應之密碼子、於其下游具有Cys、Pro、乳酸之tRNA之反密碼子對應之密碼子、更於其下游具有步驟C)之tRNA之反密碼子對應之密碼子、其3'側具有成為脯胺酸或其他ARS之基質之N-甲基胺基酸之密碼子
I)從步驟H)之模板DNA庫提供mRNA庫
J)使步驟I)之mRNA庫之3’末端與間隙子鍵結
K)於步驟J)之無細胞轉譯系，加入步驟J)之間隙子鍵結之mRNA庫並轉譯，而提供環化前胜肽化合物-mRNA複合體展示庫
L)使胜肽去甲醯基酶、甲硫胺酸 胺基肽酶作用於步驟K)之資料庫
K,L之步驟，也可藉由於轉譯時將胜肽去甲醯基酶、甲硫胺酸胺基肽酶加到系中而同時實施。
L)形成環狀結構
M)將胺基及視需要硫醇基亦經保護之化合物Na-4或化合物Na-10(Na-7基)或化合物Na-11(Na-7基)予以脫保護
N)生成直鏈部位2
環狀結構形成時，視需要可進行脫硫反應。
本發明中，步驟J)之後，可包含以黏合於mRNA庫之3’區域的引子合成cDNA之步驟。又，本發明之方法，可包含以下步驟。
O)以淘選濃縮與標的物質鍵結之mRNA庫
P)以反轉錄酶合成cDNA
Q)解析鹼基序列之步驟於步驟G)，可將甲硫胺酸替換為加入正白胺酸。
〔XVII〕係關於利用於N末端具有甲硫胺酸以外之胺基酸之胜肽之環化建構環狀分支胜肽庫之方法，包含以下1或多數步驟。本發明之具有環狀部之胜肽化合物之製造方法，係可藉由將N末端胺基酸不同之多種胜肽同時轉譯而實施之建構環化部位之結構不同之醯胺環化胜肽庫之方法，包含以下1或多數步驟。
A)提供將化合物C-1予以胺基醯基化而得之pdCpA
B)提供3’末端之CA欠缺之tRNA
C)使步驟A)之pdCpA與步驟B)之tRNA連結，提供將化合物C-1予以胺基醯基化而得之tRNA
D)提供將化合物胺基及視需要硫醇基亦經保護之化合物Na-4或化合物Na-10(Na-7基)或化合物Na-11(Na-7基)予以胺基醯基化而得之pdCpA
E)提供3’末端之CA欠缺之tRNA
F)使步驟D)之pdCpA與步驟E)之tRNA連結，提供將化合物胺基及視需要硫醇基亦經保護之化合物Na-4或化合物Na-10(Na-7基)或化合物Na-11(Na-7基)予以胺基醯基化而得之tRNA
G)提供包含步驟C)之tRNA與步驟F)之tRNA與乳酸之無細胞轉譯系
H)提供編碼為胜肽序列之模板DNA庫，其於啟動子之下游具有步驟C)之tRNA之反密碼子對應之密碼子作為第2位密碼子，並於其下游具有半胱胺酸、脯胺酸、與乳酸相應之密碼子，更於其下游具有步驟F)之tRNA之反密碼子對應之密碼子、其3'側具有成為脯胺酸或其他ARS之基質之N-甲基胺基酸之密碼子
I)從步驟H)之模板DNA庫提供mRNA庫
J)使步驟I)之mRNA庫之3’末端與間隙子鍵結
K)於步驟J)之無細胞轉譯系，加入步驟J)之間隙子鍵結之mRNA庫並轉譯，而提供環化前胜肽化合物-mRNA複合體展示庫
L)使胜肽去甲醯基酶、甲硫胺酸 胺基肽酶作用於步驟K)之資料庫
K,L之步驟，也可藉由於轉譯時將胜肽去甲醯基酶、甲硫胺酸胺基肽酶加到系中而同時實施。
M)形成環狀結構
環狀結構形成時，視需要可進行脫硫反應。
N)使化合物Na-4或化合物Na-10(Na-7基)或化合物Na-11(Na-7基)之側鏈保護基脫保護、及從Cys、Pro、乳酸單元產生活性硫酯
O)使生成之活性硫酯化與側鏈胺基形成醯胺鍵，使直鏈部位2生成
本發明中，步驟J)之後，可包含以黏合於mRNA庫之3’區域的引子合成cDNA之步驟。又，本發明之方法，可包含以下步驟。
P)以淘選濃縮與標的物質鍵結之mRNA庫
Q)以反轉錄酶合成cDNA
R)解析鹼基序列之步驟步驟G)的甲硫胺酸也可替換為加入正白胺酸。
胺基醯基tRNA之製備，不限於利用pdCpA，也包括利用胺基醯基tRNA合成酵素、Flexizyme、陽離子微胞中超音波混合法、PNA胺基酸活性酯法等。
天冬醯亞胺形成抑制法
天冬胺酸型之硫酯以轉譯導入之情形，由於係於C末端側正後之醯胺鍵與氫原子反應並形成天冬醯亞胺，所以將天冬胺酸型之硫酯以轉譯導入時，藉由使正後之胺基酸殘基為具有N-烷基之胺基酸(例如脯胺酸)，將含有所望硫酯之全長胜肽予以轉譯合成之方法
本說明書中，「烷基」，係指從脂肪族烴去除任意1個氫原子並衍生之1價基，為骨架中不含雜原子或不飽和碳-碳鍵，具有含有氫及碳原子之烴基(hydrocarbyl)或烴基結構之部分集合。碳鏈之長度n為1~20個之範圍。烷基，例如「C1~C6烷基」，具體而言，可列舉甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、異丙基、第三丁基、第二丁基、1-甲基丙基、1,1-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,2,2-三甲基丙基、1,1,2,2-四甲基丙基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、 2,3-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、異戊基、新戊基等。
本說明書中，前述「烷基」有時包括下列「烯基」、「炔基」。
本說明書中，「烯基」係至少有1個雙鍵(2個相鄰之SP2碳原子)之1價基。藉由雙鍵及取代成分(存在時)之配置，雙鍵之幾何學形態可採取反向(entgegen)(E)或同向(zusammen)(Z)、順式或反式配置。烯基可列舉直鏈狀或分支鏈狀者，包括含內部烯烴之直鏈等。較佳為例如C2-C10烯基，更佳為C2-C6烯基。如此的烯基，具體而言，例如乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基(包括順式、反式)、3-丁烯基、戊烯基、己烯基等。
本說明書中，「炔基」係至少有1個參鍵(2個相鄰之SP碳原子)之1價基。可列舉直鏈狀或分支鏈狀之炔基，包括內部伸烷基。較佳為C2-C10炔基，更佳為C2-C6炔基。炔基，具體而言，例如乙炔基、1-丙炔基、炔丙基、3-丁炔基、戊炔基、己炔基、3-苯基-2-丙炔基、3-(2'-氟苯基)-2-丙炔基、2-羥基-2-丙炔基、3-(3-氟苯基)-2-丙炔基、3-甲基-(5-苯基)-4-戊炔基等。
「環烷基」，係指飽和或部分飽和之環狀之1價脂肪族烴基，包括單環、雙環、螺環。較佳為例如C3-C10環烷基。環烷基，具體而言，例如環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環庚基、環辛基、雙環[2.2.1]庚基等。
「取代基也可具有鹵素之C1~C6烷基」，係指經1個以上之鹵素原子取代之「C1~C6烷基」。例如：三氟甲基、二 氟甲基、氟甲基、五氟乙基、四氟乙基、三氟乙基、二氟乙基、氟乙基、三氯甲基、二氯甲基、氯甲基、五氯乙基、四氯乙基、三氯乙基、二氯乙基、氯乙基等。
「鹵素」，意指氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)或碘(I)。
本說明書中，「芳基」意指1價芳香族烴環，較佳為C5-C10芳基。芳基具體而言，可列舉例如苯基、萘基(例如1-萘基、2-萘基)等。
本說明書中，前述「芳基」有時包括下列「雜芳基」。
本說明書中，「雜芳基」，係指構成環之原子中較佳為含有1~5個雜原子之芳香族性環之1價基，也可部分飽和。環可為單環、或2個縮合環(例如與苯環或與單環雜芳基環縮合而得之2環雜芳基)。構成環之原子之數較佳為5~10(C5-C10雜芳基)。
雜芳基，具體而言，例如呋喃基、噻吩基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、異噻唑基、噁唑基、異噁唑基、噁二唑基、噻二唑基、三嗪基、四唑基、吡啶基、嘧啶基、嗒嗪基、哌嗪基、三嗪基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并噻二唑基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、苯并噁二唑基、苯并咪唑基、吲哚基、異吲哚基、吲唑基、喹啉基、異喹啉基、喋啉基、喹唑啉基、喹噁啉基、苯并間二氧雜環戊烯基(benzodioxolyl)、異吲哚基、咪唑并吡啶基等。
「C5~C10芳基C1-C6烷基(芳烷基)」，係前述C1-C6烷基之氫原子當中的1個取代為前述C5~C10芳基而得之烷基。
芳基烷基(芳烷基)，係同時包含芳基與烷基之基，例如指前述烷基之至少1個氫原子取代為芳基而得之基，較佳為「C5~C10芳基C1-C6烷基」。例如苄基等。「可具有取代基之C5~C10芳基C1-C6烷基」，係指前述「C5~C10芳基C1-C6烷基」之芳基及/或烷基之至少1個氫原子取代為取代基而得之基。該等取代基，例如於"胺基酸"之側鏈之取代基定義的各種取代基等。
「烷氧基」，係指羥基之氫原子取代為前述烷基而得之基，例如較佳為「C1-C6烷氧基」。
本說明書中，「活性酯基」係指包含與胺基反應而生成醯胺鍵之羰基之基，該羰基例如有OBt、OAt、OSu、OPfp、SR1等鍵結之基，係能促進與胺基之反應之基。
「反應輔助基」，係為了於所望位置選擇性的起反應，而導入所鍵結之官能基附近，使該官能基對於鍵結反應活化之基，例如為使羰基與胺基反應，可在羰基與胺基側其中之一或兩者導入反應輔助基。如此的反應輔助基，例如SH等。如此的反應輔助基，可以與鍵結反應同時或鍵結反應後脫離。
「通常胺」，係指未由反應輔助基活化之胺。
mRNA display
本發明中，「核酸」也可包括去氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或具有人造鹼基之核苷酸衍生物。又，也可包括胜肽核酸(PNA)。本發明之核酸，只要能保持目的之遺傳資訊，也可為該等核酸中任意者、或混成者。亦即，DNA-RNA之雜交核苷酸或如DNA與RNA之不同核酸連接成1條鏈之嵌合核 酸，也包括在本發明之核酸。
本發明中，可理想地使用包含該等核酸作為模板之展示庫等核酸庫。
展示庫，係將編碼為表現型胜肽及其基因型胜肽之RNA或DNA予以對應之資料庫。藉由使所望之已固定之標的接觸庫，洗去未與標的鍵結之分子，可將鍵結之胜肽濃縮(淘選(panning)法)。將經過如此的過程選擇的胜肽取得對應的之基因資訊加以解析，能明白與標的結合之蛋白質之序列。例如：利用將胺基醯基tRNA之類似物抗生物質嘌呤黴素於核糖體所為之mRNA轉譯伸長中之蛋白質進行非專一性連結之方法，據報告有mRNA展示(display)(Proc Natl Acad Sci USA.1997；94：12297-302.RNA-peptide fusions for the in vitro selection of peptides and proteins.Roberts RW,Szostak JW.)或體外病毒(FEBS Lett.1997；414：405-8.In vitro virus：bonding of mRNA bearing puromycin at the 3'-terminal end to the C-terminal end of its encoded protein on the ribosome in vitro.Nemoto N,Miyamoto-Sato E,Husimi Y,Yanagawa H.)。
於從包含T7啟動子等啟動子之DNA庫以轉錄獲得之mRNA之資料庫之3'端以嘌呤黴素等間隙子先鍵結，以無細胞轉譯系將mRNA轉譯為蛋白質，則嘌呤黴素會由於核糖體而納入非胺基酸而是蛋白質，mRNA與其所編碼為之蛋白質連結，成為mRNA與其產物賦予對應之資料庫。於此過程，由於不包括大腸菌等的轉形，能達成高效率，可建構大規模的展示庫(1012-1014種)。針對以淘選濃縮、選擇之分子，從包含基因 資訊之附標籤mRNA合成cDNA，進行PCR增幅並將鹼基序列解析，可明白結合之蛋白之序列。成為庫之模板之DNA庫之未將胺基酸殘基固定之處，可藉由混合鹼基合成。尚有以下方法：若能重複A,T,G,C之4個鹼基之混合(N)之3之倍數個，或密碼子之第一字母第二字母，N、第三字母為W,M,K,S等2個鹼基的混合的形式合成，並將導入之胺基酸之種類壓制在16種以下，能使第三字母成為1種鹼基之方法。又，如實施例，準備相當於密碼子之3種字母之密碼子單元，將其以任意比例混合並用於合成，能自由調整胺基酸殘基之出現頻度。
利用無細胞轉譯系之展示庫中，除了mRNA展示以外，已知有編碼為胜肽與有嘌呤黴素之複合體結合之胜肽之cDNA構成之資料庫，即cDNA展示(Nucleic Acids Res.2009；37(16)：e108.cDNA display：a novel screening method for functional disulfide-rich peptides by solid-phase synthesis and stabilization of mRNA-protein fusions.Yamaguchi J,Naimuddin M,Biyani M,Sasaki T,Machida M,Kubo T,Funatsu T,Husimi Y,Nemoto N.)、利用mRNA轉譯中核糖體與轉譯產物比較穩定的複合體的核糖體展示(ribosome display)(Proc Natl Acad Sci U S A.1994；91：9022-6.An in vitro polysome display system for identifying ligands from very large peptide libraries.Mattheakis LC,Bhatt RR,Dower WJ.)、利用噬菌體內切核酸酶(bacteriophage endonuclease)P2A與DNA形成共價鍵之共價展示(covalent display)(Nucleic Acids Res.2005；33：e10.Covalent antibody display--an in vitro antibody-DNA library selection system.Reiersen H,Lobersli I,Loset GA,Hvattum E,Simonsen B,Stacy JE,McGregor D,Fitzgerald K,Welschof M,Brekke OH,Marvik OJ.)、利用將微生物之質體之複製開始蛋白RepA鍵結於複製開始點ori之CIS展示(Proc Natl Acad Sci U S A.2004；101：2806-10.CIS display：In vitro selection of peptides from libraries of protein-DNA complexes.Odegrip R,Coomber D,Eldridge B,Hederer R,Kuhlman PA,Ullman C,FitzGerald K,McGregor D.)。又，也已知：就構成DNA庫之DNA的每1分子，將轉錄轉譯系封入油中水(water-in-oil)乳劑或微脂體並進行轉譯反應之體外隔間(in vitro compartmentalization)(Nat Biotechnol.1998；16：652-6.Man-made cell-like compartments for molecular evolution.Tawfik DS,Griffiths AD.)。可適當使用公知方法並採用上述方法。
本發明中，可使用以下記載之無細胞轉譯系將該等核酸庫進行轉譯。使用無細胞轉系之情形，宜於目的核酸之下游含有編碼為間隙子之序列較佳。間隙子序列，可列舉含有甘胺酸或絲胺酸，但不限於該等。又，將嘌呤黴素(Puromycin)、其衍生物等利用核糖體轉譯時，在納入胜肽之化合物與核酸庫之間，含有以RNA、DNA、六乙二醇(spc18)之聚合物(例如5個聚合物)等形成之連結子較佳。
無細胞轉譯系
本發明之胜肽化合物之製造方法中，宜使用無細胞轉譯系等蛋白質製造系較佳。無細胞轉譯系，除了由細胞萃取之核糖體以外，更將涉及轉譯之蛋白因子群、tRNA、胺基酸、ATP 等能量源、再生系組合者，可將mRNA轉譯為蛋白。本發明之無細胞轉譯系中，除了該等以外，也包含開始因子、伸長因子、解離因子、胺基醯基tRNA合成酵素、甲硫胺醯基tRNA轉甲醯基酶等。該等因子，可藉由從各種細胞之萃取液精製而獲得。為了將因子精製之細胞，例如原核細胞、或真核細胞。原核細胞可列舉大腸菌細胞、高度好熱菌細胞、或枯草菌細胞。真核細胞，已知有以酵母細胞、小麥胚芽、兔網狀紅血球、植物細胞、昆蟲細胞、或動物細胞作為材料者。
無細胞轉譯系，係將材料之細胞破碎並離心分離、透析等以製備之萃取液中加入有tRNA、胺基酸、ATP等者。例如：以大腸菌(Methods Enzymol.1983；101：674-90.Prokaryotic coupled transcription-translation.Chen HZ,Zubay G.)、酵母(J.Biol.Chem.1979 254：3965-3969.The preparation and characterization of a cell-free system from Saccharomyces cerevisiae that translates natural messenger ribonucleic acid.E Gasior,F Herrera,I Sadnik,C S McLaughlin,and K Moldave)、小麥胚芽(Methods Enzymol.1983；96：38-50.Cell-free translation of messenger RNA in a wheat germ system.Erickson AH,Blobel G.)、兔網狀紅血球(Methods Enzymol.1983；96：50-74.Preparation and use of nuclease-treated rabbit reticulocyte lysates for the translation of eukaryotic messenger RNA.Jackson RJ,Hunt T.)、Hela細胞(Methods Enzymol.1996；275：35-57.Assays for poliovirus polymerase,3D(Pol),and authentic RNA replication in HeLa S10 extracts.Barton DJ, Morasco BJ,Flanegan JB.)、昆蟲細胞(Comp Biochem Physiol B.1989；93：803-6.Cell-free translation in lysates from Spodoptera frugiperda(Lepidoptera：Noctuidae)cells.Swerdel MR,Fallon AM.)可作為材料。藉由將T7 RNA polymerase等RNA聚合酶加入，能使從DNA之轉錄、轉譯成對。另一方面，PURE system係各別將對於大腸菌轉譯必要之蛋白因子類、能量再生系酵素、核糖體萃取、精製，並與tRNA、胺基酸、ATP、GTP等混合而得之再構成無細胞轉譯系。雜質之含量不僅少，且由於係再構成系，故能輕易製作不含欲排除之蛋白因子、胺基酸之系。((i)Nat Biotechnol.2001；19：751-5.Cell-free translation reconstituted with purified components.Shimizu Y,Inoue A,Tomari Y,Suzuki T,Yokogawa T,Nishikawa K,Ueda T.(ii)Methods Mol Biol.2010；607：11-21.PURE technology.Shimizu Y,Ueda T.)。可使用適當、公知之方法採用上述方法。
核糖體、tRNA等、無細胞轉譯系所含之各種因子，可從大腸菌細胞或酵母細胞依該技術領域中具有通常知識者周知之方法精製。又，tRNA或胺基醯基tRNA合成酵素除了天然存在者，也可使用認識人工tRNA或非天然胺基酸之人工胺基醯基tRNA合成酵素。藉由使用人工tRNA或人工胺基醯基tRNA合成酵素，能合成以部位專一性的導入有非天然胺基酸之胜肽。
非天然胺基酸對於胜肽之轉譯導入，須要具有直交性且以良好效率地納入於核糖體之tRNA((i)Biochemistry. 2003；42：9598-608.Adaptation of an orthogonal archaeal leucyl-tRNA and synthetase pair for four-base,amber,and opal suppression.Anderson JC,Schultz PG.,(ii)Chem Biol.2003；10：1077-84.Using a solid-phase ribozyme aminoacylation system to reprogram the genetic code.Murakami H,Kourouklis D,Suga H.)之胺基醯基化。將tRNA胺基醯基化之方法，可使用以下5種方法。
在細胞中將tRNA之胺基醯基化依胺基酸分別準備胺基醯基tRNA合成酵素。某些種之胺基醯基tRNA合成酵素利用容許N-Me His等非天然胺基酸之方法、準備容許非天然胺基酸變異胺基醯基tRNA合成酵素並利用其之方法((i)Proc Natl Acad Sci U S A.2002；99：9715-20.An engineered Escherichia coli tyrosyl-tRNA synthetase for site-specific incorporation of an unnatural amino acid into proteins in eukaryotic translation and its application in a wheat germ cell-free system.Kiga D,Sakamoto K,Kodama K,Kigawa T,Matsuda T,Yabuki T,Shirouzu M,Harada Y,Nakayama H,Takio K,Hasegawa Y,Endo Y,Hirao I,Yokoyama S.(ii)Science.2003；301：964-7.An expanded eukaryotic genetic code.Chin JW,Cropp TA,Anderson JC,Mukherji M,Zhang Z,Schultz PG.Chin,JW.(iii)Proc Natl Acad Sci U S A.2006；103：4356-61.Enzymatic aminoacylation of tRNA with unnatural amino acids.Hartman MC,Josephson K,Szostak JW.)。在試管內將tRNA予以胺基醯基化之後進行胺基酸化學 修飾之方法也可採用(J Am Chem Soc.2008；130：6131-6.Ribosomal synthesis of N-methyl peptides.Subtelny AO,Hartman MC,Szostak JW.)。藉由從tRNA之3'末端之CCA序列已去除CA者與分別製備之經胺基醯基化之pdCpA以RNA接合酶鍵結，能獲得胺基醯基tRNA(Biochemistry.1984；23：1468-73.T4 RNA ligase mediated preparation of novel "chemically misacylated" tRNAPheS.Heckler TG,Chang LH,Zama Y,Naka T,Chorghade MS,Hecht SM.)。也可利用將各種非天然胺基酸之活性酯載持於tRNA之ribozyme flexizyme也可進行胺基醯基化(J Am Chem Soc.2002；124：6834-5.Aminoacyl-tRNA synthesis by a resin-immobilized ribozyme.Murakami H,Bonzagni NJ,Suga H.)。也可使用將tRNA與胺基酸活性酯在陽離子性微胞中進行超音波混合之方法(Chem Commun(Camb).2005；(34)：4321-3.Simple and quick chemical aminoacylation of tRNA in cationic micellar solution under ultrasonic agitation.Hashimoto N,Ninomiya K,Endo T,Sisido M.)。也可藉由於與tRNA之3'末端附近為互補之PNA已有胺基酸活性酯鍵結者加到tRNA進行胺基醯基化(J Am Chem Soc.2004；126：15984-9.In situ chemical aminoacylation with amino acid thioesters linked to a peptide nucleic acid.Ninomiya K,Minohata T,Nishimura M,Sisido M.)。
作為導入非天然胺基酸之密碼子利用終止密碼子之方法已有許多報告，由於藉由使用前述PUREsystem能夠建 構不含天然胺基酸、ARS之合成系，所以可針對編碼為胺基酸之密碼子，將除外之天然胺基酸替換為使用非天然胺基酸導入(J Am Chem Soc.2005；127：11727-35.Ribosomal synthesis of unnatural peptides.Josephson K,Hartman MC,Szostak JW.)。再者，藉由解開密碼子之退化性(Degeneracy)，可不將天然胺基酸除外，而加入非天然胺基酸(Kwon I,et al.Breaking the degeneracy of the genetic code.J Am Chem Soc.2003,125,7512-3.)。含有N-甲基胺基酸之胜肽可利用活用PureSystem等無細胞轉譯系於核糖體合成。
N-甲基胺基酸之出現頻度之調整
構成庫之胜肽所含之N-甲基胺基酸之數，可於合成DNA庫時依對應於N-甲基胺基酸之密碼子之出現頻度調整。例如於包含10個胺基酸殘基可變處之胜肽之資料庫，假定胺基酸之種類從20種選擇的情形，若選擇N-Me胺基酸10種，則藉由合成使N-Me胺基酸之密碼子單元在可變處1處佔10/20(50%)，能使庫之胜肽所含之N-甲基胺基酸之數平均成為5個。
本發明之由具有環狀部之胜肽化合物構成之資料庫，係由胺基酸及/或胺基酸類似物之數為9~13殘基之具有環狀部之胜肽化合物構成，但該9~13個殘基係以展示庫之無規區域即將開始之N末端側胺基酸定為1，直到第13個殘基之胺基酸來計算(就轉譯後修飾已完了後之單元數計算)。形成該具有環狀部之胜肽化合物之9~13個殘基中，N-甲基胺基酸之數之平均為3~10，較佳為4~9，更佳為5~8，須考慮無規區 域所含之胺基酸為N-烷胺基酸與具有NH2之胺基酸之比例。同樣地，須選擇無規區域所含之胺基酸之種類，使該13個殘基之胜肽之ClogP值之平均設為4以上，較佳為5以上，更佳為6以上。
選擇之胺基酸，宜為選擇之所有胺基酸在中性(例如pH=7.0)極度不離子化之官能基之中較佳。例如酸為pKa3.5以上較佳。更佳為4.5以上，又更佳為5以上。例如天冬胺酸之側鏈羧基之pKa=3.9，酪胺酸之側鏈苯酚性羥基之pKa=10。又，四唑之pKa=5.6。又，鹼以pKa9以下較佳，更佳為7.5以下，又更佳為6.5以下。例如：精胺酸之側鏈胍基之pKa為12.5，離胺酸之側鏈胺基之pKa為10.5，組胺酸之咪唑基之pKa為6.1。又，吡啶之pKa為5.2。胜肽之N末端α胺基酸之主鏈胺基之pKa為8左右。
實際依吾人之實施例24記載，依據該規則，可變區域之胺基酸種類為21種，其中10種選擇N甲基等N烷胺基酸。以Initiation read through法中，固定胺基酸2個之中，均為NH2，故計算平均之N-烷基數為4.4。Inhitiation suppression法中，2個固定胺基酸其中1個為N烷基，且交叉單元之C末端側有時從N-烷胺基酸之中選擇，故計算平均之N-烷胺基酸數為6.0。
同樣，兩者之平均CLogP值各為5.97與6.12。
轉譯合成能使用之非天然型胺基酸
本發明能使用之非天然型胺基酸(轉譯胺基酸)列舉如下，但不限定於此等。該等非天然型胺基酸多為側鏈以保護或無保 護、胺部位以保護或無保護之狀態購買。未購買者，係以既知方法合成。
Figure 107130626-A0101-12-0159-173
非天然型胺基酸，也可使用以下之N-Me胺基酸。
N-甲基丙胺酸、N-甲基甘胺酸、N-甲基苯丙胺酸、N-甲基酪胺酸、N-甲基-3-氯苯丙胺酸、N-甲基-4-氯苯丙胺酸、N-甲基-4-甲氧基苯丙胺酸、N-甲基-4-噻唑丙胺酸、N-甲基組胺酸、N-甲基絲胺酸、N-甲基天冬胺酸、
Figure 107130626-A0101-12-0160-174
非天然型胺基酸也可使用以下之N-烷胺基酸。
Figure 107130626-A0101-12-0160-175
非天然型胺基酸，也可使用以下之D型胺基酸。
Figure 107130626-A0101-12-0160-176
非天然型胺基酸，也可使用以下之α，α-二烷胺基酸。
Figure 107130626-A0101-12-0160-177
非天然型胺基酸也可使用以下之胺基酸。
Figure 107130626-A0101-12-0160-178
胺基醯基tRNA之製作
胺基酸及胺基酸類似物為了與pdCpA反應，可例如變換為活性酯。該等活性酯多可單離為氰基甲酯之形式。
單離的氰基甲酯與pdCpA反應成為配對體後，例 如可藉由接合(Ligation)成為tRNA與胺基酸或胺基酸類似物之配對體。
進行tRNA與胺基酸之接合之手法，不拘於如此的pdCpA法，也可藉由使用Flexizyme之手法、或使用ARS之手法合成。
轉譯合成後為了環化可活用之醯胺鍵形成反應
利用羧酸與一級及二級胺之反應所為之醯胺鍵形成反應，在有機合成化學一般廣為使用。例如可使用將羧酸預先活化而得之活性酯等單離後與胺混合之方法、直接混合羧酸與胺後使羧酸活化並形成醯胺鍵之方法等。羧酸之活性體，廣為人知有醯氯或醯碘等醯鹵化物群、或HOBt、HOAt、HOSu、HOPfp、硫酯等活性酯群。
硫酯較佳為例如以-C(=O)SR1表示者。
Figure 107130626-A0101-12-0161-179
醯鹵，可藉由使羧酸與SOCl2等鹵化劑混合後以精製操作而單離。獲得之醯鹵由於有高反應性，因此於PureSystem等轉譯系使用之情形，可使用以PureSystem轉譯後能使羧酸予以醯鹵化之溫和反應條件，從PPh3與I2活化為醯碘之手法(Lakshman等人，Eur.J.Org.Chem.2010,2709)。
Figure 107130626-A0101-12-0162-180
活性酯化法，可使用例如將羧酸以PureSystem等轉譯後於反應系中利用活性酯化反應使產生活化酯之手法、將預先單離為活性酯之化合物以PureSystem使轉譯之手法等。一般而言，活性酯當中之反應性較低之硫酯等以預先單離為活性酯後轉譯為適當，相對於此，反應性較高之HOAt活性酯等宜於轉譯後使產生活化酯較理想。
又，為了於所望位置選擇性地使羧酸與胺基反應，可於羧酸與胺基側之任一者、或兩者導入反應輔助基。
於胺基附近導入反應輔助基之手法，例如於胺基附近導入硫醇基之手法。將胺基與硫醇基連接之原子數(碳鏈數)宜為2或3尤佳。具有羧酸或已活化之羧酸與附近導入有硫醇基之胺基之單元以PureSystem導入後，將此2個部位選擇性地反應，可獲得醯胺鍵化合物。SH基由於有高親核性，故會先與SH基活性酯快速反應，以分子內轉移反應而向熱力學穩定之醯胺鍵方向移動，結果能對於有輔助基之胺基選擇性的醯胺化。如此的反應例特別廣泛使用在硫酯與半胱胺酸之反應(Chemical ligation法)。
Figure 107130626-A0101-12-0163-181
得到之含SH基之醯胺化合物宜於溫和的反應條件還原並進行脫硫反應。原因為當含有SH基的情形，SH基會與各種標的形成共價鍵結，所以難以有效率的創出活性化合物(Hit)。
於羧酸側與胺基側之兩者導入反應輔助基之例，可列舉以下流程(Li等，Org.Lett.2010,12,1724)。
Figure 107130626-A0101-12-0163-2179
由於在羧酸側之活性酯基有醛部位，所以會與胺基附近有醇部位之基質選擇性的快速形成N，O-亞苄基縮醛。將其於酸性條件下轉移反應，則會生成醯胺鍵。將該活性酯於苯基硫酯共存下，可選擇性的與絲胺酸反應。又，含有OH基之絲胺酸於離胺酸存在下，能選擇性的與本活性酯反應。
也可不經由活性酯，而使羧酸與胺直接反應。不經由活性酯之情形，為了脫水反應，例如以縮合將生成之水除去(併用與甲苯之共沸或分子篩等脫水劑)。據報告有非質子酸，較溫和之反應條件。又，作為使用過渡金屬等觸媒之反應， 例如可使用鐵觸媒(Das等，J.Org.Chem.2003,68,1165.)。
也可不為羧酸與胺之反應，而將其中一者或兩者作為另一官能基反應，例如不使用胺而使用疊氮化物與活性酯反應之手法。
也可使用硫羧酸作為羧酸之活化體，使用疊氮化物作為胺等價體(Williams等人.J.Am.Chem.Soc.2003,125,7754.)。
Figure 107130626-A0101-12-0164-183
此反應可於較溫和的反應條件，(60℃、36小時)、水中適用。
胺等價體也可使用疊氮化物(Vilarrasa等，J.Org.Chem.2009,74,2203)。使羧酸於反應系中在3級膦存在下以二硫基觸媒或二硒基觸媒活化而活化為硫酯或硒酯。又，疊氮化物部位與3級膦反應使活化，並與活性酯反應。藉由製成分子內有硫酯與膦部位之兩者的活性酯，據報報能更有效生成醯胺鍵，廣泛作為Staudinger反應使用(Raines等人Org.Lett.2001,3,9)。也可應用在胜肽合成(Hackenberger等人Angew.Chem.Int.Ed.2008,47,5984)。
Figure 107130626-A0101-12-0164-184
羧酸替換為使用酮酸，胺替換為使用羥基胺，以縮合反應可進行醯胺化反應(Bode等人.Angew.Chem.Int.Ed. 2006,45,1248)。本反應可於溫和條件，於(40℃)於含水溶劑系在羧酸或胺等官能基共存下選擇性的反應。
Figure 107130626-A0101-12-0165-185
上述反應之變法，也可使用如以下之方法(Bode等人.Angew.Chem.Int.Ed.2006,45,1248)。
Figure 107130626-A0101-12-0165-186
此外，就羧酸部位轉換為其他官能基，也可使用以醇、腈、乙炔部位作為開始原料之手法。以腈與胺之縮合所為之醯胺化反應(下列反應例)中，可利用釕(Murahashi等人，J.Am.Chem.Soc.1986,108,7846)、鉑(Vries等人，.Tet.Lett.2000,41,2467)、鐵(Williams等人.Tet.Lett.2009,50,4262)等過渡金屬觸媒。
Figure 107130626-A0101-12-0165-187
將炔與胺使用錳紫質系觸媒之觸媒反應，可於水中，室溫、1小時於溫和的氧化條件，oxone進行醯胺化(Che等.J.Am.Chem.Soc.2006,128,14796)。該方法也可應用於側 鏈無保護之胜肽合成。
Figure 107130626-A0101-12-0166-188
也可使用醇與胺之釕錯體觸媒縮合(Milstein等，Science 2007,317,790)。
Figure 107130626-A0101-12-0166-189
也可利用醛與胺之鈀錯體觸媒(Yoshida等人s.Synthesis,1983,474)及銠錯體觸媒(Beller等人，Eur.J.Org.Chem.2001,423)所為之縮合反應。
Figure 107130626-A0101-12-0166-190
<醫藥組合物>
本發明提供包含以本發明之方法製造之胜肽化合物之醫藥組合物。
本發明之醫藥組合物除了以本發明之方法製造之胜肽化合物以外，可導入醫藥上可容許之擔體，以公知方法製劑化。可使用製劑化通常使用之賦形劑、黏結劑、潤滑劑、著色劑、矯味矯臭劑、及視需要之安定化劑、乳化劑、吸收促進劑、界面活性劑、pH製備劑、防腐劑、抗氧化劑等，摻合一般作為醫藥品製劑之原料使用之成分，以常法製劑化。
例如：製造經口製劑時，加入本發明之化合物或其在藥理學可容許之鹽及賦形劑、及視需要之黏結劑、崩散劑、潤滑劑、著色劑、矯味矯臭劑等後，以常法製成散劑、細粒劑、顆粒劑、錠劑、被覆錠劑、膠囊劑等。
該等成分，例如：黃豆油、牛脂、合成甘油酯等動植物油；流動石蠟、角鯊烷、固體石蠟等烴；肉豆蔻酸辛基十二酯、肉豆蔻酸異丙酯等酯油；鯨蠟硬脂基醇、二十二醇等高級醇；矽樹脂；矽油；聚氧乙烯脂肪酸酯、山梨糖醇酐脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯硬化蓖麻子油、聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物等界面活性劑；羥基乙基纖維素、聚丙烯酸、羧基乙烯基聚合物、聚乙二醇、聚乙烯基吡咯烷酮、甲基纖維素等水溶性高分子；乙醇、異丙醇等低級醇；甘油、丙二醇、二丙二醇、山梨醇等多元醇；葡萄糖、蔗糖等糖；無水矽酸、矽酸鋁鎂、矽酸鋁等無機粉體、精製水等。
賦形劑，例如乳糖、玉米澱粉、白糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、結晶纖維素、二氧化矽等。
黏結劑，例如聚乙烯醇、聚乙烯醚、甲基纖維素、乙基纖維素、阿拉伯膠、黃蓍膠、明膠、蟲膠、羥基丙基甲基纖維素、羥基丙基纖維素、聚乙烯基吡咯烷酮、聚丙二醇‧聚氧乙烯‧嵌段聚合物、美洛明(Meglumine)等。
崩散劑，例如澱粉、瓊脂、明膠粉末、結晶纖維素、碳酸鈣、碳酸氫鈉、檸檬酸鈣、糊精、果膠、羧基甲基纖維素‧鈣等。
潤滑劑，例如硬脂酸鎂、滑石、聚乙二醇、二氧化矽、硬化植物油等。
作為著色劑可使用能容許添加到醫藥品者，作為矯味矯臭劑可使用可可粉末、薄荷腦、芳香散、薄荷油、龍腦(borneol)、桂皮粉末等。
該等錠劑‧顆粒劑可外覆糖衣、其他視需要的適當塗層。又，製造糖漿劑或注射用製劑等液劑時，在本發明之化合物或其在藥理學上可容許之鹽加入pH調整劑、溶解劑、等張化劑等、及視需要加入溶解輔助劑、安定化劑等，依常法製劑化。
例如：可以為與水或其他藥學可容許容之液體的無菌性溶液、或懸浮液劑之注射劑之形式，以非經口的使用。例如：藥理學上可容許之單體或介質，具體而言，據認為可與滅菌水或生理食鹽水、植物油、乳化劑、懸浮劑、界面活性劑、安定劑、香味劑、賦形劑、媒液(vehicle)、防腐劑、黏結劑等適當組合並以一般認可製藥實務要求之單位用量形態混和而製劑化。具體而言，可列舉輕質無水矽酸、乳糖、結晶纖維素、甘露醇、澱粉、羧甲基纖維素(carmellose)鈣、羧甲基纖維素鈉、羥基丙基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、聚乙烯基縮醛二乙胺基乙酸酯、聚乙烯基吡咯烷酮、明膠、中鏈脂肪酸三酸甘油酯、聚氧乙烯硬化篦麻子油60、白糖、羧基甲基纖維素、玉米澱粉、無機鹽類等作為擔體。該等製劑中之有效成分量，可定為能獲得指示之範圍之適當容量。
注射用之無菌組合物，可使用如注射用蒸餾水之媒液，依 通常之製劑實務配方。
注射用之水溶液，例如可列舉生理食鹽水、含葡萄糖或其他輔助藥之等張液，例如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化鈉，也可以與適當的溶解輔助劑，例如醇，具體而言，乙醇、多元醇例如丙二醇、聚乙二醇、非離子性界面活性劑例如聚山梨醇酯80(註冊商標)、HCO-50併用。
油性液可列舉蔴油、黃豆油，溶解輔助劑也可併用苯甲酸苄酯、苯甲醇。又，也可摻合緩衝劑例如磷酸鹽緩衝液、乙酸鈉緩衝液，止痛劑例如：鹽酸普卡因、安定劑例如苯甲醇、苯酚、抗氧化劑。製備之注射液通常填充在適當的安瓿。
投予較佳為經口投予，但投予方法不拘於經口投予。非經口投予，具體而言，可列舉注射劑型、經鼻投予劑型、經肺投予劑型、經皮投予型等。注射劑型，可利用例如：靜脈內注射、肌肉內注射、腹腔內注射、皮下注射等以全身或局部投予。
又，可依患者年紀、症狀選擇適當投予方法。含有本發明之方法製造之胜肽化合物之醫藥組合物之投予量，例如可每次就體重1kg從0.0001mg至1000mg之範圍選擇。或，例如每名患者從0.001至100000mg/body之範圍選擇投予量，但不一定受限於該等數值。投予量、投予方法，取決於患者之體重或年紀、症狀等變動，但如為該技術領域中具有通常知識者可適當選擇。
【實施例】
本發明依以下實施例進一步例示，但不限定於下 列實施例。
[實施例1]側鏈羧酸經活性酯化之化合物(1g)之合成
實施具有硫酯之一系列活性酯(化合物1g)之合成，Rex1=Me、Et、iPr、tBu、Bn、Ph、Phenetyl基之合成依圖1之方法實施。
又，實施例中使用以下簡稱。
DCM 二氯甲烷
DIC N,N-二異丙基碳二醯亞胺
DIPEA N,N-二異丙基乙胺
DMAP 4-二甲胺基吡啶
DMF 二甲基甲醯胺
DMSO 二甲基亞碸
DTT 二硫蘇糖醇(dithiothreitol)
FA 甲酸
TFA 三氟乙酸
THF 四氫呋喃
HFIP 1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇
HOBT 1H-苯并[d][1,2,3]三唑-1-醇
WSCI‧HCl 1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二醯亞胺鹽酸鹽
TCEP 參(2-羧基乙基)膦
NMP N-甲基-2-吡咯烷酮
DBU 1,8-二氮雜雙環[5.4.0]-7-十一烯
又，胜肽合成及固相合成使用之反應溶劑，使用胜肽合成 用(從關東化學、和光純藥或渡邊化學購買)。例如DCM、DMF、DMSO、2% DBU in DMF，20% piperidine in DMF等。又，在不添加水作為溶劑之反應，係使用脫水溶劑或無水溶劑(從關東化學、和光純藥等購買)。
又，LCMS之分析條件如下。
【表1】
Figure 107130626-A0101-12-0172-2180
Figure 107130626-A0101-12-0173-2181
Figure 107130626-A0101-12-0174-2184
1.1g-ID之合成
1-1.(S)-4-(第三丁氧基)-4-側氧基-3-(戊-4-烯醯胺)丁酸(化合物1b-I)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0174-194
於(S)-3-胺基-4-(第三丁氧基)-4-側氧基丁酸(化合物1a-I)(21.1mmol、4.00g)與Na2CO3(63.3mmol，6.71g)之THF(70mL)、水(140ml)溶液中，於0℃加入氯化戊-4-烯醇(42.2mmol，4.66ml)，於室溫攪拌20分鐘。之後，於反應混合物於0℃滴加濃鹽酸，調整為pH2。以乙酸乙酯稀釋後，加入適量NaCl，進行鹽析萃取。將獲得之有機萃取物以飽和食鹽水洗滌，以硫酸鎂乾燥。並且，以減壓濃縮獲得(S)-4-(第三丁氧基)-4-側氧基-3-(戊-4-烯醯胺)丁酸(化合物1b-I)與戊-4-烯酸(1：0.8)之混合粗產物A(7.69g、100%)。
1-2.(S)-4-(苄硫基)-4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)丁酸 (化合物1f-ID)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0175-195
於(S)-4-(第三丁氧基)-4-側氧基-3-(戊-4-烯醯胺)丁酸(化合物1b-I)與戊-4-烯酸(1：0.8)之混合粗產物A(2.51g、12.9mmol)之CH2Cl2(35ml)溶液，加入DIC(N、N'-二異丙基碳二醯亞胺)(2.41ml、15.5mmol)、DMAP(N、N-二甲胺基吡啶)(315mg、2.58mmol)及苯基甲烷硫醇(1.82ml、15.5mmol)，於室溫攪拌4小時。之後，於反應混合物加入TFA(21ml)，於室溫攪拌9小時半。之後，將反應混合物減壓濃縮，將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(10mM乙酸銨水溶液/甲醇=80/20→40/60)精製，獲得(S)-4-(苄硫基)-4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)丁酸(化合物1f-ID)(1.65g、74%)。
LCMS(ESI)m/z=322(M+H)+
保持時間：0.78分(分析條件SQDAA05)
1-3.4-(苄硫基)-4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)丁酸(S)-氰基甲酯(化合物1g-ID)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0176-196
於(S)-4-(苄硫基)-4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)丁酸(化合物1f-ID)(1.00g、3.12mmol)之DMSO(4.35ml)溶液加入2-溴乙腈(4.35ml、62.4mmol)與N-乙基-N-異丙基丙烷-2-胺(0.651ml、3.74mmol)，於室溫攪拌40分鐘。於反應混合物中加入飽和氯化銨水溶液(5ml)後，以乙酸乙酯稀釋，將有機層以水洗滌。之後將有機萃取物以硫酸鎂乾燥。減壓濃縮後，將獲得之殘渣以矽膠管柱層析(己烷/乙酸乙酯=100/0→40/60)精製，獲得4-(苄硫基)-4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)丁酸(S)-氰基甲酯(化合物1g-ID)(885.2mg、79%)。
LCMS(ESI)m/z=361(M+H)+
保持時間：0.91分(分析條件SQDAA05)
2.1g-IE之合成
2-1.(S)-4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)-4-(苯乙硫基)丁酸(化合物1f-IE)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0177-198
與化合物1f-ID之製造例以同樣條件，使用(S)-4-(第三丁氧基)-4-側氧基-3-(戊-4-烯醯胺)丁酸(化合物1b-I)與戊-4-烯酸(1：0.8)之混合粗產物A(1.3g、6.65mmol)，並將苯基甲烷硫醇替換為使用2-苯基乙烷硫醇(0.889ml、6.63mmol)，藉此獲得(S)-4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)-4-(苯乙硫基)丁酸(化合物1f-IE)(607mg、49%)。
LCMS(ESI)m/z=336(M+H)+
保持時間：0.83分(分析條件SQDAA05)
2-2.4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)-4-(苯乙硫基)丁酸(S)-氰基甲酯(化合物1g-IE)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0177-197
於((S)-4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)-4-(苯乙硫基)丁 酸(化合物1f-IE)(300mg、0.894mmol)之2-溴乙腈(1.87ml)溶液中加入N-乙基-N-異丙基丙烷-2-胺(0.187ml、1.07mmol)，於室溫攪拌30分鐘。於反應混合物中加入飽和氯化銨水溶液(5ml)後，以乙酸乙酯稀釋、將有機層以水洗滌。之後將有機萃取物以硫酸鎂乾燥。減壓濃縮後，將獲得之殘渣以矽膠管柱層析(己烷/乙酸乙酯=100/0→60/40)精製，獲得4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)-4-(苯乙硫基)丁酸(S)-氰基甲酯(化合物1g-IE)(295mg、88%)。
LCMS(ESI)m/z=375(M+H)+
保持時間：0.95分(分析條件SQDAA05)
3.1g-IG之合成
3-1. (S)-4-(乙硫基)-4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)丁酸(化合物1f-IG)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0178-199
與化合物1f-ID之製造例以同樣條件，使用(S)-4-(第三丁氧基)-4-側氧基-3-(戊-4-烯醯胺)丁酸(化合物1b-I)與戊-4-烯酸(1：0.8)之混合粗產物A(889mg、4.55mmol)，並且將苯基甲烷硫醇替換為使用乙烷硫醇(0.338ml、4.56mmol)，獲得(S)-4-(乙硫基)-4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)丁酸(化合物1f-IG)(233mg、36%)。
LCMS(ESI)m/z=260(M+H)+
保持時間：0.58分(分析條件SQDAA05)
3-2. 4-(乙硫基)-4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)丁酸(S)-氰基甲酯(化合物1g-IG)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0179-200
與化合物1g-ID之製造例以同樣條件，將(S)-4-(苄硫基)-4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)丁酸(化合物1f-ID)替換為使用(S)-4-(乙硫基)-4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)丁酸(化合物1f-IG)(100mg、0.386mmol)，獲得4-(乙硫基)-4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)丁酸(S)-氰基甲酯(化合物1g-IG)(59.8mg、52%)。
LCMS(ESI)m/z=299(M+H)+
保持時間：0.69分(分析條件SQDFA05)
4.1g-IB之合成
4-1. (S)-4-(異丙硫基)-4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)丁酸(化合物1f-IB)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0179-2185
與化合物1f-ID之製造例以同樣條件，使用(S)-4-(第三丁氧基)-4-側氧基-3-(戊-4-烯醯胺)丁酸(化合物1b-I)與戊-4-烯酸(1：0.8)之混合粗產物A(788mg、4.23mmol)，並將苯基甲烷硫醇替換為使用丙烷-2-硫醇(0.393ml、4.23mmol)，獲得(S)-4-(異丙硫基)-4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)丁酸(化合物1f-IB)(485mg、76%)。
LCMS(ESI)m/z=274(M+H)+
保持時間：0.70分(分析條件SQDAA05)
4-2.4-(異丙硫基)-4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)丁酸(S)-氰基甲酯(化合物1g-IB)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0180-202
於(S)-4-(異丙硫基)-4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)丁酸(化合物1f-IB)(200mg、0.732mmol)之DMF(1ml)溶液中，加入2-溴乙腈(0.510ml、7.32mmol)與N-乙基-N-異丙基丙烷-2-胺(0.153ml、0.878mmol)，於室溫攪拌30分鐘。於反應混合物中加入飽和氯化銨水溶液(1ml)後，以乙酸乙酯稀釋，將有機層以水洗滌。之後將有機萃取物以硫酸鎂乾燥。減壓濃縮後，將獲得之殘渣以矽膠管柱層析(己烷/乙酸乙酯=100/0→60/40)精製，獲得4-(異丙硫基)-4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)丁酸(S)-氰基甲酯(化合物1g-IB)(161mg、70%)。
LCMS(ESI)m/z=313(M+H)+
保持時間：0.75分(分析條件SQDFA05)
5.1g-IC之合成
5-1.(S)-4-(第三丁硫基)-4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)丁酸(化合物1f-IC)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0181-2187
與化合物1f-ID之製造例以同樣條件，使用(S)-4-(第三丁氧基)-4-側氧基-3-(戊-4-烯醯胺)丁酸(化合物1b-I)與戊-4-烯酸(1：0.8)之混合粗產物A(1.23g、6.64mmol)，並將苯基甲烷硫醇替換為使用2-甲基丙烷-2-硫醇(0.748ml、6.63mmol)，獲得(S)-4-(第三丁硫基)-4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)丁酸(化合物1f-IC)(653mg、62%)。
LCMS(ESI)m/z=288(M+H)+
保持時間：0.79分(分析條件SQDAA05)
5-2. 4-(第三丁硫基)-4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)丁酸(S)-氰基甲酯(化合物1g-IC)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0181-2189
與化合物1g-IE之製造例以同樣條件，將((S)-4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)-4-(苯乙硫基)丁酸(化合物1f-IE)替換為使用(S)-4-(第三丁硫基)-4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)丁酸(化合物1f-IC)(300mg、1.04mmol)，獲得4-(第三丁硫基)-4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)丁酸(S)-氰基甲酯(化合物1g-IC)(293mg、86%)。
LCMS(ESI)m/z=327(M+H)+
保持時間：0.90分(分析條件SQDAA05)
6.1e-IF之合成
6-1.4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)-4-(苯硫基)丁酸(S)-第三丁酯(化合物1e-IF)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0182-205
於(S)-4-(第三丁氧基)-4-側氧基-3-(戊-4-烯醯胺)丁酸(化合物1b-I)與戊-4-烯酸(1：0.8)之混合粗產物A(2.53g、13.0mmol)之CH2Cl2(35ml)溶液中，加入DIC(2.43ml、15.6mmol)、DMAP(318mg、2.60mmol)及苯硫醇(1.59ml、15.6mmol)，於室溫攪拌4小時。過濾反應混合物，將獲得之濾液濃縮後，以乙酸乙酯稀釋後，以飽和氯化銨水溶液、飽和重碳酸鈉水、飽和食鹽水洗滌。之後，將有機萃取物以硫酸鎂乾燥並減壓濃縮。將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(10mM乙 酸銨水溶液/甲醇=70/30→0/100)精製，將獲得之粗產物以矽膠管柱層析(己烷/乙酸乙酯=100/0→65/35)精製，獲得4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)-4-(苯硫基)丁酸(S)-第三丁酯(化合物1e-IF)(1.99g、79%)。
LCMS(ESI)m/z=364(M+H)+
保持時間：1.01分(分析條件SQDAA05)
7.1g-IA之合成
7-1. 4-(甲硫基)-4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)丁酸(S)-第三丁酯(化合物1e-IA)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0183-206
於(S)-4-(第三丁氧基)-4-側氧基-3-(戊-4-烯醯胺)丁酸(化合物1b-I)與戊-4-烯酸(1：0.8)之混合粗產物A(1.96g、9.68mmol)之THF(44ml)溶液中，加入Et3N(1.54ml、11.0mmol)與氯碳酸乙酯(1.05ml、11.0mmol)，於室溫攪拌25分鐘。之後，於反應混合物中加甲烷硫醇基鈉(1.06g、15.1mmol)之DMF(18ml)溶液，於室溫攪拌1小時。之後，於反應混合物中加水，以二氯甲烷稀釋，有機層以水洗滌後，以硫酸鎂乾燥並減壓濃縮。將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(10mM乙酸銨水溶液/甲醇=70/30→40/60)精製，獲得4-(甲硫基)-4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)丁酸(S)-第三丁酯(化合物1e-IA)(1.38g、85%)。
LCMS(ESI)m/z=302(M+H)+
保持時間：0.90分(分析條件SQDAA05)
7-2.(S)-4-(甲硫基)-4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)丁酸(化合物1f-IA)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0184-207
於4-(甲硫基)-4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)丁酸(S)-第三丁酯(化合物1e-IA、69.3mg、0.23mmol)之二氯甲烷(1.2ml)溶液中，加入三氟乙酸(0.684ml、9.20mmol)，於室溫攪拌6小時半。之後，將反應混合物減壓濃縮，將殘渣以逆相矽膠管柱層析(10mM乙酸銨水溶液/甲醇=100/0→60/40)精製，獲得(S)-4-(甲硫基)-4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)丁酸(化合物1f-IA)(46.9mg、83%)。
LCMS(ESI)m/z=246(M+H)+
保持時間：0.51分(分析條件SQDAA05)
7-3.4-(甲硫基)-4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)丁酸(S)-氰基甲酯(化合物1g-IA)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0184-208
於(S)-4-(甲硫基)-4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)丁酸 (化合物1f-IA)(1.17g、3.78mmol)之DMF(5ml)溶液中，加入2-溴乙腈(2.64ml、37.8mmol)與N-乙基-N-異丙基丙烷-2-胺(3.29ml、18.9mmol)，於室溫攪拌30分鐘。於反應混合物加入飽和氯化銨水溶液(3ml)後，以乙酸乙酯稀釋，將有機層以水洗滌。之後將有機萃取物以硫酸鎂乾燥。減壓濃縮後，將獲得之殘渣以矽膠管柱層析(己烷/乙酸乙酯=100/0→30/70)精製，獲得4-(甲硫基)-4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)丁酸(S)-氰基甲酯(化合物1g-IA)(368mg、34%)。
LCMS(ESI)m/z=285(M+H)+
保持時間：0.69分(分析條件SQDAA05)
8.1g-IID之合成
8-1.(S)-5-(第三丁氧基)-5-側氧基-4-(戊-4-烯醯胺)戊酸(化合物1b-II)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0185-209
與化合物1b-I之製造例以同樣條件，將(S)-3-胺基-4-(第三丁氧基)-4-側氧基丁酸(化合物1a-I)替換為使用(S)-4-胺基-5-(第三丁氧基)-5-側氧基戊酸(化合物1a-II、5.00g、24.2mmol)，獲得(S)-5-(第三丁氧基)-5-側氧基-4-(戊-4-烯醯胺)戊酸(化合物1b-II)與戊-4-烯酸(1：0.8)之混合粗產物B(9.28g、100%)。
8-2.(S)-5-(苄硫基)-5-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)戊酸 (化合物1f-IID)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0186-210
與化合物1f-ID之製造例以同樣條件，將混合粗產物A替換為使用混合粗產物B(2.30g、10.80mmol)，獲得(S)-5-(苄硫基)-5-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)戊酸(化合物1f-IID)(1.45g、72%)。
LCMS(ESI)m/z=336(M+H)+
保持時間：0.82分(分析條件SQDAA05)
8-3. 5-(苄硫基)-5-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)戊酸(S)-氰基甲酯(化合物1g-IID)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0186-211
與化合物1g-ID之製造例以同樣條件，將(S)-4-(苄硫基)-4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)丁酸(化合物1f-ID)替換為使用(S)-5-(苄硫基)-5-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)戊酸(化合物 1f-IID)(964mg、2.87mmol)，獲得5-(苄硫基)-5-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)戊酸(S)-氰基甲酯(化合物1g-IID)(951mg、89%)。
LCMS(ESI)m/z=375(M+H)+
保持時間：0.93分(分析條件SQDAA05)
9.1g-IIA之合成
9-1. 5-(甲硫基)-5-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)戊酸(S)-第三丁酯(化合物1e-IIA)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0187-212
與化合物1e-IA之製造例以同樣條件，將混合粗產物A替換為使用混合粗產物B(1.94g、9.11mmol)，獲得5-(甲硫基)-5-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)戊酸(S)-第三丁酯(化合物1e-IIA)(1.22g、76%)。
LCMS(ESI)m/z=316(M+H)+
保持時間：0.92分(分析條件SQDAA05)
9-2. (S)-5-(甲硫基)-5-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)戊酸(化合物1f-IIA)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0187-213
與化合物1f-IA之製造例以同樣條件，將4-(甲硫基)-4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)丁酸(S)-第三丁酯(化合物1e-IA)替換為使用5-(甲硫基)-5-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)戊酸(S)-第三丁酯(化合物1e-IIA)(1.02g、3.24mmol)，獲得(S)-5-(甲硫基)-5-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)戊酸(化合物1f-IIA)(790mg、94%)。
LCMS(ESI)m/z=260(M+H)+
保持時間：0.54分(分析條件SQDAA05)
9-3. 5-(甲硫基)-5-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)戊酸(S)-氰基甲酯(化合物1g-IIA)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0188-214
於(S)-5-(甲硫基)-5-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)戊酸(化合物1f-IIA)(673mg、2.60mmol)之DMSO(5、5ml)溶液中，加入2-溴乙腈(3.60ml、52.0mmol)與N-乙基-N-異丙基丙烷-2-胺(0.297ml、2.86mmol)，於室溫攪拌30分鐘。於反應混合物加入飽和氯化銨水溶液(3ml)後，以乙酸乙酯稀釋，將有機層以水洗滌。之後將有機萃取物以硫酸鎂乾燥。減壓濃縮後，將獲得之殘渣以矽膠管柱層析(己烷/乙酸乙酯=100/0→30/70)精製，獲得5-(甲硫基)-5-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)戊酸(S)-氰基甲酯(化合物1g-IIA)(772mg、100%)。
LCMS(ESI)m/z=299(M+H)+
保持時間：0.75分(分析條件SQDAA05)
10. 1g-IIF之合成
10-1. 5-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)-5-(苯硫基)戊酸(S)-第三丁酯(化合物1e-IIF)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0189-215
與化合物1e-IF之製造例以同樣條件，將混合粗產物A替換為使用混合產物B(2.11g、9.90mmol)，獲得5-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)-5-(苯硫基)戊酸(S)-第三丁酯(化合物1e-IIF)(1.52g、73%)。
LCMS(ESI)m/z=378(M+H)+
保持時間：1.03分(分析條件SQDAA05)
10-2. 5-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)-5-(苯硫基)戊酸(S)-氰基甲酯(化合物1g-IIF)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0190-216
於5-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)-5-(苯硫基)戊酸(S)-第三丁酯(化合物1e-IIF)(978mg、2.59mmol)之二氯甲烷(6.74ml)溶液中，加入三氟乙酸(3.85ml、51.8mmol)，於室溫攪拌3小時。之後，將反應混合物減壓濃縮。於獲得之殘渣之2-溴乙腈(8ml)溶液中加入N-乙基-N-異丙基丙烷-2-胺(1.30ml、7，47mmol)，於室溫攪拌30分鐘。於反應混合物中加水後，以逆相矽膠管柱層析(10mM乙酸銨水溶液/甲醇=60/40→20/80)精製，獲得5-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)-5-(苯硫基)戊酸(S)-氰基甲酯(化合物1g-IIF)(722mg、64%)。
LCMS(ESI)m/z=361(M+H)+
保持時間：0.89分(分析條件SQDAA05)
[實施例2]側鏈羧酸經活性酯化之胺基醯基化pdCpA之合成
使用於實施例1合成之側鏈羧酸經活性酯化之化合物(化合物1g)，合成胺基醯基化pdCpA(化合物1i)。
1. 4-(苄硫基)-4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)丁酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥 基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物1i-ID)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0191-217
依文獻、Nucleosides,Nucleotides & Nucleic Acids,20(3),197-211；2001、Xue-Feng Zhu and A.lan Scott、合成pdCpA(磷酸二氫((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-3-(((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(羥基)磷氧基)氧基)四氫呋喃-2-基)甲酯化合物1h)。
於緩衝液A(113ml)中，加入磷酸二氫((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-3-(((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(羥基)磷氧基)氧基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物1h)(200mg、0.314mmol)之水溶液(6.25ml)與4-(苄硫基)-4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)丁酸(S)-氰基甲酯(化合物1g-ID)(454mg、1.26mmol)之四氫呋喃(3.15ml)溶液，於室溫攪拌1小時。之後，加入三 氟乙酸(2.52ml、33.9mmol)後使冷凍乾燥。將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.05%三氟乙酸水溶液/0.05%三氟乙酸乙腈溶液=100/0→60/40)精製，獲得4-(苄硫基)-4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)丁酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物1i-ID)(70.9mg、24%)。
LCMS(ESI)m/z=940(M+H)+
保持時間：0.53分(分析條件SQDFA05)
又，緩衝液A以下列方式製備。
於N,N,N-三甲基十六烷-1-氯化銨(6，40g、20mmol)與咪唑(6.81g、100mmol)之水溶液中加入乙酸，獲得pH8、20mM N,N,N-三甲基十六烷-1-銨鹽、100mM咪唑之緩衝液A(1L)。
2.4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)-4-(苯乙硫基)丁酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物1i-IE)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0193-218
於化合物1i-ID之製造例以同樣條件，使用磷酸二氫((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-3-(((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(羥基)磷氧基)氧基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物1h)(50mg、0.079mol)，並將4-(苄硫基)-4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)丁酸(S)-氰基甲酯(化合物1g-ID)替換為使用4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)-4-(苯乙硫基)丁酸(S)-氰基甲酯(化合物1g-IE)(118mg、0.314mmol)，獲得4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)-4-(苯乙硫基)丁酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物1i-IE)(22.8mg、30%)。
LCMS(ESI)m/z=954(M+H)+
保持時間：0.80分(分析條件SMD法1)
3. 4-(乙硫基)-4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)丁酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物1i-IG)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0194-219
與化合物1i-ID之製造例以同樣條件，使用磷酸二氫((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-3-(((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(羥基)磷氧基)氧基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物1h)(50mg、0.079mmol)，並將4-(苄硫基)-4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)丁酸(S)-氰基甲酯(化合物1g-ID)替換為使用4-(乙硫基)-4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)丁酸(S)-氰基甲酯(化合物1g-IG)(94mg、0.314mmol)，獲得4-(乙硫基)-4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)丁酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基) 四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物1i-IG)(23.9mg、35%)。
LCMS(ESI)m/z=878(M+H)+
保持時間：0.66分(分析條件SMD法1)
4. 4-(異丙硫基)-4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)丁酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物1i-IB)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0195-220
與化合物1i-ID之製造例以同樣條件，使用磷酸二氫((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-3-(((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(羥基)磷氧基)氧基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物1h)(50mg、0.079mmol)，並將4-(苄硫基)-4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)丁酸(S)-氰基甲酯(化合物1g-ID)替換為 使用4-(異丙硫基)-4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)丁酸(S)-氰基甲酯(化合物1g-IB)(98mg、0.314mmol)，獲得4-(異丙硫基)-4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)丁酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物1i-IB)(27.3mg、39%)。
LCMS(ESI)m/z=892(M+H)+
保持時間：0.70分(分析條件SMD法1)
5. 4-(第三丁硫基)-4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)丁酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物1i-IC)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0196-2190
與化合物1i-ID之製造例以同樣條件，使用磷酸二 氫((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-3-(((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(羥基)磷氧基)氧基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物1h)(50mg、0.079mmol)，並將4-(苄硫基)-4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)丁酸(S)-氰基甲酯(化合物1g-ID)替換為使用4-(第三丁硫基)-4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)丁酸(S)-氰基甲酯(化合物1g-IC)(103mg、0.314mmol)，獲得4-(第三丁硫基)-4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)丁酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物1i-IC)(26.2mg、37%)。
LCMS(ESI)m/z=906(M+H)+
保持時間：0.74分(分析條件SMD法1)
6. 4-(甲硫基)-4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)丁酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物1i-IA)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0198-222
與化合物1i-ID之製造例以同樣條件，使用磷酸二氫((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-3-(((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(羥基)磷氧基)氧基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物1h)(150mg、0.236mmol)，並將4-(苄硫基)-4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)丁酸(S)-氰基甲酯(化合物1g-ID)替換為使用4-(甲硫基)-4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)丁酸(S)-氰基甲酯(化合物1g-IA)(268mg、0.943mmol)，獲得4-(甲硫基)-4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)丁酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物1i-IA)(83.6mg、41%)。
LCMS(ESI)m/z=864(M+H)+
保持時間：0.40分(分析條件SQDFA05)
7. 5-(苄硫基)-5-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)戊酸 (2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物1i-IID)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0199-223
與化合物1i-ID之製造例以同樣條件，使用磷酸二氫((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-3-(((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(羥基)磷氧基)氧基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物1h)(200mg、0.314mol)，並將4-(苄硫基)-4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)丁酸(S)-氰基甲酯(化合物1g-ID)替換為使用5-(苄硫基)-5-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)戊酸(S)-氰基甲酯(化合物1g-IID)(472mg、1.26mmol)，獲得5-(苄硫基)-5-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)戊酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H- 嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物1i-IID)(31.3mg、10%)。
LCMS(ESI)m/z=954(M+H)+
保持時間：0.55分(分析條件SQDFA05)
8. 5-(甲硫基)-5-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)戊酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物1i-IIA)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0200-224
與化合物1i-ID之製造例以同樣條件，使用磷酸二氫((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-3-(((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(羥基)磷氧基)氧基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物1h)(200mg、0.314mmol)，並將4-(苄硫基)-4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)丁酸(S)-氰基甲酯(化合物1g-ID)替換為 使用5-(甲硫基)-5-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)戊酸(S)-氰基甲酯(化合物1g-IIA)(376mg、1.26mmol)，獲得5-(甲硫基)-5-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)戊酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物1i-IIA)(68.0mg、25%)。
LCMS(ESI)m/z=878(M+H)+
保持時間：0.43分(分析條件SQDFA05)
9. 5-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)-5-(苯硫基)戊酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物1i-IIF)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0201-225
與化合物1i-ID之製造例以同樣條件，使用磷酸二 氫((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-3-(((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(羥基)磷氧基)氧基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物1h)(150mg、0.236mmol)，並將4-(苄硫基)-4-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)丁酸(S)-氰基甲酯(化合物1g-ID)替換為使用5-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)-5-(苯硫基)戊酸(S)-氰基甲酯(化合物1g-IIF)(534mg、0.944mmol)，以LCMS分析觀測到推測為係將5-側氧基-2-(戊-4-烯醯胺)-5-(苯硫基)戊酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物1i-IIF)與化合物1i-IIF之硫酯部位與pdCpA部位之醇部位或胺基部位予以分子內縮合而得2種化合物(化合物1i-IIF-B1)、(化合物1i-IIF-B2)。其比例，就LCMS之UV面積%比，為化合物1i-IIF：(化合物1i-IIF-B1)+(化合物1i-IIF-B2)=20：9。
(化合物1i-IIF)
LCMS(ESI)m/z=940(M+H)+
保持時間：0.70分(分析條件SQDFA05)
Figure 107130626-A0101-12-0202-226
(1i-IIF-B1)
LCMS(ESI)m/z=828(M-H)-
保持時間：0.65分(分析條件SQDFA05)
(1i-IIF-B2)
LCMS(ESI)m/z=828(M-H)-
保持時間：0.66分(分析條件SQDFA05)由以上所示，合成了具有Rex1=Me、Et，iPr，Ph，Bz、Phenetyl基之側鏈羧酸經活性酯化之胺基醯基化pdCpA(化合物1i)。
[實施例3]側鏈羧酸經活性酯化之胺基醯基tRNA之合成
依以下方法，合成側鏈羧酸經硫酯化之胺基醯基化tRNA。
1. 利用轉錄所為之tRNA(CA欠缺)之合成
從模板DNA(序列編號D-1)，利用使用RiboMAX Large Scale RNA production System T7(Promega公司，P1300)之體外轉錄，合成3'端之CA欠缺的tRNAEnAsnGAG(-CA)(序列編號R-1)，並利用RNeasy Mini kit(Qiagen公司)精製。
序列編號D-1(序列編號：1)tRNAEnAsnGAG(-CA)DNA序列：
Figure 107130626-A0101-12-0203-227
序列編號R-1(序列編號：30)tRNAEnAsnGAG(-CA)RNA序列：
Figure 107130626-A0101-12-0203-228
2. 利用側鏈羧酸經活性酯化之胺基醯基化pdCpA(化合物1i)與tRNA(CA欠缺)(序列編號：R-1)之接合所為之胺基醯基化tRNA(化合物AT-1)之合成
於50μM轉錄tRNAEnAsnGAG(-CA)(序列編號R-1)10μL，加入10X接合緩衝液(500mM HEPES-KOH pH 7.5,200mM MgCl2,10mM ATP)2μL、Nuclease free water 4μL，於95℃加熱2分鐘後，於室溫放置5分鐘，進行tRNA之重新折疊。加入20unit/μL之T4 RNA接合酶(New England Bio Lab.公司)2μL及、5mM之側鏈羧酸經活性酯化之胺基醯基化pdCpA(化合物1i)之DMSO溶液2μL，於15℃進行45分鐘接合反應。於接合反應液20μL中，加入3M乙酸鈉4μL與125mM碘(水：THF=1：1溶液)24μL，於室溫進行1小時脫保護。將胺基醯基化tRNA(化合物AT-1)以苯酚萃取後，利用乙醇沉澱回收。將胺基醯基化tRNA(化合物AT-1)於即將添加到轉譯混合物時溶於1mM乙酸鈉。
化合物AT-1-IA
Figure 107130626-A0101-12-0204-229
化合物AT-1-IB
Figure 107130626-A0101-12-0204-230
化合物AT-1-IG
Figure 107130626-A0101-12-0205-231
化合物AT-1-IC
Figure 107130626-A0101-12-0205-232
化合物AT-1-ID
Figure 107130626-A0101-12-0205-233
化合物AT-1-IE(序列編號：31)
Figure 107130626-A0101-12-0205-234
化合物AT-1-IIA Glu(SMe)-tRNAEnAsnGAG
化合物AT-1-IID Glu(SBn)-tRNAEnAsnGAG
[實施例4]使用側鏈羧酸經活性酯化之胺基酸進 行轉譯合成
藉由將以各種胺基酸予以胺基醯基化而得之tRNA加到無細胞轉譯系並開始轉譯，進行含有所望非天然胺基酸之多胜肽之轉譯合成。轉譯系，係使用含有來自模板DNA之轉錄系之原核生物來源之再構成無細胞蛋白質合成系PURE system。具體而言，於轉錄轉譯液(5%(v/v)T7 RNA polymerase RiboMAX Enzyme Mix(Promega公司，P1300)，2mM GTP，2mM ATP，1mM CTP，1mM UTP，20mM肌酸磷酸，50mM HEPES-KOH pH7.6，100mM麩胺酸鉀，12mM乙酸鎂，2mM亞精胺(spermidine)，1mM二硫蘇糖醇，1.5mg/ml E.coli MRE600(RNase陰性)來源tRNA(Roche公司)，4μg/ml肌酸激酶，3μg/ml肌激酶，2unit/ml無機焦磷解酶，1.1μg/ml核苷二磷酸激酶，0.6μM甲硫胺醯基tRNA轉甲醯基酶，0.26μM EF-G，0.25μM RF1，0.24μM RF2，0.17μM RF3，0.5μM RRF，2.7μM IF1，0.4μM IF2,1.5μM IF3,40μM EF-Tu，84μM EF-Ts，1.2μM核糖體，0.73μM AlaRS，0.03μM ArgRS，0.38μM AsnRS，0.13μM AspRS，0.02μM CysRS，0.06μM GlnRS，0.23μM GluRS，0.09μM GlyRS，0.02μM HisRS，0.4μM IleRS，0.04μM LeuRS，0.11μM LysRS，0.03μM MetRS，0.68μM PheRS，0.16μM ProRS，0.04μM SerRS，0.09μM ThrRS，0.03μM TrpRS，0.02μM TyrRS，0.02μM ValRS(實驗室製備之蛋白基本上係製備成附加His標籤之蛋白))中，加入0.02μM模板DNA、由各模板DNA編碼之蛋白質性胺基酸群300μM、及50μM之側鏈羧酸經活性酯化 之胺基醯基化tRNA(化合物AT-1)到轉譯反應混合物中，並於37℃靜置30分鐘至1小時以進行。
轉譯產物，係使用α-氰基-4-羥基桂皮酸作為基質，測定MALDI-MS光譜並鑑定。
1.含有經硫酯化之麩胺酸衍生物之胜肽(化合物P-1)之轉譯合成
將於20nM模板DNA Mtyg_R(序列編號D-2)含有0.3mM Gly，0.3mM Met，0.3mM Arg，0.3mM Thr，0.3mM Tyr及、50μM Glu(SBn)-tRNAEnAsnGAG(化合物AT-1-IID)之前述轉錄轉譯液於37℃保溫60分鐘。將獲得之轉譯反應物以SPE C-TIP(Nikkyo Technos公司)精製並以MALDI-MS分析。但是如圖2所示，以MALDI-MS未能確認在分子量799至2000之範圍來自轉譯胜肽之質譜之峰部。例如：在分子量882、918、1256附近檢測到的峰部，是在未加入作為陰性對照之模板DNA分析PURESystem時也會觀測到的峰部，故不是轉譯胜肽來源之峰部。
序列編號D-2(序列編號：2)Mtyg_R DNA序列
Figure 107130626-A0101-12-0207-235
胜肽序列P-1 MetThrThrThrArg[Glu(SBn)]TyrTyrArgArgGlyGly
MALDI-MS： 未檢測到(calc.1595.7)
2.含有經硫酯化之天冬胺酸衍生物之胜肽之轉譯合成
2-1.含有Asp(SMe)之示範胜肽之轉譯合成
將加入有20nM模板DNA Mtryg3(序列編號D-3)、除了Leu以外的各0.3mM之19種蛋白質性胺基酸、50μM Asp(SMe)-tRNAEnAsnGAG(化合物AT-1-IA)之轉錄轉譯液，於37℃保溫60分鐘。以SPE C-TIP(Nikkyo Technos公司)精製，並以MALDI-MS分析。其結果，觀測到顯示從含硫酯之全長胜肽脫去MeSH後之分子量之質譜(MS)作為主產物(圖3)。
序列編號D-3(序列編號：3)Mtryg3 DNA序列
Figure 107130626-A0101-12-0208-236
胜肽序列P-2 MetThrThrThrArg[Asp(SMe)]TyrTyrArgGlyGly
MALDI-MS：m/z：[H+M]+=1302.5(含硫酯之全長胜肽Calc.1349.6,脫MeSH胜肽Calc.1301.6)(將觀測到的分子量1302的化合物命名為胜肽P-3)
2-2.不含反應性最高之Tyr、含硫酯之胜肽(化合物P-5)之轉譯
於20nM模板DNA Ft02A_dR(序列編號D-4)中，在前 述轉錄轉譯液加入除了Leu以外的各0.3mM的19種蛋白質性胺基酸，及前述方法製備之50μM化合物AT-1-ID(Asp(SBn)-tRNAEnAsnGAG)，於37℃進行60分鐘轉譯。將轉譯反應物以SPE C-TIP(Nikkyo Technos公司)精製，並以MALDI-MS分析，生成含硫酯胺基酸之全長胜肽P-5後，同樣確認經脫BnSH化之MS光譜作為主產物(胜肽P-6)。由此可確認，在苯酚性羥基非脫BnSH化之反應點(圖5)。
Ft02A_dR DNA序列(序列編號D-4)(序列編號：4)
Figure 107130626-A0101-12-0209-237
胜肽序列P-5 MetThrThrThrAlaGlyGly[Asp(SBn)]PhePheGlyGlyLys
MALDI-MS：m/z：[H+M]+=1271.8(胜肽P-5經脫BnSH化之胜肽P-6 Calc.1270.6)
2-3.為了推定轉譯胜肽P-6之結構之水解實驗
將前述轉譯反應物P-6於333mM Bicine KOH pH9.0中於95℃進行15分鐘水解，以SPE C-TIP(Nikkyo Technos公司)精製，並以MALDI-MS分析。其結果，確認脫BnSH胜肽P-6水解，分子量增加18(胜肽化合物P-4)。推定之硫酯部位之縮合反應，啟示不是與胺基之醯胺形成反應，而是與較水解之OH基或SH基的酯化反應或硫酯化反應等(圖4)。
胜肽化合物P-4
MALDI-MS： m/z：[H+M]+=1289.6(P-6之水解體Calc.1288.7)
2-4.以不具N末端胺基之MeOFlac(化合物7a)使轉譯開始之含硫酯之胜肽之轉譯合成
實施N末端不具胺基之胜肽之轉譯合成，並以下列方式解析。
2-4-1. MeOFlac-pdCpA之合成
2-4-1-1.(S)-2-甲氧基-3-苯基丙酸之合成(化合物7a、MeOFlac)
Figure 107130626-A0101-12-0210-238
將(S)-2-羥基-3-苯基丙酸(1.0g、6.02mmol)溶於THF(100ml)，加入氫化鈉(0.48g、12.00mmol)及碘甲烷(1.71g、12.04mmol)，於65度攪拌1小時。放冷後，將反應液減壓濃縮，加入6M鹽酸水溶液使成pH4。將該水層以乙酸乙酯萃取，將該有機層濃縮並將獲得之殘渣以管柱層析(二氯甲烷：甲醇=10：1)精製，獲得標題化合物(0.71g、59%)。
2-4-1-2.2-甲氧基-3-苯基丙酸(S)-氰基甲酯(化合物7b)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0210-239
使(S)-2-甲氧基-3-苯基丙酸(化合物7a、0.50g、2.50mmol)及2-溴乙腈(1.20g、10.00mmol)溶於乙腈(60ml)，於 冰冷下，滴加三乙胺(0.50g、4.99mmol)。於室溫攪拌40分鐘後，將反應液減壓濃縮，並將殘渣以管柱層析(石油醚：乙酸乙酯=20：1)精製，獲得標題化合物(0.39g、65%)。
2-甲氧基-3-苯基丙酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物7c)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0211-240
於溶有咪唑(3.40g、50.00mmol)及N,N,N-三甲基十六烷-1-氯化銨(3.20g、10.00mmol)之水溶液(30ml)中，加入磷酸二氫((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-3-(((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(羥基)磷氧基)氧基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物1h、0.32g、0.50mmol)及2-甲氧基-3-苯基丙酸 (S)-氰基甲酯(化合物7b、0.44g、2.01mmol)，於室溫攪拌30分鐘。於反應液中加入TFA(1.0ml)並濃縮，將獲得之殘渣以製備性-HPLC(0.05%TAF水溶液：乙腈=84：16~60：40)精製，獲得標題化合物(66mg、16%)。
LCMS：m/z 799(M+H)+
保持時間：0.609分(分析條件SMD法1)
2-4-2.利用轉錄所為之tRNA(CA欠缺)之合成
從模板DNA(序列編號D-5)利用使用RiboMAX Large Scale RNA production System T7(Promega公司，P1300)之體外轉錄，合成3'端之CA欠缺的tRNAfMetCAU(-CA)(序列編號R-5)，並利用RNeasy Mini kit(Qiagen公司)精製。
序列編號D-5(序列編號：5)：
Figure 107130626-A0101-12-0212-241
序列編號R-5(序列編號：32)：
Figure 107130626-A0101-12-0212-242
2-4-3. 利用不含N末端胺基之醯基化pdCpA(化合物7c)與tRNA(CA欠缺)(序列編號：R-5)之連接(ligation)所為之醯基化tRNA(化合物AT-2)之合成
於50μM轉錄tRNAfMetCAU(-CA)(序列編號R-5)10μL中，加入10X接合緩衝液(500mM HEPES-KOH pH 7.5,200mM MgCl2,10mM ATP)2μL、無核酸酶之水4μL，於95℃加 熱2分鐘後，於室溫放置5分鐘，進行tRNA之重新折疊。加入10unit/μL之T4 RNA接合酶(New England Bio Lab.公司)2μL及5mM之不含N末端胺基之醯基化pdCpA(化合物7c)之DMSO溶液2μL，於15℃進行45分鐘接合反應。醯基化tRNA(化合物AT-2)進行苯酚萃取後，以乙醇沉澱回收。醯基化tRNA(化合物AT-2)，係於即將添加到轉譯混合物時溶於1mM乙酸鈉。
化合物AT-2 MeOFlac-tRNAfMetCAU(序列編號：33)
Figure 107130626-A0101-12-0213-243
於20nM模板DNA Mtyg_R(序列編號D-2)中，加入前述轉錄轉譯液、胺基酸0.3mM Gly，0.3mM Arg，0.3mM Thr，0.3mM Tyr，及以前述方法製備的50μM Asp(SBn)-tRNAEnAsnGAG(化合物AT-1-ID)，50μM MeOFlac-tRNAfMetCAU(化合物AT-2)，於37℃進行60分鐘轉譯。將轉譯反應物以SPE C-TIP(Nikkyo Technos公司)精製，並以MALDI-MS分析，結果觀測到相當於從含硫酯之全長胜肽P-7脫BnSH化而得之胜肽的MS作為主產物(轉譯胜肽P-8)。即便使用MeOFlac作為轉譯起點，而轉譯了N末端不具胺之胜肽，由於見到分子量減少，所以也否定係與N末端胺之反應(圖6)。
胜肽序列P-7[MeOFlac]ThrThrThrArg[Asp(SBn)]TyrTyrArgArgGlyGly
MALDI-MS：m/z：[H+M]+=1489.6(從胜肽序列P-7脫BnSH化而得之胜肽P-8 Calc.1488.6)
2-5.在與側鏈經硫酯化之胺基酸相接的C末端側胺基酸導入有經N-烷基化之胺基酸的示範胜肽之轉譯合成
於20nM模板DNA KA03(序列編號D-6)中，加入前述轉錄轉譯液、0.1mM 10-HCO-H4folate(10-formyl-5,6,7,8,-tetrahydrophilic acid、參照日本特開2003-102495)、除了Leu以外的各0.3mM的19種蛋白質性胺基酸，及以前述方法製備之50μM Asp(SMe)-tRNAEnAsnGAG(化合物AT-1-IA)，於37℃進行60分鐘轉譯。將轉譯反應物以SPE C-TIP(Nikkyo Technos公司)精製，以MALDI-MS分析，結果觀測到以含硫酯之全長胜肽之MS作為主產物，未認有經脫MeSH化之峰部。
由以上結果，可明白：天冬胺酸型之硫酯殘基當其正後方的醯胺鍵有氫原子存在的情形，會與其反應並形成天冬醯亞胺(aspartimide)(轉譯胜肽P-3、P-6、P-8均與成為硫酯之C末端側的醯胺鍵的氫原子反應而形成了天冬醯亞胺)。另一方面，由於正後方的胺基酸殘基成為N-烷基之胺基酸，成功地進行之含所望硫酯之全長胜肽之轉譯(圖7)。
序列編號D-6(序列編號：6)KA03 DNA序列
Figure 107130626-A0101-12-0214-244
胜肽序列P-9 MetThrArgThrLysAlaTyrTrpSer[Asp(SMe)]ProGlyGly
MALDI-MS：m/z：[H+M]+=1527.7(轉譯胜肽P-9 Calc.1526.7,)
轉譯胜肽P-3之化學結構(序列編號：34)
Figure 107130626-A0101-12-0215-245
MALDI-MS：m/z：[H+M]+=1302.5(含硫酯之全長胜肽Calc.1348.6，脫MeSH胜肽Calc.1301.6)(將觀測到的分子量1302之化合物定為胜肽P-3)
轉譯胜肽P-6之化學結構(序列編號：35)
Figure 107130626-A0101-12-0215-246
生成含硫酯胺基酸之全長胜肽P-5後，脫BnSH化而得之胜肽MALDI-MS：m/z：[H+M]+=1271.8(胜肽P-5脫BnSH化而得之胜肽Calc.1270.6)
轉譯胜肽P-8之化學結構
Figure 107130626-A0101-12-0215-247
MALDI-MS：m/z：[H+M]+=1489.6(從胜肽序列P-7脫BnSH化而得之胜肽Calc.1488.6)
又，作為模板DNA，將KA01硫酯胺基酸之C末端側定為NMe-苯丙胺酸，也同樣地能以MS光譜確認含硫酯胺基酸之全長胜肽(Met-Thr-Arg-Thr-Lys-Ala-Tyr-Trp-Ser-Asp(SBn)-MePhe-Gly-Gly)。
MALDI-MS：m/z：[H+M]+=1639.7(Calc.1638.7)
[實施例5]用以選擇與硫酯反應之胺基側單元之實驗
為能進行硫酯之轉譯合成，依以下程序實施用以指定其與醯胺鍵縮合之胺基側之單元的良好要件的實驗。
1.具有硫酯部位之示範化合物之合成
依圖8記載之方法，合成化合物5b-1及5b-2作為具有天冬胺酸或麩胺酸之硫酯作為示範胜肽。
1-1. 4-(苄硫基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-4-側氧基丁酸(S)-苄酯(化合物5b-1)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0216-2191
於(S)-4-(苄氧基)-3-((第三丁氧羰基)胺基)-4-側氧基丁酸(化合物5a-1)(1.00g、3.09mmol)之二氯甲烷(15ml)溶液中，加入N,N'-二異丙基碳二醯亞胺(1.06ml、6.80mmol)、 N,N-二甲胺基吡啶(94.4mg、0.773mmol)、苄基硫醇(0.380ml、3.24mmol)，於室溫終夜攪拌。之後，於反應液中加水，以乙酸乙酯稀釋後，將有機層以飽和氯化銨水溶液、飽和重碳酸鈉水、飽和食鹽水洗滌。之後將有機萃取物以硫酸鎂乾燥。減壓濃縮後，將獲得之殘渣以矽膠管柱層析(己烷/乙酸乙酯=100/0→65/35)精製，獲得4-(苄硫基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-4-側氧基丁酸(S)-苄酯(化合物5b-1)(478mg、36%)。又，化合物5a-1係一般可取得。
LCMS(ESI)m/z=430(M+H)+
保持時間：1.10分(分析條件SQDAA05)
1-2. 5-(苄硫基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-側氧基戊酸(S)-苄酯(化合物5b-2)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0217-249
於(S)-5-(苄氧基)-4-((第三丁氧羰基)胺基)-5-側氧基戊酸(化合物5a-2)(1.00g、2.96mmol)之二氯甲烷(14.8ml)溶液中，加入N,N'-二異丙基碳二醯亞胺(1.02ml、6.51mmol)與N,N-二甲胺基吡啶(90.4mg、0.740mmol)、苄基硫醇(0.365ml、3.11mmol)，於室溫終夜攪拌。之後，於反應液中加水，以乙酸乙酯稀釋後，將有機層以飽和氯化銨水溶液、飽和重碳酸鈉 水、飽和食鹽水洗滌。之後將有機萃取物以硫酸鎂乾燥。減壓濃縮後，將獲得之殘渣以矽膠管柱層析(己烷/乙酸乙酯=100/0→65/35)精製，獲得5-(苄硫基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-側氧基戊酸(S)-苄酯(化合物5b-2)(1.18g、90%)。
LCMS(ESI)m/z=444(M+H)+
保持時間：1.11分(分析條件SQDAA05)
1-3.2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-((4-氟苯基)硫)-5-側氧基戊酸(S)-苄酯(化合物5e-2)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0218-250
於(S)-5-(苄氧基)-4-((第三丁氧羰基)胺基)-5-側氧基戊酸(化合物5a-2)(500mg、1.48mmol)之二氯甲烷(5ml)溶液中，加入N,N'-二異丙基碳二醯亞胺(0.510ml、3.26mmol)與N,N-二甲胺基吡啶(45.2mg、0.370mmol)、4-氟苯硫醇(0.164ml、1.55mmol)，於室溫終夜攪拌。之後，將反應混合物以逆相矽膠管柱層析(10mM乙酸銨水溶液/甲醇=70/30→20/80)精製，獲得2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-((4-氟苯基)硫)-5-側氧基戊酸(S)-苄酯(化合物5e-2)(540mg、82%)。
LCMS(ESI)m/z=448(M+H)+
保持時間：1.09分(分析條件SQDAA05)
1-4.2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-側氧基-5-((4-(三氟甲基)苯基)硫)戊酸(S)-苄酯(化合物5f-2)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0219-251
於(S)-5-(苄氧基)-4-((第三丁氧羰基)胺基)-5-側氧基戊酸(化合物5a-2)(500mg、1.48mmol)之二氯甲烷(5ml)溶液中，加入N,N'-二異丙基碳二醯亞胺(0.510ml、3.26mmol)與N,N-二甲胺基吡啶(45.2mg、0.370mmol)、4-(三氟甲基)苯硫醇(0.211ml、1.55mmol)，於室溫終夜攪拌。之後，將反應混合物以逆相矽膠管柱層析(10mM乙酸銨水溶液/甲醇=70/30→20/80)精製，獲得2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-側氧基-5-((4-(三氟甲基)苯基)硫)戊酸(S)-苄酯(化合物5f-2)(373mg、51%)。
LCMS(ESI)m/z=498(M+H)+
保持時間：1.12分(分析條件SQDAA05)
2.利用含硫酯之示範化合物與胺基側單元之反應探討所為之具有良好反應性之胺基側單元之選擇
如圖8所示，選擇藉由使硫酯示範化合物5b或5e、5f、與半胱胺酸或甘胺酸衍生物示範化合物反應，能輕易與硫酯生成醯胺鍵之基質。
2-1. 2-((第三丁氧羰基)胺基)-4-(((R)-1-乙氧基-3-巰基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-4-側氧基丁酸(S)-苄酯(化合物5c-1)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0220-252
於4-(苄硫基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-4-側氧基丁酸(S)-苄酯(化合物5b-1)(201.5mg、0.469mmol)與2-胺基-3-巰基丙酸(R)-乙基鹽酸鹽(104.5mg、0.563mmol)之DMF(1.2ml)與水(0.3ml)溶液中，加入DIPEA(0.098ml、0.563mmol)，於50度攪拌3小時。之後，於反應液中加水後，以逆相矽膠管柱層析(10mM乙酸銨水溶液/甲醇=80/20→0/100)精製，獲得2-((第三丁氧羰基)胺基)-4-(((R)-1-乙氧基-3-巰基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-4-側氧基丁酸(S)-苄酯(化合物5c-1)(133mg、67%)。
LCMS(ESI)m/z=455(M+H)+
保持時間：0.98分(分析條件SQDAA05)
2-2. 2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-(((R)-1-乙氧基-3-巰基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-5-側氧基戊酸(S)-苄酯(化合 物5c-2)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0221-253
於5-(苄硫基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-側氧基戊酸(S)-苄酯(化合物5b-2)(208.2mg、0.469mmol)與2-胺基-3-巰基丙酸(R)-乙基鹽酸鹽(104.5mg、0.563mmol)之DMF(1.2ml)與水(0.3ml)溶液中，加入DIPEA(0.098ml、0.563mmol)，於50度攪拌3小時。之後，作為後處理，在反應液中加入0.4M參(2-羧基乙基)膦(TCEP)水溶液(3.27ml)、DMF(3.27ml)後於室溫攪拌1小時。之後，將反應混合物以逆相矽膠管柱層析(10mM乙酸銨水溶液/甲醇=70/30→20/80)精製，獲得2-((第三丁氧羰基)胺基)-4-(((R)-1-乙氧基-3-巰基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-4-側氧基丁酸(S)-苄酯(化合物5c-2)(192.4mg、88%)。
LCMS(ESI)m/z=469(M+H)+
保持時間：0.99分(分析條件SQDAA05)
又，0.4M參(2-羧基乙基)膦(TCEP)水溶液之製備依以下進行。
於參(2-羧基乙基)膦(TCEP)鹽酸鹽(1.0g、3.49mmol)之水(6.8ml)溶液加入三乙胺(1.64ml)，使成pH7，獲得0.4M參(2- 羧基乙基)膦(TCEP)水溶液。
2-3. 4-((2-(苄氧基)-2-側氧基乙基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-4-側氧基丁酸(S)-苄酯(化合物5d-1)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0222-254
於4-(苄硫基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-4-側氧基丁酸(S)-苄酯(化合物5b-1)(30.0mg、0.0698mmol)與2-胺基乙酸苄基鹽酸鹽(16.8mg、0.0834mmol)之DMF(0.18ml)與水(0.045ml)溶液中，加入DIPEA(0.0145ml、0.0834mmol)，於50度攪拌。反應之經時變化使用LCMS觀測。3日攪拌後，觀測到目的化合物5d-1，但也觀測到化合物5d-1之苄酯有1個水解而得之化合物5d-1b，且有多量原料化合物5b-1殘留。其比例為：化合物5b-1：化合物5d-1：化合物5d-1之苄酯有1個水解而得之化合物5d-1b=22：1：8(依LCMS之UV面積比)。
化合物5d-1
LCMS(ESI)m/z=472(M+H)+
保持時間：0.99分(分析條件SQDAA05)
化合物5d-1b
LCMS(ESI)m/z=380(M+H)+
保持時間：0.90分(分析條件SQDAA05)
2-4.5-((2-(苄氧基)-2-側氧基乙基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-側氧基戊酸(S)-苄酯(化合物5d-2)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0223-255
於5-(苄硫基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-側氧基戊酸(S)-苄酯(化合物5b-2)(31.8mg、0.0717mmol)與2-胺基乙酸苄基鹽酸鹽(17.3mg、0.0860mmol)之DMF(0.19ml)與水(0.048ml)溶液中，加入DIPEA(0.0150ml、0.0860mmol)，於50度攪拌。反應之經時變化使用LCMS觀測。3日攪拌後，觀測到目的化合物5d-2，但有多量原料化合物5b-2殘留。其比例為化合物5b-2：化合物5d-2=22：10(依LCMS之UV面積比)。
化合物5d-2
LCMS(ESI)m/z=485(M+H)+
保持時間：1.01分(分析條件SQDAA05)
2-5.5-((2-(苄氧基)-2-側氧基乙基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-側氧基戊酸(S)-苄酯(化合物5d-2)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0224-256
於2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-((4-氟苯基)硫)-5-側氧基戊酸(S)-苄酯(化合物5e-2)(30.0mg、0.0670mmol)之DMF(0.463ml)與水(0.220ml)溶液中，加入2-胺基乙酸苄基鹽酸鹽(17.6mg、0.0871mmol)與DIPEA(0.0152ml、0.0871mmol)之DMF溶液(0.0871ml)，於50度攪拌6小時。之後，將反應混合物以逆相矽膠管柱層析(10mM乙酸銨水溶液/甲醇=70/30→20/80)精製，獲得5-((2-(苄氧基)-2-側氧基乙基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-側氧基戊酸(S)-苄酯(化合物5d-2)(29.4mg、91%)。
LCMS(ESI)m/z=485(M+H)+
保持時間：2.80分(分析條件ZQAA05)
2-6.5-((2-(苄氧基)-2-側氧基乙基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-側氧基戊酸(S)-苄酯(化合物5d-2)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0225-257
於2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-((4-三氟苯基)硫)-5-側氧基戊酸(S)-苄酯(化合物5f-2)(30.0mg、0.0603mmol)之DMF(0.541ml)與水(0.200ml)溶液中，加入2-胺基乙酸苄基鹽酸鹽(15.8mg、0.0784mmol)與DIPEA(0.0136ml、0.0784mmol)之DMF溶液(0.0784ml)，於50度攪拌45分鐘。之後，將反應混合物以逆相矽膠管柱層析(10mM乙酸銨水溶液/甲醇=70/30→20/80)精製，獲得5-((2-(苄氧基)-2-側氧基乙基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-側氧基戊酸(S)-苄酯(化合物5d-2)(26.4mg、90%)。
LCMS(ESI)m/z=485(M+H)+
保持時間：2.80分(分析條件ZQAA05)
如以上，與硫酯之間的反應性，在有反應輔助基之胺之示範化合物Cys衍生物與無反應輔助基之胺之示範Gly衍生物之間有大差異。可明白有反應輔助基之Cys衍生物，於RNA為安定之條件具有足夠高的環化反應性。又，有反應輔助基之胺相對於無反應輔助基之胺具有足夠選擇性，所以可判斷 以轉譯後之環化能從多數反應點當中與有反應輔助基之胺選擇的反應。又，硫酯之反應性，當比較硫芳基之情形及硫烷基或硫芳烷基之情形，硫芳酯的情形較高，此情形可明白與無反應輔助基之胺基也有良好反應性。
3.於已知硫酯與無反應輔助基之胺之反應顯示高反應性之條件的咪唑添加條件進行的化學反應
依Yangmei等人的文獻(Journal of combinatorial chemistry2009,11,1066-1072)，於乙腈-1.5M咪唑水溶液(7：1)之條件下進行反應(圖9)。
液性為pH6.4、pH7.4之2個條件、反應溫度為37度、70度、100度的3個條件進行。反應轉化率最良好的反應條件，(pH7.4、100度)，確認所望的醯胺化反應進行約46LC面積%。
[實施例6]經以SH基活化之胺基酸及其胺基醯基化pdCpA之合成
作為硫酯部位及轉譯後使環化之N末端使用之胺基酸，依圖10所示之方法，以下列方式實施Cys及MeCys等經以SH基活化之胺基酸之合成及使用此等之胺基醯基化pdCpA之合成。
1. 2n-A之合成
1-1. 2-((第三丁氧羰基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(R)-氰基甲酯(化合物21-A)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0227-258
於(R)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(化合物2k-A)(700mg、2.26mmol)之DMF(5ml)溶液中加入2-溴乙腈(0.473ml、6.78mmol)與N-乙基-N-異丙基丙烷-2-胺(0.444ml、2.49mmol)，於室溫攪拌10分鐘。於反應混合物中加入飽和氯化銨水溶液(1ml)後以乙酸乙酯稀釋，將有機層以水洗滌。之後將有機萃取物以硫酸鎂乾燥。減壓濃縮後，將獲得之殘渣以矽膠管柱層析(己烷/乙酸乙酯=100/0→70/30)精製，獲得2-((第三丁氧羰基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(R)-氰基甲酯(化合物21-A)(748mg、95%)。
LCMS(ESI)m/z=347(M-H)-
保持時間：1.00分(分析條件SQDAA05)
1-2. 2-((第三丁氧羰基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(2R)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(2m-A)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0228-259
於緩衝液A(113ml)加入磷酸二氫((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-3-(((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(羥基)磷氧基)氧基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物1h)(200mg、0.314mmol)之水溶液(6.25ml)與2-((第三丁氧羰基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(R)-氰基甲酯(化合物21-A)(454mg、1.26mmol)之THF(3.15ml)溶液，於室溫攪拌1小時。之後，使反應混合物冷凍乾燥。將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.05%三氟乙酸水溶液/0.05%三氟乙酸乙腈溶液=100/0→60/40)精製，獲得2-((第三丁氧羰基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(2R)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物2m-A)(129mg、46%)。
LCMS(ESI)m/z=928(M+H)+
保持時間：0.58分(分析條件SQDFA05)
1-3. 2-胺基-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(2R)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(2n-A)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0229-260
於2-((第三丁氧羰基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(2R)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物2m-A)(40mg、0.045mmol)加入三氟乙酸(0.5ml)，於室溫攪拌10分鐘。之後，將反應混合物減壓濃縮，獲得2-胺基-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(2R)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧 基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物2n-A)(45.1mg、100%)。
LCMS(ESI)m/z=828(M+H)+
保持時間：0.35分(分析條件SQDFA05)
2. 2n-B之合成
2-1. 4-((第三丁基二硫烷基)甲基)-5-側氧基噁唑烷-3-羧酸(R)-(9H-茀-9-基)甲基(化合物2b-B)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0230-2192
於(R)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(化合物2a-B)(2.00g、4.63mmol)之甲苯(10ml)溶液中加入三聚甲醛(843mg、9.26mmol)與10-樟腦磺酸(75mg、0.324mmol)，於100度攪拌4小時。使反應混合物回到室溫後，減壓使濃縮。將獲得之殘渣以矽膠管柱層析(己烷/乙酸乙酯=100/0→70/30)精製，獲得4-((第三丁基二硫烷基)甲基)-5-側氧基噁唑烷-3-羧酸(R)-(9H-茀-9-基)甲酯(化合物2b-B)(1.936g、94%)。
LCMS(ESI)m/z=444(M+H)+
保持時間：1.16分(分析條件SQDAA05)
2-2. (R)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)胺 基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(化合物2c-B)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0231-2193
於4-((第三丁基二硫烷基)甲基)-5-側氧基噁唑烷-3-羧酸(R)-(9H-茀-9-基)甲基(化合物2b-B)(1.68g、3.78mmol)之二氯甲烷(18ml)溶液中，加入三乙基矽烷(6.04ml、37.8mmol)與三氟乙酸(9ml)，於室溫攪拌1日。之後，將反應混合物減壓濃縮，將殘渣以逆相矽膠管柱層析(10mM乙酸銨水溶液/甲醇=70/30→20/80→0/100)精製，獲得(R)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(化合物2c-B)(1.22g、72%)。
LCMS(ESI)m/z=446(M+H)+
保持時間：1.02分(分析條件SQDAA05)
2-3. (R)-2-((第三丁氧羰基)(甲基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(化合物2k-B)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0231-263
於(R)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)胺 基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(化合物2c-B)(1.06g、2.37mmol)之四氫呋喃(11ml)溶液中加入哌啶(0.586ml、5.93mmol)，於室溫攪拌70分鐘。之後，於反應混合物中加入二碳酸二-第三丁酯(4.15g、19.0mmol)與三乙胺(3.30ml、23.7mmol)，於室溫攪拌30分鐘。之後將反應混合物減壓濃縮，將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(10mM乙酸銨水溶液/甲醇=70/30→20/80→0/100)精製，獲得(R)-2-((第三丁氧羰基)(甲基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(化合物2k-B)(586mg、76%)。
LCMS(ESI)m/z=322(M-H)-
保持時間：0.88分(分析條件SQDAA05)
2-4. 2-((第三丁氧羰基)(甲基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(R)-氰基甲酯(化合物21-B)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0232-264
於(R)-2-((第三丁氧羰基)(甲基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(化合物2K-B)(309mg、0.955mmol)之N,N-二甲基甲醯胺(2.5ml)溶液中加入2-溴乙腈(0.200ml、2.87mmol)與N-乙基-N-異丙基丙烷-2-胺(0.183ml、1.05mmol)，於室溫攪拌30分鐘。於反應混合物加入飽和氯化銨水溶液(3ml)後，以乙酸乙酯稀釋，將有機層以水洗滌。之後將有機萃取物以硫酸鎂乾燥。減壓濃縮後，將獲得之殘渣以矽膠管柱層析(己烷/乙 酸乙酯=100/0→70/30)精製，獲得2-((第三丁氧羰基)(甲基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(R)-氰基甲酯(化合物21-B)(272mg、78%)。
LCMS(ESI)m/z=363(M+H)+
保持時間：1.05分(分析條件SQDAA05)
2-5. 2-((第三丁氧羰基)(甲基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(2R)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物2m-B)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0233-265
與化合物2m-A之製造例以同樣條件，使用磷酸二氫((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-3-(((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(羥基)磷氧基)氧基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物1h)(112mg、0.176mmol)，並將2-((第三丁氧羰基) 胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(R)-氰基甲酯(化合物21-A)替換為使用2-((第三丁氧羰基)(甲基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(R)-氰基甲酯(化合物21-B)(255mg、0.704mmol)，以獲得2-((第三丁氧羰基)(甲基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(2R)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物2m-B)(38.6mg、23%)。
LCMS(ESI)m/z=942(M+H)+
保持時間：0.62分(分析條件SQDFA05)
2-6. 3-(第三丁基二硫烷基)-2-(甲胺基)丙酸(2R)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物2n-B)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0234-266
與化合物2n-A之製造例以同樣條件，並將2-((第三丁氧羰基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(2R)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(2m-A)替換為使用2-((第三丁氧羰基)(甲基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(2R)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物2m-B)(23.2mg、0.025mmol)，以獲得3-(第三丁基二硫烷基)-2-(甲胺基)丙酸(2R)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物2n-B)(26.3mg、100%)。
LCMS(ESI)m/z=842(M+H)+
保持時間：0.36分(分析條件SQDFA05)
3.2m-c之合成
3-1.(R)-3-(第三丁基二硫烷基)-2-(戊-4-烯醯胺)丙酸(化合物2k-C)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0236-267
於(R)-2-胺基-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(1g、4.58mmol)與碳酸鈉(1.46g、13.7mmol)之四氫呋喃(7ml)、水(14ml)溶液中，於0℃加入氯化戊-4-烯醇(1.015ml，9.16mmol)，於室溫攪拌20分鐘。之後，於反應混合物中，於0℃滴加濃鹽酸，使調整為pH2。以乙酸乙酯稀釋後，加入適量NaCl並進行鹽析萃取。將獲得之有機萃取物以飽和食鹽水洗滌，並以硫酸鎂乾燥。並且，以減壓濃縮獲得(R)-3-(第三丁基二硫烷基)-2-(戊-4-烯醯胺)丙酸(2k-C)與戊-4-烯酸(1：0.9)之混合粗產物C(1.71g、100%)。
3-2. 3-(第三丁基二硫烷基)-2-(戊-4-烯醯胺)丙酸(R)-氰基甲酯(化合物21-C)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0236-268
於(R)-3-(第三丁基二硫烷基)-2-(戊-4-烯醯胺)丙酸(化合物2k-C)與戊-4-烯酸(1：0.9)之混合粗產物C(1.75g、8.70mmol)之N,N-二甲基甲醯胺(11ml)溶液中，加入2-溴乙腈(0.957ml、13.74mmol)與N-乙基-N-異丙基丙烷-2-胺(1.76ml、 10.1mmol)，於室溫攪拌50分鐘。於反應混合物中加入飽和氯化銨水溶液(6ml)後以乙酸乙酯稀釋，將有機層以水洗滌。之後將有機萃取物以硫酸鎂乾燥。減壓濃縮後，將獲得之殘渣以矽膠管柱層析(己烷/乙酸乙酯=100/0→50/50)精製，獲得3-(第三丁基二硫烷基)-2-(戊-4-烯醯胺)丙酸(R)-氰基甲酯(化合物21-C)(940mg、62%)。
LCMS(ESI)m/z=331(M+H)+
保持時間：0.94分(分析條件SQDAA05)
3-3. 3-(第三丁基二硫烷基)-2-(戊-4-烯醯胺)丙酸(2R)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物2m-C)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0237-269
與化合物2m-A之製造例以同樣條件，使用磷酸二氫((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)- 基)-3-(((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(羥基)磷氧基)氧基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物1h)(200mg、0.314mmol)，將2-((第三丁氧羰基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(R)-氰基甲酯(化合物21-A)替換為使用3-(第三丁基二硫烷基)-2-(戊-4-烯醯胺)丙酸(R)-氰基甲酯(21-C)(415mg、1.23mmol)，藉此獲得3-(第三丁基二硫烷基)-2-(戊-4-烯醯胺)丙酸(2R)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物2m-C)(42.0mg、15%)。
LCMS(ESI)m/z=910(M+H)+
保持時間：0.53分(分析條件SQDFA05)
4.2m-D之合成
4-1. (R)-2-(戊-4-烯醯胺)-3-(三苯甲硫基)丙酸(化合物2h)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0238-270
於(R)-2-胺基-3-(三苯甲硫基)丙酸(1.50g、4.13mmol)與碳酸鈉(1.31g、12.4mmol)之四氫呋喃(3.5ml)、水 (7ml)溶液中，加入氯化戊-4-烯醇(0.915ml，8.25mmol)，於室溫攪拌1小時。之後，於反應混合物中於0℃滴加濃鹽酸，調整為pH2。以乙酸乙酯稀釋後，加入適量NaCl，進行鹽析萃取。將獲得之有機萃取物以飽和食鹽水洗滌，並以硫酸鎂乾燥後，進行減壓濃縮。將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(10mM乙酸銨水溶液/甲醇=70/30→0/100)精製，獲得(R)-2-(戊-4-烯醯胺)-3-(三苯甲硫基)丙酸(化合物2h)(1.14g、62%)。
LCMS(ESI)m/z=444(M-H)-
保持時間：0.95分(分析條件SQDAA05)
4-2. 3-(甲基二硫烷基)-2-(戊-4-烯醯胺)丙酸(R)-氰基甲酯(化合物21-D)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0239-2194
於(R)-2-(戊-4-烯醯胺)-3-(三苯甲硫基)丙酸(化合物2h)(1.01g、2.28mmol)之二氯甲烷(10ml)溶液中，加入三氟乙酸(1.76ml、22.8mmol)與三異丙基矽烷(0.934ml、4.56mmol)，於室溫攪拌10分鐘。之後，將反應混合物減壓濃縮。於獲得之殘渣與碳酸鈉(1.21g、11.4mmol)之水(5ml)溶液中，於0℃滴加甲烷磺酸基硫代酸(sulfonothioic acid)S-甲酯(1.44g、11.4mmol)之乙醇(5ml)溶液，之後於室溫攪拌30分鐘。之後，於反應混合物中於0℃滴加濃鹽酸，調整為pH2。以乙酸乙酯稀釋並萃取。將獲得之有機萃取物以飽和食鹽水洗滌， 並以硫酸鎂乾燥後減壓濃縮。於獲得之殘渣之DMF(1ml)溶液中加入2-溴乙腈(0.438ml、6.29mmol)與N-乙基-N-異丙基丙烷-2-胺(0.440ml、2.52mmol)，於室溫攪拌10分鐘。於反應混合物加入飽和氯化銨水溶液(3ml)後，以乙酸乙酯稀釋，將有機層以水洗滌。之後將有機萃取物以硫酸鎂乾燥。減壓濃縮後，將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(10mM乙酸銨水溶液/甲醇=70/30→0/100)精製，獲得3-(甲基二硫烷基)-2-(戊-4-烯醯胺)丙酸(R)-氰基甲酯(化合物21-D)(291mg、48%)。
LCMS(ESI)m/z=289(M+H)+
保持時間：0.79分(分析條件SQDAA05)
4-3. 3-(甲基二硫烷基)-2-(戊-4-烯醯胺)丙酸(2R)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物2m-D)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0240-272
與化合物2m-A之製造例以同樣條件，使用磷酸二氫((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-3-(((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(羥基)磷氧基)氧基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物1h)(150mg、0.236mmol)，將2-((第三丁氧羰基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(R)-氰基甲酯(化合物21-A)替換為使用3-(甲基二硫烷基)-2-(戊-4-烯醯胺)丙酸(R)-氰基甲酯(化合物21-D)(272mg、0.943mmol)，藉此獲得3-(甲基二硫烷基)-2-(戊-4-烯醯胺)丙酸(2R)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物2m-D)(21.2mg、10%)。
LCMS(ESI)m/z=868(M+H)+
保持時間：0.45分(分析條件SQDFA05)
5.2m-E之合成
5-1. 3-(第三丁基二硫烷基)-2-((((4,5-二甲氧基-2-硝基苄基)氧基)羰基)胺基)丙酸(R)-氰基甲酯(化合物21-E)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0241-2195
於(R)-2-胺基-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(化合物2f-E、500mg、2.29mmol)與碳酸鈉(534mg、5.04mmol)之二噁烷(5ml)、水(5ml)溶液中加入氯碳酸4,5-二甲氧基-2-硝基苄酯(694mg、2.52mmol)，於室溫攪拌30分鐘。之後，於反應液加入1N鹽酸，調整為pH2，加入乙酸乙酯並萃取。將有機萃取物以硫酸鎂乾燥，減壓濃縮。於獲得之殘渣之DMF(6ml)溶液中加入2-溴乙腈(0.284ml、4.08mmol)與N-乙基-N-異丙基丙烷-2-胺(0.285ml、1.63mmol)，於室溫攪拌20分鐘。於反應混合物加入飽和氯化銨水溶液(3ml)後，以乙酸乙酯稀釋，將有機層以水洗滌。之後將有機萃取物以硫酸鎂乾燥。減壓濃縮後，將獲得之殘渣以矽膠管柱層析(己烷/乙酸乙酯=100/0→60/40)精製，獲得3-(第三丁基二硫烷基)-2-((((4,5-二甲氧基-2-硝基苄基)氧基)羰基)胺基)丙酸(R)-氰基甲酯(化合物21-E)(653mg、98%)。
LCMS(ESI)m/z=486(M-H)-
保持時間：0.99分(分析條件SQDAA05)
5-2. 3-(第三丁基二硫烷基)-2-((((4,5-二甲氧基-2-硝基苄基)氧基)羰基)胺基)丙酸(2R)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物2m-E)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0243-274
與化合物2m-A之製造例以同樣條件，使用磷酸二氫((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-3-(((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(羥基)磷氧基)氧基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物1h)(150mg、0.236mmol)，將2-((第三丁氧羰基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(R)-氰基甲酯(化合物21-A)替換為使用3-(第三丁基二硫烷基)-2-((((4,5-二甲氧基-2-硝基苄基)氧基)羰基)胺基)丙酸(R)-氰基甲酯(化合物21-E)(460mg、0.943mmol)，藉此獲得3-(第三丁基二硫烷基)-2-((((4,5-二甲氧基-2-硝基苄基)氧基)羰基)胺基)丙酸(2R)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋 喃-3-酯(化合物2m-E)(10.6mg、4%)。
LCMS(ESI)m/z=1067(M+H)+
保持時間：0.62分(分析條件SQDFA05)
6.2m-F之合成
6-1. 4-((乙基二硫烷基)甲基)-5-側氧基噁唑烷-3-羧酸(R)-第三丁酯(2e-F)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0244-2196
於二環己胺(R)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-3-(乙基二硫烷基)丙酸鹽(化合物2d-f)(2.00g、4.32mmol)之甲苯(8ml)溶液中，加入((1S，4R)-7,7-二甲基-2-側氧基雙環[2.2.1]庚烷-1-基)甲烷磺酸(1.07g、4.62mmol)、三聚甲醛(847mg、2.89mmol)，於100℃終夜攪拌。之後，使反應液回到室溫並減壓濃縮。將獲得之殘渣以矽膠管柱層析(己烷/乙酸乙酯=100/0→87/13)精製，獲得4-((乙基二硫烷基)甲基)-5-側氧基噁唑烷-3-羧酸(R)-第三丁酯(2e-F)(847mg、67%)。
LCMS(ESI)m/z=294(M+H)+
保持時間：0.98分(分析條件SQDAA05)
6-2. (R)-3-(乙基二硫烷基)-2-(甲胺基)丙酸(2f-F)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0245-276
於4-((乙基二硫烷基)甲基)-5-側氧基噁唑烷-3-羧酸(R)-第三丁酯(化合物2e-F)(819mg、2.79mmol)之二氯甲烷(14ml)溶液中，於0℃加入三乙基矽烷(4.46ml、27.9mmol)、三氟乙酸(6.88ml、89.0mmol)，於室溫攪拌1小時。之後，將反應混合物減壓濃縮，將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(10mM乙酸銨水溶液/甲醇=100/0→60/40)精製，獲得(R)-3-(乙基二硫烷基)-2-(甲胺基)丙酸(化合物2f-F)(232mg、43%)。
LCMS(ESI)m/z=196(M+H)+
保持時間：0.39分(分析條件SQDAA05)
6-3. (R)-2-((((4,5-二甲氧基-2-硝基苄基)氧基)羰基)(甲基)胺基)-3-(乙基二硫烷基)丙酸(2k-F)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0245-2197
於(R)-3-(乙基二硫烷基)-2-(甲胺基)丙酸(化合物2f-F)(232mg，1.19mmol)與碳酸鈉(252mg、2.38mmol)之二噁烷(3ml)、水(3ml)溶液中，加入氯碳酸4,5-二甲氧基-2-硝基苄 酯(394mg、1.43mmol)，於室溫攪拌30分鐘。於反應混合物加入飽和氯化銨水溶液(3ml)後，以乙酸乙酯稀釋，將有機層以水洗滌。之後將有機萃取物以硫酸鎂乾燥。減壓濃縮後，將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(10mM乙酸銨水溶液/甲醇=70/30→0/100)精製，獲得(R)-2-((((4,5-二甲氧基-2-硝基苄基)氧基)羰基)(甲基)胺基)-3-(乙基二硫烷基)丙酸(化合物2k-F)(483mg、93%)。
LCMS(ESI)m/z=435(M+H)+
保持時間：0.82分(分析條件SQDAA05)
6-4.2-((((4,5-二甲氧基-2-硝基苄基)氧基)羰基)(甲基)胺基)-3-(乙基二硫烷基)丙酸(R)-氰基甲酯(21-F)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0246-278
於(R)-2-((((4,5-二甲氧基-2-硝基苄基)氧基)羰基)(甲基)胺基)-3-(乙基二硫烷基)丙酸(化合物2k-F)(238mg、0.549mmol)之DMF(2.5ml)溶液中，加入2-溴乙腈(0.115ml、1.65mmol)與N-乙基-N-異丙基丙烷-2-胺(0.105ml、0.604mmol)，於室溫攪拌10分鐘。於反應混合物加入飽和氯化銨水溶液(3ml)後，以乙酸乙酯稀釋，將有機層以水洗滌。之後將有機萃取物以硫酸鎂乾燥。減壓濃縮後，將獲得之殘渣 以逆相矽膠管柱層析(10mM乙酸銨水溶液/甲醇=70/30→0/100)精製，獲得2-((((4,5-二甲氧基-2-硝基苄基)氧基)羰基)(甲基)胺基)-3-(乙基二硫烷基)丙酸(R)-氰基甲酯(化合物21-F)(221mg、85%)。
LCMS(ESI)m/z=474(M+H)+
保持時間：0.97分(分析條件SQDAA05)
6-5. 2-((((4,5-二甲氧基-2-硝基苄基)氧基)羰基)(甲基)胺基)-3-(乙基二硫烷基)丙酸(2R)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(2m-F)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0247-279
與化合物2m-A之製造例以同樣條件，使用磷酸二 氫((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-3-(((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(羥基)磷氧基)氧基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物1h)(66.0mg、0.104mmol)，將2-((第三丁氧羰基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(R)-氰基甲酯(化合物21-A)替換為使用2-((((4,5-二甲氧基-2-硝基苄基)氧基)羰基)(甲基)胺基)-3-(乙基二硫烷基)丙酸(R)-氰基甲酯(化合物21-F)(196mg、0.415mmol)，以獲得2-((((4,5-二甲氧基-2-硝基苄基)氧基)羰基)(甲基)胺基)-3-(乙基二硫烷基)丙酸(2R)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物2m-F)(18.6mg、17%)。
LCMS(ESI)m/z=1053(M+H)+
保持時間：0.59分(分析條件SQDFA05)
7. 2m-G之合成
7-1. (R)-3-(第三丁基二硫烷基)-2-(甲胺基)丙酸(化合物2f-G)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0248-280
於(R)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(化合物2c-B)(2.70g、6.06mmol) 之四氫呋喃(20ml)溶液中加入哌啶(1.8ml、18.2mmol)，於室溫攪拌30分鐘。之後，將反應混合物減壓濃縮，將殘渣以逆相矽膠管柱層析(10mM乙酸銨水溶液/甲醇=100/0→60/40)精製，獲得(R)-3-(第三丁基二硫烷基)-2-(甲胺基)丙酸(化合物2f-G)(610mg、45%)。
LCMS(ESI)m/z=224(M+H)+
保持時間：0.63分(分析條件SQDAA05)
7-2. 2-((第三丁基二硫化二氫羰基)(甲基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(R)-氰基甲酯(化合物21-G)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0249-2198
於氯羰基硫氯(chlorochlorocarbonyl sulfenyl)(0.497ml、6.00mmol)之四氫呋喃(6ml)溶液中，於0℃滴加2-甲基丙烷-2-硫醇(0.663ml、5.88mmol)，於0℃攪拌30分鐘，製備0.8M羰基氯(carbono chloride)(二硫過酸)SS-第三丁基-四氫呋喃溶液。於(R)-3-(第三丁基二硫烷基)-2-(甲胺基)丙酸(化合物2f-G、500mg、2.24mmol)之四氫呋喃(3.4ml)、水(14.4ml)溶液加入碳酸氫鈉(752mg、8.95mmol)、0.8M羰基氯(carbonono chloride)(二硫過酸)SS-第三丁基-四氫呋喃溶液(4.2ml、3.36mmol)，於室溫攪拌5分鐘。之後，於反應混合物中，於0℃滴加濃鹽酸，調整為pH2。以乙酸乙酯稀釋後， 加入適量NaCl，進行鹽析萃取。將獲得之有機萃取物以飽和食鹽水洗滌後，以硫酸鎂乾燥並減壓濃縮。於獲得之殘渣之2-溴乙腈(1.02ml)溶液中加入N-乙基-N-異丙基丙烷-2-胺(0.282ml、1.62mmol)，於室溫攪拌30分鐘。於反應混合物加入飽和氯化銨水溶液(3ml)後，以乙酸乙酯稀釋，將有機層以水洗滌。之後將有機萃取物以硫酸鎂乾燥。減壓濃縮後，將獲得之殘渣以矽膠管柱層析(己烷/乙酸乙酯=100/0→80/20)精製，獲得2-((第三丁基二硫化二氫羰基)(甲基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(R)-氰基甲酯(化合物21-G)(205mg、68%)。
LCMS(ESI)m/z=411(M+H)+
保持時間：1.11分(分析條件SQDAA05)
7-3. 2-((第三丁基二硫化二氫羰基)(甲基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(2R)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物2m-G)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0251-282
於緩衝液A(46ml)中加入磷酸二氫((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-3-(((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(羥基)磷氧基)氧基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物1h)(77mg、0.121mmol)之水溶液(2.40ml)與2-((第三丁基二硫化二氫羰基)(甲基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(R)-氰基甲酯(化合物21-G)(198mg、0.483mmol)之四氫呋喃(1.21ml)溶液，於室溫攪拌2小時。之後，加入三氟乙酸(0.967ml)後，以逆相矽膠管柱層析(0.05%三氟乙酸水溶液/0.05%三氟乙酸乙腈溶液=100/0→60/40)精製，獲得2-((第三丁基二硫化二氫羰基)(甲基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(2R)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合 物2m-G)(3.8mg、3%)。
LCMS(ESI)m/z=990(M+H)+
保持時間：0.65分(分析條件SQDFA05)
[實施例7]具有Cys衍生物之胺基醯基化tRNA之合成
於50μM轉錄tRNAfMetCAU(-CA)(序列編號R-5)10μl中，加入10X接合緩衝液(500mM HEPES-KOH pH 7.5,200mM MgCl2,10mM ATP)2μl、無核酸酶之水4μl，於95℃加熱2分鐘後，於室溫放置5分鐘，進行tRNA之重新折疊。加入10unit/μl T4 RNA接合酶(New england bio lab.公司)2μL及、5mM之Cys(StBu)之胺基醯基化pdCpA(化合物2n-A)之DMSO溶液2μL，於15℃進行45分鐘接合反應。胺基醯基化tRNA(化合物AT-2-A)以苯酚萃取後，以乙醇沉澱回收。將胺基醯基化tRNA(化合物AT-2-A)於即將添加到轉譯混合物時溶於1mM乙酸鈉。
化合物AT-2-A(序列編號：33)
Figure 107130626-A0101-12-0252-283
[實施例8]使用pdCpA法之Cys(StBu)之轉譯合成1.胜肽序列P-10之轉譯合成
於20nM模板DNA Mtryg3(序列編號D-3)中，加入前述轉錄轉譯液、0.1mM 10-HCO-H4folate、0.3mM Gly， 0.3mM Arg，0.3mM Thr，0.3mM Tyr，0.3mM Leu，及以前述方法製備之50μM Cys(StBu)-tRNAfMetCAU(化合物AT-2-A)，於37℃進行60分鐘轉譯。將轉譯反應物以SPE C-TIP(Nikkyo Technos公司)精製並以MALDI-MS分析，未能觀測到標的分子胜肽序列P-10(圖12)。亦即，未檢測到從開始AUG起之轉譯胜肽。使Cys衍生物配置於N末端並使轉譯導入，須要設計。另一方面，確認從第2號密碼子編碼之胺基酸Thr起全長轉譯之胜肽(胜肽P-11)之MS觀測到專一的特別的現象。
胜肽序列P-10[Cys(StBu)]ThrThrThrArgLeuTyrTyrArgGlyGly
MALDI-MS：m/z：未檢測到(Calc.1345.7)
胜肽序列(P-11)(序列編號：36)ThrThrThrArgLeuTyrTyrArgGlyGly
MALDI-MS：m/z：[M+H]+=1300.7(Calc.1299.7)
2.胜肽序列P-12之轉譯合成
於20nM模板DNA(序列編號D-7)中，前述轉錄轉譯液、0.1mM 10-HCO-H4folate、Met與Lys以外的各0.3mM的18種蛋白質性胺基酸，及以前述方法製備之50μM Cys(StBu)-tRNAfMetCAU(化合物AT-2-A)，於37℃進行60分鐘轉譯。將轉譯反應物以SPE C-TIP(Nikkyo Technos公司)精製並以MALDI-MS分析，未能觀測到標的分子胜肽序列P-12。另一方面，觀測到第2號密碼子編碼之胺基酸Thr起全長轉譯之胜肽P-13之MS為主產物。顯示可進行使Cys(StBu)配置於 N末端之胜肽轉譯合成，但其效率低，進行以下改良探討。
DNA序列(D-7)AKC17 DNA序列(與序列編號D-31相同)(序列編號：7)
Figure 107130626-A0101-12-0254-330
胜肽序列(P-12)
Figure 107130626-A0101-12-0254-331
MALDI-MS：m/z：[M+H]+=1723.7(Calc.1722.7)
胜肽序列(P-13)(序列編號：37)ThrArgThrAlaTyrTrpSerLeuCysGlySerGlySerGlySer
MALDI-MS：m/z：[M+H]+=1532.7(Calc.1531.7)
[實施例9]利用pdCpA法所為之N末端Cys導入效率低之原因之指明
為了指明利用pdCpA法所為之N末端Cys(StBu)導入效率低之原因，進行以下實驗。
1.化合物2n-A側鏈StBu之脫保護
使用前驅體化合物2n-A，進行以下實驗來檢查pdCpA-Cys之側鏈StBu之脫保護及經脫保護之化合物2e-A之安定性。於250μM之化合物2n-A、pH7之50mM Tris‧HCl buffer、DTT 10mM之條件下，於室溫進行側鏈之脫保護，並使用LC-MS(SQD)觀測其經時變化。未觀測到目的之化合物2e-A，觀測到胺基酸水解並脫離而得之pdCpA。5分鐘後，化合物2n-A 51%、化合物2e-A 0%，pdCpA49%，2小時後脫保護完成，化合物2n-A成為0%，但化合物2e-A為0%，pdCpA100%完全水解(圖13)。
由以上可知，pdCpA-Cys(化合物2e-A)於通常轉譯條件下不安定，大約在生成的同時便被水解，不利於轉譯。
2.化合物2n-A之安定性評價
評價Cys之SH基經保護的化合物2n-A的安定性。如以下表2，分別製備5個條件之保存樣本，並使用LC-MS分析。
Figure 107130626-A0101-12-0255-332
HEPES buffer中，pH7、1小時後之化合物2n-A之殘存%為30%。若與先前記載，將側鏈已脫保護之化合物2e-A若脫保護會快速水解之結果加以比較，藉由保護側鏈，安定性會有增加的結果。
3.化合物2n-B之安定性評價
也一併評價MeCys之SH基經保護之化合物2n-B之安定性。如以下表3，製備4個條件的保存樣本，使用LC-MS分析。
Figure 107130626-A0101-12-0256-333
Figure 107130626-A0101-12-0256-334
pH7之buffer中，與化合物2n-A為同等安定性。pH5 buffer中，或DMSO溶液中之安定性，與化合物2n-A相比較為安定。化合物2n-B係經N-甲基化，據認為由於甲基原子之電子效果，會使pdCpA-胺基酸之安定度提高。
由以上，可指明pdCpA法所為之N末端Cys(StBu)導入效率低之一原因，係側鏈SH基之存在所致之胺基醯基化tRNA之不安定化。
[實施例10]使用Initiation read through法將N末端Cys有效率的轉譯導入
藉由積極活用從實施例9觀測得之第2號密碼子起之轉譯開始有效率的獲得的現象(Intiation read through)，如以下方法嘗試對於胜肽之N末端導入Cys。
1. Initiation read through法
依以下方法轉譯。於20nM模板DNA Mctryg3(序列編 號D-8)中，加入前述轉錄轉譯液、0.3mM Gly，0.3mM Arg，0.3mM Thr，0.3mM Tyr，0.3mM Leu、0.3mM Cys，於37℃進行60分鐘轉譯。將轉譯反應物以SPE C-TIP(Nikkyo Technos公司)精製並以MALDI-MS分析，如期待，並非從開始密碼子AUG而是編碼為從AUG以後的密碼子(相當於TGC、Cys)開始轉譯的標的胜肽P-14之MS係主產物(參照圖14)。
序列編號D-8(序列編號：8)Mctryg3 DNA序列
Figure 107130626-A0101-12-0257-335
轉譯胜肽P-14(序列編號：38)CysThrThrThrArgLeuTyrTyrArgGlyGly
MALDI-MS：m/z：[M+H]+=1290.6(Calc.1289.6)
2.緊接於Cys後之第3號密碼子的不同所致之initiation read through效率之差異之探討
評價第三號的密碼子是如何影響initiation read through。於20nM模板DNA IniRt_XXX_am(序列編號D-9至D-28)，添加前述大腸菌來源之再構成無細胞轉錄轉譯液、除了Met以外的各0.3mM的19種蛋白質性胺基酸，於37℃進行60分鐘轉譯。另外進行作為對照實驗之含Met之轉譯。將轉譯反應物以SPE C-TIP(Nikkyo Technos公司)精製並以MALDI-MS分析，觀測到從開始之AUG之後編碼的Cys一起轉譯之胜肽之 MS。
發現：將原本的轉譯開始胺基酸即甲硫胺酸從轉譯系去除，並使編碼為轉譯開始密碼子ATG緊接之後之Cys的mRNA轉譯，則以Cys作為N末端殘基之胜肽會在實施之19種轉譯胜肽(轉譯胜肽P-15至P-33)均以良好再現性被轉譯合成作為主產物。藉此，不用將不安定的Cysacyl tRNA於系外製備並添加到轉譯系，能於N末端導入Cys(參照圖15~23)。又，也同時進行作為對照實驗之在上述轉譯系中添加甲硫胺酸，不進行initiation read through而使全長胜肽轉譯之試驗。
IniRt_XXX_am模板DNA序列
Figure 107130626-A0101-12-0258-336
(XXX：TTT(序列編號D-9(序列編號：9)),TTG(序列編號D-10(序列編號：10)),TAC(序列編號D-11(序列編號：11)),TGC(序列編號D-12(序列編號：12)),TGG(序列編號D-13(序列編號：13)),CTT(序列編號D-14(序列編號：14)),CTA(序列編號D-15(序列編號：15)),CCG(序列編號D-16(序列編號：16)),CAT(序列編號D-17(序列編號：17)),CAG(序列編號D-18(序列編號：18)CGT(序列編號D-19(序列編號：19)),CGG(序列編號D-20(序列編號：20)),ATT(序列編號D-21(序列編號：21)),ACT(序列編號D-23(序列編號：22)),AAC(序列編號D-24(序列編號：23)),AGT(序列編號D-25(序列編號：24)),AGG(序列編號D-26(序列編號：25)),GTT(序列編號D-27(序列編號：26)), GCT(序列編號D-28(序列編號：27))
IniRt_XXX_am胜肽序列(轉譯胜肽番號P-15至P-33)CysXaaThrThrThrLeuTyrTyrArgGlyGly(序列編號：39~57)
MALDI-MS之計算值及實測值之表
Figure 107130626-A0101-12-0259-337
[實施例11]Cys以外之附有SH基之非天然型胺基酸及其胺基醯基化pdCpA之合成
天然型胺基酸Cys可利用活用ARS之Intiation read through法有效率的轉譯導入，但是將非天然型胺基酸進行ARS導入有其極限，故合成設計使胺基醯基化pdCpA當中之活性酯部分之水解速度慢的化合物並評價。亦即，合成使SH基從羧酸活性酯部位分離之一連串化合物群並評價。
首先合成具有Cys以外之SH基且活性酯部位對水解為安定之具有N末端非天然型胺基酸之胺基醯基化pdCpA(圖24)
1.化合物6i-A之合成
1-1.(2-(第三丁基二硫烷基)乙基)胺甲酸第三丁酯(化合物6b-A)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0260-2199
於氮氣氛圍下，使1-氯-1H-苯并[d][1,2,3]三唑(1.73g、11.28mmol)及1H-苯并[d][1,2,3]三唑(0.67g、5.64mmol)溶於DCM(24.0ml)，冷卻至-78度後，滴加(2-巰基乙基)胺甲酸第三丁酯(化合物6a)(1.00g、5.64mmol)之DCM溶液(3.0ml)。於-78度攪拌10分鐘後，加入硫脲(1.29g、16.92mmol)之THF懸浮液(6.0ml)，再攪拌10分鐘。之後，滴加2-甲基丙烷-2-硫醇(0.76g、8.46mmol)之DCM溶液(3.0ml)，邊升溫直到室溫邊攪拌20小時。過濾去除反應液中之固體，將減壓濃縮獲得之殘渣以管柱層析(己烷：乙酸乙酯=4：1)精製，獲得標題化合物(1.15g、77%)。
LCMS：m/z 266(M+H)+
保持時間：1.05分(分析條件SQDAA05)
1-2.2-(第三丁基二硫烷基)乙烷胺(化合物6c-A)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0261-339
於(2-(第三丁基二硫烷基)乙基)胺甲酸第三丁酯(化合物6b-A、100mg、0.377mmol)添加TFA(1.0ml)之DCM溶液(1.0ml)，於室溫攪拌15分鐘。將反應液減壓濃縮，獲得標題化合物(209mg、quant.)。
LCMS：m/z 166(M+H)+
保持時間：0.63分(分析條件SQDAA05)
1-3.2-((第三丁氧羰基)(2-(第三丁基二硫烷基)乙基)胺基)乙酸乙酯(化合物6e-A)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0261-2200
將2-(第三丁基二硫烷基)乙烷胺(化合物6c-A、0.21g、1.26mmol)、2-溴乙酸乙酯(0.23g、1.39mmol)溶於DCM(6.0ml)，加入DIPEA(1.10ml、6.31mmol)，於於室溫攪拌17小時。於反應液中加入二碳酸第三丁酯(358mg、1.64mmol)，於室溫攪拌15分鐘後，直接將反應液以管柱層析(己烷：乙酸乙酯=4：1)精製，獲得標題化合物(334.8mg、75%)。
LCMS：m/z 352(M+H)+
保持時間：1.11分(分析條件SQDAA05)
1-4.2-((第三丁氧羰基)(2-(第三丁基二硫烷基)乙基)胺基)乙酸(化合物6f-A)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0262-341
將2-((第三丁氧羰基)(2-(第三丁基二硫烷基)乙基)胺基)乙酸乙酯(化合物6e-A、320mg、0.91mmol)溶於甲醇(80ml)，加入氫氧化鉀水溶液(0.18mol/l、30.3ml)，於室溫攪拌2小時。將反應液中之甲醇以減壓濃縮除去，將水層以二乙醚洗滌後，以1mol/l鹽酸水溶液調整為pH3。將該水層以乙酸乙酯萃取，將有機層以無水硫酸鎂乾燥，過濾、並減壓濃縮，獲得標題化合物(268.1mg、91%)。
LCMS：m/z 322(M-H)-
保持時間：0.89分(分析條件SQDAA05)
1-5.2-((第三丁氧羰基)(2-(第三丁基二硫烷基)乙基)胺基)乙酸氰基甲酯(化合物6g-A)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0262-2201
將2-((第三丁氧羰基)(2-(第三丁基二硫烷基)乙基)胺基)乙酸(化合物6f-A、268.1mg、0.83mmol)及2-溴乙腈(199mg、1.66mmol)溶於DMF(1.0ml)，加入DIPEA(0.43ml、 2.49mmol)，於室溫攪拌15分鐘。於反應液加入飽和氯化銨水溶液後，以二乙醚萃取。將獲得之有機層以無水硫酸鎂乾燥，過濾、減壓濃縮，將獲得之殘渣以管柱層析(己烷：乙酸乙酯=3：1)精製，獲得標題化合物(287.7mg、96%)。
LCMS：m/z 363(M+H)+
保持時間：1.04分(分析條件SQDAA05)
1-6.2-((第三丁氧羰基)(2-(第三丁基二硫烷基)乙基)胺基)乙酸(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物6h-A)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0263-2202
溶解咪唑(272.3mg、4.00mmol)及N,N,N-三甲基十六烷-1-氯化銨(256.0mg、0.80mmol)，於以乙酸調整為pH8之 緩衝液(40ml)中加入磷酸二氫((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-3-(((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(羥基)磷氧基)氧基)四氫呋喃-2-基)甲基(化合物1h、100mg、0.157mmol)之水溶液(1.0ml)後，加入2-((第三丁氧羰基)(2-(第三丁基二硫烷基)乙基)胺基)乙酸氰基甲酯(化合物6g-A、198mg、0.546mmol)之THF(1.2ml)溶液，於室溫攪拌4小時。直接將反應液冷凍乾燥，將獲得之殘渣以管柱層析(0.05%TFA水溶液：0.05%TFA乙腈溶液=85：15)精製，獲得標題之化合物(57.7mg、39%)。
LCMS：m/z 942(M+H)+
保持時間：0.89分(分析條件SMD法1)
1-7.2-((2-(第三丁基二硫烷基)乙基)胺基)乙酸(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物6i-A)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0265-344
將2-((第三丁氧羰基)(2-(第三丁基二硫烷基)乙基)胺基)乙酸(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物6h-A、56.2mg、0.060mmol)溶於TFA(1.0ml)，於室溫攪拌5分鐘。將反應液減壓濃縮後，將殘渣以管柱層析(0.05%TFA水溶液：0.05%TFA乙腈溶液=85：15=85：15)精製，獲得標題化合物(40.6mg、81%)。
LCMS：m/z 842(M+H)+
保持時間：0.39分(分析條件SQDAA05)
2.化合物6i-B之合成
2-1.3-((第三丁氧羰基)(2-(第三丁基二硫烷基)乙基)胺基)丙酸甲酯(化合物6e-B)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0266-345
將2-(第三丁基二硫烷基)乙烷胺(化合物6c-A、0.80g、0.84mmol)及丙烯酸甲酯(1.74ml、19.36mmol)溶於二氯乙烷(14.0ml)，加入DIPEA(4.23ml、24.20mmol)，於85℃攪拌2小時。放冷並加入二碳酸第三丁酯(1.37g、6.29mmol)，於室溫攪拌45分鐘後，加入飽和氯化銨水溶液，以DCM萃取。將獲得之有機層以飽和氯化鈉水溶液洗滌後，以無水硫酸鎂乾燥，過濾並減壓濃縮，將獲得之殘渣以管柱層析(己烷：乙酸乙酯=3：1)精製，獲得標題化合物(1.14g、67%)。
LCMS：m/z 352(M+H)+
保持時間：1.11分(分析條件SQDAA05)
2-2.3-((第三丁氧羰基)(2-(第三丁基二硫烷基)乙基)胺基)丙酸(化合物6f-B)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0266-346
將3-((第三丁氧羰基)(2-(第三丁基二硫烷基)乙基)胺基)丙酸甲酯(化合物6e-B、1.14g、3.24mmol)作為原料，與化合物6f-A之合成以同樣方法，獲得標題化合物(1.04g、95%)。
LCMS：m/z 336(M-H)-
保持時間：0.96分(分析條件SQDAA05)
2-3.3-((第三丁氧羰基)(2-(第三丁基二硫烷基)乙基)胺基)丙酸氰基甲酯(化合物6g-B)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0267-347
將3-((第三丁氧羰基)(2-(第三丁基二硫烷基)乙基)胺基)丙酸(化合物6f-B、1.03g、3.05mmol)作為原料，與化合物6g-A之合成以同樣方法，獲得標題化合物(1.05g、91%)。
LCMS：m/z 377(M+H)+
保持時間：1.09分(分析條件SQDAA05)
2-4.3-((2-(第三丁基二硫烷基)乙基)胺基)丙酸(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物6i-B)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0268-348
於冰冷下，使磷酸二氫((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-3-(((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(羥基)磷氧基)氧基)四氫呋喃-2-基)甲酯四丁基銨鹽(化合物1h、44.6mg、0.314mmol)與3-((第三丁氧羰基)(2-(第三丁基二硫烷基)乙基)胺基)丙酸氰基甲酯(化合物6g-B、236mg、0.628mmol)溶於DMF，並加入三乙胺(0.088ml、0.628mmol)。於室溫攪拌1小時後，將反應液以管柱層析(0.05%TFA水溶液：0.05%TFA乙腈溶液=70：30)精製。於獲得之殘渣中加入TFA(1.5ml)，於室溫攪拌5分鐘。將反應液減壓濃縮，並將獲得之殘渣以管柱層析(0.05%TFA水溶液：0.05%TFA乙腈溶液=80：20)精製，獲得標題化合物(66.9mg、25%)。
LCMS：m/z 856(M+H)+
保持時間：0.629分(分析條件SMD法1)
3.化合物6i-C之合成
3-1.4-((第三丁氧羰基)(2-(第三丁基二硫烷基)乙基)胺基)丁酸乙酯(化合物6e-C)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0269-349
將2-溴乙酸乙酯替換為使用4-溴丁酸乙酯(2.68ml、18.15mmol)，與化合物6e-A之合成以同樣方法，獲得標題化合物(556.2mg、24.2%)。
LCMS：m/z 380(M+H)+
保持時間：1.15分(分析條件SQDAA05)
3-2.4-((第三丁氧羰基)(2-(第三丁基二硫烷基)乙基)胺基)丁酸(化合物6f-C)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0269-350
將2-((第三丁氧羰基)(2-(第三丁基二硫烷基)乙基)胺基)乙酸乙酯(化合物6e-A)替換為使用4-((第三丁氧羰基)(2-(第三丁基二硫烷基)乙基)胺基)丁酸乙酯(化合物6e-C、0.96g、2.53mmol)當作原料，與化合物6f-A之合成以同樣方法，獲得標題化合物(0.86g、97%)。
LCMS：m/z 352(M+H)+
保持時間：0.99分(分析條件SQDAA05)
3-3.4-((第三丁氧羰基)(2-(第三丁基二硫烷基)乙基)胺基)丁酸氰基甲酯(化合物6g-C)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0270-351
將2-((第三丁氧羰基)(2-(第三丁基二硫烷基)乙基)胺基)乙酸(化合物6f-A)替換為使用4-((第三丁氧羰基)(2-(第三丁基二硫烷基)乙基)胺基)丁酸(化合物6f-C、0.86g、2.45mmol)作為原料，與化合物6g-A之合成以同樣方法，獲得標題化合物(0.71g、74%)。
LCMS：m/z 391(M+H)+
保持時間：1.05分(分析條件SQDAA05)
3-4.-((2-(第三丁基二硫烷基)乙基)胺基)丁酸(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物6i-C)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0271-352
將3-((第三丁氧羰基)(2-(第三丁基二硫烷基)乙基)胺基)丙酸氰基甲酯(化合物6g-B)替換為使用4-((第三丁氧羰基)(2-(第三丁基二硫烷基)乙基)胺基)丁酸氰基甲酯(化合物6g-C、245mg、0.628mmol)作為原料，與化合物6i-B之合成以同樣方法，獲得標題化合物(103mg、37.6%)。
LCMS：m/z 870(M+H)+
保持時間：0.641分(分析條件SMD法1)
[實施例12]使用具有SH基之安定胺基醯基化pdCpA之胺基醯基化tRNA合成
於50μM轉錄tRNAfMetCAU(-CA)(序列編號R-5)10μl，加入10X接合緩衝液(500mM HEPES-KOH pH 7.5,200mM MgCl2,10mM ATP)2μl、無核酸酶之水4μl，於95℃加熱2分鐘後，於室溫放置5分鐘，進行tRNA之重新折疊。加入10unit/μl T4 RNA接合酶(New england bio lab.公司)2μL 及、5mM之胺基醯基化pdCpA(化合物6i-A、B、C、2n-A、2m-c、2m-E)之DMSO溶液2μL，於15℃進行45分鐘接合反應。將胺基醯基化tRNA(化合物AT-2-A、C、E、AT-6-A、B、C)進行苯酚萃取後，以乙醇沉澱回收。胺基醯基化tRNA(化合物AT-2-A、C、E、AT-6-A、B、C)在即將添加到轉譯混合物時溶於1mM乙酸鈉。
化合物AT-2-A
Figure 107130626-A0101-12-0272-353
化合物AT-2-C
Figure 107130626-A0101-12-0272-354
化合物AT-2-E
Figure 107130626-A0101-12-0272-355
化合物AT-6-A
Figure 107130626-A0101-12-0272-356
化合物AT-6-B
Figure 107130626-A0101-12-0273-357
化合物AT-6-C(序列編號：33)
Figure 107130626-A0101-12-0273-358
[實施例13]使用含SH基之安定化胺基醯基化tRNA之轉譯合成
如以下實驗所示，若將Cys之SH基或主鏈胺基予以保護，與Cys本身相比，胺基醯基化pdCpA之轉譯液示範系中(HEPES buffer)之安定性提高，且轉譯合成效率也提高。又，SH基之位置配置為遠離α-羧酸部位之各種新穎之含SH基之各種非天然型胺基酸之轉譯導入效率也提高。
於20nM模板DNA AKC17(序列編號D-31)或KA03(序列編號D-6)，添加前述轉錄轉譯液、0.1mM 10-HCO-H4folate、除了Met以外的各0.3mM之19種蛋白質性胺基酸，及以前述方法製備之25~50μM Xaa-tRNAfMetCAU(Xaa：Cys(StBu)，PenCys(StBu)，NVOC-Cys(StBu)，tBuSSEtGly，tBuSSEtβAla，tBuSSEtGABA)，於37℃進行30分鐘轉譯。將轉譯反應物以SPE C-TIP(Nikkyo Technos公司)精製並以MALDI-MS分析，觀測到於N末端導入有Xaa之胜肽之MS(MALDI-MS)。
結果，相較於Cys，若將SH基或N予以保護，會顯示pdCpA-胺基酸體之安定性提高且轉譯合成效率也提高。又，使 Cys更安定化之含SH之各種非天然型胺基酸之轉譯導入效率也提高(參照圖25、26)。
Figure 107130626-A0101-12-0274-359
序列編號D-31(序列編號：7)AKC17 DNA序列
Figure 107130626-A0101-12-0274-360
胜肽序列編號P-34~P-41之支架序列
KA03胜肽序列[Xaa]ThrArgThrLysAlaTyrTrpSerLeuProGlyGly
AKC17胜肽序列[Xaa]ThrArgThrAlaTyrTrpSerLeuCysGlySerGlySerGlySer
[實施例14]使用Intiation supression法之轉譯及環化反應
1.側鏈羧酸經活性酯化之胺基醯基tRNA之合成
依以下方法合成側鏈漿酸經硫酯化之胺基醯基化tRNA。
1-1.利用轉錄所為之tRNA(CA欠缺)之合成
從模板DNA(序列編號D-33)，利用使用RiboMAX Large Scale RNA production System T7(Promega公司，P1300)之體外轉錄，合成3'端之CA欠缺的tRNAEnAsnGAG(-CA)(序列編號R-33)，並利用RNeasy Mini kit(Qiagen公司)精製。
序列編號D-33(與序列編號D-1相同)(序列編號：1)tRNAEnAsnGAG(-CA)DNA序列：
Figure 107130626-A0101-12-0275-361
序列編號R-33(與序列編號R-1相同)(序列編號：30)tRNAEnAsnGAG(-CA)RNA序列：
Figure 107130626-A0101-12-0275-362
1-2.利用將側鏈羧酸經活性酯化之胺基醯基化pdCpA(化合物1i)與tRNA(CA欠缺)(序列編號：R-33)以接合(ligation)所為之胺基醯基化tRNA(化合物AT-1)之合成
於50μM轉錄tRNAEnAsnGAG(-CA)(序列編號R-33)10μL，加入10X接合緩衝液(500mM HEPES-KOH pH7.5，200mM MgCl2,10mM ATP)2μL、無核酸酶之水4μL，於95℃加熱2分鐘後，於室溫放置5分鐘，進行tRNA之重新折疊。加入10unit/μL之T4 RNA接合酶(New England Bio Lab.公司)2μL及、5mM之側鏈羧酸經活性酯化之胺基醯基化pdCpA(化合物1i)之DMSO溶液2μL，於15℃進行45分鐘接合反應。於接合反應液20μL加入125mM碘(水：THF=1：1溶液)4μL，於室溫進行1小時脫保護。將胺基醯基化tRNA(化合物AT-1)進行苯酚萃取後以乙醇沉澱回收。胺基醯基化tRNA(化合物AT-1)於即將添加到轉譯混合物時溶於1mM乙酸鈉。
化合物AT-1-IA2(與化合物AT-1-IA相同)Asp(SMe)-tRNAEnAsnGAG
化合物編號AT-1-IB2(與化合物AT-1-IB相同)Asp(SiPr)-tRNAEnAsnGAG
化合物編號AT-1-IC2(與化合物AT-1-IC相同)Asp(StBu)-tRNAEnAsnGAG
化合物編號AT-1-ID2(與化合物AT-1-ID相同)Asp(SBn)-tRNAEnAsnGAG
化合物編號AT-1-IE2(與化合物AT-1-IE相同)Asp(SPhenetyl)-tRNAEnAsnGAG
化合物編號AT-1-IG2(與化合物AT-1-IG相同)Asp(SEt)-tRNAEnAsnGAG
2.使用將甲硫胺酸以外之胺基酸、胺基酸類似物或N末端羧酸類似物導入N末端之方法之轉譯合成及醯胺環化反應
使用KA03 DNA序列(序列編號D-6)作為模板DNA，進行轉譯反應。
於模板DNA，加入前述轉錄轉譯液、除了Met及Leu以外的各0.3mM之18種蛋白質性胺基酸，及以前述方法製備之25μM tBuSSEtGABA-tRNAfMetCAU(化合物編號AT-6-C)與50μM Asp(SMe)-tRNAEnAsnGAG(化合物編號AT-1-IA2)，於37℃進行3小時轉譯。於轉譯產物添加1/20(v/v)量之200mM TCEP(pH6.6)，於37℃反應15分鐘，與Asp(SMe)部位進行分子內環化反應。其結果，以MS光譜確認目的之環狀胜肽(胜肽序列P-43)(圖27)。藉由將與硫酯連接的胺基酸予以N-烷胺基酸，有效率地達成了轉譯‧環化。
胜肽序列P-42[tBuSSEtGABA]ThrArgThrLysAlaTyrTrpSer[Asp(SMe)]ProGlyGly
MALDI-MS：m/z：[M+H]+=1601.7(Calc.1601.0)
胜肽序列P-43以[HSEtGABA]ThrArgThrLysAlaTyrTrpSer[Asp(SMe)]ProGlyGly之GABA之主鏈氮原子與Asp之側鏈羧酸予以醯胺環化而得之化合物
Figure 107130626-A0101-12-0277-363
MALDI-MS：m/z：[M+H]+=1465.6(Calc.1465.0)
[實施例15]使用Intioation read through法之轉譯及環化
1.經由NCL(Native Chemical Ligation)之醯胺型環化胜肽之合成
模板DNA使用KA02.5U DNA序列(序列編號D-32)，進行轉譯反應。
於模板DNA，加入前述轉錄轉譯液、除了Met及Ala、Leu以外的各0.3mM之17種蛋白質性胺基酸，3mM乳酸、及以前述方法製備之50μM Asp(SRex2)-tRNAEnAsnGAG(Rex2：苄基，甲基，乙基，異丙基、第三丁基、苯乙基)(化合物編號AT-1-IA2、IB2、IC2、ID2、IE2，IG2)，於37℃進行3小時轉譯。其結果，以MS光譜確認了經環化之全長胜肽(圖28~圖29)。
序列編號D-32(序列編號：28)KA02.5U DNA序列：
Figure 107130626-A0101-12-0278-364
轉譯胜肽CysThrArgThrLys[Lac]TyrTrpSer[Asp(SRex2)]ProGly(Rex2：苄基、甲基、乙基、異丙基、第三丁基、苯乙基、Lac：乳酸)轉譯後，環化之胜肽之化學結構(胜肽序列編號P-44至P-49)CysThrArgThrLys[Lac]TyrTrpSer[Asp(SRex2)]ProGly之Cys之主鏈胺基與Asp之側鏈羧酸間予以分子內醯胺化而得之化合物
Figure 107130626-A0101-12-0279-365
Figure 107130626-A0101-12-0279-366
由以上結果，可明白：利用Ininitiation read through法將Cys轉譯導入，轉譯及環化會順利進行，且從各種硫酯體獲得作為主產物之醯胺環化體。再者，首次了解由於含乳酸之本序列有效地被轉譯，能將乳酸利用AlaRS而選擇性且有效率的導入。
如Initiation read through法所述，當未保護使胺活化之作用的SH基的情形，連接於硫酯之非天然型胺基酸(也包括蛋白性胺基酸)也可不拘於具有N-烷基之胺基酸。原因為轉譯後立即會經由與SH基之反應而生成醯胺。當使SH基受保護之胺基酸轉譯之情形，從轉譯步驟結束後至脫保護步驟的時間內會形成天冬醯亞胺。
2.利用轉譯所為之醯胺環化胜肽之結構決定
2-1.LC-MS分析用轉譯胜肽製備
於20nM模板DNA Mctryg3(序列編號D-8)，加入前述轉錄轉譯液、0.1mM 10-HCO-H4folate(10-formyl-5,6,7,8,-tetrahydrophilic acid)、除了Met及Leu以外的各0.3mM之18種蛋白質性胺基酸，及以前述方法製備之50μM Asp(SMe)-tRNAEnAsnGAG(化合物AT-1-IA)，於37℃進行3小時轉譯。於轉譯反應物添加1mM二硫蘇糖醇，於37℃進行30分鐘還原後，添加10mM碘乙醯胺，於遮光‧室溫進行40分鐘硫醇之羧基醯胺甲基化。
胜肽序列P-52 CysThrThrThrArg[Asp(SMe)]TyrTyrArgGlyGly
胜肽序列P-53(序列編號：59)CysThrThrThrArg[Asp(SMe)]TyrTyrArgGlyGly之Cys之主鏈胺基與Asp之側鏈羧酸予以分子內醯胺環化而得之化合物mass光譜calc.1273.6
Figure 107130626-A0101-12-0280-367
胜肽序列P-54乙醯胺化後Exact Mass Calc.1330.6 CysThrThrThrArg[Asp(SMe)]TyrTyrArgGlyGly(胜肽序列P-52)之Cys之主鏈胺基與Asp之側鏈羧酸予以分子內醯胺環化而得之胜肽序列P-53之Cys之SH基經乙醯胺化之化合物
Figure 107130626-A0101-12-0281-368
2-2.與轉譯合成品具有相同序列之胜肽之化學合成
2-2-1.利用自動合成機所為之胜肽固相合成之一般法
使用胜肽合成機(Multipep RS；Intavis公司製)，依Fmoc法進行胜肽合成。Fmoc-Cys(Mmt)-OH係從NOVABIOCHEM公司購買，Fmoc-Cys(Mmt)-OH以外的其他Fmoc胺基酸係從渡邊化學工業購買。又，關於操作之詳細程序，依循合成機附帶的手冊。
於合成機中放入有C末端之Fmoc胺基鍵結之2-氯三苯甲基樹脂(每1管柱250-300mg)、及各種Fmoc胺基酸(0.6mol/L)與1-羥基-7-氮雜苯并三唑(HOAt)(0.375mol/L)之N,N-二甲基甲醯胺溶液、二異丙基碳二醯亞胺(DIC)之N,N-二甲基甲醯胺(DMF)溶液(10%v/v)，Fmoc脫保護溶液使用含5%(wt/v)之尿素之哌啶之N,N-二甲基甲醯胺溶液(20%v/v)、或二氮雜雙環十一烯(DBU)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(2%v/v)，進行合成。將樹脂以DMF溶液洗滌後，進行Fmoc脫保護，其次進行Fmoc胺基酸之縮合反應，以此作為1個循環，反複此循環，使樹脂表面上的胜肽伸長。如此的實驗例，係參考Ramon Subiros-funosas等人之非專利文獻(Org.Biomol.Chem.2010,8,3665-3673)等合成。
2-2-2.H-Cys(CH2CONH2)-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Asp-OBn(胜肽P-55)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0282-2203
Fmoc胺基酸，係使用Fmoc-Cys(Mmt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH(均由渡邊化學工業購買)。於合成機放入有Fmoc-Asp-OBn鍵結之2-氯三苯甲基樹脂(250mg、13管柱、1.36mmol)，將胜肽進行固相合成。
伸長結束後，將樹脂以二氯甲烷洗滌，添加三氟乙酸/三異丙基矽烷/二氯甲烷(=2/5/93,100mL)，進行從樹脂切出胜肽及S-甲氧基三苯甲基之脫保護。1.5小時後，將管內溶液以合成用管柱過濾，去除樹脂，於反應液加入2-碘乙醯胺(252mg、1.36mmol)，DIPEA(15mL)，DMF(15mL)，進行S之烷基化。1.5小時後，減壓濃縮並將獲得之殘渣以逆相矽膠層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液=95/5→0/100)精製，獲得直鏈胜肽H-Cys(CH2CONH2)-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Asp-Arg(Pbf)-Asp-OBn(胜肽P-55)。(180mg、10%)
LCMS(ESI)m/z=1262(M-H)-
保持時間：0.71分(分析條件SQDFA05)
2-2-3.c(Cys(CH2CONH2)-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Asp)-OBn(胜肽P-56)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0283-2204
H-Cys(CH2CONH2)-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Asp-OBn(胜肽P-55、180mg)溶於二氯甲烷/二甲基亞碸(9/1)(141mL)，添加O-(7-氮雜-1H苯并三唑-1-基)-N,N,N,N四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)(81mg、0.214mmol)、及二異丙基乙胺(0.149mL、0.855mmol)並攪拌。1.5小時後，將反應液減壓濃縮並將獲得之殘渣以逆相矽膠層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液=50/50→0/100)精製，獲得環狀胜肽c(Cys(CH2CONH2)-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Asp)-OBn(胜肽P-56)。(92mg、52%)
LCMS(ESI)m/z=1246(M+H)+
保持時間：1.02分(分析條件SQDFA05)
2-2-4.c(Cys(CH2CONH2)-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Thr(t Bu)-Arg(Pbf)-Asp)-OH(胜肽P-57)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0284-2205
使c(Cys(CH2CONH2)-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Asp)-OBn(胜肽P-56、90mg)溶於乙醇(2mL)，加入10%鈀碳(100mg)，於氫氣氛圍下攪拌。18小時後，將反應液減壓濃縮，獲得環狀胜肽c(Cys(CH2CONH2)-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Asp)-OH(胜肽P-57)。(72mg、86%)
LCMS(ESI)m/z=1156(M+H)+
保持時間：0.93分(分析條件SQDFA05)
2-2-5.C(Cys(CH2CONH2)-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Asp)-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Gly-Gly-OH(胜肽P-58)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0285-372
Fmoc胺基酸使用Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH(均從渡邊化學工業購買)，於合成機放入有Fmoc-Gly-OH鍵結之2-氯三苯甲基樹脂(250mg)，將具有H-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Gly-Gly-OH序列之胜肽(胜肽P-59)進行固相合成。
於上述樹脂加入c(Cys(CH2CONH2)-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Asp)-OH(胜肽P-57、46mg、0.04mmol)、1-羥基-7-氮雜苯并三唑(HOAt)(5.4mg、0.04mmol)二異丙基碳二醯亞胺(DIC)(0.075mL0.048mmol)之N,N-二甲基甲醯胺(DMF)溶液。17小時後，將樹脂以二氯甲烷洗滌，加入三氟乙酸/二氯甲烷(=1/99,4mL)，從樹脂切出胜肽。1.5小時後，將管內溶液以合成用管柱過濾以去除樹脂，減壓濃縮並將獲得之殘渣以逆相矽膠層析(10mM乙酸銨水溶液/甲醇=50/50→0/100)精製，獲得C(Cys(CH2CONH2)-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Asp) -Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Gly-Gly-OH(胜肽P-58)。(6.2mg、7.3%)
LCMS：1059 m/z(M+2H)2+
保持時間：0.83分(分析條件SQDAA50)
2-2-6.C(Cys(CH2CONH2)-Thr-Thr-Thr-Arg-Asp)-Tyr-Tyr-Arg-Gly-Gly-OH(胜肽P-54)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0286-373
C(Cys(CH2CONH2)-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Asp)-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-於Arg(Pbf)-Gly-Gly-OH(胜肽P-58、6.2mg)中，加入三氟乙酸/三異丙基矽烷/水(=9/1/1,v/v/v、1mL)並攪拌。4小時後，減壓濃縮並將獲得之殘渣以逆相矽膠層析(10mM乙酸銨水溶液/甲醇=95/5→0/100)精製，獲得C(Cys(CH2CONH2)-Thr-Thr-Thr-Arg-Asp)-Tyr-Tyr-Arg-Gly-Gly-OH(胜肽P-54)。(0.8mg、20%)
LCMS：664 m/z(M-2H)2-、1329.4(M-H)-
LCMS：1331.4 m/z(M+H)+
保持時間：0.49分(分析條件SQDAA05)
2-3.轉譯胜肽利用LC/MS分析所為之環化部位特定與結構決定
由製作了與轉譯合成品(胜肽P-54)具有相同序列之有機合成品，使用高分解能LC/MS裝置(Orbitrap Velos、Thermofisher Scientific公司製，USA)進行比較分析。針對轉譯品，於轉譯溶液約30uL加入0.5%三氟乙酸60uL並攪拌後，將離心分離上清通入Oasis HLB匣(30mg、1cc、Waters Corporation、USA)。以含0.5%三氟乙酸之5%乙腈溶液1mL
Figure 107130626-A0101-12-0287-328
洗滌後，以含0.5%三氟乙酸之60%乙腈溶液1mL溶出。將溶出液以氮氣乾固，再溶於含0.5%三氟乙酸之20%乙腈溶液60uL，供LC/MS分析。轉譯產物之精密質量以正離子模式測定之結果，於m/z 666.2937賦予2價之質子化分子[M+2H]2+，與理論值m/z 666.2935良好地為一致。將高速液體層析中的保持時間及MS/MS光譜圖案與有機合成品比較，結果均為良好地一致。由以上結果，可確認轉譯合成產物與有機合成所獲之環化胜肽相同(圖30)。
[實施例16]轉譯合成、環化後之脫硫反應
於以轉譯合成使醯胺環化反應進行的另一方面，必須為了吾人的目的將反應輔助基之SH基除去。SH基已知會與各種蛋白形成共價鍵，所以獲得SH基依存性鍵結的化合物的可能性高，另一方面，如此的化合物由於係高反應性，不易製成藥劑。
SH基之除去須要分子間反應。如既述，分子間反應於1uM濃度且各種反應性官能基共存之條件下達成的難易度高。使如此的反應達成的方手法，可考量以下2者。(i)過量使用之試藥，除了期望的反應點以外只會產生可逆反應(例如配位鍵結)，在反應完成後之後可利用處理除去。(ii)過量使用之試藥 在RNA完全無影響。
探討可通過如此之各種條件的反應基質與反應條件，結果如以下所示。
1.使用示範基質之自由基脫硫反應
使用示範基質即2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-(((R)-1-乙氧基-3-巰基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-5-側氧基戊酸(S)-苄酯(化合物3a)，與Wan等人(Angew.Chem.Int.Ed.2007,46,9248)以同樣方法，確認自由基脫硫反應進行(圖31及圖32)。自由基脫硫反應係進行MethodA及MethodB。
1-1.MethodA之實驗例
以下進行圖32記載之實驗。
1-1-1.圖32 Entry 1之實驗
2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-(((S)-1-乙氧基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-5-側氧基戊酸(S)-苄酯(化合物3b)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0288-2206
於2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-(((R)-1-乙氧基-3-巰基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-5-側氧基戊酸(S)-苄酯(化合物3a)(20.0mg、0.0427mmol)之DMF(0.8ml)溶液中，加入0.4M參(2-羧基乙基)膦(TCEP)水溶液(0.428ml、0.171mmol)，於室溫 攪拌15分鐘後，加入tBuSH(0.0144ml、0.128mmol)1M 2,2'-偶氮雙-2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷(VA-044)水溶液(0.0427ml、0.0427mmol)，於50度攪拌2小時半。之後於反應溶液加水稀釋後，以逆相矽膠管柱層析(10mM乙酸銨水溶液/甲醇=70/30→20/80)精製，獲得2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-(((S)-1-乙氧基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-5-側氧基戊酸(S)-苄酯(化合物3b)(18.1mg、97%)。
LCMS(ESI)m/z=437(M+H)+
保持時間：0.96分(分析條件SQDAA05)
反應使用之試藥等如以下方式製備。
0.4M參(2-羧基乙基)膦(TCEP)水溶液之製備
於參(2-羧基乙基)膦(TCEP)鹽酸鹽(1.0g、3.49mmol)之水(6.8ml)溶液中加入三乙胺(1.64ml)，調整成pH7，獲得0.4M參(2-羧基乙基)膦(TCEP)水溶液。
1M 2,2'-偶氮雙-2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷(VA-044)水溶液之製備
於2,2'-偶氮雙-2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷(VA-044)鹽酸鹽(100mg、0.309mmol)中加入水(0.309ml)，製備1M 2,2'-偶氮雙-2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷(VA-044)水溶液。
0.1M 2,2'-偶氮雙-2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷(VA-044)水溶液之製備
於2,2'-偶氮雙-2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷(VA-044)鹽酸鹽(100mg、0.309mmol)中加入水(3，09ml)，製備0.1M 2,2'-偶氮雙-2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷(VA-044)水溶液。
1-1-2.圖32 Entry2、Entry3之實驗
2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-(((S)-1-乙氧基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-5-側氧基戊酸(S)-苄酯(化合物3b)
於2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-(((R)-1-乙氧基-3-巰基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-5-側氧基戊酸(S)-苄酯(化合物3a)(10.0mg、0.0213mmol)之DMF(0.5ml)或甲醇(0.5ml)溶液中，加入麩胱甘肽(19.7mg、0.064mmol)與0.4M參(2-羧基乙基)膦(TCEP)水溶液(0.214ml、0.0852mmol)，於室溫攪拌10分鐘後，於室溫添加1M 2,2'-偶氮雙-2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷(VA-044)水溶液(0.0213ml、0.0213mmol)，於50度攪拌2小時。使用LCMS觀測反應之變化，entry2於2小時原料化合物3a完全消失，觀測到目的之化合物3b。
LCMS(ESI)m/z=437(M+H)+
保持時間：0.96分(分析條件SQDAA05)
1-1-3.圖32 Entry4之實驗
2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-(((S)-1-乙氧基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-5-側氧基戊酸(S)-苄酯(化合物3b)
於2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-(((R)-1-乙氧基-3-巰基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-5-側氧基戊酸(S)-苄酯(化合物3a)(10.0mg、0.0213mmol)之甲醇(4.66ml)、水(2.06ml)溶液中，加入0.4M參(2-羧基乙基)膦(TCEP)水溶液(0.268ml、0.107mmol)，於室溫攪拌10分鐘後，於室溫添加1M 2,2'-偶氮雙-2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷(VA-044)水溶液(0.0213ml、0.0213mmol)，於50度攪拌1小時。使用LCMS觀測反應之變 化，原料3a雖未完全消失，但觀測到目的化合物3b。再者，作為副產物也觀測到推定化合物3c、3d。其比例，依LCMS UV面積強度比，為原料化合物3a：目的化合物3b：3c：3d=7：20：16：11。
化合物3b
LCMS(ESI)m/z=437(M+H)+
保持時間：0.96分(分析條件SQDAA05)
結構推定化合物3c
LCMS(ESI)m/z=453(M+H)+
保持時間：0.91分(分析條件SQDAA05)
結構推定化合物3d
LCMS(ESI)m/z=337(M+H)+
保持時間：0.87分(分析條件SQDAA05)
1-1-4.圖32 Entry5之實驗
2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-(((S)-1-乙氧基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-5-側氧基戊酸(S)-苄酯(化合物3b)
於2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-(((R)-1-乙氧基-3-巰基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-5-側氧基戊酸(S)-苄酯(化合物3a)(10.0mg、0.0213mmol)之甲醇(4.66ml)、水(0.20ml)溶液中，加入麩胱甘肽(196mg、0.639mmol)與0.4M參(2-羧基乙基)膦(TCEP)水溶液(0.268ml、0.107mmol)，於室溫攪拌10分鐘後，於室溫添加1M 2,2'-偶氮雙-2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷(VA-044)水溶液(0.0213ml、0.0213mmol)，於50度攪拌1小時。使用LCMS觀測反應之變化，原料3a完全消失，觀測到目的化合物 3b。
LCMS(ESI)m/z=437(M+H)+
保持時間：0.96分(分析條件SQDAA05)
1-1-5.圖32 Entry6之實驗
2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-(((S)-1-乙氧基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-5-側氧基戊酸(S)-苄酯(化合物3b)
於2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-(((R)-1-乙氧基-3-巰基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-5-側氧基戊酸(S)-苄酯(化合物3a)(10.0mg、0.0213mmol)之甲醇(4.66ml)、水(2.06ml)溶液中，添加麩胱甘肽(19。6mg、0.0639mmol)與0.4M參(2-羧基乙基)膦(TCEP)水溶液(0.268ml、0.107mmol)，於室溫攪拌10分鐘後，於室溫添加1M 2,2'-偶氮雙-2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷(VA-044)水溶液(0.0213ml、0.0213mmol)，於50度攪拌1小時。使用LCMS觀測反應之變化，原料3a完全消失，觀測到目的化合物3b。再者，作為副產物也觀測到推定化合物3c、3d。其比例，依LCMS UV面積強度比，為原料化合物3a：目的化合物3b：3c：3d=0：79：14：6。
化合物3b
LCMS(ESI)m/z=437(M+H)+
保持時間：0.96分(分析條件SQDAA05)
結構推定化合物3c
LCMS(ESI)m/z=453(M+H)+
保持時間：0.91分(分析條件SQDAA05)
結構推定化合物3d
LCMS(ESI)m/z=337(M+H)+
保持時間：0.87分(分析條件SQDAA05)
1-1-6.圖32 Entry7之實驗
2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-(((S)-1-乙氧基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-5-側氧基戊酸(S)-苄酯(化合物3b)
於2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-(((R)-1-乙氧基-3-巰基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-5-側氧基戊酸(S)-苄酯(化合物3a)(10.0mg、0.0213mmol)之甲醇(0.5ml)溶液中，加入0.4M參(2-羧基乙基)膦(TCEP)水溶液(0.268ml、0.107mmol)，於室溫攪拌10分鐘後，於室溫添加1M 2,2'-偶氮雙-2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷(VA-044)水溶液(0.0213ml、0.0213mmol)，於50度攪拌1小時。使用LCMS觀測反應之變化，原料3a完全消失，觀測到目的化合物3b。再者，作為副產物也觀測到推定化合物3c、3d。其比例為，依LCMS UV面積強度比為原料化合物3a：目的化合物3b：3c：3d=0：24：32：19。
化合物3b
LCMS(ESI)m/z=437(M+H)+
保持時間：0.96分(分析條件SQDAA05)
結構推定化合物3c
LCMS(ESI)m/z=453(M+H)+
保持時間：0.91分(分析條件SQDAA05)
結構推定化合物3d
LCMS(ESI)m/z=337(M+H)+
保持時間：0.87分(分析條件SQDAA05)
1-2.Method B之實驗例
依與Method A大致相同之製造方法，於2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-(((R)-1-乙氧基-3-巰基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-5-側氧基戊酸(S)-苄酯(化合物3a)之MeOH-H2O溶液中加入0.4M參(2-羧基乙基)膦(TCEP)水溶液、麩胱甘肽，加熱到目的之反應溫度30度、40度或50度後，添加1M 2,2'-偶氮雙-2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷(VA-044)水溶液，維持於30度、40度或50度之反應溫度攪拌。使用LC-MS觀測反應之經時變化。
又，0.4M參(2-羧基乙基)膦(TCEP)水溶液之製備依以下方式進行。
於參(2-羧基乙基)膦(TCEP)鹽酸鹽(1.0g、3.49mmol)之水(6.8ml)溶液中加入三乙胺(1.64ml)，調整為pH7，獲得0.4M參(2-羧基乙基)膦(TCEP)水溶液。
又，1M 2,2'-偶氮雙-2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷(VA-044)水溶液之製備依以下方式進行。
於2,2'-偶氮雙-2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷(VA-044)鹽酸鹽(100mg、0.309mmol)中加入水(0.309ml)，製備1M 2,2'-偶氮雙-2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷(VA-044)水溶液。
1-2-1.圖32 Entry8之實驗
2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-(((S)-1-乙氧基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-5-側氧基戊酸(S)-苄酯(化合物3b)
於2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-(((R)-1-乙氧基-3-巰基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-5-側氧基戊酸(S)-苄酯(化合物3a)(1.1mg、0.0023mmol)之甲醇(0.5ml)，水(0.06ml)溶液中， 加入0.4M參(2-羧基乙基)膦(TCEP)水溶液(0.192ml、0.092mmol)，於50度攪拌10分鐘後，於50度添加0.1M 2,2'-偶氮雙-2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷(VA-044)水溶液(0.023ml、0.0023mmol)，之後，於50度攪拌30分鐘。使用LCMS觀測反應之變化，原料3a完全消失，觀測到目的化合物3b。
LCMS(ESI)m/z=437(M+H)+
保持時間：0.95分(分析條件SQDAA05)
1-2-2.圖32 Entry9之實驗
2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-(((S)-1-乙氧基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-5-側氧基戊酸(S)-苄酯(化合物3b)
於2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-(((R)-1-乙氧基-3-巰基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-5-側氧基戊酸(S)-苄酯(化合物3a)(1.1mg、0.0023mmol)之甲醇(0.5ml)，水(0.06ml)溶液，添加麩胱甘肽(21.2mg、0.069mmol)與0.4M參(2-羧基乙基)膦(TCEP)水溶液(0.192ml、0.092mmol)，於50度攪拌10分鐘後，於50度添加0.1M 2,2'-偶氮雙-2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷(VA-044)水溶液(0.023ml、0.0023mmol)，之後，於50度攪拌30分鐘。使用LCMS觀測反應之變化，原料3a完全消失，觀測到目的化合物3b。
LCMS(ESI)m/z=437(M+H)+
保持時間：0.95分(分析條件SQDAA05)
1-2-3.圖32 Entry10之實驗
2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-(((S)-1-乙氧基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-5-側氧基戊酸(S)-苄酯(化合物3b)
於2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-(((R)-1-乙氧基-3-巰基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-5-側氧基戊酸(S)-苄酯(化合物3a)(1.1mg、0.0023mmol)之甲醇(0.5ml)，水(0.06ml)溶液中，添加0.4M參(2-羧基乙基)膦(TCEP)水溶液(0.192ml、0.092mmol)，於40度攪拌15分鐘後，於40度添加0.1M 2,2'-偶氮雙-2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷(VA-044)水溶液(0.023ml、0.0023mmol)，於40度攪拌30分鐘。使用LCMS觀測反應之變化，原料3a完全消失，觀測到目的化合物3b。
LCMS(ESI)m/z=437(M+H)+
保持時間：0.96分(分析條件SQDAA05)
1-2-4.圖32 Entry11之實驗
2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-(((S)-1-乙氧基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-5-側氧基戊酸(S)-苄酯(化合物3b)
於2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-(((R)-1-乙氧基-3-巰基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-5-側氧基戊酸(S)-苄酯(化合物3a)(1.1mg、0.0023mmol)之甲醇(0.5ml)，水(0.06ml)溶液中，添加麩胱甘肽(21.2mg、0.069mmol)與0.4M參(2-羧基乙基)膦(TCEP)水溶液(0.192ml、0.092mmol)，於40度攪拌15分鐘後，於40度添加0.1M 2,2'-偶氮雙-2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷(VA-044)水溶液(0.023ml、0.0023mmol)，之後於40度攪拌30分鐘。使用LCMS觀測反應之變化，原料3a完全消失，觀測到目的化合物3b。
LCMS(ESI)m/z=437(M+H)+
保持時間：0.95分(分析條件SQDAA05)
1-2-5.圖32 Entry12之實驗
2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-(((S)-1-乙氧基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-5-側氧基戊酸(S)-苄酯(化合物3b)
於2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-(((R)-1-乙氧基-3-巰基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-5-側氧基戊酸(S)-苄酯(化合物3a)(1.1mg、0.0023mmol)之甲醇(0.5ml)，水(0.06ml)溶液中，添加0.4M參(2-羧基乙基)膦(TCEP)水溶液(0.192ml、0.092mmol)，於30度攪拌15分鐘後，於30度添加0.1M 2,2'-偶氮雙-2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷(VA-044)水溶液(0.023ml、0.0023mmol)，之後於30度攪拌1小時30分鐘。使用LCMS觀測反應之變化，原料3a完全消失，觀測到目的化合物3b。
LCMS(ESI)m/z=437(M+H)+
保持時間：0.95分(分析條件SQDAA05)
1-2-6.圖32 Entry13之實驗
2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-(((S)-1-乙氧基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-5-側氧基戊酸(S)-苄酯(化合物3b)
於2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-(((R)-1-乙氧基-3-巰基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-5-側氧基戊酸(S)-苄酯(化合物3a)(1.1mg、0.0023mmol)之甲醇(0.5ml)，水(0.06ml)溶液中，添加麩胱甘肽(21.2mg、0.069mmol)與0.4M參(2-羧基乙基)膦(TCEP)水溶液(0.192ml、0.092mmol)，於30度攪拌15分鐘後，於30度添加0.1M 2,2'-偶氮雙-2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷(VA-044)水溶液(0.023ml、0.0023mmol)，之後於30度攪拌1小時30分鐘。使用LCMS觀測反應之變化，原料3a完全消失， 觀測到目的化合物3b。
LCMS(ESI)m/z=437(M+H)+
保持時間：0.95分(分析條件SQDAA05)
如圖32所示，以各種條件探討自由基脫硫反應。Entry4,6，7中，硫醇之總量為低濃度之情形，於methodA觀測到3c、3d為副產物。為了適應展示庫(Display library)(胜肽低濃度)，探討即使硫醇為低濃度也不生成副產物3c，3d之條件，結果，於反應溶液加熱下加入自由基開始劑(VA-044)
Figure 107130626-A0101-12-0298-329
(MethodB)，可抑制副產物3c，3d之生成。(entry8，10，12)
結果，找到使於側鏈具有硫酯之天冬胺酸衍生物作為羧酸衍生物進行轉譯導入，並且將作為胺基之Cys或其衍生物轉譯導入N末端後，將其環化之方法。於利用initiataion read-through法於N末端導入Cys之情形，藉由將Asp(SBn)轉譯導入於胜肽，可獲得目的之環狀胜肽。
2.脫硫反應之RNA安定性評價
將RNA化合物提供為脫硫反應之條件進行安定性之確認。
2-1.5'-AGCUUAGUCA-嘌呤黴素(puromycin)-3'(化合物RP-1、(序列編號：178))之合成
使用Glenresearch公司製嘌呤黴素CPG(22.7mg、0.999μmol)，以DNA合成機實施RNA鍵結伸長。A、G、C、U之伸長反應使用之醯胺(Amidite)試藥，使用Glenresearch公司製A-TOM-CE亞磷醯胺、G-TOM-CE亞磷醯胺、C-TOM-CE亞磷醯胺、U-TOM-CE亞磷醯胺，縮合活化劑使用5-苄硫基-1H-四唑實施。將縮合後之固相擔體乾燥 後，添加乙醇(0.25mL)、40%甲胺水溶液(0.25mL)，於65℃攪拌1小時。將固相擔體分濾，以甲醇(0.5mL)洗滌。將獲得之溶液濃縮並溶於甲醇(1.0mL)，將其中的0.8mL濃縮，溶於四甲基氟化銨水合物(50μL)，於65℃攪拌15分鐘。於反應液中加入0.1M乙酸銨水溶液，以逆相管柱精製。濃縮後，將獲得之化合物再度以逆相管柱精製。於獲得之溶液加水，含浸於逆相管柱後，以水(30mL)洗滌後，以甲醇(50mL)使目的物溶出。將獲得之溶液濃縮，溶於水(1.0mL)，獲得5'-AGCUUAGUCA-嘌呤黴素-3'(化合物RP-1)水溶液。
LCMS(ESI)m/z=1224.6(M-3H)3-
保持時間：0.38分(分析條件SQDAA05)
2-2.利用脫硫反應所為之2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-(((S)-1-乙氧基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-5-側氧基戊酸(S)-苄酯(化合物5e-2)之合成及其反應條件中之5'-AGCUUAGUCA-嘌呤黴素-3'(化合物RP-1)之安定性評價
Figure 107130626-A0101-12-0299-375
將5'-AGCUUAGUCA-嘌呤黴素-3'(化合物RP-1)水溶液(10μL)、作為標準物質之5mM 3-苯基苯甲酸甲醇溶液(10μL)、5mM 2-((第三丁氧羰基)胺基)-4-(((R)-1-乙氧基-3- 巰基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-4-側氧基丁酸(S)-苄酯(化合物5c-2)甲醇溶液(5μL)、100mM麩胱甘肽水溶液(15μL)、使用三乙胺並預先調整為pH7.1之0.4M參(2-羧基乙基)膦(TCEP)水溶液(5μL)、10mM 2,2'-偶氮雙-2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷水溶液(5μL)混合，於50℃反應2小時。將反應液以LC/MS分析，確認5'-AGCUUAGUCA-嘌呤黴素-3'(化合物RP-1)之殘存量無變化。於該條件中，2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-(((R)-1-乙氧基-3-巰基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-5-側氧基戊酸(S)-苄酯(化合物5c-2)消失，確認係脫硫反應之產物2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-(((S)-1-乙氧基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-5-側氧基戊酸(S)-苄酯(化合物5e-2)。
LCMS(ESI)m/z=437.3(M+H)+
保持時間：0.96分(分析條件SQDAA05)
以此方式，確認在脫硫反應進行之反應條件，RNA未反應而安定存在。
2.使用轉譯產物之脫硫反應
依以下方法進行轉譯。
模板DNA序列編號D-34使用以下序列，進行轉譯反應。
序列編號D-34(序列編號：29)Mctryg3_08U05U：
Figure 107130626-A0101-12-0300-376
反應系中，胺基酸係加入除了甲硫胺酸以外的19 種蛋白質性胺基酸。其結果，合成開始密碼子所編碼之甲硫胺酸欠缺且從第二號密碼子所編碼之半胱胺酸開始轉譯的胜肽。於此反應液中加入VA-044(250mM)、TCEP(200mM)、L-半胱胺酸(20mM)，於40℃反應1小時。其結果，確認胜肽鏈中之半胱胺酸側鏈之SH基脫硫，分子量減少32之MS光譜(圖33)。
胜肽編號P-50脫硫前(序列編號：38)CysThrThrThrArgLeuTyrTyrArgGlyGly(Calc.1289.6)
胜肽編號P-51脫硫後(序列編號：58)AlaThrThrThrArgLeuTyrTyrArgGlyGly m/z：[M+H]+=1258.7(Calc.1257.7)
[實施例17]環化脫硫反應下之蛋白改性之評價
利用脫硫反應液進行蛋白質改性之評價(圖34)。作為示範系，於利用電氣化學發光免疫測定法所為之IL-6及IL-6R之交互作用檢測系中，評價脫硫反應條件對於IL-6R會有如何的影響。首先，於MSD Multi-array 384 well(MSD公司)將750ng之抗IL-6R抗體選殖體編號17506(R&D biosystems公司)以4度保存一晚，進行抗體之固相化。以80μl之PBST將板洗滌三次，去除未反應之抗體後，以2%脫脂乳進行1小時阻斷。將阻斷劑以80μlPBST將板洗滌三次後，添加10μl之soluble human IL-6R(IL-6R)25nM，於室溫振盪50分鐘。以80μl之PBST將板洗滌三次，添加脫硫反應液(25mM HEPES-K(pH7.6)，200mM TCEP，250mM VA-044，10mM Cys)，於室溫振盪50 分鐘。以80μl之PBST將板洗滌三次，添加10μl之human IL-6-BAP(500nM)，於室溫振盪50分鐘。以80μl之PBST將板洗滌三次，添加10μL SULFO-TAG StAv(MSD公司，cat # R32AD-5，1μg/mL)後，於室溫振盪50分鐘。以80μl之PBST將板洗滌三次，添加35μl之2X read buffer(MSD公司，R92SC-3)後，以SECTOR Imager 2400(MSD公司)測定(圖34)。
其結果，添加脫硫反應液，使IL6-R受影響，顯示與IL-6之交互作用減弱。又，藉由於脫硫反應液添加氧化型之DTT(DTTox)，對IL-6R之影響減弱，顯示與IL-6之交互作用回復。
[實施例18]與硫醚化法之比較
比較硫醚環化法與本發明之環化法。合成據認為脂質膜穿透速度快的脂溶性高的硫醚環化胜肽。
1.硫醚環化胜肽之合成
Fmoc胺基酸使用Fmoc-MePhe-OH、Fmoc-MeAla-OH、Fmoc-MeLeu-OH、Fmoc-MeGly-OH、Fmoc-MeIle-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(Trt)-OH、Fmoc-Ser(Trt)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Bip-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Cha-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Cys(Mmt)OH等，進行胜肽之伸長(簡稱係依渡邊化學型錄)。胜肽伸長後，將N末端之Fmoc基脫保護，將HOAt，DIC作為縮合劑使氯乙酸縮合後，將樹脂以二氯甲烷洗滌。於樹脂加入三氟乙酸/二氯甲烷/2,2，2-三氟乙醇/三異丙基矽烷(=1/62/31/6，v/v/v/v、4mL)，反應2小時，從樹脂切出胜肽，同時進行O-三苯甲基、S-二甲氧基三苯甲基之脫保 護。反應結束後，將管內溶液以合成用管柱過濾，去除樹脂，並將反應液加入裝有二異丙基乙胺(1mL)溶液之管，進行氯乙醯與半胱胺酸之環化反應。反應結束後，將溶劑餾去。將得到之粗產物於DMF中，以哌啶(1.9eq.)O-(7-氮雜-1H苯并三唑-1-基)-N,N，N,N四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)(1.7eq.)進行C末端羧酸之哌啶醯胺化。反應結束後，以Genevac將溶劑餾去。將獲得之粗產物溶於二甲基亞碸，將獲得之胜肽溶液以高速逆相層析(HPLC)精製。
化合物P-101 Ac*-MePhe-MeAla-MePhe-MeLeu-Thr-MeGly-MeLeu-Cys*-哌啶(於2個*部位環化)
Figure 107130626-A0101-12-0303-2208
LCMS：1063 m/z(M+H)+
保持時間：0.77分(分析條件SQDAA50)
化合物P-102 Ac*-MeAla-MePhe-MeLeu-Thr-MeGly-MeLeu-Ser(tBu)-Cys*-哌啶(2個*部位環化)
Figure 107130626-A0101-12-0304-378
LCMS：1045 m/z(M+H)+
保持時間：0.76分(分析條件SQDAA50)
化合物P-103 Ac*-MePhe-MeLeu-Thr-MeGly-MeLeu-Ser(tBu)-MeIle-Cys*-哌啶(2個*部位環化)
Figure 107130626-A0101-12-0304-2209
LCMS：1087 m/z(M+H)+
保持時間：2.72分(分析條件ZQAA50)
化合物P-104 Ac*-MeLeu-Thr-MeGly-MeLeu-Ser-MeIle-Bip-Cys*-哌啶(2個*部位環化)
Figure 107130626-A0101-12-0305-380
LCMS：1093 m/z(M+H)+
保持時間：2.52分(分析條件ZQAA50)
化合物P-105 Ac*-MePhe-MeAla-Phe-MeLeu-Thr-MeGly-MeLeu-Cys*-哌啶(2個*部位環化)
Figure 107130626-A0101-12-0305-2211
LCMS：1049 m/z(M+H)+
保持時間：0.77分(分析條件SQDAA50)
化合物P-106 Ac*-MeAla-Phe-MeLeu-Thr-MeGly-MeLeu-Ser(tBu)-Cys*-哌啶(2個*部位環化)
Figure 107130626-A0101-12-0306-382
LCMS：1031 m/z(M+H)+
保持時間：0.74分(分析條件SQDAA50)
化合物P-107 Ac*-Phe-MeLeu-Thr-MeGly-MeLeu-Ser(tBu)-MeIle-Cys*-哌啶(2個*部位環化)
Figure 107130626-A0101-12-0306-383
LCMS：1073 m/z(M+H)+
保持時間：0.82分(分析條件SQDAA50)
化合物P-108 Ac*-MePhe-MeAla-MePhe-MeLeu-Thr-MeGly-MeLeu-Ser(tBu)-Cys*-哌啶(2個*部位環化)
Figure 107130626-A0101-12-0306-384
LCMS：1206 m/z(M+H)+
保持時間：2.60分(分析條件ZQAA50)
化合物P-109 Ac*-MeAla-MePhe-MeLeu-Thr-MeGly-MeLeu-Ser(tBu)-MeIle-Cys*-哌啶(2個*部位環化)
Figure 107130626-A0101-12-0307-385
LCMS：1172 m/z(M+H)+
保持時間：2.75分(分析條件ZQAA50)
化合物P-110 Ac*-MePhe-MeAla-Phe-MeLeu-Thr-MeGly-MeLeu-Ser(tBu)-Cys*-哌啶(2個*部位環化)
Figure 107130626-A0101-12-0307-386
LCMS：1192 m/z(M+H)+
保持時間：0.81分(分析條件SQDAA50)
化合物P-111 Ac*-MeAla-Phe-MeLeu-Thr-MeGly-MeLeu-Ser(tBu)-MeIle-Cys *-哌啶(2個*部位環化)
Figure 107130626-A0101-12-0308-387
LCMS：1158 m/z(M+H)+
保持時間：2.75分(分析條件ZQAA50)
化合物P-112 Ac*-MePhe-MeAla-MePhe-MeLeu-Thr-MeGly-MeLeu-Ser(tBu)-MeIle-Cys*-哌啶(2個*部位環化)
Figure 107130626-A0101-12-0308-2212
LCMS：1333 m/z(M+H)+
保持時間：2.87分(分析條件ZQAA05)
化合物P-113 Ac*-Leu-MeAla-Cha-Thr-Thr-Ala-Cys*-Cha-哌啶(2個*部位環化)
Figure 107130626-A0101-12-0308-389
LCMS：1007 m/z(M+H)+
保持時間：2.46分(分析條件ZQAA50)
2.安定性之評價
2-1.硫醚環化胜肽之血清安定性、肝微體中安定性試驗
將獲得之化合物於2uM之濃度與小鼠血清(雄雌混合、Valley Biomedical公司、USA)(以33.5mM HEPES緩衝液調整為pH7.4)進行2小時代謝反應。隨時間經過以乙腈施行除蛋白處理，使用LC/MS分析殘存之未變化體量，並計算代謝半減期(t1/2)。於NADPH存在下及非存在下，將小鼠肝微體及小腸微體(雄、XENOTECH公司、USA)以100mM磷酸緩衝液(pH7.4)調整為0.5mg protein/mL之微體溶液與化合物以1uM之濃度進行30分鐘代謝反應。隨時間經過以乙腈施行除蛋白處理，並使用LC/MS分析殘存之未變化體量，計算肝固有廓清(CLh，int)及小腸固有廓清(CLg，int)。(表7)。該等胜肽於小鼠血清中及微體中受到肽酶等水解所為之代謝之速度十分緩慢，比起由脂溶性低之天然胺基酸構成的胜肽，成為對照的結果。相較於該等結果，可知於微體中NADPH存在下之代謝速度高，代謝之主要路徑係氧化代謝。
【表7】
Figure 107130626-A0101-12-0310-390
 表7之各胜肽係於Ac部位與C部位環化。
2-2.代謝安定性較高之硫醚環化胜肽及硫醚部位之氧化化合物(亞碸體及碸體)之人類肝微體中代謝安定性試驗、小鼠小腸微體中代謝安定性試驗
以2-1.所示為同樣之實驗，進行代謝安定性試驗。
實施於小鼠之代謝安定性較高之硫醚化合物在小腸之代謝安定性試驗及於人類之肝微體中之代謝安定性試驗(化合物P-112、103、102、109)。在人類之肝微體之代謝安定性，相較於小鼠的情形，約有3倍惡化。
然後，測定使化合物P-112(序列Ac*-MeA-MeF-MeL-Thr-MeG-MeL-SertBu-MeI-Cys*-哌啶)之S原子氧化而得之亞碸體(化合物P-114)之肝及小腸氧化代謝速度，結果，相較於化合物P-112，於小鼠肝成為0.6倍、人 類肝成為約0.3倍、小腸成為約0.2倍，在人類肝及小腸代謝觀測到改善(表8)。碸體P-115之小腸氧化代謝速度成為0.5倍。
硫醚至亞碸的變換的代謝安定化，在小鼠之肝微體也有一些其他之合成檢體有觀測到(表9)。
Figure 107130626-A0101-12-0311-391
 表8之胜肽於Ac部位與C部位環化。
【表9】
Figure 107130626-A0101-12-0312-392
 表9之胜肽於Ac部位與C部位環化。
3.代謝部位之特定
將化合物P-113環化胜肽於10uM之濃度在NADPH存在下，與將小鼠肝臓(雄、XENOTECH公司製，USA)使用100mM磷酸緩衝液(pH7.4)調整為0.5mg protein/mL之微體溶液進行1小時代謝反應(圖35)。反應後以乙腈施行除蛋白處理，將獲得之代謝產物以高分解性能LC/MS裝置(Q-TOF Ultima API、Waters Corporation公司製，USA)分析。代謝產物之質譜層析圖如以下所示。就強度較強之代謝產物，檢測到相當於氫氧化體之峰部4根。各峰部之MS/MS光譜如下。針對Peak1及Peak2之代謝物，推測含高脂溶性側鏈之環己基之次結構受到氫氧化。針對Peak3之代謝物，提供哌啶環受氫氧化時之特徵的離子m/z 102，但也提供與Peak1及Peak2為類似的斷片離子，啟示於Peak3中存在Peak1與Peak2之類似物，或由於分離不 充分而有Peak1及Peak2混入之可能性。推測Peak4之代謝物其含硫醇之部位已氧化，但是若考慮此部位之氧化容易度，據認為硫原子為代謝部位之可能性高。
4.硫醚環化胜肽之直接氧化反應
為了更指明代謝部位，使獲得之硫醚環化胜肽直接氧化反應。對於硫醚體衍生物若使用四氫呋喃使直接氧化，甲硫胺酸衍生物(胜肽P-130)會被選擇性氧化，另一方面，確認色胺酸衍生物(胜肽P-132)在同一條件下不會進行氧化反應。使用本條件將一些硫醚體(胜肽P-109、P-112、P-111、P-103)之硫醚部分選擇性氧化獲得胜肽P-114、P-115、P-116、P-117、P-118。
18-4-1.(5S，8S，11S，14S，20S，23S，26S，29R)-8-苄基-23-(第三丁氧基甲基)-26-((S)-第二丁基)-14-((R)-1-羥基乙基)-11,20-二異丁基-4,5,7,10,16,19,25-七甲基-29-(哌啶-1-羰基)-1-硫雜-4,7,10,13,16,19,22,25,28-九氮雜環三十烷-3,6,9,12,15,18,21,24,27-壬酮1-氧化物(化合物P-114)之合成Ac*-MeAla-MePhe-MeLeu-Thr-MeGly-MeLeu-Ser(tBu)-MeIle-Cys*-哌啶化合物(2個*環化，化合物P-109)之亞碸體
Figure 107130626-A0101-12-0313-2214
將(5S，8S，11S，14S，20S，23S，26S，29R)-8-苄基-23-(第三丁氧基甲基)-26-((S)-第二丁基)-14-((R)-1-羥基 乙基)-11,20-二異丁基-4,5,7,10,16,19,25-七甲基-29-(哌啶-1-羰基)-1-硫雜-4,7,10,13,16,19,22,25,28-九氮雜環三十烷-3,6,9,12,15,18,21,24,27-壬酮(化合物P-109)(9.5mg、8.11x10-3mmol)溶於甲醇(0.5ml)，並加水(0.25ml)。邊攪拌溶液邊於冰浴冷卻，添加OXONE(5.5mg、8.92x10-3mmol)。將反應混合物於冰冷下攪拌25分鐘後，添加DMSO(80μl)。將混合物以逆相矽膠管柱層析(10mM乙酸銨水溶液/甲醇=60/40→0/100)精製，獲得(5S，8S，11S，14S，20S，23S，26S，29R)-8-苄基-23-(第三丁氧基甲基)-26-((S)-第二丁基)-14-((R)-1-羥基乙基)-11,20-二異丁基-4,5,7,10,16,19,25-七甲基-29-(哌啶-1-羰基)-1-硫雜-4,7,10,13,16,19,22,25,28-九氮雜環三十烷-3,6,9,12,15,18,21,24,27-壬酮1-氧化物(化合物P-114)(8.6mg、90%)。
LCMS(ESI)m/z=1187(M+H)+
保持時間：2.48分、2.62分(分析條件ZQAA50)
18-4-2.(5S，8S，11S，14S，20S，23S，26S，29R)-8-苄基-23-(第三丁氧基甲基)-26-((S)-第二丁基)-14-((R)-1-羥基乙基)-11,20-二異丁基-4,5,7,10,16,19,25-七甲基-29-(哌啶-1-羰基)-1-硫雜-4,7,10,13,16,19,22,25,28-九氮雜環三十烷-3,6,9,12,15,18,21,24,27-壬酮1,1-二氧化物(化合物P-115)之合成Ac*-MeAla-MePhe-MeLeu-Thr-MeGly-MeLeu-Ser(tBu)-MeIle-Cys*-哌啶化合物(於2個*環化，化合物P-109)之碸體
Figure 107130626-A0101-12-0315-394
將(5S，8S，11S，14S，20S，23S，26S，29R)-8-苄基-23-(第三丁氧基甲基)-26-((S)-第二丁基)-14-((R)-1-羥基乙基)-11,20-二異丁基-4,5,7,10,16,19,25-七甲基-29-(哌啶-1-羰基)-1-硫雜-4,7,10,13,16,19,22,25,28-九氮雜環三十烷-3,6,9,12,15,18,21,24,27-壬酮(9.6mg、8.19x10-3mmol)溶於甲醇(0.6ml)，並加水(0.3ml)。邊攪拌溶液邊添加OXONE(15.1mg、2.46x10-2mmol)。將反應混合物於室溫攪拌14小時後，添加DMSO(80μl)。將混合物以逆相矽膠管柱層析(10mM乙酸銨水溶液/甲醇=60/40→0/100)精製，獲得5S，8S，11S，14S，20S，23S，26S，29R)-8-苄基-23-(第三丁氧基甲基)-26-((S)-第二丁基)-14-((R)-1-羥基乙基)-11,20-二異丁基-4,5,7,10,16,19,25-七甲基-29-(哌啶-1-羰基)-1-硫雜-4,7,10,13,16,19,22,25,28-九氮雜環三十烷-3,6,9,12,15,18,21,24,27-壬酮1,1-二氧化物(8.3mg、84%)。
LCMS(ESI)m/z=1203(M+H)+
保持時間：0.82分(分析條件SQDAA50)
18-4-3.(5S，8S，11S，14S，17S，23S，26S，29S，32R)-5,11-二苄基-26-(第三丁氧基甲基)-29-((S)-第二丁基)-17-((R)-1-羥基乙基)-14,23-二異丁基-4,7,8,10,13,19,22,28-八甲基-32-(哌啶-1-羰基)-1-硫雜 -4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-十氮雜環三十三烷-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-癸酮1-氧化物(化合物P-116)之合成Ac*-MePhe-MeAla-MePhe-MeLeu-Thr-MeGly-MeLeu-Ser(tBu)-MeIle-Cys*-哌啶(化合物P-112)之直接氧化所得之亞碸體
Figure 107130626-A0101-12-0316-395
與18-4-1.以同樣方法，從(5S，8S，11S，14S，17S，23S，26S，29S，32R)-5,1-二苄基-26-(第三丁氧基甲基)-29-((S)-第二丁基)-17-((R)-1-羥基乙基)-14,23-二異丁基-4,7,8,10,13,19,22,28-八甲基-32-(哌啶-1-羰基)-1-硫雜-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-十氮雜環三十三烷-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-癸酮(16.9mg、1.27x10-2mmol)獲得5S，8S，11S，14S，17S，23S，26S，29S，32R)-5,11-二苄基-26-(第三丁氧基甲基)-29-((S)-第二丁基)-17-((R)-1-羥基乙基)-14,23-二異丁基-4,7,8,10,13,19,22,28-八甲基-32-(哌啶-1-羰基)-1-硫雜-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-十氮雜環三十三烷-3,6,9,12,15,18,21,24,27，30-癸酮1-氧化物(11.6mg、68%)。
LCMS(ESI)m/z=1348(M+H)+
保持時間：0.84分(分析條件SQDAA50)
18-4-4.(5S，8S，11S，14S，20S，23S，26S，29R)-8-苄基-23-(第三丁氧基甲基)-26-((S)-第二丁基)-14-((R)-1-羥基乙基)-11,20-二異丁基-4,5,10,16,19,25-六甲基-29-(哌啶-1-羰 基)-1-硫雜-4,7,10,13,16,19,22,25,28-九氮雜環三十烷-3,6,9,12,15,18,21,24,27-壬酮1-氧化物(化合物P-117)之合成Ac*-MeAla-Phe-MeLeu-Thr-MeGly-MeLeu-Ser(tBu)-MeIle-Cys*-哌啶(化合物P-111)之直接氧化所得之亞碸體(化合物P-117)
Figure 107130626-A0101-12-0317-2216
與18-4-1.以同樣方法，從(5S，8S，11S，14S，20S，23S，26S，29R)-8-苄基-23-(第三丁氧基甲基)-26-((S)-第二丁基)-14-((R)-1-羥基乙基)-11,20-二異丁基-4,5,10,16,19,25-六甲基-29-(哌啶-1-羰基)-1-硫雜-4,7,10,13,16,19,22,25,28-九氮雜環三十烷-3,6,9,12,15,18,21,24,27-壬酮(12.5mg、1.08x10-2mmol)，獲得(5S，8S，11S，14S，20S，23S，26S，29R)-8-苄基-23-(第三丁氧基甲基)-26-((S)-第二丁基)-14-((R)-1-羥基乙基)-11,20-二異丁基-4,5,10,16,19,25-六甲基-29-(哌啶-1-羰基)-1-硫雜-4,7,10,13,16,19,22,25,28-九氮雜環三十烷-3,6,9,12,15,18,21,24,27-壬酮1-氧化物(10.5mg、83%)。
LCMS(ESI)m/z=1173(M+H)+
保持時間：2.57分(分析條件ZQAA50)
18-4-5.(5S，8S，11S，17S，20S，23S，26R)-5- 苄基-20-(第三丁氧基甲基)-23-((S)-第二丁基)-11-((R)-1-羥基乙基)-8，17-二異丁基-4,7,13,16,22-五甲基-26-(哌啶-1-羰基)-1-硫雜-4,7,10,13,16,19,22,25-八氮雜環二十七烷-3,6,9,12,15,18,21,24-辛酮1-氧化物(化合物P-118)之合成化合物P-103之利用直接氧化反應所為之合成
Figure 107130626-A0101-12-0318-397
與18-4-1.以同樣的方法，從((5S，8S，11S，17S，20S，23S，26R)-5-苄基-20-(第三丁氧基甲基)-23-((S)-第二丁基)-11-((R)-1-羥基乙基)-8，17-二異丁基-4,7,13,16,22-五甲基-26-(哌啶-1-羰基)-1-硫雜-4,7,10,13,16,19,22,25-八氮雜環二十七烷-3,6,9,12,15,18,21,24-辛酮(21.4mg、1.97x10-2mmol)獲得18-4-5.(5S，8S，11S，17S，20S，23S，26R)-5-苄基-20-(第三丁氧基甲基)-23-((S)-第二丁基)-11-((R)-1-羥基乙基)-8，17-二異丁基-4,7,13,16,22-五甲基-26-(哌啶-1-羰基)-1-硫雜-4,7,10,13,16,19,22,25-八氮雜環二十七烷-3,6,9,12,15,18,21,24-辛酮1-氧化物(16.8mg、77%)。
LCMS(ESI)m/z=1102(M+H)+
保持時間：0.80分(分析條件SQDAA50)
18-4-6.(S)-2-(9H-茀-9-基甲氧基羰胺基)-4-甲基硫烷基-丁酸之氧化
Figure 107130626-A0101-12-0319-398
將(S)-2-(9H-茀-9-基甲氧基羰胺基)-4-甲基硫烷基-丁酸(胜肽P-130、38mg、0.102mmol)於室溫溶於甲醇(2mL)，加水(0.2mL)後，於冰浴冷卻。於混合物添加OXONE(69mg、0.113mmol)，將反應混合物攪拌20分鐘後，添加DMSO(100μL)。以LCMS確認反應進行，結果呈現在與原料不同之保持時間有單一峰部(胜肽P-131)。
(S)-2-(9H-茀-9-基甲氧基羰胺基)-4-甲基硫烷基-丁酸(胜肽P-130)
LCMS(ESI)m/z=372(M+H)+
保持時間：0.94分(分析條件SQDAA05)
產物P-131
LCMS(ESI)m/z=388(M+H)+
保持時間：0.86分(分析條件SQDAA05)
18-4-7.(S)-2-(9H-茀-9-基甲氧基羰胺基)-3-(1H-吲哚-3-基)-丙酸‧2-異丙氧基-丙烷(1：2/3)之氧化
Figure 107130626-A0101-12-0320-399
將(S)-2-(9H-茀-9-基甲氧基羰胺基)-3-(1H-吲哚-3-基)-丙酸‧2-異丙氧基-丙烷(胜肽P-132、1：2/3)(50mg、0.101mmol)於室溫溶於甲醇(2mL)，加水(0.2mL)後，於冰浴冷卻。於混合物添加OXONE(68mg、0.113mmol)，將反應混合物攪拌20分鐘後，添加DMSO(100μL)。以LCMS確認反應進行，結果呈現與原料相同之峰部。
(S)-2-(9H-茀-9-基甲氧基羰胺基)-3-(1H-吲哚-3-基)-丙酸(胜肽P-132)
LCMS(ESI)m/z=427(M+H)+
保持時間：0.95分(分析條件SQDAA05)
如此，胜肽之氧化反應容易使硫醇受氧化反應，故硫醚如廣為一般認知之受氧化代謝係為相關連。
該等實驗可明白以下事項。吾人定義為可穿膜的胜肽中，硫醚環化胜肽之代謝速度快。儘管是胜肽，主要代謝並非醯胺鍵之水解，而顯示係氧化代謝。使硫醚部位預先氧化而封鎖氧化代謝部位的化合物，可獲得代謝安定化，可由與對 應之亞碸之比較而明白。推測硫醚部位為一個代謝部位。利用化學反應所為之氧化反應中，亦為硫醚部位係選擇性地受氧化，顯示硫醚部位較其他部位更容易受氧化。硫醚易受氧化代謝為廣為一般知曉者。有人報告利用細胞色素P450分解為RSCH2R'→RSH+R'CHO、或利用含黃素之單氧酶代謝為亞碸(非專利文獻、藥物代謝學 醫療藥學‧毒性學之基礎第2版 加藤隆一‧鎌瀧哲也 編)。前者若生成，係反應性代謝物，故可能與表現毒性相關。
由以上知識，獲得以下結論：醯胺鍵對代謝為安定，另一方面，具有易氧化之硫醚的環化法尚有改良空間。各單元均是醯胺鍵之本發明之方法獲得之環狀胜肽，可推測比習知環化法所得之環狀胜肽更優良。
5.硫醚環化與醯胺環化化合物之代謝安定性之比較
脂溶性高之硫醚環化胜肽群之中，選擇代謝安定性較高的硫醚3種，合成除了環化部位以外為相同之序列(MeAla-MePhe-MeLeu-Thr-MeGly-MeLeu-Ser(tBu)、MePhe-MeLeu-Thr-MeGly-MeLeu-Ser(tBu)-MeIle、MeAla-MePhe-MeLeu-Thr-MeGly-MeLeu-Ser(tBu)-MeIle)之醯胺環化胜肽，並比較此等的代謝安定性。如下表，小鼠、人類均為微體代謝安定性在小鼠提高約2倍、在人類提高約3倍。由在一連串化合物獲得安定而代謝安定化的結果，據認為所呈現之全部化合物所含之硫醚次結構已除去之醯胺環化法，係使呈現的化合物之多數更代謝安定化的更類似藥物(Druglike)的 展示(Display)方法。
Figure 107130626-A0101-12-0322-400
表10之胜肽，於N末端胺基酸與Asp或Glu為醯胺環化，或Ac部位與Cys為硫醚環化中之任一者。
化合物P-119 Ala-MeAla-MePhe-MeLeu-Thr-MeGly-MeLeu-Ser(tBu)-Asp-哌啶
N末端胺與Asp側鏈係醯胺環化
Figure 107130626-A0101-12-0322-401
LCMS：1067.8 m/z(M-H)-
保持時間：0.72分(分析條件SQDAA50)
化合物P-120 MeAla-MeAla-MePhe-MeLeu-Thr-MeGly-MeLeu-Ser(tBu)-Asp- 哌啶
N末端胺與Asp側鏈係醯胺環化
Figure 107130626-A0101-12-0323-402
LCMS：1081.9 m/z(M-H)-
保持時間：0.73分(分析條件SQDAA50)
化合物P-121 Ala-MeAla-MePhe-MeLeu-Thr-MeGly-MeLeu-Ser(tBu)-Glu-哌啶
N末端胺與Glu側鏈係醯胺環化
Figure 107130626-A0101-12-0323-403
LCMS：1082.0 m/z(M-H)-
保持時間：0.73分(分析條件SQDAA50)
化合物P-122 MeAla-MeAla-MePhe-MeLeu-Thr-MeGly-MeLeu-Ser(tBu)-Glu-哌啶
N末端胺與Glu側鏈係醯胺環化
Figure 107130626-A0101-12-0324-404
LCMS：1096.0 m/z(M-H)-
保持時間：0.73分(分析條件SQDAA50)
化合物P-123 Ala-MePhe-MeLeu-Thr-MeGly-MeLeu-Ser(tBu)-MeIle-Asp-哌啶
N末端胺與Asp側鏈係醯胺環化
Figure 107130626-A0101-12-0324-405
LCMS：1110.0 m/z(M-H)-
保持時間：0.82分(分析條件SQDAA50)
化合物P-124 MeAla-MePhe-MeLeu-Thr-MeGly-MeLeu-Ser(tBu)-MeIle-Glu-哌啶
N末端胺與Glu側鏈係醯胺環化
Figure 107130626-A0101-12-0324-406
LCMS：1137.8 m/z(M-H)-
保持時間：0.81分(分析條件SQDAA50)
化合物P-125 Ala-MeAla-MePhe-MeLeu-Thr-MeGly-MeLeu-Ser(tBu)-MeIle-Asp-哌啶
N末端胺與Asp側鏈係醯胺環化
Figure 107130626-A0101-12-0325-407
LCMS：1194.7 m/z(M-H)-
保持時間：0.81分(分析條件SQDAA50)
[實施例18-2]使用硫酯環化胜肽所為之利用酵素進行之N末端胺基酸除去與在醯胺環化之應用
將含有於非N末端之位置之半胱胺酸及側鏈羧酸經活化之胺基酸的胜肽轉譯，製備兩官能基已反應之硫酯環化胜肽。然後，以酵素去除比起同半胱胺酸更位在N末端部之胺基酸，使半胱胺酸殘基之α-胺基露出，並以如下方式嘗試使用其之胜肽之醯胺環化是否會進行。
1.利用轉錄所為之tRNA(CA欠缺)之合成
從模板DNA(序列編號DT-E1)，利用使用RiboMAX Large Scale RNA production System T7(Promega公司，P1300)之體外轉錄，合成3'端之CA欠缺的tRNAGluAAG(-CA)(序列編號RT-E1)，並利用RNeasy Mini kit(Qiagen公司)精製。
序列編號DT-E1(序列編號：179)tRNAGluAAG(-CA)DNA序列：
Figure 107130626-A0101-12-0325-408
Figure 107130626-A0101-12-0326-409
序列編號RT-E1(序列編號：180)tRNAGluAAG(-CA)RNA序列：
Figure 107130626-A0101-12-0326-410
2.利用側鏈羧酸經活性酯化之胺基醯基化pdCpA(化合物1i-IA)與tRNA(CA欠缺)(序列編號：RT-E1)之接合(ligation)所為之胺基醯基化tRNA(化合物AT-E1)之合成
於50μM轉錄tRNAGluAAG(-CA)(序列編號RT-E1)10μL，加入10X接合緩衝液(500mM HEPES-KOH pH 7.5,200mM MgCl2)2μL、10mM ATP 2μL、無核酸酶之水2.8μL，於95℃加熱2分鐘後，於室溫放置5分鐘，進行tRNA之重新折疊。加入20unit/μL之T4 RNA接合酶(New England Bio Lab.公司)1.2μL及、5mM之胺基醯基化pdCpA(化合物1i-IA)之DMSO溶液2μL，於15℃進行45分鐘接合反應。於接合反應液20μL中加入3M乙酸鈉4μL與125mM碘(水：THF=1：1溶液)24μL，於室溫進行1小時脫保護。胺基醯基化tRNA(化合物AT-E1)進行苯酚萃取後，利用乙醇沉澱回收。胺基醯基化tRNA(化合物AT-E1)於即將添加到轉譯混合物時溶於1mM乙酸鈉。
化合物AT-E1(序列編號：181)Asp(SMe)-tRNAGluAAG
Figure 107130626-A0101-12-0327-411
3.含有未位於N末端之半胱胺酸殘基與側鏈羧酸經活性酯化之胺基酸之胜肽之轉譯合成
使將側鏈羧酸利用硫酯活化之天冬胺酸衍生物予以胺基醯基化而得的tRNA加到無細胞轉譯系，開始轉譯，以進行含有所望之非天然胺基酸之多胜肽之轉譯合成。轉譯系使用原核生物來源之再構成無細胞蛋白質合成系PURE system。具體而言，於轉譯液，1%(v/v)RNasein Ribonuclease inhibitor(Promega公司，N2111),1mM GTP，1mM ATP，20mM肌酸磷酸，50mM HEPES-KOH pH7.6，100mM乙酸鉀，6mM乙酸鎂，2mM亞精胺(spermidine)，2mM二硫蘇糖醇，0.1mM 10-HCO-H4folate,1.5mg/ml E.coli MRE600(RNase陰性)來源tRNA(Roche公司)，4μg/ml肌酸激酶，3μg/ml肌激酶，2unit/ml無機焦磷解酶，1.1μg/ml核苷二磷酸激酶，0.6μM甲硫胺醯基tRNA轉甲醯基酶，0.26μM EF-G，0.24μM RF2，0.17μM RF3，0.5μM RRF，2.7μM IF1，0.4μM IF2,1.5μM IF3,40μM EF-Tu，93μM EF-Ts，1.2μM核糖體，0.73μM AlaRS，0.03μM ArgRS，0.38μM AsnRS，0.13μM AspRS，0.02μM CysRS，0.06μM GlnRS，0.23μM GluRS，0.09μM GlyRS，0.4μM IleRS，0.04μM LeuRS，0.11μM LysRS，0.03μM MetRS，0.68μM PheRS，0.16μM ProRS，0.04μM SerRS，0.09μM ThrRS，0.03μM TrpRS，0.02μM TyrRS，0.02μM ValRS(實驗室製備之蛋白，基本上係製備成附加His 標籤之蛋白))中，添加1μM模板RNA、由各模板DNA編碼之蛋白質性胺基酸群各250μM、及50μM之側鏈羧酸經活性酯化之胺基醯基化tRNA(化合物AT-E1)於轉譯反應混合物，於37℃靜置1小時以進行。
轉譯產物，係使用α-氰基-4-羥基桂皮酸作為基質，測定MALDI-MS光譜而鑑定。
4.硫酯環化胜肽之轉譯合成及利用酵素將N末端胺基酸除去而變換為醯胺環化
於1μM模板RNA OT43 RNA(序列編號RM-E1)中，將含0.25mM Met，0.25mM Cys，0.25mM Thr，0.25mM Arg，0.25mM Tyr，0.25mM Pro，0.25mM Gly及、50μM Asp(SMe)-tRNAGluAAG(化合物AT-E1)之前述轉譯液於37℃保溫60分鐘。於獲得之轉譯溶液1μL中加入9μL之0.2%三氟乙酸，其中1μL載置於MALDI標靶板上後，與1μL之CHCA溶液(10mg/ml α-氰基-4-羥基桂皮酸、50%乙腈、0.1%三氟乙酸溶液)混合，在板上乾固，並以MALDI-MS分析。其結果，觀測到相當於含N末端甲醯基甲硫胺酸，且以側鏈硫醇基與羧酸予以硫酯環化而得之胜肽P-E1的峰部(圖62、峰部I)。然後，於上述轉譯反應物添加為酵素之胜肽去甲醯基酶、甲硫胺酸胺基肽酶，使終濃度各為2μM、14μM，於37℃進行5分鐘保溫。將獲得之反應物如上述以MALDI-MS分析，結果，原料之硫酯環化胜肽之峰部減小，代之係觀測到相當於N末端甲醯基甲硫胺酸經除，其結果露出之N末端胺基之氮原子與Asp之側鏈羧酸予以醯胺環化而得之化合物P-E2的峰部(圖62、峰部II)。 由此顯示，即使硫酯環化進行後，仍可藉由從Cys去除N末端部，而獲得目的之醯胺環化胜肽。
序列編號RM-E1(序列編號：182)OT43 RNA
Figure 107130626-A0101-12-0329-412
胜肽序列P-E1(序列編號：183)之側鏈硫原子與Asp之側鏈羧酸予以硫酯環化而得之化合物
MALDI-MS：m/z：[M+H]+=1367.5(Calc.1367.6)
胜肽序列P-E2(序列編號：184)CysThrThrThrArgAspProTyrArgGlyGly之N末端胺基之氮原子與Asp之側鏈羧酸予以醯胺環化而得之化合物
MALDI-MS：m/z：[M+H]+=1208.3(Calc.1208.6)
[實施例19]胜肽化合物
1.醯胺環化胜肽之合成
合成以下所示之環化胜肽(表11-1：合成之胜肽化合物之例(共計965個化合物))。若無特別明示，則表中位於1之胺基酸係與前述流程A等所示之白圓○對應的交叉單元為對應，且胺基酸序列中左端表示記載之胺基酸同樣對應於▲單元。此等2個部位形成鍵結並構成環化胜肽。又，表中H-1至H-6表示之胺基酸，相當於前述流程A等所示之直鏈部。在此，表中右端存在之部位形成C末端。在此記載的pip，係指C末端羧酸與哌啶形成醯胺鍵並形成了哌啶醯胺。又，H-1全無記載之環化胜肽，係指C末端羧酸經削除之化合物。於此情形，具有位 於1之胺基酸之1個羧酸與N末端之胺係經醯胺化反應而環化，且C末端羧酸部位經削除之衍生物，例如取代為甲基或三氟甲基之化合物係位在C末端。表11-1所示之簡稱，係指表11-2(胺基酸簡稱與意指結構間的關連表)表示記載之胺基酸。
使用與已記載之方法為相同之方法，合成表11-1表示記載之環化胜肽，並分別進行化合物之鑑定(表11-3-1、表11-3-2：合成之胜肽化合物之鑑定(共計965個化合物))。
1-1.鍵結於樹脂之C末端部位胺基酸或胜肽之合成例及對於該樹脂之載持方法
C末端部位之主鏈部位以醯胺進行化學修飾(許多實施例係哌啶醯胺)，並且為合成天冬胺酸之側鏈羧酸部位(交叉單元)與N末端側之胺基(三角單元)經醯胺鍵結的各種化合物，合成以下胺基酸或胜肽之載持樹脂。以下敘述合成例的更詳細內容。又，不限於以下方法，也可依本說明書另外記載之部分、或一般的胜肽之合成法合成。
1-1-1.以Fmoc-Asp-pip(化合物SP401)之側鏈羧酸與樹脂鍵結而得之化合物(化合物SP402)合成
(S)-3-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-4-側氧基-4-(哌啶-1-基)丁酸第三丁酯(化合物SP403、Fmoc-Asp(OtBu)-pip)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0331-413
使(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-4-(第三丁氧基)-4-側氧基丁酸(化合物SP404、Fmoc-Asp(OtBu)-OH)(30g、72.9mmol)溶於DMF(243mL)，於0℃添加N-甲基嗎啉(9.6ml、87mmol)，接著添加O-(7-氮雜-1H苯并三唑-1-基)-N,N，N,N四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)(33.3g、87mmol)，攪拌10分鐘。再滴加哌啶(7.1ml、71.5mmol)，攪拌30分鐘。將反應混合物以己烷/乙酸乙酯=1/1(1500ml)稀釋，將有機層以飽和氯化銨水溶液、飽和碳酸氫鈉水溶液、水、飽和食鹽水依序洗滌。將有機萃取物以硫酸鈉乾燥後，於減壓下濃縮，將獲得之殘渣以矽膠管柱層析(己烷/乙酸乙酯=2/1)精製，獲得(S)-3-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-4-側氧基-4-(哌啶-1-基)丁酸第三丁酯(化合物SP403)(35.2g、99%)。
LCMS(ESI)m/z=479.5(M+H)+
保持時間：1.10分(分析條件SQDAA05)
(S)-3-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-4-側氧基-4-(哌啶-1-基)丁酸(Fmoc-Asp-pip、化合物SP401)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0332-414
使(S)-3-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-4-側氧基-4-(哌啶-1-基)丁酸第三丁酯(化合物SP403)(9.3g、19.4mmol)溶於甲苯(300mL)，將其於減壓下濃縮。再重複此操作2次，於減壓下終夜乾燥。於反應容器中裝入脫水二氯甲烷(8.6ml)，於氮氣氛圍下於0℃進行5分鐘攪拌後，滴加三氟乙酸(8.6ml、116mmol)。於室溫攪拌4小時後，於0℃滴加三乙胺(16.2ml、116mmol)。將反應混合物以二氯甲烷(100ml)稀釋，並將有機層以5%磷酸2氫鈉水溶液洗滌6次。將有機萃取物以硫酸鈉乾燥後，於減壓下濃縮，將獲得之殘渣再度以二氯甲烷(100ml)稀釋，將有機層以5%磷酸二氫鈉水溶液洗滌2次。將有機萃取物以硫酸鈉乾燥後，於減壓下濃縮，獲得(S)-3-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-4-側氧基-4-(哌啶-1-基)丁酸(Fmoc-Asp-pip、化合物SP401)(7.8g、96%)。此化合物不進行進一步的精製操作，供其次之步驟使用。
LCMS(ESI)m/z=423(M+H)+
保持時間：0.88分(分析條件SQDAA05)
(S)-3-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-4-側氧基-4-(哌啶-1-基)丁酸-2-氯三苯甲酯樹脂(化合物SP402、Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-Resin)-pip)之合成
又，本說明書中，當聚合物或樹脂與化合物鍵結之情形， 有時聚合物或樹脂部位以○表示記載。又，為了使樹脂部位之反應點明確，有時會有與○連接並表示記載反應部位之化學結構的情形。以下結構中，表示樹脂之2-氯三苯甲基經由Asp之側鏈羧酸與酯鍵鍵結之狀態。
Figure 107130626-A0101-12-0333-415
於附濾器的反應容器中，放入2-氯三苯甲基氯化物樹脂(100-200mesh、1%DVB、從Chem-Impex購買、29.6g、33.4mmol)及脫水二氯甲烷(300ml)，於室溫進行10分鐘振盪。施以氮壓去除二氯甲烷後，將於(S)-3-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-4-側氧基-4-(哌啶-1-基)丁酸(化合物SP401)(7.8g)之脫水二氯甲烷(334ml)溶液中加入脫水甲醇(5.4ml)及二異丙基乙胺(14ml)的混合液添加到反應容器，並進行10分鐘振盪。施以氮壓去除反應液後，將於脫水二氯甲烷(334ml)加入脫水甲醇(41.6ml)及二異丙基乙胺(14ml)的混合液添加到反應容器，進行90分鐘振盪。施以氮壓去除反應液後，放入二氯甲烷(300ml)，進行5分鐘振盪。施以氮壓去除反應液後，再度裝入二氯甲烷(300ml)，進行5分鐘振盪。施以氮壓去除反應液後，於減壓下使樹脂終夜乾燥，獲得(S)-3-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-4-側氧基-4-(哌啶-1-基)丁酸-2-氯三苯甲 酯樹脂(化合物SP402)(34.8g)。
將獲得之(S)-3-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-4-側氧基-4-(哌啶-1-基)丁酸-2-氯三苯甲酯樹脂(化合物SP402)(13.42mg)放入反應容器中，添加DMF(0.2ml)及哌啶(0.2ml)，於室溫進行1小時振盪。於反應容器中加入DMF(1.6ml)後，將反應混合液(0.4ml)以DMF(9.6ml)稀釋，測定其吸光度(301.2nm)。依以下計算式，計算(S)-3-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-4-側氧基-4-(哌啶-1-基)丁酸-2-氯三苯甲酯樹脂(化合物SP402)之裝載(loading)率為27.8%、0.267mmol/g。
(吸光度(301.2nm)x1000x50)/(13.42x7800)=0.267mmol/g0.267mmol/gx100/(33.4/34.8)=27.8%
1-1-2.以Fmoc-Asp-MePhe-Ala-pip(化合物SP454)之Asp之側鏈羧酸與樹脂鍵結而得之化合物(化合物SP455)之合成、及以Fmoc-Asp-MePhe-MePhe-Ala-pip(化合物SP458)之Asp之側鏈羧酸與樹脂鍵結而得之化合物(化合物SP459)之合成
依以下流程，合成(3S)-3-(9H-茀-9-基甲氧基羰胺基)-4-[甲基-[(2S)-1-側氧基-1-[[(2S)-1-側氧基-1-哌啶-1-基丙烷-2-基]胺基]-3-苯基丙烷-2-基]胺基]-4-側氧基丁酸-2-氯三苯甲酯樹脂(化合物SP455，Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-Resin)-MePhe-Ala-pip)。
Figure 107130626-A0101-12-0335-416
(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-茀-9-基甲氧基羰胺基)-4-側氧基-4-苯基甲氧基丁醯基]-甲胺基]-3-苯基丙醯基]胺基]丙酸(化合物SP451，Fmoc-Asp(OBn)-MePhe-Ala-OH)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0335-417
將(2S)-2-(9H-茀-9-基甲氧基羰胺基)丙酸(Fmoc-Ala-OH)(4.86g、15.8mmol)及二異丙基乙胺(EtN(iPr)2)(14.5mL、83mmol)溶於脫水二氯甲烷(60ml)，加入2-氯三苯甲基氯化物樹脂(100-200mesh、1%DVB、從渡邊化學購買、6.5g、10.5mmol)，於室溫振盪90分鐘，使胺基酸載持於樹脂。將反應溶液除去，並將樹脂以脫水二氯甲烷(100ml)洗滌4次。於樹脂加入20%哌啶N,N-二甲基甲醯胺溶液(52ml)並振盪60分鐘，進行Fmoc基之脫保護。將反應溶液除去，並將樹脂以N,N-二甲基甲醯胺(45ml)洗滌3次。然後，央 (2S)-2-[9H-茀-9-基甲氧羰基(甲基)胺基]-3-苯基丙酸(Fmoc-MePhe-OH)(3.74g、9.3mmol)、3H-(1,2,3)疊氮并(4,5-b)吡啶-3-醇(HOAt)(1.27g、9.3mmol)及N,N’-甲烷二亞基雙(丙烷-2-胺)(DIC)(1.44ml、9.3mmol)溶於N,N-二甲基甲醯胺(13.5ml)，添加到樹脂，於室溫振盪90分鐘，進行胜肽化。將反應溶液除去，並將樹脂以N,N-二甲基甲醯胺(23ml)洗滌3次後，再以二氯甲烷(23ml)洗滌3次。然後，於前述樹脂加入2%2,3,4,6,7,8,9,10-八氫嘧啶并[1,2-a]氮呯N,N-二甲基甲醯胺溶液(2%DBU in DMF)(40ml)，振盪180分鐘，進行Fmoc基之脫保護。將反應溶液除去，將樹脂以N,N-二甲基甲醯胺(45ml)洗滌3次。然後，將(2S)-2-(9H-茀-9-基甲氧基羰胺基)-4-側氧基-4-苯基甲氧基丁酸(Fmoc-Asp(OBn)-OH)(5.14g、11.5mmol)、3H-(1,2,3)疊氮并(4,5-b)吡啶-3-醇(HOAt)(1.58g、11.6mmol)及N,N’-甲烷二亞基雙(丙烷-2-胺)(DIC)(1.78ml、211.6mmol)溶於N,N-二甲基甲醯胺(30ml)，加到樹脂，於室溫振盪16小時，進行胜肽化。將反應溶液除去，將樹脂以N,N-二甲基甲醯胺(45ml)洗滌3次後，再以二氯甲烷(45ml)洗滌3次。然後，將4N鹽酸乙酸乙酯溶液(1.92ml、7.69mmol)與二氯甲烷(100ml)混合而得之溶液加到前述樹脂，進行1小時振盪2次，進行胺基酸從樹脂之切出。將樹脂以二氯甲烷/2,2，2-三氟乙醇(=1/1，v/v、25mL)洗滌2次後，將所有萃取液混合並於減壓下濃縮，獲得Fmoc-Asp(OBn)-MePhe-Ala-OH(化合物SP451)(7.11g)。
LCMS(ESI)m/z=678.6(M+H)+
保持時間：0.65分(分析條件SQDAA50)
(3S)-3-(9H-茀-9-基甲氧基羰胺基)-4-[甲基-[(2S)-1-側氧基-1-[[(2S)-1-側氧基-1-哌啶-1-基丙烷-2-基]胺基]-3-苯基丙烷-2-基]胺基]-4-側氧基丁酸苄酯(化合物SP453，Fmoc-Asp(OBn)-MePhe-Ala-pip)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0337-418
於氮氣氛圍下，將Fmoc-Asp(OBn)-MePhe-Ala-OH(化合物SP451)(7.11g、10.5mmol)、二異丙基乙胺(EtN(iPr)2)(3.29ml、18.9mmol)及O-(7-氮雜-1H-苯并三唑-1-基)-N,N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)(5.19g、13.6mmol)溶於N,N-二甲基甲醯胺(40ml)，加入哌啶(化合物SP452)(0.99ml、10.0mmol)，於室溫攪拌10分鐘。於反應液加入150ml乙酸乙酯，將有機層以150ml之氯化銨飽和水溶液、150ml純水及150ml飽和食鹽水洗滌。回收有機層，進行減壓濃縮，獲得Fmoc-Asp(OBn)-MePhe-Ala-pip(化合物SP453)(7.44g、95%)。
LCMS(ESI)m/z=745.7(M+H)+
保持時間：0.82分(分析條件SQDAA50)
(3S)-3-(9H-茀-9-基甲氧基羰胺基)-4-[甲基-[(2S)-1-側氧基-1-[[(2S)-1-側氧基-1-哌啶-1-基丙烷-2-基]胺基]-3-苯基丙烷-2-基]胺基]-4-側氧基丁酸(化合物SP454， Fmoc-Asp-MePhe-Ala-pip)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0338-419
於氮氣氛圍下，將Fmoc-Asp(OBn)-MePhe-Ala-pip(化合物SP453)(7.44g、10.0mmol)、及20%鈀-活性碳(1.49g、2.8mmol)添加到甲醇(50ml)，將反應容器中以氫氣取代，於室溫攪拌5小時。將反應液以沸石過濾後，將有機層減壓濃縮，獲得Fmoc-Asp-MePhe-Ala-pip(化合物SP454)(5.69g、86%)。
LCMS(ESI)m/z=655.6(M+H)+
保持時間：0.61分(分析條件SQDAA50)
(3S)-3-(9H-茀-9-基甲氧基羰胺基)-4-[甲基-[(2S)-1-側氧基-1-[[(2S)-1-側氧基-1-哌啶-1-基丙烷-2-基]胺基]-3-苯基丙烷-2-基]胺基]-4-側氧基丁酸-2-氯三苯甲酯樹脂(化合物SP455，Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-Resin)-MePhe-Ala-pip)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0338-2217
於附有濾器之反應容器中放入2-氯三苯甲基氯化 物樹脂(100-200mesh、1%DVB、從渡邊化學購買、10.8g、17.2mmol)與脫水二氯甲烷(100ml)，於室溫進行10分鐘振盪。施以氮壓去除二氯甲烷後，將於Fmoc-Asp-MePhe-Ala-pip(化合物SP454)(5.64g、8.61mmol)之脫水二氯甲烷(100ml)溶液中加入脫水甲醇(1.4ml)及二異丙基乙胺(EtN(iPr)2)(7.2ml，41.3mmol)而得之混合液添加到反應容器，進行40分鐘振盪。施以氮壓去除反應液後，將於二氯甲烷(100ml)加入脫水甲醇(22.4ml)及二異丙基乙胺(EtN(iPr)2)(7.2ml，41.3mmol)而得之混合液添加到反應容器並進行2小時振盪。施以氮壓去除反應液後，裝入二氯甲烷(100ml)，進行5分鐘振盪。施以氮壓去除反應液後，再度裝入二氯甲烷(100ml)，進行5分鐘振盪。施以氮壓去除反應液後，於減壓下使樹脂終夜乾燥，獲得Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-Resin)-MePhe-Ala-pip(化合物SP455)(14.0g)。
裝載率：0.317mmol/g、25.7%
依以下流程，進行(3S)-3-(9H-茀-9-基甲氧基羰胺基)-4-[甲基-[(2S)-1-[甲基-[(2S)-1-側氧基-1-[[(2S)-1-側氧基-1-哌啶-1-基丙烷-2-基]胺基]-3-苯基丙烷-2-基]胺基]-1-側氧基-3-苯基丙烷-2-基]胺基]-4-側氧基丁酸-2-氯三苯甲酯樹脂(化合物SP459，Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-Resin)-MePhe-MePhe-Ala-pip)之合成。
Figure 107130626-A0101-12-0340-421
(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-茀-9-基甲氧基羰胺基)-4-側氧基-4-苯基甲氧基丁醯基]-甲胺基]-3-苯基丙醯基]-甲胺基]-3-苯基丙醯基]胺基]丙酸(化合物SP456，Fmoc-Asp(OBn)-MePhe-MePhe-Ala-OH)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0340-422
將(2S)-2-(9H-茀-9-基甲氧基羰胺基)丙酸(Fmoc-Ala-OH)(4.86g、15.8mmol)及二異丙基乙胺(EtN(iPr)2)(14.5mL、83mmol)溶於脫水二氯甲烷(60ml)，添加2-氯三苯甲基氯化物樹脂(100-200mesh、1%DVB、從渡邊化學購買、6.5g、10.5mmol)，於室溫進行90分鐘振盪，使胺基酸載持於樹脂。將反應溶液除去，將樹脂以二氯甲烷(100ml)洗滌4次。於樹脂加入20%哌啶N,N-二甲基甲醯胺溶液(52ml) 進行60分鐘振盪，進行Fmoc基之脫保護。將反應溶液除去，將樹脂以N,N-二甲基甲醯胺(45ml)洗滌3次。然後將(2S)-2-[9H-茀-9-基甲氧羰基(甲基)胺基]-3-苯基丙酸(Fmoc-MePhe-OH)(3.74g、9.3mmol)、3H-(1,2,3)疊氮并(4,5-b)吡啶-3-醇(HOAt)(1.27g、9.3mmol)及N,N’-甲烷二亞基雙(丙烷-2-胺)(DIC)(1.44ml、9.3mmol)溶於N,N-二甲基甲醯胺(13.5ml)，加到樹脂，於室溫振盪90分鐘，進行胜肽化。將反應溶液除去，將樹脂以N,N-二甲基甲醯胺(23ml)洗滌3次後，再以二氯甲烷(23ml)洗滌3次。然後於樹脂加入2%2,3,4,6,7,8,9,10-八氫嘧啶并[1,2-a]氮呯N,N-二甲基甲醯胺溶液(2% DBU於DMF)(40ml)，振盪60分鐘，進行Fmoc基之脫保護。將反應溶液除去，將樹脂以N,N-二甲基甲醯胺(45ml)洗滌3次。然後將(2S)-2-[9H-茀-9-基甲氧羰基(甲基)胺基]-3-苯基丙酸(Fmoc-MePhe-OH)(4.61g、11.5mmol)、3H-(1,2,3)疊氮并(4,5-b)吡啶-3-醇(HOAt)(1.58g、11.6mmol)及N,N’-甲烷二亞基雙(丙烷-2-胺)(DIC)(1.78ml、11.6mmol)溶於N,N-二甲基甲醯胺(30ml)，加到樹脂，於室溫振盪16小時，進行胜肽化。將反應溶液除去，將樹脂以N,N-二甲基甲醯胺(45ml)洗滌3次後，再以二氯甲烷(45ml)洗滌3次。然後於樹脂中加入2%2,3,4,6,7,8,9,10-八氫嘧啶并[1,2-a]氮呯N,N-二甲基甲醯胺溶液(2% DBU於DMF)(40ml)，振盪60分鐘，進行Fmoc基之脫保護。將反應溶液除去，將樹脂以N,N-二甲基甲醯胺(45ml)洗滌3次。然後將(2S)-2-(9H-茀-9-基甲氧基羰胺基)-4-側氧基-4-苯基甲氧基丁酸 (Fmoc-Asp(OBn)-OH)(5.14g、11.5mmol)、3H-(1,2,3)疊氮并(4,5-b)吡啶-3-醇(HOAt)(1.58g、11.6mmol)及N,N’-甲烷二亞基雙(丙烷-2-胺)(DIC)(1.78ml、11.6mmol)溶於N,N-二甲基甲醯胺(30ml)，加到樹脂中，於室溫振盪16小時，進行胜肽化。將反應溶液除去，將樹脂以N,N-二甲基甲醯胺(45ml)洗滌3次後，再以二氯甲烷(45ml)洗滌3次。然後將4N鹽酸乙酸乙酯溶液(1.92ml、7.69mmol)混入二氯甲烷(100ml)而得之溶液加到前述樹脂，進行1小時振盪2次，將胺基酸從樹脂切出。將樹脂以二氯甲烷/2,2，2-三氟乙醇(=1/1，v/v、25mL)洗滌2次後，將全部萃取液混合，於減壓下濃縮，獲得Fmoc-Asp(OBn)-MePhe-MePhe-Ala-OH(化合物SP456)(7.81g)。
LCMS(ESI)m/z=839.6(M+H)+
保持時間：0.71分(分析條件SQDAA50)
(3S)-3-(9H-茀-9-基甲氧基羰胺基)-4-[甲基-[(2S)-1-[甲基-[(2S)-1-側氧基-1-[[(2S)-1-側氧基-1-哌啶-1-基丙烷-2-基]胺基]-3-苯基丙烷-2-基]胺基]-1-側氧基-3-苯基丙烷-2-基]胺基]-4-側氧基丁酸苄酯(化合物SP457，Fmoc-Asp(OBn)-MePhe-MePhe-Ala-pip)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0342-423
於氮氣氛圍下，將Fmoc-Asp(OBn)-MePhe-MePhe-Ala-OH(化合物SP456)(7.81g、 9.70mmol)、二異丙基乙胺(EtN(iPr)2)(3.04ml、17.5mmol)及O-(7-氮雜-1H-苯并三唑-1-基)-N,N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)(4.80g、12.6mmol)溶於N,N-二甲基甲醯胺(40ml)，加入哌啶(化合物SP452)(0.94ml、9.51mmol)，於室溫攪拌15分鐘。於反應液加入150ml乙酸乙酯，將有機層以150ml氯化銨飽和水溶液、150ml純水及150ml飽和食鹽水洗滌。將有機層回收並減壓濃縮，獲得Fmoc-Asp(OBn)-MePhe-MePhe-Ala-pip(化合物SP457)(8.06g、92%)。
LCMS(ESI)m/z=906.7(M+H)+
保持時間：0.87分(分析條件SQDAA50)
(3S)-3-(9H-茀-9-基甲氧基羰胺基)-4-[甲基-[(2S)-1-[甲基-[(2S)-1-側氧基-1-[[(2S)-1-側氧基-1-哌啶-1-基丙烷-2-基]胺基]-3-苯基丙烷-2-基]胺基]-1-側氧基-3-苯基丙烷-2-基]胺基]-4-側氧基丁酸(化合物SP458，Fmoc-Asp-MePhe-MePhe-Ala-pip)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0343-424
於氮氣氛圍下，將Fmoc-Asp(OBn)-MePhe-MePhe-Ala-pip(化合物SP457)(8.06g、8.90mmol)、及20%鈀-活性碳(1.61g、3.0mmol)加到甲醇(50ml)，將反應容器中以氫氣取代，於室溫攪拌5小時。將反 應液以沸石過濾後，將有機層以減壓濃縮，獲得Fmoc-Asp-MePhe-MePhe-Ala-pip(化合物SP458)(4.79g、66%)。
LCMS(ESI)m/z=816.7(M+H)+
保持時間：0.69分(分析條件SQDAA50)
(3S)-3-(9H-茀-9-基甲氧基羰胺基)-4-[甲基-[(2S)-1-[甲基-[(2S)-1-側氧基-1-[[(2S)-1-側氧基-1-哌啶-1-基丙烷-2-基]胺基]-3-苯基丙烷-2-基]胺基]-1-側氧基-3-苯基丙烷-2-基]胺基]-4-側氧基丁酸-2-氯三苯甲酯樹脂(化合物SP459，Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-Resin)-MePhe-MePhe-Ala-pip)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0344-425
於附有濾器之反應容器中裝入2-氯三苯甲基氯化物樹脂(100-200mesh、1%DVB、從渡邊化學購買、6.69g、11.7mmol)與脫水二氯甲烷(50ml)，於室溫進行10分鐘振盪。施以氮壓去除二氯甲烷後，將於Fmoc-Asp-MePhe-MePhe-Ala-pip(化合物SP458)(4.79g、5.87mmol)之脫水二氯甲烷(100ml)溶液加入脫水甲醇(0.95ml)及二異丙基乙胺(EtN(iPr)2)(4.91ml、28.2mmol)而得之混合液添加到反應容器，進行40分鐘振盪。施以氮壓去除反應液後，將於脫水二氯甲烷(100ml)加入脫水甲醇(15.2ml)及二異丙基乙胺(EtN(iPr)2)(4.9ml，28.2mmol)而得之混合液添加到反應 容器，進行2小時振盪。施以氮壓去除反應液後，裝入二氯甲烷(100ml)，進行5分鐘振盪。施以氮壓去除反應液後，再度裝入二氯甲烷(100ml)，進行5分鐘振盪。施以氮壓去除反應液後，於減壓下使樹脂終夜乾燥，獲得Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-Resin)-MePhe-MePhe-Ala-pip(化合物SP459)(8.66g)。
裝載率：0.285mmol/g、21.0%
1-1-3.作為以Fmoc-Asp之側鏈羧酸與樹脂鍵結而得之化合物衍生物之將主鏈羧酸部位已除去之化合物(化合物SP405、L-3-ABU之羧酸部位與樹脂係鍵結之化合物)之合成
(S)-3-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)丁酸-2-氯三苯甲酯樹脂(Fmoc-L-3-ABU-(O-Trt-(2-Cl)-Resin、化合物SP405)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0345-2218
於附有濾器之反應容器中裝入2-氯三苯甲基氯化物樹脂(100-200mesh、1%DVB、從渡邊化學購買、3.84g、6.15mmol)與脫水二氯甲烷(61ml)，於室溫進行10分鐘振盪。施以氮壓去除二氯甲烷後，將於(S)-3-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)丁酸(化合物SP406、Fmoc-L-3-ABU-OH)(1.00g)之脫水二氯甲烷(61ml)溶液加入脫水甲醇(980μl)及二異丙基乙胺(2.52ml)而得之混合液添加到反應容器，進行5分鐘振盪。 施以氮壓去除反應液後，將於脫水二氯甲烷(64ml)加入脫水甲醇(8.0ml)及二異丙基乙胺(2.5ml)而得之混合液加到反應容器，進行2小時振盪。施以氮壓去除反應液後，裝入二氯甲烷(61ml)，進行5分鐘振盪。施以氮壓去除反應液後，再度裝入二氯甲烷(61ml)，進行5分鐘振盪。施以氮壓去除反應液後，於減壓下使樹脂終夜乾燥，獲得(S)-3-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)丁酸-2-氯三苯甲酯樹脂(化合物SP405)(4.16g)。裝載率：0.470mmol/g、31.8%
1-1-4.作為以Fmoc-Asp之側鏈羧酸與樹脂鍵結而得之化合物衍生物之將主鏈羧酸部位已除去之化合物(3-CF3-bAla之羧酸部位與樹脂係鍵結之化合物、化合物SP407)之合成
(S)-3-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-4,4,4-三氟丁酸-2-氯三苯甲酯樹脂(Fmoc-3-CF3-bAla-(O-Trt-(2-Cl)-Resin、化合物SP407)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0346-427
於附有濾器之反應容器中裝入2-氯三苯甲基氯化物樹脂(100-200mesh、1%DVB、從渡邊化學購買、1.65g、2.64mmol)與脫水二氯甲烷(26ml)，於室溫進行10分鐘振盪。施以氮壓去除二氯甲烷後，將於(S)-3-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-4,4,4-三氟丁酸(化合物SP408、 Fmoc-CF3-bAla-OH)(500mg)之脫水二氯甲烷(26ml)溶液加入脫水甲醇(428μl)及二異丙基乙胺(1.03ml)而得之混合液加到反應容器，進行5分鐘振盪。施以氮壓去除反應液後，將於脫水二氯甲烷(25ml)加入脫水甲醇(3.0ml)及二異丙基乙胺(1.0ml)而得之混合液加到反應容器，進行2小時振盪。施以氮壓去除反應液後，裝入二氯甲烷(25ml)，進行5分鐘振盪。施以氮壓去除反應液後，再度裝入二氯甲烷(25ml)，進行5分鐘振盪。施以氮壓去除反應液後，於減壓下使樹脂終夜乾燥，獲得(S)-3-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-4,4,4-三氟丁酸-2-氯三苯甲酯樹脂(化合物SP407)(1.76g)。
裝載率：0.234mmol/g、15.6%
1-2.胺基酸衍生物之合成
為了評價類藥之許多胺基酸衍生物係可購買或文獻已知，可依定法合成。以下記載文獻未知之胺基酸衍生物之合成法。
(2S)-2-(9H-茀-9-基甲氧基羰胺基)-3-(1-三苯甲基四唑-5-基)丙酸與(2S)-2-(9H-茀-9-基甲氧基羰胺基)-3-(2-三苯甲基四唑-5-基)丙酸(化合物SP409、Fmoc-Ala(5-Tet(Trt))-OH)之合成
依以下流程合成
Figure 107130626-A0101-12-0348-428
於以上流程中，三苯甲基係指與四唑環上之4個氮原子中任意者鍵結。
將(2S)-2-(9H-茀-9-基甲氧基羰胺基)-3-(1H-四唑-5-基)丙酸與(2S)-2-(9H-茀-9-基甲氧基羰胺基)-3-(2H-四唑-5-基)丙酸(化合物SP410、Fmoc-Ala(5-Tet)-OH)(900mg、2.37mmol)溶於四氫呋喃(2.7ml)，加入N,N-二異丙基乙胺(0.36mL、2.61mmol)並攪拌5分鐘。於上述反應溶液中加入三苯甲基氯化物(628mg、2.25mmol)溶於四氫呋喃(0.6ml)之溶液，攪拌90分鐘。將反應液過濾，將回收之反應液減壓濃縮，將殘渣以逆相矽膠管柱層析(10mM乙酸銨水溶液/甲醇)精製，獲得(2S)-2-(9H-茀-9-基甲氧基羰胺基)-3-(1-三苯甲基四唑-5-基)丙酸與(2S)-2-(9H-茀-9-基甲氧基羰胺基)-3-(2-三苯甲基四唑-5-基)丙酸(化合物SP409、Fmoc-Ala(5-Tet(Trt))-OH)(644mg、44%)。
LCMS(ESI)m/z=620.3(M-H)-
保持時間：1.06分(分析條件SQDAA05)
(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)(乙基)胺基)-3-苯基丙酸(化合物SP443、Fmoc-EtPhe-OH)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0349-429
(S)-2-(乙胺基)-3-苯基丙酸(化合物SP442)之合成，依文獻、Tetrahedron Asymmetry、19(8)、970-975；2008、Stodulski,Maciej and Mlynarski,Jacek合成。
使(S)-2-(乙胺基)-3-苯基丙酸(化合物SP442)(4.00g、20.7mmol)溶於1,4-二噁烷(100ml)與水(100ml)之混合液，加入碳酸鉀(8.69g、62.9mmol)及碳酸(2,5-二側氧基吡咯烷-1-基)(9H-茀-9-基)甲酯(6.98g、20.7mol)，於室溫攪拌8小時。將水層以硫酸氫鉀水溶液調整為pH4，於減壓下將1,4-二噁烷餾去。將獲得之水溶液以乙酸乙酯萃取，獲得之有機萃取物以飽和食鹽水洗滌，以硫酸鈉乾燥後減壓濃縮。獲得之殘渣以管柱層析(乙酸乙酯：石油醚=1：1)精製，獲得(2S，4R)-1-(((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)-4-乙氧基吡咯烷-2-羧酸(化合物SP443)(3.2g、37%)。
LCMS(ESI)m/z=416(M+H)+
保持時間：1.97分(分析條件SMD法11)
(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-5-(甲胺基)-5-側氧基戊酸(Fmoc-Gln(Me)-OH、化合物SP446)及(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-5-(二甲胺基)-5-側氧基戊酸(Fmoc-Gln(Me2)-OH、化合物SP448)之合成
依以下流程合成。
Figure 107130626-A0101-12-0350-430
(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-5-(甲胺基)-5-側氧基戊酸第三丁酯(化合物SP445)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0350-431
將(S)-3-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-4-(第三丁氧基)-4-側氧基丁酸(化合物SP444)(7.00g、17.0mmol)溶於二甲基甲醯胺(50ml)，添加六氟磷酸(苯并三唑-1-氧基)三吡咯烷鏻(PyBOP)(10.3g、19.8mmol)、與甲胺(42mmol)之2mol/l之四氫呋喃溶液，於室溫攪拌1小時。於反應液中加水，以二氯甲烷萃取。將有機萃取液依序以重碳酸水溶液、水洗滌後，以硫酸鎂乾燥，於減壓下溶劑餾去，獲得(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-5-(甲胺基)-5-側氧基戊酸第三丁酯(化合物SP445)(13.3g)粗產物。
LCMS(ESI)m/z=439(M+H)+
保持時間：1.05分(分析條件SQDAA05)
(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-5-(甲胺基)-5-側氧基戊酸(化合物SP446)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0351-432
將(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-5-(甲胺基)-5-側氧基戊酸第三丁酯(化合物SP445)(13.3g、粗產物)溶於二氯甲烷(140ml)與三氟乙酸(140ml)之混合液，於室溫攪拌2小時。於減壓下將溶劑餾去，將獲得之固體以己烷洗滌後，真空乾燥，獲得(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-5-(甲胺基)-5-側氧基戊酸(化合物SP446)(5.84g、93%、2步驟)。
LCMS(ESI)m/z=383(M+H)+
保持時間：2.07分(分析條件ZQAA05)
(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-5-(二甲胺基)-5-側氧基戊酸第三丁酯(化合物SP447)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0351-433
將(S)-3-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-4-(第三丁氧基)-4-側氧基丁酸(化合物SP444)(10.0g、23.5mmol)溶於二甲基甲醯胺(70ml)，加入((苯并三唑-1-氧基)-參(二甲胺基) 鏻六氟磷酸鹽(BOP)(12.5g、28.3mmol)、與二甲胺(58mmol)之2mol/l之四氫呋喃溶液，於室溫攪拌30分鐘。於反應液中加水，以二氯甲烷萃取。將有機萃取液以硫酸鎂乾燥，於減壓下將溶劑餾去，獲得(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-5-(二甲胺基)-5-側氧基戊酸第三丁酯(化合物SP447)(15.2g)粗產物。
LCMS(ESI)m/z=453(M+H)+
保持時間：3.00分(分析條件SQDAA05)
(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-5-(二甲胺基)-5-側氧基戊酸(化合物SP448)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0352-434
將(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-5-(二甲胺基)-5-側氧基戊酸第三丁酯(化合物SP447(15.2g、粗產物)溶於二氯甲烷(200ml)與三氟乙酸(200ml)之混合液，於室溫攪拌2.5小時。於減壓下將溶劑餾去，獲得之固體以己烷與第三丁基甲醚之混合溶液洗滌後，真空乾燥，獲得(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-5-(二甲胺基)-5-側氧基戊酸(化合物SP448)(9.12g、85%、2步驟)。
LCMS(ESI)m/z=397(M+H)+
保持時間：2.18分(分析條件ZQAA05)
(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(3-氟-4-羥基苯基)丙酸(Fmoc-Tyr(3-F)-OH、化合物SP450)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0353-435
將(S)-2-胺基-3-(3-氟-4-羥基苯基)丙酸(H-Tyr(3-F)-OH、SP449)(7.2g、36.2mmol)溶於10%碳酸鈉水溶液(250ml)，加入N-(9-茀基甲氧羰氧基)-琥珀醯亞胺(12.2g、36.2mmol)，於室溫攪拌1小時半。反應液中加水(120ml)後，以200ml之二乙醚洗滌2次，以100ml之二乙醚洗滌1次。於水層加入6N之HCl水溶液，使成酸性(pH=2)後，以250ml乙酸乙酯萃取2次、以200ml乙酸乙酯萃取1次。獲得之乙酸乙酯層以無水硫酸鎂乾燥，過濾並減壓濃縮，獲得標題化合物(SP450、15.3g、100%)。
LCMS(ESI)m/z=420.3(M-H)-
保持時間：0.39分(分析條件SQDAA50)
1-3.醯胺環化類藥胜肽之合成
1-3-1. C末端之Asp作為交叉單元之功能且亦即主鏈羧酸由哌啶等醯胺化、於側鏈羧酸與N末端之主鏈胺(三角單元)醯胺環化之具天冬胺酸之胜肽群之合成例
敘述C末端經醯胺化(本例為哌啶化)之天冬胺酸即側鏈羧酸與N末端之主鏈胺基以醯胺鍵環化之胜肽群之合 成例。本例作為1個代表例記述，但關於胜肽化學合成也可使用在本說明書之不同處記載之方法。以下於流程G1顯示其一合成例。
使用載持有化合物SP402(化合物SP401(Fmoc-Asp-pip)之2-氯三苯甲基樹脂)(200mg)，並且Fmoc胺基酸使用Fmoc-MePhe-OH、Fmoc-EtPhe-OH(化合物SP443)、Fmoc-MeAla-OH、Fmoc-MeLeu-OH、Fmoc-D-MeAla-OH、Fmoc-MeGly-OH、Fmoc-MeVal-OH、Fmoc-MeIlc-OH、Fmoe-g-McAbu-OH、Fmoe-b-McAla-OH、Fmoe-nPrGly-OH(化合物SP815)、Fmoc-MeAla(4-Thz)-OH(化合物SP811)、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Aze(2)-OH、Fmoc-Pic(2)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Phg-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-D-Val-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(Trt)-OH、Frnoc-Leu-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Frnoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Me2)-OH、Fmoc-Arg(Me2)-OH、Fmoc-Gln(Me2)-OH(化合物SP448)、Fmoc-Gln(Me)-OH(化合物SP446)、Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Algly-OH、Fmoc-Ala(4-Thz)-OH、Fmoc-Ala(CN)-OH、Fmoc-Hph-OH、Fmoc-Phe3-OH、Fmoc-Ala(3Pyr)-OH、Fmoc-Tyr(3-F)-OH(化合物SP450)等，進行胜肽之伸長(胺基酸之簡稱記載於表11-2)。依已於實施例記載之Fmoc法所為之胜肽合成法，進行胜肽之伸長。胜肽之伸長後，於胜肽合成機上實施N末端之Fmoc基之除去後，將樹脂以DMF洗滌。於樹脂加入4N HCl之1,4-二噁烷溶液/二氯甲烷/2,2,2-三氟乙醇/ 三異丙基矽烷(=1/60/30/5.7，v/v、4mL)，使反應2小時，從樹脂進行胜肽之切出。反應結束後，將管內溶液以合成用管柱過濾以去除樹脂，並將樹脂以二氯甲烷/2,2,2-三氟乙醇(=1/1，v/v、1mL)洗滌2次。將全部萃取液混合，以DIPEA(43.2μL、0.248mmol)中和後，於減壓下濃縮。將獲得之殘渣溶於二氯甲烷(8mL)。加入O-(7-氮雜-1H苯并三唑-1-基)-N,N，N,N四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)(0.24mmol)之DMSO溶液(0.24mL)，DIPEA(50.2μL、0.29mmol)，於室溫振盪2小時。於減壓下將溶劑餾去後，溶於DMSO，以製備性-HPLC精製，進行標題之醯胺環化類藥胜肽之合成。又，DP-1~39、DP-47~122、DP-125~176、DP-215~277、DP-317~343、DP-408~442、DP-465~482、DP-485~489、DP-494、DP-511~564、DP-587~588、DP-590~591、DP-593~594、DP-597~630、DP-632~638、DP-673~675、DP-677~751可依據本合成法之方法合成。各化合物之質譜之值與液體層析之保持時間記載於表11-3-2。
Figure 107130626-A0101-12-0355-436
【表11-1】
Figure 107130626-A0101-12-0356-437
Figure 107130626-A0101-12-0357-438
Figure 107130626-A0101-12-0358-439
Figure 107130626-A0101-12-0359-440
Figure 107130626-A0101-12-0360-441
Figure 107130626-A0101-12-0361-2220
Figure 107130626-A0101-12-0362-443
Figure 107130626-A0101-12-0363-2221
Figure 107130626-A0101-12-0364-445
Figure 107130626-A0101-12-0365-2222
Figure 107130626-A0101-12-0366-447
Figure 107130626-A0101-12-0367-2223
Figure 107130626-A0101-12-0368-449
Figure 107130626-A0101-12-0369-450
Figure 107130626-A0101-12-0370-451
Figure 107130626-A0101-12-0371-2224
Figure 107130626-A0101-12-0372-2225
Figure 107130626-A0101-12-0373-454
Figure 107130626-A0101-12-0374-455
Figure 107130626-A0101-12-0375-456
Figure 107130626-A0101-12-0376-457
Figure 107130626-A0101-12-0377-458
Figure 107130626-A0101-12-0378-459
【表11-2】
Figure 107130626-A0101-12-0379-460
Figure 107130626-A0101-12-0380-461
Figure 107130626-A0101-12-0381-491
Figure 107130626-A0101-12-0382-492
Figure 107130626-A0101-12-0383-493
Figure 107130626-A0101-12-0384-494
Figure 107130626-A0101-12-0385-495
Figure 107130626-A0101-12-0386-496
【表11-3-1】
Figure 107130626-A0101-12-0387-497
Figure 107130626-A0101-12-0388-498
Figure 107130626-A0101-12-0389-499
Figure 107130626-A0101-12-0390-500
Figure 107130626-A0101-12-0391-501
Figure 107130626-A0101-12-0392-502
Figure 107130626-A0101-12-0393-503
Figure 107130626-A0101-12-0394-504
Figure 107130626-A0101-12-0395-505
Figure 107130626-A0101-12-0396-506
Figure 107130626-A0101-12-0397-507
Figure 107130626-A0101-12-0398-508
Figure 107130626-A0101-12-0399-509
Figure 107130626-A0101-12-0400-510
Figure 107130626-A0101-12-0401-511
Figure 107130626-A0101-12-0402-512
Figure 107130626-A0101-12-0403-513
Figure 107130626-A0101-12-0404-514
Figure 107130626-A0101-12-0405-515
Figure 107130626-A0101-12-0406-516
Figure 107130626-A0101-12-0407-517
Figure 107130626-A0101-12-0408-518
Figure 107130626-A0101-12-0409-519
Figure 107130626-A0101-12-0410-520
Figure 107130626-A0101-12-0411-521
Figure 107130626-A0101-12-0412-522
Figure 107130626-A0101-12-0413-523
Figure 107130626-A0101-12-0414-524
Figure 107130626-A0101-12-0415-525
Figure 107130626-A0101-12-0416-526
Figure 107130626-A0101-12-0417-527
Figure 107130626-A0101-12-0418-528
Figure 107130626-A0101-12-0419-529
Figure 107130626-A0101-12-0420-530
Figure 107130626-A0101-12-0421-531
Figure 107130626-A0101-12-0422-532
Figure 107130626-A0101-12-0423-533
Figure 107130626-A0101-12-0424-534
Figure 107130626-A0101-12-0425-535
Figure 107130626-A0101-12-0426-536
Figure 107130626-A0101-12-0427-537
Figure 107130626-A0101-12-0428-538
Figure 107130626-A0101-12-0429-539
Figure 107130626-A0101-12-0430-540
Figure 107130626-A0101-12-0431-541
Figure 107130626-A0101-12-0432-542
Figure 107130626-A0101-12-0433-543
Figure 107130626-A0101-12-0434-544
Figure 107130626-A0101-12-0435-545
Figure 107130626-A0101-12-0436-546
Figure 107130626-A0101-12-0437-547
Figure 107130626-A0101-12-0438-548
Figure 107130626-A0101-12-0439-549
Figure 107130626-A0101-12-0440-550
Figure 107130626-A0101-12-0441-551
Figure 107130626-A0101-12-0442-552
Figure 107130626-A0101-12-0443-553
Figure 107130626-A0101-12-0444-554
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Figure 107130626-A0101-12-0446-556
Figure 107130626-A0101-12-0447-557
Figure 107130626-A0101-12-0448-558
Figure 107130626-A0101-12-0449-559
Figure 107130626-A0101-12-0450-560
Figure 107130626-A0101-12-0451-561
Figure 107130626-A0101-12-0452-562
Figure 107130626-A0101-12-0453-563
Figure 107130626-A0101-12-0454-564
Figure 107130626-A0101-12-0455-565
Figure 107130626-A0101-12-0456-566
Figure 107130626-A0101-12-0457-567
Figure 107130626-A0101-12-0458-568
Figure 107130626-A0101-12-0459-569
Figure 107130626-A0101-12-0460-570
Figure 107130626-A0101-12-0461-571
Figure 107130626-A0101-12-0462-572
Figure 107130626-A0101-12-0463-573
Figure 107130626-A0101-12-0464-574
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Figure 107130626-A0101-12-0466-576
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Figure 107130626-A0101-12-0470-580
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Figure 107130626-A0101-12-0476-586
Figure 107130626-A0101-12-0477-587
Figure 107130626-A0101-12-0478-588
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Figure 107130626-A0101-12-0480-590
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Figure 107130626-A0101-12-0482-592
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Figure 107130626-A0101-12-0484-594
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Figure 107130626-A0101-12-0490-600
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Figure 107130626-A0101-12-0500-610
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Figure 107130626-A0101-12-0515-2230
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Figure 107130626-A0101-12-0533-2246
Figure 107130626-A0101-12-0534-2248
Figure 107130626-A0101-12-0535-696
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Figure 107130626-A0101-12-0537-698
Figure 107130626-A0101-12-0538-699
Figure 107130626-A0101-12-0539-700
Figure 107130626-A0101-12-0540-701
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Figure 107130626-A0101-12-0550-711
Figure 107130626-A0101-12-0551-712
Figure 107130626-A0101-12-0552-713
Figure 107130626-A0101-12-0553-714
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Figure 107130626-A0101-12-0556-717
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Figure 107130626-A0101-12-0558-719
Figure 107130626-A0101-12-0559-720
Figure 107130626-A0101-12-0560-721
Figure 107130626-A0101-12-0561-722
Figure 107130626-A0101-12-0562-723
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Figure 107130626-A0101-12-0567-728
Figure 107130626-A0101-12-0568-729
Figure 107130626-A0101-12-0569-730
Figure 107130626-A0101-12-0570-731
Figure 107130626-A0101-12-0571-732
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Figure 107130626-A0101-12-0573-734
Figure 107130626-A0101-12-0574-735
Figure 107130626-A0101-12-0575-736
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Figure 107130626-A0101-12-0577-738
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Figure 107130626-A0101-12-0579-740
Figure 107130626-A0101-12-0580-741
Figure 107130626-A0101-12-0581-742
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Figure 107130626-A0101-12-0584-745
Figure 107130626-A0101-12-0585-746
Figure 107130626-A0101-12-0586-747
Figure 107130626-A0101-12-0587-748
Figure 107130626-A0101-12-0588-749
Figure 107130626-A0101-12-0589-750
Figure 107130626-A0101-12-0590-751
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Figure 107130626-A0101-12-0605-766
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Figure 107130626-A0101-12-0609-770
Figure 107130626-A0101-12-0610-771
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Figure 107130626-A0101-12-0612-773
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Figure 107130626-A0101-12-0622-783
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Figure 107130626-A0101-12-0629-790
Figure 107130626-A0101-12-0630-791
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Figure 107130626-A0101-12-0632-793
Figure 107130626-A0101-12-0633-794
Figure 107130626-A0101-12-0634-795
Figure 107130626-A0101-12-0635-796
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Figure 107130626-A0101-12-0637-820
Figure 107130626-A0101-12-0638-821
Figure 107130626-A0101-12-0639-822
Figure 107130626-A0101-12-0640-823
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Figure 107130626-A0101-12-0642-825
Figure 107130626-A0101-12-0643-826
Figure 107130626-A0101-12-0644-827
Figure 107130626-A0101-12-0645-828
Figure 107130626-A0101-12-0646-829
Figure 107130626-A0101-12-0647-830
又，記載之LC-Mass條件之細節記載於表11-4
【表11-4】
Figure 107130626-A0101-12-0648-831
1-3-2.具有直鏈部1之胜肽之合成例之1
具有經固定之直鏈部(MePhe-Ala-pip及MePhe-MePhe-Ala-pip)之胜肽之合成
記述C末端經醯胺化(本例為哌啶化)、且利用於C末端以外配置之天冬胺酸側鏈羧酸與N末端胺基以醯胺鍵環化之合成例。本例係作為1個代表例記述，但是針對胜肽化學合成，也可使用在本說明書之不同處(例如142、512(實施例15之2-2)、553(實施例18)等)之各處記載之方法。以下流程X顯示其合成之一例。
Figure 107130626-A0101-12-0648-2249
使用與化合物SP455以同樣方法合成之Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-Resin)-MePhe-Ala-pip(200mg)，作為Fmoc胺基酸使用Fmoc-MePhe-OH、Fmoc-EtPhe-OH(化合物 SP443)、Fmoc-MeAla-OH、Fmoc-MeLeu-OH、Fmoc-D-MeAla-OH、Fmoc-MeGly-OH、Fmoc-MeVal-OH、Fmoc-MeIle-OH、Fmoc-g-MeAbu-OH、Fmoc-b-MeAla-OH、Fmoc-nPrGly-OH(化合物SP815)、Fmoc-MeAla(4-Thz)-OH(化合物SP811)、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Aze(2)-OH、Fmoc-Pic(2)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Phg-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-D-Val-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Me2)-OH、Fmoc-Arg(Me2)-OH、Fmoc-Gln(Me2)-OH(化合物SP448)、Fmoc-Gln(Me)-OH(化合物SP446)、Fmoc-Gln-OH、Fmoc-AlGly-OH、Fmoc-Ala(4-Thz)-OH、Fmoc-Ala(CN)-OH、Fmoc-Hph-OH、Fmoc-Phe3-OH、Fmoc-Ala(3Pyr)-OH、Fmoc-Tyr(3-F)-OH(化合物SP450)、Fmoc-Glu(OAl)-OH，Fmoc-His(Mmt)-OH，Fmoc-Ala(5-Tet(Trt))-OH(化合物SP409)等，進行胜肽之伸長(胺基酸之簡稱記載於表11-2)。依已於實施例記載之Fmoc法所為之胜肽合成法，實施胜肽之伸長。例如：化合物DP-177之合成的情形，於胜肽之伸長後，在胜肽合成機上進行N末端之Fmoc基之除去後，將樹脂以DMF洗滌。於樹脂加入4N HCl之1,4-二噁烷溶液/二氯甲烷/2,2,2-三氟乙醇/三異丙基矽烷(=1/60/30/5.7，v/v、4mL)，反應2小時，從樹脂進行胜肽之切出。反應結束後，將管內溶液以合成用管柱過濾以去除樹脂，將樹脂以二氯甲烷/2,2,2-三氟乙醇(=1/1，v/v、1mL)洗滌2次。將全部萃取液混合，並以 DIPEA(50.0μL、0.286mmol)中和後，於減壓下濃縮。將獲得之殘渣溶於二氯甲烷(8mL)。加入O-(7-氮雜-1H苯并三唑-1-基)-N,N,N,N四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)(68mg、0.18mmol)之DMSO溶液(0.20mL)，DIPEA(37μL、0.21mmol)，於室溫振盪2小時。於減壓下將溶劑餾去後，溶於DMSO，以製備性-HPLC精製，獲得DP-177(4.27mg、5%)。與上述以同樣方法、或將Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-Resin)-MePhe-Ala-pip替換為使用化合物SP459以同樣方法製備之Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-Resin)-MePhe-MePhe-Ala-pip，進行標題之醯胺環化類藥胜肽之合成。又，DP-123~124、DP-177~214、DP-278~316、DP-344~407、DP-443~464、DP-483~484、DP-490~493、DP-495~510、DP-587~588、DP-590~591、DP-593~594、DP-597~613、DP-631可用依據本合成法之方法合成。各化合物之質譜之值與液體層析之保持時間記載於表11-3-2。
1-3-3.具有直鏈部1之胜肽之合成例之2
記載C末端經醯胺化(本例為哌啶化)、且利用C末端以外配置之天冬胺酸側鏈羧酸與N末端胺基以醯胺鍵環化之合成例。本例記述1個代表例，但針對胜肽化學合成，也可使用在本說明書之不同處之各處記載之方法。以下流程G2顯示其一合成例。
N末端之Fmoc胺基酸替換為使用Boc胺基酸，使用載持有Fmoc-Ile-OH或Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH之2-氯三苯甲基樹脂(100mg)(胺基酸載持於樹脂 之方法依前述方法)，天冬胺酸之來源使用Fmoc-Asp(OtBu)-OH，依已於實施例記載之Fmoc法所為之胜肽合成法，進行胜肽之伸長。胜肽之伸長後，於樹脂加入二氯甲烷/2,2,2-三氟乙醇/三異丙基矽烷(=1/1/0.2，v/v、2mL)，使反應2小時，進行從樹脂切出胜肽。反應結束後，將管內之溶液以合成用管柱過濾去除樹脂，將樹脂以二氯甲烷/2,2,2-三氟乙醇(=1/1，v/v、1mL)洗滌2次後，將全部萃取液混合，於減壓下濃縮。獲得之殘渣以O-(7-氮雜-1H苯并三唑-1-基)-N,N，N,N四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)(0.12mmol)、DIPEA(0.145mmol)、哌啶(0.145mmol)將C末端之羧酸予以哌啶醯胺化後，於減壓下將溶劑餾去。將獲得之殘渣以TFA/三異丙基矽烷/二氯甲烷(3/1/6、v/v、0.5mL)處理，同時進行N末端之Boc基、o-三苯甲基及天冬胺酸側鏈羧酸之第三丁基之除去。反應完結後，加入冰冷之DMF(3mL)後，於減壓下將溶劑餾去。將獲得之殘渣溶於二氯甲烷(3mL)。再者，加入水(0.5mL)後，將溶液通入以水(0.5mL)透濕之矽藻土管柱(1mL、Chem Elut、安捷倫科技公司製)，以二氯甲烷(3mL)萃取2次。將全部萃取液混合，將溶液以O-(7-氮雜-1H苯并三唑-1-基)-N,N，N,N四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)(0.12mmol)、DIPEA(0.145mmol)處理，進行胜肽之環化。於減壓下將溶劑餾去後，溶於DMSO，以製備性-HPLC精製，進行具直鏈部1之醯胺環化類藥胜肽之合成。又，DP-40~46、DP-565~584、DP-658~672、DP-910~956、DP-960~963、DP-965可用依據本合成法之方法合成。各化合物之質譜之值與液體層析之保持時 間記載於表11-3-2。
Figure 107130626-A0101-12-0652-833
1-3-4.具有直鏈部1及2之胜肽之合成
記述C末端以外配置之天冬胺酸側鏈羧酸經醯胺化(本例也可哌啶與構成直鏈部1之胜肽鍵結)、利用N末端以外配置之具胺基側鏈之胺基酸之側鏈胺基與C末端配置之胺基酸之羧酸環化之胜肽之化學合成例。在此，具直鏈部1及2之胜肽之例，就交叉單元(○單元)而言舉例Asp-pip、胺基源舉例帶有保護基之具胺基側鏈之胺基酸、N末端使用羧酸類似物之情形為代表例。本例中，也可使用N末端使用之HOGly係保護羥基之化合物。針對胜肽化學合成，也可使用在本說明書之不同處之各處記載之方法。以下流程G3顯示其一合成例。
Figure 107130626-A0101-12-0652-834
記述本例為1個代表例，但合成法不拘於本法，其應用可採各種方法。例如：如非專利文獻(Tetrahedron Lett.1993,34,4709-4712)等，側鏈羧酸之保護基使用烯丙酯、環化部位胺基之保護基使用1-(4,4-二甲基-2,6-二側氧基環亞己基)乙基(Dde)，進行胜肽之伸長後，於將Dde基經脫保護之胺基使寡胜肽縮合，與已經將烯丙酯脫保護之羧酸在樹脂上進行環化也可合成。
DP-964 HOGly-Pro-MeLeu-＊Lys-MeAla-Leu-MeLeu-MeLeu-Asp-哌啶-MeLeu-Mephe(3-Cl)-Ile＊(於2個＊部位環化)
Figure 107130626-A0101-12-0653-835
N末端將Fmoc胺基酸替換為使用HOGly，天冬胺酸源使用Fmoc-Asp-Piperidine，使用載持有Fmoc-Ile-OH之2-氯三苯甲基樹脂(100mg)，Fmoc胺基酸使用Fmoc-MePhe(3-Cl)-OH(化合物SP812)、Fmoc-MeAla-OH、Fmoc-MeLeu-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、等，進行胜肽之伸長(胺基酸之簡稱記載於表11-2)。依已於實施例記載之Fmoc法所為之胜肽合成法，進行胜肽之伸長。將4N HCl之1,4-二噁烷溶液/二氯甲烷/三氟乙醇/三異丙基矽烷(1/40/20/4、v/v、2mL)加入樹脂，使反應2小時，進行從樹脂切出胜肽。反應結束後，將管內之溶液以合成用管柱過濾去除樹脂，於裝有DMF(1mL)之管添加反應液。將樹脂以二氯甲烷/2,2,2-三氟乙醇(=1/1，v/v、1mL)洗滌2次後，以逆相管柱層析精製。將獲得之產物溶於二氯甲烷(8mL)後，加入O-(7-氮雜-1H苯并三唑-1-基)-N,N，N,N四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)(0.129mmol)之DMSO溶液(0.129mL)、DIPEA(30.0μL、0.155mmol)，於室溫振盪1小時。於減壓下將溶劑餾去後，溶於DMSO，以逆相管柱層析(Wakosil 25C18、0.1%甲酸水溶液/0，1%甲酸乙腈)精製，獲得標題化合物DP-964(1.6mg、1.6%)。
LCMS(ESI)m/z=1479(M-H)-
保持時間：0.85分(分析條件SQDAA50)
1-3-5.具有胜肽環化後，必須使用弱酸予以脫保護之胺基酸(本件係Fmoc-Ala(5-Tet(Trt))-OH及Fmoc-His(Mmt)-OH)之胜肽之合成
使用與化合物SP402以同樣方法合成之Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-Resin)-pip(100mg)，作為Fmoc胺基酸使用Fmoc-MePhe-OH、Fmoc-MeAla-OH、Fmoc-MeLeu-OH、Fmoc-D-MeAla-OH、Fmoc-MeGly-OH、Fmoc-MeVal-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-D-Val-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Mmt)-OH，Fmoc-Ala(5-Tet(Trt))-OH(化合物409)等，進行胜肽之伸長(胺基酸之簡稱記載於表11-2)。依已於實施例記載之Fmoc法所為之胜肽合成法，進行胜肽之伸長。例如：化合物DP-908之合成的情形，將N末端之Fmoc基脫保護，於樹脂加入二氯甲烷/三氟乙醇(=2/1、v/v、2ml)，進行2小時振盪，進行從樹脂切出胜肽。反應結束後，將管內溶液以合成用管柱過濾去除樹脂。再於樹脂加入二氯甲烷/三氟乙醇(=2/1、v/v、1ml)，進行15分鐘振盪，合併上述溶液，將溶劑餾去。將獲得之殘渣溶於DCM(8ml)，加入DIPEA(17μL、0.096mmol)。於其中加入1M-O-(7-氮雜-1H苯并三唑-1-基)-N,N，N,N四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)(30mg，0.08mmol)於DMSO(250μL)，進行N末胺與Asp側鏈羧酸之環化反應。反應結束後，將溶劑餾去。將獲得之殘渣溶於三氟乙醇(1.0ml)。於其中加入TFA/三異丙基矽烷/DCM(1/5/94、v/v/v、1.0ml)，攪拌10分鐘，進行保護基之脫保護。反應結束後，加入DIPEA(50μL，0.286mmol)將TFA中和，並將溶劑餾去。獲得之粗產物溶於二甲基亞碸，獲得之 胜肽溶液以高速逆相層析(HPLC)精製，並將溶劑餾去。獲得之殘渣溶於三氟乙醇(1.5ml)，加入水(0.5ml)與己烷(2ml)並攪拌，將己烷層除去。再度加入己烷(2ml)並攪拌，去除己烷層後將溶劑餾去，獲得化合物DP-908(1.92mg，4.8%)。使用與上述為同樣方法、或將Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-Resin)-pip替換為使用化合物SP455且同樣製備之Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-Resin)-MePhe-Ala-pip，進行標題之醯胺環化類藥胜肽之合成。DP-585~586、DP-592、DP-676、DP-904~909可用依據本合成法之方法合成。各化合物之質譜之值與液體層析之保持時間記載於表11-3-2。
1-3-6.具有胜肽環化後，須要使用還原反應予以脫保護之胺基酸(本件係Fmoc-Glu(OAl)-OH)之胜肽之合成
使用與化合物SP455以同樣方法合成之Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-Resin)-MePhe-Ala-pip(100mg)、作為Fmoc胺基酸之Fmoc-MePhe-OH、Fmoc-MeAla-OH、Fmoc-MeLeu-OH、Fmoc-MeGly-OH、Fmoc-MeVal-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-D-Val-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OAl)-OH等，進行胜肽之伸長(胺基酸之簡稱記載於表11-2)。依照已於實施例記載之Fmoc法所為之胜肽合成法，進行胜肽之伸長。例如：化合物DP-595之合成的情形，將N末端之Fmoc基脫保護，於樹脂加入二氯甲烷/三氟乙醇(=2/1、v/v、2ml)，進行2小時振盪，進行從樹脂切出胜肽。反應結束 後，將管內溶液以合成用管柱過濾將樹脂去除。再於樹脂加入二氯甲烷/三氟乙醇(=2/1、v/v、1ml)並進行15分鐘振盪，合併上述溶液，將溶劑餾去。獲得之殘渣溶於DCM(8ml)，加入DIPEA(20μL、0.115mmol)。於其中加入1MO-(7-氮雜-1H苯并三唑-1-基)-N,N，N,N四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)(37mg，0.096mmol)於DMSO(200μL)，進行N末端胺與Asp側鏈羧酸之環化反應。反應結束後，將溶劑餾去。獲得之粗產物溶於DMF，加入肆(三苯基膦)鈀(0)(Pd(PPh3)4)(7mg、0.006mmol)之二氯甲烷(1ml)溶液。然後，加入苯基矽烷(7.4ul，0.06mmol)，於室溫攪拌1小時。將反應液過濾後，將有機層減壓濃縮，將獲得之粗產物溶於DMSO，獲得之胜肽溶液以高速逆相層析(HPLC)精製後，將溶劑餾去，獲得化合物DP-595(14.7mg，22%)。與上述以同樣方法進行醯胺環化類藥胜肽DP-589、DP-596之合成。各化合物之質譜之值與液體層析之保持時間記載於表11-3-2。
1-3-7.將C末端胺基酸具有之主鏈羧酸部位除去且取代為烷基等之胜肽衍生物之合成
記載C末端使用beta-胺基酸衍生物、且C末端之beta胺基酸衍生物與N末端胺基以醯胺鍵環化之不具直鏈部之化合物之合成例。針對胜肽化學合成，也可使用本說明書之不同處之各處記載之方法。
使用與2-氯三苯甲基樹脂鍵結之化合物(化合物SP405、100mg)，作為Fmoc胺基酸使用Fmoc-MePhe-OH、Fmoc-MePhe(3-Cl)-OH、Fmoc-MeAla-OH、Fmoc-b-MeAla-OH、 Fmoc-g-MeAbu-OH、Fmoc-MeLeu-OH、Fmoc-MeIle-OH、Fmoc-MeVal-OH、Fmoc-D-MeAla-OH、Fmoc-MeGly-OH、Fmoc-MeSer(DMT)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Phe(4-CF3)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-D-Val-OH、Fmoc-Ser(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-AOC(2)-OH、Fmoc-Abu-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH等，依照已於實施例記載之Fmoc法所為之胜肽合成法，進行胜肽之伸長(胺基酸之簡稱記載於表11-2)。胜肽之伸長後，例如化合物DP-639的情形，將N末端之Fmoc基脫保護，於樹脂加入二氯甲烷/三氟乙醇(=2/1、v/v、2ml)，進行2小時振盪，進行從樹脂切出胜肽。反應結束後，將管內溶液以合成用管柱過濾將樹脂去除。再於樹脂加入二氯甲烷/三氟乙醇(=2/1、v/v、1ml)，進行15分鐘振盪，合併上述溶液，將溶劑餾去。將獲得之殘渣溶於DCM(4ml)，添加DIPEA(31.6μl、3.6eq.)。於其中加入1M O-(7-氮雜-1H苯并三唑-1-基)-N,N，N,N四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)於DMSO(155μl、3.0eq.)，進行N末端之主鏈胺與C末端之羧酸間的環化反應。反應結束後，將溶劑餾去。獲得之殘渣溶於三氟乙醇(1.1ml)，添加三異丙基矽烷(5.0eq.)。於其中加入TFA/DCM(1/99、v/v、1.1ml)，攪拌10分鐘，進行保護基之脫保護。反應結束後，加入DIPEA(43.9μl、5.0eq.)，將TFA中和並將溶劑餾去。獲得之粗產物溶於二甲基亞碸，將獲得之胜肽溶液以高速逆相層析(HPLC)精製，並將溶劑餾去。獲得之殘 渣溶於三氟乙醇(1.5ml)，加入水(0.5ml)與己烷(2ml)並攪拌，將己烷層除去。再度添加己烷(2ml)並攪拌，去除己烷層後將溶劑餾去，獲得DP-639。使用與DP-639以同樣方法、或使用將Fmoc-L-3-ABU-(O-Trt-(2-Cl)-Resin((S)-3-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)丁酸-2-氯三苯甲酯樹脂)替換為使用Fmoc-3-CF3-bAla-(O-Trt-(2-Cl)-Resin((S)-3-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-4,4,4-三氟丁酸-2-氯三苯甲酯樹脂、化合物SP407)，獲得DP-640~DP-657、DP-752~DP829。各化合物之質譜之值與液體層析之保持時間記載於表11-3-2。
2.C-C環化胜肽之合成
2-1.C-C為合成環化胜肽之N末端羧酸衍生物之合成
2-1-1.戊-4-炔酸甲酯
Figure 107130626-A0101-12-0659-836
將戊-4-炔酸(5.0g、51.0mmol)溶於MeOH(20ml)，於冰冷下加入三甲基矽基重氮甲烷之二乙醚溶液(2.0M、50ml、100mmol)。於室溫攪拌30分鐘後，將反應液減壓濃縮，獲得標題化合物(5.7g、100%)。
1H-NMR(Varian 400-MR，400MHz，CDCl3)δ ppm 3.72(3H，s)，2.50-2.60(4H，m)，1.99(1H，m)
2-1-2.(E)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼烷(dioxaborolan)-2-基)戊-4-烯酸 甲酯
Figure 107130626-A0101-12-0660-837
將戊-4-炔酸甲酯(5.0g、44.6mmol)與4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼烷(7.42g、58.0mmol)混合，加入氫氯二茂鋯(1.18g、4.46mmol)及三乙胺(0.622ml、4.46mmol)，於65度終夜攪拌。放冷後，將反應液以二乙醚稀釋，將析出之白色固體以沸石過濾除去。將濾液減壓濃縮，並將獲得之殘渣以管柱層析(己烷：乙酸乙酯)精製，獲得標題化合物(5.36g、50.1%)。
1H-NMR(Varian 400-MR，400MHz，CDCl3)δ ppm 6.02(1H，dt，18，5.6Hz)，5.48(1H，d，18Hz)，3.68(3H，s)，2.40-2.53(4H，m)，1.28(12H，s)
2-1-3.(E)-5-硼戊-4-烯酸
Figure 107130626-A0101-12-0660-838
將(E)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼烷-2-基)戊-4-烯酸 甲酯(2.0g、8.33mmol)溶於MeOH(100ml)，加入0.8M氫氧化鉀水溶液(52.1ml、41.6mmol)並於室溫終夜攪拌。以減壓濃縮將MeOH除去後，加入3M鹽酸直到pH成為3。將該水溶液以第三丁基-甲醚洗滌後減壓濃縮。將獲得之殘渣以管柱層析(10mM乙酸銨水溶液：甲醇)精製，減壓濃縮並將獲得之固體再度以第三丁基-甲醚洗滌，獲得標題化合物(674.6mg、56.3%)。
1H-NMR(Varian 400-MR，400MHz，D2O)δ ppm 6.59(1H，m)，5.51(1H，d，18Hz)，2.44-2.51(4H，m)
2-2.C-C環化之類藥胜肽之合成
2-2-1.＊Phe-MeLeu-MeVal-MeGly-Thr-MeAla-Ala-MeLeu-Leu-Phe＊-哌啶(於2個＊之間以C-C鍵結)(化合物DCC-1)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0661-839
依照已於實施例記載之Fmoc法所為之胜肽合成法，將N末端從Fmoc胺基酸替換為使用(E)-5-硼戊-4-烯酸進行合成之((2S，5S，8S，11S，14S，17S，23S，26S，29S，E)-29-苄基-17-((R)-1-羥基乙基)-2-(3-碘苄基)-5,8,26-三異丁基-23-異丙基-9,11,14,15,21,24,27-七甲基-1,4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-十一側氧基-1-(哌啶-1-基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-十氮雜五-三十-34-烯-35-基)硼酸 (Phe-MeLeu-MeVal-MeGly-Thr-MeAla-Ala-MeLeu-Leu-Phe(3-I)-哌啶、上述反應式之原料化合物、0.02g、0.0405mmol)溶於DMF(7.0ml)，加入Pd(dppf)Cl2‧CH2Cl2(10.0mg、0.012mmol)、三乙胺(0.282ml、2.025mmol)，於80度進行2小時半攪拌。將反應液放冷、減壓濃縮後，溶於DMSO，以製備性-HPLC精製，獲得標題化合物DCC-1(3.32mg、6.5%)。
LCMS：m/z 1268.8(M+H)+
保持時間：0.75分(分析條件SQDAA50)
2-2-1.＊Phe-MeLeu-MeVal-MeGly-Thr-MeAla-Ala-MeLeu-Leu-Phe＊-哌啶(於2個＊之間以C-C鍵結)(化合物DCC-2)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0662-840
作為合成上述DCC-1之反應之反應副產物，獲得標題化合物DCC-2(2.43mg、4.8%)。
LCMS：m/z 1268.8(M+H)+
保持時間：0.78分(分析條件SQDAA50)
2-3.C-C鍵結化合物類藥評價
也記述C-C鍵結環化胜肽合成之其他方法。於利用C-C鍵結環化之展示庫(Display library)中，藉由例如將N末端側之三角單元部位具有碳-碳雙鍵、C末端側之交叉單元之胺基酸之側鏈具有碘苯基之胜肽予以轉譯合成後(流程C-2)，利用使用 Pd之Heck反應可獲得C-C鍵結環化產物。
為了評價上述方法獲得之C-C鍵結環化產物之類藥，進行C-C鍵結環化胜肽之合成。以下流程H顯示其一合成例。環化胜肽之合成時，不以Pd進行環化反應，而以醯胺化反應合成環化胜肽。亦即，合成交叉單元C末端苯丙胺酸之主鏈羧酸以醯胺化學修飾(哌啶醯胺化)，且於側鏈上之羧酸部位與樹脂鍵結而得之苯丙胺酸衍生物，並使用此樹脂，依Fmoc合成法進行胜肽之伸張反應。伸張後，將胜肽從樹脂切出，使N末端側之胺基(三角單元)與C末端苯丙胺酸衍生物側鏈上之羧酸部位(交叉單元)以醯胺鍵縮合成環化體，以進行相當於展示庫(Display library)之產物之C-C鍵結環化胜肽之合成。流程H僅記載以C-C鍵結獲得C-C之雙鍵之情形，但也可為C-C之單鍵或參鍵，可依其情形合成化合物群。
Figure 107130626-A0101-12-0663-841
2-3-1.胺基酸單元及鍵結於樹脂之胺基酸單元之合成
作為類藥評價使用之交叉單元部位之苯丙胺酸衍生物，合成以下所示之胺基酸及其樹脂鍵結化合物。
Figure 107130626-A0101-12-0664-842
化合物SP416及化合物SP417之合成(S)-(3-(4-碘苯基)-1-側氧基-1-(哌啶-1-基)丙烷-2-基)胺甲酸第三丁酯(化合物SP413、Boc-Phe(4-I)-pip)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0664-2250
使(S)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-3-(4-碘苯基)丙酸(Boc-Phe(4-I)-OH)(15.0g、38.3mmol)溶於DMF(180.0ml)，於冰冷下加入哌啶(7.95ml、80.6mmol)、HATU(17.5g、46.0mmol)及DIPEA(8.01ml、46.0mmol)。於室溫攪拌30分鐘後，將反應液以己烷/乙酸乙酯(1/1、400ml)稀釋，以飽和碳酸氫鈉水溶液 及飽和氯化銨水溶液洗滌。將有機層以無水硫酸鎂乾燥後，過濾、並減壓濃縮，獲得標題化合物SP413(16.9g、96%)淡黃色固體。
LCMS(ESI)m/z=459.5(M+H)+
保持時間：1.05分(分析條件SQDAA05)
(S)-(1-側氧基-1-(哌啶-1-基)-3-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼烷-2-基)苯基)丙烷-2-基)胺甲酸 第三丁酯(化合物SP414)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0665-844
將(S)-(3-(4-碘苯基)-1-側氧基-1-(哌啶-1-基)丙烷-2-基)胺甲酸 第三丁酯(化合物SP413)(6.0g、13.09mmol)溶於DMSO(60.0ml)，加入雙(頻哪醇合)二硼(bis(pinacolato)diboron)(4.99g、19.64mmol)、Pd(dppf)Cl2‧CH2Cl2(0.538g、0.655mmol)及乙酸鉀(5.40g、55.02mmol)，於室溫攪拌5小時。將反應液以己烷/乙酸乙酯(1/1)稀釋，以飽和氯化銨水溶液及飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌。將有機層以無水硫酸鎂乾燥後，過濾、減壓濃縮，將獲得之殘渣以管柱層析(己烷：乙酸乙酯=100：0~60：40)精製，獲得標題化合物SP414(5.55g、92%)。
LCMS(ESI)m/z=459.4(M+H)+
保持時間：0.99分(分析條件SQDFA05)
(S)-4-(4-(2-((第三丁氧羰基)胺基)-3-側氧基-3-(哌啶-1-基)丙基)苯基)戊-4-烯酸 第三丁酯(化合物SP415)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0666-845
將(S)-(1-側氧基-1-(哌啶-1-基)-3-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼烷-2-基)苯基)丙烷-2-基)胺甲酸 第三丁酯(化合物SP414)(3.00g、6.54mmol)溶於DMF(24.0ml)及水(6.0ml)，依以文獻(Organic Letters、2011、13、5830-5833)記載方法合成之4-溴戊-4-烯酸 第三丁酯(2.31g、9.82mmol)、Pd(PPh3)4(1.13g、0.978mmol)及碳酸鉀(1.81g、13.10mmol)，於80℃進行2小時攪拌。放冷後，將反應液以己烷/乙酸乙酯(1/1)稀釋，以飽和碳酸氫鈉水溶液及飽和氯化銨水溶液洗滌。將有機層以無水硫酸鎂乾燥後，過濾、減壓濃縮，將獲得之殘渣以管柱層析(己烷：乙酸乙酯=100：0~75：25)精製，獲得標題化合物SP415(2.72g、85%)。
LCMS(ESI)m/z=487.6(M+H)+
保持時間：1.05分(分析條件SQDFA05)
(S)-4-(4-(2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-側氧基-3-(哌啶-1-基)丙基)苯基)戊-4-烯酸(化合物SP416)之合 成
Figure 107130626-A0101-12-0667-846
使(S)-4-(4-(2-((第三丁氧羰基)胺基)-3-側氧基-3-(哌啶-1-基)丙基)苯基)戊-4-烯酸 第三丁酯(化合物SP415)(0.50g、1.03mmol)懸浮於乙酸(7.0ml、122.28mmol)及水(7.0ml)，於加熱回流條件攪拌8小時。追加同樣反應，實施4次，合併反應液並減壓濃縮，將獲得之殘渣懸浮於10%碳酸鈉水溶液(38ml)，加入N-(9-茀基甲氧羰氧基)-琥珀醯亞胺(1.65g、4.89mmol)之1,4-二噁烷溶液(19.0ml)，於室溫攪拌1小時。將反應液以二乙醚洗滌，加入乙酸使成酸性後，以乙酸乙酯萃取。將有機層以無水硫酸鎂乾燥，過濾、減壓濃縮，將獲得之殘渣以管柱層析(己烷：乙酸乙酯=100：0~40：60)精製，獲得標題化合物SP416(1.60g、56.3%)。
LCMS(ESI)m/z=553.4(M+H)+
保持時間：0.89分(分析條件SQDFA05)
(S)-4-(4-(2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-側氧基-3-(哌啶-1-基)丙基)苯基)戊-4-烯酸-2-氯三苯甲酯樹脂(化合物SP417)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0668-847
將2-氯三苯甲基氯化物樹脂(1.07mmol/g、100-200mesh、1%DVB、Chem-Impex公司製，2.50g、2.68mmol)與二氯甲烷(18ml)混合，於室溫進行5分鐘振盪。去除二氯甲烷後，添加於(S)-4-(4-(2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-側氧基-3-(哌啶-1-基)丙基)苯基)戊-4-烯酸(化合物SP416)(0.74g、1.34mmol)之二氯甲烷溶液(16.5ml)加入甲醇(0.43ml、10.7mmol)及二異丙基乙胺(1.1ml、6.32mmol)之混合液，於室溫進行10分鐘振盪。去除反應液後，添加於二氯甲烷(16.5ml)加入甲醇(5ml)及二異丙基乙胺(1.7ml)之混合液，於室溫進行2小時振盪。去除該反應液後，放入二氯甲烷(18ml)並振盪，去除二氯甲烷後，再度放入二氯甲烷(18ml)並振盪。去除二氯甲烷後，於減壓下將樹脂乾燥，獲得標題化合物SP417(2.53g)。
於獲得之(S)-4-(4-(2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-側氧基-3-(哌啶-1-基)丙基)苯基)戊-4-烯酸-2-氯三苯甲酯樹脂(化合物SP417)(7.94mg)加入DMF(0.2ml)及哌啶(0.2ml)，於室溫進行30分鐘振盪。於反應液加入DMF(1.6ml)後，將反應混合液(0.4ml)以DMF(9.6ml)稀釋，測定其吸光度(301nm)，為0.328。依以下計算式，計算(S)-4-(4-(2-((((9H- 茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-側氧基-3-(哌啶-1-基)丙基)苯基)戊-4-烯酸(化合物SP416)之裝載率為25.0%、0.265mmol/g。
(吸光度(301nm)x1000x50)/(使用之樹脂量x7800)=0.265mmol/g0.265mmol/gx100/(2.68/2.53)=25.0%
(S)-(3-(3-碘苯基)-1-側氧基-1-(哌啶-1-基)丙烷-2-基)胺甲酸 第三丁酯(化合物SP418、Boc-Phe(3-I)-pip)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0669-848
使(S)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-3-(3-碘苯基)丙酸(Boc-Phe(3-I)-OH)(10.0g、25.6mmol)溶於DMF(100.0ml)，於冰冷下加入哌啶(5.30ml、53.7mmol)、HATU(11.7g、30.8mmol)及DIPEA(5.34ml、30.7mmol)。於室溫攪拌30分鐘後，將反應液以己烷/乙酸乙酯(1/1)稀釋，以飽和碳酸氫鈉水溶液及飽和氯化銨水溶液洗滌。將有機層以無水硫酸鎂乾燥後，過濾、減壓濃縮，獲得標題化合物SP418(11.6g、99%)淡黃色非晶物。
LCMS(ESI)m/z=459.2(M+H)+
保持時間：0.95分(分析條件SQDFA05)
(S)-(1-側氧基-1-(哌啶-1-基)-3-(3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼烷-2-基)苯基)丙烷-2-基)胺甲酸 第三丁酯(化合物SP419)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0670-849
將(S)-(3-(3-碘苯基)-1-側氧基-1-(哌啶-1-基)丙烷-2-基)胺甲酸 第三丁酯(化合物SP418)(6.76g、14.75mmol)溶於DMSO(60.0ml)，加入雙(頻哪醇合)二硼(5.62g、22.12mmol)、Pd(dppf)Cl2‧CH2Cl2(607.0mg、0.737mmol)及乙酸鉀(6.08g、61.9mmol)，於室溫6小時攪拌後，再加入雙(頻哪醇合)二硼(5.62g、22.12mmol)、Pd(dppf)Cl2‧CH2Cl2(607.0mg、0.737mmol)及乙酸鉀(6.08g、61.9mmol)，於室溫終夜攪拌。將反應液以己烷/乙酸乙酯(1/1)稀釋，以飽和氯化銨水溶液及飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌。將有機層以無水硫酸鎂乾燥後，過濾、減壓濃縮，將獲得之殘渣以管柱層析(己烷：乙酸乙酯=100：0~60：40)精製，獲得標題化合物SP419(6.50g、96%)。
LCMS(ESI)m/z=459.6(M+H)+
保持時間：0.99分(分析條件SQDFA05)
(S)-4-(3-(2-((第三丁氧羰基)胺基)-3-側氧基-3-(哌啶-1-基)丙基)苯基)戊-4-烯酸 第三丁酯(化合物SP420)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0671-850
將(S)-(1-側氧基-1-(哌啶-1-基)-3-(3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼烷-2-基)苯基)丙烷-2-基)胺甲酸 第三丁酯(化合物SP419)(3.00g、6.54mmol)溶於DMF(24.0ml)及水(6.0ml)，加入以文獻(Organic Letters、2011、13、5830-5833)記載之方法合成之4-溴戊-4-烯酸 第三丁酯(2.31g、9.82mmol)、Pd(PPh3)4(1.134g、0.982mmol)及碳酸鉀(1.81g、13.1mmol)，於80℃進行2小時攪拌。放冷後，將反應液以己烷/乙酸乙酯(1/1)稀釋，以飽和碳酸氫鈉水溶液及飽和氯化銨水溶液洗滌。將有機層以無水硫酸鎂乾燥後，過濾、減壓濃縮，將獲得之殘渣以管柱層析(己烷：乙酸乙酯=100：0~75：25)精製，獲得標題化合物SP420(2.94g、92%)。
LCMS(ESI)m/z=487.6(M+H)+
保持時間：1.05分(分析條件SQDFA05)
(S)-4-(3-(2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-側氧基-3-(哌啶-1-基)丙基)苯基)戊-4-烯酸(化合物SP421)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0672-851
使(S)-4-(3-(2-((第三丁氧羰基)胺基)-3-側氧基-3-(哌啶-1-基)丙基)苯基)戊-4-烯酸 第三丁酯(化合物SP420)(0.50g、1.03mmol)懸浮於乙酸(7.0ml、122.28mmol)及水(7.0ml)，以加熱回流條件攪拌8小時。追加同樣反應並實施4次，合併反應液並減壓濃縮，將獲得之殘渣懸浮於10%碳酸鈉水溶液(38ml)，加入N-(9-茀基甲氧羰氧基)-琥珀醯亞胺(1.65g、4.89mmol)之1,4-二噁烷溶液(19.0ml)，於室溫攪拌1小時。將反應液以二乙醚洗滌，加入乙酸使成酸性後，以乙酸乙酯萃取。將有機層以無水硫酸鎂乾燥，過濾、減壓濃縮，將獲得之殘渣以管柱層析(己烷：乙酸乙酯=100：0~50：50)精製，獲得標題化合物SP421(0.78g、27.5%)。
LCMS(ESI)m/z=553.5(M+H)+
保持時間：0.90分(分析條件SQDFA05)
(S)-4-(3-(2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-側氧基-3-(哌啶-1-基)丙基)苯基)戊-4-烯酸-2-氯三苯甲酯樹脂(化合物SP422)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0673-852
將2-氯三苯甲基氯化物樹脂(1.07mmol/g、100-200mesh、1%DVB、Chem-Impex公司製，2.50g、2.68mmol)與二氯甲烷(18ml)混合，於室溫進行5分鐘振盪。去除二氯甲烷後，添加於(S)-4-(3-(2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-側氧基-3-(哌啶-1-基)丙基)苯基)戊-4-烯酸(化合物SP421)(0.74g、1.34mmol)之二氯甲烷溶液(16.5ml)加入甲醇(0.43ml、10.7mmol)及二異丙基乙胺(1.1ml、6.32mmol)而得之混合液，於室溫進行10分鐘振盪。去除反應液後，添加於二氯甲烷(16.5ml)加入甲醇(5ml)及二異丙基乙胺(1.7ml)之混合液，於室溫進行2小時振盪。將該反應液去除後，放入二氯甲烷(18ml)並振盪，去除二氯甲烷後，再度放入二氯甲烷(18ml)並振盪。將二氯甲烷去除後，於減壓下使樹脂乾燥，獲得標題化合物SP422(2.52g)。
裝載率：0.278mmol/g、26.1%
己-5-炔酸 第三丁酯(化合物SP423)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0673-853
使己-5-炔酸(化合物SP424)(8.0g、71.3mmol)、2-甲基丙烷-2-醇(10.6g、143.0mmol)及4-(二甲胺基)吡啶(0.44g、3.60mmol)溶於DCM(17.5ml)，加入二環己基碳二醯亞胺(16.2g、78.5mmol)之DCM溶液(17.5ml)，於室溫終夜攪拌。將反應液中之白色固體過濾去除後，以0.5M鹽酸水溶液及飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌並以無水硫酸鎂乾燥。過濾、減壓濃縮，將獲得之殘渣以管柱層析(己烷：乙酸乙酯=100：0~90：10)精製，獲得標題化合物SP423(6.73g、56.1%)。
1H-NMR(Varian 400-MR，400MHz，CDCl3)δ ppm 2.39(2H，t，7.2Hz)，2.28(2H，m)，2.08(1H，s)，1.85(2H，m)，1.49(9H，s)
(S)-6-(4-(2-((第三丁氧羰基)胺基)-3-側氧基-3-(哌啶-1-基)丙基)苯基)己-5-炔酸 第三丁酯(化合物SP425)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0674-2251
將(S)-(3-(4-碘苯基)-1-側氧基-1-(哌啶-1-基)丙烷-2-基)胺甲酸 第三丁酯(化合物SP413、Boc-Phe(4-I)-pip)(6.00g、13.09mmol)、己-5-炔酸 第三丁酯(化合物SP423)(4.40g、26.2mmol)、三乙胺(5.47ml、39.3mmol)溶於DMF(60.0ml)，加入CuI(0.125g、0.655mmol)及Pd(dppf)Cl2‧CH2Cl2(0.538g、0.655mmol)，於室溫攪拌4小時。將反應液 以己烷/乙酸乙酯(1/1)稀釋，以飽和氯化銨水溶液及飽和食鹽水洗滌。將有機層以無水硫酸鎂乾燥後，過濾、減壓濃縮，將獲得之殘渣以管柱層析(己烷：乙酸乙酯=100：0~60：40)精製，獲得標題化合物SP425(6.19g、95%)。
LCMS(ESI)m/z=499.4(M+H)+
保持時間：1.07分(分析條件SQDFA05)
(S)-6-(4-(2-((第三丁氧羰基)胺基)-3-側氧基-3-(哌啶-1-基)丙基)苯基)己酸 第三丁酯(化合物SP426)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0675-855
將(S)-6-(4-(2-((第三丁氧羰基)胺基)-3-側氧基-3-(哌啶-1-基)丙基)苯基)己-5-炔酸 第三丁酯(化合物SP425)(5.74g、11.51mmol)溶於乙酸乙酯(40ml)，於氮氣氛圍下加入10%鈀(II)碳(1.72g)。之後，於氫氣氛圍下、於室溫攪拌2小時。以沸石過濾後，將濾液減壓濃縮，獲得標題化合物SP426(5.65g、98%)。
LCMS(ESI)m/z=503.6(M+H)+
保持時間：1.14分(分析條件SQDAA05)
(S)-6-(4-(2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-側氧基-3-(哌啶-1-基)丙基)苯基)己酸(化合物SP427)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0676-856
將(S)-6-(4-(2-((第三丁氧羰基)胺基)-3-側氧基-3-(哌啶-1-基)丙基)苯基)己酸 第三丁酯(化合物SP426)(5.65g、11.24mmol)溶於DCM(30.0ml)，加入三氟乙酸(15.0ml、195mmol)，於室溫進行30分鐘攪拌後，將反應液減壓濃縮。將獲得之殘渣溶於二噁烷(40ml)、10%碳酸鈉水溶液(80ml)，加入N-(9-茀基甲氧羰氧基)-琥珀醯亞胺(3.68g、10.90mmol)，於室溫攪拌1小時。將反應液以二乙醚洗滌，加入5N HCl水溶液使成酸性後，以乙酸乙酯萃取。將乙酸乙酯層以無水Na2SO4乾燥，過濾、減壓濃縮，獲得標題化合物SP427(6.39g、100%)。
LCMS(ESI)m/z=569.6(M+H)+
保持時間：1.02分(分析條件SQDAA05)
(S)-6-(4-(2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-側氧基-3-(哌啶-1-基)丙基)苯基)己酸-2-氯三苯甲酯樹脂(化合物SP428)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0677-857
將2-氯三苯甲基氯化物樹脂(1.07mmol/g、100-200mesh、1%DVB、Chem-Impex公司製，3.00g、3.21mmol)與二氯甲烷(20ml)混合，於室溫振盪。將二氯甲烷去除後，添加於(S)-6-(4-(2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-側氧基-3-(哌啶-1-基)丙基)苯基)己酸(化合物SP427)(0.91g、1.60mmol)之二氯甲烷溶液(14ml)加入甲醇(0.52ml、12.85mmol)及二異丙基乙胺(1.35ml、7.75mmol)之混合液，於室溫進行5分鐘振盪。將反應液去除後，添加於二氯甲烷(14ml)加入甲醇(4.2ml)及二異丙基乙胺(1.4ml)之混合液，於室溫進行2.5小時振盪。將該反應液去除後，放入二氯甲烷(20ml)並振盪，將二氯甲烷去除後，再度放入二氯甲烷(20ml)並振盪。將二氯甲烷去除後，於減壓下使樹脂乾燥，獲得標題化合物(化合物SP428)(3.15g)。裝載率：0.217mmol/g、21.3%
戊-4-炔酸 第三丁酯(化合物SP429)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0677-858
使戊-4-炔酸(5.0g、51.0mmol)、2-甲基丙烷-2-醇(7.56g、102.0mmol)及4-(二甲胺基)吡啶(0.31g、2.54mmol)溶於DCM(17.5ml)，加入二環己基碳二醯亞胺(11.6g、56.2mmol) 之DCM溶液(17.5ml)，於室溫終夜攪拌。將反應液中之白色固體過濾去除後，以0.5M鹽酸水溶液及飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌，並以無水硫酸鎂乾燥。過濾、減壓濃縮，將獲得之殘渣以矽膠管柱層析(DCM)精製，獲得標題化合物(化合物SP429)(7.15g、91.0%)。
1H-NMR(Varian 400-MR，400MHz，CDCl3)δ ppm 2.48-2.50(4H，m)，2.00(1H，s)，1.49(9H，s)
(S)-5-(3-(2-((第三丁氧羰基)胺基)-3-側氧基-3-(哌啶-1-基)丙基)苯基)戊-4-炔酸 第三丁酯(化合物SP430)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0678-2252
將(S)-(3-(3-碘苯基)-1-側氧基-1-(哌啶-1-基)丙烷-2-基)胺甲酸 第三丁酯(化合物SP418、Boc-Phe(3-I)-pip)(5.00g、10.91mmol)、戊-4-炔酸 第三丁酯(3.36g、21.82mmol)、三乙胺(4.56ml、32.7mmol)溶於DMF(50.0ml)，加入CuI(0.104g、0.545mmol)及Pd(dppf)Cl2‧CH2Cl2(0.449g、0.545mmol)，於室溫攪拌5小時。將反應液以己烷/乙酸乙酯(1/1)稀釋，以飽和氯化銨水溶液及飽和食鹽水洗滌。將有機層以無水硫酸鎂乾燥後，過濾、減壓濃縮，將獲得之殘渣以矽膠管柱層析(己烷：乙酸乙酯=100：0~60：40) 精製，獲得標題化合物(化合物SP430)(4.84g、92%)。
LCMS(ESI)m/z=485.6(M+H)+
保持時間：1.03分(分析條件SQDFA05)
(S)-5-(3-(2-((第三丁氧羰基)胺基)-3-側氧基-3-(哌啶-1-基)丙基)苯基)戊酸 第三丁酯(化合物SP431)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0679-860
將(S)-5-(3-(2-((第三丁氧羰基)胺基)-3-側氧基-3-(哌啶-1-基)丙基)苯基)戊-4-炔酸 第三丁酯(化合物SP430)(4.84g、9.99mmol)溶於乙酸乙酯(40ml)，於氮氣氛圍下加入10%鈀(II)碳(968mg)。之後，於氫氣氛圍下於室溫攪拌3.5小時。以沸石過濾後，將濾液減壓濃縮，獲得標題化合物(化合物SP431)(4.74g、97%)。
LCMS(ESI)m/z=489.6(M+H)+
保持時間：1.08分(分析條件SQDFA05)
(S)-5-(3-(2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-側氧基-3-(哌啶-1-基)丙基)苯基)戊酸(化合物SP432)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0679-861
將(S)-5-(3-(2-((第三丁氧羰基)胺基)-3-側氧基-3-(哌啶-1-基)丙基)苯基)戊酸 第三丁酯(化合物SP431)(4.70g、9.62mmol)溶於DCM(30.0ml)，加入三氟乙酸(15.0ml、195mmol)，於室溫進行50分鐘攪拌後，將反應液減壓濃縮。將獲得之殘渣溶於二噁烷(34ml)、10%碳酸鈉水溶液(68ml)，加入N-(9-茀基甲氧羰氧基)-琥珀醯亞胺(3.15g、9.33mmol)，於室溫攪拌3小時。加入5N HCl水溶液使成酸性後，以乙酸乙酯萃取。將乙酸乙酯層以無水Na2SO4乾燥，過濾、減壓濃縮，將獲得之殘渣以矽膠管柱層析(己烷：乙酸乙酯=100：0~30：70)精製，獲得標題化合物(化合物SP432)(4.65g、87%)。
LCMS(ESI)m/z=555.6(M+H)+
保持時間：0.92分(分析條件SQDFA05)
(S)-5-(3-(2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-側氧基-3-(哌啶-1-基)丙基)苯基)戊酸-2-氯三苯甲酯樹脂(化合物SP433)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0680-2253
裝入2-氯三苯甲基氯化物樹脂(1.07mmol/g、100-200mesh、1%DVB、Chem-Impex公司製，5.00g、5.35mmol) 與二氯甲烷(35ml)，於室溫振盪。將二氯甲烷去除後，添加於(S)-5-(3-(2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-側氧基-3-(哌啶-1-基)丙基)苯基)戊酸(化合物SP432)(1.48g、2.67mmol)之二氯甲烷溶液(33ml)加入甲醇(0.87ml、21.50mmol)及二異丙基乙胺(2.24ml、12.86mmol)之混合液，於室溫進行10分鐘振盪。將反應液去除後，添加於二氯甲烷(33ml)加入甲醇(10ml)及二異丙基乙胺(3.3ml)之混合液，於室溫進行2小時振盪。將該反應液去除後，放入二氯甲烷(33ml)並振盪，將二氯甲烷去除後，再度放入二氯甲烷(33ml)並振盪。將二氯甲烷去除後，於減壓下使樹脂乾燥，獲得標題化合物(化合物SP433)(5.80g)。裝載率：0.326mmol/g、35.3%
2.合成之環化胜肽利用PAMPA法所為之透膜性評價
為了比較探討合成之環化胜肽之透膜性，實施PAMPA(Parallel Artificial Membrane Permeability Assay)所為之試驗。於MILLIPORE96孔濾膜(疏水性PVDF(聚偏二氟乙烯)、pore size 0.45μm)(從日本MILLIPORE公司購買)添加由蛋卵磷脂10%(w/v)、膽固醇0.5%(w/v)、十二烷(以上從Fluka公司購買)構成的磷脂質有機溶劑溶液4μL，以製作人工磷脂質膜。
於含甘醇酸5.0%(w/v)之pH6.5 50mM MOPSO緩衝液中，以0.5%(v/v)之比例添加含有化合物10mM之濃度的DMSO溶液，將其添加到96孔特氟龍製板330μL(捐出者板)。於捐出者板上安裝上述人工磷脂質膜板，將以0.5%(v/v) 之比例添加DMSO於含甘醇酸5.0%(w/w)之pH6.5 50mM MOPSO緩衝液而得之溶液280μL，添加到人工磷脂質膜上(接受者板)。將其於37℃靜置18小時後，以LC/MS或LC/UV測定捐出者板及接受者板中的溶液中化合物濃度，依下式(1)、(2)式計算化合物之透膜速度(Pe)。惟，t定為試驗時間、A為濾膜面積、VD為捐出者液量、VA為接受者液量、CD、t為於時間t之捐出者液中化合物濃度、CA、t為時間t之接受者液中化合物濃度。依本方法獲得之結果，記載於表11-5(PAMPA法所為之環狀胜肽之透膜評價結果)。
Figure 107130626-A0101-12-0682-863
【表11-5】
Figure 107130626-A0101-12-0683-864
Figure 107130626-A0101-12-0684-865
Figure 107130626-A0101-12-0685-2254
Figure 107130626-A0101-12-0686-867
Figure 107130626-A0101-12-0687-868
3.環化胜肽化合物之人類肝微體中代謝安定性試驗
為了比較探討合成之環化胜肽之代謝安定性，實施人類肝微體中代謝安定性試驗。(方法已記載，結果如表11-6：人類肝微體中代謝安定性試驗結果)。
【表11-6】
Figure 107130626-A0101-12-0688-869
Figure 107130626-A0101-12-0689-870
Figure 107130626-A0101-12-0690-871
Figure 107130626-A0101-12-0691-872
Figure 107130626-A0101-12-0692-873
胜肽之小鼠PK試驗
評價吾人明白的兼顧類藥(drug like)之胜肽之條件，滿足(鏈長、N-甲基胺基酸數、ClogP)之8種胜肽在小鼠靜脈內及經口投予後之血漿中濃度變動。對於雄性小鼠(C57BL/6J、6週齡、CLEA JAPAN公司製：1群3隻)將化合物以20mg/kg之用量進行靜脈內及經口投予，投予後直到24小時之血液使用經作為抗凝固劑之肝素處理過的血比容管，從背足靜脈經時抽血。血液以離心分離分離血漿，以乙腈進行除蛋白處理後，使用LC/MS/MS裝置(API3200、AB SCIEX公司製，USA)測定血漿中濃度。從獲得之血漿中濃度變動，使用解析軟體Phoenix WinNonlin 6.1(Pharsight Corporation公司製，USA)，以非隔室解析計算藥物動態參數。
以下顯示各參數之定義。計算靜脈內投予後之時間0之濃度(C0；外插值、ng/mL)、經口投予後之最高血漿中濃度(Cmax；ng/mL)、最高血漿中濃度到達時間(Tmax；時間)、血漿中濃度-時間曲線下面積(AUC；ng‧時間/mL)、全身 廓清(CL；mL/分/kg)、穩定狀態分布容積(Vss；mL/kg)、消失半減期(t1/2；時間)、及生體可用性(F；%)。靜脈內投予後之全身廓清均小(1.7-9.5mL/分/kg)，啟示代謝的安定性高。化合物之生體可用性最大為35%，評價之8種胜肽如期待，具有可開發作為經口投予劑之經口吸收性。
Figure 107130626-A0101-12-0693-874
Figure 107130626-A0101-12-0693-875
Figure 107130626-A0101-12-0693-876
[實施例20]不具反應輔助基之N末端胺基酸與C末端側活性酯之醯胺化縮合反應
1.不具反應輔助基之N末端胺基與活性酯在轉譯液中之醯胺化反應
1-1.先將較安定之活性酯轉譯合成，使轉譯後活性酯部分予以活化，同時從系外添加活化劑，使與不具反應輔助基之胺反應之方法例
1-1-1.示範反應原料化合物之合成
(化合物P-145)
(9S，12S，18S，21S，24S，27S，30S)-30-(((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-(第三丁氧基)-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)(甲基)胺甲醯基)-12,27-二苄基-18-異丁基-24-異丙基-2,2,9,11,17,21-六甲基-4,7,10,13,16,19,22,25,28-九側氧基-3-氧雜-5,8,11,14,17,20,23,26,29-九氮雜三十二烷-32-酸(Boc-Gly-Ala-MePhe-Gly-MeLeu-Ala-Val-Phe-Asp-MeAla-Ser(tBu)-Gly-NH2)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0694-2255
N末端將Fmoc胺基酸替換為使用Boc胺基酸，依已記載之Fmoc法所為胜肽合成進行合成(9S，12S，18S，21S，24S，27S，30S)-30-(((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-(第三丁氧基)-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)(甲基)胺甲醯基)-12,27-二苄基-18-異丁基-24-異丙基-2,2,9,11,17,21-六甲基-4,7,10,13,16,19,22,25,28-九側氧基-3- 氧雜-5,8,11,14,17,20,23,26,29-九氮雜三十二烷-32-酸 苄酯(Boc-Gly-Ala-MePhe-Gly-MeLeu-Ala-Val-Phe-Asp(OBn)-MeAla-Ser(tBu)-Gly-NH2、919mg，0.657mmol)之甲醇(6ml)溶液中，於氮氣氛圍下加入二羥基鈀/碳(312mg、50%wet w/w)，氫取代後於室溫攪拌2小時。之後，將反應液進行沸石過濾，將濾液減壓濃縮，將獲得之殘渣以管柱層析(10mM乙酸銨水溶液：甲醇=70/30-0/100)精製，獲得標題化合物P-145(Boc-Gly-Ala-MePhe-Gly-MeLeu-Ala-Val-Phe-Asp-MeAla-Ser(tBu)-Gly-NH2)(374mg、44%)。LCMS：m/z 1307(M-H)-保持時間：1.09分(分析條件SQD AA05)
(化合物P-146)
(9S，12S，18S，21S，24S，27S，30S)-30-(((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-(第三丁氧基)-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)(甲基)胺甲醯基)-12,27-二苄基-18-異丁基-24-異丙基-2,2,9,11,17,21-六甲基-4,7,10,13,16,19,22,25,28-九側氧基-3-氧雜-5,8,11,14,17,20,23,26,29-九氮雜三十二烷-32-硫代酸 S-苄酯(Boc-Gly-Ala-MePhe-Gly-MeLeu-Ala-Val-Phe-Asp(SBn)-MeAla-Ser(tBu)-Gly-NH2)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0695-878
使(9S，12S，18S，21S，24S，27S， 30S)-30-(((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-(第三丁氧基)-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)(甲基)胺甲醯基)-12,27-二苄基-18-異丁基-24-異丙基-2,2,9,11,17,21-六甲基-4,7,10,13,16,19,22,25,28-九側氧基-3-氧雜-5,8,11,14,17,20,23,26,29-九氮雜三十二烷-32-酸(化合物P-145，(Boc-Gly-Ala-MePhe-Gly-MeLeu-Ala-Val-Phe-Asp-MeAla-Ser(tBu)-Gly-NH2))(50.0mg、0.038mmol)溶於二氯甲烷(320μL)及DMF(80μL)，加入苯基甲烷硫醇(9.49mg、0.076mmol)、DIC(9.64mg、0.076mmol)及N,N-二甲基吡啶-4-胺(3.54mg、0.029mmol)，於室溫終夜攪拌。將反應液減壓濃縮，將獲得之殘渣以管柱層析(10mM乙酸銨水溶液：甲醇)精製，獲得標題化合物(11.8mg、21.8%)。
LCMS：m/z 1414.8(M+H)+
保持時間：1.08分(分析條件SQD AA05)
(化合物P-147)
(4S，7S，13S，16S，19S，22S，25S)-1-胺基-25-(((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-羥基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)(甲基)胺甲醯基)-7,22-二苄基-13-異丁基-19-異丙基-4,6,12,16-四甲基-2,5,8,11,14,17,20,23-八側氧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氮雜二十七烷-27-硫代酸 S-苄酯(Gly-Ala-MePhe-Gly-MeLeu-Ala-Val-Phe-Asp(SBn)-MeAla-Ser-Gly-NH2)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0697-879
將(9S，12S，18S，21S，24S，27S，30S)-30-(((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-(第三丁氧基)-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)(甲基)胺甲醯基)-12,27-二苄基-18-異丁基-24-異丙基-2,2,9,11,17,21-六甲基-4,7,10,13,16,19,22,25,28-九側氧基-3-氧雜-5,8,11,14,17,20,23,26,29-九氮雜三十二烷-32-硫代酸 S-苄酯(化合物P-146)(11.8mg、0.0083mmol)溶於二氯甲烷(150μL)，加入TFA(75.0μL，0.973mmol)，於室溫進行1小時半攪拌。將反應液減壓濃縮，將獲得之殘渣以管柱層析(0.1%FA水溶液：0.1%FA乙腈溶液)精製，獲得標題化合物(7.3mg、69.5%)。
LCMS：m/z 1258.6(M+H)+
保持時間：0.58分(分析條件SQD FA05)
(化合物P-133)
(6S，9S，12S，15S，18S，24S，27S，30S，33S)-18,30-二苄基-12,24-二異丁基-9,27-二異丙基-2,2,6,11,17,23,26-七甲基-33-(甲基((S)-1-側氧基-1-(((S)-1-側氧基-1-(哌啶-1-基)丙烷-2-基)胺基)-3-苯基丙烷-2-基)胺甲醯基)-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-十側氧基-15-((R)-1-(三苯甲氧基)乙基)-3-氧雜-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-十氮雜三十五烷-35-酸 (Boc-Ala-Val-MeLeu-Thr(Trt)-MePhe-Gly-MeLeu-MeVal-Phe-Asp-MePhe-Ala-哌啶)之合成
又，本說明書中，Ala-哌啶或Ala-pip，係指哌啶之氮原子與Ala之主鏈羧酸部位形成醯胺鍵之化合物。該次結構係於胜肽部位具有之情形，亦使用同樣的表示記載。
Figure 107130626-A0101-12-0698-880
於依常法合成之(6S，9S，12S，15S，18S，24S，27S，30S，33S)-18,30-二苄基-12,24-二異丁基-9,27-二異丙基-2,2,6,11,17,23,26-七甲基-33-(甲基((S)-1-側氧基-1-(((S)-1-側氧基-1-(哌啶-1-基)丙烷-2-基)胺基)-3-苯基丙烷-2-基)胺甲醯基)-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-十側氧基-15-((R)-1-(三苯甲氧基)乙基)-3-氧雜-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-十氮雜三十五烷-35-酸 苄酯(Boc-Ala-Val-MeLeu-Thr(Trt)-MePhe-Gly-MeLeu-MeVal-Phe-Asp(OBn)-MePhe-Ala-哌啶)(770mg，0.412mmol)之甲醇(4ml)溶液中，於氮氣氛圍下加入羥基鈀/碳(256mg、50%wet.w/w)，氫取代後於室溫攪拌2.5小時。之後，將反應液以沸石過濾，將濾液減壓濃縮，獲得標題化合物(726mg、99%)。
LCMS：m/z 1777.6(M-H)-
保持時間：0.86分(分析條件SQD AA50)
(化合物P-134)
(6S，9S，12S，15S，18S，24S，27S，30S，33S)-18,30-二苄基-12,24-二異丁基-9,27-二異丙基-2,2,6,11,17,23,26-七甲基-33-(甲基((S)-1-側氧基-1-(((S)-1-側氧基-1-(哌啶-1-基)丙烷-2-基)胺基)-3-苯基丙烷-2-基)胺甲醯基)-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-十側氧基-15-((R)-1-(三苯甲氧基)乙基)-3-氧雜-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-十氮雜三十五烷-35-硫代酸 S-苄酯(Boc-Ala-Val-MeLeu-Thr(Trt)-MePhe-Gly-MeLeu-MeVal-Phe-Asp(SBn)-MePhe-Ala-哌啶)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0699-881
以(6S，9S，12S，15S，18S，24S，27S，30S，33S)-18,30-二苄基-12,24-二異丁基-9,27-二異丙基-2,2,6,11,17,23,26-七甲基-33-(甲基((S)-1-側氧基-1-(((S)-1-側氧基-1-(哌啶-1-基)丙烷-2-基)胺基)-3-苯基丙烷-2-基)胺甲醯基)-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-十側氧基-15-((R)-1-(三苯甲氧基)乙基)-3-氧雜-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-十氮雜三十五烷-35-酸(化合物P-133)(50.0mg、0.028mmol)作為原料，與化合物P-146之合成同樣進行，獲得標題化合物(33.0mg、62.3%)。
LCMS：m/z 1883.3(M-H)-
保持時間：0.93分(分析條件SQD AA50)
(化合物P-135)
(3S，6S，9S，12S，18S，21S，24S，27S，30S)-30-胺基-6,18-二苄基-21-((R)-1-羥基乙基)-12,24-二異丁基-9,27-二異丙基-10,13,19,25-四甲基-3-(甲基((S)-1-側氧基-1-(((S)-1-側氧基-1-(哌啶-1-基)丙烷-2-基)胺基)-3-苯基丙烷-2-基)胺甲醯基)-5,8,11,14,17,20,23,26,29-九側氧基-4,7,10,13,16,19,22,25,28-九氮雜三十一烷-1-硫代酸 S-苄酯(Ala-Val-MeLeu-Thr-MePhe-Gly-MeLeu-MeVal-Phe-Asp(5Bn)-MePhe-Ala-哌啶)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0700-882
以(6S，9S，12S，15S，18S，24S，27S，30S，33S)-18,30-二苄基-12,24-二異丁基-9,27-二異丙基-2,2,6,11,17,23,26-七甲基-33-(甲基((S)-1-側氧基-1-(((S)-1-側氧基-1-(哌啶-1-基)丙烷-2-基)胺基)-3-苯基丙烷-2-基)胺甲醯基)-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-十側氧基-15-((R)-1-(三苯甲氧基)乙基)-3-氧雜-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-十氮雜三十五烷-35-硫代酸 S-苄酯(化合物P-134)(33.0mg、0.018mmol)作為原料，與化合物P-147之合成同樣進行，獲得標題化合物(6.0mg、22.9%)。
LCMS：m/z 1541.0(M-H)-
保持時間：0.77分(分析條件SQD FA05)
(6S，9S，12S，15S，18S，24S，27S，30S，33S)-18,30-二苄基-12,24-二異丁基-9,27-二異丙基-2,2,6,11,17,23,26-七甲 基-33-(甲基((S)-1-側氧基-1-(((S)-1-側氧基-1-(哌啶-1-基)丙烷-2-基)胺基)-3-苯基丙烷-2-基)胺甲醯基)-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-十側氧基-15-((R)-1-(三苯甲氧基)乙基)-3-氧雜-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-十氮雜三十五烷-35-酸2-(乙基二硫烷基)-6-甲基苯酯(化合物P-138)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0701-883
於N末端將Fmoc胺基酸替換為使用Boc胺基酸，依已記載之Fmoc法所為之胜肽合成合成之(6S，9S，12S，15S，18S，24S，27S，30S，33S)-18,30-二苄基-12,24-二異丁基-9,27-二異丙基-2,2,6,11,17,23,26-七甲基-33-(甲基((S)-1-側氧基-1-(((S)-1-側氧基-1-(哌啶-1-基)丙烷-2-基)胺基)-3-苯基丙烷-2-基)胺甲醯基)-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-十側氧基-15-((R)-1-(三苯甲氧基)乙基)-3-氧雜-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-十氮雜三十五烷-35-酸(Boc-Ala-Val-MeLeu-Thr(Trt)-MePhe-Gly-MeLeu-MeVal-Phe-Asp-MePhe-Ala-哌啶、60.9mg、0.034mmol)之二氯甲烷(300ul)溶液中，加入依常法(J.AM.CHEM.SOC.2009,131,5432-5437)另外合成之2-(乙基二硫烷基)-6-甲基苯酚(10.3mg、0.051mmol)、N,N'-甲烷二亞基雙(丙烷-2-胺)(8.0ul、0.051mmol)、N,N-二甲基吡啶-4-胺(4.2mg、0.034mmol)，於室 溫終夜攪拌。之後，將反應液減壓濃縮，以逆相矽膠管柱層析(10mM乙酸銨水溶液/甲醇=70/30→0/100)精製，獲得(6S，9S，12S，15S，18S，24S，27S，30S，33S)-18,30-二苄基-12,24-二異丁基-9,27-二異丙基-2,2,6,11,17,23,26-七甲基-33-(甲基((S)-1-側氧基-1-(((S)-1-側氧基-1-(哌啶-1-基)丙烷-2-基)胺基)-3-苯基丙烷-2-基)胺甲醯基)-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-十側氧基-15-((R)-1-(三苯甲氧基)乙基)-3-氧雜-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-十氮雜三十五烷-35-酸2-(乙基二硫烷基)-6-甲基苯酯(化合物P-138)(53.8mg，80%)。
LCMS(ESI)m/z=1959.2(M-H)-
保持時間：1.05分(分析條件SQDAA50)
(3S，6S，9S，12S，18S，21S，24S，27S，30S)-30-胺基-6,18-二苄基-21-((R)-1-羥基乙基)-12,24-二異丁基-9,27-二異丙基-10,13,19,25-四甲基-3-(甲基((S)-1-側氧基-1-(((S)-1-側氧基-1-(哌啶-1-基)丙烷-2-基)胺基)-3-苯基丙烷-2-基)胺甲醯基)-5,8,11,14,17,20,23,26,29-九側氧基-4,7,10,13,16,19,22,25,28-九氮雜三十一烷-1-酸2-(乙基二硫烷基)-6-甲基苯酯(化合物P-139)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0702-884
於(6S，9S，12S，15S，18S，24S，27S，30S， 33S)-18,30-二苄基-12,24-二異丁基-9,27-二異丙基-2,2,6,11,17,23,26-七甲基-33-(甲基((S)-1-側氧基-1-(((S)-1-側氧基-1-(哌啶-1-基)丙烷-2-基)胺基)-3-苯基丙烷-2-基)胺甲醯基)-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-十側氧基-15-((R)-1-(三苯甲氧基)乙基)-3-氧雜-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-十氮雜三十五烷-35-酸2-(乙基二硫烷基)-6-甲基苯酯(化合物P-138)(53.0mg、27umol)之二氯甲烷(200ul)溶液中，加入三氟乙酸(300ul)與三異丙基矽烷(27.7ul、0.135mmol)，於室溫攪拌1小時。之後，將反應液減壓濃縮，以逆相矽膠管柱層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液=70/30→0/100)精製，獲得(3S，6S，9S，12S，18S，21S，24S，27S，30S)-30-胺基-6,18-二苄基-21-((R)-1-羥基乙基)-12,24-二異丁基-9,27-二異丙基-10,13,19,25-四甲基-3-(甲基((S)-1-側氧基-1-(((S)-1-側氧基-1-(哌啶-1-基)丙烷-2-基)胺基)-3-苯基丙烷-2-基)胺甲醯基)-5,8,11,14,17,20,23,26,29-九側氧基-4,7,10,13,16,19,22,25,28-九氮雜三十一烷-1-酸2-(乙基二硫烷基)-6-甲基苯酯(化合物P-139)(22.4mg、51%)。
LCMS(ESI)m/z=1620(M+H)+
保持時間：0.88分(分析條件SQDAA50)
(6S，9S，12S，18S，21S，24S，27S，30S)-30-(((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-(第三丁氧基)-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)(甲基)胺甲醯基)-12,27-二苄基-18-異丁基-24-異丙基-2,2,6,9,11,21-六甲基-4,7,10,13,16,19,22,25,28-九側氧基-3-氧雜 -5,8,11,14,17,20,23,26,29-九氮雜三十二烷-32-酸(Boc-Ala-Ala-MePhe-Gly-Leu-Ala-Val-Phe-Asp-MeAla-Ser(tBu)-Gly-NH2)(化合物SP-501)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0704-885
於依常法合成之(6S，9S，12S，18S，21S，24S，27S，30S)-30-(((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-(第三丁氧基)-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)(甲基)胺甲醯基)-12,27-二苄基-18-異丁基-24-異丙基-2,2,6,9,11,21-六甲基-4,7,10,13,16,19,22,25,28-九側氧基-3-氧雜-5,8,11,14,17,20,23,26,29-九氮雜三十二烷-32-酸 苄酯(化合物SP-502、Boc-Ala-Ala-MePhe-Gly-Leu-Ala-Val-Phe-Asp(OBn)-MeAla-Ser(tBu)-Gly-NH2)(749mg，0.536mmol)之甲醇(5ml)-乙酸乙酯(5ml)溶液中，於氮氣氛圍下加入羥基鈀/碳(250mg、50%wet.w/w)，氫取代後於室溫攪拌3.5小時。之後，將反應液以沸石過濾，將濾液減壓濃縮，獲得標題化合物(SP-501)(620mg、88%)。
LCMS(ESI)m/z=1306.4(M-H)-
保持時間：0.74分(分析條件SQD FA05)
(6S，9S，12S，18S，21S，24S，27S，30S)-30-(((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-(第三丁氧基)-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)(甲基)胺甲醯基)-12,27-二苄基-18-異丁基-24-異丙基-2,2,6,9,11,21-六甲基-4,7,10,13,16,19,22,25,28-九側氧基-3-氧雜-5,8,11,14,17,20,23,26,29-九氮雜三十二烷-32-硫代酸 S-苄酯(Boc-Ala-Ala-MePhe-Gly-Leu-Ala-Val-Phe-Asp(SBn)-MeAla-Ser(tBu)-Gly-NH2)(化合物SP-503)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0705-886
以(6S，9S，12S，18S，21S，24S，27S，30S)-30-(((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-(第三丁氧基)-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)(甲基)胺甲醯基)-12,27-二苄基-18-異丁基-24-異丙基-2,2,6,9,11,21-六甲基-4,7,10,13,16,19,22,25,28-九側氧基-3-氧雜-5,8,11,14,17,20,23,26,29-九氮雜三十二烷-32-酸(化合物SP-501)(325.5mg、0.249mmol)作為原料，與化合物P-146之合成同樣進行，獲得標題化合物(SP-503)(178.2mg、51%)。
LCMS(ESI)m/z=1412.6(M-H)-
保持時間：0.87分(分析條件SQD FA05)
(3S，6S，9S，12S，15S，21S，24S，27S)-27-胺基-3-(((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-羥基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)(甲基)胺甲醯基)-6,21-二苄基-15-異丁基-9-異丙基-12,22,24-三甲基-5,8,11,14,17,20,23,26-八側氧基-4,7,10,13,16,19,22,25-八氮雜二十八烷-1-硫代酸 S-苄酯(Ala-Ala-MePhe-Gly-Leu-Ala-Val-Phe-Asp(SBn)-MeAla-Ser-Gly-NH2)(化合物SP-504)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0706-887
以(6S，9S，12S，18S，21S，24S，27S，30S)-30-(((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-(第三丁氧基)-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)(甲基)胺甲醯基)-12,27-二苄基-18-異丁基-24-異丙基-2,2,6,9,11,21-六甲基-4,7,10,13,16,19,22,25,28-九側氧基-3-氧雜-5,8,11,14,17,20,23,26,29-九氮雜三十二烷-32-硫代酸 S-苄酯(化合物SP-503)(72.9mg、0.052mmol)作為原料，與化合物P-147之合成同樣進行，獲得標題化合物(SP-504)(47.3.mg、73%)。
LCMS(ESI)m/z=1256.8(M-H)-
保持時間：0.58分(分析條件SQD FA05)
(6S，9S，12S，18S，21S，24S，27S，30S)-30-(((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-(第三丁氧基)-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)(甲基)胺甲醯基)-6,12,27-三苄基-18-異丁基-24-異丙基-2,2,9,11,21-五甲基-4,7,10,13,16,19,22,25,28-九側氧基-3-氧雜-5,8,11,14,17,20,23,26,29-九氮雜三十二烷-32-酸(Boc-Phe-Ala-MePhe-Gly-Leu-Ala-Val-Phe-Asp-MeAla-Ser(tBu)-Gly-NH2))(化合物SP-505)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0707-2256
於依常法合成之(6S，9S，12S，18S，21S，24S，27S，30S)-30-(((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-(第三丁氧基)-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)(甲基)胺甲醯基)-6,12,27-三苄基-18-異丁基-24-異丙基-2,2,9,11,21-五甲基-4,7,10,13,16,19,22,25,28-九側氧基-3-氧雜-5,8,11,14,17,20,23,26,29-九氮雜三十二烷-32-酸 苄酯(Boc-Phe-Ala-MePhe-Gly-Leu-Ala-Val-Phe-Asp(OBn)-MeAla-S er(OtBu)-Gly-NH2)(化合物SP-506)(831mg，0.563mmol)之甲醇(5ml)-乙酸乙酯(5ml)溶液中，於氮氣氛圍下加入羥基鈀/碳(277mg、50%wet.w/w)，氫取代後於室溫攪拌3.5小時。之後，將反應液以沸石過濾，將濾液減壓濃縮，獲得標題化合物(SP-505)(648mg、83%)。
LCMS(ESI)m/z=1382.6(M-H)-
保持時間：0.80分(分析條件SQD FA05)
(6S，9S，12S，18S，21S，24S，27S，30S)-30-(((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-(第三丁氧基)-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)(甲基)胺甲醯基)-6,12,27-三苄基-18-異丁基-24-異丙基-2,2,9,11,21-五甲基-4,7,10,13,16,19,22,25,28-九側氧基-3-氧雜-5,8,11,14,17,20,23,26,29-九氮雜三十二烷-32-硫代酸 S-苄酯(Boc-Phe-Ala-MePhe-Gly-Leu-Ala-Val-Phe-Asp(SBn)-MeAla-Ser(tBu)-Gly-NH2)(化合物SP-507)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0708-889
以(6S，9S，12S，18S，21S，24S，27S，30S)-30-(((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-(第三丁氧基)-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)(甲基) 胺甲醯基)-6,12,27-三苄基-18-異丁基-24-異丙基-2,2,9,11,21-五甲基-4,7,10,13,16,19,22,25,28-九側氧基-3-氧雜-5,8,11,14,17,20,23,26,29-九氮雜三十二烷-32-酸(化合物SP-505)(344.5mg、0.249mmol)作為原料，與化合物P-146之合成同樣進行，獲得標題化合物(SP-507)(143.8mg、39%)。
LCMS(ESI)m/z=1490.6(M+H)+
保持時間：0.93分(分析條件SQD FA05)
(3S，6S，9S，12S，15S，21S，24S，27S)-27-胺基-3-(((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-羥基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)(甲基)胺甲醯基)-6,21-二苄基-15-異丁基-9-異丙基-12,22,24-三甲基-5,8,11,14,17,20,23,26-八側氧基-28-苯基-4,7,10,13,16,19,22,25-八氮雜二十八烷-1-硫代酸 S-苄酯(Phe-Ala-MePhe-Gly-Leu-Ala-Val-Phe-Asp(SBn)-MeAla-Ser-Gly-NH2)(化合物SP-508)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0709-890
以(6S，9S，12S，18S，21S，24S，27S，30S)-30-(((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-(第三丁氧基)-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)(甲基)胺甲醯基)-6,12,27-三苄基-18-異丁基-24-異丙基-2,2,9,11,21- 五甲基-4,7,10,13,16,19,22,25,28-九側氧基-3-氧雜-5,8,11,14,17,20,23,26,29-九氮雜三十二烷-32-硫代酸 S-苄酯(化合物SP-507)(72.1mg、0.048mmol)作為原料，與化合物P-147之合成同樣進行，獲得標題化合物(SP-508)(56.1mg、87%)。
LCMS(ESI)m/z=1332.7(M-H)-
保持時間：0.60分(分析條件SQD FA05)
1-1-2.環化示範反應例
顯示N末端為Gly之情形之反應例。
(化合物P-136)
(5S，8S，14S，17S，20S，23S，26S)-N-((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-羥基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)-8,23-二苄基-14-異丁基-20-異丙基-N,5,7,13,17-五甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,28-九側氧基-1,4,7,10,13,16,19,22,25-九氮雜環二十八烷-26-羧醯胺之合成
Figure 107130626-A0101-12-0710-891
之1
使4-(三氟甲基)苯硫醇(0.018g、0.10mmol)及三乙胺(10.1mg、0.10mmol)溶於100mM之磷酸氫2鈉水溶液(80μL)及NMP(10μL)。於該溶液中加入(4S，7S，13S，16S，19S，22S，25S)-1-胺基-25-(((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺 基)-3-羥基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)(甲基)胺甲醯基)-7,22-二苄基-13-異丁基-19-異丙基-4,6,12,16-四甲基-2,5,8,11,14,17,20,23-八側氧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氮雜二十七烷-27-硫代酸 S-苄酯(化合物P-147)之NMP溶液(10mM、10μL、0.10μmol)，於室溫攪拌5小時。將反應液以LCMS分析，確認標題化合物之生成。又，標題化合物與原料(保持時間0.58分、分析條件SQDFA05)及Asp之硫酯經水解之羧酸體(保持時間：0.51分、分析條件SQDFA05)之生成比，以LCMS之UV面積比計，約74：11：15。結果如圖36。
LCMS：m/z 1134.6(M+H)+
保持時間：0.64分(分析條件SQDFA05)
之2
使苯硫醇(0.110mg、0.001mmol)及三乙胺(0.202mg、0.002mmol)溶於100mM磷酸氫2鈉水溶液(80μL)及NMP(10μL)。於該溶液中加入(4S，7S，13S，16S，19S，22S，25S)-1-胺基-25-(((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-羥基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)(甲基)胺甲醯基)-7,22-二苄基-13-異丁基-19-異丙基-4,6,12,16-四甲基-2,5,8,11,14,17,20,23-八側氧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氮雜二十七烷-27-硫代酸 S-苄酯(化合物P-147)之NMP溶液(10mM、10μL、0.10μmol)，於室溫攪拌8小時。將反應液以LCMS分析，確認標題化合物之生成。又，標題化合物與原料(保持時間0.58分、分析條件SQDFA05)及Asp之硫酯經水解之羧酸體(保持時間：0.50分、分析條件SQDFA05)之生成比， 以LCMS之UV面積比計，約89：8：3。結果如圖37。
LCMS：m/z 1134.6(M+H)+
保持時間：0.63分(分析條件SQDFA05)
顯示N末端為Ala之情形之反應例。
(化合物P-137)
(2R，5S，8S，11S，14S，20S，23S，26S，29S)-14,26-二苄基-11-((R)-1-羥基乙基)-8,20-二異丁基-5,23-二異丙基-N，2,7,13,19,22-六甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,31-十側氧基-N-((S)-1-側氧基-1-(((S)-1-側氧基-1-(哌啶-1-基)丙烷-2-基)胺基)-3-苯基丙烷-2-基)-1,4,7,10,13,16,19,22,25,28-十氮雜環三十一烷-29-羧醯胺之合成
Figure 107130626-A0101-12-0712-892
之1
將4-(三氟甲基)苯硫醇(8.91mg、0.05mmol)及三乙胺(5.06mg、0.05mmol)之水溶液(25μL)與(3S，6S，9S，12S，18S，21S，24S，27S，30S)-30-胺基-6,18-二苄基-21-((R)-1-羥基乙基)-12,24-二異丁基-9,27-二異丙基-10,13,19,25-四甲基-3-(甲基((S)-1-側氧基-1-(((S)-1-側氧基-1-(哌啶-1-基)丙烷-2-基)胺基)-3-苯基丙烷-2-基)胺甲醯基)-5,8,11,14,17,20,23,26,29-九側氧基-4,7,10,13,16,19,22,25,28-九氮雜三十一烷-1-硫代酸 S-苄酯(化合物P-135)之NMP溶液(5mM、20μL、0.1μmol)混合， 再加入水(25μL)與NMP(30μL)，於50度終夜攪拌。以LCMS測定，確認原料消失及確認標題化合物之生成。又，標題化合物與Asp之硫酯經水解之羧酸體(保持時間：0.68分、分析條件SQDFA05)之生成比，以LCMS之UV面積比計，約72：28。結果如圖38。
LCMS：m/z 1417(M-H)-
保持時間：1.04分(分析條件SQDFA05)
之2
於(3S，6S，9S，12S，18S，21S，24S，27S，30S)-30-胺基-6,18-二苄基-21-((R)-1-羥基乙基)-12,24-二異丁基-9,27-二異丙基-10,13,19,25-四甲基-3-(甲基((S)-1-側氧基-1-(((S)-1-側氧基-1-(哌啶-1-基)丙烷-2-基)胺基)-3-苯基丙烷-2-基)胺甲醯基)-5,8,11,14,17,20,23,26,29-九側氧基-4,7,10,13,16,19,22,25,28-九氮雜三十一烷-1-酸2-(乙基二硫烷基)-6-甲基苯基(0.162mg，0.1umol)(化合物P-139)與1-羥基吡咯烷-2,5-二酮(0.575mg、5umol)之DMF-400mM磷酸緩衝溶液(pH8.5)1：1混合溶液(95ul)中，加入1M參(2-羧基乙基)膦(TCEP)水溶液(5ul)，於室溫攪拌30分鐘後，使用LCMS觀測反應，結果環化前驅體完全消失，且觀測到標題化合物P-137與水解體P-140為3：1(LCMS：UV面積比)。
LCMS(ESI)m/z=1417.2(M-H)-
保持時間：1.04分(分析條件SQDFA05)
水解體P-140
(3S，6S，9S，12S，18S，21S，24S，27S，30S)-30-胺基-6,18- 二苄基-21-((R)-1-羥基乙基)-12,24-二異丁基-9,27-二異丙基-10,13,19,25-四甲基-3-(甲基((S)-1-側氧基-1-(((S)-1-側氧基-1-(哌啶-1-基)丙烷-2-基)胺基)-3-苯基丙烷-2-基)胺甲醯基)-5,8,11,14,17,20,23,26,29-九側氧基-4,7,10,13,16,19,22,25,28-九氮雜三十一烷-1-酸
Figure 107130626-A0101-12-0714-893
LCMS(ESI)m/z=1435.3(M-H)-
保持時間：0.67分(分析條件SQDFA05)
Figure 107130626-A0101-12-0714-894
顯示N末端為Phe情形之反應例。
(2S,5S，8S，14S，17S，20S，23S，26S)-N-((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-羥基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)-2,8,23-三苄基-14-異丁基-20-異丙基-N,5,7,17-四甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,28-九側氧基-1,4,7,10,13,16,19,22,25-九氮雜環二十八烷-26-羧醯胺(化合物SP-509)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0715-895
使4-(三氟甲基)苯硫醇(13.6ul、0.10mmol)及三乙胺(13.9ul、0.10mmol)溶於100mM之磷酸氫2鈉水溶液(80μL)及NMP(10μL)。於該溶液中，將(3S，6S，9S，12S，15S，21S，24S，27S)-27-胺基-3-(((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-羥基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)(甲基)胺甲醯基)-6,21-二苄基-15-異丁基-9-異丙基-12,22,24-三甲基-5,8,11,14,17,20,23,26-八側氧基-28-苯基-4,7,10,13,16,19,22,25-八氮雜二十八烷-1-硫代酸 S-苄酯(化合物SP-508)之NMP溶液(10mM、10μL、0.10μmol)及作為內部標準之鄰苯二甲酸之乙腈溶液(50mM、1.0μl)加入，於30度攪拌3小時。反應開始時之pH為9.7。將反應液以LCMS分析，確認標題化合物之生成。3小時攪拌後，內部標準與原料依面積之面積比所得之轉化率為90%，標題化合物(SP-509)與水解體(化合物SP-510)之生成比，以LCMS之UV面積比計約3：2。
‧標題化合物
LCMS(ESI)m/z=1210.4(M+H)+
保持時間：1.04分(分析條件SMD法1)
‧水解體(化合物SP-510)
(3S，6S，9S，12S，15S，21S，24S，27S)-27-胺基-3-(((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-羥基-1-側 氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)(甲基)胺甲醯基)-6,21-二苄基-15-異丁基-9-異丙基-12,22,24-三甲基-5,8,11,14,17,20,23,26-八側氧基-28-苯基-4,7,10,13,16,19,22,25-八氮雜二十八烷-1-酸
Figure 107130626-A0101-12-0716-896
LCMS(ESI)m/z=1228.5(M+H)+
保持時間：0.89分(分析條件SMD法1)
使用示範胜肽於PureSystem(轉譯液)中之環化反應例之1
(2S，5S，8S，14S，17S，20S，23S，26S)-N-((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-羥基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)-8,23-二苄基-14-異丁基-20-異丙基-N,2,57,17-五甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,28-九側氧基-1,4,7,10,13,16,19,22,25-九氮雜環二十八烷-26-羧醯胺(化合物SP-511)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0716-897
使4-(三氟甲基)苯硫醇(6.8μL、0.050mmol)及三乙胺(7.0μl、0.050mmol)溶於水(8.2μl)，製備硫醇溶液。
於(3S，6S，9S，12S，15S，21S，24S，27S)-27-胺基 -3-(((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-羥基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)(甲基)胺甲醯基)-6,21-二苄基-15-異丁基-9-異丙基-12,22,24-三甲基-5,8,11,14,17,20,23,26-八側氧基-4,7,10,13,16,19,22,25-八氮雜二十八烷-1-硫代酸 S-苄酯(化合物SP-504)之NMP溶液(10mM、5.0μl、0.050μmol)中，加入作為內部標準之4-丙基苯甲酸之NMP溶液(11mM、2.25μl)。其次加入轉譯用緩衝液(6.25μl)、PURESYSTEM(r)classic II Sol.B(BIOCOMBER公司、產品編號PURE2048C)(10μl)、20種天然胺基酸溶液(各5mM，2.5μl)。
又，轉譯用緩衝液之成分係8mM GTP，8mM ATP，160mM肌酸磷酸，400mM HEPES-KOH pH7.6，800mM乙酸鉀，48mM乙酸鎂，16mM亞精胺(spermidine)，8mM二硫蘇糖醇，0.8mM 10-HCO-H4folate，12mg/ml E.coli MRE600(RNase陰性)來源tRNA(Roche公司)。於其中，加入參(2-羧基乙基)膦水溶液(pH=7.5、1.25M、2.0μl)及先前製備之硫醇溶液。於此時點之反應液之pH為7.8。將反應液於30℃攪拌20小時後，以LC/MS分析，確認標題化合物之生成。20小時攪拌後之反應液之pH為9.4。又，標題化合物(SP-511)與水解體(化合物SP-512)之生成比，以UV面積比計，為1：1.6。
標題化合物
LCMS(ESI)m/z=1134.4(M+H)+
保持時間：0.64分(分析條件SQDFA05)
水解體(化合物SP-512)
(3S，6S，9S，12S，15S，21S，24S，27S)-27-胺基-3-(((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-羥基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)(甲基)胺甲醯基)-6,21-二苄基-15-異丁基-9-異丙基-12,22,24-三甲基-5,8,11,14,17,20,23,26-八側氧基-4,7,10,13,16,19,22,25-八氮雜二十八烷-1-酸
Figure 107130626-A0101-12-0718-2257
LCMS(ESI)m/z=1152.5(M+H)+
保持時間：0.48分(分析條件SQDFA05)
如以上所示，可明白，繼Cys(具有反應輔助基之)或Gly(α位不存在取代基，反應性最高)，Ala或Phe也可於水中使用將可轉譯之硫酯進一步活化之方法進行環化反應。轉譯液之中可確認反應進行。
1-1-3.具有環化用活性酯之pdCpA-AA之合成
Figure 107130626-A0101-12-0719-899
7-甲基苯并[d][1,3]氧雜硫醇-2-酮(化合物102)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0719-900
於鄰甲酚(化合物101)(27.7mmol、3.00g)與三丁胺(30.5mmol，7.35ml)之二氯乙烷(48mL)溶液中，於0℃加入氯化氯羰基硫基(30.5mmol，2.58ml)，於室溫攪拌2小時。之後，於反應混合物中，於0℃加入氯化鋁(66.6mmol、8.88g)，於室溫終夜攪拌。之後，於反應混合物中，於0度加入水(10ml)後，以乙酸乙酯稀釋，將有機層以水洗滌。之後，將有機萃取 物以硫酸鈉乾燥。減壓濃縮後，將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液=100/0→30/70)精製，獲得7-甲基苯并[d][1,3]氧雜硫醇-2-酮(化合物102)(2.46g、53%)。
LCMS(ESI)m/z=167(M+H)+
保持時間：0.81分(分析條件SQDFA05)
2-巰基-6-甲基苯酚(化合物103)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0720-901
於7-甲基苯并[d][1,3]氧雜硫醇-2-酮(化合物102)(2.34g、14.44mmol)之乙醇(15ml)溶液中，加入2N氫氧化鈉水溶液(15ml)，於60度攪拌1小時。之後，於反應混合物中，將濃鹽酸於0度加入並淬滅後，以乙酸乙酯稀釋，將有機層以水洗滌。之後，將有機萃取物以硫酸鈉乾燥獲得2-巰基-6-甲基苯酚(化合物103)(1.90g)。此化合物不進行進一步的精製操作，供其次之步驟使用。
LCMS(ESI)m/z=139(M-H)-
保持時間：0.70分(分析條件SQDFA05)
6,6'-二硫化二氫二基雙(2-甲基苯酚)(化合物104)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0721-902
於上述獲得之2-巰基-6-甲基苯酚(化合物103)(1.90g)之水(10ml)2層溶液中加入I2(1.717g、6.76mmol)之甲醇(7ml)溶液，於室溫攪拌10分鐘。將反應混合物以乙酸乙酯稀釋，將有機層以飽和Na2S2O3水溶液、及水洗滌。之後，將有機萃取物以硫酸鈉乾燥。減壓濃縮後，將獲得之殘渣以矽膠管柱層析(己烷/乙酸乙酯=100/0→92/8)精製，獲得6,6’-二硫化二氫二基雙(2-甲基苯酚)(化合物104)(1.61g、43%(2步驟))。
LCMS(ESI)m/z=277(M-H)-
保持時間：0.95分(分析條件SQDFA05)
2-(乙基二硫烷基)-6-甲基苯酚(化合物105)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0721-903
於6,6’-二硫化二氫二基雙(2-甲基苯酚)(化合物104)(1.61g、5.78mmol)之二氯甲烷(30ml)溶液中加入二硫化二乙烷(14.24ml、116mmol)與BF3‧OEt2(14.66mml，16.42mmol)，於室溫攪拌5小時。之後，於反應混合物中將飽和NaHCO3溶液於0度緩慢滴加並淬滅後，以乙酸乙酯稀釋，將有機層以水洗滌。之後，’將有機萃取物以硫酸鈉乾燥並濃縮。將獲得之殘渣以矽膠管柱層析(己烷/乙酸乙酯= 100/0→90/10)精製，獲得2-(乙基二硫烷基)-6-甲基苯酚(化合物105)(1.67g、72%)。
LCMS(ESI)m/z=199(M-H)-
保持時間：0.92分(分析條件SQDFA05)
(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)琥珀酸1-(2-苯基丙烷-2-基)4-烯丙酯(化合物107)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0722-904
於(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-4-(烯丙氧基)-4-側氧基丁酸(化合物106)(1.80g、4.55mmol)之二氯甲烷(40ml)溶液中，加入依常法另外合成之2,2，2-三氯乙醯亞胺酸2-苯基丙烷-2-酯(2.17g、7.74mmol)，於室溫攪拌1小時。之後，將反應混合物減壓濃縮。將獲得之殘渣以矽膠管柱層析(己烷/乙酸乙酯=100/0→65/35)精製，獲得(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)琥珀酸1-(2-苯基丙烷-2-基)4-烯丙酯(化合物107)(2.17g、93%)。
LC保持時間：1.12分(分析條件SQDAA05)
1H-NMR(Varian 400-MR，400MHz，CDCl3)δ ppm 7.76(2H，d，7.6Hz)，7.49(2H，d，7.2Hz)，7.41-7.24.(9H，m)，5.90(1H，m)5.77(1H，d，8.4Hz)，5.29(2H，m)，4.62(3H，m)，4.37(2H， m)，4.21(1H，t，6.8Hz)，3.08(1H，dd，17.2，4.4Hz)，2.90(1H，dd，17.2，4.8Hz)，1.80(3H，s)，1.78(3H，s)
(S)-2-((第三丁氧羰基)胺基)琥珀酸1-(2-苯基丙烷-2-基)4-烯丙酯(化合物108)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0723-2258
於(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)琥珀酸1-(2-苯基丙烷-2-基)4-烯丙基(化合物107)(1.03g、2.00mmol)之THF(6ml)-DMF(1.5ml)溶液中加入哌啶(0.297ml、3.00mmol)，於室溫攪拌3小時半。之後，於反應混合物中加入二碳酸二-第三丁酯(1.31g、6.00mmol)與三乙胺(0.837ml、6mmol)，於室溫攪拌15分鐘。之後，將反應混合物減壓濃縮。將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(10mM乙酸銨水溶液/甲醇=70/30→0/100)精製，獲得(S)-2-((第三丁氧羰基)胺基)琥珀酸1-(2-苯基丙烷-2-基)4-烯丙酯(化合物108)(710mg、91%)。
LCMS(ESI)m/z=390(M-H)-
保持時間：0.63分(分析條件SQDAA50)
(S)-3-((第三丁氧羰基)胺基)-4-側氧基-4-((2-苯基丙烷-2-基)氧基)丁酸(化合物109)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0724-906
於(S)-2-((第三丁氧羰基)胺基)琥珀酸1-(2-苯基丙烷-2-基)4-烯丙酯(化合物108)(710mg、1.81mmol)之二氯甲烷(20ml)-乙酸(1.08ml)-N-甲基嗎啉(0.541ml)溶液中加入Pd(Ph3P)4(210mg、0.181mmol)，於室溫攪拌3小時半。之後，將反應混合物減壓濃縮。將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(10mM乙酸銨水溶液/甲醇=100/0→30/70)精製，獲得(S)-3-((第三丁氧羰基)胺基)-4-側氧基-4-((2-苯基丙烷-2-基)氧基)丁酸(化合物109)(525mg、82%)。
LCMS(ESI)m/z=350(M-H)-
保持時間：0.80分(分析條件SQDAA05)
(S)-2-((第三丁氧羰基)胺基)琥珀酸1-(2-苯基丙烷-2-基)4-(2-(乙基二硫烷基)-6-甲基苯酯)(化合物110)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0724-2259
於(S)-3-((第三丁氧羰基)胺基)-4-側氧基-4-((2-苯基丙烷-2-基)氧基)丁酸(化合物109)(495mg、1.41mmol)之二氯 甲烷(7ml)溶液中，加入2-(乙基二硫烷基)-6-甲基苯酚(化合物105)(423mg、2.11mmol)、N,N’-二異丙基碳二醯亞胺(0.329ml，2.11mmol)，N,N-二甲基吡啶-4-胺(34.4mg，0.282mmol)，於室溫攪拌1小時。之後，將反應液以逆相矽膠管柱層析(10mM乙酸銨水溶液/甲醇=70/30→0/100)精製，獲得(S)-2-((第三丁氧羰基)胺基)琥珀酸1-(2-苯基丙烷-2-基)4-(2-(乙基二硫烷基)-6-甲基苯酯)(化合物110)(249mg、33%)。
LCMS(ESI)m/z=532(M-H)-
保持時間：1.15分(分析條件SQDAA05)
(S)-2-((第三丁氧羰基)胺基)琥珀酸4-(2-(乙基二硫烷基)-6-甲基苯基)1-(氰基甲酯)(化合物112)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0725-908
於(S)-2-((第三丁氧羰基)胺基)琥珀酸1-(2-苯基丙烷-2-基)4-(2-(乙基二硫烷基)-6-甲基苯基)(化合物110)(240mg、0.450mmol)之二氯甲烷(4ml)溶液中，加入三氟乙酸(0.040ml，0.519mmol)，於室溫攪拌1小時半，再加入三氟乙酸(0.040ml，0.519mmol)，於室溫攪拌1小時半。之後，將反應液減壓濃縮。於獲得之殘渣之溴乙腈(4.70ml)溶液中，加入DIPEA(0.259ml，1.49mmol)，於室溫攪拌10分鐘，將反應液以矽膠管柱層析(己烷/乙酸乙酯=100/0→50/50) 精製，獲得(S)-2-((第三丁氧羰基)胺基)琥珀酸4-(2-(乙基二硫烷基)-6-甲基苯基)1-(氰基甲酯)(化合物112)(151mg、74%)。
LCMS(ESI)m/z=453(M-H)-
保持時間：1.04分(分析條件SQDAA05)
(2S)-2-胺基琥珀酸4-(2-(乙基二硫烷基)-6-甲基苯基)1-((2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯)(化合物114)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0726-909
於緩衝液A(29.2ml)中，加入磷酸二氫((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-3-(((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(羥基)磷氧基)氧基)四氫呋喃-2-基)甲基(pdCpA，化合物1h)(49.0mg、0.077mmol)之水溶液(1.52ml)與(S)-2-((第三丁氧 羰基)胺基)琥珀酸4-(2-(乙基二硫烷基)-6-甲基苯基)1-(氰基甲酯)(140mg、0.308mmol)之四氫呋喃(0.764ml)溶液，於室溫攪拌1小時半。之後，加入三氟乙酸(0.396ml、5.37mmol)後使冷凍乾燥。將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液=100/0→50/50)精製，獲得(2S)-2-((第三丁氧羰基)胺基)琥珀酸4-(2-(乙基二硫烷基)-6-甲基苯基)1-((2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯)與N,N，N-三甲基十六烷-1-銨鹽之混合物。使獲得之混合物溶於三氟乙酸(0.10ml)，於室溫攪拌10分鐘後，將反應液減壓濃縮。將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液=100/0→60/40)精製，嘿獲得(2S)-2-胺基琥珀酸4-(2-(乙基二硫烷基)-6-甲基苯基)1-((2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯)(化合物114)(2.9mg，40%)。
LCMS(ESI)m/z=932(M-H)-
保持時間：0.70分(分析條件SQDAA05)
2.於經轉譯之胜肽之醯胺化反應
以TOF-MS確認生成不利用轉譯合成後之反應輔助基之醯胺化反應。
2-1.利用轉錄所為之tRNA(CA欠缺)之合成
從模板DNA(序列編號D-40)利用使用RiboMAX Large Scale RNA production System T7(Promega公司，P1300)之體外轉錄，合成3'端之CA欠缺的tRNAGluAAG(-CA)(序列編號R-40)，並利用RNeasy Mini kit(Qiagen公司)精製。
序列編號D-40(序列編號：64)tRNAGluAAG(-CA)DNA序列：
Figure 107130626-A0101-12-0728-910
序列編號R-40(序列編號：65)tRNAGluAAG(-CA)RNA序列：
Figure 107130626-A0101-12-0728-911
2-2.利用側鏈羧酸經活性酯化之胺基醯基化pdCpA(化合物1i-ID)與tRNA(CA欠缺)(序列編號：R-40)之接合(ligation)所為之胺基醯基化tRNA(化合物AT-7-A)之合成
於50μM轉錄tRNAGluAAG(-CA)(序列編號R-40)10μL中，加入10X接合緩衝液(500mM HEPES-KOH pH 7.5,200mM MgCl2,10mM ATP)2μL、無核酸酶之水4μL，於95℃加熱2分鐘後，於室溫放置5分鐘，進行tRNA之重新折疊。加入20unit/μL之T4 RNA接合酶(New England Bio Lab.公司)2μL及5mM之側鏈羧酸經活性酯化之胺基醯基化pdCpA(化合物1i-ID)之DMSO溶液2μL，於15℃進行45分鐘接合反應。於接合反應液20μL加入3M乙酸鈉4μL與125mM碘 (水：THF=1：1溶液)24μL，於室溫進行1小時脫保護。胺基醯基化tRNA(化合物AT-7-A)進行苯酚萃取後，利用乙醇沉澱回收。胺基醯基化tRNA(化合物AT-7-A)於即將添加到轉譯混合物時溶於1mM乙酸鈉。
化合物AT-7-A(序列編號：66)
Figure 107130626-A0101-12-0729-912
2-3.使用側鏈羧酸經活性酯化之胺基酸之轉譯合成
藉由將側鏈羧酸以硫酯予以活化而得之天冬胺酸衍生物使胺基醯基化而得之tRNA加到無細胞轉譯系以開始轉譯，進行含有所望非天然胺基酸之多胜肽之轉譯合成。轉譯系使用原核生物來源之再構成無細胞蛋白質合成系PURE system。具體而言，於轉譯液，1%(v/v)RNasein Ribonuclease inhibitor(Promega公司，N2111),1mM GTP，1mM ATP，20mM肌酸磷酸，50mM HEPES-KOH pH7.6，100mM乙酸鉀，6mM乙酸鎂，2mM亞精胺(spermidine)，1mM二硫蘇糖醇，0.1mM 10-HCO-H4folate,1.5mg/ml E.coli MRE600(RNase陰性)來源tRNA(Roche公司)，4μg/ml肌酸激酶，3μg/ml肌激酶，2unit/ml無機焦磷解酶，1.1μg/ml核苷二磷酸激酶，0.6μM甲硫胺醯基tRNA轉甲醯基酶，0.26μM EF-G，0.24μM RF2， 0.17μM RF3，0.5μM RRF，2.7μM IF1，0.4μM IF2,1.5μM IF3,40μM EF-Tu，93μM EF-Ts，1.2μM核糖體，0.73μM AlaRS，0.03μM ArgRS，0.38μM AsnRS，0.13μM AspRS，0.02μM CysRS，0.06μM GlnRS，0.23μM GluRS，0.09μM GlyRS，0.02μM HisRS，0.4μM IleRS，0.04μM LeuRS，0.11μM LysRS，0.03μM MetRS，0.68μM PheRS，0.16μM ProRS，0.04μM SerRS，0.09μM ThrRS，0.03μM TrpRS，0.02μM TyrRS，0.02μM ValRS(實驗室製備之蛋白基本上係製備為附加His標籤之蛋白))中，添加1μM模板RNA、各模板DNA所編碼之蛋白質性胺基酸群各250μM、及50μM之側鏈羧酸經活性酯化之胺基醯基化tRNA(化合物AT-7-A)到轉譯反應混合物，於37℃靜置1小時以進行。
轉譯產物，係以α-氰基-4-羥基桂皮酸作為基質，測定MALDI-MS光譜以鑑定。
2-4.含經苄基硫酯化之天冬胺酸衍生物之胜肽(化合物P-141)之轉譯合成
於1μM模板RNAMgtp_R(序列編號R-41(序列編號：67))，將含0.25mM Gly，0.25mM Pro，0.25mMArg，0.25mM Thr，0.25mM Tyr及、50μM Asp(SBn)-tRNAGluAAG(化合物AT-7-A)之前述轉譯液於37℃保溫60分鐘。將獲得之轉譯反應物以SPEC-TIP(Nikkyo Technos公司)精製，並以MALDI-MS分析。其結果，觀測到開始甲硫胺酸正後之Gly開始轉譯的含N末端α-胺基與硫酯之胜肽P-141(圖39、峰部I)、及從該Gly正後之Thr開始轉譯之胜肽P-142(圖39、峰部II) 為主產物(圖39)
序列編號R-41(序列編號：67)Mgtp_R RNA序列
Figure 107130626-A0101-12-0731-913
胜肽序列P-141 GlyThrThrThrArg[Asp(SBn)]ProTyrArgGlyGly
胜肽序列P-142 ThrThrThrArg[Asp(SBn)]ProTyrArgGlyGly
MALDI-MS：m/z：[H+M]+=1286.6(序列P-141所對應之胜肽。Calc.1286.6)
m/z：[H+M]+=1229.6(序列P-142所對應之胜肽。Calc.1229.6)
2-5.使用轉譯胜肽P-141上之硫酯與N末端α-胺基之胜肽之醯胺環化實驗
將含有前述轉譯反應物P-141之轉譯溶液3.5μL、1μL硫苯酚溶液(5M 4-三氟甲硫基苯酚、5M三乙胺等量混合者)、0.5μL 500mM三羧基乙基膦溶液(pH7.5)混合，於50℃保溫2小時。其結果，開始物質P-141之峰部消失，代之觀測到相當於N末端α-胺基之氮原子與Asp之側鏈羧酸予以醯胺環化而得之化合物P-143的峰部(圖40、峰部I)。
胜肽序列P-143(序列編號：68)GlyThrThrThrArg[Asp(SBn)]ProTyrArgGlyGly之N末端胺基之氮原子與Asp之側鏈羧酸予以醯胺環化而得之化合物
MALDI-MS：m/z：[M+H]+=1162.4(Calc.1162.6)
Figure 107130626-A0101-12-0732-914
2-6.使用Initiation read through法之含多種非Cys殘基之N末端胺基酸的胜肽合成、及使用其之不利用反應輔助基之胜肽環化
藉由將側鏈羧酸以硫酯活化之天冬胺酸衍生物予以胺基醯基化而得之tRNA及除了開始甲硫胺酸以外的蛋白質性胺基酸混合物加到無細胞轉譯系並轉譯，進行含有所望之非天然胺基酸之多胜肽之轉譯合成。轉譯系使用原核生物來源之再構成無細胞蛋白質合成系PURE system。具體而言，於轉譯液，1%(v/v)RNasein Ribonuclease inhibitor(Promega公司，N2111),1mM GTP，1mM ATP，20mM肌酸磷酸，50mM HEPES-KOH pH7.6，100mM乙酸鉀，6mM乙酸鎂，2mM亞精胺(spermidine)，0.1mM 10-HCO-H4folate,1.5mg/ml E.coli MRE600(RNase陰性)來源tRNA(Roche公司)，4μg/ml肌酸激酶，3μg/ml肌激酶，2unit/ml無機焦磷解酶，1.1μg/ml核苷二磷酸激酶，0.6μM甲硫胺醯基tRNA轉甲醯基酶，0.26μM EF-G，0.24μM RF2，0.17μM RF3，0.5μM RRF，2.7μM IF1，0.4μM IF2,1.5μM IF3,40μM EF-Tu，93μM EF-Ts，1.2μM核糖體，0.73μM AlaRS，0.03μM ArgRS，0.38μM AsnRS，0.13μM AspRS，0.02μM CysRS，0.06μM GlnRS，0.23μM GluRS，0.09μM GlyRS，0.4μM IleRS，0.04μM LeuRS，0.11μM LysRS，0.03μM MetRS，0.68μM PheRS，0.16μM ProRS，0.04μM SerRS，0.09μM ThrRS，0.03μM TrpRS，0.02μM TyrRS，0.02μM ValRS(實驗室製備之蛋白基本上係製備為附加His標籤之蛋白))中，將1μM模板RNA、蛋白質性胺基酸群各250μM、及50μM之側鏈羧酸經活性酯化之胺基醯基化tRNA(化合物AT-7-A)添加到轉譯反應混合物，於37℃靜置1小時以進行。
轉譯產物，係使用α-氰基-4-羥基桂皮酸作為基質，測定MALDI-MS光譜並鑑定。
2-7.含N末端Phe,Ala及含經苄基硫酯化之天冬胺酸衍生物之胜肽(P-D1，P-D2)之轉譯合成
於1μM模板RNA OT89(序列編號RM-D1)，將含0.25mM Phe，0.25mM Gly，0.25mM Pro，0.25mM Arg，0.25mM Thr，0.25mM Tyr及、50μM Asp(SBn)-tRNAGluAAG(化合物AT-7-A)之前述轉譯液於37℃保溫60分鐘。同樣地，在另一容器中，於1μM模板RNA OT90(序列編號RM-D2)將含有0.25mM Ala，0.25mM Gly，0.25mM Pro，0.25mM Arg，0.25mM Thr，0.25mM Tyr及、50μM Asp(SBn)-tRNAGluAAG(化合物AT-7-A)之前述轉譯液於37℃保溫60分鐘。於獲得之2種轉譯反應物1μL各加入9μL之0.2%三氟乙酸，之後各將1μL乘載於MALDI標靶板上後，與1μLCHCA溶液(10mg/ml α-氰基-4-羥基桂皮酸、50%乙腈、0.1%三氟乙酸溶液)混合，於板上乾固。MALDI-MS分析之結果，觀測到從RM-D1、RM-D2各模板起，從開始甲硫胺酸正後之Phe或Ala開始轉譯之所望之胜肽P-D1(圖44、峰 部I)及胜肽P-D2(圖45、峰部I)為主產物。
序列編號RM-D1(序列編號：78)OT89 RNA序列
Figure 107130626-A0101-12-0734-915
胜肽序列P-D1 PheThrThrThrArg[Asp(SBn)]ProTyrArgGlyGly
序列編號RM-D2(序列編號：79)OT90 RNA序列
Figure 107130626-A0101-12-0734-916
胜肽序列P-D2 AlaThrThrThrArg[Asp(SBn)]ProTyrArgGlyGly
MALDI-MS：m/z：[H+M]+=1376.4(序列P-D1所對應之胜肽。Calc.1376.6)
m/z：[H+M]+=1300.4(序列P-D2所對應之胜肽。Calc.1300.6)
2-8.使用轉譯胜肽P-D1、P-D2上之硫酯與N末端α-胺基之胜肽之醯胺環化實驗
於含有前述轉譯反應物P-D1之轉譯溶液3.5μL，混合1μL硫苯酚溶液(5M 4-三氟甲硫基苯酚、5M三乙胺等量混合者)、0.5μL 500mM三羧基乙基膦溶液(pH7.5)，於50℃保溫2小時。於獲得之反應液2μL加入12μL之2%三氟乙酸，之後將1μL乘載於MALDI標靶板上後，與1μLCHCA溶液(10mg/ml α-氰基-4-羥基桂皮酸、50%乙腈、0.1%三氟乙酸溶 液)混合，將板乾固後，以MALDI-MS解析。其結果，開始物質P-D1之峰部消失，代之以觀測到相當於N末端α-胺基之氮原子與Asp之側鏈羧酸予以醯胺環化而得之化合物P-D3之峰部(圖44、峰部II)。針對含前述轉譯反應物P-D2之轉譯溶液，亦進行與上述同樣操作，以MALDI-MS解析，結果觀測到相當於N末端α-胺基之氮原子與Asp之側鏈羧酸予以醯胺環化而得之化合物P-D4之峰部(圖45、峰部II)
胜肽序列P-D3(序列編號：80)PheThrThrThrArg[Asp(SBn)]ProTyrArgGlyGly之N末端胺基之氮原子與Asp之側鏈羧酸予以醯胺環化而得之化合物
MALDI-MS：m/z：[M+H]+=1252.3(Calc.1252.6)
Figure 107130626-A0101-12-0735-917
胜肽序列P-D4(序列編號：81)AlaThrThrThrArg[Asp(SBn)]ProTyrArgGlyGly之N末端胺基之氮原子與Asp之側鏈羧酸予以醯胺環化而得之化合物
MALDI-MS：m/z：[M+H]+=1176.3(Calc.1176.6)
Figure 107130626-A0101-12-0735-918
2-9.環化反應條件之RNA安定性評價
為了評價不利用反應輔助基之醯胺化環化反應條件下，RNA不分解，將符合反應條件之RNA以凝膠電泳解析。
將含1uM Mgtp_R RNA(序列編號R-41)之溶液(1mM GTP，1mM ATP，20mM肌酸磷酸，50mM HEPES-KOH pH7.6，100mM乙酸鉀，6mM乙酸鎂，2mM亞精胺(spermidine)，1mM二硫蘇糖醇，0.1mM 10-HCO-H4folate,)3.5μL、1μL硫苯酚溶液(5M 4-三氟甲硫基苯酚、5M三乙胺等量混合者)、0.5μL 500mM三羧基乙基膦溶液(pH7.6)混合，於50℃保溫0.5~2小時。之後將反應液以RNeasy minelute(qiagen公司)精製。作為未施以環化條件之對照實驗，對於不設保溫時間者、硫苯酚溶液替換為使用水者、不更進一步實施精製操作者，也施以同樣操作。獲得之RNA溶液以含6M尿素之l0%聚丙烯醯胺進行電泳後，以SYBR gold nucleic acid stain(Invitrogen公司)染色。
其結果，相較於作為對照實驗之未施以環化條件之RNA(lane 1-3)，施以反應條件之RNA(lane 6)在譜帶圖案或譜帶濃度無變化，於環化反應條件中RNA亦為安定(圖46)。
從本實驗明白以下事項。(1)Intiation read through法中，與Cys或Gly同樣，Ala或Phe亦能有效作用且選擇性地將所望之胜肽序列轉譯。(2)Ala、Phe均能進行所望之環化反應。轉譯液中，Cys(有反應輔助基)或Gly(無α位取代基，反應性最高)以外之胺基酸也首次顯示會進行經由硫酯之醯胺化反應。為了使本反應進行，必須於轉譯液中使安定的活性酯轉譯合成，且成為含其活性酯之交叉單元之C末端側的單元之胺基酸須選擇N-甲基化等經N-烷基化之單元(也包括脯胺酸)(為了避免天冬醯亞胺形成)。(3)主要副產物係硫酯部位之 水解。(4)本反應條件中，能使RNA安定存在，於胜肽-RNA複合體也能進行同樣反應。
3-1.環化反應條件之最適化
由於在轉譯胜肽之環化反應例及於合成胜肽之轉譯合成液中的反應例已獲得類似結果，故可解釋若能確認在合成胜肽之轉譯合成液中的反應產率提高，轉譯胜肽之環化反應產率會獲提高。以下針對於合成胜肽之轉譯液中之反應最適化探討。
3-1-1.pH之效果
於pH9至10附近實施反應，但於pH7.8,8.1,9.2之3點進行環化反應之結果，可明白：pH較小者，環化：水解之比會往目的之方向提高。
(2S，5S，8S，14S，17S，20S，23S，26S)-N-((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-羥基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)-8,23-二苄基-14-異丁基-20-異丙基-N,2,57,17-五甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,28-九側氧基-1,4,7,10,13,16,19,22,25-九氮雜環二十八烷-26-羧醯胺(化合物SP-511)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0737-919
使4-(三氟甲基)苯硫醇(13.6ul、0.10mmol)及三乙胺(13.9ul、0.10mmol)溶於100mM之磷酸氫2鈉水溶液(80μl)及NMP(10μl)。於該溶液中，加入(3S，6S，9S，12S，15S， 21S，24S，27S)-27-胺基-3-(((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-羥基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)(甲基)胺甲醯基)-6,21-二苄基-15-異丁基-9-異丙基-12,22,24-三甲基-5,8,11,14,17,20,23,26-八側氧基-28-苯基-4,7,10,13,16,19,22,25-八氮雜二十八烷-1-硫代酸 S-苄酯(化合物SP-504)之NMP溶液(10mM、10μl、0.10μmol)及作為內部標準之4-丙基苯甲酸之乙腈溶液(50mM、1.0μl)，於30度終夜攪拌。反應開始時之pH為9.0。將反應液以LCMS分析，確認標題化合物之生成。2小時攪拌後之轉化率，就與內部標準之LCMS-UV面積比，為72%，標題化合物(SP-511)與水解體(化合物SP-512)之生成比(依LCMS之UV面積比)為12：1。再者，4小時後轉化率為81%、標題化合物(SP-511)與水解體(化合物SP-512)之生成比(依LCMS之UV面積比)為8：1。又，終夜攪拌後，原料化合物(SP-504)消失，但標題化合物(SP-511)與水解體(化合物SP-512)之生成比(LCMS之UV面積比及質譜強度比之變化(6小時後數據與終夜攪拌後數據之比較))為3：1。亦即，隨反應時間之延長，標題化合物對水解之選擇性下降(表12)。測定終夜攪拌後之反應液之pH，結果為pH10.0。
‧標題化合物
LCMS(ESI)m/z=1132.3(M-H)-
保持時間：0.64分(分析條件SQDFA05)
‧水解體(化合物SP-512)
Figure 107130626-A0101-12-0739-920
LCMS(ESI)m/z=1150.4(M-H)-
保持時間：0.49分(分析條件SQDFA05)
Figure 107130626-A0101-12-0739-921
由以上結果，可知：隨反應時間經過，pH上升，隨之環化體(標題化合物)/水解體之選擇性逐漸下降。隨時間經過之pH上升，原因為系內產生游離之三乙胺。本反應中，為了提高水溶性，將作為添加劑之4-(三氟甲基)苯硫醇以與三乙胺之鹽的形式添加。若4-(三氟甲基)苯硫醇氧化成為二硫醚，則至此為止以SH基中和之胺會過量，於系內生成游離的三乙胺，結果使pH上升。
為了使環化體(標題化合物)/水解體之選擇性提高，結論為：反應中維持鹼性且不使鹼性提高之反應條件設定係決定性的。為此之方法，可列舉提高使用之緩衝液之濃度、使即使產生游離三乙胺仍利用緩衝作用抑制pH上升。又，也可考量抑制硫醇氧化以使得系內不產生游離之三乙胺。亦即，反應於氮氣氛圍下進行、或使為還原劑之參(2-羧基乙基)膦等共存以進行較理想。
因此，從如此的觀點，為了抑制反應之pH上升，於將反 應液中之緩衝劑之濃度從62mM提高到500mM，並添加作為還原劑之參(2-羧基乙基)膦50mM的條件進行實驗。以下，為了確認pH對於環化體(標題化合物)/水解體之選擇性之影響，於反應之pH為pH7.8,8.1,9.2之3點實施。
(2S，5S，8S，14S，17S，20S，23S，26S)-N-((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-羥基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)-8,23-二苄基-14-異丁基-20-異丙基-N,2,57,17-五甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,28-九側氧基-1,4,7,10,13,16,19,22,25-九氮雜環二十八烷-26-羧醯胺(化合物SP-511)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0740-2260
於pH7.8之化合物SP-511之合成
製備水(10.9ul)、4-(三氟甲基)苯硫醇(6.80ul、0.050mmol)與三乙胺(6.97ul、0.050mmol)之混合溶液。於該混合溶液中加入1.9M HEPES緩衝溶液(pH=7.5，13.1ul)、0.5M參(2-羧基乙基)膦水溶液(pH=7.6、5.0ul)。再者，加入(3S，6S，9S，12S，15S，21S，24S，27S)-27-胺基-3-(((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-羥基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)(甲基)胺甲醯基)-6,21-二苄基-15-異丁基-9-異丙基-12,22,24-三甲基-5,8,11,14,17,20,23,26-八側氧基-28-苯基-4,7,10,13,16,19,22,25-八氮雜二十八烷-1-硫代酸 S-苄酯(化合物SP-504)之10mM N-甲基吡咯烷酮溶液5ul與11mM之內 部標準(4-丙基苯甲酸)N-甲基吡咯烷酮溶液(2.25ul)，於30℃攪拌6小時。反應開始時之pH為7.8。使用LCMS觀測反應之變化，確認標題化合物之生成。於6小時，從與內部標準之面積面積比獲得之轉化率為96%，標題化合物(SP-511)與水解體(化合物SP-512)之生成比，依LCMS之UV面積比，約38：1。
‧標題化合物
LCMS(ESI)m/z=1132.3(M-H)-
保持時間：0.63分(分析條件SQDFA05)
‧水解體(化合物SP-512)
Figure 107130626-A0101-12-0741-2261
LCMS(ESI)m/z=1150.5(M-H)-
保持時間：0.48分(分析條件SQDFA05)
於pH8.1之化合物SP-511之合成
與於上述pH7.8之化合物SP-511之合成為同樣方法，將1.9M HEPES緩衝溶液(pH=7.5，13.1ul)替換為使用1.9M HEPES緩衝溶液(pH=8.1，13.1ul)，進行反應。於30℃攪拌6小時。反應開始時之pH為8.1。使用LCMS觀測反應之變化，確認標題化合物之生成。於6小時，從與內部標準之面積面積比獲得之轉化率為93%，標題化合物(SP-511)與水解體(化合物SP-512)之生成比以LCMS之UV面積比計，約為40：1。
‧標題化合物(SP-511)
LCMS(ESI)m/z=1132.3(M-H)-
保持時間：0.63分(分析條件SQDFA05)
‧水解體(化合物SP-512)
LCMS(ESI)m/z=1150.4(M-H)-
保持時間：0.48分(分析條件SQDFA05)
於pH9.2之化合物SP-511之合成
與於上述pH7.8之化合物SP-511之合成為同樣之方法，使用1.9M HEPES緩衝溶液(pH=7.5，13.1ul)替換為使用1.9M Bicine緩衝溶液(pH=9.5，13.1ul)，進行反應。於30℃攪拌6小時。反應開始時之pH為9.2。使用LCMS觀測反應之變化，確認標題化合物之生成。於6小時從與內部標準之面積面積比獲得之轉化率為87%，標題化合物(SP-511)與水解體(化合物SP-512)之生成比以LCMS之UV面積比計，約為22：1。
‧標題化合物(SP-511)
LCMS(ESI)m/z=1132.4(M-H)-
保持時間：0.63分(分析條件SQDFA05)
‧水解體(化合物SP-512)
LCMS(ESI)m/z=1150.3(M-H)-
保持時間：0.48分(分析條件SQDFA05)
3-1-2.添加劑(4-(三氟甲基)苯硫醇)之濃度效果
明白：濃度不是1M而是設為100mM之情形，水解比率增加。
(2S，5S，8S，14S，17S，20S，23S，26S)-N-((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-羥基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1- 側氧基丙烷-2-基)-8,23-二苄基-14-異丁基-20-異丙基-N,2,57,17-五甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,28-九側氧基-1,4,7,10,13,16,19,22,25-九氮雜環二十八烷-26-羧醯胺(化合物SP-511)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0743-924
製備水(41.6ul)、4-(三氟甲基)苯硫醇(1.36ul、0.01mmol)與三乙胺(1.39ul、0.01mmol)之混合溶液。於此混合溶液中，加入1.9MHEPES緩衝溶液(pH=8.1，26.2ul)、0.5M參(2-羧基乙基)膦水溶液(pH=7.6、10ul)。再者，添加(3S，6S，9S，12S，15S，21S，24S，27S)-27-胺基-3-(((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-羥基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)(甲基)胺甲醯基)-6,21-二苄基-15-異丁基-9-異丙基-12,22,24-三甲基-5,8,11,14,17,20,23,26-八側氧基-28-苯基-4,7,10,13,16,19,22,25-八氮雜二十八烷-1-硫代酸 S-苄酯(化合物SP-504)之10mM N-甲基吡咯烷酮溶液10ul、11mM之內部標準(4-丙基苯甲酸)N-甲基吡咯烷酮溶液(4.56ul)與N-甲基吡咯烷酮(4.89ul)，於30℃終夜攪拌。反應開始時之pH為7.9。使用LCMS觀測反應之變化，確認標題化合物之生成。終夜攪拌後，從與內部標準之面積面積比獲得之轉化率為98%，標題化合物(SP-511)與水解體(化合物SP-512)之生成比以LCMS之UV面積比計，約6：1。
‧標題化合物(SP-511)
LCMS(ESI)m/z=1132.3(M-H)-
保持時間：0.63分(分析條件SQDFA05)
‧水解體(化合物SP-512)
LCMS(ESI)m/z=1150.2(M-H)-
保持時間：0.48分(分析條件SQDFA05)
3-1-3.有機溶劑與水之比率變化所獲環化與水解體生成比變化
使有機溶劑比率提高可獲有利結果。
添加劑(4-(三氟甲基)苯硫醇)濃度1M、有機溶劑(NMP)：水=50：50之反應例
(2S，5S，8S，14S，17S，20S，23S，26S)-N-((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-羥基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)-8,23-二苄基-14-異丁基-20-異丙基-N,2,57,17-五甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,28-九側氧基-1,4,7,10,13,16,19,22,25-九氮雜環二十八烷-26-羧醯胺(化合物SP-511)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0744-925
製備HEPES緩衝溶液(5M、pH=7.5、10.0μl)、4-(三氟甲基)苯硫醇(13.6μl、0.10mmol)及三乙胺(13.9μl、0.10mmol)之混合溶液。於此混合溶液中加入水(21.75μl)、 NMP(21.75μl)、參(2-羧基乙基)膦水溶液(1.1M、pH=7.5、4.5μl)。再者，加入(3S，6S，9S，12S，15S，21S，24S，27S)-27-胺基-3-(((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-羥基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)(甲基)胺甲醯基)-6,21-二苄基-15-異丁基-9-異丙基-12,22,24-三甲基-5,8,11,14,17,20,23,26-八側氧基-4,7,10,13,16,19,22,25-八氮雜二十八烷-1-硫代酸 S-苄酯(化合物SP-504)之NMP溶液(10mM、10μl、0.10μmol)及作為內部標準之4-丙基苯甲酸之NMP溶液(11mM、4.5μl)，於30℃攪拌。反應開始時之pH為7.5。6小時後，以LC/MS分析反應、確認標題化合物之生成。從與內部標準之面積面積比，反應之轉換率為91%，標題化合物(SP-511)與水解體(化合物SP-512)之生成比為LC/MS之UV面積比計，約35：1。
‧標題化合物(SP-511)
LCMS(ESI)m/z=1134.5(M+H)+
保持時間：0.64分(分析條件SQDFA05)
添加劑(4-(三氟甲基)苯硫醇)濃度1M、有機溶劑(NMP)：水=10：90之反應例
(2S,5S，8S，14S，17S，20S，23S，26S)-N-((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-羥基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)-8,23-二苄基-14-異丁基-20-異丙基-N,2,57,17-五甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,28-九側氧基-1,4,7,10,13,16,19,22,25-九氮雜環二十八烷-26-羧醯胺(化合物SP-511)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0746-926
製備HEPES緩衝溶液(5M、pH=7.5、10.0μl)、4-(三氟甲基)苯硫醇(13.6μl、0.10mmol)及三乙胺(13.9μl、0.10mmol)之混合溶液。於此混合溶液中加入水(50.75μl)、參(2-羧基乙基)膦水溶液(1.1M、pH=7.5、4.5μl)。再者，加入(3S，6S，9S，12S，15S，21S，24S，27S)-27-胺基-3-(((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-羥基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)(甲基)胺甲醯基)-6,21-二苄基-15-異丁基-9-異丙基-12,22,24-三甲基-5,8,11,14,17,20,23,26-八側氧基-4,7,10,13,16,19,22,25-八氮雜二十八烷-1-硫代酸 S-苄基(化合物SP-504)之NMP溶液(18.2mM、5.5μl、0.10μmol)及作為內部標準之4-丙基苯甲酸之NMP溶液(28.5mM、1.75μl)，於30℃攪拌。反應開始時之pH為7.4。6小時後，以LC/MS分析反應，確認標題化合物之生成。從與內部標準之面積面積比，反應之轉換率為93%，標題化合物(SP-511)與水解體(化合物SP-512)之生成比為LC/MS之UV面積比計，約12：1。
‧標題化合物
LCMS(ESI)m/z=1134.5(M+H)+
保持時間：0.64分(分析條件SQDFA05)
3-1-4.添加劑之最適化
(2S，5S，8S，14S，17S，20S，23S，26S)-N-((S)-1-(((S)-1-((2- 胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-羥基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)-2,8,23-三苄基-14-異丁基-20-異丙基-N,5,7,17-四甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,28-九側氧基-1,4,7,10,13,16,19,22,25-九氮雜環二十八烷-26-羧醯胺(化合物SP-509)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0747-927
製備水(21.8ul)、4-(三氟甲基)苯硫醇(13.6ul、0.100mmol)與三乙胺(13.9ul、0.100mmol)之混合溶液。於此混合溶液中加入1.9M HEPES緩衝溶液(pH=8.1，26.2ul)、0.5M參(2-羧基乙基)膦水溶液(pH=7.0、10.0ul)。再者，加入(3S，6S，9S，12S，15S，21S，24S，27S)-27-胺基-3-(((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-羥基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)(甲基)胺甲醯基)-6,21-二苄基-15-異丁基-9-異丙基-12,22,24-三甲基-5,8,11,14,17,20,23,26-八側氧基-28-苯基-4,7,10,13,16,19,22,25-八氮雜二十八烷-1-硫代酸 S-苄酯(Phe-Ala-MePhe-Gly-Leu-Ala-Val-Phe-Asp(SBn)-MeAla-Ser-Gly-NH2)(化合物SP-508)之10mM N-甲基吡咯烷酮溶液10ul與11mM之內部標準(4-丙基苯甲酸)N-甲基吡咯烷酮溶液(4.56ul)，於30℃終夜攪拌。反應開始時之pH為8.1。使用LCMS觀測反應之變化，原料化合物SP-508消失，觀測到標題化合 物(SP-509)與水解體(化合物SP-510)之MASS，LCMS之MASS強度比(+)約8：1。
標題化合物(SP-509)
LCMS(ESI)m/z=1210.4(M+H)+
‧水解體(化合物SP-510)
(3S，6S，9S，12S，15S，21S，24S，27S)-27-胺基-3-(((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-羥基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)(甲基)胺甲醯基)-6,21-二苄基-15-異丁基-9-異丙基-12,22,24-三甲基-5,8,11,14,17,20,23,26-八側氧基-28-苯基-4,7,10,13,16,19,22,25-八氮雜二十八烷-1-酸
Figure 107130626-A0101-12-0748-928
LCMS(ESI)m/z=1228.4(M+H)+
3-1-4-1.添加劑不使用(4-(三氟甲基)苯硫醇)(1M)而使用4-硝基苯硫醇(1M)之情形
(2S，5S，8S，14S，17S，20S，23S，26S)-N-((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-羥基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)-2,8,23-三苄基-14-異丁基-20-異丙基-N,5,7,17-四甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,28-九側氧基-1,4,7,10,13,16,19,22,25-九氮雜環二十八烷-26-羧醯胺(化合物SP-509)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0749-929
製備水(32.68ul)、4-硝基苯硫醇(16.0mg、0.100mmol)、三乙胺(13.94ul、0.100mmol)、1.9M HEPES緩衝溶液(pH=8.1，26.2ul)、0.5M參(2-羧基乙基)膦水溶液(pH=7.6、10.0ul)與N-甲基吡咯烷酮(2.66ul)之混合溶液。於此混合溶液中，加入(3S，6S，9S，12S，15S，21S，24S，27S)-27-胺基-3-(((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-羥基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)(甲基)胺甲醯基)-6,21-二苄基-15-異丁基-9-異丙基-12,22,24-三甲基-5,8,11,14,17,20,23,26-八側氧基-28-苯基-4,7,10,13,16,19,22,25-八氮雜二十八烷-1-硫代酸 S-苄酯(化合物SP-508)之10mM N-甲基吡咯烷酮溶液10ul與11mM之內部標準(4-丙基苯甲酸)N-甲基吡咯烷酮溶液(4.56ul)，於30℃終夜攪拌。反應開始時之pH為8.3。使用LCMS觀測反應之變化，若終夜攪拌，原料化合物消失，觀測到標題化合物(SP-509)與水解體(化合物SP-510)與硫酯交換體(化合物SP-513)之MASS，LCMS之MASS強度比(+)約7：7：2。
‧標題化合物(SP-509)
LCMS(ESI)m/z=1210.4(M+H)+
‧水解體(化合物SP-510)
Figure 107130626-A0101-12-0750-930
LCMS(ESI)m/z=1228.4(M+H)+
‧硫酯交換體(化合物SP-513)
(3S，6S，9S，12S，15S，21S，24S，27S)-27-胺基-3-(((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-羥基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)(甲基)胺甲醯基)-6,21-二苄基-15-異丁基-9-異丙基-12,22,24-三甲基-5,8,11,14,17,20,23,26-八側氧基-28-苯基-4,7,10,13,16,19,22,25-八氮雜二十八烷-1-硫代酸 S-(4-硝基苯酯)
Figure 107130626-A0101-12-0750-931
LCMS(ESI)m/z=1365.3(M+H)+
3-1-4-2.添加劑不使用(4-(三氟甲基)苯硫醇)(1M)而使用2,3,4,5,6-五氟苯硫醇(1M)之情形
(2S，5S，8S，14S，17S，20S，23S，26S)-N-((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-羥基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)-2,8,23-三苄基-14-異丁基-20-異丙基-N,5,7,17-四甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,28-九側氧基-1,4,7,10,13,16,19,22,25-九氮雜環二十八烷-26-羧醯胺(化合 物SP-509)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0751-932
製備水(22.04ul)、2,3,4,5,6-五氟苯硫醇(13.3ul、0.100mmol)、三乙胺(13.94ul、0.100mmol)、1.9MHEPES緩衝溶液(pH=8.1，26.2ul)、0.5M參(2-羧基乙基)膦水溶液(pH=7.6、10.0ul)之混合溶液。於此混合溶液中，添加(3S，6S，9S，12S，15S，21S，24S，27S)-27-胺基-3-(((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-羥基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)(甲基)胺甲醯基)-6,21-二苄基-15-異丁基-9-異丙基-12,22,24-三甲基-5,8,11,14,17,20,23,26-八側氧基-28-苯基-4,7,10,13,16,19,22,25-八氮雜二十八烷-1-硫代酸 S-苄酯(化合物SP-508)之10mM N-甲基吡咯烷酮溶液10ul與11mM之內部標準(4-丙基苯甲酸)N-甲基吡咯烷酮溶液(4.56ul)，於30℃終夜攪拌。反應開始時之pH為8.0。使用LCMS觀測反應之變化，即使終夜攪拌後，原料化合物(化合物SP-508)仍不消失，未觀測到標題化合物(SP-509)與硫酯交換體(化合物SP-514)之MASS。另一方面，觀測到水解體(化合物SP-510)之MASS。原料化合物(化合物SP-508)與水解體(化合物SP-510)之LCMS之MASS強度比(+)約18：1。
‧原料化合物(化合物SP-508)
LCMS(ESI)m/z=1334.4(M+H)+
‧水解體(化合物SP-510)
LCMS(ESI)m/z=1228.4(M+H)+
‧硫酯交換體(化合物SP-514)
(3S，6S，9S，12S，15S，21S，24S，27S)-27-胺基-3-(((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-羥基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)(甲基)胺甲醯基)-6,21-二苄基-15-異丁基-9-異丙基-12,22,24-三甲基-5,8,11,14,17,20,23,26-八側氧基-28-苯基-4,7,10,13,16,19,22,25-八氮雜二十八烷-1-硫代酸 S-(全氟苯酯)
Figure 107130626-A0101-12-0752-2263
 未觀測到LCMS(ESI)m/z。
3-1-4-3.添加劑不使用(4-(三氟甲基)苯硫醇)(1M)而使用2-巰基苯甲酸(1M)之情形
(2S，5S，8S，14S，17S，20S，23S，26S)-N-((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-羥基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)-2,8,23-三苄基-14-異丁基-20-異丙基-N,5,7,17-四甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,28-九側氧基-1,4,7,10,13,16,19,22,25-九氮雜環二十八烷-26-羧醯胺(化合物SP-509)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0753-934
製備水(32.68ul)、2-巰基苯甲酸(15.0mg、0.100mmol)、三乙胺(13.94ul、0.100mmol)、1.9M HEPES緩衝溶液(pH=8.1，26.2ul)、0.5M參(2-羧基乙基)膦水溶液(pH=7.6、10.0ul)與N-甲基吡咯烷酮(2.66ul)之混合溶液。於此混合溶液中，加入(3S，6S，9S，12S，15S，21S，24S，27S)-27-胺基-3-(((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-羥基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)(甲基)胺甲醯基)-6,21-二苄基-15-異丁基-9-異丙基-12,22,24-三甲基-5,8,11,14,17,20,23,26-八側氧基-28-苯基-4,7,10,13,16,19,22,25-八氮雜二十八烷-1-硫代酸 S-苄酯(化合物SP-508)之10mM N-甲基吡咯烷酮溶液10ul與11mM之內部標準(4-丙基苯甲酸)N-甲基吡咯烷酮溶液(4.56ul)，於30℃終夜攪拌。反應開始時之pH為8.0。使用LCMS觀測反應之變化，若終夜攪拌則原料化合物消失，觀測到標題化合物(SP-509)與水解體(化合物SP-510)與硫酯交換體(化合物SP-515)之MASS，LCMS之MASS強度比(-)約1：10：7。
‧標題化合物(SP-509)
LCMS(ESI)m/z=1208.9(M-H)-
‧水解體(化合物SP-510)
LCMS(ESI)m/z=1226.3(M-H)-
‧硫酯交換體(化合物SP-515)
2-(((3S，6S，9S，12S，15S，21S，24S，27S)-27-胺基-3-(((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-羥基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)(甲基)胺甲醯基)-6,21-二苄基-15-異丁基-9-異丙基-12,22,24-三甲基-5,8,11,14,17,20,23,26-八側氧基-28-苯基-4,7,10,13,16,19,22,25-八氮雜二十八烷-1-醯基)硫)苯甲酸
Figure 107130626-A0101-12-0754-935
LCMS(ESI)m/z=1362.1(M-H)-
3-1-4-4.添加劑不使用(4-(三氟甲基)苯硫醇)(1M)而使用2-巰基苯酚(1M)之情形
(2S，5S，8S，14S，17S，20S，23S，26S)-N-((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-羥基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)-2,8,23-三苄基-14-異丁基-20-異丙基-N,5,7,17-四甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,28-九側氧基-1,4,7,10,13,16,19,22,25-九氮雜環二十八烷-26-羧醯胺(化合物SP-509)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0754-936
製備水(24.64ul)、2-巰基苯酚(10.05ul、 0.100mmol)、三乙胺(13.94ul、0.100mmol)、1.9M HEPES緩衝溶液(pH=8.1，26.2ul)、0.5M參(2-羧基乙基)膦水溶液(pH=7.6、10.0ul)與N-甲基吡咯烷酮(0.65ul)之混合溶液。於此混合溶液中，加入(3S，6S，9S，12S，15S，21S，24S，27S)-27-胺基-3-(((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-羥基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)(甲基)胺甲醯基)-6,21-二苄基-15-異丁基-9-異丙基-12,22,24-三甲基-5,8,11,14,17,20,23,26-八側氧基-28-苯基-4,7,10,13,16,19,22,25-八氮雜二十八烷-1-硫代酸 S-苄酯(化合物SP-508)之10mM N-甲基吡咯烷酮溶液10ul與11mM之內部標準(4-丙基苯甲酸)N-甲基吡咯烷酮溶液(4.56ul)，於30℃攪拌1小時。反應開始時之pH為8.0。使用LCMS觀測反應之變化，若攪拌1小時，原料化合物消失，觀測到標題化合物(SP-509)與水解體(化合物SP-510)之MASS，LCMS之MASS強度比(+)約1.1：1。
‧標題化合物(SP-509)
LCMS(ESI)m/z=1210.4(M+H)+
‧水解體(化合物SP-510)
LCMS(ESI)m/z=1228.4(M+H)+
3-1-4-5.添加劑不使用(4-(三氟甲基)苯硫醇)(1M)，而使用2-巰基苯酚(0.5M)與2-氰基-2-(羥基亞胺基)乙酸(S，Z)-(2,2-二甲基-1,3-二氧戊環(dioxolane)-4-基)甲酯(0.5M)之情形
(2S，5S，8S，14S，17S，20S，23S，26S)-N-((S)-1-(((S)-1-((2- 胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-羥基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)-2,8,23-三苄基-14-異丁基-20-異丙基-N,5,7,17、四甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,28-九側氧基-1,4,7,10,13,16,19,22,25-九氮雜環二十八烷-26-羧醯胺(化合物SP-509)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0756-937
製備水(2.46ul)、2-巰基苯酚(5.03ul、0.050mmol)、依常法(Organic Letter，2012,14，3372-3375)另外合成之2-氰基-2-(羥基亞胺基)乙酸(S，Z)-(2,2-二甲基-1,3-二氧戊環(dioxolane)-4-基)甲酯(化合物SP517)(11.0mg、0.050mmol)、三乙胺(13.94ul、0.100mmol)、1M磷酸緩衝溶液(pH=7.7，52.4ul)、0.5M參(2-羧基乙基)膦水溶液(pH=7.6、10.0ul)與N-甲基吡咯烷酮(1.65ul)之混合溶液。於此混合溶液中，加入(3S，6S，9S，12S，15S，21S，24S，27S)-27-胺基-3-(((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-羥基-1-側 氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)(甲基)胺甲醯基)-6,21-二苄基-15-異丁基-9-異丙基-12,22,24-三甲基-5,8,11,14,17,20,23,26-八側氧基-28-苯基-4,7,10,13,16,19,22,25-八氮雜二十八烷-1-硫代酸 S-苄酯(化合物SP-508)之10mM N-甲基吡咯烷酮溶液10ul與11mM之內部標準(4-丙基苯甲酸)N-甲基吡咯烷酮溶液(4.56ul)，於30℃攪拌1小時。反應開始時之pH為7.0。使用LCMS觀測反應之變化，攪拌1小時後，觀測到標題化合物(SP-509)、水解體(化合物SP-510)與酯交換體(化合物SP-516)之MASS，LCMS之MASS強度比(-)約4：5：2。
‧標題化合物(SP-509)
LCMS(ESI)m/z=1208.1(M-H)-
‧水解體(化合物SP-510)
LCMS(ESI)m/z=1226.2(M-H)-
‧酯交換體(化合物SP-516)
(7S，10S，13S，16S，19S，25S，28S，31S，E)-31-胺基-7-(((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-羥基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)(甲基)胺甲醯基)-10，25-二苄基-2-氰基-19-異丁基-13-異丙基-16，26，28-三甲基-5，9,12,15,18,21,24,27，30-九側氧基-32-苯基-4-氧雜-3，8,11,14，17，20,23,26,29-九氮雜三十二-2-烯-1-酸((S)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊環(dioxolane)-4-基)甲酯
Figure 107130626-A0101-12-0758-938
LCMS(ESI)m/z=1436.4(M-H)-
3-1-4-6.添加劑不使用(4-(三氟甲基)苯硫醇)(1M)，而使用2-氰基-2-(羥基亞胺基)乙酸(S，Z)-(2,2-二甲基-1,3-二氧戊環(dioxolane)-4-基)甲酯(0.5M)之情形
(2S，5S，8S，14S，17S，20S，23S，26S)-N-((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-羥基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)-2,8,23-三苄基-14-異丁基-20-異丙基-N,5,7,17-四甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,28-九側氧基-1,4,7,10,13,16,19,22,25-九氮雜環二十八烷-26-羧醯胺(化合物SP-509)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0758-939
製備水(6.48ul)、依常法(Organic Letter，2012,14，3372-3375)另外合成之2-氰基-2-(羥基亞胺基)乙酸(S，Z)-(2,2-二甲基-1,3-二氧戊環(dioxolane)-4-基)甲酯(化合物SP-517)(11.0mg、0.050mmol)、三乙胺(13.94ul、0.100mmol)、1M磷酸緩衝溶液(pH=7.7，52.4ul)、0.5M參(2-羧基乙基)膦水溶液(pH=7.6、10.0ul)與N-甲基吡咯烷酮(2.7ul)之混合溶 液。於此混合溶液中，加入(3S，6S，9S，12S，15S，21S，24S，27S)-27-胺基-3-(((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-羥基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)(甲基)胺甲醯基)-6,21-二苄基-15-異丁基-9-異丙基-12,22,24-三甲基-5,8,11,14,17,20,23,26-八側氧基-28-苯基-4,7,10,13,16,19,22,25-八氮雜二十八烷-1-硫代酸 S-苄酯(化合物SP-508)之10mM N-甲基吡咯烷酮溶液10ul與11mM之內部標準(4-丙基苯甲酸)N-甲基吡咯烷酮溶液(4.56ul)，於30℃攪拌1小時。反應開始時之pH為9.8。使用LCMS觀測反應之變化，攪拌1小時後，觀測到水解體(化合物SP-510)之MASS。未觀測到標題化合物(SP-509)及酯交換體(化合物SP-516)之MASS。
‧水解體(化合物SP-510)
LCMS(ESI)m/z=1226.7(M-H)-
3-1-4-7.添加劑不使用(4-(三氟甲基)苯硫醇)(100mM)，而使用苯硫醇(100mM)之情形
(2S，5S，8S，14S，17S，20S，23S，26S)-N-((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-羥基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)-8,23-二苄基-14-異丁基-20-異丙基-N,2,57,17-五甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,28-九側氧基-1,4,7,10,13,16,19,22,25-九氮雜環二十八烷-26-羧醯胺(化合物SP-511)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0760-940
製備水(41.86ul)、苯硫醇(1.03ul、0.01mmol)與三乙胺(1.39ul、0.01mmol)之混合溶液。於此混合溶液中，加入1.9MHEPES緩衝溶液(pH=8.1，26.2ul)、0.5M參(2-羧基乙基)膦水溶液(pH=7.6、10ul)。再者，添加(3S，6S，9S，12S，15S，21S，24S，27S)-27-胺基-3-(((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-羥基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)(甲基)胺甲醯基)-6,21-二苄基-15-異丁基-9-異丙基-12,22,24-三甲基-5,8,11,14,17,20,23,26-八側氧基-28-苯基-4,7,10,13,16,19,22,25-八氮雜二十八烷-1-硫代酸 S-苄酯(化合物SP-504)之10mM N-甲基吡咯烷酮溶液10ul、11mM之內部標準(4-丙基苯甲酸)N-甲基吡咯烷酮溶液(4.56ul)與N-甲基吡咯烷酮(4.96ul)，於30℃終夜攪拌。反應開始時之pH為7.9。使用LCMS觀測反應之變化，確認標題化合物之生成。終夜攪拌後，從與內部標準之面積面積比獲得之轉化率為94%，標題化合物(SP-511)與水解體(化合物SP-512)之生成比以LCMS之UV面積比計，約3：1。
‧標題化合物(SP-511)
LCMS(ESI)m/z=1132.3(M-H)-
保持時間：0.63分(分析條件SQDFA05)
‧水解體(化合物SP-512)
LCMS(ESI)m/z=1150.2(M-H)-
保持時間：0.48分(分析條件SQDFA05)
3-1-4-8.添加劑不使用(4-(三氟甲基)苯硫醇)(1M)，而使用苯硫醇(1M)之情形
(2S，5S，8S，14S，17S，20S，23S，26S)-N-((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-羥基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)-8,23-二苄基-14-異丁基-20-異丙基-N,2,57,17-五甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,28-九側氧基-1,4,7,10,13,16,19,22,25-九氮雜環二十八烷-26-羧醯胺(化合物SP-511)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0761-941
製備水(24.44ul)、苯硫醇(10.3ul、0.10mmol)與三乙胺(13.9ul、0.10mmol)之混合溶液。於此混合溶液中，加入1.9MHEPES緩衝溶液(pH=8.1，26.2ul)、0.5M參(2-羧基乙基)膦水溶液(pH=7.6、10ul)。再者，加入(3S，6S，9S，12S，15S，21S，24S，27S)-27-胺基-3-(((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-羥基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)(甲基)胺甲醯基)-6,21-二苄基-15-異丁基-9-異丙基-12,22,24-三甲基-5,8,11,14,17,20,23,26-八側氧基-28-苯基-4,7,10,13,16,19,22,25-八氮雜二十八烷-1-硫代酸 S-苄酯(化合物SP-504)之10mM N-甲基吡咯烷酮溶液10ul與11mM之 內部標準(鄰苯二甲酸)N-甲基吡咯烷酮溶液(4.56ul)，於30℃攪拌40小時。反應開始時之pH為8.1。使用LCMS觀測反應之變化，確認標題化合物之生成。攪拌40小時後，原料(化合物SP-504)消失，標題化合物(SP-511)與水解體(化合物SP-512)之生成比以LCMS之UV面積比計，約7：1。
‧標題化合物(SP-511)
LCMS(ESI)m/z=1132.3(M-H)-
保持時間：0.63分(分析條件SQDFA05)
‧水解體(化合物SP-512)
LCMS(ESI)m/z=1150.4(M-H)-
保持時間：0.48分(分析條件SQDFA05)
由以上結果可明白：添加劑可使用各種芳基硫酯。為了將可轉譯之硫酯以快速的反應速度活化，硫醇基之電子提供性高者較有利，為了使經活化之硫酯與胺以足夠的速度環化反應，以電子吸引性高者較有利，兩者之均衡性係為重要。
於甘胺酸等高反應性之胺的情形、添加劑使用苯硫醇之情形，其濃度10mM即可獲得充分之環化反應之選擇性(環化反應：水解=30：1)。另一方面，於丙胺酸等反應性較低之胺的情形，於將苯硫醇濃度從10mM提高到100mM之條件，環化反應與水解之比率下降到3：1。再者，於提高苯硫醇濃度為1M之條件，其比率為7：1，未獲得反應性高之胺的相應的選擇性(30：1)。於此情形，添加劑若不使用苯硫醇而使用導入有電子吸引性基之4-(三氟甲基)苯硫醇1M，則環化反應與水解之比率成為30：1，能使選擇性提高。然而，若4-(三氟甲基) 苯硫醇濃度下降到100mM，其選擇性會下降(6：1)。因此於反應性低之胺的情形，添加劑使用之4-(三氟甲基)苯硫醇濃度宜為高濃度較理想。
又，向活性酯之交換反應，也可非為添加單一添加劑實施，而添加多數添加劑而達成。可明白：2-氰基-2-(羥基亞胺基)乙酸(S，Z)-(2,2-二甲基-1,3-二氧戊環(dioxolane)-4-基)甲基(化合物SP-517)之活化，雖未可達成從可轉譯之硫酯直接變換，但可首先以2-巰基苯酚活化可轉譯之硫酯後，再進一步活化。2-氰基-2-(羥基亞胺基)乙酸(S，Z)-(2,2-二甲基-1,3-二氧戊環(dioxolane)-4-基)甲酯(化合物SP-517)，據報告於水中能以高效率進行成為經N-甲基化之胺基酸或胜肽之高效率醯胺化反應(Organic Letter，2012,14，3372-3375)，經2階段活化而達成本活性物質之活化之事實值得重視。
3-2-1.於反應轉譯液中之反應最適化條件之環化反應
伴隨上述反應條件最適化實施於反應轉譯液中之環化反應，結果相較於轉譯胜肽之環化實驗實施條件，水解比率下降，能提高目的化合物比例。
(2S，5S，8S，14S，17S，20S，23S，26S)-N-((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-羥基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)-8,23-二苄基-14-異丁基-20-異丙基-N,2,57,17-五甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,28-九側氧基-1,4,7,10,13,16,19,22,25-九氮雜環二十八烷-26-羧醯胺(化合物SP-511)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0764-942
使4-(三氟甲基)苯硫醇(6.8μL、0.050mmol)及三乙胺(7.0μl、0.050mmol)溶於HEPES緩衝液(pH=7.6、1.9M、8.2μl)，製備硫醇溶液。
於(3S，6S，9S，12S，15S，21S，24S，27S)-27-胺基-3-(((S)-1-(((S)-1-((2-胺基-2-側氧基乙基)胺基)-3-羥基-1-側氧基丙烷-2-基)胺基)-1-側氧基丙烷-2-基)(甲基)胺甲醯基)-6,21-二苄基-15-異丁基-9-異丙基-12,22,24-三甲基-5,8,11,14,17,20,23,26-八側氧基-4,7,10,13,16,19,22,25-八氮雜二十八烷-1-硫代酸 S-苄酯(化合物SP-504)之NMP溶液(10mM、5.0μl、0.050μmol)中，添加作為內部標準之4-丙基苯甲酸之NMP溶液(11mM、2.25μl)。其次加入轉譯用緩衝液(6.25μl)、PURESYSTEM(r)classic II Sol.B(BIOCOMBER公司、產品編號PURE2048C)(10μl)、20種之天然胺基酸溶液(各5mM，2.5μl)。
又，轉譯用緩衝液之成分，為8mM GTP，8mM ATP，160mM肌酸磷酸，400mM HEPES-KOH pH7.6，800mM乙酸鉀，48mM乙酸鎂，16mM亞精胺(spermidine)，8mM二硫蘇糖醇，0.8mM 10-HCO-H4folate，12mg/ml E.coli MRE600(RNase陰性)來源tRNA(Roche公司)。於其中加入參(2-羧基乙基)膦水溶液(pH=7.5、1.25M、2.0μl)及先前製備之硫 醇溶液。此時點之反應液之pH為7.7。
將反應液於30℃攪拌22小時後，以LC/MS分析，確認標題化合物之生成。22小時攪拌後之反應液之pH為9.4。又，標題化合物(化合物SP-511)與水解體(化合物SP-512)之生成比，以UV面積比計，為2.6：1。
標題化合物(SP-511)
LCMS(ESI)m/z=1134.4(M+H)+
保持時間：0.64分(分析條件SQDFA05)
水解體(化合物SP-512)
LCMS(ESI)m/z=1152.5(M+H)+
保持時間：0.48分(分析條件SQDFA05)
3-3.使用N末MeAla示範胜肽之環化反應
接續N末端為Ala或Phe，也實施N-烷胺基酸MeAla之示範反應，確認環化體之生成。
3-3-1.N末端MeAla示範胜肽之合成
(6S，9S，12S，15S，18S，24S，27S，30S，33S)-18,30-二苄基-12,24-二異丁基-9,27-二異丙基-2,2,5,6,11,17,23,26-八甲基-33-(甲基((S)-1-側氧基-1-(((S)-1-側氧基-1-(哌啶-1-基)丙烷-2-基)胺基)-3-苯基丙烷-2-基)胺甲醯基)-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-十側氧基-15-((R)-1-(三苯甲氧基)乙基)-3-氧雜-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-十氮雜三十五烷-35-酸(Boc-MeAla-Val-MeLeu-Thr(Trt)-MePhe-Gly-MeLeu-MeVal-Phe-Asp-MePhe-Ala-哌啶)(化合物SP-518)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0766-944
於依常法合成之(6S，9S，12S，15S，18S，24S，27S，30S，33S)-18,30-二苄基-12,24-二異丁基-9,27-二異丙基-2,2,5,6,11,17,23,26-八甲基-33-(甲基((S)-1-側氧基-1-(((S)-1-側氧基-1-(哌啶-1-基)丙烷-2-基)胺基)-3-苯基丙烷-2-基)胺甲醯基)-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-十側氧基-15-((R)-1-(三苯甲氧基)乙基)-3-氧雜-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-十氮雜三十五烷-35-酸苄酯(化合物SP-519、Boc-MeAla-Val-MeLeu-Thr(Trt)-MePhe-Gly-MeLeu-MeVal-Phe-Asp(OBn)-MePhe-Ala-哌啶)(516mg、0.274mmol)之甲醇(3.5ml)溶液中加入羥基鈀/碳(172mg、50%wet.w/w)，氫取代後於室溫2.攪拌5小時。之後，將反應液以沸石過濾，將濾液減壓濃縮，獲得標題化合物(SP-518)(468mg、95%)。
LCMS(ESI)m/z=1790.9(M-H)-
保持時間：0.87分(分析條件SQDAA50)
(6S，9S，12S，15S，18S，24S，27S，30S，33S)-18,30- 二苄基-12,24-二異丁基-9,27-二異丙基-2,2,5,6,11,17,23,26-八甲基-33-(甲基((S)-1-側氧基-1-(((S)-1-側氧基-1-(哌啶-1-基)丙烷-2-基)胺基)-3-苯基丙烷-2-基)胺甲醯基)-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-十側氧基-15-((R)-1-(三苯甲氧基)乙基)-3-氧雜-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-十氮雜三十五烷-35-硫代酸S-苄酯(Boc-MeAla-Val-MeLeu-Thr(Trt)-MePhe-Gly-MeLeu-MeVal-Phe-Asp(SBn)-MePhe-Ala-哌啶)(化合物SP-520)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0767-945
使(6S，9S，12S，15S，18S，24S，27S，30S，33S)-18,30-二苄基-12,24-二異丁基-9,27-二異丙基-2,2,5,6,11,17,23,26-八甲基-33-(甲基((S)-1-側氧基-1-(((S)-1-側氧基-1-(哌啶-1-基)丙烷-2-基)胺基)-3-苯基丙烷-2-基)胺甲醯基)-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-十側氧基-15-((R)-1-(三苯甲氧基)乙基)-3-氧雜-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-十氮雜三十五烷-35-酸(化合物SP-518)(50.0mg、0.028mmol)溶於二氯甲烷(320μl)及DMF(80μl)，加入苯基甲烷硫醇(6.93mg、0.056mmol)、DIC(7.04mg、0.056mmol)及N,N-二甲基吡啶-4-胺(2.58mg、0.021mmol)，於室溫終夜攪拌。將反應液減壓濃縮，將獲得之殘渣以管柱層析(10mM乙酸銨水溶液：甲醇)精製，獲得標題化合物(SP-520)(37.6mg、71.0%)。
LCMS(ESI)m/z=1897.3(M-H)-
保持時間：0.99分(分析條件SQDAA50)
(3S，6S，9S，12S，15S，21S，24S，27S，30S)-15,27-二苄基-12-((R)-1-羥基乙基)-9,21-二異丁基-6,24-二異丙基-3,8,14,20,23-五甲基-30-(甲基((S)-1-側氧基-1-(((S)-1-側氧基-1-(哌啶-1-基)丙烷-2-基)胺基)-3-苯基丙烷-2-基)胺甲醯基)-4,7,10,13,16,19,22,25,28-九側氧基-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29-十氮雜三十二烷-32-硫代酸S-苄酯(MeAla-Val-MeLeu-Thr-MePhe-Gly-MeLeu-MeVal-Phe-Asp(SBn)-MePhe-Ala-哌啶)(化合物SP-521)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0768-946
將(6S，9S，12S，15S，18S，24S，27S，30S，33S)-18,30-二苄基-12,24-二異丁基-9,27-二異丙基-2,2,5,6,11,17,23,26-八甲基-33-(甲基((S)-1-側氧基-1-(((S)-1-側氧基-1-(哌啶-1-基)丙烷-2-基)胺基)-3-苯基丙烷-2-基)胺甲醯基)-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-十側氧基-15-((R)-1-(三苯甲氧基)乙基)-3-氧雜-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-十氮雜三十五烷-35-硫代酸S-苄酯(化合物SP-520)(37.6mg、0.020mmol)溶於二氯甲烷(300μl)，加入TFA(150.0μl、1.95mmol)，於室溫攪拌1小時半。反應液中加入三異丙基矽烷(15.7mg、0.099mmol) 後，將反應液減壓濃縮，將獲得之殘渣以管柱層析(0.1%FA水溶液：0.1%FA乙腈溶液)精製，獲得標題化合物(SP-521)(18.5mg、60.0%)。
LCMS(ESI)m/z=1555.1(M-H)-
保持時間：0.79分(分析條件SQDFA05)
(6S，9S，12S，15S，18S，24S，27S，30S，33S)-18,30-二苄基-12,24-二異丁基-9,27-二異丙基-2,2,5,6,11,17,23,26-八甲基-33-(甲基((S)-1-側氧基-1-(((S)-1-側氧基-1-(哌啶-1-基)丙烷-2-基)胺基)-3-苯基丙烷-2-基)胺甲醯基)-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-十側氧基-15-((R)-1-(三苯甲氧基)乙基)-3-氧雜-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-十氮雜三十五烷-35-酸2-(乙基二硫烷基)-6-甲基苯基(Boc-MeAla-Val-MeLeu-Thr(Trt)-MePhe-Gly-MeLeu-MeVal-Phe-Asp(O(2-EtSS-6-Me-Ph))-MePhe-Ala-哌啶)(化合物SP-522)之合成
又，本說明書中，Asp之側鏈羧酸經以2-(乙基二硫烷基)-6-甲基苯酯基取代而得之化合物，記載為Asp(O(2-EtSS-6-Me-Ph))。該部位含於胜肽之情形，也同樣記載。
Figure 107130626-A0101-12-0769-947
於(6S，9S，12S，15S，18S，24S，27S，30S，33S)-18,30-二苄基-12,24-二異丁基-9,27-二異丙基-2,2,5,6,11,17,23,26-八甲基-33-(甲基((S)-1-側氧基-1-(((S)-1-側氧基-1-(哌啶-1-基)丙烷-2-基)胺基)-3-苯基丙烷-2-基)胺甲醯基)-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-十側氧基-15-((R)-1-(三苯甲氧基)乙基)-3-氧雜-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-十氮雜三十五烷-35-酸(化合物SP-518)(50.0mg、0.028mmol)之二氯甲烷(300ul)溶液中，加入依常法(J.AM.CHEM.SOC.2009，131，5432-5437)分開合成之2-(乙基二硫烷基)-6-甲基苯酚(8.38mg、0.042mmol)、N,N’-甲烷二亞基雙(丙烷-2-胺)(6.52ul、0.042mmol)、N,N-二甲基吡啶-4-胺(3.41mg、0.028mmol)，於室溫攪拌終夜。之後，將反應液減壓濃縮，以逆相矽膠管柱層析(10mM乙酸銨水溶液/甲醇=70/30→0/100)精製，獲得標題化合物(化合物SP-522)(43.8mg，80%)。
LCMS(ESI)m/z=1973.5(M-H)-
保持時間：1.01分(分析條件SQDAA50)
(3S，6S，9S，12S，15S，21S，24S，27S，30S)-15,27-二苄基-12-((R)-1-羥基乙基)-9,21-二異丁基-6,24-二異丙基-3,8,14,20,23-五甲基-30-(甲基((S)-1-側氧基-1-(((S)-1-側氧基-1-(哌啶-1-基)丙烷-2-基)胺基)-3-苯基丙烷-2-基)胺甲醯基)-4,7,10,13,16,19,22,25,28-九側氧基-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29-十氮雜三十二烷-32-酸2-(乙基二硫烷基)-6-甲基苯酯(MeAla-Val-MeLeu-Thr-MePhe-Gly-MeLeu-MeVal-Phe-Asp(O(2 -EtSS-6-Me-Ph))-MePhe-Ala-哌啶)(化合物SP-523)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0771-948
於(6S，9S，12S，15S，18S，24S，27S，30S，33S)-18,30-二苄基-12,24-二異丁基-9,27-二異丙基-2,2,5,6,11,17,23,26-八甲基-33-(甲基((S)-1-側氧基-1-(((S)-1-側氧基-1-(哌啶-1-基)丙烷-2-基)胺基)-3-苯基丙烷-2-基)胺甲醯基)-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-十側氧基-15-((R)-1-(三苯甲氧基)乙基)-3-氧雜-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-十氮雜三十五烷-35-酸2-(乙基二硫烷基)-6-甲基苯基(化合物SP-522)(42.9mg、22umol)之二氯甲烷(200ul)溶液中，加入三氟乙酸(100ul)與三異丙基矽烷(22.3ul、0.109mmol)，於室溫攪拌10分鐘。之後，將反應液減壓濃縮，以逆相矽膠管柱層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液=70/30→0/100)精製，獲得標題化合物(化合物SP-523)(11.7mg、33%)。
LCMS(ESI)m/z=1632.9(M+H)+
保持時間：0.83分(分析條件SQDFA05)
3-3-2.N末端MeAla示範胜肽之環化反應例
(2R，5S，8S，11S，14S，20S，23S，26S，29S)-14,26-二苄基-11-((R)-1-羥基乙基)-8,20-二異丁基-5,23-二異丙基-N,1,2,7,13,19,22-七甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,31-十側氧基 -N-((S)-1-側氧基-1-(((S)-1-側氧基-1-(哌啶-1-基)丙烷-2-基)胺基)-3-苯基丙烷-2-基)-1,4,7,10,13,16,19,22,25,28-十氮雜環三十一烷-29-羧醯胺之(化合物SP-524)合成
Figure 107130626-A0101-12-0772-949
於(3S，6S，9S，12S，15S，21S，24S，27S，30S)-15,27-二苄基-12-((R)-1-羥基乙基)-9,21-二異丁基-6,24-二異丙基-3,8,14,20,23-五甲基-30-(甲基((S)-1-側氧基-1-(((S)-1-側氧基-1-(哌啶-1-基)丙烷-2-基)胺基)-3-苯基丙烷-2-基)胺甲醯基)-4,7,10,13,16,19,22,25,28-九側氧基-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29-十氮雜三十二烷-32-硫代酸S-苄酯(化合物SP-521)之NMP溶液(10mM、10μl、0.10μmol)中，加入4-(三氟甲基)苯硫醇之400mM磷酸氫二鈉緩衝液(0.2M、50.0μl、10.0μmol)、三乙胺之NMP溶液(1M、10μl、10.0μmol)及NMP(30.0μl)，於室溫攪拌4小時。以LC/MS之分析，確認標題化合物(SP-524)之生成。
LCMS(ESI)m/z=1432.8(M+H)+
保持時間：1.06分(分析條件SQDFA05)
(2S，5S，8S，11S，14S，20S，23S，26S，29S)-14,26-二苄基-11-((R)-1-羥基乙基)-8,20-二異丁基-5,23-二異丙基-N,1,2,7,13,19,22-七甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,31-十側氧基-N-((S)-1-側氧基-1-(((S)-1-側氧基-1-(哌啶-1-基)丙烷-2-基)胺 基)-3-苯基丙烷-2-基)-1,4,7,10,13,16,19,22,25,28-十氮雜環三十一烷-29-羧醯胺(化合物SP-524)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0773-950
於(3S，6S，9S，12S，15S，21S，24S，27S，30S)-15,27-二苄基-12-((R)-1-羥基乙基)-9,21-二異丁基-6,24-二異丙基-3,8,14,20,23-五甲基-30-(甲基((S)-1-側氧基-1-(((S)-1-側氧基-1-(哌啶-1-基)丙烷-2-基)胺基)-3-苯基丙烷-2-基)胺甲醯基)-4,7,10,13,16,19,22,25,28-九側氧基-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29-十氮雜三十二烷-32-酸2-(乙基二硫烷基)-6-甲基苯基(化合物P-523)(0.163mg，0.100umol)與1-羥基吡咯烷-2,5-二酮(0.575mg、5.0umol)之DMF(50ul)溶液中，加入1M磷酸緩衝溶液(pH8.5、20ul)、水(25ul)。再加入1M參(2-羧基乙基)膦(TCEP)水溶液(5ul)，於室溫攪拌2小時。使用LCMS觀測反應，結果觀測到標題化合物(化合物SP-524)。
LCMS(ESI)m/z=1432.9(M+H)+
保持時間：1.09分(分析條件SQDFA05)
5.使用RNA-胜肽複合體之不利用反應輔助基之胜肽環化
於RNA-胜肽複合體實施不利用反應輔助基之胜肽環化反應，將產物以電泳解析。
5-1.含嘌呤黴素之模板mRNA之製備及使用其之RNA-胜肽複合體之轉譯合成
以由PCR製備之3個DNA(序列編號DM-D1、DM-D2、DM-D3)作為模板，各以體外轉錄製備mRNA(序列編號RM-D3、R-D4、R-D5)，並使用RNeasy mini kit(Qiagen公司)精製。對於各10μM之mRNA，加入50μM之嘌呤黴素連結子(Sigma公司)(序列編號C-D1)1X T4 RNA接合酶反應緩衝液(NEB公司)、1mM DTT、1mM ATP、0.02%BSA(Takara公司)、510μM(PEG2000)(Wako公司)、10% DMSO、1%(v/v)RNasein Ribonuclease inhibitor(Promega公司，N2111)0.85unit/μl T4 RNA接合酶(NEB公司)，於15℃進行一晚接合反應後，以RNeasy MinElutekit(Qiagen公司)精製。其次，將上述製備之3個mRNA-嘌呤黴素連結子連結體1μM分別作為模板，加入前述無細胞轉譯液與0.25mM Ser、0.25mM Gly，0.25mM Pro，0.25mM Arg，0.25mM Thr，0.25mM Tyr及、50μM Asp(SBn)-tRNAGluAAG(化合物AT-7-A)，於37℃保溫60分鐘後，接著於室溫保溫12分鐘。又，於以OT98RNA(序列編號RM-D4)、OT99RNA(序列編號RM-D5)來源之mRNA-嘌呤黴素作為模板之情形，各加入0.25mM之Phe,0.25mM之Ala，進行轉譯。之後，將反應液以RNeasy minelute(qiagen公司)精製，獲得RNA-胜肽複合體。
序列編號DM-D1 OT-97(序列編號：82)OT-97 DNA序列
Figure 107130626-A0101-12-0774-951
Figure 107130626-A0101-12-0775-952
序列編號DM-D2 OT-98(序列編號：83)OT-98 DNA序列
Figure 107130626-A0101-12-0775-953
序列編號DM-D3 OT-99(序列編號：84)OT-99 DNA序列
Figure 107130626-A0101-12-0775-954
序列編號RM-D3 OT-97(序列編號：85)OT-97 RNA序列
Figure 107130626-A0101-12-0775-955
序列編號RM-D4 OT-98(序列編號：86)OT-98 RNA序列
Figure 107130626-A0101-12-0775-956
序列編號RM-D5 OT-99(序列編號：87)OT-99 RNA序列
Figure 107130626-A0101-12-0776-957
序列編號C-D1 HY_C18_dCdClinker[P]dCdC[Fluorecein-dT][Spacer18][Spacer18][Spacer18][Spacer18]dCdC[puromycin]([P]：5'磷酸化)
5-2.使用胜肽-RNA複合體之不利用反應輔助基之胜肽環化反應
於氮氣氛圍下，於上述製備之從OT-97 RNA序列(序列編號RM-D3)而來之70μL之RNA-胜肽複合體，混合20.1μL之硫苯酚溶液(5M 4-三氟甲硫基苯酚水溶液、5M三乙胺水溶液等量混合者)、10μL 500mM三羧基乙基膦溶液(pH7.5)，於50℃使反應2小時。又，使用HEPES緩衝液(pH7.6)製備5M 4-三氟甲硫基苯酚溶液及5M三乙胺溶液，將此等等量混合，製備硫苯酚溶液後，對於從OT-98 RNA序列(序列編號RM-D4)、OT-99 RNA序列(序列編號RM-D5)而來之RNA-胜肽複合體70μL各者，將20.1μL之NMP、上述硫苯酚溶液20.1μL、500mM三羧基乙基膦溶液(pH7.5)10μL於氮氣氛圍下混合，於30℃攪拌22小時。
從獲得之3種反應液各者，使用RNeasy minelute(qiagen公司)將胜肽-RNA複合體精製，以純水70μL從管柱溶出。然後，加入8.4μL之10xRNase ONE ribonuclease反應緩衝液(promega公司)、2.8μL之RNase ONE ribonuclease(promega 公司)、2.8μL之RNase H(Life technologies公司)，於37度保溫一晚。然後，將與獲得之反應溶液未有任何反應之嘌呤黴素連結子(序列編號C-D1)以peptide-PAGE mini(TEFCO公司)電泳，以來自嘌呤黴素連結子之Fluorecein使譜帶可見化。其結果，關於任意反應溶液均為，觀測到於嘌呤黴素連結子有胜肽鍵結而來之譜帶移動度之差異((圖47)。由此顯示目的環化胜肽-RNA複合體之存在。
6.使用正白胺酸替換甲硫胺酸及利用胺基肽酶之於胜肽環化之應用
轉譯後，將N末端經甲醯基化之轉譯開始胺基酸以甲硫胺酸胺基肽酶、及胜肽去甲醯基酶切斷，藉此使用露出之α-胺基施行胜肽環化反應，以MALDI-MS分析。又，轉譯開始胺基酸，將甲硫胺酸替換為使用不含易氧化之硫原子的胺基酸即正白胺酸(CAS編號327-57-1)。
6-1.使用以正白胺酸開始轉譯、且於側鏈含經苄基硫酯化之天冬胺酸衍生物之胜肽之轉譯後開始胺基酸除去及不利用反應輔助基之胜肽環化
於1μM模板RNA Mgtp_R(序列編號R-41)中，將含0.25mM Pro，0.25mM Gly，0.25mM Thr，0.25mM Arg，0.25mM Tyr，2.5mM正白胺酸(Nle)及、50μM Asp(SBn)-tRNAGluAAG(化合物AT-7-A)之前述轉譯液於37℃保溫60分鐘。於獲得之轉譯溶液1μL加入9μL之0.2%三氟乙酸，將其中1μL乘載於MALDI標靶板上後，與1μL之CHCA溶液(10mg/ml α-氰基-4-羥基桂皮酸、50%乙腈、0.1%三氟乙 酸溶液)混合，於板上乾固。MALDI-MS之結果，觀測到從甲醯基正白胺酸開始轉譯開始之目的之胜肽P-D5為來源之峰部(圖48、峰部I)。然後於上述獲得之轉譯溶液4μL中，將製備為附加His標籤之蛋白之150μM甲硫胺酸胺基肽酶、20μM胜肽去甲醯基酶各添加0.5μL，於37℃保溫30分鐘。如前述實施前處理使獲得之反應液為1μL，以MALDI-MS分析，結果觀測到相當於開始甲醯基正白胺酸脫去，N末端露出Gly之胜肽P-141的峰部(圖48、峰部II)。最後，將含該P-141之轉譯溶液3.5μL、1μL硫苯酚溶液(5M 4-三氟甲硫基苯酚、5M三乙胺等量混合者)、0.5μL 500mM三羧基乙基膦溶液(pH7.6)混合，於50℃保溫2小時。使用獲得之反應溶液2μL，加入12μL之2%三氟乙酸，將其中1μL乘載於MALDI標靶板上後，與1μL之CHCA溶液(10mg/ml α-氰基-4-羥基桂皮酸、50%乙腈、0.1%三氟乙酸溶液)混合，於板乾固後，以MALDI-MS解析。其結果觀測到相當於N末端α-胺基之氮原子與Asp之側鏈羧酸予以醯胺環化而得之目的化合物P-143之峰部(圖48、峰部III)。
胜肽序列P-D5 fNleGlyThrThrThrArg[Asp(SBn)]ProTyrArgGlyGly
MALDI-MS：m/z：[H+M]+=1427.4(序列P-D5所對應之胜肽。Calc.1427.7)
m/z：[H+M]+=1286.4(序列P-141所對應之胜肽。Calc.1286.6)
m/z：[H+M]+=1162.3(序列P-143所對應之胜肽。Calc1162.6)
[實施例21]從分支胜肽之轉譯產物之生成(直鏈部 2之生成)
1.可從分支胜肽之轉譯產物生成之單元之選擇及反應條件探討
1-1.利用分子間示範反應所為之醯胺化反應
以下所示1-(2-巰基乙胺基)-1-側氧基-3-苯基丙烷-2-基胺甲酸(S)-第三丁酯(化合物10)之合成探討之結果，明白：藉由將酯官能基於水中添加硫醇能活化成硫酯，且藉由使經活化之硫酯與胺縮合反應，能選擇性地生成醯胺鍵。
以下反應之結果如圖41。
Entry 1
於2-巰基乙烷磺酸鈉(33mg、0.200mmol)與2-胺基乙烷硫醇 鹽酸鹽(22.7mg、0.200mmol)加入pH7.7之0.2M HEPES緩衝液(1.60ml)、DMF(0.400ml)，調整為pH7.，於室溫攪拌5分鐘。之後，加入2-(第三丁氧基羰胺基)-3-苯基丙酸(S)-2-胺基-2-側氧基乙酯(化合物11)(6.4mg、0.02mmol)，於50度攪拌24小時。使用LCMS觀測反應之變化，確認於24小時生成1-(2-巰基乙胺基)-1-側氧基-3-苯基丙烷-2-基胺甲酸(S)-第三丁酯(化合物10)。水解物與目的化合物10之生成比為，以LCMS之UV面積比計，為46：43。
Entry 2
於2-巰基乙烷磺酸鈉(164mg、1.000mmol)與2-胺基乙烷硫醇鹽酸鹽(11.4mg、0.100mmol)，加入pH7.0之0.2M HEPES緩衝液(0.250ml)、DMF(0.200ml)、水(0.500ml)，於室 溫攪拌5分鐘。再加入1M氫氧化鈉水溶液(0.050ml)，調整為pH7.6後，加入2-(第三丁氧基羰胺基)-3-苯基丙酸(S)-2-胺基-2-側氧基乙酯(化合物11)(3.2mg、0.01mmol)，於40度攪拌24小時。使用LCMS觀測反應之變化，確認於24小時生成1-(2-巰基乙胺基)-1-側氧基-3-苯基丙烷-2-基胺甲酸(S)-第三丁酯(化合物10)。水解物與目的化合物10之生成比，以LCMS之UV面積比計，為24：60。
Entry 3
於2-二甲胺基乙烷硫醇鹽酸鹽(142mg、1.000mmol)與2-胺基乙烷硫醇鹽酸鹽(11.4mg、0.100mmol)，加入pH7.0之0.2M HEPES緩衝液(0.750ml)、DMF(0.200ml)、水(0.100ml)，於室溫攪拌5分鐘。再加入1M氫氧化鈉水溶液(0.150ml)，調整為pH7.3後，加入2-(第三丁氧基羰胺基)-3-苯基丙酸(S)-2-胺基-2-側氧基乙酯(化合物11)(3.2mg、0.01mmol)，於40度攪拌24小時。使用LCMS觀測反應之變化，確認於24小時生成1-(2-巰基乙胺基)-1-側氧基-3-苯基丙烷-2-基胺甲酸(S)-第三丁酯(化合物10)。水解物與目的化合物10之生成比，以LCMS之UV面積比計，為23：71。
Entry 4
於2-二甲胺基乙烷硫醇鹽酸鹽(425mg、3.000mmol)與2-胺基乙烷硫醇鹽酸鹽(11.4mg、0.100mmol)中，加入pH7.0之0.5M HEPES緩衝液(0.300ml)、DMF(0.200ml)、水 (0.200ml)，於室溫攪拌5分鐘。再加入1M氫氧化鈉水溶液(0.300ml)，調整為pH6.9後，加入2-(第三丁氧基羰胺基)-3-苯基丙酸(S)-2-胺基-2-側氧基乙酯(化合物11)(3.2mg、0.01mmol)，於40度攪拌24小時。使用LCMS觀測反應之變化，確認於24小時生成1-(2-巰基乙胺基)-1-側氧基-3-苯基丙烷-2-基胺甲酸(S)-第三丁酯(化合物10)。水解物與目的化合物10之生成比，以LCMS之UV面積比計，為15：84。
LCMS(ESI)m/z=325(M+H)+
保持時間：0.71分(分析條件SQDFA05)
1-2.以轉譯胜肽示範化合物所為之分子內分支胜肽(直鏈部2)生成反應例
確認從推測已環化之胜肽(第1次之醯胺環化)生成後之胜肽之示範物於反應中發生分支化(直鏈部2之生成)。依以下流程，進行經醯胺環化(醯胺環化部也使用主鏈環化)，且於主鏈具有酯官能基，於胺基酸側鏈具有具反應輔助基之胺基之示範化合物之合成。然後進行分支化實驗，觀測到從環狀胜肽於RNA能安定存在之溫和反應條件下，在水中有分支化。
1-2-1.轉譯胜肽示範化合物P-150之合成
Figure 107130626-A0101-12-0782-958
(S)-2-(((9H-茀-9-基)甲氧基)羰胺基)-6-((R)-2-(烯丙氧基羰胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙烷醯胺)己酸(Fmoc-Lys(Alloc-Cys(StBu))-OH)(化合物150a)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0782-2264
將(R)-2-(烯丙氧基羰胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(Alloc-Cys(StBu)-OH)(1.9g、6.48mmol)與N-羥基琥珀醯亞胺(0.745g、6.48mmol)之二氯甲烷(10ml)溶液冷卻至0度後，加入1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二醯亞胺鹽酸鹽(EDC‧HCl、1.24g、6.48mmol)，將反應液於室溫攪拌20小時。20小時後，將反應液冷卻至0度後，加入N,N-二異丙基乙胺(2.49ml、14.25mmol)與Fmoc-Lys-OH(2.39g、6.48mmol)，將 反應液於室溫攪拌2小時。於反應混合物中加入二氯甲烷與1M鹽酸，以二氯甲烷萃取。將有機層以25wt%食鹽水洗滌，並將獲得之溶液減壓濃縮，將濃縮殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)精製，獲得(S)-2-(((9H-茀-9-基)甲氧基)羰胺基)-6-((R)-2-(烯丙氧基羰胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙烷醯胺)己酸(化合物150a、Fmoc-Lys(Alloc-Cys(StBu))-OH)(2.66g、64%)。
LCMS(ESI)m/z=644.6(M+H)+
保持時間：0.91分(分析條件SQD FA05)
(R)-3-(第三丁基二硫烷基)-1-側氧基-1-(4-((5S，8S，11S，14S，20S，23S，26S，29S)-5,14,20,29-四苄基-11-異丁基-4,10,16,19,23,25,26-七甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-十側氧基-1-氧雜-4,7,10,13,16,19,22,25,28-九氮雜環三十烷-8-基)丁胺基)丙烷-2-基胺甲酸烯丙酯(化合物150b)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0783-960
作為Fmoc胺基酸，使用Fmoc-MePhe-OH、 Fmoc-MeAla-OH、Fmoc-MeLeu-OH、Fmoc-MeGly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Lys(Alloc-Cys(StBu))-OH(化合物150a)，進行胜肽之伸長。胜肽之伸長後，將N末端之Fmoc基予以脫保護，將HOAt，DIC作為縮合劑使氯乙酸縮合後，將樹脂以DMF洗滌。於樹脂加入二氯甲烷/2,2，2-三氟乙醇(=1/1，v/v、4mL)，使反應1小時，進行從樹脂切出胜肽。反應結束後，將管內溶液以合成用管柱過濾以將樹脂去除，將樹脂以二氯甲烷/2,2,2-三氟乙醇(=1/1，v/v、1mL)洗滌。將獲得之溶液減壓濃縮，獲得粗產物(2S，5S，8S，11S，17S，20S，23S，30R)-2,11,17-三苄基-30-((第三丁基二硫烷基)甲基)-23-((S)-2-(2-氯-N-甲基乙醯胺)-3-苯基丙烷醯胺)-20-異丁基-5,6,8,12,15,21-六甲基-4,7,10,13,16,19,22,29,32-九側氧基-33-氧雜-3,6,9,12,15,18,21,28,31-九氮雜三十六-35-烯-1-酸(ClAc-MePhe-Lys(Alloc-Cys(StBu))-MeLeu-Phe-MeGly-MePhe-Ala-MeAla-Phe)(87.2mg)。於獲得之粗產物(ClAc-MePhe-Lys(Alloc-Cys(StBu))-MeLeu-Phe-MeGly-MePhe-Ala-MeAla-Phe)(87.2mg，0.059mmol)與碘化鈉(22.2mg，0.148mmol)之DMF(7.5ml)溶液中，於氮氣氛圍下加入碳酸鉀(12.3mg、0.089mmol)，將反應液於35度攪拌2.5小時。將反應液減壓濃縮，將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)精製，獲得標題化合物150b(74.2mg、87%)。
LCMS(ESI)m/z=1433(M+H)+
保持時間：0.66分(分析條件SQD FA50)
化合物P-150
(R)-2-胺基-3-(第三丁基二硫烷基)-N-(4-((5S，8S，11S，14S，20S，23S，26S，29S)-5,14,20,29-四苄基-11-異丁基-4,10,16,19,23,25,26-七甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-十側氧基-1-氧雜-4,7,10,13,16,19,22,25,28-九氮雜環三十烷-8-基)丁基)丙烷醯胺之合成
Figure 107130626-A0101-12-0785-2265
於(R)-3-(第三丁基二硫烷基)-1-側氧基-1-(4-((5S，8S，11S，14S，20S，23S，26S，29S)-5,14,20,29-四苄基-11-異丁基-4,10,16,19,23,25,26-七甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-十側氧基-1-氧雜-4,7,10,13,16,19,22,25,28-九氮雜環三十烷-8-基)丁胺基)丙烷-2-基胺甲酸烯丙基(化合物150b)(23.1mg，0.016mmol))之THF(0.16ml)溶液中，於氮氣氛圍下加入肆(三苯基膦)鈀(0)(2.0mg、0.002mmol)與嗎啉(5.62ml、0.064mmol)，將反應液於30度攪拌4小時。將反應液減壓濃縮並將獲得之殘渣以逆 相矽膠管柱層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)精製，獲得標題化合物P-150(10.2mg、47%)。
LCMS(ESI)m/z=1349(M+H)+
保持時間：0.74分(分析條件SQD FA05)
1-2-2.從轉譯示範胜肽之分子內分支胜肽生成反應
化合物P-151
(S)-2-(2-羥基-N-甲基乙醯胺)-3-苯基-N-((3R,6S,9S,12S,15S,21S,24S,27S)-6,15,21-三苄基-24-異丁基-3-(巰基甲基)-9,10,12,16,19,25-六甲基-2,5,8,11,14,17,20,23,26-九側氧基-1,4,7,10,13,16,19,22,25-九氮雜環三十一烷-27-基)丙烷醯胺之合成
Figure 107130626-A0101-12-0787-962
於2-巰基乙烷磺酸鈉(99mg、0.600mmol)與參(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽(2.9mg、0.010mmol)，加入pH7.0之0.5M HEPES緩衝液(0.060ml)、1,3-二甲基-2-四氫咪唑酮(DMI)(0.010ml)、水(0.010ml)，於室溫攪拌5分鐘。再加入2M氫氧化鈉水溶液(0.060ml)，調整為pH8.5後，加入R)-2-胺基-3-(第三丁基二硫烷基)-N-(4-((5S,8S,11S,14S,20S,23S,26S,29S)-5,14,20,29-四苄基-11-異丁基-4,10,16,19,23,25,26-七甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-十側氧基-1-氧雜-4,7,10,13,16,19,22,25,28-九氮雜環三十烷-8-基)丁基)丙烷醯胺(化合物P-150)之0.01M 1,3-二甲基-2-四氫咪唑酮(DMI)溶 液(0.050ml、0.5μmol)，於30度攪拌6小時30分鐘。使用LCMS觀測反應之變化，6小時30分後，確認生成目的化合物，目的化合物P-151與水解化合物之生成比，以LCMS之UV面積比計，為55：9。(圖42、水解化合物 保持時間：0.64分)
LCMS(ESI)m/z=1261(M+H)+
保持時間：0.87分(分析條件SQDFA05)
2.於第1次之環化使用具有反應輔助基之位於N末端之三角單元與C末端側之活性硫酯(交叉單元)之醯胺化反應、於第2次之分支化使從Cys-Pro-HOGly產生活性酯，並使與無保護之側鏈胺基反應而分支之例之實施
2-1.利用自動合成機所為之主鏈含酯基之胜肽之固相合成一般法
於合成機裝入Sieber Amide resin(每1管柱160-200mg、從Novabiochem購買)、各種Fmoc胺基酸(0.6mol/L)及1-羥基-7-氮雜苯并三唑(HOAt)(0.375mol/L)之N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)溶液、二異丙基碳二醯亞胺(DIC)之N,N-二甲基甲醯胺(DMF)溶液(10%v/v)，且Fmoc脫保護溶液使用哌啶之N,N-二甲基甲醯胺溶液(20%v/v)，設定Fmoc脫保護反應時間為5分鐘進行合成。以DMF溶液洗滌後，Fmoc脫保護後進行Fmoc胺基酸之縮合反應，作為1個循環，反複此循環，在樹脂表面上使胜肽伸長。作為如此之實驗例，也可參考相本等人之非專利文獻(Tetrahedron 2009，65，3871-3877)合成。又，本法也可作為其他胜肽之合成法，在本說明書一般適當的情況中使用。
2-2.於第1次之環化使用具有反應輔助基之位於N末端之三角單元與C末端側之活性硫酯(交叉單元)之醯胺化反應，於第2次之分支化使從Cys-Pro-HOGly產生活性酯，使與無保護之側鏈胺基反應而分支之例之化學反應條件之設定2-2-1.轉譯胜肽示範化合物SP605之合成
依以下流程，進行N末端具有Cys，且C末端側之第1次之環化單元具有Asp(SBn)，第2次之分支化單元具有作為活性硫酯產生部分的Cys-Pro-HOGly，側鏈胺反應部位具有Lys之示範胜肽之合成。
Figure 107130626-A0101-12-0789-963
(5S,8R)-5-((1H-吲哚-3-基)甲基)-1-(9H-茀-9-基)-12,12-二甲基-3,6-二側氧基-2-氧雜-10,11-二硫雜-4,7-二氮雜十三烷-8-羧酸(化合物SP602、Fmoc-Trp-Cys(StBu)-OH)之合 成
Figure 107130626-A0101-12-0790-964
將Fmoc-Trp-OH(5g、11.72mmol)與N-羥基琥珀醯亞胺(1.35g、11.72mmol)之二氯甲烷(23ml)溶液冷卻至0度後，加入1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二醯亞胺鹽酸鹽(EDC‧HCl、2.25g、11.72mmol)，將反應液於室溫攪拌5.5小時。將反應液冷卻至0度後，加入N,N-二異丙基乙胺(2.05ml、11.72mmol)與H-Cys(StBu)-OH(2.45g、11.72mmol)，將反應液於室溫攪拌14小時。於反應混合物中加入二氯甲烷與1M鹽酸，以二氯甲烷萃取。將有機層以25wt%食鹽水洗滌，並以硫酸鈉乾燥。將獲得之溶液減壓濃縮，將濃縮殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)精製，獲得(5S,8R)-5-((1H-吲哚-3-基)甲基)-1-(9H-茀-9-基)-12,12-二甲基-3,6-二側氧基-2-氧雜-10,11-二硫雜-4,7-二氮雜十三烷-8-羧酸(化合物SP602、Fmoc-Trp-Cys(StBu)-OH)(4.15g、57%)。
LCMS(ESI)m/z=618(M+H)+
保持時間：0.93分(分析條件SQD FA05)
(S)-3-((S)-2-(2-((S)-1-((6R,12S,15S,18R)-15-((1H-吲哚-3-基)甲基)-6-((4-疊氮化苄氧基)羰胺基)-18-((第三丁基二硫烷基)甲基)-12-(4-(二甲胺基)丁基)-2,2-二甲基 -7,10,13,16-四側氧基-3,4-二硫雜-8,11,14,17-四氮雜十九烷)吡咯烷-2-羰氧基)乙醯胺)-6-((4-疊氮化苄氧基)羰胺基)己烷醯胺)-4-((S)-2-胺甲醯基吡咯烷-1-基)-4-側氧基丁酸(化合物SP603、Acbz-Cys(StBu)-Gly-Lys(Me2)-Trp-Cys(StBu)-Pro-HOGly-Lys(Acbz)-Asp-Pro-NH2)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0791-965
用語之定義
Acbz：4-疊氮化苄基氧羰基
Figure 107130626-A0101-12-0791-966
HOGly：甘醇酸
Fmoc-Lys(Me2)-OH‧HCl：N-α-(9-茀基甲氧羰基)-N-ε,N-ε-二甲基-L-離胺酸 鹽酸鹽
Figure 107130626-A0101-12-0791-967
Fmoc-Asp(OPis)-OH：N-α-(9-茀基甲氧羰基)-L-天冬胺 酸β-(2-苯基)異丙基 酯
Figure 107130626-A0101-12-0792-968
N末端之胺基酸使用Acbz-Cys(StBu)-OH、Fmoc胺基酸使用Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Me2)-OH‧HCl、Fmoc-Trp-Cys(StBu)-OH、Fmoc-Pro-HOGly-OH(化合物SP632)、Fmoc-Lys(Acbz)-OH(化合物SP661)、Fmoc-Asp(OPis)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Trp-Cys(StBu)-OH(化合物SP602)，依據實施例2-1記載之方法進行胜肽之伸長。
胜肽之伸長後，將樹脂以DMF，二氯甲烷洗滌。於樹脂加入含2%TFA(v/v)之二氯甲烷/2,2，2-三氟乙醇(=1/1，v/v、4mL)，於室溫使反應3小時，進行從樹脂切出胜肽。反應結束後，將管內溶液以合成用管柱過濾以將樹脂除去，將樹脂以二氯甲烷/2,2，2-三氟乙醇(=1/1，v/v、2mL)洗滌4次。將獲得之溶液減壓濃縮，將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)精製，獲得標題化合物(Acbz-Cys(StBu)-Gly-Lys(Me2)-Trp-Cys(StBu)-Pro-HOGly-Lys(Acbz)-Asp-Pro-NH2)(化合物SP603)(360mg、39%)。
LCMS(ESI)m/z=1645(M+H)+
保持時間：0.75分(分析條件SQD FA05)
1-((6R,12S,15S,18R)-15-((1H-吲哚-3-基)甲基)-6-((4-疊氮化苄氧基)羰胺基)-18-((第三丁基二硫烷基)甲基)-12-(4-(二甲胺基)丁基)-2,2-二甲基-7,10,13,16-四側氧基-3,4-二硫雜-8,11,14,17-四氮雜十九烷)吡咯烷-2-羧酸(S)-2-((9S,12S)-1-(4-疊氮化物苯基)-12-((S)-2-胺甲醯基吡咯烷-1-羰基)-3,10,14-三側氧基-16-苯基-2-氧雜-15-硫雜-4,11-二氮雜十六烷-9-基胺基)-2-側氧基乙酯(化合物SP604、Acbz-Cys(StBu)-Gly-Lys(Me2)-Trp-Cys(StBu)-Pro-HOGly-Lys(Acbz)-Asp(SBn)-Pro-NH2)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0793-969
將(S)-3-((S)-2-(2-((S)-1-((6R,12S,15S,18R)-15-((1H-吲哚-3-基)甲基)-6-((4-疊氮化苄氧基)羰胺基)-18-((第三丁基二硫烷基)甲基)-12-(4-(二甲胺基)丁基)-2,2-二甲基-7,10,13,16-四側氧基-3,4-二硫雜-8,11,14,17-四氮雜十九烷)吡咯烷-2-羰氧基)乙醯胺)-6-((4-疊氮化苄氧基)羰胺基)己烷醯胺)-4-((S)-2-胺甲醯基吡咯烷-1-基)-4-側氧基丁酸(化合物SP603、Acbz-Cys(StBu)-Gly-Lys(Me2)-Trp-Cys(StBu)-Pro-HOGly-Lys(Acbz)-Asp-Pro-NH2)(180mg，0.110mmol)與HOBt(44.4mg， 0.329mmol)之DMF(1.096ml)溶液冷卻至0度後，加入1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二醯亞胺鹽酸鹽(EDC‧HCl、63mg、0.329mmol)，3分鐘攪拌後，加入苄基硫醇(64.3μl，0.548mmol)。將反應液於室溫攪拌1小時，將反應液以逆相矽膠管柱層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)精製，獲得標題化合物(化合物SP604、Acbz-Cys(StBu)-Gly-Lys(Me2)-Trp-Cys(StBu)-Pro-HOGly-Lys(Acbz)-Asp(SBn)-Pro-NH2)(136.3mg、71%)。
LCMS(ESI)m/z=1751(M+H)+
保持時間：0.78分(分析條件SQD FA05)
1-((6R,12S,15S,18R)-15-((1H-吲哚-3-基)甲基)-6-胺基-18-((第三丁基二硫烷基)甲基)-12-(4-(二甲胺基)丁基)-2,2-二甲基-7,10,13,16-四側氧基-3,4-二硫雜-8,11,14,17-四氮雜十九烷)吡咯烷-2-羧酸(S)-2-((S)-6-胺基-1-((S)-4-(苄硫基)-1-((S)-2-胺甲醯基吡咯烷-1-基)-1,4-二側氧基丁烷-2-基胺基)-1-側氧基己烷-2-基胺基)-2-側氧基乙酯(化合物SP605、H-Cys(StBu)-Gly-Lys(Me2)-Trp-Cys(StBu)-Pro-HOGly-Lys-Asp(SBn)-Pro-NH2)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0794-2266
將1-((6R,12S,15S,18R)-15-((1H-吲哚-3-基)甲基)-6-((4-疊氮化苄氧基)羰胺基)-18-((第三丁基二硫烷基)甲基)-12-(4-(二甲胺基)丁基)-2,2-二甲基-7,10,13,16-四側氧基-3,4-二硫雜-8,11,14,17-四氮雜十九烷)吡咯烷-2-羧酸(S)-2-((9S,12S)-1-(4-疊氮化物苯基)-12-((S)-2-胺甲醯基吡咯烷-1-羰基)-3,10,14-三側氧基-16-苯基-2-氧雜-15-硫雜-4,11-二氮雜十六烷-9-基胺基)-2-側氧基乙酯(化合物SP604、Acbz-Cys(StBu)-Gly-Lys(Me2)-Trp-Cys(StBu)-Pro-HOGly-Lys(Acbz)-Asp(SBn)-Pro-NH2)(136.3mg，0.078mmol)之1,3-二甲基-2-四氫咪唑酮(DMI)(1.6ml)溶液冷卻至0度後，加入TCEP(參(2-羧基乙基)膦)鹽酸鹽(66.9mg，0.234mmol)之水溶液(1.6ml)溶液。將反應液於室溫攪拌90分鐘，將反應液以逆相矽膠管柱層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)精製，獲得標題化合物(化合物SP605、H-Cys(StBu)-Gly-Lys(Me2)-Trp-Cys(StBu)-Pro-HOGly-Lys-Asp(SBn)-Pro-NH2)(63mg、58%)。
LCMS(ESI)m/z=1401(M+H)+
保持時間：0.46分(分析條件SQD FA05)
2-2-2.利用以直鏈胜肽作為基質之native chemical ligation所為之環化反應及利用N-S轉移之不具反應輔助基之胺基之醯胺化之連續反應所為之分子內分支胜肽化合物SP606生成反應例(緩衝溶液中)
Figure 107130626-A0101-12-0796-971
分別加入0.5M HEPES緩衝液(pH7.0、10μl)、水(78μl)、1M氫氧化鈉水溶液(5μl)、0.5M TCEP鹽酸鹽水溶液(2μl)，製備為溶液。於該溶液中，於室溫下添加1-((6R,12S,15S,18R)-15-((1H-吲哚-3-基)甲基)-6-胺基-18-((第三丁基二硫烷基)甲基)-12-(4-(二甲胺基)丁基)-2,2-二甲基-7,10,13,16-四側氧基-3,4-二硫雜-8,11,14,17-四氮雜十九烷)吡咯烷-2-羧酸(S)-2-((S)-6-胺基-1-((S)-4-(苄硫基)-1-((S)-2-胺甲醯基吡咯烷-1-基)-1,4-二側氧基丁烷-2-基胺基)-1-側氧基己烷-2-基胺基)-2-側氧基乙基(化合物SP605、H-Cys(StBu)-Gly-Lys(Me2)-Trp-Cys(StBu)-Pro-HOGly-Lys-Asp( SBn)-Pro-NH2)(20mM，0.10μmol)及作為內部標準之4-戊基苯甲酸(20mM，0.10μmol)之DMA溶液(5μl)，將反應液於37℃靜置60分鐘。之後，於2-(4-巰基苯基)乙酸溶液(100mM 2-(4-巰基苯基)乙酸、250mM HEPES、100mM TCEP)(50μl)中，於室溫下添加反應液(50μl)(反應液加入後之混合溶液之pH 8.2)，將反應液於30℃靜置7小時，使用LCMS觀測反應之變化。確認於7小時生成(S)-1-((3S,6S,12R,16S,19S)-3-((1H-吲哚-3-基)甲基)-6-(4-(二甲胺基)丁基)-19-(2-羥基乙醯胺)-12-(巰基甲基)-2,5,8,11,14,18-六側氧基-1,4,7,10,13,17-六氮雜環三十三烷-16-羰基)吡咯烷-2-羧醯胺(化合物SP606)。化合物SP606與水解物(副產物)之生成比，以LCMS之UV面積比計，為19：81。(圖49、水解化合物 保持時間：0.30分)
LCMS(ESI)m/z=900(M+H)+
保持時間：0.36分(分析條件SQD FA05)
2-3.經轉譯之胜肽之分子內分支胜肽(直鏈部2)生成反應例
為了獲得使2-2合成之胜肽於緩衝液中(水中)以RNA為安定溫和之反應條件使分支之反應條件，以MALDI-MS確認轉譯合成後也同樣生成分子內分支胜肽。
2-3-1.利用轉錄所為之tRNA(CA欠缺)之合成
從2個模板DNA(序列編號DT-H1、序列編號DT-H2)，利用使用各RiboMAX Large Scale RNA production System T7(Promega公司，P1300)之體外轉錄合成3'端之CA欠缺之tRNAGluAAG(-CA)(序列編號RT-H1)、tRNAGluCUG(-CA)(序 列編號RT-H2)，並利用RNeasy Mini kit(Qiagen公司)精製。
序列編號DT-H1(與序列編號D-40相同)(序列編號：64)tRNAGluAAG(-CA)DNA序列：
Figure 107130626-A0101-12-0798-972
序列編號DT-H2(序列編號：88)tRNAGluCTG(-CA)DNA序列：
Figure 107130626-A0101-12-0798-973
序列編號RT-H1(序列編號：65)tRNAGluAAG(-CA)RNA序列：
Figure 107130626-A0101-12-0798-974
序列編號RT-H2(序列編號：89)tRNAGluCUG(-CA)RNA序列：
Figure 107130626-A0101-12-0798-975
2-3-2.利用側鏈羧酸經活性酯化之胺基醯基化pdCpA(化合物1i-IA)與tRNA(CA欠缺)(序列編號：RT-H1)之接合(ligation)所為之胺基醯基化tRNA(化合物AT-H1)之合成
於50μM轉錄tRNAGluAAG(-CA)(序列編號RT-H1) 10μL中，加入10X接合緩衝液(500mM HEPES-KOH pH 7.5,200mM MgCl2)2μL、10mM ATP 2μL、無核酸酶之水2.8μL，於95℃加熱2分鐘後，於室溫放置5分鐘，進行tRNA之重新折疊。加入20unit/μL之T4 RNA接合酶(New England Bio Lab.公司)1.2μL及5mM之胺基醯基化pdCpA(化合物1i-IA)之DMSO溶液2μL，於15℃進行45分鐘接合反應。於接合反應液20μL中，加入3M乙酸鈉4μL與125mM碘(水：THF=1：1溶液)24μL，於室溫進行1小時脫保護。胺基醯基化tRNA(化合物AT-H1)進行苯酚萃取後，利用乙醇沉澱回收。胺基醯基化tRNA(化合物AT-H1)於即將添加到轉譯混合物時溶於1mM乙酸鈉。
化合物AT-H1 Asp(SMe)-tRNAGluAAG(序列編號：66)
Figure 107130626-A0101-12-0799-976
2-3-3.將經以甘醇酸醯基化之pdCpA(化合物20)與tRNA(CA欠缺)(序列編號：RT-H2)利用ligation所為之胺基醯基化tRNA(化合物AT-H2)之合成
於50μM轉錄tRNAGluCTG(-CA)(序列編號RT-H2)10μL加入10X接合緩衝液(500mM HEPES-KOH pH 7.5,200mM MgCl2)2μL、10mM ATP 2μL、無核酸酶之水2.8μL，於95℃加熱2分鐘後，於室溫放置5分鐘，進行tRNA之重新折疊。加入20unit/μL之T4 RNA接合酶(New England Bio Lab.公司)1.2μL及5mM之經甘醇酸醯基化而得之pdCpA(化合物20)之DMSO溶液2μL，於15℃進行45分鐘接合反應。胺基醯基化tRNA(化合物AT-H2)進行苯酚萃取後，利用乙醇沉澱回收。胺基醯基化tRNA(化合物AT-H2)於即將添加到轉譯混合物時溶於1mM乙酸鈉。
化合物AT-H2(序列編號：90)HOGly-tRNAGluCUG
Figure 107130626-A0101-12-0800-977
2-3-4.具半胱胺醯基脯胺醯基酯序列及側鏈胺基之環狀胜肽(化合物P-H1)之轉譯合成
經前述經醯基化之tRNA(化合物AT-H1、化合物AT-H2)加到無細胞轉譯系並開始轉譯，進行含所望非天然胺基酸之多胜肽之轉譯合成。轉譯系使用原核生物來源之再構成無細胞蛋白質合成系PURE system。
具體而言，於轉譯液，1%(v/v)RNasein Ribonuclease inhibitor(Promega公司，N2111),1mM GTP，1mM ATP，20mM肌酸磷酸，50mM HEPES-KOH pH7.6，100mM乙酸鉀，6mM乙酸鎂，2mM亞精胺(spermidine)，1mM二硫蘇糖醇，1.5mg/ml E.coli MRE600(RNase陰性)來源tRNA(Roche公司)，4μg/ml肌酸激酶，3μg/ml肌激酶，2unit/ml無機焦磷解酶，1.1μg/ml核苷二磷酸激酶，0.6μM甲硫胺醯基tRNA轉甲醯基酶，0.26μM EF-G，0.24μM RF2，0.17μM RF3，0.5μM RRF，2.7μM IF1，0.4μM IF2,1.5μM IF3,40μM EF-Tu，93μM EF-Ts， 1.2μM核糖體，0.73μM AlaRS，0.03μM ArgRS，0.38μM AsnRS，0.13μM AspRS，0.02μM CysRS，0.06μM GlnRS，0.23μM GluRS，0.09μM GlyRS，0.4μM IleRS，0.04μM LeuRS，0.11μM LysRS，0.03μM MetRS，0.68μM PheRS，0.16μM ProRS，0.04μM SerRS，0.09μM ThrRS，0.03μM TrpRS，0.02μM TyrRS，0.02μM ValRS(實驗室製備之蛋白基本上係製備為附加His標籤之蛋白))中，將含1μM模板RNAOT86b(序列編號RM-H1)、0.25mM Cys，0.25mM Thr，0.25mM Trp，0.25mM Phe，0.25mM Arg，0.25mM Pro，0.25mM Lys，0.25mM Ser、20mM參(2-羧基乙基)膦(TCEP)、及50μM Asp(SMe)-tRNAGluAAG(化合物AT-H1)、50μM HOGly-tRNAGluCUG(化合物AT-H2)之前述轉譯液於37℃保溫60分鐘。將獲得之轉譯反應物以SPE C-TIP(Nikkyo Technos公司)精製，使用α-氰基-4-羥基桂皮酸作為基質以MALDI-MS分析。其結果，從開始甲硫胺酸正後之Cys開始轉譯，觀測到其α-胺基上之氮原子與天冬胺酸之側鏈羧酸予以醯胺環化而得之胜肽P-H1(圖50、峰部I)(圖50)。又，作為對照實驗，將從上述轉譯反應組成僅排除模板RNAOT86b(序列編號RM-H1)之轉譯溶液也於37℃進行60分鐘保溫。
序列編號RM-H1(序列編號：91)OT86b RNA序列
Figure 107130626-A0101-12-0801-978
胜肽序列P-H1 CysThrThrTrpPheArgTrpCysProHOGlyPheLysTrp[Asp(SMe)]ProArgSer之N末端胺基之氮原子與Asp之側鏈羧酸予以醯胺環化而得之化合物(HOGly指甘醇酸)
MALDI-MS：m/z：[H+M]+=2155.6(序列P-H1所對應之胜肽。Calc.2156.0)
2-3-5.使用轉譯胜肽P-H1之分子內分支胜肽(直鏈部2)生成反應
將含前述轉譯反應物P-H1之轉譯溶液5μL、與調整為pH8.5之5μL環化反應試藥溶液(0.3M HEPES-KOH、0.1M TCEP、0.1M p-巰基苯基乙酸)混合，於30℃保溫17小時。之後，將獲得之反應溶液以SPE C-TIP(Nikkyo Technos公司)精製，使用α-氰基-4-羥基桂皮酸作為基質，以MALDI-MS分析。作為對照實驗，對於不含前述模板RNAOT86b(序列編號RM-H1)之轉譯溶液也實施同樣操作，並將兩者比較，判別模板RNA依存性合成之轉譯產物來源之峰部並解析。其結果，含模板RNAOT86b(序列編號RM-H1)之轉譯反應液中，觀測到相當於具目的之分子內分支骨架之化合物H1之峰部，且確認生成使用轉譯胜肽之分子內分支胜肽(直鏈部2)(圖51、峰部I)。
化合物H1
Figure 107130626-A0101-12-0803-979
更詳細之結構(胺基酸之3字母表示記載全部變換為化學結構)如以下所示。
Figure 107130626-A0101-12-0803-980
MALDI-MS：m/z：[H+M]+=1955.4(化合物H1所對應之胜肽。Calc.1955.9)
化合物H2
Figure 107130626-A0101-12-0803-981
更詳細之結構(胺基酸之3字母表示記載全部變換 為化學結構)如以下所示。
Figure 107130626-A0101-12-0804-982
MALDI-MS：m/z：[H+M]+=1973.4(化合物H2所對應之胜肽。Calc.1973.9)
3.於第1次之環化進行具反應輔助基之位於N末端之三角單元與C末端側之活性硫酯(交叉單元)之醯胺環化反應，於第2次之分支化使從Cys-Pro-HOGly產生活性酯，並使與無保護之胺基反應而使分支之例之化學反應條件之改良及於經改良之條件下生成之具直鏈部2之分支胜肽所具硫醇基除去用的脫硫反應例
如上所示，將在從合成胜肽化合物SP605變換為化合物SP606設定之分支化反應條件應用於轉譯胜肽，結果於轉譯胜肽也確認到分支化反應之進行。以下之實驗中，係將從化合物SP605變換為化合物SP606之合成胜肽作為示範之反應最適化。實施水中之反應、及轉譯液中之反應，並將以轉譯胜肽所為之分支化反應之最適化，結果達成反應選擇性優異之反應條件之設定。
Figure 107130626-A0101-12-0805-983
3-1.緩衝溶液中之分子內分支胜肽生成反應有機溶劑之效果之比較實驗
作為變更點，顯示於第1次之環化反應使有機溶劑(DMA)含有率從5%增大為50%，於第2次之分支化反應從2.5%增大為50%之結果。
各添加0.5M HEPES緩衝液(pH7.0，10μl)、水(33μl)、1M氫氧化鈉水溶液(5μl)、DMA(45μl),0.5M TCEP鹽酸鹽水溶液(2μl)，製備為溶液。於該溶液中，於室溫下添加1-((6R,12S,15S,18R)-15-((1H-吲哚-3-基)甲基)-6-胺基-18-((第三丁基二硫烷基)甲基)-12-(4-(二甲胺基)丁基)-2,2-二甲基 -7,10,13,16-四側氧基-3,4-二硫雜-8,11,14,17-四氮雜十九烷)吡咯烷-2-羧酸(S)-2-((S)-6-胺基-1-((S)-4-(苄硫基)-1-((S)-2-胺甲醯基吡咯烷-1-基)-1,4-二側氧基丁烷-2-基胺基)-1-側氧基己烷-2-基胺基)-2-側氧基乙酯(化合物SP605、H-Cys(StBu)-Gly-Lys(Me2)-Trp-Cys(StBu)-Pro-HOGly-Lys-Asp(SBn)-Pro-NH2)(20mM，0.10μmol)及作為內部標準之4-戊基苯甲酸(20mM，0.10μmol)之DMA溶液(5μl)，將反應液於37℃靜置60分鐘。60分鐘後，於各添加125mM 2-(4-巰基苯基)乙酸之DMA溶液(40μl)、0.5M HEPES緩衝液(pH7.0，18μl)、水(6μl)、5M氫氧化鈉水溶液(6μl)、0.5M TCEP鹽酸鹽水溶液(10μl)之溶液中，於室溫下添加反應液(20μl)(反應液加入後之混合溶液之pH 8.2)，將反應液於30℃靜置24小時，使用LCMS觀測反應之變化。24小時後，確認生成(S)-1-((3S,6S,12R,16S,19S)-3-((1H-吲哚-3-基)甲基)-6-(4-(二甲胺基)丁基)-19-(2-羥基乙醯胺)-12-(巰基甲基)-2,5,8,11,14,18-六側氧基-1,4,7,10,13,17-六氮雜環三十三烷-16-羰基)吡咯烷-2-羧醯胺(化合物SP606)。化合物SP606與水解物(副產物)與反應中間體之生成比為，以LCMS之UV面積比計，為40：4：56。
從以上結果，可知：第1次之環化反應中，有機溶劑含有率之提高係為有利，水解受抑制，獲得目的化合物之選擇性提高。另一方面，第2次之分支化反應中，為了獲得目的化合物之化學反應速度下降，故繼續進行改良探討。
2-(4-巰基苯基)乙酸替換為使用硫苯酚之情形之 效果比較實驗
分別加入0.5M HEPES緩衝液(pH7.0，10μl)、水(33μl)、1M氫氧化鈉水溶液(5μl)、DMA(45μl),0.5M TCEP鹽酸鹽水溶液(2μl)，製備為溶液。於該溶液中，於室溫加入1-((6R,12S,15S,18R)-15-((1H-吲哚-3-基)甲基)-6-胺基-18-((第三丁基二硫烷基)甲基)-12-(4-(二甲胺基)丁基)-2,2-二甲基-7,10,13,16-四側氧基-3,4-二硫雜-8,11,14,17-四氮雜十九烷)吡咯烷-2-羧酸(S)-2-((S)-6-胺基-1-((S)-4-(苄硫基)-1-((S)-2-胺甲醯基吡咯烷-1-基)-1,4-二側氧基丁烷-2-基胺基)-1-側氧基己烷-2-基胺基)-2-側氧基乙基(化合物SP605、H-Cys(StBu)-Gly-Lys(Me2)-Trp-Cys(StBu)-Pro-HOGly-Lys-Asp(SBn)-Pro-NH2)(20mM，0.10μmol)及作為內部標準之4-丁基苯甲酸(20mM，0.10μmol)之DMA溶液(5μl)，將反應液於37℃靜置30分鐘。之後，各添加硫苯酚(0.52μl，5μmol)
Figure 107130626-A0101-12-0807-943
DMA(40μl)，2M Bicine(N,N-雙-(2-羥基乙基)甘胺酸)緩衝液(pH8.7，18μl)、0.5M TCEP鹽酸鹽水溶液(10μl)，以1M氫氧化鈉水溶液(12μl)製備溶液後，於室溫下添加反應液(20μl)(反應液加入後之混合溶液之pH 8.1)，將反應液於30℃靜置24小時，使用LCMS觀測反應之變化。於24小時確認(S)-1-((3S,6S,12R,16S,19S)-3-((1H-吲哚-3-基)甲基)-6-(4-(二甲胺基)丁基)-19-(2-羥基乙醯胺)-12-(巰基甲基)-2,5,8,11,14,18-六側氧基-1,4,7,10,13,17-六氮雜環三十三烷-16-羰基)吡咯烷-2-羧醯胺(化合物SP606)生成。化合物SP606與水解物(副產物)之生成比為，以LCMS之UV面積比 計，為84：16。
分支化反應良好進行之反應條件之實施例
探討之結果，發現以下所示反應條件比起上述條件，(2-2-2)更優異。作為變更點，於第1次之環化反應中，有機溶劑含有率增大(50%)，於第2次之分支化反應也是有機溶劑含有率增大(50%)，且同時將添加劑之硫醇改為(4-(三氟甲基)苯硫醇)且添加劑濃度增大(500mM)。再者，緩衝溶液從HEPES 150mM變更為Bicine(N,N-雙-(2-羥基乙基)甘胺酸)360mM。各添加0.5M HEPES緩衝液(pH7.0，10μl)、水(33μl)、1M氫氧化鈉水溶液(5μl)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)(45μl),0.5M TCEP鹽酸鹽水溶液(2μl)，製備溶液。於該溶液中，於室溫下添加1-((6R,12S,15S,18R)-15-((1H-吲哚-3-基)甲基)-6-胺基-18-((第三丁基二硫烷基)甲基)-12-(4-(二甲胺基)丁基)-2,2-二甲基-7,10,13,16-四側氧基-3,4-二硫雜-8,11,14,17-四氮雜十九烷)吡咯烷-2-羧酸(S)-2-((S)-6-胺基-1-((S)-4-(苄硫基)-1-((S)-2-胺甲醯基吡咯烷-1-基)-1,4-二側氧基丁烷-2-基胺基)-1-側氧基己烷-2-基胺基)-2-側氧基乙酯(化合物SP605、H-Cys(StBu)-Gly-Lys(Me2)-Trp-Cys(StBu)-Pro-HOGly-Lys-Asp(SBn)-Pro-NH2)(20mM，0.10μmol)及作為內部標準之4-丁基苯甲酸(20mM，0.10μmol)之NMP溶液(5μl)，將反應液於37℃靜置30分鐘。之後，各添加4-(三氟甲基)苯硫醇(6.8μl，50μmol)
Figure 107130626-A0101-12-0808-942
NMP(40μl)，2M Bicine(N,N-雙-(2-羥基乙基)甘胺酸)緩衝液(pH8.7，18μl)、0.5M TCEP鹽酸鹽水溶液(10μl)，以5M氫氧化鈉水溶液(12μl)製備溶液，於室溫下添 加反應液(20μl)(反應液加入後之混合溶液之pH 8.2)，將反應液於30℃靜置24小時，使用LCMS觀測反應之變化。確認於24小時生成(S)-1-((3S,6S,12R,16S,19S)-3-((1H-吲哚-3-基)甲基)-6-(4-(二甲胺基)丁基)-19-(2-羥基乙醯胺)-12-(巰基甲基)-2,5,8,11,14,18-六側氧基-1,4,7,10,13,17-六氮雜環三十三烷-16-羰基)吡咯烷-2-羧醯胺(化合物SP606)。化合物SP606與水解物(副產物)之生成比為，以LCMS之UV面積比計，為98：2。(圖52、水解化合物 保持時間：0.31分)
3-2.適用於經改良之緩衝液中之化學反應條件，於PURE system(轉譯合成液)中實施從化合物SP605變換為SP606之反應之分子內分支胜肽生成反應
將轉譯用緩衝液(6.25μl)、水(1.25μl)、PURESYSTEM(r)classic II Sol.B(BIOCOMBER公司、產品編號PURE2048C)(10μl)、20種天然型胺基酸溶液(各5mM，2.5μl)混合，各加入二甲基乙醯胺(DMA)(22.5μl),TCEP水溶液(100mM、5μl)，製備成溶液。轉譯用緩衝液之成分係8mM GTP，8mM ATP，160mM肌酸磷酸，400mM HEPES-KOH pH7.6，800mM乙酸鉀，48mM乙酸鎂，16mM亞精胺(spermidine)，8mM二硫蘇糖醇，0.8mM 10-HCO-H4folate,12mg/ml E.coli MRE600(RNase陰性)來源tRNA(Roche公司)。於該溶液中，於室溫下添加1-((6R,12S,15S,18R)-15-((1H-吲哚-3-基)甲基)-6-胺基-18-((第三丁基二硫烷基)甲基)-12-(4-(二甲胺基)丁基)-2,2-二甲基-7,10,13,16-四側氧基-3,4-二硫雜-8,11,14,17-四氮雜十九烷)吡咯烷-2-羧酸 (S)-2-((S)-6-胺基-1-((S)-4-(苄硫基)-1-((S)-2-胺甲醯基吡咯烷-1-基)-1,4-二側氧基丁烷-2-基胺基)-1-側氧基己烷-2-基胺基)-2-側氧基乙酯(化合物SP605、H-Cys(StBu)-Gly-Lys(Me2)-Trp-Cys(StBu)-Pro-HOGly-Lys-Asp(SBn)-Pro-NH2)(20mM，0.05μmol)及作為內部標準之4-丁基苯甲酸(20mM，0.05μmol)之DMA溶液(2.5μl)，將反應液於37℃靜置30分鐘。各添加4-(三氟甲基)苯硫醇(6.8μl，50μmol)
Figure 107130626-A0101-12-0810-941
DMA(40μl)、2M Bicine(N,N-雙-(2-羥基乙基)甘胺酸)緩衝液(pH8.7，18μl)、0.5M TCEP鹽酸鹽水溶液(10μl)，以5M氫氧化鈉水溶液(12μl)製備溶液後，於室溫添加反應液(20μl)(反應液加入後之混合溶液之pH 8.2)，將反應液於30℃靜置24小時，使用LCMS觀測反應之變化。於24小時確認生成(S)-1-((3S,6S,12R,16S,19S)-3-((1H-吲哚-3-基)甲基)-6-(4-(二甲胺基)丁基)-19-(2-羥基乙醯胺)-12-(巰基甲基)-2,5,8,11,14,18-六側氧基-1,4,7,10,13,17-六氮雜環三十三烷-16-羰基)吡咯烷-2-羧醯胺(化合物SP606)。化合物SP606與水解物(副產物)之生成比為，LCMS之UV面積比計，為91：9。(圖53、水解化合物 保持時間：0.30分)
3-3.PURE SYSTEM之轉譯溶劑採用RNeasy(r)MinEluteTM Cleanup Kit(QIAGEN公司)所精製而得之溶出液中之分支胜肽生成反應(化合物SP605變換為化合物SP606)
以轉譯胜肽實施展示庫時，可於轉譯液直接追加試藥實施轉譯後修飾，另一方面，也可先將胜肽-RNA複合體精製後，實施一部分或全部轉譯後修飾。如此之精製過程之1種，可列 舉使用RNeasy(r)MinEluteTM Cleanup Kit(QIAGEN公司)之精製。實施如此之精製後之轉譯後修飾，例如實施以下之實驗。
將PURE SYSTEM之轉譯溶劑係採用RNeasy(r)MinEluteTM Cleanup Kit(QIAGEN公司)精製而得之溶出液(35μl)與二甲基乙醯胺(DMA)(45μl)、100mM參(2-羧基乙基)膦(TCEP)鹽酸鹽溶液(10μl、1.0μmol)混合，於室溫添加1-((6R，12S，15S，18R)-15-((1H-吲哚-3-基)甲基)-6-胺基-18-((第三丁基二硫烷基)甲基)-12-(4-(二甲胺基)丁基)-2,2-二甲基-7,10,13,16-四側氧基-3,4-二硫雜-8,11,14,17-四氮雜十九烷)吡咯烷-2-羧酸(S)-2-((S)-6-胺基-1-((S)-4-(苄硫基)-1-((S)-2-胺甲醯基吡咯烷-1-基)-1,4-二側氧基丁烷-2-基胺基)-1-側氧基己烷-2-基胺基)-2-側氧基乙酯(H-Cys(StBu)-Gly-Lys(Me2)-Trp-Cys(StBu)-Pro-HOGly-Lys-Asp(SBn)-Pro-NH2)(化合物SP605)(20mM、0.10μmol)及作為內部標準之4-丁基苯甲酸(20mM、0.10μmol)之DMA溶液(5.0μl)。加入2M HEPES緩衝液(5μl、pH=7.5)與1N氫氧化鈉水溶液(1.5μl)，於pH=7.5在熱循環器中於37℃靜置30分鐘。
於4-(三氟甲基)苯硫醇(6.8μl，50μmol)以二甲基乙醯胺(DMA)(40μl)、2M Bicine(N,N-雙-(2-羥基乙基)甘胺酸)緩衝液(pH8.7、16μl)、0.5M參(2-羧基乙基)膦(TCEP)鹽酸鹽水溶液(10μl)、5N氫氧化鈉水溶液(14μl)製備之溶液中，於室溫加入獲得之反應液(20μl)，於pH 8.2在熱循環器中於 37℃靜置20小時，使用LCMS觀測反應之變化。20小時後，確認生成(S)-1-((3S，6S，12R，16S，19S)-3-((1H-吲哚-3-基)甲基)-6-(4-(二甲胺基)丁基)-19-(2-羥基乙醯胺)-12-(巰基甲基)-2,5,8,11,14,18-六側氧基-1,4,7,10,13,17-六氮雜環三十三烷-16-羰基)吡咯烷-2-羧醯胺(化合物SP606)。目的化合物與水解物(LCMS保持時間0.29分)之生成比為，LCMS之UV面積比計，為95：5。(圖54)
LCMS(ESI)m/z=900(M+H)+
保持時間：0.36分(分析條件SQDFA05)
以下列方式製備PURE SYSTEM之轉譯溶劑採用RNeasy(r)MinEluteTM Cleanup Kit(QIAGEN公司)精製而得之溶出液。將已於實施例記載之轉譯用緩衝液(12.5μl)、PURESYSTEM(r)classic II Sol.B(BIOCOMBER公司、產品編號PURE2048C)(20μl)、20種天然胺基酸溶液(各5mM，5.0μl)、水(62.5μl)混合，製備轉譯液。於轉譯液(20μl)加入Buffer RLT(70μl)、EtOH(135μl)，進行移液，施用到RNeasy MinElute Spin Column。於10000rpm離心15秒，去除濾液。添加RNeasy MinElute Spin Column
Figure 107130626-A0101-12-0812-940
Buffer RPE(500μl)，於10000rpm離心15秒，去除濾液。於RNeasy MinElute Spin Column加入80%EtOH水溶液(500μl)，於10000rpm離心2分鐘，去除濾液。打開RNeasy MinElute Spin Column之蓋，於15000rpm離心5分鐘，使管柱乾燥後，加水(22μl)，使用溶出之液體。又，此際使用之水係使用無RNase之水。
100mM參(2-羧基乙基)膦(TCEP)鹽酸鹽溶液之製備法如下。於500mM參(2-羧基乙基)膦(TCEP)鹽酸鹽水溶液(20μl、10μmol)加入2N氫氧化鈉水溶液(18μl)、水(62μl)並製備。
以上，於水中(緩衝液中)及PureSystem(反應轉譯液中)同樣地，確認兩者之差距不大，目的之反應進行。該等反應條件係RNA十分安定之範圍，且由此可知，反應轉譯後從直鏈胜肽化合物有效率地進行分支反應、且於胜肽-RNA複合體仍能不使RNA分解而有效率地使分支反應進行。
由該等結果了解以下情事。
三角單元配置具有反應輔助基之胺基之情形，可獲得第1次之環化反應係高選擇地進行，且與用於第2次之分支化之Cys-Pro-HOGly之活化可獲選擇性。尤其，若與水能互混之有機溶劑含有率高，反應選擇性優異。第2次之分支化中，於作為添加劑之硫醇存在下(較佳為芳基硫醇)中，宜存在與水互混之有機溶劑較佳，反應溶液之pH為7.0至9.0之間較佳，反應溫度為0℃至100℃(更佳為15℃至50℃)較佳。從至今為止所示之結果，可知本條件不僅於緩衝液(水中)，在轉譯液中(PureSystem)也提供同樣結果。
3-4.從具直鏈部2之分子內分支胜肽之脫硫反應(S)-1-((3S,6S,12S,16S,19S)-3-((1H-吲哚-3-基)甲基)-6-(4-(二甲胺基)丁基)-19-(2-羥基乙醯胺)-12-甲基-2,5,8,11,14,18-六側氧基-1,4,7,10,13,17-六氮雜環三十三烷-16-羰基)吡咯烷-2-羧醯胺(化合物SP607)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0814-984
PURE system中之從分子內分支胜肽之脫硫反應
在從上述3-2.記載之轉譯胜肽示範化合物(化合物SP605)進行分子內分支胜肽生成反應所用之反應溶液(10μl)中，加入0.5M參(2-羧基乙基)膦(TCEP)鹽酸鹽水溶液(10μl)。混合溶液以己烷(200μl)洗滌後(己烷所為之洗滌實施7次)，於獲得之水層中於室溫加入500mM麩胱甘肽水溶液(4μl)、1M 2、2-偶氮雙[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二鹽酸鹽(VA-044)水溶液(2μl)、5M氫氧化鈉水溶液(2μl)，於40℃靜置3小時。以LCMS追蹤反應的變化，3小時後原料化合物SP606完全消耗，確認變換為目的物(S)-1-((3S,6S,12S,16S,19S)-3-((1H-吲哚-3-基)甲基)-6-(4-(二甲胺基)丁基)-19-(2-羥基乙醯胺)-12-甲基-2,5,8,11,14,18-六側氧基-1,4,7,10,13,17-六氮雜環三十三烷-16-羰基)吡咯烷-2-羧醯胺(化合物SP607)。(圖55、56)
LCMS(ESI)m/z=868(M+H)+
保持時間：0.35分(分析條件SQD FA05)
從於PURE SYSTEM之轉譯溶劑採用RNeasy(r)MinEluteTM Cleanup Kit(QIAGEN公司)精製而得之溶出液中進行反應而生成之分支胜肽之脫硫反應
於上述3-3.PURE SYSTEM之轉譯溶劑採用RNeasy(r)MinEluteTM Cleanup Kit(QIAGEN公司)並精製之溶出液中之分支胜肽生成反應(從化合物SP605變換為化合物SP606)所使用之反應溶液(50μl)中，加入0.5M參(2-羧基乙基)膦(TCEP)鹽酸鹽水溶液(50μl)。將混合溶液以己烷(1.0ml)洗滌後(以己烷洗滌7次)，於獲得之水層中，於室溫加入500mM麩胱甘肽水溶液(20μl)、1M 2、2-偶氮雙[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二鹽酸鹽(VA-044)水溶液(10μl)、5N氫氧化鈉水溶液(8μl)，於45℃靜置30分鐘。以LCMS追蹤反應的變化，1小時後確認目的物(S)-1-((3S,6S,12S,16S,19S)-3-((1H-吲哚-3-基)甲基)-6-(4-(二甲胺基)丁基)-19-(2-羥基乙醯胺)-12-甲基-2,5,8,11,14,18-六側氧基-1,4,7,10,13,17-六氮雜環三十三烷-16-羰基)吡咯烷-2-羧醯胺(化合物SP607)生成。(圖57、58)
LCMS(ESI)m/z=868(M+H)+
保持時間：0.35分(分析條件SQD FA05)
4.於第1次之環化使用具反應輔助基之N末端與C末端側之活性硫酯之醯胺化反應，於第2次之分支化使從酯直接產生活性酯，且依與使保護胺基脫保護之具反應輔助基之胺之反應而使分支之例之實施。
與在3記載為同樣之想法，確認了有效性。
4-1.轉譯胜肽示範化合物(化合物SP616)之合成
依以下流程，為了實施第1次之環化在N末端使用Cys、C末端側使用Asp(SBn)而進行醯胺化環化反應，於第2次之分支化係將活性酯以甘醇酸之酯之活化實施，將於Lys之側鏈胺基配置保護N原子與S原子之Cys的化合物之S原子與N原子予以脫保護並進行醯胺化反應之例，合成以下示範化合物SP616。
Figure 107130626-A0101-12-0816-2268
Figure 107130626-A0101-12-0817-986
(R)-3-(((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)噻唑烷-4-羧酸(Acbz-Thz-OH)(化合物SP610)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0817-2269
於氮氣氛圍下，於(R)-噻唑烷-4-羧酸(H-Thz-OH)(化合物SP609)(1.48g、11.1mmol)與三乙胺(Et3N)(4.66ml、33.4mmol)之二甲基甲醯胺(DMF)溶液(11.0ml)中，於0度加入以文獻已知法(Biocon j ugate Chem.2008，19，714)製備之碳酸(4-硝基苯基)4-疊氮化苄酯(3.50g、11.1mmol)，於室溫攪拌19小時。於反應液中加入甲酸(2.1ml)，以逆相矽膠層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)精製，獲 得(R)-3-(((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)噻唑烷-4-羧酸(Acbz-Thz-OH)(化合物SP610)(3.17g、92%)。
LCMS(ESI)m/z=307(M-H)-
保持時間：0.68分(分析條件SQDFA05)
(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-6-((R)-3-(((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)噻唑烷-4-羧醯胺)己酸(Fmoc-Lys(Acbz-Thz)-OH)(化合物SP611)之合成
又，本說明書中，與其他例同樣將Fmoc-Lys-OH之側鏈胺基與Acbz-Thz-OH之羧基係以醯胺鍵結之化合物，定義為Fmoc-Lys(Acbz-Thz)-OH。
Figure 107130626-A0101-12-0818-988
於氮氣氛圍下，於(R)-3-(((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)噻唑烷-4-羧酸(Acbz-Thz-OH)(化合物SP610)(3.17g、10.3mmol)之二甲基甲醯胺(DMF)溶液(17.0ml)，於室溫加入4-(4,6-二甲氧基[1.3.5]三
Figure 107130626-A0101-12-0818-929
-2-基)-4-甲基氯化嗎啉(DMT-MM)(2.85g、10.3mmol)，於同溫度攪拌1小時30分鐘。於反應液，於室溫加入(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-6-胺基己酸(Fmoc-Lys-OH)鹽酸鹽(4.16g、10.3mmol)與二異丙基乙胺(DIPEA)(2.69ml、15.4mmol)之二甲基甲醯胺(DMF) 溶液(17ml)，於同溫度攪拌4小時。於反應液加入甲酸(1.9ml)，以逆相矽膠層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)精製，獲得(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-6-((R)-3-(((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)噻唑烷-4-羧醯胺)己酸(Fmoc-Lys(Acbz-Thz)-OH)(化合物SP611)(3.48g、51%)。
LCMS(ESI)m/z=659(M+H)+
保持時間：0.87分(分析條件SQDFA05)
(S)-2-((2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(1H-吲哚-3-基)丙醯基)氧基)乙酸(Fmoc-Trp-HOGly-OH)(化合物SP612)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0819-989
於氮氣氛圍下，於(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(1-(第三丁氧羰基)-1H-吲哚-3-基)丙酸(Fmoc-Trp(Boc)-OH)(化合物SP613)(5.0g、9.50mmol)與二異丙基乙胺(DIPEA)(4.98ml、28.5mmol)之二氯甲烷(DCM)溶液(9.5ml)中，於室溫加入2-溴乙酸 第三丁酯(2.09ml、14.2mmol)，於同溫度攪拌48小時。於反應液中加入氯化銨水溶液，以二氯甲烷(DCM)萃取2次，將有機層以飽和食鹽水洗滌2次。使有機層以硫酸鈉乾燥後過濾，進行減壓濃縮。將獲得之殘渣以順相矽膠層析(己烷/乙酸乙酯)精製，獲得3-(2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(2-(第三丁氧基)-2- 側氧基乙氧基)-3-側氧基丙基)-1H-吲哚-1-羧酸(S)-第三丁酯(Fmoc-Trp(Boc)-HOGly-OtBu)(化合物SP614)混合物(5.25g)。
於獲得之混合物(5.25g)之二氯甲烷(DCM)溶液(8.19ml)中，於室溫加入三異丙基矽烷(TIPS)(4.20ml、20.5mmol)與三氟乙酸(TFA)(8.21ml、107mmol)，將反應液於同溫度攪拌5小時30分鐘。將反應液減壓濃縮並將獲得之殘渣以逆相矽膠層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)精製，獲得(S)-2-((2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(1H-吲哚-3-基)丙醯基)氧基)乙酸(Fmoc-Trp-HOGly-OH)(化合物SP612)(3.40g、2階段產率74%)。
LCMS(ESI)m/z=485(M+H)+
保持時間：0.83分(分析條件SQDFA05)
(S)-3-((S)-2-((S)-1-((6R，9S，12S)-12-((1H-吲哚-3-基)甲基)-6-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-9-(4-(二甲胺基)丁基)-2,2-二甲基-7,10,13-三側氧基-14-氧雜-3,4-二硫雜-8,11-二氮雜十六烷-16-醯基)吡咯烷-2-羧醯胺)-6-((R)-3-(((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)噻唑烷-4-羧醯胺)己烷醯胺)-4-((S)-2-胺甲醯基吡咯烷-1-基)-4-側氧基丁酸(Acbz-Cys(StBu)-Lys(Me2)-Trp-HOGly-Pro-Lys(Acbz-Thz)-Asp-Pro-NH2)(化合物SP615)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0821-990
依已於實施例記載之利用自動合成機所為之主鏈含酯基之胜肽之固相合成一般法(2-1)，進行胜肽鏈之伸長。樹脂使用Sieber Amide Resin(1根管柱160mg、採用8根管柱，從Novabiochem購買)。N末端之胺基酸係使用(R)-2-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(Acbz-Cys(StBu)-OH)(化合物tk20)，Fmoc胺基酸係使用Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Asp(OPis)-OH、(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-6-((R)-3-(((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)噻唑烷-4-羧醯胺)己酸(Fmoc-Lys(Acbz-Thz)-OH)(化合物SP611)、(S)-2-((2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(1H-吲哚-3-基)丙醯基)氧基)乙酸(Fmoc-Trp-HOGly-OH)(化合物SP612)、Fmoc-Lys(Me2)-OH‧HCl。
胜肽之伸長後，將樹脂以二甲基甲醯胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)洗滌。於樹脂加入2%三氟乙酸(TFA)之二氯甲烷(DCM)/2,2，2-三氟乙醇(TFE)(=1/1、v/v、4.0ml)溶液，於室溫反應3小時，進行從樹脂切出胜肽。反應結束後，將管內溶液以合成用管柱過濾以將樹脂除去，將樹脂以二氯甲烷(DCM)/2,2,2-三氟乙醇(TFE)(=1/1，v/v、4.0mL)洗滌4次。 將獲得之溶液減壓濃縮，並將殘渣以逆相矽膠層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)精製，獲得(S)-3-((S)-2-((S)-1-((6R，9S，12S)-12-((1H-吲哚-3-基)甲基)-6-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-9-(4-(二甲胺基)丁基)-2,2-二甲基-7,10,13-三側氧基-14-氧雜-3,4-二硫雜-8,11-二氮雜十六烷-16-醯基)吡咯烷-2-羧醯胺)-6-((R)-3-(((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)噻唑烷-4-羧醯胺)己烷醯胺)-4-((S)-2-胺甲醯基吡咯烷-1-基)-4-側氧基丁酸(Acbz-Cys(StBu)-Lys(Me2)-Trp-HOGly-Pro-Lys(Acbz-Thz)-Asp-Pro-NH2)(化合物SP615)(179mg、13%)。
LCMS(ESI)m/z=1511.4(M+H)+
保持時間：0.69分(分析條件SQDFA05)
4-(((S)-5-((S)-1-((6R，9S，12S)-12-((1H-吲哚-3-基)甲基)-6-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-9-(4-(二甲胺基)丁基)-2,2-二甲基-7,10,13-三側氧基-14-氧雜-3,4-二硫雜-8,11-二氮雜十六烷-16-醯基)吡咯烷-2-羧醯胺)-6-(((S)-4-(苄硫基)-1-((S)-2-胺甲醯基吡咯烷-1-基)-1,4-二側氧基丁烷-2-基)胺基)-6-側氧基己基)胺甲醯基)噻唑烷-3-羧酸(R)-4-疊氮化苄酯(Acbz-Cys(StBu)-Lys(Me2)-Trp-HOGly-Pro-Lys(Acbz-Thz)-Asp(SBn)-Pro-NH2)(化合物SP616)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0823-991
於氮氣氛圍下，於(S)-3-((S)-2-((S)-1-((6R，9S，12S)-12-((1H-吲哚-3-基)甲基)-6-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-9-(4-(二甲胺基)丁基)-2,2-二甲基-7,10,13-三側氧基-14-氧雜-3,4-二硫雜-8,11-二氮雜十六烷-16-醯基)吡咯烷-2-羧醯胺)-6-((R)-3-(((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)噻唑烷-4-羧醯胺)己烷醯胺)-4-((S)-2-胺甲醯基吡咯烷-1-基)-4-側氧基丁酸(Acbz-Cys(StBu)-Lys(Me2)-Trp-HOGly-Pro-Lys(Acbz-Thz)-Asp-Pro-NH2)(化合物SP615)(50mg、0.033mmol)之二甲基甲醯胺(DMF)溶液(331μl)中，於室溫加入1-羥基苯并三唑(HOBt)(13.4mg、0.099mmol)、1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二醯亞胺鹽酸鹽(EDCI‧HCl)(19.2mg、0.099mmol)、苄基硫醇(BnSH)(19.4μl、0.165mmol)，於同溫度攪拌1小時。於反應液中加入1N鹽酸水溶液(43μl)，以逆相矽膠層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)精製，獲得4-(((S)-5-((S)-1-((6R，9S，12S)-12-((1H-吲哚-3-基)甲基)-6-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-9-(4-(二甲胺基)丁基)-2,2-二甲基-7,10,13-三側氧基-14-氧雜-3,4-二硫雜-8,11-二氮雜十六烷-16-醯基)吡咯烷-2- 羧醯胺)-6-(((S)-4-(苄硫基)-1-((S)-2-胺甲醯基吡咯烷-1-基)-1,4-二側氧基丁烷-2-基)胺基)-6-側氧基己基)胺甲醯基)噻唑烷-3-羧酸(R)-4-疊氮化苄酯(Acbz-Cys(StBu)-Lys(Me2)-Trp-HOGly-Pro-Lys(Acbz-Thz)-Asp(SBn)-Pro-NH2)(化合物SP616)(45.7mg、85%)。
LCMS(ESI)m/z=1617.4(M+H)+
保持時間：0.74分(分析條件SQDFA05)
4-2.從轉譯胜肽示範化合物(化合物SP616)之水中或轉譯反應液中之分支(直鏈部2)胜肽生成反應
(S)-N-((3R，6S，9S，12R，16S，19S)-6-((1H-吲哚-3-基)甲基)-16-((S)-2-胺甲醯基吡咯烷-1-羰基)-9-(4-(二甲胺基)丁基)-3,12-雙(巰基甲基)-2,5,8,11,14,18-六側氧基-1,4,7,10,13,17-六氮雜環三十三烷-19-基)-1-(2-羥基乙醯基)吡咯烷-2-羧醯胺(HOGly-Pro-Lys(＊Cys-Lys(Me2)-Trp-Cys)-Asp＊-Pro-NH2、於2個＊部位環化)(化合物SP617)之合成
又，本說明書中，與其他例同樣，將Lys之側鏈胺基與H-Cys-Lys(Me2)-Trp-Cys-OH之C末端之羧基經醯胺鍵結的化合物，記載為H-Lys(H-Cys-Lys(Me2)-Trp-Cys)-OH。
Figure 107130626-A0101-12-0824-992
4-2-1.HEPES緩衝液中之分支胜肽生成反應
依以下流程反應。亦即，從化合物SP616在步驟1將2個胺基之保護基予以脫保護後(此時點構成反應之各單元係成為與轉譯胜肽同樣之結構。C末端不為羧酸而為羧酸醯胺，除此以外與轉譯胜肽相同)、直接實施第1次之環化反應，結果可選擇性地獲得目的化合物SP618。然後，於步驟2及步驟3實施從化合物618將分支化反應使用之胺側之單元之脫保護，獲得達成具反應輔助基之胺基之脫保護的化合物SP620。能於RNA安定之化學反應條件將胺之保護基予以脫保護。於使從酯官能基直接產生硫酯之方法，獲得分支化胜肽化合物SP617。
Figure 107130626-A0101-12-0825-2270
Figure 107130626-A0101-12-0826-994
step1(從化合物SP616變換為化合物SP618之反應)
於氮氣氛圍下、50mM HEPES緩衝液(70μl、pH=7.5)中，於室溫加入4mM 4-(((S)-5-((S)-1-((6R，9S，12S)-12-((1H-吲哚-3-基)甲基)-6-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-9-(4-(二甲胺基)丁基)-2,2-二甲基-7,10,13-三側氧基-14-氧雜-3,4-二硫雜-8,11-二氮雜十六烷-16-醯基)吡咯烷-2-羧醯胺)-6-(((S)-4-(苄硫基)-1-((S)-2-胺甲醯基吡咯烷-1-基)-1,4-二側氧基丁烷-2-基)胺基)-6-側氧基己基)胺甲醯基)噻唑烷-3-羧酸(R)-4-疊氮化苄酯(化合物SP616、Acbz-Cys(StBu)-Lys(Me2)-Trp-HOGly-Pro-Lys(Acbz-Thz)-Asp(SBn)-Pro-NH2)之二甲基乙醯胺(DMA)溶液(25μl、0.1μmol)、作為內部標準之20mM 2、4-二甲基苯甲酸之二甲基乙醯胺(DMA)溶液(5.0μl、0.1μmol)、另外製備之200mM參(2-羧基乙基)膦(TCEP)鹽酸鹽溶液(10μl、2.0μmol、pH=7.4)，於pH=7.4、同溫度靜置1小時30分鐘。以LCMS追蹤反應的變化，1小時30分後自的物SP618為主要產物，未觀測到副反應(目的化合物SP618(LCMS保持時間0.38分)與內部標準(LCMS保持時間0.64分)以LCMS之UV面積比計，為54：46)。(圖59)
200mM參(2-羧基乙基)膦(TCEP)鹽酸鹽溶液之製備法如下。使參(2-羧基乙基)膦(TCEP)鹽酸鹽(5.0mg、17μmol)以50mM HEPES緩衝液(57.0μl、pH=7.5)、2N氫氧化鈉水溶液(30μl)溶解，調整為pH=7.4。
LCMS(ESI)m/z=1053(M-H)-
保持時間：0.38分(分析條件SQDFA05)
步驟2(化合物SP618變換為化合物SP619)
於氮氣氛圍下、於步驟1製備之反應液(90μl)中，於室溫加入80mM 2,2'-二硫二吡啶(化合物SP622、2,2'-PySSPy)溶液(90μl)，於pH=3.0在熱循環器中於37度靜置12小時。以LCMS追蹤反應的變化，確認12小時後生成目的物。目的化合物(化合物SP619、LCMS保持時間0.43分)與水解體(副產物、LCMS保持時間0.41分)以LCMS之UV面積比計，為97：3。(圖60)
80mM 2,2'-二硫二吡啶(2,2'-PySSPy)溶液之製備法如下。於400mM 2,2'-二硫二吡啶(2,2'-PySSPy)之二甲基乙醯胺(DMA)溶液(20μl、8.0μmol)中加入二甲基乙醯胺(DMA)(10μl)、100mM鹽酸水溶液(70μl)。
LCMS(ESI)m/z=1261.3(M+H)+
保持時間：0.43分(分析條件SQDFA05)
步驟3(化合物SP619變換為化合物SP620)
於氮氣氛圍下，於步驟2製備之反應液(90μl)中，於室溫加入另外製備之600mM參(2-羧基乙基)膦(TCEP)鹽酸鹽溶液(10μl、6.0μmol、pH=7.2)，於pH=4.6於同溫度靜置1小 時。以LCMS追蹤反應的變化，確認1小時後生成目的物(化合物SP620)。
600mM參(2-羧基乙基)膦(TCEP)鹽酸鹽溶液之製備法如下。於參(2-羧基乙基)膦(TCEP)鹽酸鹽(13.8mg、48μmol)加入2N氫氧化鈉水溶液(80μl)，調整為pH=7.2。
LCMS(ESI)m/z=1041(M-H)-(圖61)
保持時間：0.36分(分析條件SQDFA05)
步驟4(化合物SP620變換為化合物SP617)
於氮氣氛圍下，於步驟3製備之反應液(30μl)中於室溫加入另外製備之5.0M 2-巰基乙烷磺酸鈉溶液(30μl、pH=8.5)，於pH=8.5於熱循環器中，於30度靜置15小時。以LCMS追蹤反應的變化，確認15小時後生成目的物(S)-N-((3R，6S，9S，12R，16S，19S)-6-((1H-吲哚-3-基)甲基)-16-((S)-2-胺甲醯基吡咯烷-1-羰基)-9-(4-(二甲胺基)丁基)-3,12-雙(巰基甲基)-2,5,8,11,14,18-六側氧基-1,4,7,10,13,17-六氮雜環三十三烷-19-基)-1-(2-羥基乙醯基)吡咯烷-2-羧醯胺(HOGly-Pro-Lys(＊Cys-Lys(Me2)-Trp-Cys)-Asp＊-Pro-NH2、於2個＊部位環化)(化合物SP617)。
5.0M 2-巰基乙烷磺酸鈉溶液之製備法如下。於2-巰基乙烷磺酸鈉(74.0mg、0.45mmol)中加入1N氫氧化鈉水溶液(45μl)、水(45μl)，調整為pH=8.5。
LCMS(ESI)m/z=1043(M+H)+
保持時間：0.40分(分析條件SQDFA05)
4-2-2.於轉譯條件溶液中之分支胜肽生成反應
模擬實際進行之轉譯條件，以下列條件實施反應。直到脫保護(化合物SP620)為止，於PURE SYSTEM之轉譯系實施反應。之後之分支胜肽生成反應中，於展示庫實驗也可以RNeasy(r)MinEluteTM Cleanup Kit(QIAGEN公司)實施精製。於該精製過程，可將RNA與胜肽之複合體精製，尤其可將蛋白質成分或低分子成分除去。本實驗中，假設於獲得化合物SP620之時點實施精製以將化合物SP620單離並實施分支化反應。所以，考慮使用之反應溶劑於展示庫之精製，使用採PURE SYSTEM之轉譯系溶劑以RNeasy(r)MinEluteTM Cleanup Kit(QIAGEN公司)精製而得之溶出液。又，化合物SP620之精製中，將胜肽存在之2個SH基變換為於分子內形成S-S鍵結之化合物SP623。所以，從化合物SP623再於展示庫模擬中再產生化合物SP620後實施分支化反應，獲得化合物SP617。
於PURE SYSTEM之轉譯系，依下列流程實施反應。
Figure 107130626-A0101-12-0830-995
步驟1(化合物SP616變換為化合物SP618)
於氮氣氛圍下，將轉譯用緩衝液(12.5μl)、PURESYSTEM(r)classic II Sol.B(BIOCOMBER公司、產品編號PURE2048C)(20μl)、20種天然胺基酸溶液(各5mM，5.0μl)、水(32.5μl)混合，加入二甲基乙醯胺(DMA)(26.25μl)，製備為溶液。於室溫加入4mM 4-(((S)-5-((S)-1-((6R，9S，12S)-12-((1H-吲哚-3-基)甲基)-6-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-9-(4-(二甲胺基)丁基)-2,2-二甲基-7,10,13-三側氧基-14-氧雜-3,4-二硫雜-8,11-二氮雜十六烷-16-醯基)吡咯烷-2-羧醯胺)-6-(((S)-4-(苄硫基)-1-((S)-2-胺甲醯基吡咯烷-1-基)-1,4-二側氧基丁烷-2-基)胺基)-6-側氧基己基)胺甲醯基)噻唑烷-3-羧酸(R)-4-疊氮化苄酯(Acbz-Cys(StBu)-Lys(Me2)-Trp-HOGly-Pro-Lys(Acbz-Thz)-Asp(SBn)-Pro-NH2)(化合物SP616)之二甲基乙醯胺(DMA)溶液(2.5μl、0.01μmol)、作為內部標準之8mM 2、4-二甲基苯甲 酸之二甲基乙醯胺(DMA)溶液(1.25μl、0.01μmol)、另外製備之100mM參(2-羧基乙基)膦(TCEP)鹽酸鹽溶液(10μl、1.0μmol、pH=7.6)，於pH=7.5於同溫度靜置1小時。以LCMS追蹤反應的變化，確認1小時後生成目的物(化合物SP618)。目的化合物(LCMS保持時間0.37分)與內部標準(LCMS保持時間0.64分)以LCMS之UV面積比計，為45：55，可知轉譯液中可獲得與緩衝液為同等反應之選擇性及速度。(圖63)
轉譯用緩衝液之成分如下。8mM GTP，8mM ATP，160mM肌酸磷酸，400mM HEPES-KOH pH7.6，800mM乙酸鉀，48mM乙酸鎂，16mM亞精胺(spermidine)，8mM二硫蘇糖醇，0.8mM 10-HCO-H4folate，12mg/ml E.coli MRE600(RNase陰性)來源tRNA(Roche公司)。
100mM參(2-羧基乙基)膦(TCEP)鹽酸鹽溶液之製備法如下。使參(2-羧基乙基)膦(TCEP)鹽酸鹽(5.0mg、17μmol)溶於50mM HEPES緩衝液(122μl、pH=7.5)、1N氫氧化鈉水溶液(52μl)，調菶為pH=7.6。
LCMS(ESI)m/z=1053(M-H)-
保持時間：0.37分(分析條件SQDFA05)
步驟2(化合物SP618變換為化合物SP619)
於氮氣氛圍下，於步驟1製備之反應液(80μl)中，於室溫加入80mM 2,2'-二硫二吡啶(化合物SP622、2,2'-PySSPy)溶液(80μl)，於室溫加入500mM氫氧化鈉水溶液(2.0μl)，於pH=4.0在熱循環器中於37度靜置13小時。以LCMS追蹤反應 的變化，確認13小時後生成目的物(化合物SP619)。目的化合物(LCMS保持時間0.44分)與水解體(LCMS保持時間0.40分)以LCMS之UV面積比計，為90：10。(圖64)
80mM 2,2'-二硫二吡啶(化合物SP622、2,2'-PySSPy)溶液之製備法如下。於400mM 2,2'-二硫二吡啶(化合物SP622、2,2'-PySSPy)之二甲基乙醯胺(DMA)溶液(20μl、8.0μmol)中，加入二甲基乙醯胺(DMA)(10μl)230mM之鹽酸水溶液(70μl)。
LCMS(ESI)m/z=1261.3(M+H)+
保持時間：0.44分(分析條件SQDFA05)
步驟3(化合物SP619變換為化合物SP620)
於氮氣氛圍下，於步驟2製備之反應液(81μl)中，於室溫加入另外製備之600mM參(2-羧基乙基)膦(TCEP)鹽酸鹽溶液(9.0μl、pH=7.2)，於pH=5.1於同溫度靜置1小時。以LCMS追蹤反應的變化，確認1小時後生成目的物(化合物SP620)。與HEPES緩衝液中之反應比較，未觀測到由於PURE SYSTEM之使用所得之新的副產物。(圖65)
600mM參(2-羧基乙基)膦(TCEP)鹽酸鹽溶液之製備法如下。於參(2-羧基乙基)膦(TCEP)鹽酸鹽(17.6mg、61μmol)加入2N氫氧化鈉水溶液(102μl)，調整為pH=7.2。
LCMS(ESI)m/z=1041(M-H)-保持時間：0.36分(分析條件SQDFA05)
依以下流程實施使用精製之結果新形成S-S鍵結之分支胜肽前驅體(化合物SP623)(製備法於下述(4-2-4)記載)(S)-1-((3S，10R，15R，18S，21S，29aS，33S)-21-((1H- 吲哚-3-基)甲基)-10-胺基-18-(4-(二甲胺基)丁基)-1,9,16,19,22,25,31,35-八側氧基二十六氫-15,3-(橋亞胺基(epimino)丙亞胺基甲橋)吡咯并[2,1-x][1,11,12,4,7,16,22,25]氧雜二[口塞]戊氮雜環二十七炔-33-羰基)吡咯烷-2-羧醯胺(＊Cys #-Lys(Me2)-Trp-HOGly-Pro-Lys(H-Cys #)-Asp＊-Pro-NH2、於2個＊部位、#部位環化，於#部位2個SH基形成二硫醚鍵)，於PURE SYSTEM之轉譯溶劑使用RNeasy(r)MinEluteTM Cleanup Kit(QIAGEN公司)精製而得之溶出液中，使化合物SP620再生成後分支胜肽(化合物SP617)生成反應。
Figure 107130626-A0101-12-0833-996
於氮氣氛圍下，於PURE SYSTEM之轉譯系溶劑使用RNeasy(r)MinEluteTM Cleanup Kit(QIAGEN公司)精製而得之溶出液(25μl)中混合500mM參(2-羧基乙基)膦(TCEP)鹽酸鹽溶液(5.0μl、2.5μmol)、2N氫氧化鈉(8μl)、2- 巰基乙烷磺酸鈉(24.8mg、0.15mmol)而得之溶液中，加入10mM(S)-1-((3S，10R，15R，18S，21S，29aS，33S)-21-((1H-吲哚-3-基)甲基)-10-胺基-18-(4-(二甲胺基)丁基)-1,9,16,19,22,25,31,35-八側氧基二十六氫-15,3-(橋亞胺基丙亞胺基甲橋)吡咯并[2,1-x][1,11,12,4,7,16,22,25]氧雜二[口塞]戊氮雜環二十七炔-33-羰基)吡咯烷-2-羧醯胺(＊Cys #-Lys(Me2)-Trp-HOGly-Pro-Lys(H-Cys #)-Asp＊-Pro-NH2、2個＊部位、#部位環化，#部位的2個SH基形成雙硫鍵)(化合物SP623)之二甲基四氫咪唑酮(DMI)溶液(12.5μl、0.125μmol)、作為內部標準使用之50mM 2、4-二甲基苯甲酸之二甲基四氫咪唑酮(DMI)溶液(2.5μl、0.125μmol)，於pH=8.4於熱循環器中，於30度靜置30小時。以LCMS追蹤反應的變化，於30小時後確認生成目的物(S)-N-((3R，6S，9S，12R，16S，19S)-6-((1H-吲哚-3-基)甲基)-16-((S)-2-胺甲醯基吡咯烷-1-羰基)-9-(4-(二甲胺基)丁基)-3,12-雙(巰基甲基)-2,5,8,11,14,18-六側氧基-1,4,7,10,13,17-六氮雜環三十三烷-19-基)-1-(2-羥基乙醯基)吡咯烷-2-羧醯胺(HOGly-Pro-Lys(＊Cys-Lys(Me2)-Trp-Cys)-Asp＊-Pro-NH2、於2個＊部位環化)(化合物SP617)。與HEPES緩衝液中之反應比較，未觀測到由於使用將PURE SYSTEM之轉譯溶劑精製而得之溶出液所獲之新的副產物。
PURE SYSTEM之轉譯溶劑使用RNeasy(r)MinEluteTM Cleanup Kit(QIAGEN公司)精製而得之溶出液以下列方式製備。製備將已於實施例記載之轉譯用緩衝液 (12.5μl)、PURE SYSTEM(r)classic II Sol.B(BIOCOMBER公司、產品編號PURE2048C)(20μl)、20種天然胺基酸溶液(各5mM，5.0μl)、水(62.5μl)混合成的轉譯液。於轉譯液(20μl)加入Buffer RLT(70μl)、EtOH(135μl)並移液，施用到RNeasy MinElute Spin Column。於10000rpm離心15秒，將濾液去除。於管柱添加Buffer RPE(500μl)，於10000rpm離心15秒，去除濾液。於管柱添加80%EtOH水溶液(500μl)，於10000rpm離心2分鐘，去除濾液。打開管柱之蓋，以15000rpm離心5分鐘，使乾燥後加水(22μl)並進行溶出。又，此時使用之水係使用無RNase之水。
LCMS(ESI)m/z=1043(M+H)+
保持時間：0.40分(分析條件SQDFA05)
以上，確認於水中及PureSystem(反應轉譯液中)同樣，兩者之差異不大，目的之反應會進行。該等反應條件係RNA十分安定之範圍，由此可知，反應轉譯後從直鏈胜肽化合物能有效率的進行分支反應、及於胜肽-RNA複合體仍能不使RNA分解而能有效率的使分支反應進行。
由該等也可知：於評估轉譯反應液中之反應進行時，在與此等為類似之反應的情形，只要評價水中(緩衝液中)之反應性即能評價。
4-2-3.於模擬轉譯條件之條件下從分支(直鏈部2)胜肽之脫硫反應
對於在4-2-2使用之將含化合物617之Pure SYSTEM之轉譯系溶劑使用RNeasy(註冊商標)MinElute(註冊商標)Cleanup Kit(QIAGEN公司)精製而得之溶出液中之分支胜肽精製反應所用之反應溶液，進行脫硫反應。
(S)-N-((3S，6S，9S，12S，16S，19S)-6-((1H-吲哚-3-基)甲基)-16-((S)-2-胺甲醯基吡咯烷-1-羰基)-9-(4-(二甲胺基)丁基)-3,12-二甲基-2,5,8,11,14,18-六側氧基-1,4,7,10,13,17-六氮雜環三十三烷-19-基)-1-(2-羥基乙醯基)吡咯烷-2-羧醯胺(化合物SP624、HOGly-Pro-Lys(＊Ala-Lys(Me2)-Trp-Ala)-Asp＊-Pro-NH2、於2個＊部位環化)之合成
又，本說明書中，與其他例同樣，將Lys之側鏈胺基與H-Ala-Lys(Me2)-Trp-Ala-OH之C末端之羧基經醯胺鍵結之化合物記載為H-Lys(H-Ala-Lys(Me2)-Trp-Ala)-OH。
Figure 107130626-A0101-12-0836-997
於氮氣氛圍下，在將4-2-2使用之含化合物SP617之PURE SYSTEM之轉譯系溶劑以RNeasy(註冊商標)MinElute(註冊商標)Cleanup Kit(QIAGEN公司)精製而得之溶出液中之分支胜肽生成反應所用之反應溶液(9.0μl)中，加入1.5M參(2-羧基乙基)膦(TCEP)鹽酸鹽溶液(20μl、pH=7.4)，於50℃攪拌5分鐘。於室溫加入250mM 2、2-偶氮雙[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二鹽酸鹽(VA-044)水溶液(1.2μl)，於50℃攪拌1小時。以LCMS追蹤反應的變化，確認 於1小時後生成目的物(S)-N-((3S，6S，9S，12S，16S，19S)-6-((1H-吲哚-3-基)甲基)-16-((S)-2-胺甲醯基吡咯烷-1-羰基)-9-(4-(二甲胺基)丁基)-3,12-二甲基-2,5,8,11,14,18-六側氧基-1,4,7,10,13,17-六氮雜環三十三烷-19-基)-1-(2-羥基乙醯基)吡咯烷-2-羧醯胺(化合物SP624、HOGly-Pro-Lys(＊Ala-Lys(Me2)-Trp-Ala)-Asp＊-Pro-NH2、於2個＊部位環化)。
1.5M參(2-羧基乙基)膦(TCEP)鹽酸鹽溶液之製備法如下。加入參(2-羧基乙基)膦(TCEP)鹽酸鹽(24.5mg、85.5μmol)5N氫氧化鈉水溶液(57μl)，調整為pH=7.4。
LCMS(ESI)m/z=979(M+H)+
保持時間：0.36分(分析條件SQDFA05)
4-2-4.實施第1次之環化且實施之後胺基部位之脫保護後之精製步驟
依下述流程進行反應。
Figure 107130626-A0101-12-0838-998
(S)-1-((3S，6S，10R，13S，16S，24aS)-16-((1H-吲哚-3-基)甲基)-3-(4-((R)-2-胺基-3-(吡啶-2-基二硫烷基)丙醯胺)丁基)-13-(4-(二甲胺基)丁基)-1,4,8,11,14,17,20-七側氧基-10-((吡啶-2-基二硫烷基)甲基)二十二氫-1H-吡咯并[1,2-d][1,4,7,10,14,17,20]氧雜六氮雜環二十二炔-6-羰基)吡咯烷-2-羧醯胺(＊Cys(SPy)-Lys(Me2)-Trp-HOGly-Pro-Lys(H-Cys(SPy))-Asp＊-Pro-NH2、於2個＊部位環化)(化合物SP619)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0839-999
於氮氣氛圍下，在於200mM磷酸緩衝液(691μl、pH=7.6)混有二甲基乙醯胺(DMA)(797μl)之溶液中，於室溫加入4-(((S)-5-((S)-1-((6R，9S，12S)-12-((1H-吲哚-3-基)甲基)-6-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-9-(4-(二甲胺基)丁基)-2,2-二甲基-7,10,13-三側氧基-14-氧雜-3,4-二硫雜-8,11-二氮雜十六烷-16-醯基)吡咯烷-2-羧醯胺)-6-(((S)-4-(苄硫基)-1-((S)-2-胺甲醯基吡咯烷-1-基)-1,4-二側氧基丁烷-2-基)胺基)-6-側氧基己基)胺甲醯基)噻唑烷-3-羧酸(R)-4-疊氮化苄酯(Acbz-Cys(StBu)-Lys(Me2)-Trp-HOGly-Pro-Lys(Acbz-Thz)-Asp(SBn)-Pro-NH2)(化合物SP616)(8.0mgl、4.94μmol)。於室溫加入另外製備之1M參(2-羧基乙基)膦(TCEP)鹽酸鹽溶液(100μl、100μmol、pH=7.4)，調整反應液為pH=7.4，於同溫度靜置2小時。以LCMS追蹤反應的變化，確認2小時後環化反應進行且生成化合物SP618。
1M參(2-羧基乙基)膦(TCEP)鹽酸鹽溶液之製備法如下。使參(2-羧基乙基)膦(TCEP)鹽酸鹽(39mg、0.136mmol)溶於5N氫氧化鈉水溶液(91μl)、水(45μl)，調整為pH=7.4。
於氮氣氛圍下，於獲得之含有化合物SP618之反應液(1.5ml)中於室溫加入330mM 2,2'-二硫二吡啶(化合物SP622、2,2'-PySSPy)溶液(1.5ml)，於pH=2.1於37度靜置靜置13小時。將獲得之反應液以逆相矽膠層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)精製，獲得(S)-1-((3S，6S，10R，13S，16S，24aS)-16-((1H-吲哚-3-基)甲基)-3-(4-((R)-2-胺基-3-(吡啶-2-基二硫烷基)丙醯胺)丁基)-13-(4-(二甲胺基)丁基)-1,4,8,11,14,17,20-七側氧基-10-((吡啶-2-基二硫烷基)甲基)二十二氫-1H-吡咯并[1,2-d][1,4,7,10,14,17,20]氧雜六氮雜環二十二炔-6-羰基)吡咯烷-2-羧醯胺(＊Cys(SPy)-Lys(Me2)-Trp-HOGly-Pro-Lys(H-Cys(SPy))-Asp＊-Pro-NH2、於2個＊部位環化)(化合物SP619)(3.7mg、60%)。
330mM 2,2'-二硫二吡啶(化合物SP622、2,2'-PySSPy)溶液之製備法如下。於400mM 2,2-二硫吡啶(化合物SP622、2,2'-PySSPy)之二甲基乙醯胺(DMA)溶液(1.5ml、0.6mmol)中加入2N鹽酸水溶液(238μl)、水(80μl)。
LCMS(ESI)m/z=1261.4(M+H)+
保持時間：0.43分(分析條件SQDFA05)
分支胜肽前驅體、(S)-1-((3S，10R，15R，18S，21S，29aS，33S)-21-((1H-吲哚-3-基)甲基)-10-胺基-18-(4-(二甲胺基)丁基)-1,9,16,19,22,25,31,35-八側氧基二十六氫-15,3-(橋亞胺基丙亞胺基甲橋)吡咯并[2,1-x][1,11,12,4,7,16,22,25]氧雜二噻戊氮雜環二十七炔-33-羰基)吡咯烷-2-羧醯胺(＊Cys # -Lys(Me2)-Trp-HOGly-Pro-Lys(H-Cys #)-Asp＊-Pro-NH2、於2個＊部位、#部位環化，於#部位2個SH基形成雙硫鍵)(化合物SP623)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0841-1000
於氮氣氛圍下，於200mM磷酸緩衝液(720μl、pH=7.6)與二甲基乙醯胺(DMA)(720μl)之溶液中，於室溫加入(S)-1-((3S，6S，10R，13S，16S，24aS)-16-((1H-吲哚-3-基)甲基)-3-(4-((R)-2-胺基-3-(吡啶-2-基二硫烷基)丙醯胺)丁基)-13-(4-(二甲胺基)丁基)-1,4,8,11,14,17,20-七側氧基-10-((吡啶-2-基二硫烷基)甲基)二十二氫-1H-吡咯并[1,2-d][1,4,7,10,14,17,20]氧雜六氮雜環二十二炔-6-羰基)吡咯烷-2-羧醯胺(＊Cys(SPy)-Lys(Me2)-Trp-HOGly-Pro-Lys(H-Cys(SPy))-Asp＊-Pro-NH2、於2個＊部位環化)(化合物SP619)(9.1mg、7.2μmol)。於室溫加入另外製備之600mM參(2-羧基乙基)膦(TCEP)鹽酸鹽溶液(100μl、60μmol、pH=3.7)，於pH=5.6於同溫度靜置30分鐘。將獲得之反應液以逆相矽膠層析(0.1%甲 酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)精製。將獲得之級分冷凍乾燥，形成二硫醚，獲得作為分支胜肽前驅體之(S)-1-((3S，10R，15R，18S，21S，29aS，33S)-21-((1H-吲哚-3-基)甲基)-10-胺基-18-(4-(二甲胺基)丁基)-1,9,16,19,22,25,31,35-八側氧基二十六氫-15,3-(橋亞胺基丙亞胺基甲橋)吡咯并[2,1-x][1,11,12,4,7,16,22,25]氧雜二噻戊氮雜環二十七炔-33-羰基)吡咯烷-2-羧醯胺(＊Cys #-Lys(Me2)-Trp-HOGly-Pro-Lys(H-Cys #)-Asp＊-Pro-NH2、於2個＊部位、#部位環化，於#部位2個SH基形成雙硫鍵)(化合物SP623)(3.7mg、49%)。
600mM參(2-羧基乙基)膦(TCEP)鹽酸鹽溶液之製備法如下。使參(2-羧基乙基)膦(TCEP)鹽酸鹽(22.5mg、78.5mmol)溶於1N氫氧化鈉水溶液(131μl)，調整為pH=3.7。
LCMS(ESI)m/z=1039(M-H)-
保持時間：0.34分(分析條件SQDFA05)
5.於第2次之分支化反應產生之活性硫酯創出單元之最適化探討
已明白從Cys-Pro-HOGly使硫酯產生之反應條件，於溫和且在pH=7.3最緩慢進行(後述)。為了使與第1次之環化反應之選擇性最大化，且為了能使用較第1次之環化反應不溫和之反應條件，探討比Cys-Pro-HOGly更安定且反應進行能開啟關閉(switch on-off)可能之單元，結果明白更理想之單元之條件。確認使用理想的Cys-Pro-Lac單元，在轉譯液中之環化反應及分支化反應會進行。
5-1.示範化合物原料之合成
將含Cys-Pro-HOGly及其代替單元之5個殘基之胜肽之合成，作為為了獲得產生其硫酯之條件的示範胜肽。合成該示範化合物。
吡咯烷-1,2-二羧酸2-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)(S)-1-((9H-茀-9-基)甲酯)(Fmoc-Pro-HOGly-OtBu)(化合物SP631)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0843-2271
於(S)-1-(((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)吡咯烷-2-羧酸(Fmoc-Pro-OH)(5.00g、14.8mmol)之二氯甲烷溶液(59mL)中，於室溫邊攪拌N-乙基二異丙胺(DIPEA)(7.77mL、44.5mmol)與2-溴乙酸 第三丁酯(4.34g、22.2mmol)邊混合，將反應混合物於室溫攪拌48小時。於反應混合物加入飽和氯化銨水溶液並洗滌，將有機層以二氯甲烷萃取。將獲得之有機層以飽和氯化鈉水溶液洗滌，加入硫酸鈉使乾燥。將有機層減壓濃縮，將獲得之殘渣以矽膠管柱層析(己烷/乙酸乙酯)精製，獲得吡咯烷-1,2-二羧酸2-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)(S)-1-((9H-茀-9-基)甲酯)(Fmoc-Pro-HOGly-OtBu)(化合物SP631)(6.40g、14.2mmol、96%)。
LCMS(ESI)m/z=396(M-tBu+H)+
保持時間：1.02分(分析條件SQDFA05)
(S)-2-((1-(((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)吡咯烷-2-羰 基)氧基)乙酸(Fmoc-Pro-HOGly-OH)(化合物SP632)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0844-2272
於吡咯烷-1,2-二羧酸2-(2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基)(S)-1-((9H-茀-9-基)甲酯)(Fmoc-Pro-HOGly-OtBu)(化合物SP631)(6.40g、14.2mmol)之二氯甲烷溶液(29mL)中，將三異丙基矽烷(7.29mL、35.4mmol)與三氟乙酸(14.2mL、184mmol)於室溫邊攪拌邊混合，將反應混合物於室溫攪拌16小時。將反應溶液減壓濃縮，將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)精製，獲得(S)-2-((1-(((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)吡咯烷-2-羰基)氧基)乙酸(Fmoc-Pro-HOGly-OH)(化合物SP632)(5.6g、14.2mmol、100%)。
LCMS(ESI)m/z=396(M+H)+
保持時間：0.77分(分析條件SQDFA05)
(S)-2-(((S)-1-(((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)吡咯烷-2-羰基)氧基)丙酸(Fmoc-Pro-Lac-OH)(化合物SP633)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0844-1002
於氮氣氛圍下，於0度攪拌(S)-1-(((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)吡咯烷-2-羧酸(Fmoc-Pro-OH)(6.00g、17.8mmol)與N,N-二甲基甲醯胺(69μL、0.889mmol)之二氯甲烷溶液 (71mL)，並邊滴加草醯氯(2.34mL、26.7mmol)後，將反應混合物於室溫攪拌1小時。將反應溶液減壓濃縮，於獲得之殘渣中於0度混合二氯甲烷(71mL)、N-乙基二異丙胺(DIPEA)(46.6mL、267mmol)、L-(+)-乳酸(24.0g、267mmol)，將反應混合物於室溫攪拌2小時。將反應溶液以1N鹽酸洗滌2次、以飽和氯化鈉水溶液洗滌2次，以硫酸鈉乾燥後，進行減壓濃縮。將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)精製，獲得(S)-2-(((S)-1-(((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)吡咯烷-2-羰基)氧基)丙酸(Fmoc-Pro-Lac-OH)(化合物SP633)(5.2g、12.7mmol、71%)。
LCMS(ESI)m/z=410(M+H)+
保持時間：0.81分(分析條件SQDFA05)
(S)-2-(((S)-1-(((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)吡咯烷-2-羰基)氧基)-3-苯基丙酸(Fmoc-Pro-PhLac-OH)(化合物SP634)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0845-2273
於氮氣氛圍下，於0度攪拌(S)-1-(((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)吡咯烷-2-羧酸(Fmoc-Pro-OH)(3.00g、8.89mmol)與N,N-二甲基甲醯胺(34μL、0.445mmol)之二氯甲烷溶液(40mL)，邊滴加草醯氯(1.17mL、13.3mmol)後，將反應混合物於室溫攪拌1小時。將反應溶液減壓濃縮，於獲得之殘渣中於0度混合二氯甲烷(36mL)、N-乙基二異丙胺(DIPEA)(2.33mL、 13.3mmol)、(S)-2-羥基-3-苯基丙酸(HO-PhLac-OH、2.22g、13.3mmol)，將反應混合物於室溫攪拌2小時。將反應溶液以1N鹽酸洗滌2次、飽和氯化鈉水溶液洗滌2次，以硫酸鈉乾燥後，進行減壓濃縮。將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)精製，獲得(S)-2-(((S)-1-(((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)吡咯烷-2-羰基)氧基)-3-苯基丙酸(Fmoc-Pro-PhLac-OH)(化合物SP634)(3.00g、6.18mmol、70%)。
LCMS(ESI)m/z=486(M+H)+
保持時間：0.92分(分析條件SQDFA05)
又，PhLac，在本說明書係指將與(S)-羥基-3-苯基丙酸之羥基形成羧酸官能基之羥基去掉後的次結構。
(R)-2-(((S)-1-(((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)吡咯烷-2-羰基)氧基)-3-苯基丙酸(Fmoc-Pro-D-PhLac-OH)(化合物SP635)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0846-2275
於氮氣氛圍下，於0度攪拌(S)-1-(((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)吡咯烷-2-羧酸(Fmoc-Pro-OH)(3.00g、8.89mmol)與N,N-二甲基甲醯胺(34μL、0.445mmol)之二氯甲烷溶液(36mL)，並邊滴入草醯氯(1.17mL、13.3mmol)後，將反應混合物於室溫攪拌1小時。將反應溶液減壓濃縮，於獲得之殘渣中於0度混合二氯甲烷(36mL)、N-乙基二異丙胺(DIPEA)(2.33mL、13.3mmol)、(R)-2-羥基-3-苯基丙酸(2.22g、 13.3mmol)，將反應混合物於室溫攪拌2小時。將反應溶液以1N鹽酸洗滌2次、以飽和氯化鈉水溶液洗滌2次，以硫酸鈉乾燥後，進行減壓濃縮。將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)精製，獲得(R)-2-(((S)-1-(((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)吡咯烷-2-羰基)氧基)-3-苯基丙酸(Fmoc-Pro-D-PhLac-OH)(化合物SP635)(3.20g、6.59mmol、74%)。
LCMS(ESI)m/z=486(M+H)+
保持時間：0.91分(分析條件SQDFA05)
(S)-2-((1-(((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)吡咯烷-2-羰基)氧基)-2-甲基丙酸(Fmoc-Pro-HOGly(Me)2-OH)(化合物SP636)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0847-1006
於氮氣氛圍下，將(S)-1-(((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)吡咯烷-2-羧酸(Fmoc-Pro-OH)(3.00g、8.89mmol)與N,N-二甲基甲醯胺(34μL、0.445mmol)之二氯甲烷溶液(36mL)於0度攪拌，並邊滴加草醯氯(1.17mL、13.3mmol)後，將反應混合物於室溫攪拌1小時。將反應溶液減壓濃縮，於獲得之殘渣中於0度混合二氯甲烷(36mL)、N-乙基二異丙胺(DIPEA)(4.66mL、26.7mmol)、2-羥基-2-甲基丙酸(2.78g、26.7mmol)，將反應混合物於室溫攪拌2小時。將反應溶液以1N鹽酸洗滌2次、以飽和氯化鈉水溶液洗滌2次，以硫酸鈉乾燥後，進行減壓濃縮。 將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)精製，獲得(S)-2-((1-(((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)吡咯烷-2-羰基)氧基)-2-甲基丙酸(Fmoc-Pro-HOGly(Me)2-OH)(化合物SP636)(3.70g、8.74mmol、98%)。
LCMS(ESI)m/z=424(M+H)+
保持時間：0.85分(分析條件SQDFA05)
又，HOGly(Me)2，在本說明書係指將與2-羥基-2-甲基丙酸之羥基形成羧酸官能基之羥基去掉後的次結構。
2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)胺基)乙酸2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙酯(Fmoc-MeGly-HOGly-OtBu)(化合物SP637)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0848-1007
於2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)胺基)乙酸(Fmoc-MeGly-OH)(1.94g、6.23mmol)之二氯甲烷溶液(25mL)中，於室溫邊攪拌邊混合N-乙基二異丙胺(DIPEA)(3.26mL、18.7mmol)與2-溴乙酸 第三丁酯(1.82g、9.34mmol)，將反應混合物於室溫攪拌48小時。於反應混合物加入1N鹽酸並洗滌，將有機層以二氯甲烷萃取。獲得之有機層以飽和氯化鈉水溶液洗滌，然後加入硫酸鈉使乾燥。將有機層減壓濃縮，將獲得之殘渣以矽膠管柱層析(己烷/乙酸乙酯)精製，獲得2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)胺基)乙酸2-(第三丁氧基)-2-側 氧基乙酯(Fmoc-MeGly-HOGly-OtBu)(化合物SP637)(2.30g、5.41mmol、87%)。
LCMS(ESI)m/z=370(M-tBu+H)+
保持時間：0.99分(分析條件SQDFA05)
2-(2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)胺基)乙醯氧基)乙酸(Fmoc-MeGly-HOGly-OH)(化合物SP638)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0849-1008
於2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)胺基)乙酸2-(第三丁氧基)-2-側氧基乙基(Fmoc-MeGly-HOGly-OtBu)(化合物SP637)(2.30g、5.41mmol)之二氯甲烷溶液(18mL)中，將三異丙基矽烷(2.78mL、13.5mmol)與三氟乙酸(5.41mL、70.3mmol)於室溫邊攪拌邊混合，將反應混合物於室溫攪拌2小時。將反應溶液減壓濃縮，將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)精製，獲得2-(2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)胺基)乙醯氧基)乙酸(Fmoc-MeGly-HOGly-OH)(化合物SP638)(2.00g、5.41mmol、100%)。
LCMS(ESI)m/z=370(M+H)+
保持時間：0.75分(分析條件SQDFA05)
(R)-2-((S)-2-胺基-3-(1H-吲哚-3-基)丙醯胺)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(H-Trp-Cys(StBu)-OH)(化合物SP639)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0850-1009
於製備之(R)-2-((S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(1H-吲哚-3-基)丙醯胺)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(Fmoc-Trp-Cys(StBu)-OH)(化合物SP602)(500mg、0.809mmol)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(1.6mL)中，將1，8-二氮雜雙環[5.4.0]-7-十一烯(DBU)(134μL、0.890mmol)於室溫邊攪拌邊混合，將反應溶液於室溫攪拌30分鐘。將反應溶液以逆相矽膠管柱層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)精製，獲得(R)-2-((S)-2-胺基-3-(1H-吲哚-3-基)丙醯胺)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(H-Trp-Cys(StBu)-OH)(化合物SP639)(290mg、0.733mmol、91%)。
LCMS(ESI)m/z=396(M+H)+
保持時間：0.49分(分析條件SQDFA05)
(R)-2-((S)-2-乙醯胺-3-(1H-吲哚-3-基)丙醯胺)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(Ac-Trp-Cys(StBu)-OH)(化合物SP640)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0851-1010
於(R)-2-((S)-2-胺基-3-(1H-吲哚-3-基)丙醯胺)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(H-Trp-Cys(StBu)-OH)(化合物SP639)(280mg、0.708mmol)之二氯甲烷溶液(1.4mL)中，於室溫邊攪拌邊混合N-乙基二異丙胺(DIPEA)(371μL、2.12mmol)與乙酸酐(66.8μL、0.708mmol)，將反應溶液於室溫攪拌1小時。將反應溶液以逆相矽膠管柱層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)精製，獲得(R)-2-((S)-2-乙醯胺-3-(1H-吲哚-3-基)丙醯胺)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(Ac-Trp-Cys(StBu)-OH)(化合物SP640)(270mg、0.617mmol、87%)。
LCMS(ESI)m/z=438(M+H)+
保持時間：0.66分(分析條件SQDFA05)
甲烷磺酸基(sulfono)硫代酸S-第三丁酯(化合物SP684)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0851-2276
於2-甲基-2-丙烷硫醇鈉(7.83g、69.8mmol)中加入四氫呋喃(100ml)，冷卻至-60度以下。於該懸浮液中，費時25分鐘滴加甲烷磺醯基氯化物(6.77ml、87.0mmol)之四氫呋喃(50ml)溶液。將反應液費時2小時升溫至室溫，再於室溫攪拌1小時。將反應液以二氯甲烷(300ml)稀釋，以飽和重碳酸水溶 液及飽和食鹽水洗滌。將有機層以無水硫酸鈉乾燥，過濾後，減壓濃縮，獲得甲烷磺酸基(sulfono)硫代酸S-第三丁酯(化合物SP684)(11.17g、76%)。獲得之化合物以在非專利文獻(Inorganic Chemistly、2010、49、8637-8644)掲載之化合物數據確認。
(S)-2-胺基-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(H-D-Cys(StBu)-OH)(化合物SP641)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0852-1012
於(S)-2-胺基-3-巰基丙酸 鹽酸鹽 水合物(1.00g、5.69mmol)之甲醇溶液(5.1mL)中混合邊於0度攪拌邊製備之甲烷磺酸基(sulfono)硫代酸S-第三丁酯(化合物SP684、1.05g、6.26mmol)之四氫呋喃溶液(2.0mL)與三乙胺(2.38mL、17.1mmol)，將反應混合物於室溫攪拌3小時。將反應混合物以逆相矽膠管柱層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)精製，獲得(S)-2-胺基-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(H-D-Cys(StBu)-OH)(化合物SP641)(620mg、2.96mmol、52%)。
LCMS(ESI)m/z=210(M+H)+
保持時間：0.56分(分析條件SQDAA05)
(S)-2-((S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(1H-吲哚-3-基)丙醯胺)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(Fmoc-Trp-D-Cys(StBu)-OH)(化合物SP642)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0853-1013
於(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(1H-吲哚-3-基)丙酸(Fmoc-Trp-OH)(1.26g、2.96mmol)與N-羥基琥珀醯亞胺(341mg、2.96mmol)之二氯甲烷(5.9mL)中，於0度混合1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二醯亞胺鹽酸鹽(WSCI‧HCl)(568mg、2.96mmol)，將反應溶液於室溫1攪拌6小時。然後將N-乙基-N-異丙基丙烷-2-胺(DIPEA、517μL、2.96mmol)與(S)-2-胺基-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(H-D-Cys(StBu)-OH)(化合物SP641)(620mg、2.96mmol)於0度混合，將反應溶液於室溫攪拌5小時。加入1N鹽酸並洗滌，將有機層以乙酸乙酯萃取，將獲得之有機層以飽和氯化鈉水溶液洗滌後，以硫酸鈉乾燥。減壓濃縮後，將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)粗精製，獲得(S)-2-((S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(1H-吲哚-3-基)丙醯胺)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(Fmoc-Trp-D-Cys(StBu)-OH)(化合物SP642)。
LCMS(ESI)m/z=618(M+H)+
保持時間：0.94分(分析條件SQDFA05)
(S)-2-((S)-2-胺基-3-(1H-吲哚-3-基)丙醯胺)-3-(第 三丁基二硫烷基)丙酸(H-Trp-D-Cys(StBu)-OH)(化合物SP643)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0854-2278
於((S)-2-((S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(1H-吲哚-3-基)丙醯胺)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(Fmoc-Trp-D-Cys(StBu)-OH)(化合物SP642)(1.93g、3.12mmol)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(6.3mL)中，於室溫邊攪拌邊混合1，8-二氮雜雙環[5.4.0]-7-十一烯(DBU)(706μL、4.69mmol)，將反應溶液於室溫攪拌1小時。於反應溶液中加入1N鹽酸，將有機層以乙酸乙酯萃取，以飽和食鹽水洗滌後，以硫酸鈉乾燥。減壓濃縮後，將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)精製，獲得(S)-2-((S)-2-胺基-3-(1H-吲哚-3-基)丙醯胺)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(H-Trp-D-Cys(StBu)-OH)(化合物SP643)(870mg、2.20mmol、70%)。
LCMS(ESI)m/z=396(M+H)+
保持時間：0.83分(分析條件SQDAA05)
(S)-2-((S)-2-乙醯胺-3-(1H-吲哚-3-基)丙醯胺)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(Ac-Trp-D-Cys(StBu)-OH)(化合物SP644)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0855-1015
於(S)-2-((S)-2-胺基-3-(1H-吲哚-3-基)丙醯胺)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(H-Trp-D-Cys(StBu)-OH)(化合物SP643)(870mg、2.20mmol)之二氯甲烷溶液(4.4mL)中，於室溫邊攪拌邊混合N-乙基二異丙胺(DIPEA)(1.15mL、6.60mmol)與乙酸酐(208μL、2.20mmol)，將反應溶液於室溫攪拌1小時。將反應溶液以逆相矽膠管柱層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)精製，獲得(S)-2-((S)-2-乙醯胺-3-(1H-吲哚-3-基)丙醯胺)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(Ac-Trp-D-Cys(StBu)-OH)(化合物SP644)(960mg、2.20mmol、100%)。
LCMS(ESI)m/z=438(M+H)+
保持時間：0.67分(分析條件SQDFA05)
Fmoc-Ala-O-Trt(2-Cl)resin(化合物SP645)之製備
Figure 107130626-A0101-12-0855-1016
於氯-三苯甲基(2-氯)樹脂(Cl-Trt-(2-Cl)-Resin(100~200Mesh、1% DVB)、從渡邊化學購買、14.4g、22.96mmol)加入二氯甲烷(100mL)，將混合物於室溫靜置45分鐘。去除液 相，將固相以二氯甲烷(100mL)洗滌。對於固相混合二氯甲烷(100mL)、甲醇(3.5mL)、N-乙基二異丙胺(DIPEA)(10mL)、(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)丙酸(3.57g、11.5mmol)，將反應混合物於室溫進行5分鐘振盪。分離固相與液相，於獲得之樹脂中混合二氯甲烷(100mL)、甲醇(30mL)、N-乙基二異丙胺(DIPEA)(10mL)，將反應混合物於室溫振盪2小時。分離固相與液相，將獲得之樹脂以二氯甲烷(100mL)洗滌3次並減壓乾燥，獲得標題化合物(化合物SP645)15.96g。依本說明書記載之方法計載裝載值，結果為25.4%。
(S)-2-(2-(((S)-1-((R)-2-((S)-2-乙醯胺-3-(1H-吲哚-3-基)丙醯胺)-3-(第三丁基二硫烷基)丙醯基)吡咯烷-2-羰基)氧基)乙醯胺)丙酸(Ac-Trp-Cys(StBu)-Pro-HOGly-Ala-OH)(化合物SP646)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0856-2280
於製備之Fmoc-Ala-O-resin(化合物SP645)(200mg、0.405mmol/g、80.9μmol)加入DMF(0.8mL)，於室溫振盪15分鐘，分離固相與液相。於獲得之樹脂中加入2%DBU/N,N-二甲基甲醯胺溶液(0.8mL)，於室溫振盪30分鐘，去除液相，反複此作業2次。將獲得之樹脂以N,N-二甲基甲醯胺(0.8mL)洗滌4次，然後將(S)-2-((1-(((9H-茀-9-基)甲氧基) 羰基)吡咯烷-2-羰基)氧基)乙酸(Fmoc-Pro-HOGly-OH)(化合物SP632)(154mg、0.388mmol)與1-羥基-7-氮雜苯并三唑(HOAt)(33.0mg、0.243mmol)之NMP溶液(0.64mL)與二異丙基碳二醯亞胺(DIC)(65μL、0.417mmol)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(0.52mL)混合，於室溫振盪3小時。
分離固相與液相，將獲得之樹脂以N,N-二甲基甲醯胺(0.8mL)洗滌4次後，混合5%哌啶/N,N-二甲基甲醯胺溶液(0.8mL)，於室溫振盪1小時。分離固相與液相，將獲得之樹脂以N,N-二甲基甲醯胺溶液(0.8mL)洗滌4次後，將(R)-2-((S)-2-乙醯胺-3-(1H-吲哚-3-基)丙醯胺)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(Ac-Trp-Cys(StBu)-OH)(化合物SP640)(170mg、0.388mmol)與3,4-二氫-3-羥基-4-側氧基-1,2,3-苯并三
Figure 107130626-A0101-12-0857-939
(HOObt(39.6mg、0.243mmol)之NMP溶液(0.64mL)與二異丙基碳二醯亞胺(DIC)(65μL、0.417mmol)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(0.52mL)混合，於室溫振盪15小時。
分離固相與液相，將獲得之樹脂以N,N-二甲基甲醯胺(0.8mL)洗滌4次、然後以二氯甲烷(0.8mL)洗滌4次後，混合50%2,2,2-三氟乙醇/二氯甲烷溶液(1.0mL)，於室溫振盪2小時。
分離固相與液相，將固相以二氯甲烷(1.0mL)洗滌，將獲得之液相減壓濃縮。將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)精製，獲得(S)-2-(2-(((S)-1-((R)-2-((S)-2-乙醯胺-3-(1H-吲哚-3-基)丙醯胺)-3-(第三丁基二硫烷基)丙醯基)吡咯烷-2-羰基)氧基)乙醯胺)丙酸(Ac-Trp-Cys(StBu)-Pro-HOGly-Ala-OH)(化合物 SP646)(37.8mg、57μmol、70%)。
LCMS(ESI)m/z=664(M+H)+
保持時間：0.80分(分析條件SQDAA05)
(S)-2-((S)-2-(((S)-1-((R)-2-((S)-2-乙醯胺-3-(1H-吲哚-3-基)丙醯胺)-3-(第三丁基二硫烷基)丙醯基)吡咯烷-2-羰基)氧基)丙醯胺)丙酸(Ac-Trp-Cys(StBu)-Pro-Lac-Ala-OH)(化合物SP647)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0858-1018
於製備之Fmoc-Ala-O-resin(化合物SP645)(200mg、0.405mmol/g、80.9μmol)加入DMF(0.8mL)，於室溫振盪15分鐘，分離固相與液相。於獲得之樹脂加入2%DBU/N,N-二甲基甲醯胺溶液(0.8mL)，於室溫振盪30分鐘，去除液相，重複此作業2次。將獲得之樹脂以N,N-二甲基甲醯胺(0.8mL)洗滌4次，然後將(S)-2-(((S)-1-(((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)吡咯烷-2-羰基)氧基)丙酸(Fmoc-Pro-Lac-OH)(化合物SP633)(159mg、0.388mmol)與1-羥基-7-氮雜苯并三唑(HOAt)(33.0mg、0.243mmol)之NMP溶液(0.64mL)與二異丙基碳二醯亞胺(DIC)(65μL、0.417mmol)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(0.52mL)混合，於室溫振盪3小時。分離固相與液相，將獲得 之樹脂以N,N-二甲基甲醯胺(0.8mL)洗滌4次後，混合5%哌啶/N,N-二甲基甲醯胺溶液(0.8mL)，於室溫振盪1小時。
分離固相與液相，將獲得之樹脂以N,N-二甲基甲醯胺溶液(0.8mL)洗滌4次後，混合(R)-2-((S)-2-乙醯胺-3-(1H-吲哚-3-基)丙醯胺)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(Ac-Trp-Cys(StBu)-OH)(化合物SP640)(170mg、0.388mmol)與3,4-二氫-3-羥基-4-側氧基-1,2,3-苯并三
Figure 107130626-A0101-12-0859-938
(HOObt)(39.6mg、0.243mmol)之NMP溶液(0.64mL)與二異丙基碳二醯亞胺(DIC)(65μL、0.417mmol)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(0.52mL)，於室溫振盪15小時。
分離固相與液相，將獲得之樹脂以N,N-二甲基甲醯胺(0.8mL)洗滌4次，然後以二氯甲烷(0.8mL)洗滌4次後，混合50%2,2,2-三氟乙醇/二氯甲烷溶液(1.0mL)，於室溫振盪2小時。
分離固相與液相，將固相以二氯甲烷(1.0mL)洗滌，並將獲得之液相減壓濃縮。將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)精製，獲得(S)-2-((S)-2-(((S)-1-((R)-2-((S)-2-乙醯胺-3-(1H-吲哚-3-基)丙醯胺)-3-(第三丁基二硫烷基)丙醯基)吡咯烷-2-羰基)氧基)丙醯胺)丙酸(Ac-Trp-Cys(StBu)-Pro-Lac-Ala-OH)(化合物SP647)(51.4mg、76μmol、94%)。
LCMS(ESI)m/z=678(M+H)+
保持時間：0.82分(分析條件SQDAA05)
(S)-2-((S)-2-(((S)-1-((R)-2-((S)-2-乙醯胺-3-(1H-吲哚-3-基)丙醯胺)-3-(第三丁基二硫烷基)丙醯基)吡咯烷-2-羰基)氧基)-3-苯基丙醯胺)丙酸 (Ac-Trp-Cys(StBu)-Pro-PhLac-Ala-OH)(化合物SP648)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0860-1019
於製備之Fmoc-Ala-O-resin(化合物SP645)(200mg、0.405mmol/g、80.9μmol)中加入DMF(0.8mL)，於室溫振盪15分鐘，分離固相與液相。於獲得之樹脂加入2%DBU/N,N-二甲基甲醯胺溶液(0.8mL)，於室溫振盪30分鐘、去除液相，重複此作業2次。將獲得之樹脂以N,N-二甲基甲醯胺(0.8mL)洗滌4次，然後將(S)-2-(((S)-1-(((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)吡咯烷-2-羰基)氧基)-3-苯基丙酸(Fmoc-Pro-PhLac-OH)(化合物SP634)(189mg、0.388mmol)與1-羥基-7-氮雜苯并三唑(HOAt)(33.0mg、0.243mmol)之NMP溶液(0.64mL)與二異丙基碳二醯亞胺(DIC)(65μL、0.417mmol)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(0.52mL)混合，於室溫振盪3小時。
分離固相與液相，將獲得之樹脂以N,N-二甲基甲醯胺(0.8mL)洗滌4次後，混合5%哌啶/N,N-二甲基甲醯胺溶液(0.8mL)，於室溫振盪1小時。分離固相與液相，將獲得之樹脂以N,N-二甲基甲醯胺溶液(0.8mL)洗滌4次後，將(R)-2-((S)-2-乙醯胺-3-(1H-吲哚-3-基)丙醯胺)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(Ac-Trp-Cys(StBu)-OH)(化合物SP640)(170mg、 0.388mmol)與3,4-二氫-3-羥基-4-側氧基-1,2,3-苯并三
Figure 107130626-A0101-12-0861-937
(HOObt(39.6mg、0.243mmol)之NMP溶液(0.64mL)與二異丙基碳二醯亞胺(DIC)(65μL、0.417mmol)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(0.52mL)混合，於室溫振盪15小時。分離固相與液相，將獲得之樹脂以N,N-二甲基甲醯胺(0.8mL)洗滌4次、然後以二氯甲烷(0.8mL)洗滌4次後，混合50%2,2,2-三氟乙醇/二氯甲烷溶液(1.0mL)，於室溫振盪2小時。
分離固相與液相，將固相以二氯甲烷(1.0mL)洗滌，將獲得之液相減壓濃縮。將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)精製，獲得(S)-2-((S)-2-(((S)-1-((R)-2-((S)-2-乙醯胺-3-(1H-吲哚-3-基)丙醯胺)-3-(第三丁基二硫烷基)丙醯基)吡咯烷-2-羰基)氧基)-3-苯基丙醯胺)丙酸(Ac-Trp-Cys(StBu)-Pro-PhLac-Ala-OH)(化合物SP648)(51.2mg、68μmol、84%)。
LCMS(ESI)m/z=754(M+H)+
保持時間：0.92分(分析條件SQDAA05)
(S)-2-((R)-2-(((S)-1-((R)-2-((S)-2-乙醯胺-3-(1H-吲哚-3-基)丙醯胺)-3-(第三丁基二硫烷基)丙醯基)吡咯烷-2-羰基)氧基)-3-苯基丙醯胺)丙酸(Ac-Trp-Cys(StBu)-Pro-D-PhLac-Ala-OH)(化合物SP649)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0862-1020
於製備之Fmoc-Ala-O-resin(化合物SP645)(200mg、0.405mmol/g、80.9μmol)加入DMF(0.8mL)，於室溫振盪15分鐘，分離固相與液相。於獲得之樹脂加入2%DBU/N,N-二甲基甲醯胺溶液(0.8mL)，於室溫振盪30分鐘、去除液相，重複此作業2次。將獲得之樹脂以N,N-二甲基甲醯胺(0.8mL)洗滌4次，然後將(R)-2-(((S)-1-(((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)吡咯烷-2-羰基)氧基)-3-苯基丙酸(Fmoc-Pro-D-PhLac-OH)(化合物SP635)(189mg、0.388mmol)與1-羥基-7-氮雜苯并三唑(HOAt)(33.0mg、0.243mmol)之NMP溶液(0.64mL)與二異丙基碳二醯亞胺(DIC)(65μL、0.417mmol)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(0.52mL)混合，於室溫振盪3小時。
分離固相與液相，將獲得之樹脂以N,N-二甲基甲醯胺(0.8mL)洗滌4次後，混合5%哌啶/N,N-二甲基甲醯胺溶液(0.8mL)，於室溫振盪1小時。分離固相與液相，將獲得之樹脂以N,N-二甲基甲醯胺溶液(0.8mL)洗滌4次後，混合(R)-2-((S)-2-乙醯胺-3-(1H-吲哚-3-基)丙醯胺)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(Ac-Trp-Cys(StBu)-OH)(化合物SP640)(170mg、0.388mmol)與3,4-二氫-3-羥基-4-側氧基-1,2,3-苯并三
Figure 107130626-A0101-12-0862-936
(HOObt)(39.6mg、0.243mmol)之NMP溶液(0.64mL)與二異丙 基碳二醯亞胺(DIC)(65μL、0.417mmol)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(0.52mL)，於室溫振盪15小時。分離固相與液相，將獲得之樹脂以N,N-二甲基甲醯胺(0.8mL)洗滌4次，然後以二氯甲烷(0.8mL)洗滌4次後，混合50%2,2,2-三氟乙醇/二氯甲烷溶液(1.0mL)，於室溫振盪2小時。
分離固相與液相，將固相以二氯甲烷(1.0mL)洗滌，將獲得之液相減壓濃縮。將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)精製，獲得(S)-2-((R)-2-(((S)-1-((R)-2-((S)-2-乙醯胺-3-(1H-吲哚-3-基)丙醯胺)-3-(第三丁基二硫烷基)丙醯基)吡咯烷-2-羰基)氧基)-3-苯基丙醯胺)丙酸(Ac-Trp-Cys(StBu)-Pro-D-PhLac-Ala-OH)(化合物SP649)(50.0mg、66.0μmol、82%)。
LCMS(ESI)m/z=754(M+H)+
保持時間：0.93分(分析條件SQDAA05)
(S)-2-(2-(((S)-1-((R)-2-((S)-2-乙醯胺-3-(1H-吲哚-3-基)丙醯胺)-3-(第三丁基二硫烷基)丙醯基)吡咯烷-2-羰基)氧基)-2-甲基丙醯胺)丙酸(Ac-Trp-Cys(StBu)-Pro-HOGly(Me)2-Ala-OH)(化合物SP650)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0863-1021
於製備之Fmoc-Ala-O-resin(化合物SP645)(200mg、0.405mmol/g、80.9μmol)加入DMF(0.8mL)，於室溫振盪15分鐘，分離固相與液相。於獲得之樹脂加入2%DBU/N,N-二甲基甲醯胺溶液(0.8mL)，於室溫振盪30分鐘、去除液相，重複此作業2次。將獲得之樹脂以N,N-二甲基甲醯胺(0.8mL)洗滌4次，然後將(S)-2-((1-(((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)吡咯烷-2-羰基)氧基)-2-甲基丙酸(Fmoc-Pro-HOGly(Me)2-OH)(化合物SP636)(164mg、0.388mmol)與1-羥基-7-氮雜苯并三唑(HOAt)(33.0mg、0.243mmol)之NMP溶液(0.64mL)與二異丙基碳二醯亞胺(DIC)(65μL、0.417mmol)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(0.52mL)混合，於室溫振盪3小時。分離固相與液相，將獲得之樹脂以N,N-二甲基甲醯胺(0.8mL)洗滌4次後，混合5%哌啶/N,N-二甲基甲醯胺溶液(0.8mL)，於室溫振盪1小時。
分離固相與液相，將獲得之樹脂以N,N-二甲基甲醯胺溶液(0.8mL)洗滌4次後，將(R)-2-((S)-2-乙醯胺-3-(1H-吲哚-3-基)丙醯胺)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(Ac-Trp-Cys(StBu)-OH)(化合物SP640)(170mg、0.388mmol)與3,4-二氫-3-羥基-4-側氧基-1,2,3-苯并三
Figure 107130626-A0101-12-0864-935
(HOObt)(39.6mg、0.243mmol)之NMP溶液(0.64mL)與二異丙基碳二醯亞胺(DIC)(65μL、0.417mmol)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(0.52mL)混合，於室溫振盪15小時。
分離固相與液相，將獲得之樹脂以N,N-二甲基甲醯胺(0.8mL)洗滌4次，然後以二氯甲烷(0.8mL)洗滌4次後，混合50%2,2,2-三氟乙醇/二氯甲烷溶液(1.0mL)，於室溫振盪2小時。分離固相與液相，將固相以二氯甲烷(1.0mL)洗滌，將獲 得之液相減壓濃縮。將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)精製，獲得(S)-2-(2-(((S)-1-((R)-2-((S)-2-乙醯胺-3-(1H-吲哚-3-基)丙醯胺)-3-(第三丁基二硫烷基)丙醯基)吡咯烷-2-羰基)氧基)-2-甲基丙醯胺)丙酸(Ac-Trp-Cys(StBu)-Pro-HOGly(Me)2-Ala-OH)(化合物SP650)(46.4mg、67μmol、83%)。
LCMS(ESI)m/z=692(M+H)+
保持時間：0.84分(分析條件SQDAA05)
(4S，7R，16S)-4-((1H-吲哚-3-基)甲基)-7-((第三丁基二硫烷基)甲基)-9,16-二甲基-2,5,8,11,14-五側氧基-12-氧雜-3,6,9,15-四氮雜十七烷-17-酸(Ac-Trp-Cys(StBu)-MeGly-HOGly-Ala-OH)(化合物SP651)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0865-1022
於製備之Fmoc-Ala-O-resin(化合物SP645)(200mg、0.405mmol/g、80.9μmol)中加入DMF(0.8mL)，於室溫振盪15分鐘，分離固相與液相。於獲得之樹脂加入2%DBU/N,N-二甲基甲醯胺溶液(0.8mL)，於室溫振盪30分鐘、去除液相，重複此作業2次。將獲得之樹脂以N,N-二甲基甲醯胺(0.8mL)洗滌4次，然後將2-(2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰 基)(甲基)胺基)乙醯氧基)乙酸(Fmoc-MeGly-HOGly-OH)(化合物SP638)(143mg、0.388mmol)與1-羥基-7-氮雜苯并三唑(HOAt)(33.0mg、0.243mmol)之NMP溶液(0.64mL)與二異丙基碳二醯亞胺(DIC)(65μL、0.417mmol)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(0.52mL)混合，於室溫振盪3小時。
分離固相與液相，將獲得之樹脂以N,N-二甲基甲醯胺(0.8mL)洗滌4次後，混合5%哌啶/N,N-二甲基甲醯胺溶液(0.8mL)，於室溫振盪1小時。分離固相與液相，將獲得之樹脂以N,N-二甲基甲醯胺溶液(0.8mL)洗滌4次後，將(R)-2-((S)-2-乙醯胺-3-(1H-吲哚-3-基)丙醯胺)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(Ac-Trp-Cys(StBu)-OH)(化合物SP640)(170mg、0.388mmol)與3,4-二氫-3-羥基-4-側氧基-1,2,3-苯并三
Figure 107130626-A0101-12-0866-934
(HOObt)(39.6mg、0.243mmol)之NMP溶液(0.64mL)與二異丙基碳二醯亞胺(DIC)(65μL、0.417mmol)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(0.52mL)混合，於室溫振盪15小時。分離固相與液相，將獲得之樹脂以N,N-二甲基甲醯胺(0.8mL)洗滌4次，然後以二氯甲烷(0.8mL)洗滌4次後，混合50%2,2,2-三氟乙醇/二氯甲烷溶液(1.0mL)，於室溫振盪2小時。分離固相與液相，將固相以二氯甲烷(1.0mL)洗滌，將獲得之液相減壓濃縮。將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)精製，獲得(4S，7R，16S)-4-((1H-吲哚-3-基)甲基)-7-((第三丁基二硫烷基)甲基)-9,16-二甲基-2,5,8,11,14-五側氧基-12-氧雜-3,6,9,15-四氮雜十七烷-17-酸(Ac-Trp-Cys(StBu)-MeGly-HOGly-Ala-OH)(化合物 SP651)(26.7mg、42μmol、52%)。
LCMS(ESI)m/z=638(M+H)+
保持時間：0.79分(分析條件SQDAA05)
(4S，7S，16S)-4-((1H-吲哚-3-基)甲基)-7-((第三丁基二硫烷基)甲基)-9,16-二甲基-2,5,8,11,14-五側氧基-12-氧雜-3,6,9,15-四氮雜十七烷-17-酸(Ac-Trp-D-Cys(StBu)-MeGly-HOGly-Ala-OH)(化合物SP652)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0867-2281
於製備之Fmoc-Ala-O-resin(化合物SP645)(200mg、0.405mmol/g、80.9μmol)中加入DMF(0.8mL)，於室溫振盪15分鐘，分離固相與液相。於獲得之樹脂中加入2%DBU/N,N-二甲基甲醯胺溶液(0.8mL)，於室溫振盪30分鐘、去除液相，重複重複此作業2次。將獲得之樹脂以N,N-二甲基甲醯胺(0.8mL)洗滌4次，然後將2-(2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)胺基)乙醯氧基)乙酸(Fmoc-MeGly-HOGly-OH)(化合物SP638)(143mg、0.388mmol)與1-羥基-7-氮雜苯并三唑(HOAt)(33.0mg、0.243mmol)之NMP溶液(0.64mL)與二異丙基碳二醯亞胺(DIC)(65μL、0.417mmol)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(0.52mL)混合，於室溫振盪3小時。
分離固相與液相，將獲得之樹脂以N,N-二甲基甲醯胺(0.8mL)洗滌4次後，將5%哌啶/N,N-二甲基甲醯胺溶液(0.8mL)混合，於室溫振盪1小時。分離固相與液相，將獲得之樹脂
Figure 107130626-A0101-12-0868-933
N,N-二甲基甲醯胺溶液(0.8mL)洗滌4次後，(S)-2-((S)-2-乙醯胺-3-(1H-吲哚-3-基)丙醯胺)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(Ac-Trp-D-Cys(StBu)-OH)(化合物SP644)(170mg、0.388mmol)與3,4-二氫-3-羥基-4-側氧基-1,2,3-苯并三
Figure 107130626-A0101-12-0868-930
(HOObt)(39.6mg、0.243mmol)之NMP溶液(0.64mL)與二異丙基碳二醯亞胺(DIC)(65μL、0.417mmol)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(0.52mL)混合，於室溫振盪15小時。分離固相與液相，將獲得之樹脂以N,N-二甲基甲醯胺(0.8mL)洗滌4次，然後以二氯甲烷(0.8mL)洗滌4次後，將50%2,2,2-三氟乙醇/二氯甲烷溶液(1.0mL)混合，於室溫振盪2小時。分離固相與液相，將固相以二氯甲烷(1.0mL)洗滌，並將獲得之液相減壓濃縮。將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)精製，獲得(4S，7S，16S)-4-((1H-吲哚-3-基)甲基)-7-((第三丁基二硫烷基)甲基)-9,16-二甲基-2,5,8,11,14-五側氧基-12-氧雜-3,6,9,15-四氮雜十七烷-17-酸(Ac-Trp-D-Cys(StBu)-MeGly-HOGly-Ala-OH)(化合物SP652)(36.5mg、57μmol、71%)。
LCMS(ESI)m/z=638(M+H)+
保持時間：0.81分(分析條件SQDAA05)
(S)-2-(2-(((S)-1-((S)-2-((S)-2-乙醯胺-3-(1H-吲哚-3-基)丙醯胺)-3-(第三丁基二硫烷基)丙醯基)吡咯烷-2-羰基)氧基)乙醯胺)丙酸(Ac-Trp-D-Cys(StBu)-Pro-HOGly-Ala-OH)(化 合物SP653)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0869-1024
於製備之Fmoc-Ala-O-resin(化合物SP645)(50mg、0.405mmol/g、20.2μmol)中加入DMF(0.2mL)，於室溫振盪15分鐘，分離固相與液相。於獲得之樹脂中加入2%DBU/N,N-二甲基甲醯胺溶液(0.2mL)，於室溫振盪30分鐘、去除液相，重複重複此作業2次。將獲得之樹脂以N,N-二甲基甲醯胺(0.2mL)洗滌4次，然後將(S)-2-((1-(((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)吡咯烷-2-羰基)氧基)乙酸(Fmoc-Pro-HOGly-OH)(化合物SP632)(38.4mg、0.097mmol)與1-羥基-7-氮雜苯并三唑(HOAt)(8.26mg、60.7μmol)之NMP溶液(0.16mL)與二異丙基碳二醯亞胺(DIC)(16μL、0.104mmol)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(0.13mL)混合，於室溫振盪6小時。分離固相與液相，將獲得之樹脂以N,N-二甲基甲醯胺(0.2mL)洗滌4次後，混合5%哌啶/N,N-二甲基甲醯胺溶液(0.2mL)，於室溫振盪1小時。
分離固相與液相，將獲得之樹脂以N,N-二甲基甲醯胺溶液(0.2mL)洗滌4次後，混合(S)-2-((S)-2-乙醯胺-3-(1H-吲哚-3-基)丙醯胺)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(Ac-Trp-D-Cys(StBu)-OH)(化合物SP644)(42.5mg、0.097mmol)與3,4-二氫-3-羥基-4-側氧基-1,2,3-苯并三
Figure 107130626-A0101-12-0869-932
(HOObt)(9.9mg、 60.8mol)之NMP溶液(0.160mL)與二異丙基碳二醯亞胺(DIC)(16μL、0.104mmol)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(0.13mL)，於室溫振盪15小時。分離固相與液相，將獲得之樹脂以N,N-二甲基甲醯胺(0.2mL)洗滌4次，然後以二氯甲烷(0.2mL)洗滌4次後，混合50%2,2,2-三氟乙醇/二氯甲烷溶液(0.25mL)，於室溫振盪2小時。分離固相與液相，將獲得之液相減壓濃縮。將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(10mM乙酸銨水溶液/甲醇)精製，獲得(S)-2-(2-(((S)-1-((S)-2-((S)-2-乙醯胺-3-(1H-吲哚-3-基)丙醯胺)-3-(第三丁基二硫烷基)丙醯基)吡咯烷-2-羰基)氧基)乙醯胺)丙酸(Ac-Trp-D-Cys(StBu)-Pro-HOGly-Ala-OH)(化合物SP653)(3.0mg、4.5μmol、22%)。
LCMS(ESI)m/z=664(M+H)+
保持時間：0.85分(分析條件SQDAA05)
(S)-2-((S)-2-(((S)-1-((S)-2-((S)-2-乙醯胺-3-(1H-吲哚-3-基)丙醯胺)-3-(第三丁基二硫烷基)丙醯基)吡咯烷-2-羰基)氧基)丙醯胺)丙酸(Ac-Trp-D-Cys(StBu)-Pro-Lac-Ala-OH)(化合物SP654)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0870-1025
於製備之Fmoc-Ala-O-resin(化合物SP645)(50mg、0.405mmol/g、20.2μmol)中加入DMF(0.2mL)， 於室溫振盪15分鐘，分離固相與液相。於獲得之樹脂加入2%DBU/N,N-二甲基甲醯胺溶液(0.2mL)，於室溫振盪30分鐘、去除液相，重複此作業2次。將獲得之樹脂以N,N-二甲基甲醯胺(0.2mL)洗滌4次，然後將(S)-2-(((S)-1-(((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)吡咯烷-2-羰基)氧基)丙酸(Fmoc-Pro-Lac-OH)(化合物SP633)(39.8mg、0.097mmol)與1-羥基-7-氮雜苯并三唑(HOAt)(8.2633.0mg、60.7μ0.243mmol)之NMP溶液(0.16mL)與二異丙基碳二醯亞胺(DIC)(16μL、0.104mmol)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(0.13mL)混合，於室溫6振盪3小時。
分離固相與液相，將獲得之樹脂以N,N-二甲基甲醯胺(0.2mL)洗滌4次後，混合5%哌啶/N,N-二甲基甲醯胺溶液(0.2mL)，於室溫振盪1小時。分離固相與液相，將獲得之樹脂以N,N-二甲基甲醯胺溶液(0.2mL)洗滌4次後，將(S)-2-((S)-2-乙醯胺-3-(1H-吲哚-3-基)丙醯胺)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(Ac-Trp-D-Cys(StBu)-OH)(化合物SP644)(42.5mg、0.097mmol)與3,4-二氫-3-羥基-4-側氧基-1,2,3-苯并三
Figure 107130626-A0101-12-0871-931
(HOObt)(9.9mg、60.8mol)之NMP溶液(0.160mL)與二異丙基碳二醯亞胺(DIC)(16μL、0.104mmol)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(0.13mL)混合，於室溫振盪15小時。分離固相與液相，將獲得之樹脂以N,N-二甲基甲醯胺(0.2mL)洗滌4次，然後以二氯甲烷(0.2mL)洗滌4次後，混合50%2,2,2-三氟乙醇/二氯甲烷溶液(0.5mL)，於室溫振盪2小時。分離固相與液相，將獲得之液相減壓濃縮。將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(10mM乙酸銨/甲醇)精製，獲得 (S)-2-((S)-2-(((S)-1-((S)-2-((S)-2-乙醯胺-3-(1H-吲哚-3-基)丙醯胺)-3-(第三丁基二硫烷基)丙醯基)吡咯烷-2-羰基)氧基)丙醯胺)丙酸(Ac-Trp-D-Cys(StBu)-Pro-Lac-Ala-OH)(化合物SP654)(3.0mg、4.4μmol、22%)。
LCMS(ESI)m/z=678(M+H)+
保持時間：0.86分(分析條件SQDAA05)
5-2.於轉譯用PURESYSTEM中之5個殘基的示範化合物之反應性評價
評價於各pH之安定性(第1次之環化反應中不反應而穩定為理想)及使pH提高之情形之反應選擇性(以與巰基乙胺之反應確認)。
轉譯用PURESYSTEM中，於pH 7.3，5個殘基之示範化合物與2-胺基乙烷硫醇之反應性確認
評價於各pH之安定性(第1次之環化反應中希望不反應而穩定存在。)及使pH提高之情形之反應選擇性(以與2-胺基乙烷硫醇之反應確認)。
將10mM Ac-Trp-Cys(StBu)-Pro-RRR-Ala-OH/25%DMA水溶液(2.0μL)、10mM2,4-二甲基苯甲酸/25%DMA水溶液(2.0μL、作為內部標準使用)、100mMTCEP/50mMHEPES緩衝液溶液(pH7.6、2.0μL)混合，於氮氣氛圍下，於室溫靜置1小時。然後，將轉譯用緩衝液(3.8μL)、PURESYSTEM(r)classic II Sol.B(BIOCOMBER公司、產品編號PURE2048C)(4.0μL)、50mM 1,2-二硫陸圜(dithiane)-4,5-二醇水溶液(4.2μL)、500mM2-胺基乙烷硫醇 /50mMHEPES緩衝液溶液(pH7.6、2.0μL)混合，於氮氣氛圍下，於37度靜置。又，轉譯用緩衝液之成分在反應溶液中之濃度分別如下。2mM GTP，2mM ATP，1mM CTP，1mM UTP，20mM肌酸磷酸，50mM HEPES-KOH pH7.6，100mM乙酸鉀，14mM乙酸鎂，2mM亞精胺(spermidine)，1mM二硫蘇糖醇，0.5mg/ml E.coli MRE600(RNase陰性)來源tRNA(Roche公司)，胺基酸(Ala,Cys,Phe,Gly,His,Ile,Leu,Met,Pro,Ser,Thr,Val,Trp各為0.3mM)。反應之進行狀況以LCMS測定確認。又，RRR代表HOGly、Lac、PhLac、D-PhLac、HOGly(Me)2中之任意者。
Figure 107130626-A0101-12-0873-1026
 (8h之產率/24h之產率)，產率為LC之UV面積比
上述表中，基質，顯示在5個殘基之示範Ac-Trp-Cys-Pro-RRR-Ala-OH當中代表中核之Cys-Pro-RRR部位(也記載一部分Cys替換為使用D-Cys，及Pro替換為使用MeGly之例)。基質回收，係定為：Ac-Trp-Cys-Pro-RRR-Ala-OH與、Cys部位與係反應劑之2-巰基乙胺以雙硫鍵結成 Ac-Trp-Cys(SCH2CH2NH2)-Pro-RRR-Ala-OH、及Cys部位與含於反應系中之推定為二硫蘇糖醇(DTT)之脫水體的1,4-二巰基丁烷-2-酮以雙硫鍵結而得之Ac-Trp-Cys(SCH2COCH2CH2SH)-Pro-RRR-Ala-OH或Ac-Trp-Cys(SCH2CH2COCH2SH)-Pro-RRR-Ala-OH之比例之合計。亦即，係維持主鏈之基本骨架的化合物群之合計。相本反應，係從5個殘基示範產生硫酯，結果，與2-巰基乙胺反應而得之Ac-Trp-NHCH2CH2SH、及其與反應劑2-巰基乙胺以雙硫鍵而得之Ac-Trp-NHCH2CH2SSCH2CH2NH2之比例之合計。直接醯胺化，係顯示副反應獲得之Ac-Trp-Cys-Pro-NHCH2CH2SH、與Ac-Trp-Cys*-Pro-NHCH2CH2S*中以＊予以雙硫鍵成環之產物、及Ac-Trp-Cys(SCH2CH2NH2)-Pro-NHCH2CH2SSCH2CH2NH2之合計之比例。水解，係顯示從5個殘基示範產生之硫酯不與2-巰基乙胺反應，代之與水反應而獲得之Ac-Trp-OH之比例。
因此，於假定以指定之pH實施第1次之環化反應之情形，希望基質回收比例愈高愈理想。又，於假定以指定之pH實施第2次之環化反應之情形，希望相本反應之比例愈高愈理想。
又，針對表13之entry 6及7，由於峰部彼此的保持時間重疊，未計算出UV面積比，但各化合物群之質量強度比(陰性模式)如下。
Entry 6
(8小時)基質回收：27% 相本反應：39% 直接醯胺化：33% 水解：0%
(24小時)基質回收：13% 相本反應：31% 直接醯胺化：56% 水解：0%
Entry 7
(8小時)基質回收：12% 相本反應：50% 直接醯胺化：38% 水解：0%
(24小時)基質回收：0% 相本反應：50% 直接醯胺化：50% 水解：0%
轉譯用PURESYSTEM中，於pH 7.8之5個殘基示範化合物與2-胺基乙烷硫醇之反應性確認
使10mM Ac-Trp-Cys(StBu)-Pro-RRR-Ala-OH/25%DMA水溶液(5.0μL)、10mM4-戊基苯甲酸/25%DMA水溶液(5.0μL、作為內部標準使用)、100mMTCEP/50mMHEPES緩衝液溶液(pH7.6、5.0μL)混合，快速將半胱胺酸殘基側鏈保護基予以脫保護，於氮氣氛圍下，於室溫靜置1小時。然後，將轉譯用緩衝液(9.5μL)、PURESYSTEM(註冊商標)classic II Sol.B(BIOCOMBER公司、產品編號PURE2048C)(10μL)、50mM 1,2-二硫陸圜-4,5-二醇水溶液(10.5μL)、500mM2-胺基乙烷硫醇/50mMHEPES緩衝液溶液(pH7.6、5.0μL)混合，再混合1N氫氧化鈉水溶液(1.0μL)，將反應液調整為pH7.8，於氮氣氛圍下於37度靜置。又，轉譯用緩衝液之成分在反應溶液中的濃度各如下。2mM GTP，2mM ATP，1mM CTP，1mM UTP，20mM肌酸磷酸，50mM HEPES-KOH pH7.6，100mM乙酸鉀，14mM乙酸鎂，2mM亞精胺(spermidine)，1mM二硫蘇糖醇，0.5mg/ml E.coli MRE600(RNase陰性)來源 tRNA(Roche公司)，胺基酸(Ala,Cys,Phe,Gly,His,Ile,Leu,Met,Pro,Ser,Thr,Val,Trp各為0.3mM)。反應之進行狀況以LCMS測定確認。
Figure 107130626-A0101-12-0876-1027
 (8h之產率/27h之產率)，產率為LC之UV面積比
如實施例所示，使用Cys-Pro-HOGly之情形，第1次之環化使用Cys與Asp(SBn)之情形係高選擇的。但是，從本結果可明白：在第1次之環化使用之pH=7.8附近，Cys-Pro-HOGly具有反應性，於此條件仍不會安定存在，而會產生硫酯(可解釋為：於使用具有反應輔助基之胺基之情形，第1次之環化反應十分快速，所以結果會具有反應選擇性。)。可明白：為了獲得於第1次之反應中不反應、在第2次之反應時方開始產生硫酯之狀態，提高Cys-Pro-Lac等較靠近酯之立體障礙於獲得提高選擇性之目的較理想。
Buffer中，於pH 8.5之5個殘基示範化合物與2-胺基乙烷硫醇之反應性確認
使10mM Ac-Trp-Cys(StBu)-Pro-RRR-Ala-OH/25%DMA水溶液(5.0μL)、10mM4-戊基苯甲酸/25%DMA水溶液(5.0μL、作為內部標準使用)、100mMTCEP/50mMHEPES緩衝液溶液(pH7.8、5.0μL)混合，快速將半胱胺酸殘基側鏈保護基予以脫保護，於氮氣氛圍下，於室溫靜置1小時。然後，將100mMBicine 緩衝液(pH8.9、19.5μL)、50mM 1,2-二硫陸圜-4,5-二醇/100mMBicine緩衝液溶液(pH8.9、10.5μL)、500mM2-胺基乙烷硫醇/100mMBicine緩衝液溶液(pH8.5、5.0μL)混合，再混合0.5N氫氧化鈉水溶液(1.0μL)，將反應液調整為pH8.5，於氮氣氛圍下，於37度或57度靜置。反應之進行狀況以LCMS測定確認。
Figure 107130626-A0101-12-0877-1028
 產率為LC之UV面積比
Figure 107130626-A0101-12-0877-1029
 產率為LC之UV面積比
可明白：Cys-Pro-Lac或Cys-Pro-PhLac等，於使pH上升到8.5之情形，方會選擇性地產生硫酯，且理想之反應在轉譯液中相對水解會選擇性的進行。於pH為7.8附近不使反應進行，可於8.5使理想之反應進行。
Buffer中，於pH 9.0之5個殘基示範化合物與2-胺基乙烷硫醇之反應性確認
使10mM Ac-Trp-Cys(StBu)-Pro-RRR-Ala-OH/25%DMA 水溶液(5.0μL)、10mM4-戊基苯甲酸/25%DMA水溶液(5.0μL、作為內部標準使用)、100mMTCEP/50mMHEPES緩衝液溶液(pH7.8、5.0μL)混合，將半胱胺酸殘基側鏈保護基予以快速脫保護，於氮氣氛圍下，於室溫靜置1小時。然後，將100mMBicine緩衝液(pH8.9、19.5μL)、50mM 1,2-二硫陸圜-4,5-二醇/100mMBicine緩衝液溶液(pH8.9、10.5μL)、500mM2-胺基乙烷硫醇/100mMBicine緩衝液溶液(pH8.5、5.0μL)混合，再混合0.5N氫氧化鈉水溶液(2.0μL)，將反應液調整為pH9.0，於氮氣氛圍下，於37度或57度靜置。反應之進行狀況以LCMS測定確認。
Figure 107130626-A0101-12-0878-1030
 產率為LC之UV面積比
Figure 107130626-A0101-12-0878-1031
 產率為LC之UV面積比
即使於pH9.0，RNA仍安定存在而不分解也已於實施例記載，因此顯示若採用本條件，胜肽-RNA複合體也能為理想之分支化。
5-3.於第1次之環化使用具反應輔助基之位於N末 端之三角單元與C末端側之活性硫酯(交叉單元)之醯胺化反應，以第2次之分支化使具反應輔助基之保護胺基進行脫保護反應後從Cys-Pro-Lac產生活性酯，並與側鏈胺基反應而使分支之例之化學反應條件之設定
5-3-1.轉譯胜肽示範化合物SP655之合成
依以下流程，在第1次之環化使用N末端為Cys、C末端側為Asp(SBn)進行醯胺化環化反應，作為第2次之分支化，為了實施作為活性硫酯產生部分具有Cys-Pro-Lac，且於Lys之側鏈胺基配置保護N原子與S原子之Cys之化合物之S原子與N原子予以脫保護並進行醯胺化反應之例，進行以下示範化合物SP655之合成。
Figure 107130626-A0101-12-0879-1032
(S)-3-((S)-2-((S)-2-((S)-1-((6R,12S,15S,18R)-15-((1H-吲哚-3-基)甲基)-6-((4-疊氮化苄氧基)羰胺基)-18-((第三丁基二硫烷基)甲基)-12-(4-(二甲胺基)丁基)-2,2-二甲基-7,10,13,16-四側氧基-3,4-二硫雜-8,11,14,17-四氮雜十九烷)吡咯烷-2-羰氧基)丙醯胺)-6-((R)-3-((4-疊氮化苄氧基)羰基)噻唑 烷-4-羧醯胺)己烷醯胺)-4-((S)-2-胺甲醯基吡咯烷-1-基)-4-側氧基丁酸(化合物SP681、Acbz-Cys(StBu)-Gly-Lys(Me2)-Trp-Cys(StBu)-Pro-Lac-Lys(Acbz-Thz)-Asp-Pro-NH2)之合成
本說明書中，將Lys之側鏈之胺基與Acbz-Thz具有之羧基予以醯胺鍵結而得之化合物，表示記載為Lys(Acbz-Thz)。
Figure 107130626-A0101-12-0880-1033
依已於實施例記載之自動合成機，依主鏈含酯基之胜肽之固相合成一般法實施胜肽鏈之伸長。樹脂，使用Sieber Amide Resin(每1管柱160mg、從Novabiochem購買)。N末端之胺基酸使用Acbz-Cys(StBu)-OH、Fmoc胺基酸使用Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Me2)-OH‧HCl、Fmoc-Trp-Cys(StBu)-OH(化合物SP602)、Fmoc-Pro-Lac-OH(化合物SP633)、Fmoc-Lys(Acbz-Thz)-OH(化合物SP611)、Fmoc-Asp(OPis)-OH、Fmoc-Pro-OH，實施胜肽之伸長。
胜肽之伸長後，將樹脂以二甲基甲醯胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)洗滌。於樹脂加入2%三氟乙酸(TFA)之二氯甲烷(DCM)/2,2,2-三氟乙醇(TFE)(=1/1、v/v、4.0ml)溶液，於室溫反應3小時，進行從樹脂切出胜肽。反應結束後，將管內溶液 以合成用管柱過濾以將樹脂除去，將樹脂以二氯甲烷(DCM)/2,2,2-三氟乙醇(TFE)(=1/1，v/v、4.0mL)洗滌4次。將獲得之溶液減壓濃縮，將殘渣以逆相矽膠層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)精製，獲得(S)-3-((S)-2-((S)-2-((S)-1-((6R,12S,15S,18R)-15-((1H-吲哚-3-基)甲基)-6-((4-疊氮化苄氧基)羰胺基)-18-((第三丁基二硫烷基)甲基)-12-(4-(二甲胺基)丁基)-2,2-二甲基-7,10,13,16-四側氧基-3,4-二硫雜-8,11,14,17-四氮雜十九烷)吡咯烷-2-羰氧基)丙醯胺)-6-((R)-3-((4-疊氮化苄氧基)羰基)噻唑烷-4-羧醯胺)己烷醯胺)-4-((S)-2-胺甲醯基吡咯烷-1-基)-4-側氧基丁酸(Acbz-Cys(StBu)-Gly-Lys(Me2)-Trp-Cys(StBu)-Pro-Lac-Lys(Acbz-Thz)-Asp-Pro-NH2)(化合物SP681)(184.6mg、24%)。
LCMS(ESI)m/z=1773.9(M+H)+
保持時間：0.76分(分析條件SQDFA05)
4-(((S)-5-((S)-2-(((S)-1-((6R，12S，15S，18R)-15-((1H-吲哚-3-基)甲基)-6-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-18-((第三丁基二硫烷基)甲基)-12-(4-(二甲胺基)丁基)-2,2-二甲基-7,10,13,16-四側氧基-3,4-二硫雜-8,11,14，17-四氮雜十九烷-19-醯基)吡咯烷-2-羰基)氧基)丙醯胺)-6-(((S)-4-(苄硫基)-1-((S)-2-胺甲醯基吡咯烷-1-基)-1,4-二側氧基丁烷-2-基)胺基)-6-側氧基己基)胺甲醯基)噻唑烷-3-羧酸(R)-4-疊氮化苄酯(化合物SP655、Acbz-Cys(StBu)-Gly-Lys(Me2)-Trp-Cys(StBu)-Pro-Lac-Lys(Acbz-Thz)-Asp(SBn)-Pro-NH2)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0882-1034
將(S)-3-((S)-2-((S)-2-((S)-1-((6R,12S,15S,18R)-15-((1H-吲哚-3-基)甲基)-6-((4-疊氮化苄氧基)羰胺基)-18-((第三丁基二硫烷基)甲基)-12-(4-(二甲胺基)丁基)-2,2-二甲基-7,10,13,16-四側氧基-3,4-二硫雜-8,11,14,17-四氮雜十九烷)吡咯烷-2-羰氧基)丙醯胺)-6-((R)-3-((4-疊氮化苄氧基)羰基)噻唑烷-4-羧醯胺)己烷醯胺)-4-((S)-2-胺甲醯基吡咯烷-1-基)-4-側氧基丁酸(化合物SP681、Acbz-Cys(StBu)-Gly-Lys(Me2)-Trp-Cys(StBu)-Pro-Lac-Lys(Acbz-Thz)-Asp-Pro-NH2)(102mg，0.057mmol)與HOBt(23.2mg，0.172mmol)之DMF(0.6ml)溶液冷卻至0度後，加入1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二醯亞胺鹽酸鹽(EDC‧HCl、32.9mg、0.172mmol)，攪拌5分鐘後加入苄基硫醇(34μl，0.286mmol)。將反應液於室溫攪拌70分鐘，將反應液以逆相矽膠管柱層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)精製，獲得標題化合物(化合物SP655、Acbz-Cys(StBu)-Gly-Lys(Me2)-Trp-Cys(StBu)-Pro-Lac-Lys(Acbz-Thz)-Asp(SBn)-Pro-NH2)(75.7mg、70%)。
LCMS(ESI)m/z=1880.0(M+H)+
保持時間：0.80分(分析條件SQDFA05)
5-4.轉譯用PURESYSTEM中，使用序列具有Cys-Pro-Lac之直鏈示範胜肽、利用NCL反應進行環化及接續進行分支形成反應
已明白Cys-Pro-Lac單元中，在第1次之環化反應中，無論反應輔助基之有無，均能安定存在，且於第2次之分支化反應可以高選擇性實現理想之分支化反應，以示範胜肽將分支化反應於轉譯液中確認。
第1階段：利用NCL反應所為之直鏈示範胜肽(化合物SP655、Acbz-Cys(StBu)-Gly-Lys(Me2)-Trp-Cys(StBu)-Pro-Lac-Lys(Acbz-Thz)-Asp(SBn)-Pro-NH2)之環化所為之化合物SP656之生成反應
Figure 107130626-A0101-12-0883-1035
將54mM4-(((S)-5-((S)-2-(((S)-1-((6R，12S，15S， 18R)-15-((1H-吲哚-3-基)甲基)-6-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-18-((第三丁基二硫烷基)甲基)-12-(4-(二甲胺基)丁基)-2,2-二甲基-7,10,13,16-四側氧基-3,4-二硫雜-8,11,14，17-四氮雜十九烷-19-醯基)吡咯烷-2-羰基)氧基)丙醯胺)-6-(((S)-4-(苄硫基)-1-((S)-2-胺甲醯基吡咯烷-1-基)-1,4-二側氧基丁烷-2-基)胺基)-6-側氧基己基)胺甲醯基)噻唑烷-3-羧酸(R)-4-疊氮化苄基(化合物SP655、Acbz-Cys(StBu)-Gly-Lys(Me2)-Trp-Cys(StBu)-Pro-Lac-Lys(Acbz-Thz)-Asp(SBn)-Pro-NH2)/DMA溶液(9.4μL)、54mM 2,4-二甲基苯甲酸/DMA溶液(9.4μL、作為內部標準使用)、轉譯用緩衝液(6.3μL)、PURESYSTEM(註冊商標)classic II Sol.B(BIOCOMBER公司、產品編號PURE2048C)(10μL)、20種天然胺基酸溶液(2.5μL)、1.0M TCEP(12.5μL、pH7.5)混合，於25度靜置2小時。又，轉譯用緩衝液之成分為8mM GTP，8mM ATP，160mM肌酸磷酸，400mM HEPES-KOH pH7.6，800mM乙酸鉀，48mM乙酸鎂，16mM亞精胺(spermidine)，8mM二硫蘇糖醇，0.8mM 10-HCO-H4folate,12mg/ml E.coli MRE600(RNase陰性)來源tRNA(Roche公司)。將反應溶液進行LCMS測定，確認生成目的之環化體(R)-N-(4-((3S，6S，9S，13R，19S，22S，25R，30aS)-22-((1H-吲哚-3-基)甲基)-9-((S)-2-胺甲醯基吡咯烷-1-羰基)-19-(4-(二甲胺基)丁基)-13,25-雙(巰基甲基)-3-甲基-1,4,7,11,14,17,20,23,26-九側氧基二十八氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4,7,10,13,16,19,23,26]氧雜八氮雜環二十八炔-6-基)丁基)噻唑烷-4-羧醯胺(化合物 SP656、*Cys-Gly-Lys(Me2)-Trp-Cys-Pro-Lac-Lys(Thz)-Asp*-Pro-NH2中，以*成環之化合物)。(圖66)
LCMS(ESI)m/z=1227(M-H)-
保持時間：0.76分(分析條件SQDAA05)
第2階段：化合物SP656之利用Thz之脫保護反應所為之化合物SP657之生成反應
Figure 107130626-A0101-12-0885-1036
混合以NCL環化而得之化合物SP656之反應混合物(上面的反應混合物、25μL)、DMA(25μL)、6.7M 1,2-二(吡啶-2-基)二硫化二氫/DMA溶液(15μL)，將以5N鹽酸調整為pH3.8之混合物於37度靜置15小時。然後取出反應混合物之中的25μL，混合1.25M TCEP水溶液(50μL、pH7.5)，於25度靜置3小時。將反應溶液進行LCMS測定，確認生成Thz部 位經脫保護之化合物、(S)-1-((3S，6S，9S，13R，19S，22S，25R，30aS)-22-((1H-吲哚-3-基)甲基)-6-(4-((R)-2-胺基-3-巰基丙醯胺)丁基)-19-(4-(二甲胺基)丁基)-13,25-雙(巰基甲基)-3-甲基-1,4,7,11,14,17,20,23,26-九側氧基二十八氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4,7,10,13,16,19,23,26]氧雜八氮雜環二十八炔-9-羰基)吡咯烷-2-羧醯胺(化合物SP657、*Cys-Gly-Lys(Me2)-Trp-Cys-Pro-Lac-Lys(H-Cys)-Asp*-Pro-NH2，且於*成環之化合物)。
LCMS(ESI)m/z=1215(M-H)-(圖67)
保持時間：0.73分(分析條件SQDAA05)
第3階段：化合物SP657環狀胜肽之分支形成反應所為之化合物SP658之生成反應
Figure 107130626-A0101-12-0886-1037
進行Thz之脫保護，混合二硫醚已還原之化合物SP657之反應混合物(上面的反應混合物、25μL)與2.0M Bicine緩衝液(pH8.7、30μL)，以5N氫氧化鈉水溶液調整為pH9.5，將反應溶液於37度靜置4小時。將反應溶液進行LCMS測定，確認於環狀胜肽形成有分支之(S)-1-((3R，6S，9S，15R，19S，22S)-6-((1H-吲哚-3-基)甲基)-9-(4-(二甲胺基)丁基)-22-((S)-2-羥基丙醯胺)-3,15-雙(巰基甲基)-2,5,8,11,14,17,21-七側氧基-1,4,7,10,13,16,20-七氮雜環二十六烷-19-羰基)吡咯烷-2-羧醯胺(化合物SP658、H-Lac-Lys(*Cys-Gly-Lys(Me2)-Trp-Cys)-Asp*-Pro-NH2，且於＊成環之化合物)之生成。
LCMS(ESI)m/z=1017(M+H)+
保持時間：0.65分(分析條件SQDAA05)(圖68)
6.假定第1次之環化已結束，且於第2次之分支化使從Cys-Pro-HOGly產生活性酯、且使保護胺基脫保護而使分支之例之實施。
為了證明第2次之分支化之概念之另一實驗。假定第1次之環化已結束。因此，不實施Asp之側鏈之羧酸與N末端之胺基所為之醯胺環化，並定為主鏈經環化之示範化合物。以下列方式，實施於第2次之分支化使從Cys-Pro-HOGly產生活性酯，將其前後保護之胺予以脫保護而分支化之示範反應性。
6-1.轉譯胜肽示範化合物SP662之合成
依以下流程合成。
Figure 107130626-A0101-12-0888-1038
(5S,8R)-5-苄基-1-(9H-茀-9-基)-12,12-二甲基-3,6-二側氧基-2-氧雜-10,11-二硫雜-4,7-二氮雜十三烷-8-羧酸(化合物SP663、Fmoc-Phe-Cys(StBu)-OH)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0888-2282
將Fmoc-Phe-OH(4g、10.32mmol)與N-羥基琥珀醯亞胺(1.19g、10.32mmol)之二氯甲烷(20ml)溶液冷卻至0度後，加入1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二醯亞胺鹽酸鹽(EDC‧HCl、1.98g、10.32mmol)，將反應液於室溫攪拌6小時。反應液冷卻至0度後，加入N,N-二異丙基乙胺(1.80ml、10.23mmol)與S-(t-丁硫基)-L-半胱胺酸(H-Cys(StBu)-OH)(2.16g、10.32mmol)，將反應液於室溫攪拌12小時。於反應混合物加入乙酸乙酯與2M鹽酸，以乙酸乙酯萃取。將有機層以25wt%食鹽水洗滌，以硫酸鈉乾燥。將獲得之溶液減壓濃縮，將濃縮 殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)精製，獲得(5S,8R)-5-苄基-1-(9H-茀-9-基)-12,12-二甲基-3,6-二側氧基-2-氧雜-10,11-二硫雜-4,7-二氮雜十三烷-8-羧酸(化合物SP663、Fmoc-Phe-Cys(StBu)-OH)(4.22g、71%)。
LCMS(ESI)m/z=579(M+H)+
保持時間：0.97分(分析條件SQD FA05)
(6S,9S,12S,15S,18S,21S,24S,27S,30S,33S,36R,41aS)-9-(4-疊氮化物丁基)-6,24,33-三苄基-36-((第三丁基二硫烷基)甲基)-12,18-二異丁基-14,15,17,21,23,26,27,30-八甲基二十六氫吡咯并[2,1-c][1,4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37]氧雜十二氮雜環三十九炔-1,4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37(3H)-十三酮(化合物SP662、c(HOGly-Phe-Lys(N3)-Leu-MeAla-MeLeu-Ala-MePhe-MeAla-Ala-Phe-Cys(StBu)-Pro))之合成
(HOGly代表甘醇酸)
用語之定義
Fmoc-Lys(N3)-OH：(S)-2-(((9H-茀-9-基)甲氧基)羰胺基)-6-疊氮化物己酸
Figure 107130626-A0101-12-0890-1040
Fmoc胺基酸使用Fmoc-MePhe-OH、Fmoc-MeAla-OH、Fmoc-MeLeu-OH、Fmoc-Lys(N3)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Phe-Cys(StBu)-OH(化合物SP663)，實施胜肽之伸長。胜肽之伸長後，將N末端之Fmoc基脫保護，以HOAt，DIC作為縮合劑使氯乙酸縮合後，將樹脂以DMF，二氯甲烷洗滌。於樹脂加入二氯甲烷/2,2,2-三氟乙醇(=1/1，v/v、4mL)，使反應1小時，進行從樹脂切出胜肽。反應結束後，將管內溶液以合成用管柱過濾以將樹脂除去，並將樹脂以二氯甲烷/2,2,2-三氟乙醇(=1/1，v/v、1mL)洗滌。將獲得之溶液減壓濃縮，獲得粗產物((S)-1-((2R,5S,8S,11S,14S,17S,20S,23S,26S,29S,32S)-29-(4-疊氮化物丁基)-5,14,32-三苄基-2-((第三丁基二硫烷基)甲基)-35-氯-20,26-二異丁基-8,11,12,15,17,21,23,24-八甲基-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34-十一側氧基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十一氮雜三十五烷)吡咯烷-2- 羧酸(ClAc-Phe-Lys(N3)-Leu-MeAla-MeLeu-Ala-MePhe-MeAla-Ala-Phe-Cys(StBu)-Pro)(419mg)。於獲得之粗產物(ClAc-Phe-Lys(N3)-Leu-MeAla-MeLeu-Ala-MePhe-MeAla-Ala-Phe-Cys(StBu)-Pro)(419mg，0.271mmol)與碘化鈉(102mg，0.678mmol)之DMF(20ml)、THF(20ml)溶液中，於氮氣氛圍下加入碳酸鉀(56.2mg、0.407mmol)，將反應液於40度攪拌5.5小時。將反應液減壓濃縮並將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)精製，獲得標題化合物(化合物SP662、158mg、39%)。
LCMS(ESI)m/z=1509(M+H)+
保持時間：0.63分(分析條件SQD FA50)
6-2.從轉譯示範胜肽之分子內分支胜肽生成反應(S)-N-((3S,6S,9S,12S,15S,18S,21S,24S,27S)-3,12-二苄基-18,24-二異丁基-6,9,10,13,15,19,21,22-八甲基-2,5,8,11,14,17,20,23,26-九側氧基-1,4,7,10,13,16,19,22,25-九氮雜環三十一烷-27-基)-2-(2-羥基乙醯胺)-3-苯基丙醯胺(化合物SP664)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0892-1041
緩衝溶液中之分子內分支胜肽生成反應
於0.5M HEPES緩衝液(pH7.0、60μl)與1,3-二甲基-2-四氫咪唑酮(DMI)(40μl)之混合溶液中，加入TCEP鹽酸鹽(參(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽)(2.9mg、0.010mmol)、2-(4-巰基苯基)乙酸(1.7mg、0.010mmol)。再於該溶液中加入2N氫氧化鈉水溶液(35μl)與水(45μl)，調整為pH8.5，於室溫攪拌5分鐘。之後，加入(6S,9S,12S,15S,18S,21S,24S,27S,30S,33S,36R,41aS)-9-(4-疊氮化物丁基)-6,24,33-三苄基-36-((第三丁基二硫烷基)甲基)-12,18-二異丁基-14,15,17,21,23,26,27,30-八甲基二十六氫吡咯并[2,1-c][1,4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37]氧雜十二氮雜環三十九炔-1,4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37(3H)-十三酮(c(HOGly-Phe-Lys(N3)-Leu-MeAla-MeLeu-Ala-MePhe-MeAla-Ala-Phe-Cys(StBu)-Pro))(化合物SP662)之0.01M 1,3-二甲基 -2-四氫咪唑酮(DMI)溶液(20μl、0.2μmol)，將反應液於30℃攪拌24小時。使用LCMS觀測反應之變化，於24小時確認(S)-N-((3S,6S,9S,12S,15S,18S,21S,24S,27S)-3,12-二苄基-18,24-二異丁基-6,9,10,13,15,19,21,22-八甲基-2,5,8,11,14,17,20,23,26-九側氧基-1,4,7,10,13,16,19,22,25-九氮雜環三十一烷-27-基)-2-(2-羥基乙醯胺)-3-苯基丙醯胺(化合物SP664)生成。水解物與化合物SP664之生成比為，以LCMS之UV面積比計，為12：88。(圖69、水解化合物 保持時間：0.62分)
LCMS(ESI)m/z=1195(M+H)+
保持時間：0.77分(分析條件SQD FA05)
7.假定第1次之環化反應結束後，於第2次之分支化使從具反應輔助基之酯直接產生活性酯，且將(保護)胺基利用醯胺化反應使分支之例之實施。
為了證明概念之另一實驗。假定第1次之環化反應結束後。因此不將Asp之側鏈羧酸與N末端胺環化，而使C末端Ala之羧酸與N末端胺予以醯胺環化。用於第2次之分支化之胺基之保護基，也假設不在展示庫使用。係為了證明確認從具反應輔助基之酯會進行分支化反應之概念的示範實驗。
7-1.轉譯胜肽示範化合物(化合物665)之合成
依以下流程合成。
Figure 107130626-A0101-12-0894-1099
3-(第三丁基二硫烷基)-2-羥基丙酸(化合物SP666、H-tBuSSlac-OH)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0895-2283
於依照文獻習知法(J.Am.Chem.Soc.2008，130，4919.)製備之2-(第三丁基二甲基矽氧基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(化合物24)(30.0mg、0.092mmol)之四氫呋喃(THF)溶液(300μl)中，於室溫加入1N鹽酸水溶液(300μl)，於60度攪拌16小時。將反應液以逆相矽膠層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)精製，獲得3-(第三丁基二硫烷基)-2-羥基丙酸(H-tBuSSlac-OH)(化合物SP666)(7.4mg、54%)。
又，本說明書中，將化合物SP666之羥基上之氫原子與羧酸上之羥基已去除之2價之結構，定為tBuSSlac。
LCMS(ESI)m/z=209(M-H)-
保持時間：0.60分(分析條件SQDFA05)
2-(((S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-苯基丙醯基)氧基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(Fmoc-Phe-tBuSSlac-OH)(化合物SP667)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0895-1101
於氮氣氛圍下，於(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-苯基丙酸(Fmoc-Phe-OH)(500mg、1.29mmol)與N- 羥基琥珀醯亞胺(HOSu)(149mg、1.29mmol)之二甲基甲醯胺(DMF)溶液(4.5ml)，於室溫加入1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二醯亞胺鹽酸鹽(EDCI‧HCl)(247mg、1.29mmol)，於同溫度攪拌18小時。於反應液(1.7ml)中，於室溫加入3-(第三丁基二硫烷基)-2-羥基丙酸(化合物SP666)(100mg、0.475mmol)與4-二甲胺基吡啶(DMAP)(58.1mg、0.475mmol)，於同溫度攪拌5小時。於反應液加入甲酸(18μl)，以逆相矽膠層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)精製，獲得2-(((S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-苯基丙醯基)氧基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(Fmoc-Phe-tBuSSlac-OH)(化合物SP667)(110mg、40%)。
LCMS(ESI)m/z=580.5(M+H)+
保持時間：1.05分(分析條件SQDFA05)
(5S，11S，14S，17S，20S，23S，26S，29S，32S，35S)-14-(4-((R)-2-(((烯丙氧基)羰基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙醯胺)丁基)-5,11,29-三苄基-8-((第三丁基二硫烷基)甲基)-1-(9H-茀-9-基)-17,23-二異丁基-19,20,22,26,28,31,32,35-八甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十一側氧基-2,7-二氧雜-4,10,13,16,19,22,25,28,31,34-十氮雜三十六烷-36-酸(Fmoc-Phe-tBuSSlac-Phe-Lys(Alloc-Cys(StBu))-Leu-MeAla-MeLeu-Ala-MePhe-MeAla-Ala-OH)(化合物SP668)之合成
又，本說明書中，與其他例同樣將H-Lys-OH之側鏈胺基與Alloc-Cys(StBu)-OH之羧基經醯胺鍵結之化合物，記載為H-Lys(Alloc-Cys(StBu))-OH。
Figure 107130626-A0101-12-0897-1102
依已於實施例記載之Fmoc法所為之胜肽合成法，實施胜肽鏈之伸長，合成H-Phe-Lys(Alloc-Cys(StBu))-Leu-MeAla-MeLeu-Ala-MePhe-MeAla-Ala-OH(化合物SP669)。樹脂使用Cl-Trt(2-Cl)-Resin(100~200Mesh，1% DVB，從渡邊化學購買)。Fmoc胺基酸使用Fmoc-Ala-OH、Fmoc-MeAla-OH、Fmoc-MePhe-OH、Fmoc-MeLeu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Alloc-Cys(StBu))-OH(化合物150a)、Fmoc-Phe-OH。胜肽之伸長後，將N末端之Fmoc基以20%哌啶之二甲基甲醯胺(DMF)溶液(4.0ml)脫保護，將樹脂以二甲基甲醯胺(DMF)洗滌。於樹脂加入二氯甲烷(DCM)/2,2,2-三氟乙醇(TFE)(=1/1、v/v、4.0ml)，使反應1小時，進行從樹脂切出胜肽。反應結束後，將管內溶液以合成用管柱過濾以將樹脂除去，將樹脂以二氯甲烷(DCM)/2,2,2-三氟乙醇(TFE)(=1/1，v/v、1mL)洗滌4次。將獲得之溶液減壓濃縮，獲得作為粗產物之(2S，5S，8S，11S，14S，17S，20S，23S，30R)-23-((S)-2-胺基-3-苯基丙醯胺)-8-苄基-30-((第三丁基二硫烷基)甲基)-14，20-二異丁基-2,5,6,9,11,15,17,18-八甲基-4,7,10,13,16,19,22,29,32-九側氧基-33-氧雜-3,6,9,12,15,18,21,28,31-九氮雜三十六-35-烯-1-酸(H-Phe-Lys(Alloc-Cys(StBu))-Leu-MeAla-MeLeu-Ala-MePhe-M eAla-Ala-OH)(化合物SP669)(71.0mg)。
於氮氣氛圍下，於2-(((S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-苯基丙醯基)氧基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(Fmoc-Phe-tBuSSlac-OH)(化合物SP667)(10.0mg、17μmol)與N-羥基琥珀醯亞胺(HOSu)(1.99mg、17μmol)之二甲基甲醯胺(DMF)溶液(100μl)，於室溫加入1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二醯亞胺鹽酸鹽(EDCI‧HCl)(3.31mg、17μmol)，於同溫度攪拌15小時。於反應液中，於室溫加入(2S，5S，8S，11S，14S，17S，20S，23S，30R)-23-((S)-2-胺基-3-苯基丙醯胺)-8-苄基-30-((第三丁基二硫烷基)甲基)-14，20-二異丁基-2,5,6,9,11,15,17,18-八甲基-4,7,10,13,16,19,22,29,32-九側氧基-33-氧雜-3,6,9,12,15,18,21,28,31-九氮雜三十六-35-烯-1-酸(H-Phe-Lys(Alloc-Cys(StBu))-Leu-MeAla-MeLeu-Ala-MePhe-MeAla-Ala-OH)(化合物SP669)(22.1mg)之二甲基甲醯胺(DMF)溶液(220μl)與二異丙基乙胺(DIPEA)(3.01μl、17μmol)，於30度攪拌3小時30分。
將反應液以逆相矽膠層析(10mM乙酸銨水溶液/甲醇)精製，獲得(5S，11S，14S，17S，20S，23S，26S，29S，32S，35S)-14-(4-((R)-2-(((烯丙氧基)羰基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙醯胺)丁基)-5,11,29-三苄基-8-((第三丁基二硫烷基)甲基)-1-(9H-茀-9-基)-17,23-二異丁基-19,20,22,26,28,31,32,35-八甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十一側氧基-2,7-二氧雜-4,10,13,16,19,22,25,28,31,34-十氮雜三十六烷-36-酸 (Fmoc-Phe-tBuSSlac-Phe-Lys(Alloc-Cys(StBu))-Leu-MeAla-MeLeu-Ala-MePhe-MeAla-Ala-OH)(化合物SP668)(17.0mg、54%)。
LCMS(ESI)m/z=1844.6(M+H)+
保持時間：0.84分(分析條件SQDAA50)
(9S，12S，15S，18S，21S，24S，27S，30S，33S)-12-(4-((R)-2-(((烯丙氧基)羰基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙醯胺)丁基)-6-(((S)-2-胺基-3-苯基丙醯基)氧基)-9,27-二苄基-15,21-二異丁基-2,2,17,18,20,24,26,29,30,33-十甲基-7,10,13,16,19,22,25,28,31-九側氧基-3,4-二硫雜-8,11,14,17,20,23,26,29,32-九氮雜三十四烷-34-酸(H-Phe-tBuSSlac-Phe-Lys(Alloc-Cys(StBu))-Leu-MeAla-MeLeu-Ala-MePhe-MeAla-Ala-OH)(化合物SP670)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0899-2284
於(5S，11S，14S，17S，20S，23S，26S，29S，32S，35S)-14-(4-((R)-2-(((烯丙氧基)羰基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙醯胺)丁基)-5,11,29-三苄基-8-((第三丁基二硫烷基)甲基)-1-(9H-茀-9-基)-17,23-二異丁基-19,20,22,26,28,31,32,35-八甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十一側氧基-2,7-二氧雜-4,10,13,16,19,22,25,28,31,34-十氮雜三十六烷-36-酸 (Fmoc-Phe-tBuSSlac-Phe-Lys(Alloc-Cys(StBu))-Leu-MeAla-MeLeu-Ala-MePhe-MeAla-Ala-OH)(化合物SP668)(23.0mg、0.012mmol)，於室溫加入5%哌啶之二甲基甲醯胺(DMF)溶液(250μl)，於同溫度攪拌10分鐘。於反應液加入甲酸(5.0μL)，以逆相矽膠層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)精製，定量地獲得(9S，12S，15S，18S，21S，24S，27S，30S，33S)-12-(4-((R)-2-(((烯丙氧基)羰基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙醯胺)丁基)-6-(((S)-2-胺基-3-苯基丙醯基)氧基)-9,27-二苄基-15,21-二異丁基-2,2,17,18,20,24,26,29,30,33-十甲基-7,10,13,16,19,22,25,28,31-九側氧基-3,4-二硫雜-8,11,14,17,20,23,26,29,32-九氮雜三十四烷-34-酸(H-Phe-tBuSSlac-Phe-Lys(Alloc-Cys(StBu))-Leu-MeAla-MeLeu-Ala-MePhe-MeAla-Ala-OH)(化合物SP670)(21.0mg)。
LCMS(ESI)m/z=1622(M+H)+
保持時間：0.30分、0.34分(分析條件SQDFA50)
tBuSSlac部位為光學異構物混合物，故化合物存在非鏡像異構物，觀測到2根峰部。
((2R)-3-(第三丁基二硫烷基)-1-側氧基-1-((4-((5S，8S，11S，14S，17S，20S，23S，26S，29S，32S)-5,23,32-三苄基-2-((第三丁基二硫烷基)甲基)-11,17-二異丁基-13,14,16,20,22,25,26,29-八甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十一側氧基-1-氧雜-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-十氮雜環三-三十烷-8-基)丁基)胺基)丙烷-2-基)胺甲酸烯丙酯(＊ Phe-tBuSSlac-Phe-Lys(Alloc-Cys(StBu))-Leu-MeAla-MeLeu-Ala-MePhe-MeAla-Ala＊、於2個＊部位環化)(化合物SP671)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0901-1104
於(9S，12S，15S，18S，21S，24S，27S，30S，33S)-12-(4-((R)-2-(((烯丙氧基)羰基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙醯胺)丁基)-6-(((S)-2-胺基-3-苯基丙醯基)氧基)-9,27-二苄基-15,21-二異丁基-2,2,17,18,20,24,26,29,30,33-十甲基-7,10,13,16,19,22,25,28,31-九側氧基-3,4-二硫雜-8,11,14,17,20,23,26,29,32-九氮雜三十四烷-34-酸(H-Phe-tBuSSlac-Phe-Lys(Alloc-Cys(StBu))-Leu-MeAla-MeLeu-Ala-MePhe-MeAla-Ala-OH)(化合物SP670)(1.2mg、0.74μmmol)之二甲基甲醯胺(DMF)/二氯甲烷(DCM)(=4/1、v/v、800μl)溶液中，於室溫加入O-(7-氮雜-1H-苯并三唑-1-基)-N,N，N’N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)(0.42mg、1.11μmol)之二甲基甲醯胺(DMF)溶液(4.2μl)與二異丙基乙胺(DIPEA)(0.194μl、1.11μmol)之二甲基甲醯胺(DMF)溶液(2.0μl)，於同溫度攪拌3小時。於反應液加入甲酸(0.28μL)，以逆相矽膠層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)精製，獲得((2R)-3-(第三丁基二硫 烷基)-1-側氧基-1-((4-((5S，8S，11S，14S，17S，20S，23S，26S，29S，32S)-5,23,32-三苄基-2-((第三丁基二硫烷基)甲基)-11,17-二異丁基-13,14,16,20,22,25,26,29-八甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十一側氧基-1-氧雜-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-十氮雜環三-三十烷-8-基)丁基)胺基)丙烷-2-基)胺甲酸烯丙酯(＊Phe-tBuSSlac-Phe-Lys(Alloc-Cys(StBu))-Leu-MeAla-MeLeu-Ala-MePhe-MeAla-Ala＊、於2個＊部位環化)(化合物SP671)(0.90mg、76%)。
LCMS(ESI)m/z=1604.5(M+H)+
保持時間：0.79分(分析條件SQDFA50)
(2R)-2-胺基-3-(第三丁基二硫烷基)-N-(4-((5S，8S，11S，14S，17S，20S，23S，26S，29S，32S)-5,23,32-三苄基-2-((第三丁基二硫烷基)甲基)-11,17-二異丁基-13,14,16,20,22,25,26,29-八甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十一側氧基-1-氧雜-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-十氮雜環三-三十烷-8-基)丁基)丙醯胺(＊Phe-tBuSSlac-Phe-Lys(H-Cys(StBu))-Leu-MeAla-MeLeu-Ala-MePhe-MeAla-Ala＊、於2個＊部位環化)(化合物SP665)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0903-1105
於((2R)-3-(第三丁基二硫烷基)-1-側氧基-1-((4-((5S，8S，11S，14S，17S，20S，23S，26S，29S，32S)-5,23,32-三苄基-2-((第三丁基二硫烷基)甲基)-11,17-二異丁基-13,14,16,20,22,25,26,29-八甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十一側氧基-1-氧雜-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-十氮雜環三-三十烷-8-基)丁基)胺基)丙烷-2-基)胺甲酸烯丙酯(＊Phe-tBuSSlac-Phe-Lys(Alloc-Cys(StBu))-Leu-MeAla-MeLeu-Ala-MePhe-MeAla-Ala＊、於2個＊部位環化)(化合物SP671)(2.5mg、1.56μmol)中，於室溫加入苯基矽烷(PhSiH3)(0.385μl、3.12μmol)之1,3-二甲基-2-四氫咪唑酮(DMI)溶液(140μl)、肆(三苯基膦)鈀(0)(Pd(Ph3P)4)(1.80mg、1.56μmol)，將反應液於30度攪拌1小時30分。將反應液以逆相矽膠層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)精製，獲得(2R)-2-胺基-3-(第三丁基二硫烷基)-N-(4-((5S，8S，11S，14S，17S，20S，23S，26S，29S，32S)-5,23,32-三苄基-2-((第三丁基二硫烷基)甲基)-11,17-二異丁基-13,14,16,20,22,25,26,29-八甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十一側氧基-1-氧雜-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-十氮雜環三-三十烷-8-基)丁基) 丙醯胺(＊Phe-tBuSSlac-Phe-Lys(H-Cys(StBu))-Leu-MeAla-MeLeu-Ala-MePhe-MeAla-Ala＊、於2個＊部位環化)(化合物SP665)(2.60mg、88%)。
LCMS(ESI)m/z=1520(M+H)+
保持時間：0.83分(分析條件SQDFA05)
7-2.從轉譯胜肽示範化合物(化合物SP665)之分支胜肽生成反應
(2S)-N-((3R，6S，9S，12S，15S，18S，21S，24S，27S，30S)-6,15-二苄基-21,27-二異丁基-3-(巰基甲基)-9,12,13,16,18,22,24,25-八甲基-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29-十側氧基-1,4,7,10,13,16,19,22,25,28-十氮雜環三十四烷-30-基)-2-(2-羥基-3-巰基丙醯胺)-3-苯基丙醯胺(H-HSlac-Phe-Lys(＊Cys)-Leu-MeAla-MeLeu-Ala-MePhe-MeAla-Ala-Phe＊、於2個＊部位環化)(化合物SP672)之合成
又，本說明書中，HSlac係指化合物SP666之側鏈tBuS基經脫保護者，係羥基上之氫原子與羧酸上之羥基已去除之2價之結構。
Figure 107130626-A0101-12-0904-1106
於氮氣氛圍下，於混合1M參(2-羧基乙基)膦(TCEP)鹽酸鹽水溶液(1μl)、2M HEPES緩衝液(1.5μl、pH= 7.6)、1N氫氧化鈉水溶液(1.8μl)、水(38.2μl)之溶液中，於室溫加入(2R)-2-胺基-3-(第三丁基二硫烷基)-N-(4-((5S，8S，11S，14S，17S，20S，23S，26S，29S，32S)-5,23,32-三苄基-2-((第三丁基二硫烷基)甲基)-11,17-二異丁基-13,14,16,20,22,25,26,29-八甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十一側氧基-1-氧雜-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-十氮雜環三-三十烷-8-基)丁基)丙醯胺(＊Phe-tBuSSlac-Phe-Lys(H-Cys(StBu))-Leu-MeAla-MeLeu-Ala-MePhe-MeAla-Ala＊、於2個＊部位環化)(化合物SP665)(76μg、0.05μmol)之1,3-二甲基-2-四氫咪唑酮(DMI)溶液(7.5μl)，於pH=6.6於30度攪拌13小時。以LCMS追蹤反應的變化，確認於13小時後生成目的物化合物SP672。目的化合物以外，觀測到水解體(m/z=1359.8(M-H)-)、m/z=1309.6(M-H)-(均為LCMS保持時間0.64分)、m/z=1377.8(M-H)-(LCMS保持時間0.82分)、m/z=1559.9(M-H)-(LCMS保持時間0.56分)為副產物。目的化合物以LCMS之UV面積比計，為43%。(圖70)
LCMS(ESI)m/z=1342(M-H)-
保持時間：0.81分(分析條件SQDFA05)
7-3.從分支胜肽之脫硫反應
(2S)-N-((3S，6S，9S，12S，15S，18S，21S，24S，27S，30S)-6,15-二苄基-21,27-二異丁基-3,9,12,13,16,18,22,24,25-九甲基-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29-十側氧基 -1,4,7,10,13,16,19,22,25,28-十氮雜環三十四烷-30-基)-2-(2-羥基丙醯胺)-3-苯基丙醯胺(H-lac-Phe-Lys(＊Ala)-Leu-MeAla-MeLeu-Ala-MePhe-MeAla-Ala-Phe＊、於2個＊部位環化)(化合物SP673)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0906-1107
於氮氣氛圍下，於從上述7-2.記載之含化合物SP673之轉譯胜肽示範化合物(化合物SP665)之分支胜肽生成反應使用之反應溶液(20μl)中，加入330mM麩胱甘肽水溶液(10.8μl)、670mM參(2-羧基乙基)膦(TCEP)鹽酸鹽溶液(7.2μl、pH=7.1)，於50℃攪拌5分鐘。於室溫加入250mM 2、2-偶氮雙[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二鹽酸鹽(VA-044)水溶液(1.6μl)，於50℃攪拌20分鐘。以LCMS追蹤反應的變化，20分鐘後確認目的物(2S)-N-((3S，6S，9S，12S，15S，18S，21S，24S，27S，30S)-6,15-二苄基-21,27-二異丁基-3,9,12,13,16,18,22,24,25-九甲基-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29-十側氧基-1,4,7,10,13,16,19,22,25,28-十氮雜環三十四烷-30-基)-2-(2-羥基丙醯胺)-3-苯基丙醯胺(H-lac-Phe-Lys(＊Ala)-Leu-MeAla-MeLeu-Ala-MePhe-MeAla-Ala-Phe＊、於2個＊部位環化)(化合物SP673)生成。
670mM參(2-羧基乙基)膦(TCEP)鹽酸鹽溶液之製備法如下。於參(2-羧基乙基)膦(TCEP)鹽酸鹽(29mg、101μmol)加入水 (100μl)、三乙胺(Et3N)(50μl)，調整為pH=7.1。
LCMS(ESI)m/z=1280(M+H)+
保持時間：0.77分(分析條件SQDFA05)
8.使用胜肽-RNA複合體之分子內分支胜肽(直鏈部2)生成反應
於RNA-胜肽複合體施以分子內分支胜肽反應，將產物以電泳分析。
8-1.含嘌呤黴素之模板mRNA之製備及使用其之RNA-胜肽複合體之轉譯合成
以利用PCR製備之DNA(序列編號DM-H1)作為模板，利用體外轉錄製備mRNA(序列編號RM-H2)，並使用RNeasy mini kit(Qiagen公司)精製。於10μMmRNA加入15μM之嘌呤黴素連結子(Sigma公司)(序列編號C-H1)1X T4 RNA接合酶反應緩衝液(NEB公司)、1mM ATP、10% DMSO、0.63unit/μl T4 RNA接合酶(NEB公司)，於室溫進行30分鐘接合反應後，以RNeasy MiniElutekit(Qiagen公司)精製。其次，將前述轉譯系之模板RNAOT86b(序列編號RM-H1)替換為使用上述製備之1μM之mRNA-嘌呤黴素連結子連結體作為模板，再追加0.25mM Gly而得之轉譯反應液，於37℃保溫60分鐘後，接著於室溫保溫12分鐘。之後，將反應液以RNeasy minelute(qiagen公司)精製，獲得胜肽-RNA複合體分子。
序列編號DM-H1 OT-104(序列編號：92)OT-104 DNA序列
Figure 107130626-A0101-12-0907-1108
Figure 107130626-A0101-12-0908-1109
序列編號RM-H2 OT-104(序列編號：93)OT-104 RNA序列
Figure 107130626-A0101-12-0908-1110
序列編號C-H1 S2PuFLin序列(序列編號：76)[P]CCCGTCCCCGCCGCCC[Fluorecein-dT][Spacer18][Spacer18][Spacer18][Spacer18][Spacer18]CC[Puromycin]([P]：5'磷酸化)
8-2.具有分子內分支胜肽(直鏈部2)之胜肽-RNA複合體之生成
對於上述製備之胜肽-RNA複合體溶液100μL，加入100μL之N,N-二甲基乙醯胺(DMA)、5.5μL之2M HEPES-KOH(pH7.6)、2.1μL之1M參(2-羧基乙基)膦(TCEP)(pH7.6)，於37℃保溫2小時。然後，將848μL之試藥溶液(59mM參(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽、425mM N,N-雙-(2-羥基乙基)甘胺酸(Bicine)(pH8.7)、590mM氫氧化鈉、47%(v/v)N,N-二甲基乙醯胺(DMA)、593mM 4-(三氟甲基)苯硫醇)加到反應溶液，於37℃再保溫20小時。從獲得之反應液使用RNeasy minelute(qiagen公司)將胜肽-RNA複合體精製，以純水100μL從管柱溶出。然後，加入12μL之10xRNase ONE ribonuclease反應緩衝液(promega公司)、6μL之RNase ONEribonuclease(promega公司)、6μL之RNase H(Life Technologies公司)，於室溫保溫3日。將與獲得之反應溶液不會有任何反應之嘌呤黴素連結子(序列編號C-H1)以peptide-PAGE mini(TEFCO公司)電泳，以來自嘌呤黴素連結子之Fluorecein將譜帶可見化(圖71)。其結果，關於已進行分支胜肽(直鏈部2)生成反應之樣本，觀測到嘌呤黴素連結子有胜肽鍵結而來之譜帶移動度之差異(圖71、帶2、譜帶I)。由此顯示存在目的之分子內分支胜肽-RNA複合體。
9.可從分支胜肽之轉譯產物生成之單元之胺基醯基化pdCpA之合成
又，本說明書中，將胺基酸或胺基酸衍生物、胺基酸類似物之主鏈羧酸與pdCpA之羥基(2位或3位)形成酯鍵之化合物，記載為胺基酸-pdCpA。胺基酸、胺基酸衍生物、胺基酸類似物部位以簡稱代表，各簡稱定義如下。
Figure 107130626-A0101-12-0909-2285
9-1.胺基醯基化pdCpA化合物20之合成
化合物21
2-(第三丁基二甲基矽氧基)乙酸氰基甲酯之合成
Figure 107130626-A0101-12-0910-1112
將甘醇酸(1.0g、13.15mmol)與咪唑(4.48g、65.7mmol)之DMF(13.15ml)溶液冷卻至0度後，加入第三丁基二甲基氯矽烷(4.76g、31.6mmol)，將反應液於室溫攪拌12小時。將反應混合物以二乙醚/水進行萃取操作，將有機層以25wt%食鹽水洗滌。將有機層以無水硫酸鈉乾燥，過濾後，減壓濃縮。於獲得之殘渣中加入THF(30mL)，冷卻至0度後，加入甲醇(90mL)與9.1wt%碳酸鉀水溶液(30mL)，將反應液於室溫攪拌1小時。將反應混合物減壓濃縮，獲得粗產物(4.25g)。
於粗產物(1.53g)中加入乙腈(6.7ml)與DMF(6.7ml)，將混合物冷卻至0度後，加入二異丙基乙胺(3.51mL、20.1mmol)與2-溴乙腈(0.93ml、13.4mmol)，將反應液於室溫攪拌6小時。將反應混合物以二乙醚/水進行萃取操作，將有機層以25wt%食鹽水洗滌。將有機層以無水硫酸鈉乾燥，過濾後，減壓濃縮。將獲得之殘渣以順相矽膠管柱層析(己烷/乙酸乙酯)精製，獲得2-(第三丁基二甲基矽氧基)乙酸氰基甲酯(化合物21)(556mg、52%)。
LCMS(ESI)m/z=230(M+H)+
保持時間：0.54分(分析條件SQDAA50)
化合物22
2-(第三丁基二甲基矽氧基)乙酸(2R，3S，4R，5R)-2-((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-(膦醯氧基甲基) 四氫呋喃-3-氧基)(羥基)磷氧基氧)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-基之合成
Figure 107130626-A0101-12-0911-2286
於緩衝液A(30mL)加入磷酸二氫((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-3-(((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(羥基)磷氧基)氧基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物1h)(144mg、0.227mmol)之水溶液(1ml)與2-(第三丁基二甲基矽氧基)乙酸氰基甲酯(化合物21)(104mg、0.453mmol)之四氫呋喃(1ml)溶液，於室溫攪拌2小時。冷凍乾燥後，將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)精製，獲得2-(第三丁基二甲基矽氧基)乙酸(2R，3S，4R，5R)-2-((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-(膦醯氧基甲基)四氫呋喃-3-氧基)(羥基)磷氧基氧)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物22)(104.5mg、57%)。
LCMS(ESI)m/z=809.5(M+H)+
保持時間：0.52分(分析條件SQDFA05)
化合物20
2-羥基乙酸(2R，3S，4R，5R)-2-((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-(膦醯氧基甲基)四氫呋喃-3-氧基)(羥基)磷氧基氧)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(HOGly-pdCpA)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0912-1114
於2-(第三丁基二甲基矽氧基)乙酸(2R，3S，4R，5R)-2-((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-(膦醯氧基甲基)四氫呋喃-3-氧基)(羥基)磷氧基氧)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物22)(70.0mg、87μmol)之二氯甲烷(2ml)溶液中，於室溫添加三氟乙酸(2ml)，於同溫度攪拌30分鐘。減壓濃縮後，將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)精製，獲得2-羥基乙酸(2R，3S，4R，5R)-2-((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基 -2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-(膦醯氧基甲基)四氫呋喃-3-氧基)(羥基)磷氧基氧)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(HOGly-pdCpA)(化合物20)(14.0mg、23%)。
LCMS(ESI)m/z=695(M+H)+
保持時間：0.28分(分析條件SQDAA05)
2-2.胺基醯基化pdCpA化合物23之合成依以下流程合成。
Figure 107130626-A0101-12-0913-1115
2-(第三丁基二甲基矽氧基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸氰基甲酯(化合物25)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0913-1116
於依文獻既知法(J.Am.Chem.Soc.2008，130，4919.)製備之2-(第三丁基二甲基矽氧基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(化合物24、60.0mg、0.185mmol)與2-溴乙腈(26.0μl、0.373mmol)之DMF(1.8ml)溶液中，於室溫加入二異丙基乙胺(98.0μl、0.56mmol)，將反應液於同溫度攪拌1.5小時。將反應 混合物以二乙醚稀釋，以飽和氯化銨水溶液、飽和食鹽水洗滌。將有機層以無水硫酸鈉乾燥，過濾後，減壓濃縮。將獲得之殘渣以順相矽膠管柱層析(己烷/乙酸乙酯)精製，獲得2-(第三丁基二甲基矽氧基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸氰基甲酯(化合物25)(48mg、71%)。
LCMS(ESI)m/z=364(M+H)+
保持時間：0.84分(分析條件SQDAA50)
3-(第三丁基二硫烷基)-2-羥基丙酸(2R，3S，4R，5R)-2-((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-(膦醯氧基甲基)四氫呋喃-3-氧基)(羥基)磷氧基氧)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物23)(tBuSSlac-pdCpA)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0914-1117
於2-(第三丁基二甲基矽氧基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸氰基甲酯(化合物25)(23.4mg、0.064mmol)，於室溫加入磷酸二氫((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)- 基)-3-(((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(羥基)磷氧基)氧基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物1h)之四丁基銨鹽(48mg、0.032mmol)之DMF(640μl)溶液、三乙胺(44.8μl、0.321mmol)於室溫加
Figure 107130626-A0101-12-0915-1094
、反應液
Figure 107130626-A0101-12-0915-1095
35度
Figure 107130626-A0101-12-0915-1096
攪拌1小時。反應混合物
Figure 107130626-A0101-12-0915-1097
甲酸(30μl)，以逆相矽膠層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)精製，獲得2-(第三丁基二甲基矽氧基)-3-(第三丁基二甲基硫烷基)丙酸(2R，3S，4R，5R)-2-((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-(膦醯氧基甲基)四氫呋喃-3-氧基)(羥基)磷氧基氧)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物26)為混合物(29.4mg)。
對於獲得之混合物(29.4mg)，加入三氟乙酸(1ml、13.0mmol)，將反應液於室溫攪拌5小時。減壓濃縮後，將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)精製，獲得3-(第三丁基二硫烷基)-2-羥基丙酸(2R，3S，4R，5R)-2-((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-(膦醯氧基甲基)四氫呋喃-3-氧基)(羥基)磷氧基氧)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(18.0mg、2階段產率68%)(化合物23)(tBuSSlac-pdCpA)。
LCMS(ESI)m/z=829(M+H)+
保持時間：0.41分(分析條件SQDFA05)
2-4.胺基醯基化pdCpA化合物27之合成
依以下流程合成。
Figure 107130626-A0101-12-0916-1118
(S)-2-第三丁氧基羰胺基-戊-4-烯酸 第三丁酯(化合物29)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0916-2287
將L-烯丙基甘胺酸(化合物28)(25.0g、217mmol)之1,4-二噁烷(250ml)/水(125ml)懸浮液冷卻至0℃後，加入二碳酸二-第三丁基(52.1g、239mol)及碳酸氫鈉(36.5g、434mol)，將反應液於室溫攪拌12小時。反應完結後，將反應液冷卻至0℃，加入1M鹽酸直到液性成為pH4。將該混合物以乙酸乙酯進行萃取操作，將有機層以飽和食鹽水洗滌。將有機層以無水硫酸鈉乾燥，過濾後，減壓濃縮，獲得(S)-2-第三丁氧基羰胺基-戊-4-烯酸。使獲得之(S)-2-第三丁氧基羰胺基-戊-4-烯酸溶於甲苯(200ml)，加入N,N-二甲基甲醯胺二-第三丁基縮醛 (130ml)，於90℃攪拌4小時。再加入N,N-二甲基甲醯胺二-第三丁基縮醛(25ml)，於90℃攪拌2小時。將反應液於減壓下濃縮，將獲得之殘渣以順相矽膠管柱層析(己烷/乙酸乙酯)精製，獲得(S)-2-第三丁氧基羰胺基-戊-4-烯酸 第三丁酯(化合物29)(33.16g、56%)。
LCMS(ESI)m/z=294(M+Na)+
保持時間：1.05分(分析條件SQDAA05)
(S)-2-第三丁氧基羰胺基-3-環氧乙烷基-丙酸 第三丁酯(化合物30)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0917-2288
於(S)-2-第三丁氧基羰胺基-戊-4-烯酸 第三丁酯(化合物29)(32.0g、118mmol)之二氯甲烷(384ml)溶液中，加入間氯過苯甲酸(40.7g、236mmol)，於室溫攪拌15小時。將反應混合物冷卻至0℃，加入碳酸氫鈉(20g)水溶液(300ml)及飽和硫代硫酸鈉水溶液(100ml)，使反應結束。將混合物以乙酸乙酯進行萃取操作，將有機層以飽和食鹽水洗滌。將有機層以無水硫酸鈉乾燥，過濾後，減壓濃縮。將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(10mM乙酸銨水溶液/甲醇)精製，獲得(S)-2-第三丁氧基羰胺基-3-環氧乙烷基-丙酸 第三丁酯(化合物30)(18.53g、55%)。
LCMS(ESI)m/z=310(M+Na)+
保持時間：1.03分(分析條件SQDAA05)
(S)-2-第三丁氧基羰胺基-3-噻喃基(thiiranyl)-丙酸 第三丁酯(化合物31)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0918-1121
於(S)-2-第三丁氧基羰胺基-3-環氧乙烷基-丙酸 第三丁酯(化合物30)(315mg、1.096mmol)中，加入甲醇(4ml)及硫脲(83mg、1.096mmol)，將反應液進行1.5小時加熱回流。將反應液於減壓下濃縮，將獲得之殘渣以順相矽膠管柱層析(己烷/乙酸乙酯)精製，獲得(S)-2-第三丁氧基羰胺基-3-噻喃基-丙酸 第三丁酯(化合物31)(278mg、84%)。
LCMS(ESI)m/z=326(M+Na)+
保持時間：0.59分(分析條件SQDAA50)
(S)-5-溴-2-第三丁氧基羰胺基-4-甲基二硫烷基-戊酸第三丁酯(化合物32)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0918-2289
於(S)-2-第三丁氧基羰胺基-3-噻喃基-丙酸 第三丁酯(化合物31)(2.28g、7.51mmol)之二氯甲烷(35ml)溶液中，加入四甲基尿素(1.06ml、9.02mmol)，冷卻到-78℃。依非專利文 獻(J.Org.Chem.2001、66、910-914)揭載之方法，加入另外製備之1.60M甲烷硫基溴化物1,2-二氯乙烷溶液(5.17ml)。將反應液費時2小時攪拌，並邊從-78℃升溫到0℃。將反應液於減壓下濃縮，獲得(S)-5-溴-2-第三丁氧基羰胺基-4-甲基二硫烷基-戊酸第三丁酯(化合物32)為粗產物。
LCMS(ESI)m/z=430(M+H)+
保持時間：0.74分(分析條件SQDAA50)
(S)-5-疊氮化-2-第三丁氧基羰胺基-4-甲基二硫烷基-戊酸第三丁酯(化合物33)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0919-2290
於前述獲得之未精製之(S)-5-溴-2-第三丁氧基羰胺基-4-甲基二硫烷基-戊酸第三丁酯(化合物32)之N,N-二甲基甲醯胺(100ml)溶液中加入疊氮化鈉(2.44g、37.6mmol)，將反應混合物於室溫攪拌6小時。反應結束後分濾不溶物，將濾液於減壓下濃縮。將獲得之殘渣以順相矽膠管柱層析(己烷/乙酸乙酯)精製，獲得(S)-5-疊氮化-2-第三丁氧基羰胺基-4-甲基二硫烷基-戊酸第三丁酯(化合物33)(1.87g、64%)。
LCMS(ESI)m/z=415(M+Na)+
保持時間：0.80分(分析條件SQDAA50)
(S)-2-胺基-5-疊氮化-4-甲基二硫烷基-戊酸鹽酸鹽 (化合物34)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0920-2291
於(S)-5-疊氮化-2-第三丁氧基羰胺基-4-甲基二硫烷基-戊酸第三丁酯(化合物33)(92mg、0.234mmol)之2,2,2-三氟乙醇(0.9ml)溶液中，加入氯三甲基矽烷(297μl、2.344mmol)，於室溫攪拌2小時。再加入氯三甲基矽烷(150μl、1.184mmol)，將反應液於室溫攪拌12小時。反應結束後，將反應液於減壓下濃縮，將獲得之殘渣以己烷/乙酸乙酯/二氯甲烷(3：1：0.1)之混合溶劑洗滌，獲得(S)-2-胺基-5-疊氮化-4-甲基二硫烷基-戊酸 鹽酸鹽(化合物34)(58mg、91%)。
LCMS(ESI)m/z=237(M+H)+
保持時間：0.36分(分析條件SQDFA05)
(S)-5-疊氮化-2-第三丁氧基羰胺基-4-甲基二硫烷基-戊酸(化合物35)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0920-2292
於(S)-2-胺基-5-疊氮化-4-甲基二硫烷基-戊酸 鹽酸鹽(化合物34)(70mg、0.257mmol)之1,4-二噁烷(0.7ml)/水(0.35ml)懸浮液中，加入二碳酸二-第三丁酯(112mg、 0.513mmol)及碳酸氫鈉(54mg、0.642mmol)，將反應液於室溫攪拌3小時。反應完結後，將反應液以逆相矽膠管柱層析(10mM乙酸銨水溶液/甲醇)精製，獲得(S)-5-疊氮化-2-第三丁氧基羰胺基-4-甲基二硫烷基-戊酸(化合物35)(79mg、92%)。
LCMS(ESI)m/z=335(M-H)-
保持時間：0.78分(分析條件SQDFA05)
(S)-5-疊氮化-2-第三丁氧基羰胺基-4-甲基二硫烷基-戊酸氰基甲酯(化合物36)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0921-2293
於(S)-5-疊氮化-2-第三丁氧基羰胺基-4-甲基二硫烷基-戊酸(化合物35)(75mg、0.223mmol)之乙腈(2ml)溶液中，加入溴乙腈(45μl、0.669mmol)及N,N-二異丙基乙胺(58μl、0.334mmol)，將反應液於室溫攪拌5小時。將反應混合物以乙酸乙酯/飽和氯化銨進行萃取操作，將有機層以飽和食鹽水洗滌。將有機層以無水硫酸鈉乾燥，過濾後，減壓濃縮。將獲得之殘渣以順相矽膠管柱層析(己烷/乙酸乙酯)精製，獲得(S)-5-疊氮化-2-第三丁氧基羰胺基-4-甲基二硫烷基-戊酸氰基甲酯(化合物36)(81mg、97%)。
LCMS(ESI)m/z=374(M-H)-
保持時間：0.87分(分析條件SQDFA05)
(2S)-(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-胺基 -2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-基5-疊氮化-2-((第三丁氧羰基)胺基)-4-(甲基二硫烷基)戊酸酯(化合物37)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0922-1127
於緩衝液A(29mL)加入磷酸二氫((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-3-(((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(羥基)磷氧基)氧基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物1h)(45mg、0.071mmol)之水溶液(1ml)與(S)-5-疊氮化-2-第三丁氧基羰胺基-4-甲基二硫烷基-戊酸氰基甲酯(化合物36)(80mg、0.213mmol)之四氫呋喃(1ml)溶液，於室溫攪拌3小時。冷凍乾燥後，將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)精製，獲得(2S)-(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3- 基5-疊氮化-2-((第三丁氧羰基)胺基)-4-(甲基二硫烷基)戊酸酯(化合物37)(15mg、22%)。
LCMS(ESI)m/z=955(M+H)+
保持時間：0.55分(分析條件SQDFA05)
2-胺基-5-疊氮化-4-(甲基二硫烷基)戊酸(2S)-(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(Orn(N3)(4-SSMe)-pdCpA)(化合物27)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0923-1128
於(2S)-(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-基5-疊氮化-2-((第三丁氧羰基)胺基)-4-(甲基二硫烷基)戊酸酯(化合物37)(10mg、10.47μmol)，於室溫加入三氟乙酸(0.2mL)，於同溫度攪拌20分鐘。減壓濃縮後，將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)精 製，獲得2-胺基-5-疊氮化-4-(甲基二硫烷基)戊酸(2S)-(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(Orn(N3)(4-SSMe)-pdCpA)(化合物27)(2mg、26%)。
LCMS(ESI)m/z=855(M+H)+
保持時間：0.32分(分析條件SQDFA05)
2-5.胺基醯基化pdCpA化合物43之合成
(2S,2'S)-二-第三丁基4,4'-二硫化二氫二基雙(5-疊氮化-2-((第三丁氧羰基)胺基)戊酸酯)(化合物38)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0924-2295
於前述(S)-5-疊氮化-2-第三丁氧基羰胺基-4-甲基二硫烷基-戊酸第三丁酯(化合物33)之合成，作為副產物，獲得(2S,2'S)-二-第三丁基4,4'-二硫化二氫二基雙(5-疊氮化-2-((第三丁氧羰基)胺基)戊酸酯)(化合物38)(414mg)。
LCMS(ESI)m/z=691.7(M+H)+
保持時間：0.80分(分析條件SQDAA50)
(S)-5-疊氮化-2-第三丁氧基羰胺基-4-第三丁基二硫烷基-戊酸第三丁酯(化合物39)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0925-1130
於(2S,2'S)-二-第三丁基4,4'-二硫化二氫二基雙(5-疊氮化-2-((第三丁氧羰基)胺基)戊酸酯)(化合物38)(312mg、0.452mmol)中，加入二-第三丁基二硫醚(5.67ml、29.4mmol)及碘(57mg、0.226mmol)，於60度攪拌18小時。將反應液以順相矽膠管柱層析(己烷/乙酸乙酯)精製，獲得(S)-5-疊氮化-2-第三丁氧基羰胺基-4-第三丁基二硫烷基-戊酸第三丁酯(化合物39)(161mg、81%)。
LCMS(ESI)m/z=435.5(M+H)+
保持時間：0.77分(分析條件SQDAA50)
(S)-2-胺基-5-疊氮化-4-第三丁基二硫烷基-戊酸鹽酸鹽(化合物40)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0925-2297
於(S)-5-疊氮化-2-第三丁氧基羰胺基-4-第三丁基二硫烷基-戊酸第三丁酯(化合物39)(160mg、0.368mmol)之2,2,2-三氟乙醇(3.2ml)溶液中，加入氯三甲基矽烷(467μl、2.344mmol)，於室溫攪拌2小時。再加入氯三甲基矽烷(467μl、 2.344mmol)，將反應液於室溫攪拌3小時。反應結束後，將反應液於減壓下濃縮，將獲得之殘渣以己烷/乙酸乙酯/二氯甲烷(3：1：0.1)之混合溶劑洗滌，獲得(S)-2-胺基-5-疊氮化-4-第三丁基二硫烷基-戊酸 鹽酸鹽(化合物40)(113mg、97%)。
LCMS(ESI)m/z=279(M+H)+
保持時間：0.78分(分析條件SQDAA05)
(S)-5-疊氮化-2-第三丁氧基羰胺基-4-第三丁基二硫烷基-戊酸(化合物40a)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0926-2298
於(S)-2-胺基-5-疊氮化-4-第三丁基二硫烷基-戊酸鹽酸鹽(化合物40)(110mg、0.349mmol)之1,4-二噁烷(1ml)/水(0.5ml)溶液中，加入二碳酸二-第三丁酯(152mg、0.699mmol)及碳酸氫鈉(73mg、0.873mmol)，將反應液於室溫攪拌1.5小時。再加入二碳酸二-第三丁酯(152mg、0.699mmol)及碳酸氫鈉(73mg、0.873mmol)，將反應液於室溫攪拌2小時。反應完結後，將反應液以順相矽膠管柱層析(二氯甲烷/甲醇)精製，獲得(S)-5-疊氮化-2-第三丁氧基羰胺基-4-第三丁基二硫烷基-戊酸(化合物40a)(120mg、91%)。
LCMS(ESI)m/z=377(M-H)-
保持時間：0.89分(分析條件SQDFA05)
(S)-5-疊氮化-2-第三丁氧基羰胺基-4-第三丁基二 硫烷基-戊酸氰基甲酯(化合物41)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0927-2299
於(S)-5-疊氮化-2-第三丁氧基羰胺基-4-第三丁基二硫烷基-戊酸(化合物40a)(115mg、0.304mmol)之乙腈(1ml)溶液中，加入溴乙腈(62μl、0.911mmol)及N,N-二異丙基乙胺(79μl、0.456mmol)，將反應液於室溫攪拌2小時。將反應混合物以乙酸乙酯/飽和氯化銨進行萃取操作，將有機層以飽和食鹽水洗滌。將有機層以無水硫酸鈉乾燥，過濾後，減壓濃縮。將獲得之殘渣以順相矽膠管柱層析(己烷/乙酸乙酯)精製，獲得(S)-5-疊氮化-2-第三丁氧基羰胺基-4-第三丁基二硫烷基-戊酸氰基甲酯(化合物41)(120mg、95%)。
LCMS(ESI)m/z=416(M-H)-
保持時間：0.97分(分析條件SQDFA05)
(2S)-(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-基5-疊氮化-2-((第三丁氧羰基)胺基)-4-(第三丁基二硫烷基)戊酸酯(化合物42)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0928-1134
於緩衝液A(29mL)中加入磷酸二氫((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-3-(((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(羥基)磷氧基)氧基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物1h)(56mg、0.088mmol)之水溶液(1ml)與(S)-5-疊氮化-2-第三丁氧基羰胺基-4-第三丁基二硫烷基-戊酸氰基甲酯(化合物41)(110mg、0.263mmol)之四氫呋喃(1ml)溶液，於室溫攪拌3小時。冷凍乾燥後，將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.05%三氟乙酸水溶液/0.05%三氟乙酸乙腈溶液)精製，獲得(2S)-(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-基5-疊氮化-2-((第三丁氧羰基)胺基)-4-(第三丁基二硫烷基)戊酸酯之粗精製物(化合物42)(55mg)。
LCMS(ESI)m/z=997(M+H)+
保持時間：0.64分(分析條件SQDFA05)
2-胺基-5-疊氮化-4-(第三丁基二硫烷基)戊酸(2S)-(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(Orn(N3)(4-SStBu)-pdCpA)(化合物43)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0929-2300
於前述(2S)-(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-基5-疊氮化-2-((第三丁氧羰基)胺基)-4-(第三丁基二硫烷基)戊酸酯(化合物42)之粗精製物(53mg)中，加入二氯甲烷(2ml)使懸浮，於室溫添加三氟乙酸(0.5mL)，於同溫度攪拌30分鐘。減壓濃縮後，將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.05%三氟乙酸水溶液/0.05%三氟乙酸乙腈溶液)精製，獲得2-胺基-5-疊氮化-4-(第三丁基二硫烷基)戊酸(2S)-(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶 -1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(Orn(N3)(4-SStBu)-pdCpA)(化合物43)(24mg、2步驟31%)。
LCMS(ESI)m/z=897(M+H)+
保持時間：0.41分(分析條件SQDFA05)
2-6.胺基醯基化pdCpA化合物47之合成
依以下所述方法，確立能將化合物36之SH之保護基以單一步驟變更，輕易地合成pdCpA衍生物之方法。
5-疊氮化-2-(第三丁氧基羰胺基)-4-(異丙基二硫烷基)戊酸(2S)-氰基甲酯(化合物45)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0930-2301
於5-疊氮化-2-(第三丁氧基羰胺基)-4-(甲基二硫烷基)戊酸(2S)-氰基甲酯(化合物36)(110mg、0.293mmol)，加入二異丙基二硫醚(4.67ml、29.3mmol)及碘(30mg、0.117mmol)，於60度攪拌24小時。將反應液以順相矽膠管柱層析(己烷/乙酸乙酯)精製，獲得5-疊氮化-2-(第三丁氧基羰胺基)-4-(異丙基二硫烷基)戊酸(2S)-氰基甲酯(化合物45)(89mg、75%)。
LCMS(ESI)m/z=402(M-H)-
保持時間：0.61分(分析條件SQDAA50)
化合物46
5-疊氮化-2-((第三丁氧羰基)胺基)-4-(異丙基二硫烷基)戊酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧 基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯之合成
Figure 107130626-A0101-12-0931-2302
於緩衝液A(12mL)加入磷酸二氫((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-3-(((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(羥基)磷氧基)氧基)四氫呋喃-2-基)甲基(化合物1h、43.6mg、0.069mmol)之水溶液(0.3mL)與5-疊氮化-2-((第三丁氧羰基)胺基)-4-(異丙基二硫烷基)戊酸(2S)-氰基甲基(化合物45)(83mg、0.206mmol)之四氫呋喃(0.2mL)溶液，於室溫攪拌55分鐘。冷凍乾燥後，將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.05%三氟乙酸水溶液/0.05%三氟乙酸乙腈溶液)精製，獲得5-疊氮化-2-((第三丁氧羰基)胺基)-4-(異丙基二硫烷基)戊酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物46)(27.7mg、41%)。
LCMS(ESI)m/z=981.6(M-H)-
保持時間：0.58分(分析條件SQDFA05)
化合物47
2-胺基-5-疊氮化-4-(異丙基二硫烷基)戊酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(Orn(N3)(4-SSiPr)-pdCpA)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0932-2305
於5-疊氮化-2-((第三丁氧羰基)胺基)-4-(異丙基二硫烷基)戊酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物46)(27.7mg、28μmol)之二氯甲烷(0.4mL)溶液中，添加三氟乙酸(0.1mL)，於室溫3攪拌5分鐘。減壓濃縮後，將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.05%三氟乙酸水溶液/0.05%三氟乙酸乙腈溶液)精製，獲得2-胺基-5-疊氮化-4-(異丙基二硫烷基)戊酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(Orn(N3)(4-SSiPr)-pdCpA)(化 合物47)(21.5mg、86%)。
LCMS(ESI)m/z=881.4(M-H)-
保持時間：0.39分(分析條件SQDFA05)
2-5. 胺基醯基化pdCpA化合物48(Lys(Cys(StBu))-pdCpA)之合成
依以下流程合成。
Figure 107130626-A0101-12-0933-1139
(S)-2,6-二胺基己酸，二氨鹽 鹽酸鹽(化合物56)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0933-2307
將L(+)-離胺酸一鹽酸鹽(3.08g、16.86mmol)以冰浴冷卻後，添加氨水(15mL)。將反應液於同溫度攪拌25分鐘後，減壓濃縮，將獲得之粗產物(3.20g)直接用在次步驟。
(1R，4'S，5S)-4'-(4-胺基丁基)-5'-側氧基螺[雙環[3.3.1]壬烷-9,2'-[1,3,2]噁唑硼烷(Oxazaborolidine)]-3'-陽離子(ium)-11-陰離子(uide)(化合物49)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0934-2308
於氮氣氛圍下，將(S)-2,6-二胺基己酸，二氨鹽 鹽酸鹽(化合物56)(3.20g、14.77mmol)及9-BBN二聚物(4.11g、16.98mmol)之甲醇(40mL)懸浮液進行1小時加熱回流。冷卻至室溫後，將溶劑減壓餾去，將獲之粗產物直接用在次步驟。
LCMS(ESI)m/z=265(M-H)-
保持時間：0.43分(分析條件SQDFA05)
(1R，4'S，5S)-4'-(4-((R)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙醯胺)丁基)-5'-側氧基螺[雙環[3.3.1]壬烷-9,2'-[1,3,2]噁唑硼烷]-3'-陽離子-11-陰離子(化合物50)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0935-1142
於氮氣氛圍下，於(1R，4'S，5S)-4'-(4-胺基丁基)-5'-側氧基螺[雙環[3.3.1]壬烷-9,2'-[1,3,2]噁唑硼烷]-3'-陽離子-11-陰離子(化合物49)(3.73g、14mmol)及Boc-Cys(StBu)-OH(4.33g、14mmol)之DMF(10mL)懸浮液中，邊於室溫攪拌邊添加N,N-二異丙基乙胺(3.66mL、21mmol)。於獲得之混合物中加入HATU(5.86g、15.4mmol)後，於室溫攪拌1日。於反應混合物加入飽和食鹽水，以乙酸乙酯萃取。將有機相以無水硫酸鈉乾燥後，減壓濃縮，將獲得之粗產物以順相矽膠管柱層析(二氯甲烷/乙酸乙酯)精製，獲得(1R，4'S，5S)-4'-(4-((R)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙醯胺)丁基)-5'-側氧基螺[雙環[3.3.1]壬烷-9,2'-[1,3,2]噁唑硼烷]-3'-陽離子-11-陰離子(化合物50)(7.34g、94%)。
LCMS(ESI)m/z=558.5(M+H)+
保持時間：0.98分(分析條件SQDFA05)
(S)-2-胺基-6-((R)-2-胺基-3-(第三丁基二硫烷基)丙醯胺)己酸(Lys(Cys(StBu)))(化合物51)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0936-1143
於(1R，4'S，5S)-4'-(4-((R)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙醯胺)丁基)-5'-側氧基螺[雙環[3.3.1]壬烷-9,2'-[1,3,2]噁唑硼烷]-3'-陽離子-11-陰離子(化合物50)(715.8mg、1.28mmol)之1,4-二噁烷(3mL)溶液，於室溫添加濃鹽酸(1.1mL)，將獲得之反應混合物於40℃攪拌13小時15分鐘。冷卻至室溫後，減壓濃縮，將獲得之粗產物以逆相矽膠管柱層析(10mM乙酸銨水溶液/甲醇)精製，獲得(S)-2-胺基-6-((R)-2-胺基-3-(第三丁基二硫烷基)丙醯胺)己酸(Lys(Cys(StBu)))(化合物51)(394.1mg、91%)。
LCMS(ESI)m/z=336(M-H)-
保持時間：0.67分(分析條件SQDAA05)
(S)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-6-((R)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙醯胺)己酸(化合物52)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0936-1144
將(S)-2-胺基-6-((R)-2-胺基-3-(第三丁基二硫烷基)丙醯胺)己酸(Lys(Cys(StBu)))(化合物51)(390mg、1.16mmol)之1,4-二噁烷(5mL)及水(6mL)混合物以冰浴冷卻，添加碳酸氫鈉(388mg、4.62mmol)，然後添加Boc2O(807mg、3.70mmol)。將反應混合物於室溫攪拌3小時。以冰浴冷卻後，添加硫酸氫鉀(157mg、1.16mmol)及飽和硫酸氫鉀水溶液(1mL)，調整為pH2。將獲得之混合物以乙酸乙酯萃取。將有機相以無水硫酸鈉乾燥後，減壓濃縮，將獲得之粗產物以順相矽膠管柱層析(乙酸乙酯)精製，獲得(S)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-6-((R)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙醯胺)己酸(化合物52)(579.5mg、93%)。
LCMS(ESI)m/z=536(M-H)-
保持時間：0.86分(分析條件SQDFA05)
2-((第三丁氧羰基)胺基)-6-((R)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙醯胺)己酸(S)-氰基甲酯(化合物53)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0937-1145
於氮氣氛圍下，於室溫在(S)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-6-((R)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙醯胺)己酸(化合物52)(206mg、0.383mmol)之乙腈(0.3mL)溶液 中添加N,N-二異丙基乙胺(0.073mL、0.421mmol)，然後添加溴乙腈(0.080mL、1.15mmol)。將反應混合物於同溫度攪拌5小時後，減壓濃縮，將獲得之粗產物以順相矽膠管柱層析(己烷/乙酸乙酯)精製，獲得2-((第三丁氧羰基)胺基)-6-((R)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙醯胺)己酸(S)-氰基甲酯(化合物53)(172.2mg、78%)。
LCMS(ESI)m/z=577.6(M+H)+
保持時間：0.92分(分析條件SQDFA05)
2-((第三丁氧羰基)胺基)-6-((R)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙醯胺)己酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物55)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0938-2309
於緩衝液A(11mL)中加入磷酸二氫((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-3-(((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(羥基)磷氧基)氧基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物1h)(37.9mg、 0.060mmol)之水溶液(0.3mL)與2-((第三丁氧羰基)胺基)-6-((R)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙醯胺)己酸(S)-氰基甲酯(化合物53)(103mg、0.179mmol)之四氫呋喃(0.3mL)溶液，於室溫攪拌2小時。冷凍乾燥後，將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.05%三氟乙酸水溶液/0.05%三氟乙酸乙腈溶液)精製，獲得2-((第三丁氧羰基)胺基)-6-((R)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙醯胺)己酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物55)(12mg、17%)。
LCMS(ESI)m/z=1156.7(M+H)+
保持時間：0.63分(分析條件SQDFA05)
2-胺基-6-((R)-2-胺基-3-(第三丁基二硫烷基)丙醯胺)己酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(Lys(Cys(StBu))-pdCpA)(化合物48)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0940-1147
於2-((第三丁氧羰基)胺基)-6-((R)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙醯胺)己酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物55)(12mg、10.38μmol)之二氯甲烷(0.4mL)溶液中，於室溫添加三氟乙酸(0.1mL)，於同溫度攪拌15分鐘。減壓濃縮後，將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.05%三氟乙酸水溶液/0.05%三氟乙酸乙腈溶液)精製，獲得2-胺基-6-((R)-2-胺基-3-(第三丁基二硫烷基)丙醯胺)己酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(Lys(Cys(StBu))-pdCpA)(化合物48)(9.3mg、94%)。
LCMS(ESI)m/z=956(M+H)+
保持時間：0.29分(分析條件SQDFA05)
10.具有保護基之胺部位之合成(之2)
探討能轉譯合成且能於對RNA為安定之反應條件脫保護之保護基、及與胺基酸單元之組合例，如以下所示。又，如以下所示，本說明書中使用之各胺基酸之簡稱，亦與化合物編號共同顯示。該等簡稱係在胜肽內含有、或在pdCpA等RNA或DNA含有，均設為包含相同單元。又，例如H-Gly-OH等情形、N末端或C末端未經化學修飾之情形，有時將H或OH基之記載省略，單記為Gly等。
Figure 107130626-A0101-12-0941-1148
又，可轉譯合成之胺基酸，在本說明書中使用之各胺基酸之簡稱定義如下。
Figure 107130626-A0101-12-0942-1149
10-1.pdCpA-側鏈胺基受保護之胺基酸之合成10-1-1.具有保護基之胺部位之探索：胺基醯基化pdCpA化合物tk5之合成
依以下流程合成。
Figure 107130626-A0101-12-0942-1150
(S)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-4-((S)-3-(第三丁氧羰基)噻唑烷-5-基)丁酸(化合物tk2)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0942-1151
將以文獻記載(J.Am.Chem.Soc.2011,133，10708.)之方法合成之(1S，4S)-1-羧基-4-(甲基亞磺酸基亞硫醯基)戊烷-1，5-二銨2,2,2-三氟乙酸鹽(化合物tk1)(273.4mg、0.604mmol)於室溫溶於2M氫氧化鈉水溶液(2.1mL)後，添加參(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽(182mg、0.635mmol)。於同溫度攪拌15分鐘後，添加37%福馬林水溶液(0.9mL)。於同溫度攪拌1.5小時後，添加2M氫氧化鈉水溶液(0.15mL)及Boc2O(528mg、2.417mmol)之1,4-二噁烷(2mL)溶液。將反應混合物於同溫度攪拌17.5小時後，添加Boc2O(250mg)。攪拌6.5小時後，將以乙酸乙酯稀釋的混合物以冰浴冷卻，添加飽和硫酸氫鉀水溶液(0.8mL)。以乙酸乙酯萃取(2次)，將有機相以飽和食鹽水(4mL)洗滌。以硫酸鈉乾燥後，減壓濃縮，將獲得之粗產物以順相矽膠管柱層析(己烷/乙酸乙酯)精製，獲得(S)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-4-((S)-3-(第三丁氧羰基)噻唑烷-5-基)丁酸(化合物tk2)(131.7mg、56%)。
LCMS(ESI)m/z=389(M-H)-
保持時間：0.83分(分析條件SQDAA05)
5-((S)-3-((第三丁氧羰基)胺基)-4-(氰基甲氧基)-4-側氧基丁基)噻唑烷-3-羧酸(S)-第三丁酯(化合物tk3)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0943-1152
於氮氣氛圍下，於(S)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-4-((S)-3-(第三丁氧羰基)噻唑烷-5-基)丁酸(化合物tk2)(98mg、0.251mmol)之乙腈(0.5mL)溶液中，於室溫添加N,N-二異丙基乙胺(48μL、0.276mmol)，然後添加溴乙腈(88μL、1.255mmol)。將反應混合物於同溫度攪拌3小時後，減壓濃縮，將獲得之粗產物以順相矽膠管柱層析(己烷/乙酸乙酯)精製，獲得5-((S)-3-((第三丁氧羰基)胺基)-4-(氰基甲氧基)-4-側氧基丁基)噻唑烷-3-羧酸(S)-第三丁酯(化合物tk3)(94.0mg、87%)。
LCMS(ESI)m/z=428.1(M-H)-
保持時間：0.85分(分析條件SQDFA05)
5-((3S)-4-(((2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-基)氧基)-3-((第三丁氧羰基)胺基)-4-側氧基丁基)噻唑烷-3-羧酸(5S)-第三丁酯(化合物tk4)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0944-2310
於緩衝液A(12.5mL)，加入磷酸二氫((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-3-(((((2R，3S，4R， 5R)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(羥基)磷氧基)氧基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物1h)(44.0mg、0.069mmol)與5-((S)-3-((第三丁氧羰基)胺基)-4-(氰基甲氧基)-4-側氧基丁基)噻唑烷-3-羧酸(S)-第三丁酯(化合物tk3)(89mg、0.207mmol)之乙腈(0.3mL)溶液，於室溫攪拌1.25小時。冷凍乾燥後，將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.05%三氟乙酸水溶液/0.05%三氟乙酸乙腈溶液)精製，獲得5-((3S)-4-(((2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-基)氧基)-3-((第三丁氧羰基)胺基)-4-側氧基丁基)噻唑烷-3-羧酸(5S)-第三丁酯(化合物tk4)(17.4mg、25%)。
LCMS(ESI)m/z=1007.7(M-H)-
保持時間：0.54分(分析條件SQDFA05)
2-胺基-4-((S)-噻唑烷-5-基)丁酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(Ala(Tzm)-pdCpA)(化合物tk5)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0946-1154
於5-((3S)-4-(((2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-基)氧基)-3-((第三丁氧羰基)胺基)-4-側氧基丁基)噻唑烷-3-羧酸(5S)-第三丁酯(化合物tk4)(8.5mg、8.43μmol)之二氯甲烷(0.2mL)溶液中，添加10%三氟乙酸之二氯甲烷溶液(0.16mL)，於室溫攪拌1.25小時。減壓濃縮後，獲得2-胺基-4-((S)-噻唑烷-5-基)丁酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(Ala(Tzm)-pdCpA)(化合物tk5)(10.6mg、quant.)。
LCMS(ESI)m/z=807.5(M-H)-
保持時間：0.14分(分析條件SQDFA05)
10-1-2. 胺基醯基化pdCpA化合物tk12之合成
依以下流程合成。
Figure 107130626-A0101-12-0947-1155
(2S，5S)-2-胺基-6-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-5-(甲基二硫烷基)己酸(Lys(5S-SSMe)(Acbz))(化合物tk7)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0947-1156
於(2S，5S)-2,6-二胺基-5-(甲基二硫烷基)己酸(化合物tk6)(176mg、0.785mol)與碳酸氫鈉(659mg、7.85mmol)之水(1.2mL)溶液中，於室溫添加硫酸銅五水合物(100mg、0.4mmol)之水(0.3mL)溶液，然後添加以文獻記載(Biocon jugate Chem.2008，19，714.)之方法合成之碳酸(4-硝基苯基)4-疊氮化苄酯(296mg、0.941mmol)之丙酮(2.7mL)溶液。於同溫度攪拌25.75小時後，過濾反應混合物，以水洗滌濾紙上的固體。將濾取的固體懸浮於水(10mL)-甲醇(1mL)，於室溫添加乙 二胺四乙酸二氫二鈉(350mg、0.941mmol)。於同溫度攪拌7.75小時後，過濾反應混合物，將濾紙上之白色固體以逆相矽膠管柱層析(10mM乙酸銨水溶液/甲醇)精製，獲得(2S，5S)-2-胺基-6-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-5-(甲基二硫烷基)己酸(Lys(5S-SSMe)(Acbz))(化合物tk7)(50.2mg、16%)。
LCMS(ESI)m/z=398(M-H)-
保持時間：0.85分(分析條件SQDAA05)
(2S，5S)-6-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-(甲基二硫烷基)己酸(化合物tk8)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0948-1157
於(2S，5S)-2-胺基-6-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-5-(甲基二硫烷基)己酸(Lys(5S-SSMe)(Acbz))(化合物tk7)(70mg、0.175mmol)之1,4-二噁烷(2mL)-乙腈(1mL)溶液中，於室溫添加碳酸氫鈉(44.2mg、0.526mmol)、水(1mL)及Boc2O(115mg、0.526mmol)。於同溫度攪拌22.5小時後，將反應混合物減壓濃縮。將獲得之粗產物以逆相矽膠管柱層析(10mM乙酸銨水溶液/甲醇)精製，獲得(2S，5S)-6-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-(甲基二硫烷基)己酸(化合物tk8)(71.6mg、82%)。
LCMS(ESI)m/z=498.4(M-H)-
保持時間：0.91分(分析條件SQDAA05)
6-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-(甲基二硫烷基)己酸(2S，5S)-氰基甲酯(化合物tk9)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0949-2311
於氮氣氛圍下，於(2S，5S)-6-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-(甲基二硫烷基)己酸(化合物tk8)(132mg、0.264mmol)之乙腈(0.4mL)溶液中，於室溫添加N,N-二異丙基乙胺(51μL、0.291mmol)，然後添加溴乙腈(92μL、1.321mmol)。將反應混合物於同溫度攪拌4.5小時後，減壓濃縮，將獲得之粗產物以順相矽膠管柱層析(己烷/乙酸乙酯)精製，獲得6-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-(甲基二硫烷基)己酸(2S，5S)-氰基甲酯(化合物tk9)(127.3mg、89%)。
LCMS(ESI)m/z=537.6(M-H)-
保持時間：0.91分(分析條件SQDFA05)
6-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-(甲基二硫烷基)己酸(2S，5S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合 物tk10)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0950-2313
於緩衝液A(13mL)中，加入磷酸二氫((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-3-(((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(羥基)磷氧基)氧基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物1h)(49.2mg、0.077mmol)與6-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-(甲基二硫烷基)己酸(2S，5S)-氰基甲酯(化合物tk9)(125mg、0.232mmol)之乙腈(0.5mL)溶液，於室溫攪拌2小時。添加乙腈(0.5mL)，攪拌1.25小時後，添加乙腈(0.5mL)。再攪拌1.25小時後，添加乙腈(0.5mL)，攪拌1.5小時。冷凍乾燥後，將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.05%三氟乙酸水溶液/0.05%三氟乙酸乙腈溶液)精製，獲得6-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-(甲基二硫烷基)己酸(2S，5S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物tk10)(14.0mg、16%)。
LCMS(ESI)m/z=1116.7(M-H)-
保持時間：0.62分(分析條件SQDFA05)
2-胺基-6-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-5-(甲基二硫烷基)己酸(2S，5S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(Lys(5S-SSMe)(Acbz)-pdCpA)(化合物tk11)及2,6-二胺基-5-(甲基二硫烷基)己酸(2S，5S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(Lys(5S-SSMe)-pdCpA、化合物tk12)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0951-1160
於6-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-(甲基二硫烷基)己酸(2S，5S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合 物tk10)(14.0mg、0.013mmol)之二氯甲烷(0.2mL)溶液中，添加10%三氟乙酸之二氯甲烷溶液(0.24mL)，於室溫攪拌30分鐘。減壓濃縮後，將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.05%三氟乙酸水溶液/0.05%三氟乙酸乙腈溶液)精製，獲得2-胺基-6-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-5-(甲基二硫烷基)己酸(2S，5S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(Lys(5S-SSMe)(Acbz)-pdCpA)(化合物tk11)(3.2mg、25%)及2,6-二胺基-5-(甲基二硫烷基)己酸(2S，5S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(Lys(5S-SSMe)-pdCpA)(化合物tk12)(1.5mg、14%)。
2-胺基-6-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-5-(甲基二硫烷基)己酸(2S，5S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(Lys(5S-SSMe)(Acbz)-pdCpA)(化合物tk11)
LCMS(ESI)m/z=1016.5(M-H)-
保持時間：0.45分(分析條件SQDFA05)
2,6-二胺基-5-(甲基二硫烷基)己酸(2S，5S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧 基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(Lys(5S-SSMe)-pdCpA)(化合物tk12)
LCMS(ESI)m/z=841.4(M-H)-
保持時間：0.20分(分析條件SQDFA05)
10-1-3. 胺基醯基化pdCpA化合物tk18之合成
依以下流程合成。
Figure 107130626-A0101-12-0953-1161
碳酸(4-硝基苯基)2-疊氮化苄酯(化合物tk13)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0953-1162
與文獻記載(Biocon jugate Chem.2008，19，714.)之方法同樣，從(2-疊氮化物苯基)甲醇及氯甲酸4-硝基苯酯合成。
LCMS(ESI)m/z=138(HOC6H4NO2-H)-
保持時間：1.03分(分析條件SQDAA05)
(2S，5S)-2-胺基-6-((((2-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-5-(甲基二硫烷基)己酸(Lys(5S-SSMe)(oAcbz))(化合物tk14)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0954-2314
於以文獻記載(J.Am.Chem.Soc.2011,133，10708.)之方法合成之(1S，4S)-1-羧基-4-(甲基亞磺酸基亞硫醯基)戊烷-1，5-二銨2,2,2-三氟乙酸鹽(化合物tk1)(226mg、0.50mmol)與碳酸氫鈉(420mg、5.00mmol)之水(1.2mL)溶液中，於室溫添加硫酸銅五水合物(63.6mg、0.255mmol)之水(0.3mL)溶液，然後添加碳酸(4-硝基苯基)2-疊氮化苄酯(化合物tk13)(188mg、0.599mmol)之乙腈(6mL)溶液。於同溫度攪拌49小時後，過濾反應混合物，以水洗滌濾紙上之固體。將濾取之固體懸浮於水(10mL)-甲醇(1mL)，於室溫添加乙二胺四乙酸二氫二鈉(223mg、0.599mmol)。於同溫度攪拌17.25小時後，過濾反應混合物，將濾紙上之白色固體以逆相矽膠管柱層析(10mM乙酸銨水溶液/甲醇)精製，獲得((2S，5S)-2-胺基-6-((((2-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-5-(甲基二硫烷基)己酸(Lys(5S-SSMe)(oAcbz))(化合物tk14)(30.2mg、15%)。
LCMS(ESI)m/z=398(M-H)-
保持時間：0.85分(分析條件SQDAA05)
(2S，5S)-6-((((2-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺 基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-(甲基二硫烷基)己酸(化合物tk15)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0955-1164
於((2S，5S)-2-胺基-6-((((2-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-5-(甲基二硫烷基)己酸(Lys(5S-SSMe)(oAcbz))(化合物tk14)(78mg、0.195mmol)及碳酸氫鈉(65.6mg、0.781mmol)之混合物中，於室溫添加水(1mL)及Boc2O(170mg、0.781mmol)之1,4-二噁烷(1mL)溶液。於同溫度攪拌12.5小時後，以冰浴冷卻，以乙酸乙酯及水稀釋而得之混合物中，加入硫酸氫鉀(115mg)水溶液。以乙酸乙酯萃取(2次)，將有機相以食鹽水(1mL，2次)洗滌，以硫酸鈉乾燥。減壓濃縮後，將獲得之粗產物以順相矽膠管柱層析(己烷/乙酸乙酯)精製，獲得(2S，5S)-6-((((2-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-(甲基二硫烷基)己酸(化合物tk15)(90.3mg、93%)。
LCMS(ESI)m/z=498(M-H)-
保持時間：0.90分(分析條件SQDAA05)
6-((((2-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-(甲基二硫烷基)己酸(2S，5S)-氰基甲酯(化合物tk16)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0956-1165
於氮氣氛圍下，於(2S，5S)-6-((((2-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-(甲基二硫烷基)己酸(化合物tk15)(89.5mg、0.179mmol)之乙腈(0.3mL)溶液中，於室溫添加N,N-二異丙基乙胺(34μL、0.197mmol)，然後添加溴乙腈(62μL、0.896mmol)。將反應混合物於同溫度攪拌1.25小時後，減壓濃縮，將獲得之粗產物以順相矽膠管柱層析(己烷/乙酸乙酯)精製，獲得6-((((2-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-(甲基二硫烷基)己酸(2S，5S)-氰基甲酯(化合物tk16)(77.5mg、80%)。
LCMS(ESI)m/z=539.5(M+H)+
保持時間：0.92分(分析條件SQDFA05)
6-((((2-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-(甲基二硫烷基)己酸(2S，5S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物tk17)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0957-1166
於緩衝液A(8mL)，加入磷酸二氫((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-3-(((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(羥基)磷氧基)氧基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物1h)(30.3mg、0.048mmol)與6-((((2-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-(甲基二硫烷基)己酸(2S，5S)-氰基甲酯(化合物tk16)(77mg、0.143mmol)之乙腈(0.7mL)溶液，於室溫攪拌40分鐘。添加乙腈(3mL)，攪拌55分鐘。再添加乙腈(2mL)，攪拌5小時。冷凍乾燥後，將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.05%三氟乙酸水溶液/0.05%三氟乙酸乙腈溶液)精製，獲得6-((((2-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-(甲基二硫烷基)己酸(2S，5S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物tk17)(2.8mg、5%)。
LCMS(ESI)m/z=1116.2(M-H)-
保持時間：0.65分(分析條件SQDFA05)
2-胺基-6-((((2-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺 基)-5-(甲基二硫烷基)己酸(2S，5S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(Lys(5S-SSMe)(oAcbz)-pdCpA)(化合物tk18)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0958-2315
於6-((((2-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-5-(甲基二硫烷基)己酸(2S，5S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物tk17)(2.8mg、2.504μmol)之二氯甲烷(0.1mL)溶液中，添加10%三氟乙酸之二氯甲烷溶液(0.1mL)，於室溫攪拌60分鐘。減壓濃縮後，將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.05%三氟乙酸水溶液/0.05%三氟乙酸乙腈溶液)精製，獲得2-胺基-6-((((2-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-5-(甲基二硫烷基)己酸(2S，5S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋 喃-3-酯(Lys(5S-SSMe)(oAcbz)-pdCpA)(化合物tk18)(1.4mg、55%)。
LCMS(ESI)m/z=1016.0(M-H)-
保持時間：0.44分(分析條件SQDFA05)
10-1-4. 胺基醯基化pdCpA化合物tk26之合成
依以下流程合成。
Figure 107130626-A0101-12-0959-1168
Figure 107130626-A0101-12-0959-1169
(R)-2-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-3-(第三 丁基二硫烷基)丙酸(化合物tk20)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0960-1170
於氮氣氛圍下，於S-第三丁基巰基-L-半胱胺酸(化合物tk19)(116mg、0.554mmol)與以文獻記載(Bioconjugate Chem.2008，19，714.)之方法合成之碳酸(4-硝基苯基)4-疊氮化苄酯(209mg、0.665mmol)之混合物中，於室溫添加DMF(0.5mL)。將混合物以冰浴冷卻後，添加三乙胺(232μL、1.663mmol)。將反應混合物從冰冷下於25℃攪拌15.5小時後，以逆相矽膠管柱層析(0.05%三氟乙酸水溶液/0.05%三氟乙酸乙腈溶液)精製，獲得(R)-2-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(化合物tk20)(211.4mg、99%)。
LCMS(ESI)m/z=383(M-H)-
保持時間：0.84分(分析條件SQDFA05)
(1R，4'S，5S)-4'-(4-((R)-2-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙醯胺)丁基)-5'-側氧基螺)-5'-雙環[3.3.1]壬烷-9,2'-[1,3,2]噁唑硼烷-9,2'-[1,3,2]陽離子-11-陰離子(化合物tk21)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0960-2316
於氮氣氛圍下，於(1R，4'S，5S)-4'-(4-胺基丁基)-5'- 側氧基螺[雙環[3.3.1]壬烷-9,2'-[1,3,2]噁唑硼烷]-3'-陽離子-11-陰離子(化合物49)(166mg、0.625mmol)及(R)-2-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(化合物tk20)(200.3mg、0.521mmol)之DMF(0.6mL)懸浮液中，於室溫邊攪拌邊添加N,N-二異丙基乙胺(136μL、0.781mmol)。將獲得之混合物以冰浴冷卻後，添加HATU(238mg、0.625mmol)。將反應混合物於室溫攪拌45分鐘後，以逆相矽膠管柱層析(0.05%三氟乙酸水溶液/0.05%三氟乙酸乙腈溶液)精製，獲得(1R，4'S，5S)-4'-(4-((R)-2-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙醯胺)丁基)-5'-側氧基螺)-5'-雙環[3.3.1]壬烷-9,2'-[1,3,2]噁唑硼烷-9,2'-[1,3,2]陽離子-11-陰離子(化合物tk21)(313.1mg、95%)。
(ESI)m/z=631.5(M-H)-
保持時間：1.01分(分析條件SQDFA05)
(S)-2-胺基-6-((R)-2-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙醯胺)己酸(Lys(Acbz-Cys(StBu)))(化合物tk22)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0961-1172
於氮氣氛圍下，於(1R，4'S，5S)-4'-(4-((R)-2-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙醯胺) 丁基)-5'-側氧基螺)-5'-雙環[3.3.1]壬烷-9,2'-[1,3,2]噁唑硼烷-9,2'-[1,3,2]陽離子-11-陰離子(化合物tk21)(300mg、0.474mmol)之1,4-二噁烷(2.4mL)之懸浮液中，添加濃鹽酸(395μL)。將反應混合物於40~45℃攪拌3.5小時。冷卻至室溫後，將反應混合物減壓濃縮。將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.05%三氟乙酸水溶液/0.05%三氟乙酸乙腈溶液)精製，獲得(S)-2-胺基-6-((R)-2-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙醯胺)己酸(Lys(Acbz-Cys(StBu)))(化合物tk22)(121.9mg、50%)。
LCMS(ESI)m/z=513(M+H)+
保持時間：0.61分(分析條件SQDFA05)
(S)-6-((R)-2-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙醯胺)-2-((第三丁氧羰基)胺基)己酸(化合物tk23)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0962-1173
於(S)-2-胺基-6-((R)-2-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙醯胺)己酸(Lys(Acbz-Cys(StBu)))(化合物tk22)(121.9mg、0.238mmol)，於室溫加入1,4-二噁烷(1mL)及水(1mL)。將獲得之混合物以冰浴冷卻後，添加碳酸氫鈉(59.9mg、0.713mmol)，再添加Boc2O(104mg、0.476mmol)。將獲得之反應混合物於室溫攪拌 21小時後，以逆相矽膠管柱層析(0.05%三氟乙酸水溶液/0.05%三氟乙酸乙腈溶液)精製，獲得(S)-6-((R)-2-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙醯胺)-2-((第三丁氧羰基)胺基)己酸(化合物tk23)(111.0mg、76%)。
LCMS(ESI)m/z=611(M-H)-
保持時間：0.88分(分析條件SQDFA05)
6-((R)-2-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙醯胺)-2-((第三丁氧羰基)胺基)己酸(S)-氰基甲酯(化合物tk24)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0963-1174
於氮氣氛圍下，於(S)-6-((R)-2-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙醯胺)-2-((第三丁氧羰基)胺基)己酸(化合物tk23)(110mg、0.180mmol)之乙腈(0.3mL)溶液中，於室溫添加N,N-二異丙基乙胺(34μL、0.197mmol)，然後添加溴乙腈(38μL、0.539mmol)。將反應混合物於同溫度攪拌15.5小時後，減壓濃縮，將獲得之粗產物以順相矽膠管柱層析(己烷/乙酸乙酯)精製，獲得6-((R)-2-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙醯胺)-2-((第三丁氧羰基)胺基)己酸(S)-氰基甲酯(化合物tk24)(97.3mg、83%)。
LCMS(ESI)m/z=650.6(M-H)-
保持時間：0.95分(分析條件SQDFA05)
6-((R)-2-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙醯胺)-2-((第三丁氧羰基)胺基)己酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物tk25)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0964-1175
於緩衝液A(9mL)，加入磷酸二氫((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-3-(((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(羥基)磷氧基)氧基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物1h)(30.3mg、0.048mmol)之水溶液(0.3mL)與6-((R)-2-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙醯胺)-2-((第三丁氧羰基)胺基)己酸(S)-氰基甲酯(化合物tk24)(93mg、0.143mmol)之四氫呋喃(0.3mL)溶液，於室溫攪拌4.5小時。冷凍乾燥後，將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.05%三氟乙酸水溶液/0.05%三氟乙酸乙腈溶液)精製，獲得6-((R)-2-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙醯胺)-2-((第三丁氧羰基)胺基)己酸(2S)-(2R，3S， 4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物tk25)(6.7mg、11%)。
LCMS(ESI)m/z=1231.7(M+H)+
保持時間：0.90分(分析條件SQDAA05)
2-胺基-6-((R)-2-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙醯胺)己酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(Lys(Acbz-Cys(StBu))-pdCpA)(化合物tk26)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0965-2317
將6-((R)-2-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙醯胺)-2-((第三丁氧羰基)胺基)己酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物tk25)(6.7mg、5.44μmol)之二氯甲烷(0.4mL)溶液以冰浴冷卻後，添加三氟乙酸(0.1mL)，於室溫攪 拌25分鐘。減壓濃縮後，將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.05%三氟乙酸水溶液/0.05%三氟乙酸乙腈溶液)精製，獲得2-胺基-6-((R)-2-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙醯胺)己酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(Lys(Acbz-Cys(StBu))-pdCpA)(化合物tk26)(1.7mg、28%)。
LCMS(ESI)m/z=1130.1(M-H)-
保持時間：0.54分(分析條件SQDFA05)
10-1-5. 胺基醯基化pdCpA化合物tk30之合成
依以下流程合成。
Figure 107130626-A0101-12-0966-1177
噻唑烷-3,4-二羧酸4-(氰基甲基)(R)-3-第三丁酯(化合物tk28)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0967-1178
於氮氣氛圍下，於Boc-Thiopro-OH(化合物tk27)(377mg、1.616mmol)之乙腈(1mL)溶液中，於室溫添加N,N-二異丙基乙胺(310μL、1.778mmol)，然後溴乙腈(563μL、8.08mmol)。將反應混合物於同溫度攪拌2.25小時後，減壓濃縮，將獲得之粗產物以順相矽膠管柱層析(己烷/乙酸乙酯)精製，獲得噻唑烷-3,4-二羧酸4-(氰基甲基)(R)-3-第三丁酯(化合物tk28)(272.9mg、62%)。
LCMS(ESI)m/z=273.3(M+H)+
保持時間：0.71分(分析條件SQDFA05)
噻唑烷-3,4-二羧酸3-第三丁基(4R)-4-((2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯)(化合物tk29)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0967-2318
於緩衝液A(30mL)，添加磷酸二氫((2R，3S， 5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-3-(((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(羥基)磷氧基)氧基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物1h)(148mg、0.233mmol)與噻唑烷-3,4-二羧酸4-(氰基甲基)(R)-3-第三丁酯(化合物tk28)(254mg、0.933mmol)之乙腈(0.7mL)溶液，於室溫攪拌1.5小時。冷凍乾燥後，將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.05%三氟乙酸水溶液/0.05%三氟乙酸乙腈溶液)精製，獲得噻唑烷-3,4-二羧酸3-第三丁基(4R)-4-((2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯)(化合物tk29)(64.7mg、33%)。
LCMS(ESI)m/z=850.3(M-H)-
保持時間：0.41分(分析條件SQDFA05)
噻唑烷-4-羧酸(4R)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(Thiopro-pdCpA)(化合物tk30)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0969-1180
於噻唑烷-3,4-二羧酸3-第三丁基(4R)-4-((2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物tk29)(19mg、0.022mmol)之二氯甲烷(0.4mL)溶液中，添加10%三氟乙酸之二氯甲烷溶液(0.4mL)，於室溫攪拌60分鐘後，減壓濃縮，獲得噻唑烷-4-羧酸(4R)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(Thiopro-pdCpA)(化合物tk30)(25mg、quant.)。
LCMS(ESI)m/z=750.4(M-H)-
保持時間：0.34分(分析條件SQDAA05)
10-1-6. 胺基醯基化pdCpA化合物tk38之合成
依以下流程合成。
Figure 107130626-A0101-12-0970-1181
Figure 107130626-A0101-12-0970-1182
(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-6-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)己酸(化合物SP661)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0970-1183
於冰冷下，於Fmoc-離胺酸鹽酸鹽(化合物tk31)(4.9g、12.10mmol)與碳酸氫鈉(2.77g、33.0mmol)之DMF(22mL)懸浮液加入以文獻記載(Bioconjugate Chem. 2008，19，714.)之方法合成之碳酸(4-硝基苯基)4-疊氮化苄酯(化合物tk32)(3.46g、11.0mmol)。將反應混合物於25℃攪拌8小時後，添加1N鹽酸，以乙酸乙酯萃取。將有機相以食鹽水洗滌3次，以硫酸鈉乾燥。減壓濃縮後，將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)精製，獲得(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-6-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)己酸(化合物SP661)(5.5g、92%)。
LCMS(ESI)m/z=542(M-H)-
保持時間：0.89分(分析條件SQDFA05)
(S)-2-胺基-6-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)己酸(Lys(Acbz))(化合物tk34)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0971-2320
於氮氣氛圍下，於(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-6-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)己酸(化合物SP661)(210mg、0.386mmol)之DMF(0.7mL)溶液中，於室溫添加DBU(0.064mL、0.425mmol)。將獲得之反應混合物於同溫度攪拌20分鐘後，以逆相矽膠管柱層析(0.05%三氟乙酸水溶液/0.05%三氟乙酸乙腈溶液)精製，獲得(S)-2-胺基-6-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)己酸(Lys(Acbz))(化合物tk34)(100mg、81%)。
LCMS(ESI)m/z=320(M-H)-
保持時間：0.47分(分析條件SQDFA05)
(S)-6-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)己酸(化合物tk35)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0972-2321
於2-胺基-6-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)己酸(Lys(Acbz))(化合物tk34)(100mg、0.311mmol)，於室溫加入1,4-二噁烷(5mL)及水(2mL)。將獲得之混合物以冰浴冷卻後，添加碳酸氫鈉(78mg、0.934mmol)，再加入Boc2O(136mg、0.622mmol)。將獲得之反應混合物於室溫攪拌2小時20分鐘後，添加Boc2O(70mg)。於同溫度攪拌40分鐘後，於冰冷下添加乙酸乙酯及水。於獲得之混合物中添加飽和硫酸氫鉀水溶液(0.3mL)後，以乙酸乙酯萃取2次。將有機相以水及食鹽水洗滌、以硫酸鈉乾燥。減壓濃縮，將獲得之粗產物以順相矽膠管柱層析(己烷/乙酸乙酯)精製，獲得(S)-6-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)己酸(化合物tk35)(103.9mg、79%)。
LCMS(ESI)m/z=420(M-H)-
保持時間：0.76分(分析條件SQDFA05)
6-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)己酸(S)-氰基甲酯(化合物tk36)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0973-1186
於氮氣氛圍下，於(S)-6-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)己酸(化合物tk35)(100.9mg、0.239mmol)之乙腈(0.4mL)溶液中，於室溫添加N,N-二異丙基乙胺(46μL、0.263mmol)，然後溴乙腈(83μL、1.197mmol)。將反應混合物於同溫度攪拌2.5小時後，減壓濃縮，將獲得之粗產物以順相矽膠管柱層析(己烷/乙酸乙酯)精製，獲得6-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)己酸(S)-氰基甲酯(化合物tk36)(108.5mg、98%)。
LCMS(ESI)m/z=459(M-H)-
保持時間：0.84分(分析條件SQDFA05)
6-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)己酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物tk37)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0973-2322
於緩衝液A(14mL)中，加入磷酸二氫((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-3-(((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(羥基)磷氧基)氧基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物1h)(47.9mg、0.075mmol)之水溶液(0.3mL)與6-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)己酸(S)-氰基甲酯(化合物tk36)(104mg、0226mmol)之四氫呋喃(0.3mL)溶液，於室溫攪拌1.75小時。冷凍乾燥後，將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.05%三氟乙酸水溶液/0.05%三氟乙酸乙腈溶液)精製，獲得6-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)己酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物tk37)(14.6mg、19%)。
LCMS(ESI)m/z=1040.8(M+H)+
保持時間：0.56分(分析條件SQDFA05)
2-胺基-6-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)己酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(Lys(Acbz)-pdCpA)(化合物tk38)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0975-1188
將6-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)己酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物tk37)(14.6mg、0.014mmol)之二氯甲烷(0.4mL)溶液以冰浴冷卻後，添加三氟乙酸(0.05mL)，於室溫攪拌35分鐘。減壓濃縮後，將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.05%三氟乙酸水溶液/0.05%三氟乙酸乙腈溶液)精製，獲得2-胺基-6-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)己酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(Lys(Acbz)-pdCpA)(化合物tk38)(1.1mg、8%)。
LCMS(ESI)m/z=938.5(M-H)-
保持時間：0.39分(分析條件SQDFA05)
10-1-7. 胺基醯基化pdCpA化合物tk43之合成
依以下流程合成。
Figure 107130626-A0101-12-0976-1189
(S)-6-((((2-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)己酸(化合物tk40)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0976-2323
於Boc-Lys-OH(化合物tk39)(295mg、1.198mmol)與碳酸氫鈉(252mg、2.99mmol)之1,4-二噁烷(3mL)-水(2mL)之懸浮液中，添加碳酸(4-硝基苯基)2-疊氮化苄酯(414mg、1.317mmol)。將反應混合物於室溫攪拌22小時後，以冰浴冷卻，於以乙酸乙酯及水稀釋而得之混合物中添加飽和硫酸氫鉀水溶液(0.7mL)。以乙酸乙酯萃取(2次)，將有機相以水(10mL，02次)及食鹽水(10mL)洗滌，以硫酸鈉乾燥。減壓濃縮後，將獲得之粗產物以順相矽膠管柱層析(己烷/乙酸乙酯)精製，獲得 (S)-6-((((2-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)己酸(化合物tk40)(431.5mg、85%)。
LCMS(ESI)m/z=420(M-H)-
保持時間：0.76分(分析條件SQDFA05)
6-((((2-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)己酸(S)-氰基甲酯(化合物tk41)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0977-1191
於氮氣氛圍下，於(S)-6-((((2-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)己酸(化合物tk40)(114mg、0.270mmol)之乙腈(0.4mL)溶液中，於室溫添加N,N-二異丙基乙胺(52μL、0.298mmol)，然後添加溴乙腈(94μL、1.352mmol)。將反應混合物於同溫度攪拌1.5小時後，減壓濃縮，將獲得之粗產物以順相矽膠管柱層析(己烷/乙酸乙酯)精製，獲得6-((((2-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)己酸(S)-氰基甲酯(化合物tk41)(140.2mg、quant.)。
LCMS(ESI)m/z=459.5(M-H)-
保持時間：0.84分(分析條件SQDFA05)
6-((((2-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)己酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌 呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物tk42)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0978-2325
於緩衝液A(14mL)加入磷酸二氫((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-3-(((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(羥基)磷氧基)氧基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物1h)(46.3mg、0.073mmol)之水溶液(0.3mL)與6-((((2-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)己酸(S)-氰基甲酯(化合物tk41)(134mg、0.291mmol)之四氫呋喃(0.3mL)溶液，於室溫攪拌1.75小時。添加乙腈(0.6mL)，於同溫度攪拌1.25小時。冷凍乾燥後，將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.05%三氟乙酸水溶液/0.05%三氟乙酸乙腈溶液)精製，獲得6-((((2-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)己酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物tk42)(11.1mg、15%)。
LCMS(ESI)m/z=1038.6(M-H)-
保持時間：0.58分(分析條件SQDFA05)
2-胺基-6-((((2-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)己酸 (2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(Lys(oAcbz)-pdCpA)(化合物tk43)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0979-2326
於(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物tk42)(10mg、9.62μmol)之二氯甲烷(0.4mL)溶液中，添加三氟乙酸(0.075mL)，於室溫攪拌20分鐘。減壓濃縮後，將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.05%三氟乙酸水溶液/0.05%三氟乙酸乙腈溶液)精製，獲得2-胺基-6-((((2-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)己酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(Lys(oAcbz)-pdCpA)(化合物tk43)(8.0mg、89%)。
LCMS(ESI)m/z=938.5(M-H)-
保持時間：0.39分(分析條件SQDFA05)
10-1-8. 胺基醯基化pdCpA化合物tk47之合成
依以下流程合成。
Figure 107130626-A0101-12-0980-1194
6-(((苄氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)己酸(S)-氰基甲酯(化合物tk45)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0980-1195
於氮氣氛圍下，於Boc-Lys(Z)-OH(化合物tk44)(160mg、0.421mmol)之乙腈(0.6mL)溶液中，於室溫添加N,N-二異丙基乙胺(81μL、0.463mmol)，然後添加溴乙腈(147μL、2.103mmol)。將反應混合物於同溫度1攪拌3小時後，減壓濃縮，將獲得之粗產物以順相矽膠管柱層析(己烷/乙酸乙 酯)精製，獲得6-(((苄氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)己酸(S)-氰基甲酯(化合物tk45)(180mg、quant.)。
LCMS(ESI)m/z=418(M-H)-
保持時間：0.79分(分析條件SQDFA05)
6-(((苄氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)己酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物tk46)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0981-1196
於緩衝液A(18mL)，加入磷酸二氫((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-3-(((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(羥基)磷氧基)氧基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物1h)(65.6mg、0.103mmol)之水溶液(0.3mL)與6-(((苄氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)己酸(S)-氰基甲酯(化合物tk45)(173mg、0.412mmol)之四氫呋喃(0.3mL)溶液，於室溫攪拌0.75小時。冷凍乾燥後，將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.05%三氟乙酸水溶液/0.05%三氟乙酸乙腈溶液)精製，獲得6-(((苄氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)己酸 (2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物tk46)(18.6mg、18%)。
LCMS(ESI)m/z=999.7(M+H)+
保持時間：0.53分(分析條件SQDFA05)
2-胺基-6-(((苄氧基)羰基)胺基)己酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(Lys(Z)-pdCpA)(化合物tk47)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0982-1197
於6-(((苄氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)己酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物tk46)(18.6mg、0.019mmol)之二氯甲烷(1mL)溶液中，添加三氟乙酸(0.075mL)，於室溫攪拌40分鐘。減壓濃縮後，將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.05%三氟乙酸水溶液/0.05%三氟乙酸乙腈溶液)精製，獲得 2-胺基-6-(((苄氧基)羰基)胺基)己酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(Lys(Z)-pdCpA)(化合物tk47)(13.4mg、80%)。
LCMS(ESI)m/z=897.4(M-H)-
保持時間：0.35分(分析條件SQDFA05)
10-1-9. 胺基醯基化pdCpA化合物tk51之合成依以下流程合成。
Figure 107130626-A0101-12-0983-1198
(S)-6-疊氮化-2-((第三丁氧羰基)胺基)己酸(化合物tk48)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0983-1199
於Boc-Lys-OH(化合物tk39)(1.0g、4.06mmol)與硫 酸銅五水合物(20mg、0.081mmol)之甲醇(15mL)-水(3mL)混合物，於室溫添加碳酸氫鈉(0.65g、7.74mmol)，然後加入以文獻記載(Org.Lett.，2007，9，3797.)之方法合成之疊氮化1H-咪唑-1-磺醯基鹽酸鹽(1.02g、4.87mmol)。於反應混合物添加碳酸氫鈉(0.65g、7.74mmol)後，於室溫攪拌23小時。將反應混合物以冰浴冷卻後，添加飽和硫酸氫鉀水溶液(10mL)。將獲得之混合物以沸石過濾，以乙酸乙酯洗滌後，將濾液減壓濃縮。將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.05%三氟乙酸水溶液/0.05%三氟乙酸乙腈溶液)精製，獲得(S)-6-疊氮化-2-((第三丁氧羰基)胺基)己酸(化合物tk48)(948.7mg、86%)。
LCMS(ESI)m/z=271(M-H)-
保持時間：0.66分(分析條件SQDFA05)
6-疊氮化-2-((第三丁氧羰基)胺基)己酸(S)-氰基甲酯(化合物tk49)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0984-1200
於氮氣氛圍下，於(S)-6-疊氮化-2-((第三丁氧羰基)胺基)己酸(化合物tk48)(140mg、0.514mmol))之乙腈(0.6mL)溶液中，於室溫添加N,N-二異丙基乙胺(99μL、0.566mmol)，然後添加溴乙腈(179μL、2.57mmol)。將反應混合物於同溫度攪拌3.75小時後，減壓濃縮，將獲得之粗產物以順相矽膠管柱層析(己烷/乙酸乙酯)精製，獲得6-疊氮化-2-((第三丁氧羰基) 胺基)己酸(S)-氰基甲酯(化合物tk49)(175mg、quant.)。
LCMS(ESI)m/z=310(M-H)-
保持時間：0.77分(分析條件SQDFA05)
6-疊氮化-2-((第三丁氧羰基)胺基)己酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物tk50)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0985-1201
於緩衝液A(18mL)加入磷酸二氫((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-3-(((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(羥基)磷氧基)氧基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物1h)(78mg、0.122mmol)之水溶液(0.3mL)與6-疊氮化-2-((第三丁氧羰基)胺基)己酸(S)-氰基甲酯(化合物tk49)(152mg、0.488mmol)之四氫呋喃(0.3mL)溶液，於室溫攪拌0.75小時。冷凍乾燥後，將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.05%三氟乙酸水溶液/0.05%三氟乙酸乙腈溶液)精製，獲得6-疊氮化-2-((第三丁氧羰基)胺基)己酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R， 3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物tk50)(30.2mg、28%)。
LCMS(ESI)m/z=889.4(M-H)-
保持時間：0.47分(分析條件SQDFA05)
2-胺基-6-疊氮化物己酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(Lys(N3)-pdCpA)(化合物tk51)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0986-1202
於6-疊氮化-2-((第三丁氧羰基)胺基)己酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物tk50)(30.2mg、0.034mmol)之二氯甲烷(1.5mL)溶液中添加三氟乙酸(0.1mL)，於室溫攪拌30分鐘。減壓濃縮後，將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.05%三氟乙酸水溶液/0.05%三氟乙酸乙腈溶液)精製，獲得2-胺基-6-疊氮化物己酸 (2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(Lys(N3)-pdCpA)(化合物tk51)(19.4mg、72%)。
LCMS(ESI)m/z=789.4(M-H)-
保持時間：0.27分(分析條件SQDFA05)
10-1-10. 胺基醯基化pdCpA化合物tk55之合成
依以下流程合成。
Figure 107130626-A0101-12-0987-1203
2-((第三丁氧羰基)胺基)-6-(2,2,2-三氟乙醯胺)己酸(S)-氰基甲酯(化合物tk53)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0987-1204
於氮氣氛圍下，於Boc-Lys(Tfa)-OH(化合物tk52)(182mg、0.532mmol)之乙腈(0.5mL)溶液中，於室溫添加N,N-二異丙基乙胺(102μL、0.585mmol)，然後添加溴乙腈(185μL、2.66mmol)。將反應混合物於同溫度攪拌5.25小時後，減壓濃縮，將獲得之粗產物以順相矽膠管柱層析(己烷/乙酸乙酯)精製，獲得2-((第三丁氧羰基)胺基)-6-(2,2,2-三氟乙醯胺)己酸(S)-氰基甲酯(化合物tk53)(200.8mg、99%)。
LCMS(ESI)m/z=379.9(M-H)-
保持時間：0.70分(分析條件SQDFA05)
2-((第三丁氧羰基)胺基)-6-(2,2,2-三氟乙醯胺)己酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物tk54)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0988-2327
於緩衝液A(20mL)加入磷酸二氫((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-3-(((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(羥基)磷氧基)氧基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物1h)(81mg、0.127mmol)與2-((第三丁氧羰基)胺基)-6-(2,2,2-三氟乙醯胺)己酸(S)-氰基甲酯(化合物tk53)(194mg、0.509mmol) 之乙腈(0.7mL)溶液，於室溫攪拌1.75小時。冷凍乾燥後，將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.05%三氟乙酸水溶液/0.05%三氟乙酸乙腈溶液)精製，獲得2-((第三丁氧羰基)胺基)-6-(2,2,2-三氟乙醯胺)己酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物tk54)(5.3mg、4%)。
LCMS(ESI)m/z=959.5(M-H)-
保持時間：0.44分(分析條件SQDFA05)
2-胺基-6-(2,2,2-三氟乙醯胺)己酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(Lys(Tfa)-pdCpA)(化合物tk55)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0989-1206
於2-((第三丁氧羰基)胺基)-6-(2,2,2-三氟乙醯胺)己酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基) 氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物tk54)(5.3mg、5.52μmol)之二氯甲烷(0.1mL)溶液中，添加10%三氟乙酸之二氯甲烷溶液(0.21mL)，於室溫攪拌55分鐘。減壓濃縮後，將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.05%三氟乙酸水溶液/0.05%三氟乙酸乙腈溶液)精製，獲得2-胺基-6-(2,2,2-三氟乙醯胺)己酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(Lys(Tfa)-pdCpA)(化合物tk55)(4.2mg、88%)。
LCMS(ESI)m/z=859.4(M-H)-
保持時間：0.26分(分析條件SQDFA05)
10-1-11. 胺基醯基化pdCpA化合物tk60之合成
依以下流程合成。
Figure 107130626-A0101-12-0990-1207
(S)-5-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)戊酸(化合物tk57)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0991-1208
於Boc-Orn-OH(化合物tk56)(321mg、1.382mmol)與碳酸氫鈉(290mg、3.45mmol)之1,4-二噁烷(3mL)-水(2mL)之懸浮液中，添加依文獻記載(Bioconjugate Chem.2008，19，714.)之方法合成之碳酸(4-硝基苯基)4-疊氮化苄酯(化合物tk32)(521mg、1.658mmol)。將反應混合物於室溫攪拌23小時後，以冰浴冷卻，於以乙酸乙酯及水稀釋而得之混合物中添加飽和硫酸氫鉀水溶液(2mL)。以乙酸乙酯萃取(2次)，將有機相以水(10mL，2次)及食鹽水(10mL)洗滌，以硫酸鈉乾燥。減壓濃縮後，獲得之粗產物以順相矽膠管柱層析(己烷/乙酸乙酯)精製，獲得((S)-5-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)戊酸(化合物tk57)(501.3mg、89%)。
LCMS(ESI)m/z=406(M-H)-
保持時間：0.73分(分析條件SQDFA05)
5-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)戊酸(S)-氰基甲酯(化合物tk58)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0991-2328
於氮氣氛圍下，於(S)-5-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)戊酸(化合物tk57)(367mg、0.901mmol)之乙腈(1mL)溶液中，於室溫添加N,N-二異丙基乙胺(173μL、0.991mmol)，然後添加溴乙腈(314μL、4.50mmol)。將反應混合物於同溫度攪拌1小時後，減壓濃縮，獲得之粗產物以順相矽膠管柱層析(己烷/乙酸乙酯)精製，獲得5-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)戊酸(S)-氰基甲酯(化合物tk58)(417.2mg、quant.)。
LCMS(ESI)m/z=445(M-H)-
保持時間：0.82分(分析條件SQDFA05)
x.5-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)戊酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物tk59)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0992-2329
於緩衝液A(33mL)中，加入磷酸二氫((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-3-(((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(羥基)磷氧基)氧基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物 1h)(143mg、0.224mmol)與5-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)戊酸(S)-氰基甲酯(化合物tk58)(400mg、0.896mmol)之乙腈(1mL)溶液，於室溫攪拌1.5小時。冷凍乾燥後，將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.05%三氟乙酸水溶液/0.05%三氟乙酸乙腈溶液)精製，獲得5-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)戊酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物tk59)(54.7mg、24%)。
LCMS(ESI)m/z=1024.5(M-H)-
保持時間：0.54分(分析條件SQDFA05)
2-胺基-5-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)戊酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(Orn(Acbz)-pdCpA)(化合物tk60)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0993-2330
於5-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-2-((第三 丁氧羰基)胺基)戊酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物tk59)(22.7mg、0.022mmol)之二氯甲烷(0.4mL)溶液中，添加10%三氟乙酸之二氯甲烷溶液(0.4mL)，於室溫攪拌20分鐘。減壓濃縮後，將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.05%三氟乙酸水溶液/0.05%三氟乙酸乙腈溶液)精製，獲得2-胺基-5-((((4-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)戊酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(Orn(Acbz)-pdCpA)(化合物tk60)(4.3mg、21%)。
LCMS(ESI)m/z=924.3(M-H)-
保持時間：0.37分(分析條件SQDFA05)
10-1-12. 胺基醯基化pdCpA化合物tk64之合成
依以下流程合成。
Figure 107130626-A0101-12-0995-1212
(S)-5-((((2-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)戊酸(化合物tk61)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0995-2331
於Boc-Orn-OH(化合物tk56)(308mg、1.326mmol)與碳酸氫鈉(278mg、3.32mmol)之1,4-二噁烷(3mL)-水(2mL)之懸浮液中，添加碳酸(4-硝基苯基)2-疊氮化苄酯(化合物tk13)(458mg、1.459mmol)。將反應混合物於室溫攪拌20.25小時後，以冰浴冷卻，於以乙酸乙酯及水稀釋而得之混合物中，添加飽和硫酸氫鉀水溶液(1.5mL)。以乙酸乙酯萃取(2次)，將有機相以水(10mL，2次)及食鹽水(10mL)洗滌，以硫酸鈉乾燥。減壓濃縮後，將獲得之粗產物以順相矽膠管柱層析(己烷/乙酸乙酯)精製，獲得(S)-5-((((2-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺 基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)戊酸(化合物tk61)(556.0mg、quant.)。
LCMS(ESI)m/z=406(M-H)-
保持時間：0.73分(分析條件SQDFA05)
5-((((2-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)戊酸(S)-氰基甲酯(化合物tk62)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0996-2332
於氮氣氛圍下，於(S)-5-((((2-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)戊酸(化合物tk61)(435.5mg、1.069mmol)之乙腈(1mL)溶液中，於室溫添加N,N-二異丙基乙胺(205μL、1.176mmol)，然後添加溴乙腈(373μL、5.34mmol)。將反應混合物於同溫度攪拌3.5小時後，減壓濃縮，將獲得之粗產物以順相矽膠管柱層析(己烷/乙酸乙酯)精製，獲得5-((((2-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)戊酸(S)-氰基甲酯(化合物tk62)(477.2mg、quant.)。
LCMS(ESI)m/z=445.4(M-H)-
保持時間：0.81分(分析條件SQDFA05)
5-((((2-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)戊酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四 氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物tk63)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0997-2333
於緩衝液A(33mL)，添加磷酸二氫((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-3-(((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(羥基)磷氧基)氧基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物1h)(160mg、0.252mmol)與5-((((2-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)戊酸(S)-氰基甲酯(化合物tk62)(450mg、1.008mmol)之乙腈(1.5mL)溶液，於室溫攪拌2小時。冷凍乾燥後，將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.05%三氟乙酸水溶液/0.05%三氟乙酸乙腈溶液)精製，獲得5-((((2-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)戊酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物tk63)(51.3mg、20%)。
LCMS(ESI)m/z=1024.5(M-H)-
保持時間：0.54分(分析條件SQDFA05)
2-胺基-5-((((2-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)戊酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(Orn(oAcbz)-pdCpA)(化合物tk64)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0998-2334
於5-((((2-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)戊酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物tk63)(51mg、0.050mmol)之二氯甲烷(0.45mL)溶液中，添加10%三氟乙酸之二氯甲烷溶液(0.45mL)，於室溫攪拌45分鐘。減壓濃縮後，將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.05%三氟乙酸水溶液/0.05%三氟乙酸乙腈溶液)精製，獲得2-胺基-5-((((2-疊氮化苄基)氧基)羰基)胺基)戊酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(Orn(oAcbz)-pdCpA)(化合物tk64)(42.6mg、93%)。
LCMS(ESI)m/z=924.4(M-H)-
保持時間：0.37分(分析條件SQDFA05)
10-1-13. 胺基醯基化pdCpA化合物tk68之合成
依以下流程合成。
Figure 107130626-A0101-12-0999-1217
5-(((苄氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)戊酸(S)-氰基甲酯(化合物tk66)之合成
Figure 107130626-A0101-12-0999-1218
於氮氣氛圍下，於Boc-Orn(Z)-OH(化合物tk65)(160mg、0.437mmol)之乙腈(0.5mL)溶液中，於室溫添加N,N-二異丙基乙胺(84μL、0.480mmol)，然後添加溴乙腈(152μL、2.183mmol)。將反應混合物於同溫度攪拌1小時後，減壓濃縮，將獲得之粗產物以順相矽膠管柱層析(己烷/乙酸乙 酯)精製，獲得5-(((苄氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)戊酸(S)-氰基甲酯(化合物tk66)(186.7mg、quant.)。
LCMS(ESI)m/z=404(M-H)-
保持時間：0.77分(分析條件SQDFA05)
5-(((苄氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)戊酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物tk67)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1000-2335
於緩衝液A(18mL)中，加入磷酸二氫((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-3-(((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(羥基)磷氧基)氧基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物1h)(67.9mg、0.107mmol)之水溶液(0.3mL)與5-(((苄氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)戊酸(S)-氰基甲酯(化合物tk66)(173mg、0.427mmol)之乙腈(0.3mL)溶液，於室溫攪拌1.25小時。冷凍乾燥後，將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.05%三氟乙酸水溶液/0.05%三氟乙酸乙腈溶液)精製，獲得5-(((苄氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)戊酸(2S)-(2R， 3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物tk67)(30.1mg、29%)。
LCMS(ESI)m/z=983.4(M-H)-
保持時間：0.54分(分析條件SQDFA05)
2-胺基-5-(((苄氧基)羰基)胺基)戊酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(Orn(Z)-pdCpA)(化合物tk68)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1001-2336
於5-(((苄氧基)羰基)胺基)-2-((第三丁氧羰基)胺基)戊酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物tk67)(30mg、0.030mmol)之二氯甲烷(1.1mL)溶液中添加三氟乙酸(0.117mL)，於室溫攪拌35分鐘。減壓濃縮後，將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.05%三氟乙酸水溶液/0.05%三氟乙酸乙腈溶液)精製，獲得2-胺基 -5-(((苄氧基)羰基)胺基)戊酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(Orn(Z)-pdCpA)(化合物tk68)(24.4mg、91%)。
LCMS(ESI)m/z=883.3(M-H)-
保持時間：0.33分(分析條件SQDFA05)
10-1-14. 胺基醯基化pdCpA化合物tk72之合成
依以下流程合成。
Figure 107130626-A0101-12-1002-1221
(S)-5-疊氮化-2-((第三丁氧羰基)胺基)戊酸(化合物tk69)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1002-1222
於Boc-Orn-OH(化合物tk56)(1.0g、4.31mmol)與硫酸銅五水合物(21mg、0.086mmol)之甲醇(20mL)-水(6mL)混合物，於室溫添加碳酸氫鈉(1.99g、23.68mmol)，然後加入以文獻記載(Org.Lett.，2007，9，3797.)之方法合成之疊氮化1H-咪唑-1-磺醯基鹽酸鹽(1.08g、5.17mmol)。將反應混合物於室溫攪拌24小時。反應混合物以冰浴冷卻後，添加飽和硫酸氫鉀水溶液(8mL)。將獲得之混合物以乙酸乙酯萃取(3次)，將有機相減壓濃縮。將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.05%三氟乙酸水溶液/0.05%三氟乙酸乙腈溶液)精製，獲得(S)-5-疊氮化-2-((第三丁氧羰基)胺基)戊酸(化合物tk69)(1.19g、quant.)。
LCMS(ESI)m/z=257(M-H)-
保持時間：0.61分(分析條件SQDFA05)
5-疊氮化-2-((第三丁氧羰基)胺基)戊酸(S)-氰基甲酯(化合物tk70)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1003-1223
於氮氣氛圍下，於(S)-5-疊氮化-2-((第三丁氧羰基)胺基)戊酸(化合物tk69)(150mg、0.581mmol)之乙腈(0.8mL)溶液中，於室溫添加N,N-二異丙基乙胺(111μL、0.639mmol)，然後添加溴乙腈(203μL、2.90mmol)。將反應混合物於同溫度攪拌4小時後，減壓濃縮，將獲得之粗產物以順相矽膠管柱層析 (己烷/乙酸乙酯)精製，獲得5-疊氮化-2-((第三丁氧羰基)胺基)戊酸(S)-氰基甲酯(化合物tk70)(185mg、quant.)。
LCMS(ESI)m/z=296(M-H)-
保持時間：0.73分(分析條件SQDFA05)
5-疊氮化-2-((第三丁氧羰基)胺基)戊酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物tk71)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1004-2337
於緩衝液A(18mL)中，加入磷酸二氫((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-3-(((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(羥基)磷氧基)氧基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物1h)(77mg、0.121mmol)之水溶液(0.3mL)與5-疊氮化-2-((第三丁氧羰基)胺基)戊酸(S)-氰基甲酯(化合物tk70)(144mg、0.484mmol)之四氫呋喃(0.3mL)溶液，於室溫攪拌0.5小時。冷凍乾燥後，將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.05%三氟乙酸水溶液/0.05%三氟乙酸乙腈溶液)精製，獲得5-疊氮化-2-((第 三丁氧羰基)胺基)戊酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物tk71)(24.5mg、23%)。
LCMS(ESI)m/z=875.4(M-H)-
保持時間：0.44分(分析條件SQDFA05)
2-胺基-5-疊氮化物戊酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(Orn(N3)-pdCpA)(化合物tk72)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1005-1225
於5-疊氮化-2-((第三丁氧羰基)胺基)戊酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物tk71)(24.5mg、0.028mmol)之二氯甲烷(1mL)溶液中，添加三氟乙酸(0.09mL)，於室溫攪拌25分鐘。減壓濃縮後，將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.05%三氟乙酸水溶 液/0.05%三氟乙酸乙腈溶液)精製，獲得2-胺基-5-疊氮化物戊酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(Orn(N3)-pdCpA)(化合物tk72)(18.8mg、87%)。
LCMS(ESI)m/z=775.4(M-H)-
保持時間：0.25分(分析條件SQDFA05)
10-1-15. 胺基醯基化pdCpA化合物tk85之合成
依以下流程合成。
Figure 107130626-A0101-12-1006-1226
(S)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-6-((R)-3-(第三丁氧羰基)噻唑烷-4-羧醯胺)己酸(化合物tk82)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1007-1227
於(R)-3-(第三丁氧羰基)噻唑烷-4-羧酸(化合物tk81)(208mg、0.892mmol)之DMF(1ml)溶液中，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三
Figure 107130626-A0101-12-1007-1098
-2-基)-4-甲基氯化嗎啉(247mg、0.892mmol)，於室溫攪拌30分鐘。於室溫費時3分鐘滴加(S)-6-胺基-2-((第三丁氧羰基)胺基)己酸(220mg、0.892mmol)之水(1ml)溶液，滴加結束後，於室溫攪拌30分鐘。將反應液以逆相矽膠管柱層析(10mM乙酸銨水溶液/甲醇)精製，獲得(S)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-6-((R)-3-(第三丁氧羰基)噻唑烷-4-羧醯胺)己酸(化合物tk82)(156mg、38%)。
LCMS(ESI)m/z=462(M+H)+
保持時間：0.66分(分析條件SQDFA05)
(R)-第三丁基4-(((S)-5-((第三丁氧羰基)胺基)-6-(氰基甲氧基)-6-側氧基己基)胺甲醯基)噻唑烷-3-羧酸酯(化合物tk83)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1007-1228
於(S)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-6-((R)-3-(第三丁 氧羰基)噻唑烷-4-羧醯胺)己酸(化合物tk82)(130mg、0.282mmol)之乙腈(5ml)溶液中，加入溴乙腈(57μl、0.845mmol)及N,N-二異丙基乙胺(147μl、0.845mmol)，將反應液於室溫攪拌3小時。將反應混合物以蒸發器減壓濃縮，將殘渣以順相矽膠管柱層析(己烷/乙酸乙酯)精製，獲得(R)-第三丁基4-(((S)-5-((第三丁氧羰基)胺基)-6-(氰基甲氧基)-6-側氧基己基)胺甲醯基)噻唑烷-3-羧酸酯(化合物tk83)(140mg、99%)。
LCMS(ESI)m/z=501.5(M+H)+
保持時間：0.76分(分析條件SQDFA05)
(4R)-第三丁基4-(((5S)-6-(((2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-基)氧基)-5-((第三丁氧羰基)胺基)-6-側氧基己基)胺甲醯基)噻唑烷-3-羧酸酯(化合物tk84)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1008-1229
於緩衝液A(40mL)中，加入磷酸二氫((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-3-(((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧 基)(羥基)磷氧基)氧基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物1h)(50mg、0.079mmol)之水溶液(0.5ml)與(R)-第三丁基4-(((S)-5-((第三丁氧羰基)胺基)-6-(氰基甲氧基)-6-側氧基己基)胺甲醯基)噻唑烷-3-羧酸酯(化合物tk83)(118mg、0.236mmol)之四氫呋喃(0.5ml)溶液，於室溫攪拌2小時。冷凍乾燥後，將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(水/乙腈溶液)精製，獲得(4R)-第三丁基4-(((5S)-6-(((2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-基)氧基)-5-((第三丁氧羰基)胺基)-6-側氧基己基)胺甲醯基)噻唑烷-3-羧酸酯(化合物tk84)之粗精製物(80mg)。
LCMS(ESI)m/z=1078(M-H)-
保持時間：0.55分(分析條件SQDFA05)
2-胺基-6-((R)-噻唑烷-4-羧醯胺)己酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(Lys(Thz)-pdCpA)(化合物tk85)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1009-2338
使前述(4R)-第三丁基4-(((5S)-6-(((2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-基)氧基)-5-((第三丁氧羰基)胺基)-6-側氧基己基)胺甲醯基)噻唑烷-3-羧酸酯(化合物tk84)之粗精製物(20mg)懸浮於二氯甲烷(0.3ml)，於室溫添加三氟乙酸(0.1mL)，於同溫度攪拌30分鐘。減壓濃縮後，將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(水/乙腈溶液)精製，獲得2-胺基-6-((R)-噻唑烷-4-羧醯胺)己酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(Lys(Thz)-pdCpA)(化合物tk85)(1.6mg、2步驟7%)。
LCMS(ESI)m/z=878(M-H)-
保持時間：0.17分(分析條件SQDFA05)
10-1-16. 胺基醯基化pdCpA化合物tk90之合成
依以下流程合成。
Figure 107130626-A0101-12-1011-1231
(S)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-6-(((3-硝基吡啶-2-基)硫)胺基)己酸(化合物tk87)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1011-2340
於硝基-2-吡啶硫基氯化物(313mg、1.644mmol)之二氯甲烷(30ml)溶液中，加入(S)-6-胺基-2-((第三丁氧羰基)胺基)己酸(化合物tk86)(270mg、1.096mmol)，於該懸浮液中費時3分鐘滴加三乙胺(1.53ml、10.96mmol)。將反應液於室溫攪拌3小時後，以蒸發器減壓濃縮，將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)精製，獲得(S)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-6-(((3-硝基吡啶-2-基)硫)胺基)己酸(化合物tk87)(62mg、14%)。
LCMS(ESI)m/z=401(M+H)+
保持時間：0.74分(分析條件SQDFA05)
(S)-氰基甲基2-((第三丁氧羰基)胺基)-6-(((3-硝基吡啶-2-基)硫)胺基)己酸酯(化合物tk88)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1012-1233
於((S)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-6-(((3-硝基吡啶-2-基)硫)胺基)己酸(化合物tk87)(150mg、0.375mmol)之乙腈(6ml)溶液中，加入溴乙腈(76μl、1.124mmol)及N,N-二異丙基乙胺(196μl、1.124mmol)，將反應液於室溫攪拌5小時。為了使反應完結，再加入溴乙腈(49μl、0.413mmol)，於室溫攪拌1小時。將反應混合物以蒸發器減壓濃縮，將殘渣以順相矽膠管柱層析(己烷/乙酸乙酯)精製，獲得(S)-氰基甲基2-((第三丁氧羰基)胺基)-6-(((3-硝基吡啶-2-基)硫)胺基)己酸酯(化合物tk88)(152mg、92%)。
LCMS(ESI)m/z=440(M+H)+
保持時間：0.83分(分析條件SQDFA05)
2-((第三丁氧羰基)胺基)-6-(((3-硝基吡啶-2-基)硫)胺基)己酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-基2-((第三丁氧羰基)胺基)-6-(((3-硝基吡啶-2-基)硫)胺基)己酸酯(化合物tk89)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1013-1234
於緩衝液A(30mL)中，加入磷酸二氫((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-3-(((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(羥基)磷氧基)氧基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物1h)(20mg、0.031mmol)之水溶液(0.5ml)與(S)-氰基甲基2-((第三丁氧羰基)胺基)-6-(((3-硝基吡啶-2-基)硫)胺基)己酸酯(化合物tk88)(30mg、0.069mmol)之乙腈(0.5ml)溶液，於室溫攪拌2小時。冷凍乾燥後，將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)精製，獲得2-((第三丁氧羰基)胺基)-6-(((3-硝基吡啶-2-基)硫)胺基)己酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-基2-((第三丁氧羰基)胺基)-6-(((3-硝基吡啶-2-基)硫)胺基)己酸酯(化合物tk89)之粗精製物(16mg)。
LCMS(ESI)m/z=1017(M-H)-
保持時間：0.54分(分析條件SQDFA05)
2-胺基-6-(((3-硝基吡啶-2-基)硫)胺基)己酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧 基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(Lys(Npys)-pdCpA)(化合物tk90)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1014-1235
使前述2-((第三丁氧羰基)胺基)-6-(((3-硝基吡啶-2-基)硫)胺基)己酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-基2-((第三丁氧羰基)胺基)-6-(((3-硝基吡啶-2-基)硫)胺基)己酸酯(化合物tk89)之粗精製物(16mg)懸浮於二氯甲烷(1ml)，於室溫添加三氟乙酸(0.25mL)，於同溫度攪拌15分鐘。減壓濃縮後，將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)精製，獲得2-胺基-6-(((3-硝基吡啶-2-基)硫)胺基)己酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(Lys(Npys)-pdCpA(化合物tk90)(12mg、2步驟42%)。
LCMS(ESI)m/z=917(M-H)-
保持時間：0.34分(分析條件SQDFA05)
10-2.脫保護條件之確認
為了確認於RNA為安定之反應條件將胺基保護基予以脫保護、或為了找尋新條件，實施以下之實驗，獲得於RNA安定存在之反應條件之胺基脫保護反應。
10-2-1. 脫保護方法之評價化合物tk94之合成及脫保護反應
依以下流程合成。
Figure 107130626-A0101-12-1015-1236
(R)-第三丁基(1-(苄胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)-1-側氧基丙烷-2-基)胺甲酸酯(化合物tk92)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1015-1237
於(R)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)丙酸(化合物tk91)(1.95g、6.30mmol)之四氫呋喃(20ml)溶液中，加入O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N、N、N'、N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)(2.52g、6.62mmol)、苄胺(0.723ml、6.62mmol)、N、N-二異丙基乙胺(1.153ml、6.62mmol)，將反應液於室溫攪拌2小時。將反應液於減壓下濃縮，並將獲得之殘渣以順相矽膠管柱層析(己烷/乙酸乙酯)精製，獲得(R)-第三丁基(1-(苄胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)-1-側氧基丙烷-2-基) 胺甲酸酯(化合物tk92)(2.357g，5.91mmol、94%)。
LCMS(ESI)m/z=399(M+H)+
保持時間：0.93分(分析條件SQDFA05)
(R)-2-胺基-N-苄基-3-(第三丁基二硫烷基)丙醯胺(化合物tk93)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1016-2341
於(R)-第三丁基(1-(苄胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)-1-側氧基丙烷-2-基)胺甲酸酯(化合物tk92)(1.049g、2.63mmol)之二氯甲烷(9ml)溶液中加入三氟乙酸(3ml)，反應液於室溫攪拌1小時。將反應液於減壓下濃縮後，以乙酸乙酯/飽和碳酸氫鈉進行萃取操作，將有機層以飽和食鹽水洗滌。將有機層以無水硫酸鈉乾燥，過濾後，減壓濃縮，藉此獲得(R)-2-胺基-N-苄基-3-(第三丁基二硫烷基)丙醯胺(化合物tk93)(810mg、100%)。
LCMS(ESI)m/z=297(M-H)-
保持時間：0.93分(分析條件SQDAA05)
(R)-N-苄基-3-(第三丁基二硫烷基)-2-(((3-硝基吡啶-2-基)硫)胺基)丙醯胺(化合物tk94)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1016-1239
將(R)-2-胺基-N-苄基-3-(第三丁基二硫烷基)丙醯 胺(化合物tk93)(60mg，0.201mmol)及三乙胺(0.034ml、0.241mmol)溶於二氯甲烷(1ml)，將該溶液冷卻至0℃。加入3-硝基-2-吡啶硫基氯化物(46.0mg，0.241mmol)，於0℃攪拌2小時。將反應液於減壓下濃縮，獲得之殘渣以順相矽膠管柱層析(己烷/乙酸乙酯)精製，得到(R)-N-苄基-3-(第三丁基二硫烷基)-2-(((3-硝基吡啶-2-基)硫)胺基)丙醯胺(化合物tk94)(87mg、96%)。
LCMS(ESI)m/z=453(M+H)+
保持時間：1.03分(分析條件SQDAA05)
3-硝基-2-吡啶硫基(Npys)之脫保護實驗
Figure 107130626-A0101-12-1017-2342
將(R)-N-苄基-3-(第三丁基二硫烷基)-2-(((3-硝基吡啶-2-基)硫)胺基)丙醯胺(化合物tk94)溶於N,N-二甲基乙醯胺(DMA)，製備50mM之DMA溶液。對於該DMA溶液50μl依序添加DMA(50μl)、調整為pH7.4之100mM HEPES緩衝液(250μl)、200mM 2-巰基吡啶DMA溶液(50μl)後，最後加入1M鹽酸(13μl)，製備pH4.1之反應液。將該反應液於室溫靜置，進行脫保護反應。反應之進行係利用LCMS追蹤(R)-N-苄基-3-(第三丁基二硫烷基)-2-(((3-硝基吡啶-2-基)硫)胺基)丙醯胺(化合物tk94)之減少、及脫保護體(R)-2-胺基-N-苄基-3-(第三丁基二硫烷基)丙醯胺(化合物tk93)之增加。反應後1小時，化 合物tk93與化合物tk94之UV面積比為100：0，確認脫保護反應完結。
化合物tk93之LCMS之保持時間與質量電荷比如下。
LCMS(ESI)m/z=299(M+H)+
保持時間：0.90分(分析條件SQDAA05)
既知之Npys基之脫保護方法，據報告有於有機溶劑中，使用親核劑2-巰基吡啶，再於反應液中添加乙酸，使脫保護反應加速之條件(非專利文獻International journal of peptide and protein research,1990,35,545-549)。本案發明人等，對於習知法進行改良結果發現於RNA安定存在之條件且能輕易進行Npys基之脫保護反應之方法。實際上將RNA施用於本反應條件，結果確認RNA有安定性地存在(表19反應條件E、及圖77帶5)、證明了本反應條件之有用性。
10-2-2. 脫保護方法之評價化合物tk95之合成及其脫保護實驗
依以下流程合成。
Figure 107130626-A0101-12-1018-1241
(R)-4-疊氮化苄基(1-(苄胺基)-3-(第三丁基二硫烷 基)-1-側氧基丙烷-2-基)胺甲酸酯(化合物tk95)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1019-1242
於(R)-2-胺基-N-苄基-3-(第三丁基二硫烷基)丙醯胺(化合物tk93)(145mg、0.486mmol)與碳酸氫鈉(102mg、1.215mmol)之1,4-二噁烷(2mL)懸浮液中，於室溫添加碳酸(4-硝基苯基)2-疊氮化苄酯(168mg、0.534mmol)。將反應混合物於同溫度攪拌15.5小時後，添加乙酸乙酯及水。將獲得之混合物以乙酸乙酯萃取，將有機相以水(5mL，2次)及食鹽水(5mL)洗滌，以硫酸鈉乾燥。減壓濃縮，將獲得之殘渣以順相矽膠管柱層析(己烷/乙酸乙酯)精製後，以逆相矽膠管柱層析(0.05%三氟乙酸水溶液/0.05%三氟乙酸乙腈溶液)精製，獲得(R)-4-疊氮化苄基(1-(苄胺基)-3-(第三丁基二硫烷基)-1-側氧基丙烷-2-基)胺甲酸酯(化合物tk95)(148.9mg、65%)。
LCMS(ESI)m/z=474.4(M+H)+
保持時間：0.97分(分析條件SQDFA05)
2-疊氮化苄基氧羰基(oAcbz)之脫保護實驗
Figure 107130626-A0101-12-1019-1243
將(R)-4-疊氮化苄基(1-(苄胺基)-3-(第三丁基二硫 烷基)-1-側氧基丙烷-2-基)胺甲酸酯(化合物tk95)溶於乙腈，製備10mM之乙腈溶液。對於該乙腈溶液10μl，依序添加乙腈(5μl)、調整為pH7.4之100mM HEPES緩衝液(50μl)、蒸餾水(25μl)、調整為pH7.0之100mM參(2-羧基乙基)膦水溶液(10μl)，製備pH7.4之反應液。將該反應液於37℃靜置，進行脫保護反應。反應之進行，利用LCMS追蹤化合物tk95之減少、及脫保護體R)-2-胺基-N-苄基-3-巰基丙醯胺(化合物tk99)之增加。反應後1.5小時，化合物tk99與化合物tk95之UV面積比為100：0，確認脫保護反應完結。化合物tk99之LCMS之保持時間與質量電荷比如下。
LCMS(ESI)m/z=211(M+H)+
保持時間：0.61分(分析條件SQDAA05)
如上述可知：2-疊氮化苄基氧羰基可藉由添加還原劑參(2-羧基乙基)膦而能輕易地脫保護。本脫保護方法係找出RNA為安定之條件，實際將RNA施用於本反應條件，結果確認RNA有安定性地存在(表19反應條件C、及圖77帶3)，證明了本反應條件之有用性。
2-3. 脫保護方法之評價化合物tk97之合成及其脫保護實驗
依以下流程合成。
Figure 107130626-A0101-12-1021-1662
(1-(苄胺基)-1-側氧基-6-(2,2,2-三氟乙醯胺)己烷-2-基)胺甲酸(S)-第三丁酯(化合物tk97)之合成
於氮氣氛圍下，將Boc-Lys(Tfa)-OH(化合物tk96)(104mg、0.304mmol)及1H-苯并[d][1,2,3]三唑-1-醇(HOBT)(61.6mg、0.456mmol)之DMF(0.5mL)溶液以冰浴冷卻後，添加1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二醯亞胺鹽酸鹽(WSCI‧HCl)(87mg、0.456mmol)。將反應混合物於同溫度攪拌5分鐘後，添加苄胺(40μL、0.365mmol)。將反應混合物於室溫攪拌17.5小時後，添加乙酸乙酯、己烷及食鹽水。將獲得之混合物以乙酸乙酯萃取，將有機相以食鹽水(1mL，2次)洗滌後，以硫酸鈉乾燥。減壓濃縮，將獲得之殘渣以順相矽膠管柱層析(己烷/乙酸乙酯)精製，獲得(1-(苄胺基)-1-側氧基-6-(2,2,2-三氟乙醯胺)己烷-2-基)胺甲酸(S)-第三丁酯(化合物tk97)(134.4mg、quant.)。
LCMS(ESI)m/z=430.4(M-H)-
保持時間：0.73分(分析條件SQDFA05)
三氟乙醯基(Tfa)之脫保護實驗
Figure 107130626-A0101-12-1022-1663
將(1-(苄胺基)-1-側氧基-6-(2,2,2-三氟乙醯胺)己烷-2-基)胺甲酸(S)-第三丁酯(化合物tk97)溶於二甲氧基乙烷，製備20mM之二甲氧基乙烷溶液。對於該二甲氧基乙烷溶液15μl，依序加入二甲氧基乙烷(30μl)、調整為pH9.1之100mM Bicine緩衝液(210μl)。於該溶液85μL中添加100mM Bicine緩衝液(15μl)，製成pH9.1之反應液，將該反應液於37℃靜置，進行脫保護反應。反應之進行，係利用LCMS追蹤三氟乙醯基保護體(化合物tk97)之減少、及脫保護體(6-胺基-1-(苄胺基)-1-側氧基己烷-2-基)胺甲酸(S)-第三丁酯(化合物tk98)之增加。
17小時後及93.5小時後之化合物tk98與化合物tk97之UV面積比如下。
17小時後：化合物tk98：化合物tk97=19：81
93.5小時後：化合物tk98：化合物tk97=70：30
化合物tk98之LCMS之保持時間與質量電荷比如下。
LCMS(ESI)m/z=336.4(M+H)+
保持時間：0.74分(分析條件SQDAA05)
以此方式，可知三氟乙醯基於pH9之反應液中可於37℃脫保護。本脫保護方法找出RNA為安定之條件，實際將RNA施用於本條件之pH、溫度，結果確認RNA安定存在(圖 80帶7)，證明了本反應條件之顯著性。
10-3-4.4-疊氮化苄基氧羰基(Acbz)之脫保護反應
於以下所示從化合物SP616變換為化合物618之變換反應之實驗，已另外證明
Figure 107130626-A0101-12-1023-1664
10-3-5.噻唑烷環之脫保護反應
於以下所示從化合物SP618變換為化合物620之變換反應之實驗，另外證明
Figure 107130626-A0101-12-1023-1665
說明書中之實施例等之用語中，下述簡稱或用語之意義除了有特別說明之情形以外，如下。
solA：含有以下成分之混合物8mM GTP，8mM ATP，160mM肌酸磷酸，400mM HEPES-KOH pH7.6，800mM乙酸鉀，48mM乙酸鎂，16mM亞精胺(spermidine)，8mM二硫蘇糖醇，0.8mM 10-HCO-H4folate，12mg/ml E.coli MRE600(RNase陰性)來源tRNA(Roche公司)
solB：PURESYSTEM(r)classic II Sol.B(BIOCOMBER公司、產品編號PURE2048C)
20種天然胺基酸溶液：20種天然胺基酸溶液(各5mM)
HOGly：甘醇酸
Lac：L-(+)-乳酸
PhLac：(S)-2-羥基-3-苯基丙酸
DPhLac：(R)-2-羥基-3-苯基丙酸
HOGly(Me)2：2-羥基-2-甲基丙酸
3.擴張分子內分支胜肽(直鏈部2)生成反應之胺基酸單元之探索
能嚴密控制環狀化反應及接續之分支骨架生成反應之二個反應，在溫和條件下能脫保護之含側鏈胺基之胺基酸之轉譯導入、及利用MALDI-MS所為之解析。
3-1. 利用轉錄所為之tRNA(CA欠缺)之合成
從模板DNA(序列編號DT-H3)利用使用RiboMAX Large Scale RNA production System T7(Promega公司，P1300)之體外轉錄，合成3'端之CA欠缺之tRNAAsn-E2GUU(-CA)(序列編號RT-H3)，並利用RNeasy Mini kit(Qiagen公司)精製。
序列編號DT-H3(序列編號：94)tRNAAsn-E2GUU(-CA)DNA序列：
Figure 107130626-A0101-12-1024-1666
序列編號RT-H3(序列編號：95)tRNAAsn-E2GUU(-CA)RNA序列：
Figure 107130626-A0101-12-1024-1667
3-2. 利用側鏈胺基經保護之胺基醯基pdCpA(化合物tk5、tk60、tk64、tk90、tk38、tk11)與tRNA(CA欠缺)(序列編號：RT-H3)之接合(ligation)所為之胺基醯基化tRNA(化合物AT-H3)之合成
於50μM轉錄tRNAAsn-E2GUU(-CA)(序列編號RT-H3)20μL，加入10X接合緩衝液(500mM HEPES-KOH pH 7.5,200mM MgCl2)4μL、,10mM ATP 4μL、無核酸酶之水5.6μL，於95℃加熱2分鐘後，於室溫放置5分鐘，進行tRNA之重新折疊。加入T4 RNA接合酶(New England Bio Lab.公司)2.4μL及5mM之側鏈胺基經保護之胺基醯基化pdCpA(化合物tk5、tk60、tk64、tk90、tk38、tk11之任意一種)之DMSO溶液4μL，於16℃進行45分鐘接合反應。胺基醯基化tRNA(化合物AT-H3)進行苯酚萃取後，利用乙醇沉澱回收。胺基醯基化tRNA(化合物AT-H3)於即將添加到轉譯混合物時溶於1mM乙酸鈉。
化合物AT-H3A Ala(Tzm)-tRNAAsn-E2GUU(序列編號：96)
Figure 107130626-A0101-12-1025-1668
化合物AT-H3B Orn(Acbz)-tRNAAsn-E2GUU(序列編號：96)
Figure 107130626-A0101-12-1026-1669
化合物AT-H3C Orn(oAcbz)-tRNAAsn-E2GUU(序列編號：96)
Figure 107130626-A0101-12-1026-1670
化合物AT-H3D Lys(Npys)-tRNAAsn-E2GUU(序列編號：96)
Figure 107130626-A0101-12-1026-1671
化合物AT-H3E Lys(Acbz)-tRNAAsn-E2GUU(序列編號：96)
Figure 107130626-A0101-12-1026-2343
化合物AT-H3F Lys(5S-SSMe)(Acbz)-tRNAAsn-E2GUU(序列編號：96)
Figure 107130626-A0101-12-1026-1673
3-3.包含經保護之側鏈胺基胜肽之胜肽之轉譯合成
藉由將經各種胺基酸使胺基醯基化而得之tRNA(化合物 AT-H3)加到無細胞轉譯系並開始轉譯，進行含有所望非天然胺基酸之多胜肽之轉譯合成。轉譯系採用原核生物來源之再構成無細胞蛋白質合成系PURE system。具體而言，於轉譯液，1%(v/v)RNasein Ribonuclease inhibitor(Promega公司，N2111),1mM GTP，1mM ATP，20mM肌酸磷酸，50mM HEPES-KOH pH7.6，100mM乙酸鉀，6mM乙酸鎂，2mM亞精胺(spermidine)，0.1mM 10-HCO-H4folate,1.5mg/ml E.coli MRE600(RNase陰性)來源tRNA(Roche公司)，4μg/ml肌酸激酶，3μg/ml肌激酶，2unit/ml無機焦磷解酶，1.1μg/ml核苷二磷酸激酶，0.6μM甲硫胺醯基tRNA轉甲醯基酶，0.26μM EF-G，0.24μM RF2，0.17μM RF3，0.5μM RRF，2.7μM IF1，0.4μM IF2,1.5μM IF3,40μM EF-Tu，93μM EF-Ts，1.2μM核糖體，0.73μM AlaRS，0.03μM ArgRS，0.38μM AsnRS，0.13μM AspRS，0.02μM CysRS，0.06μM GlnRS，0.23μM GluRS，0.09μM GlyRS，0.4μM IleRS，0.04μM LeuRS，0.11μM LysRS，0.03μM MetRS，0.68μM PheRS，0.16μM ProRS，0.04μM SerRS，0.09μM ThrRS，0.03μM TrpRS，0.02μM TyrRS，0.02μM ValRS(實驗室製備之蛋白，基本上係製備為附加His標籤之蛋白))中，各將1μM模板RNA、蛋白質性胺基酸群各250μM、及各50μM醯基化tRNA添加到轉譯反應混合物，於37℃靜置1小時。
3-3-1.含有Ala(Tzm)之示範胜肽之轉譯合成
將含有1μM模板RNA CT32(序列編號RM-H3)、0.25mM Met、0.25mM Arg，0.25mM Asp、0.25mM Tyr、 0.25mM Lys、1mM二硫蘇糖醇、50μM Ala(Tzm)-tRNAAsn-E2GUU(化合物AT-H3A)之前述轉譯液於37℃保溫60分鐘。於獲得之轉譯反應物1μL加入9μL之0.2%三氟乙酸，將其中的1μL乘載於MALDI標靶板上後，與1μL之CHCA溶液(10mg/ml α-氰基-4-羥基桂皮酸、50%乙腈、0.1%三氟乙酸溶液)混合，在板上乾固。MALDI-MS分析之結果，觀測到含Ala(Tzm)之全長胜肽(胜肽序列P-H2)為主產物(圖72、峰部I)。
序列編號RM-H3(序列編號：97)CT32 RNA序列
Figure 107130626-A0101-12-1028-1674
胜肽序列P-H2 fMetArg[Ala(Tzm)]ArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
MALDI-MS：m/z：[H+M]+=1656.4(Calc.1656.7)
3-3-2.含Orn(Acbz),Orn(oAcbz),Lys(Npys)之示範胜肽之轉譯合成
將1μM模板RNA CT32(序列編號RM-H3)、0.25mM Met、0.25mM Arg，0.25mM Asp、0.25mM Tyr、0.25mM Lys、及以前述方法製備之50μM之Orn(Acbz)-tRNAAsn-E2GUU(化合物AT-H3B)、Orn(oAcbz)-tRNAAsn-E2GUU(化合物AT-H3C)、Lys(Npys)-tRNAAsn-E2GUU(化合物AT-H3D)各含1種之前述轉譯 液共計3種反應溶液於37℃保溫60分鐘。關於含Orn(Acbz)-tRNAAsn-E2GUU(化合物AT-H3B)之轉譯樣本，於獲得之轉譯溶液1μL加入9μL之0.2%三氟乙酸，將其中的1μL乘載於MALDI標靶板上後，與1μL之CHCA溶液(10mg/ml α-氰基-4-羥基桂皮酸、50%乙腈、0.1%三氟乙酸溶液)混合，在板上乾固後，以MALDI-MS解析。其結果，未觀測到從目的之全長胜肽而來之峰部，而觀測到側鏈Acbz基已脫離之胜肽P-H3A所對應的峰部作為主產物(圖72峰部II)。此據認為係由於上述測定前處理操作或測定中之雷射照射，使得側鏈脫保護反應進行，將測定變更為LC-ESI-MS，接續進行同轉譯產物之解析。使用將含有上述Orn(Acbz)-tRNAAsn-E2GUU(化合物AT-H3B)之轉譯溶液5μL與水5μL混合而得者進行LC-MS分析，結果可確認從具有Acbz基之全長目的胜肽(Orn(Acbz)：胜肽序列P-H3)而來之峰部(圖73峰部I)。另一方面，未觀測到從側鏈脫保護之P-H3A而來之峰部，故可知如上述，側鏈Acbz基之脫保護反應係於MALDI測定或分析前處理過程發生(圖74)。同樣地，關於含有Orn(oAcbz)-tRNAAsn-E2GUU(化合物AT-H3C)、Lys(Npys)-tRNAAsn-E2GUU(化合物AT-H3D)之轉譯溶液中，利用LC-MS實施分析，結果觀測到相當於如目的Orn(oAcbz)：胜肽序列P-H4、Lys(Npys)：胜肽序列P-H5)之峰部(圖75峰部I及圖76峰部I)。
胜肽序列P-H3 fMetArg[Orn(Acbz)]ArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
LC-ESI-MS：m/z 885.3733(M-2H)2-，(Calcd for C72H106O27N24S：885.3695)
保持時間：4.99分(分析條件OrbitrapHFIP-Et3N-3)
胜肽序列P-H3A fMetArgOrn ArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
MALDI-MS：m/z：[H+M]+=1598.5(Calc.1598.7)
胜肽序列P-H4 fMetArg[Orn(oAcbz)]ArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
LC-ESI-MS：m/z 885.3735(M-2H)2-，(Calcd for C72H106O27N24S：885.3695)
保持時間：5.23分(分析條件OrbitrapHFIP-Et3N-3)
胜肽序列P-H5 fMetArg[Lys(Npys)]ArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
LC-ESI-MS：m/z 881.8500(M-2H)2-，(Calcd for C70H105O27N23S2：881.8501)
保持時間：4.34分(分析條件OrbitrapHFIP-Et3N-3)
3-3-3.含有Lys(Acbz)、Lys(5S-SSMe)(Acbz)之示範胜肽之轉譯合成
將1μM模板RNA CT32(序列編號RM-H3)、0.25mM Met、0.25mM Arg，0.25mM Asp、0.25mM Tyr、0.25mM Lys、及前述方法製備之50μM之Lys(Acbz)-tRNAAsn-E2GUU(化合物AT-H3E)、Lys(5S-SSMe)(Acbz)-tRNAAsn-E2GUU(化合物AT-H3F)各含1種之前述轉譯液共計3種反應溶液於37℃保溫60分鐘。於獲 得之轉譯反應物1μL加入9μL之0.2%三氟乙酸，將其中的1μL乘載於MALDI標靶板上後，與1μL之CHCA溶液(10mg/ml α-氰基-4-羥基桂皮酸、50%乙腈、0.1%三氟乙酸溶液)混合，在板上乾固。MALDI-MS分析之結果，均觀測到側鏈Acbz基在MALDI測定中及前處理中脫離而來之胜肽序列P-H6，P-H7(各圖72峰部III、IV)。
胜肽序列P-H6 fMetArgLysArgAspTyrLysAspAspAspAspLys(序列編號：98)
MALDI-MS：m/z：[H+M]+=1612.4(Calc.1612.7)
胜肽序列P-H7
Figure 107130626-A0101-12-1031-1675
MALDI-MS：m/z：[H+M]+=1690.1(Calc.1690.7)
3-4.於側鏈胺基脫保護條件之RNA安定性評價
為了確認前述側鏈胺基之保護基個別的脫保護條件下，RNA是否安定存在，將RNA施用於各脫保護條件後，利用凝膠電泳解析。
如表19所示反應條件製備各反應溶液，依各別之反應溫度、反應時間將RNA保溫。對於施用反應條件B-E之各反應 溶液，之後使用RNeasy minelute(qiagen公司)將RNA精製，以10μL之水溶出。對於此等及反應溶液A之各10μL之溶液中加入10μL之TBE-Urea樣本緩衝液(2x)(Invitrogen公司)，使用其中的1μL以10%TBE-尿素凝膠進行電泳，以SYBR gold nucleic acid stain(Invitrogen公司)染色(圖77)。
其結果，比起作為對照實驗經電泳之反應條件A之RNA，依反應條件B-E之RNA在譜帶圖案或譜帶濃度未觀測到大幅變化(圖77、帶1vs帶2-5)，代表RNA於該等反應條件係安定存在。又，B-E之條件，各模擬B：4-疊氮化苄基氧羰基(Acbz)、C：2-疊氮化苄基氧羰基(oAcbz)、D：噻唑烷環、E：3-硝基-2-吡啶硫基(Npys)之脫保護條件。
Figure 107130626-A0101-12-1032-1676
然後，於酸性、或鹼性條件下之RNA安定性使用電泳評價。對於2μL之RNA溶液(20μM OT95 RNA(序列編號RM-H4)、100mM氯化鉀、10mM乙酸鎂)，各加入20μL之100mM鹽酸-氯化鉀緩衝液(pH 2.0)、100mM檸檬酸鈉緩衝液(pH 3.0)、100mM乙酸鈉緩衝液(pH 4.0)、100mM乙酸鈉緩衝液(pH 5.0)、100mM HEPES-K緩衝液(pH 7.0)、100mMTris鹽酸緩衝液(pH 8.0)、Bicine-K緩衝液(pH 9.0)，將各反應溶液於37℃保溫22小時。對照實驗，係將對於上述RNA溶液中加入之緩衝液替換為使用水20μL且不經於37℃之保溫者，製備為指標RNA，用於比較與上述反應樣本之電泳之用。對於獲得之反應溶液及指標RNA22μL，添加之後等量之TBE-Urea樣本緩衝液(2x)(Invitrogen公司)，使用其中的4μL以10%TBE-尿素凝膠進行電泳，以SYBR gold nucleic acid stain(Invitrogen公司)染色。其結果任意反應樣本均為，相較於指標RNA未觀測到顯著之RNA分解(圖80)。由此可知在上述反應條件，RNA係安定存在。
序列編號RM-H4(序列編號：185)OT95 RNA序列
Figure 107130626-A0101-12-1033-1677
[實施例22]使用RNA-胜肽複合體示範化合物之Heck反應
實際上以展示庫構建且合成之化合物，mRNA之長度為約 100之mRNA-胜肽融合物，如此之高分子化合物之反應難以詳細解析。而實施分子內具有能分析分子量之長度之RNA結構，且分子內具有能利用金屬觸媒進行環化反應之胜肽結構的示範化合物，實施於mRNA-胜肽融合物之環化反應條件特定。
為了以使用Pd之轉譯後修飾應用於展示庫，必須不影響RNA而進行所望之化學修飾反應。為達成此目的，實施以下實驗。(1)於混合有tRNA等之系(PureSystem)中實施Heck反應，找出不影響tRNA，而Heck反應會進行之反應條件。(2)製作胜肽與RNA之接合物，再實施Heck反應，找到即使胜肽與RNA鍵結，仍不影響RNA而會進行Heck反應之反應條件。
作為示範化合物使用者為以下3種化合物。
4-mer RNA-胜肽接合物
10-mer RNA-胜肽接合物
20-mer RNA-胜肽接合物
1-1.RNA-胜肽接合物示範反應原料之合成
依以下之一般製法-1，進行示範反應實施用之原料合成。
(一般製法-1)RNA-胜肽接合物之合成
模板合成
Figure 107130626-A0101-12-1035-1678
固相載持
Figure 107130626-A0101-12-1035-1679
胜肽伸長
Figure 107130626-A0101-12-1036-1680
RNA合成、切出
Figure 107130626-A0101-12-1037-1681
1-1-1. 4-mer RNA-胜肽接合物(5'-AGCU-3'-Peptide)(化合物70a)之合成
(2S、4R)-4-羥基-2-[2-(2-羥基-乙氧基)-乙基胺甲醯基]-吡咯烷-1-羧酸9H-茀-9-基甲酯(化合物72)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1037-2345
將FMOC-L-羥基脯胺酸(化合物71)(2.12g、6.00mmol)、2-(2-胺基乙氧基)乙醇(0.661mg、6.60mmol)溶於DMSO(4.0mL)，於室溫加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三
Figure 107130626-A0101-12-1037-1654
-2-基)-4-甲基氯化嗎啉n水合物(1.98g、6.60mmol)，攪拌5小時。將反應液以逆相二氧化矽(甲酸0.1%、H2O、CH3CN、梯度)精製，獲得標題化合物(化合物72)(1.69g、64%)淡黃色非晶物。
LCMS(ESI)441.2(M+H)+
保持時間：1.57分(分析條件ZQAA05)
(2S、4R)-2-(2-{2-[雙-(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基]-乙氧基}-乙基胺甲醯基)-4-羥基-吡咯烷-1-羧酸9H-茀-9-基甲酯(化合物73)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1038-1683
將(2S、4R)-4-羥基-2-[2-(2-羥基-乙氧基)-乙基胺甲醯基]-吡咯烷-1-羧酸9H-茀-9-基甲酯(化合物72)(1.69g、3.83mmol)、4、4'-二甲氧基三苯甲基氯(2.47g、7.66mmol)溶於吡啶(5.0mL)，於室溫攪拌3小時。將反應液以逆相二氧化矽(乙酸銨0.1%、H2O、CH3OH、梯度)精製，獲得標題化合物(化合物73)(2.24g、79%)淡黃色非晶物。
LCMS(ESI)760.8(M+NH4)+、765.7(M+Na)+
保持時間：1.15分(分析條件SQDAA05)
琥珀酸 單-[(3R，5S)-5-(2-{2-[雙-(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基]-乙氧基}-乙基胺甲醯基)-1-(9H-茀-9-基甲氧羰基)-吡咯烷-3-基]酯(化合物74)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1039-1684
將(2S、4R)-2-(2-{2-[雙-(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基]-乙氧基}-乙基胺甲醯基)-4-羥基-吡咯烷-1-羧酸9H-茀-9-基甲酯(化合物73)(1.00g、1.35mmol)、無水琥珀酸(192mg、2.02mmol)、N、N-二甲胺基吡啶(246mg、2.02mmol)溶於乙腈(3.0mL)，於室溫攪拌2.5小時。將反應液以逆相二氧化矽(乙酸銨0.1%、H2O、CH3OH、梯度)精製，獲得標題化合物(化合物74)(349mg、31%)無色非晶物。
LCMS(ESI)860.5(M+NH4)+、865.5(M+Na)+
保持時間：1.11分(分析條件SQDAA05)
固相載持FMOC脫保護吡咯烷衍生物(化合物76)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1039-1685
於琥珀酸 單-[(3R，5S)-5-(2-{2-[雙-(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基]-乙氧基}-乙基胺甲醯基)-1-(9H-茀-9-基甲氧羰基)-吡咯烷-3-基]酯(化合物74)(85.1mg、0.101mmol)、Custom Primer Support 200 Amino(GE Healthcare、1.01g)加入乙腈(5.0mL)。於其中加入乙酸(5.8μL、0.101mmol)之乙腈(0.1mL)溶液之後，於室溫加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三
Figure 107130626-A0101-12-1040-1655
-2-基)-4-甲基氯化嗎啉n水合物(60.6mg、0.202mmol)，於室溫攪拌1.5小時。之後，於反應液加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三
Figure 107130626-A0101-12-1040-1656
-2-基)-4-甲基氯化嗎啉n水合物(300mg、1.01mmol)，攪拌15分鐘後，加入乙酸(58μL、1.01mmol)之乙腈(0.5mL)溶液，攪拌1小時。濾取反應物，將獲得之固體(化合物75)乾燥。於固體取得物加入20%哌啶DMF溶液(10mL)，反應1小時。濾取反應物，以DMF、乙腈洗滌、減壓乾燥，獲得固相載持FMOC脫保護吡咯烷衍生物(化合物76)(1.05g)。
固相載持碘苯丙胺酸衍生物(化合物78)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1040-1686
將Fmoc-3-碘-L-苯丙胺酸(622mg、1.21)、HOAt(136mg、0.909)、N,N'-二異丙基碳二醯亞胺(0.206mL、1.33)溶於DMF(5.0mL)，加入固相載持FMOC脫保護吡咯烷衍生物化合物76(1.05g)。於室溫攪拌3小時。濾取獲得之固相擔體，以DMF(10mL)洗滌3次，然後加入20%哌啶DMF溶液(10mL)，於室溫攪拌1小時。將獲得之固相擔體以DMF(10mL)、乙腈(10mL)各洗滌3次，於減壓下乾燥，獲得有3-碘-L-苯丙胺酸鍵結之固相載持碘苯丙胺酸衍生物化合物78(1.00g)。
固相載持苯丙胺酸衍生物(化合物80)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1041-1687
與獲得化合物78之方法以同樣方法，利用與固相載持碘苯丙胺酸衍生物(化合物78)(1.00g)、Fmoc-L-苯丙胺酸(234mg、0.606)之縮合、接續之Fmoc之脫保護，獲得有L-苯丙胺酸鍵結之固相載持苯丙胺酸衍生物(化合物80)(1.00g)。
固相載持4-戊烯酸衍生物(化合物81)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1041-2346
利用與獲得化合物78之方法為同樣方法，以有L-苯丙胺酸鍵結之固相載持苯丙胺酸衍生物(化合物80)(250mg)、4-戊烯酸(30.6μL、0.300mm)之縮合，獲得有4-戊烯酸鍵結之固相載持4-戊烯酸衍生物(化合物81)(249mg)。
化合物70a之合成
Figure 107130626-A0101-12-1041-2347
使用固相載持4-戊烯酸衍生物(化合物81)(8.0mg、 0.8μmol)，利用DNA合成機實施RNA鍵結伸長。A、G、C、U之伸長反應使用之醯胺(Amidite)試藥，採用Glenresearch公司製A-TOM-CE亞磷醯胺、G-TOM-CE亞磷醯胺、C-TOM-CE亞磷醯胺、U-TOM-CE亞磷醯胺，縮合活化劑使用5-苄硫基-1H-四唑實施。將縮合後之固相擔體乾燥後，加入乙醇(0.10mL)、40%甲胺水溶液(0.10mL)，於65℃攪拌15分鐘。將溶劑減壓餾去，加入四甲基氟化銨水合物(10mg)、DMSO(0.10mL)，於65℃攪拌15分鐘。於反應液加入0.1M乙酸銨水溶液，以逆相管柱精製。濃縮後，將獲得之化合物溶於精製水(0.50mL)，獲得4-mer RNA-胜肽接合物(化合物70a)(5'-AGCU-3'-Peptide)水溶液。以紫外分光計獲得之溶液之濃度為0.736mM、產率為46%。
LCMS(ESI)668.0(M-3H)3-、1002.4(M-2H)2-
保持時間：5.15分(分析條件ZQHFIP-Et3N)
1-1-2.10-mer RNA-胜肽接合物(5'-AGCUUAGUCA-3'(序列編號：69)-Peptide)(化合物70b)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1042-2348
利用與獲得化合物70a之方法為同等方法，獲得表示記載化合物水溶液(化合物70b)。獲得濃度0.33mM之水溶液0.50mL。產率為21%。
LCMS(ESI)784.8(M-5H)5-、981.2(M-4H)4-、1308.5(M-3H)3-
保持時間：4.87分(分析條件ZQHFIP-Et3N)
1-1-3.20-mer RNA-胜肽接合物(5'-AGCUUAGUCACCGUCAGUCA-3'(序列編號：70)-Peptide)(化合物70c)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1043-2349
使用與獲得化合物70a之方法為同等方法，獲得表示記載化合物水溶液(化合物70c)。獲得濃度0.147mM之水溶液0.30mL。產率為15%。
LCMS(ESI)887.9(M-8H)8-、1015.0(M-7H)7-、1184.3(M-6H)6-、1421.0(M-5H)5-、1776.6(M-4H)4-
保持時間：4.60分(分析條件ZQHFIP-Et3N)
2-1.RNA-胜肽接合物之環化反應
2-1-1. 10-mer RNA-胜肽接合物(化合物70b)之Heck環化反應(化合物83b)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1043-2351
將10-mer RNA-胜肽接合物(化合物70b)(0.33mM水溶液 3.7μL、1.2nmol)、內部標準(10mM p-n-丙基苯甲酸DMF溶液3μL、30nmol)、磷酸緩衝液(K2HPO4 1.0mmol與K3PO4 0.10mmol之水10mL之水溶液10μL)、5%PTS(Polyoxyethanyl-α-tocopheryl sebacate)水溶液(30μL)混合，以逆相LC分析後，加入PdCl2(MeCN)2(1.0mg、3.9μmol)、2,2'-雙(二苯基膦基)-1,1'-聯苯(6.2mg、12.0μmol)於氮氣氛圍下溶解於N-甲基吡咯烷酮(N-methylpyrrolidinone)(0.2mL)之Pd溶液(8.0μL)，於50℃於氮氣氛圍下攪拌3小時。於反應液(5.0μL)加入1M二硫蘇糖醇水溶液(10.0μL)，製成LC分析樣本並分析。從反應前之LC分析結果之比較，產物(化合物83b)之產率為57%。
LCMS(ESI)759.4(M-5H)5-、949.5(M-4H)4-、1265.9(M-3H)3-
保持時間：3.40分(分析條件ZQHFIP-Me2NEt)
2-1-2. 20-mer RNA-胜肽接合物(化合物70c)之Heck環化反應(化合物83c)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1044-1693
將20-mer RNA-胜肽接合物(化合物70c)(0.15mM水溶液2.0μL、0.29nmol)、內部標準(10mM p-n-丁基苯甲酸DMF溶液2μL、20nmol)、100mM三乙胺水溶液(5μL、500mmol)、5%PTS(Polyoxyethanyl-α-tocopheryl sebacate)水溶液(30μL) 混合，以逆相LC分析之後，加入PdCl2(MeCN)2(0.5mg、1.9μmol)、2,2'-雙(二苯基膦基)-1,1'-聯苯(3.1mg、6.0μmol)於氮氣氛圍下溶於N-甲基吡咯烷酮(0.4mL)而得之Pd溶液(8.0μL)，於50℃於氮氣氛圍下攪拌2小時。於反應液(5.0μL)中加入0.1M二硫蘇糖醇水溶液(10.0μL)，製成LC分析樣本並分析。從反應前之LC分析結果之比較，產物(化合物83c)之產率為61%。
LCMS(ESI)997.0(M-7H)7-、1163.0(M-6H)6-、1395.5(M-5H)5-、1745.0(M-4H)4-
保持時間：4.08分(分析條件ZQHFIP-Et3N)
〔實施例23〕轉譯胜肽之Heck反應
1.用於在轉譯合成活用之C-C鍵結單元之合成
1-1.pdCpA胺基醯基化化合物85之合成
1-1-1.丁-3-烯酸氰基甲酯(化合物86)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1045-2352
將丁-3-烯酸(0.500g、5.81mmol)溶於乙腈(20ml)，於室溫緩慢添加2-溴乙腈(3.33g、27.76mmol)及三乙胺(1.40g、13.86mmol)。於室溫攪拌30分鐘後，將反應液減壓濃縮並將獲得之殘渣以管柱層析(石油醚：乙酸乙酯=20：1)精製，獲得標題化合物86(0.550g、75%)。
1H-NMR(Bruker，avanceIII，400MHz，CDCl3)δ ppm 5.92(1H，m)，5.22-5.26(2H，m)，4.75(2H，s)，3.21(2H，m)
1-1-2.丁-3-烯酸(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物85)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1046-1695
於磷酸二氫((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-3-(((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(羥基)磷氧基)氧基)四氫呋喃-2-基)甲酯 四丁基銨鹽(化合物1h)(0.20g、0.150mmol)之DMF溶液(1.0ml)中，加入丁-3-烯酸氰基甲酯(化合物86)(0.050g、0.400mmol)，於室溫攪拌1小時。於反應液加入0.05%TFA水溶液，冷凍乾燥並將獲得之殘渣以製備性-HPLC(0.05%TFA水溶液：乙腈)精製，獲得標題化合物85(0.010g、10%)。
LCMS：m/z 705(M+H)+
保持時間：0.461、0.488分(分析條件SMD法1)
1-2.pdCpA胺基醯基化化合物87之合成
1-2-1.戊-4-烯酸氰基甲酯(化合物88)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1047-2353
將丁-3-烯酸替換為使用戊-4-烯酸(0.500g、4.99mmol)作為原料，與化合物86之合成以同樣方法，獲得標題化合物88(0.52g、75%)。
1H-NMR(Bruker，avanceII，300MHz，CDCl3)δ ppm 5.82(1H，m)，5.04-5.32(2H，m)，4.74(2H，s)，2.39-2.57(4H，m)
1-2-2.戊-4-烯酸(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物87、pdCpA-PenteA)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1047-1697
將丁-3-烯酸氰基甲酯替換為使用戊-4-烯酸氰基甲酯(化 合物88)(0.066g、0.480mmol)作為原料，與獲得化合物85之方法以同樣方法，獲得標題化合物87(0.010g、12%)。
LCMS：m/z 719(M+H)+
保持時間：0.506、0.523分(分析條件SMD法1)
1-3.pdCpA胺基醯基化化合物89之合成
1-3-1. 2-(烯丙氧基)乙酸(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物89)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1048-2354
將2-(烯丙氧基)乙酸(0.500g、4.31mmol)溶於二氯甲烷(20ml)，於室溫緩慢添加2-溴乙腈(2.06g、17.18mmol)及三乙胺(0.87g、8.61mmol)。於室溫攪拌3小時後，將反應液減壓濃縮並將獲得之殘渣以管柱層析(石油醚：乙酸乙酯=20：1)精製，獲得2-(烯丙氧基)乙酸氰基甲酯(0.40g、60%)。
溶解咪唑(1.0g、15.7mmol)及N,N，N-三甲基十六烷-1-氯 化銨(1.0g、3.14mmol)，於以乙酸調整為pH8之緩衝液(100ml)中，加入磷酸二氫((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-3-(((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(羥基)磷氧基)氧基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物1h)(100mg、0.157mmol)後，添加以上述方法獲得之2-(烯丙氧基)乙酸氰基甲酯(93mg、0.628mmol)之THF(3.0ml)溶液，於室溫攪拌30分鐘。於反應液加入乙酸並冷凍乾燥，將獲得之殘渣以製備性-HPLC(0.05%TFA水溶液：乙腈)精製，獲得標題化合物89(24.7mg、22%)。
LCMS：m/z 735(M+H)+
保持時間：0.473、0.491分(分析條件SMD法1)
1-4.pdCpA胺基醯基化化合物90之合成
1-4-1.2-((第三丁氧羰基)胺基)-3-(4-碘苯基)丙酸(S)-氰基甲酯(化合物91)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1049-1699
將丁-3-烯酸替換為使用(S)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-3-(4-碘苯基)丙酸(1.0g、2.56mmol)作為原料，與獲得化合物86之方法以同樣方法，獲得標題化合物91(0.40g、36%)。
保持時間：1.59分(分析條件SMDmethod4)
1H-NMR(Bruker，avanceII，300MHz，CDCl3)δ ppm 7.67(2H，d，8.1Hz)，6.93(2H，d，8.1Hz)， 4.62-4.94(4H，m)，2.98-3.14(2H，m)，1.44(9H，s)
1-4-2.3-(4-碘苯基)-2-(戊-4-烯醯胺)丙酸(S)-氰基甲酯(化合物92)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1050-1700
使2-((第三丁氧羰基)胺基)-3-(4-碘苯基)丙酸(S)-氰基甲酯(化合物91)(0.89g、2.07mmol)溶於二乙醚(20.0ml)。於該溶液中吹入鹽酸氣體後，於室溫攪拌2小時。過濾反應液中之固體並使減壓乾燥，獲得2-胺基-3-(4-碘苯基)丙酸(S)-氰基甲酯(0.65g、86%)。
於氮氣氛圍下，將2-胺基-3-(4-碘苯基)丙酸(S)-氰基甲酯(0.65g、1.78mmol)溶於二氯甲烷(25.0ml)，於冰冷下滴加三乙胺(0.45g、4.45mmol)。之後，於冰冷下滴加氯化戊-4-烯醇(0.25g，2.14mmol)之二氯甲烷溶液(25.0ml)，於室溫攪拌2小時半。將反應液減壓濃縮並將獲得之殘渣以管柱層析(石油醚：乙酸乙酯=50：50~33：67)精製，獲得3-(4-碘苯基)-2-(戊-4-烯醯胺)丙酸(S)-氰基甲酯(化合物92)(0.57g、78%)。
LCMS：m/z 413.2(M+H)+
保持時間：1.51分(分析條件SMDmethod5)
1-4-3.3-(4-碘苯基)-2-(戊-4-烯醯胺)丙酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧 基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物90)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1051-1701
溶解咪唑(680.8mg、10.00mmol)及N,N，N-三甲基十六烷-1-氯化銨(640.0mg、2.00mmol)，於以乙酸調整為pH8之緩衝液(100ml)中，加入磷酸二氫((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-3-(((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(羥基)磷氧基)氧基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物1h)(96mg、0.150mmol)後，加入3-(4-碘苯基)-2-(戊-4-烯醯胺)丙酸(S)-氰基甲酯(化合物92)(249mg、0.60mmol)之THF溶液(1.0ml)，於室溫攪拌2小時。於反應液加入TFA(1.0ml)並冷凍乾燥後，將獲得之殘渣以製備性-HPLC(0.05%TFA水溶液：乙腈=80：20~60：40)精製，獲得標題化合物90(35mg、23%)。
LCMS：m/z 990(M-H)-
保持時間：1.45分(分析條件ZQFA05)
1-5.pdCpA胺基醯基化化合物93之合成
1-5-1. 3-(3-碘苯基)-2-(戊-4-烯醯胺)丙酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物93、pdCpA-Phe(3-I))之合成
Figure 107130626-A0101-12-1052-1702
於氮氣氛圍下，將2-氯三苯甲基氯化物樹脂(100-200mesh、1%DVB、從渡邊化學購買、2.78g)浸於二氯甲烷(30ml)，於室溫攪拌20分鐘使膨潤。將二氯甲烷去除後， 加入(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(3-碘苯基)丙酸(Fmoc-Phe(3-I)-OH、1.50g、2.92mmol)及DIPEA(1.50g、11.7mmol)之二氯甲烷溶液(30ml)，於室溫攪拌5小時。之後，加入甲醇(3ml)，再於室溫攪拌1小時。將反應液除去，將獲得之樹脂以二氯甲烷(30ml×3次)及DMF(30ml×2次)洗滌，獲得化合物93a。
為了將Fmoc基脫保護，於化合物93a加入20%哌啶之DMF溶液(20ml)，於室溫攪拌2小時後，將反應液除去。將該樹脂以DMF(30ml×4次)洗滌，獲得化合物93b。
於化合物93b加入戊-4-烯酸(0.39g、3.90mmol)、DIC(0.550g、4.29mmol)、HOAt(0.870g、4.29mmol)之DMF溶液(20ml)，於室溫攪拌5小時。將反應液除去，將樹脂以DMF(30ml×4次)及二氯甲烷(50ml×4次)洗滌，獲得化合物93c。
於化合物93c加入2%TFA之二氯甲烷溶液(20ml)，於室溫攪拌1小時，過濾樹脂並除去。再重複3次同樣操作，將獲得之反應液合併並減壓濃縮。殘渣以管柱層析(二氯甲烷：甲醇=30：1)精製，獲得(S)-3-(3-碘苯基)-2-(戊-4-烯醯胺)丙酸(化合物93d)(0.494g、68%)。
將化合物93d(0.494g、1.324mmol)溶於DMF(10ml)，於室溫緩慢添加2-溴乙腈(0.63g、5.30mmol)及DIPEA(0.341g、2.65mmol)。於室溫攪拌30分鐘後，將反應液減壓濃縮並將獲得之殘渣以管柱層析(石油醚：乙酸乙酯=5：1)精製，獲得(S)-3-(3-碘-苯基)-2-戊-4-烯醯基胺基-丙酸 氰基甲基 酯(化合物93e)(0.392g、72%)。
溶解咪唑(476.6mg、7.0mmol)及N,N，N-三甲基十六烷-1-氯化銨(448.0mg、1.4mmol)，於以乙酸調整為pH8之緩衝液(70ml)，加入磷酸二氫((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-3-(((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(羥基)磷氧基)氧基)四氫呋喃-2-基)甲基(化合物1h、pdCpA)(70mg、0.11mmol)後，加入(S)-3-(3-碘-苯基)-2-戊-4-烯醯基胺基-丙酸 氰基甲基酯(化合物93e)(181.3mg、0.44mmol)之THF溶液(3.0ml)，於室溫攪拌2小時。於反應液加入TFA(1.0ml)並冷凍乾燥後，將獲得之殘渣以製備性-HPLC(0.05%TFA水溶液：乙腈=80：20~60：40)精製，獲得標題化合物93(17.9mg、16%)。
LCMS：m/z 992(M+H)+
保持時間：0.75分(分析條件SQDAA05)
1-6.pdCpA胺基醯基化化合物94之合成
1-6-1.3-(2-碘苯基)-2-(戊-4-烯醯胺)丙酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯之合成
Figure 107130626-A0101-12-1055-1703
將(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(3-碘苯基)丙酸替換為使用(2S)-2-[[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]胺基]-3-(2-碘苯基)丙酸(1.50g、2.92mmol)作為原料，與獲得化合物93之方法以同樣方法獲得標題化合物94(14.2mg、13%)。
LCMS：m/z 992(M+H)+
保持時間：0.71、0.73分(分析條件SQDAA05)
2-1.胺基醯基化tRNA之合成
利用pdCpA-PenteA(化合物87)與tRNA(CA欠缺)(序列編號：R-5)之接合(ligation)所為之醯基化tRNA(化合物AT-2-IIIA)之合成
於50μM轉錄tRNAfMetCAU(-CA)(序列編號R-5)10μL中，加入10X接合緩衝液(500mM HEPES-KOH pH 7.5,200mM MgCl2,10mM ATP)2μL、無核酸酶之水4μL，於95℃加熱2分鐘後，於室溫放置5分鐘，進行tRNA之重新折疊。加入10unit/μL之T4 RNA接合酶(New England Bio Lab.公司)2μL 及5mM之pdCpA-PenteA(化合物87)之DMSO溶液2μL，於15℃進行45分鐘接合反應。醯基化tRNA(化合物AT-2-IIIA)進行苯酚萃取後，利用乙醇沉澱回收。醯基化tRNA(化合物AT-2-IIIA)於即將添加到轉譯混合物時溶於1mM乙酸鈉。
化合物AT-2-IIIA
Figure 107130626-A0101-12-1056-1704
利用胺基醯基化pdCpA(化合物93)與tRNA(CA欠缺)(序列編號：R-1)之接合(ligation)所為之胺基醯基化tRNA(化合物AT-1-IIIA)之合成
於50μM轉錄tRNAEnAsnGAG(-CA)(序列編號R-1)10μL，加入10X接合緩衝液(500mM HEPES-KOH pH 7.5,200mM MgCl2,10mM ATP)2μL、無核酸酶之水4μL，於95℃加熱2分鐘後，於室溫放置5分鐘，進行tRNA之重新折疊。加入20unit/μL之T4 RNA接合酶(New England Bio Lab.公司)2μL及5mM之pdCpA-Phe(3-I)(化合物93)之DMSO溶液2μL，於15℃進行45分鐘接合反應。於接合反應液20μL中，加入3M乙酸鈉4μL與125mM碘(水：THF=1：1溶液)24μL，於室溫進行1小時脫保護。胺基醯基化tRNA係進行苯酚萃取後，利用乙醇沉澱回收。胺基醯基化tRNA(化合物AT-1-IIIA)於即將添加到轉譯混合物時溶於1mM乙酸鈉。
化合物AT-1-IIIA
Phe(3-I)-tRNAEnAsnGAG(序列編號：33)
Figure 107130626-A0101-12-1057-1705
2-2.轉譯合成
Hc1 mRNA序列(序列編號R-41')(序列編號：71)
Figure 107130626-A0101-12-1057-1706
Hc2 mRNA序列(序列編號R-42)(序列編號：72)
Figure 107130626-A0101-12-1057-1707
Hc3 mRNA序列(序列編號R-43)(序列編號：73)
Figure 107130626-A0101-12-1057-1708
Hc1胜肽序列P-160[PenteA]Phe[Phe(3-I)]ProSerGlySerGlySerGlySer
Hc2胜肽序列P-161[PenteA]ThrThrThrSerGlySerGlySerPhe[Phe(3-I)]ProGlySer
Hc3胜肽序列P-162[PenteA]AsnAsnAsnAsnAsnThrThrThrGly[Phe(3-I)]ProGlySer
胜肽P-160、P-161、P-162之轉譯合成
於已加入Met、Leu以外之各0.3mM之18種蛋白質性胺基酸、20μM Phe(3-I)-tRNAEnAsnGAG(化合物AT-1-IIIA)、 20μM PenteA-tRNAfMetCAU(化合物AT-2-IIIA)之轉譯液中，添加1μM模板mRNA Hc1、Hc2、或Hc3(序列編號R-41'、R-42、R-43)，於37℃保溫60分鐘。然後，依以下所示方法進行Heck型之環化反應。
Hc1(胜肽序列P-160)之環化反應
將磷酸緩衝液(K2HPO4 1.0mmol與K3PO4 0.2mmol之水10mL之水溶液80μL)、5%PTS(Polyoxyethanyl-α-tocopheryl sebacate)水溶液(200μL)混合，加入由序列編號R-41'獲得之轉譯產物(Hc1,20μL)，進行氮取代。於獲得之混合物中，加入將PdCl2(MeCN)2(1.0mg、3.9μmol)、2,2'-二苯基膦基-1,1'-聯苯(6.2mg、12μmol)於氮氣氛圍下溶解於N-甲基吡咯烷酮(0.2mL)而得之Pd溶液(60.0μL)，於50℃於氮氣氛圍下攪拌12小時。於反應液中加入0.2M硫三聚氰酸1.5鉀鹽水溶液(73.5μL)。
於獲得之反應溶液中加入水，成為2mL，進行離心(10000rpm、6分鐘、室溫)。針對上清進行冷凍乾燥，將獲得之殘渣再溶解於水：乙腈=9：1溶液100μL，進行LC/MS分析，確認生成環化體。
LC-HRMS：m/z 1007.4149(M-H)-,(Calcd for C46H59N10O16：1007.4116)
保持時間：6.43分(分析條件OrbitrapHFIP-Et3N)
Hc2(胜肽序列P-161)之環化反應
與Hc1的情形以同樣方法實施環化反應。將獲得之產物與Hc1的情形以同樣方法實施LC/MS分析，確認代表環化體之二 種化合物之生成。
LC-HRMS：m/z 1310.5579(M-H)-,(Calcd for C58H80N13O22：1310.5546)
保持時間：4.91分
LC-HRMS：m/z 1310.5570(M-H)-,(Calcd for C58H80N13O22：1310.5546)
保持時間：5.17分
(分析條件OrbitrapHFIP-Et3N)
Hc3(胜肽序列P-162)之環化反應
與Hc1的情形以同樣方法實施環化反應。將獲得之產物與Hc1的情形以同樣方法實施LC/MS分析，確認環化體之生成。
LC-HRMS：m/z 1415.5860(M-H)-,Calcd for C58H83N18O24：1415.5833)
保持時間：3.35分(分析條件OrbitrapHFIP-Et3N)
反轉錄實施例
將mRNA-胜肽融合物施以Heck環化反應條件，確認回收之mRNA-胜肽融合物之反轉錄無問題地進行，確認mRNA於Heck環化反應條件為安定。
mRNA-胜肽融合物溶液製備
以由PCR製備之DNA(序列編號D-50)作為模板，利用體外轉錄製備mRNA，並使用RNeasy mini kit(Qiagen公司)精製。於1μM之mRNA加入1.5μM之嘌呤黴素連結子(Sigma公司)(序列編號C-1)1X T4 RNA接合酶反應緩衝液(NEB公司)、20% DMSO、2unit/μl T4 RNA接合酶(NEB公司)，於37℃ 進行30分鐘接合反應後，以RNeasy MiniElutekit(Qiagen公司)精製。然後，以1μM之mRNA-嘌呤黴素連結子連結體(以下、mRNA-Pu)作為模板，加入前述無細胞轉譯液已去除RF1者，於37℃進行30分鐘轉譯，獲得mRNA-胜肽融合物分子(化合物Fusion-1)。
序列編號D-50(序列編號：74)KA03S2 DNA序列：
Figure 107130626-A0101-12-1060-1709
KA03S2 mRNA序列：(序列編號：75)
Figure 107130626-A0101-12-1060-1710
序列編號C-1(序列編號：76)S2PuFLin序列：[P]CCCGTCCCCGCCGCCC[Fluorecein-dT][Spacer18][Spacer18][Spacer18][Spacer18][Spacer18]CC[Puromycin]([P]：5'磷酸化)
環化反應
於獲得之mRNA-胜肽融合物分子(化合物Fusion-1,11.0μL)中，混合10-mer RNA-胜肽接合物(化合物70b)(0.33mM水溶液5.0μL、1.65nmol)、磷酸緩衝液(K2HPO4 1.0mmol與K3PO4 0.20mmol之水10mL之水溶液40μL)、5%PTS(Polyoxyethanyl-α-tocopheryl sebacate)水溶液 (100μL)，加入將PdCl2(MeCN)2(1.0mg、3.9μmol)、2,2'-二苯基膦基-1,1'-聯苯(6.2mg、12μmol)於氮氣氛圍下溶於N-甲基吡咯烷酮(0.2mL)而得之Pd溶液(30.0μL)，於50℃，於氮氣氛圍下攪拌12小時。於獲得之反應液中加入0.2M硫三聚氰酸1.5鉀鹽水溶液(37.0μL)，於室溫放置30分鐘，獲得環化反應液。將反應液(5.0μL)以水(10.0μL)稀釋，製成LC分析樣本並分析，確認10-mer RNA-胜肽接合物(化合物70b)之消失及10-mer RNA-胜肽接合物之環化體(化合物83b)之生成。
LCMS(ESI)1265.9(M-3H)3-
保持時間：3.48分(分析條件ZQHFIP-Me2NEt)
反轉錄確認
將環化反應後之mRNA-胜肽融合物分子以RNeasy MiniElute Kit(Qiagen公司)精製。以0.5μM mRNA-胜肽融合物分子作為模板，加入反轉錄反應液(1X M-MLV反轉錄反應緩衝液(Promega公司)，各0.5mM之dNTP mix,4unit/μl M-MLV反轉錄酶RNaseH負(minus)點變異，3μM反轉錄引子(序列編號C-2))，於42℃進行20分鐘反轉錄反應。將反應產物使用TGX gel anykD(Biorad公司)進行電泳，檢測附加於嘌呤黴素連結子之螢光素之螢光。其結果確認不論有無環化反應，均能以良好效率進行反轉錄反應。結果如圖43。
序列編號C-2(序列編號：77)反轉錄引子TTTGTCCCCGCCGCCCTAAGAGCCAGAGCCAGAGCCGCT
[實施例24]
RNA-複合體之Heck反應
mRNA-胜肽複合體溶液製備
於6μM之mRNA(Hc1 mRNA序列(序列編號R-41))，加入9μM之嘌呤黴素連結子(Sigma公司)(序列編號C-1)1X T4 RNA接合酶反應緩衝液(New England Biolab公司、型錄編號M0204L)、10% DMSO、0.63unit/μl T4 RNA接合酶(New England Biolab公司、型錄編號M0204L)，於37℃進行30分鐘接合反應後，以RNeasy MiniElute kit(Qiagen公司)將mRNA-嘌呤黴素連結子連結體(以下、mRNA-Pu)精製。以精製之1μM之mRNA-Pu作為模板，加入無細胞轉譯液(1mM GTP，1mM ATP，20mM肌酸磷酸，50mM HEPES-KOH pH7.6，100mM乙酸鉀，9mM乙酸鎂，2mM亞精胺(spermidine)，1mM二硫蘇糖醇，0.5mg/ml E.coli MRE600(RNase陰性)來源tRNA(Roche公司)，4μg/ml肌酸激酶，3μg/ml肌激酶，2unit/ml無機焦磷解酶，1.1μg/ml核苷二磷酸激酶，0.6μM甲硫胺醯基tRNA轉甲醯基酶，0.26μM EF-G，0.24μM RF2，0.17μM RF3，0.5μM RRF，2.7μM IF1，0.4μM IF2,1.5μM IF3,40μM EF-Tu，84μM EF-Ts，1.2μM核糖體，0.73μM AlaRS，0.03μM ArgRS，0.38μM AsnRS，0.13μM AspRS，0.02μM CysRS，0.06μM GlnRS，0.23μM GluRS，0.09μM GlyRS，0.02μM HisRS，0.4μM IleRS，0.04μM LeuRS，0.11μM LysRS，0.03μM MetRS，0.68μM PheRS，0.16μM ProRS，0.04μM SerRS，0.09μM ThrRS，0.03μM TrpRS，0.02μM TyrRS，0.02μM ValRS(實驗室製備之蛋白基本上製 備為附加His標籤之蛋白)，各300μM之除了甲硫胺酸與白胺酸以外的18種蛋白質性胺基酸)，20μM之化合物AT-1-IIIA、20μM 4-PenteA-tRNAfMetCAU(化合物AT-2-IIIA)，於37℃進行30分鐘轉譯，加入18mM EDTA pH8.0，獲得mRNA-胜肽複合體。
環化反應
於獲得之mRNA-胜肽複合體(20.0μL)，混合磷酸緩衝液(K2HPO4 1.0mmol與K3PO4 0.40mmol之水10mL之水溶液120μL)、15%PTS(Polyoxyethanyl-α-tocopheryl sebacate)水溶液(200μL)，加入將PdCl2(MeCN)2(4.0mg、15.4μmol)、2,2'-二苯基膦基-1,1'-聯苯(24.8mg、47.5μmol)於氮氣氛圍下溶於N-甲基吡咯烷酮(0.8mL)而得之Pd溶液(60.0μL)，於50℃於氮氣氛圍下攪拌24小時。於獲得之反應液中加入0.2M硫三聚氰酸1.5鉀鹽水溶液(73.5μL)，於室溫放置30分鐘，獲得環化反應液。
RNase處理
將上述環化反應液以桌上離心機進行離心分離，將上清以RNeasy miniElute Cleanup kit(Qiagen公司、Catalog No.74204)精製，以無RNase水溶出。將溶出液使用1×Reaction buffer(Promega公司、Catalog No.M217A、10mM TrisHCl pH7.5,5mM EDTA,0.2M AcONa)、0.5unit/μl RNaseONE ribonuclease(Promega公司、Catalog No.M425A)、0.1Unit/μl RNaseH(LifeTechnologies公司Catalog No.18021-014)，於37℃反應3小時，獲得以下之化合物(化合物Fusion-2)。
化合物Fusion-2
Figure 107130626-A0101-12-1064-1711
詳細之次結構如下。
Figure 107130626-A0101-12-1064-1712
Figure 107130626-A0101-12-1065-1713
LC分析
於已經過RNase處理之樣本(10μL)，加入400mM HFIP、15mM三乙胺水溶液90μL後，使用Oasis HLB μElution(Waters公司)進行固相萃取。針對50%乙腈溶出級分進行冷凍乾燥，針對再溶於水之樣本進行LC/MS分析，確認胜肽融合物環化產物之生成。(圖78)
LC-HRMS：m/z 666.2124(M-14H)14-，621.7293(M-15H)15-，582.8100(M-16H)16-(Calcd for C333H466N80O188P24：Molecular Weight 9341)
保持時間：29.74分(分析條件OrbitrapHFIP-Et3N-2)
[實施例25]以醯胺環化予以環化之展示庫之實施
利用pdCpA-胺基酸群之合成，然後tRNA-胺基酸複合體之合成，準備導入之非天然型胺基酸當中不依存於ARS而導入者。然後，準備高多樣性之無規DNA。然後，利用轉錄、轉譯、化學修飾製作RNA與環化胜肽之複合體作製，接著，實施淘選，進行為了取得對’抗TNFα、TNFR1、IL-6R之結合胜肽之實驗
1.用以建構展示庫之pdCpA-胺基酸之合成
作為與pdCpA之複合體，實施為了將以下之非天然型胺基酸(MeGly、Phg、Phe(4-CF3)、Met(O2)、βAla、MeAla(4-Thz)、MePhe(3-Cl)、nPrGly、MeSer、Hyp(Et))進行轉譯導入之合成。亦即，依以下流程，合成化合物SP705(Pen-MeGly-pdCpA)、化合物SP710(Pen-Phg-pdCpA)、化合物SP715(Pen-Phe(4-CF3)-pdCpA)、化合物SP720(Pen-Met(O2)-pdCpA)、化合物SP725(Pen-βAla-pdCpA)、化合物SP731(Pen-MeAla(4-Thz)-pdCpA)、化合物SP737(Pen-MePhe(3-Cl)-pdCpA)、化合物SP742(Pen-nPrGly-pdCpA)、化合物SP754(Pen-Hyp(Et)-pdCpA)。化合物6i-C(tBuSSEtGABA)、化合物1i-IA之合成已記載。
Figure 107130626-A0101-12-1067-1714
針對化合物SP749(Pen-MeSer-pdCpA)，依以下流程合成。
Figure 107130626-A0101-12-1068-1715
2(-((第三丁氧羰基)(甲基)胺基)乙酸氰基甲酯(化合物SP702)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1068-1716
於氮氣氛圍下，將2(-((第三丁氧羰基)(甲基)胺基)乙酸(化合物SP701)(10.0g、52.9mmol)及N-乙基-異丙基丙烷-2-胺(DIPEA)(18.9mL、108mmol)溶於二氯甲烷(100ml)，加入2-溴乙腈(26.0g、217mmol)，於室溫攪拌1小時。將反應液減壓濃縮並將殘渣以管柱層析(乙酸乙酯：石油醚=1：10→1：4)精製，獲得2(-((第三丁氧羰基)(甲基)胺基)乙酸氰基甲酯(化合物SP702)(4.80g、80%)。
LCMS(ESI)m/z=251(M+Na)+
保持時間：1.82分(分析條件SMDmethod6)
2-(甲胺基)乙酸氰基甲酯鹽酸鹽(化合物SP703)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1069-1717
使2(-((第三丁氧羰基)(甲基)胺基)乙酸氰基甲酯(化合物SP702)(4.80g、21.0mmol)溶於二乙醚(50ml)，打入鹽酸氣體，於室溫攪拌2小時。將析出之固體以過濾收集，於減壓下乾燥，獲得2-(甲胺基)乙酸氰基甲酯鹽酸鹽(化合物SP703)(3.00g、87%)粗產物，直接用於其次之反應。
2-(N-甲基戊-4-烯醯胺)乙酸氰基甲酯(Pen-MeGly-OCH2CN)(化合物SP704)之合成
又，本說明書中，4-戊烯醯基簡稱為Pen基，氰基甲基記載為CH2CN。
Figure 107130626-A0101-12-1069-1718
於氮氣氛圍下，使2-(甲胺基)乙酸氰基甲酯鹽酸鹽(化合物SP703)(3.00g、18.3mmol)及三乙胺(6.34ml、45.5mmol)溶於二氯甲烷(30ml)，於0℃滴加氯化戊-4-烯醇(2.60g、22.0mmol)。於室溫攪拌2小時30分後，將反應液減壓濃縮並使獲得之殘渣溶於乙酸乙酯，將固體以過濾去除。將溶液減壓濃縮，以管柱層析(乙酸乙酯：石油醚=1：10→2：7)精製，獲 得2-(N-甲基戊-4-烯醯胺)乙酸氰基甲酯(化合物SP704)(3.40g、88%)。
LCMS(ESI)m/z=211(M+H)+
保持時間：1.50分(分析條件SMDmethod6)
2-(N-甲基戊-4-烯醯胺)乙酸(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(Pen-MeGly-pdCpA)(化合物SP705)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1070-1719
於緩衝液A(11)中，使磷酸二氫((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-3-(((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(羥基)磷氧基)氧基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物1h)(1.00g、1.57mmol)溶解，加入2-(N-甲基戊-4-烯醯胺)乙酸氰基甲酯(化合物SP704)(2.00g、9.51mmol)之四氫呋喃(5ml)溶液，於室溫攪拌30分鐘。將反應液冷凍乾燥，並將獲得之 殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.5%三氟乙酸水溶液/乙腈)精製，獲得標題化合物(化合物SP705)(139mg、11%)。
LCMS(ESI)m/z=790.5(M+H)+
保持時間：0.46分(分析條件SQDAA05)
2-((第三丁氧羰基)胺基)-2-苯基乙酸(S)-氰基甲酯(化合物SP707)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1071-2355
與化合物SP702之製造例以同樣條件，將2(-((第三丁氧羰基)(甲基)胺基)乙酸(化合物SP701)替換為使用(S)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-2-苯基乙酸(化合物SP706)(1.00g、3.98mmol)，藉此獲得2-((第三丁氧羰基)胺基)-2-苯基乙酸(S)-氰基甲酯(化合物SP707)(1.02g、88%)。
2-胺基-2-苯基乙酸(S)-氰基甲酯鹽酸鹽(化合物SP708)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1071-1721
與化合物SP703之製造例以同樣條件，並將2(-((第三丁氧羰基)(甲基)胺基)乙酸氰基甲酯(化合物SP702)替換為使用2-((第三丁氧羰基)胺基)-2-苯基乙酸(S)-氰基甲酯(化合物SP707)(4.50g、15.5mmol)，獲得2-胺基-2-苯基乙酸 (S)-氰基甲酯鹽酸鹽(化合物SP708)(2.80g、80%)粗產物，直接用於其次之反應。
2-(戊-4-烯醯胺)-2-苯基乙酸(S)-氰基甲酯(Pen-Phg-OCH2CN)(化合物SP709)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1072-2356
與化合物SP704之製造例以同樣條件，將2-(甲胺基)乙酸氰基甲酯鹽酸鹽(化合物SP703)替換為使用2-胺基-2-苯基乙酸(S)-氰基甲酯鹽酸鹽(化合物SP708)(2.80g、12.4mmol)，獲得2-(戊-4-烯醯胺)-2-苯基乙酸(S)-氰基甲酯(化合物SP709)(1.90g、56%)。
LCMS(ESI)m/z=273(M+H)+
保持時間：1.88分(分析條件SMDmethod7)
2-(戊-4-烯醯胺)-2-苯基乙酸(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(Pen-Phg-pdCpA)(化合物SP710)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1073-1723
與化合物SP705之製造例以同樣條件，使用磷酸二氫((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-3-(((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(羥基)磷氧基)氧基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物1h)(700mg、1.10mmol)，並將2-(N-甲基戊-4-烯醯胺)乙酸氰基甲酯(化合物SP704)替換為使用2-(戊-4-烯醯胺)-2-苯基乙酸(S)-氰基甲酯(化合物SP709)，獲得標題化合物(化合物SP710)(79.7mg、8.5%)。
LCMS(ESI)m/z=852.5(M+H)+
保持時間：0.42分(分析條件SQDFA05)
2-((第三丁氧羰基)胺基)-3-(4-(三氟甲基)苯基)丙酸(S)-氰基甲酯(化合物SP712)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1074-1724
與化合物SP702之製造例以同樣條件，並將2(-((第三丁氧羰基)(甲基)胺基)乙酸(化合物SP701)替換為使用(S)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-3-(4-(三氟甲基)苯基)丙酸(化合物SP711)(1.00g、3.00mmol)，獲得2-((第三丁氧羰基)胺基)-3-(4-(三氟甲基)苯基)丙酸(S)-氰基甲酯(化合物SP712)(1.01g、90%)。
2-胺基-3-(4-(三氟甲基)苯基)丙酸(S)-氰基甲酯鹽酸鹽(化合物SP713)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1074-2357
與化合物SP703之製造例以同樣條件，並將2(-((第三丁氧羰基)(甲基)胺基)乙酸氰基甲酯(化合物SP702)替換為使用、2-((第三丁氧羰基)胺基)-3-(4-(三氟甲基)苯基)丙酸(S)-氰基甲酯(化合物SP712)(9.30g、25.0mmol)，獲得2-胺基-3-(4-(三氟甲基)苯基)丙酸(S)-氰基甲酯鹽酸鹽(化合物SP713)(7.00g、91%)粗產物，直接用於其次的反應。
2-(戊-4-烯醯胺)-3-(4-(三氟甲基)苯基)丙酸(S)- 氰基甲酯(Pen-Phe(4-CF3)-OCH2CN)(化合物SP714)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1075-2358
與化合物SP704之製造例以同樣條件，並將2-(甲胺基)乙酸氰基甲酯鹽酸鹽(化合物SP703)替換為使用2-胺基-3-(4-(三氟甲基)苯基)丙酸(S)-氰基甲酯鹽酸鹽(化合物SP713)(7.00g、22.7mmol)，獲得標題化合物(化合物SP714)(3.50g、44%)。
LCMS(ESI)m/z=355(M+H)+
保持時間：1.47分(分析條件SMDmethod7)
2-(戊-4-烯醯胺)-3-(4-(三氟甲基)苯基)丙酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(Pen-Phe(4-CF3)-pdCpA)(化合物SP715)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1076-1727
與化合物SP705之製造例以同樣條件，使用磷酸二氫((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-3-(((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(羥基)磷氧基)氧基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物1h)(1.00g、1.57mmol)，並將2-(N-甲基戊-4-烯醯胺)乙酸氰基甲酯(化合物SP704)替換為使用2-(戊-4-烯醯胺)-3-(4-(三氟甲基)苯基)丙酸(S)-氰基甲酯(化合物SP714)，獲得標題化合物(化合物SP715)(258mg、18%)。
LCMS(ESI)m/z=934.6(M+H)+
保持時間：0.73分(分析條件SQDAA05)
2-((第三丁氧羰基)胺基)-4-(甲基磺醯基)丁酸(S)-氰基甲酯(化合物SP717)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1076-2359
與化合物SP702之製造例以同樣條件，並將2(-((第三丁氧羰基)(甲基)胺基)乙酸(化合物SP701)替換為使用(S)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-4-(甲基磺醯基)丁酸(化合物SP716)(5.00g、17.8mmol)，獲得2-((第三丁氧羰基)胺基)-4-(甲基磺醯基)丁酸(S)-氰基甲酯(化合物SP717)(4.50g、79%)。
2-胺基-4-(甲基磺醯基)丁酸(S)-氰基甲酯鹽酸鹽(化合物SP718)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1077-2360
與化合物SP703之製造例以同樣條件，並將2(-((第三丁氧羰基)(甲基)胺基)乙酸氰基甲酯(化合物SP702)替換為使用2-((第三丁氧羰基)胺基)-4-(甲基磺醯基)丁酸(S)-氰基甲酯(化合物SP717)(4.50g、14.0mmol)，獲得2-胺基-4-(甲基磺醯基)丁酸(S)-氰基甲酯鹽酸鹽(化合物SP718)(3.50g、98%)粗產物，直接用於其次之反應。
4-(甲基磺醯基)-2-(戊-4-烯醯胺)丁酸(S)-氰基甲酯(Pen-Met(O2)-OCH2CN(化合物SP719)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1077-2361
與化合物SP704之製造例以同樣條件，並將2-(甲 胺基)乙酸氰基甲酯鹽酸鹽(化合物SP703)替換為使用2-胺基-4-(甲基磺醯基)丁酸(S)-氰基甲酯鹽酸鹽(化合物SP718)(3.50g、13.7mmol)，獲得4-(甲基磺醯基)-2-(戊-4-烯醯胺)丁酸(S)-氰基甲酯(化合物SP719)(2.00g、48%)。
LCMS(ESI)m/z=303(M+H)+
保持時間：1.28分(分析條件SMDmethod7)
4-(甲基磺醯基)-2-(戊-4-烯醯胺)丁酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(Pen-Met(O2)-pdCpA)(化合物SP720)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1078-2362
與化合物SP705之製造例以同樣條件，使用磷酸二氫((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-3-(((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(羥基)磷氧基)氧基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物1h)(1.00g、1.57mmol)，並將2-(N-甲基戊-4-烯醯 胺)乙酸氰基甲酯(化合物SP704)替換為使用4-(甲基磺醯基)-2-(戊-4-烯醯胺)丁酸(S)-氰基甲酯(化合物SP719)，獲得標題化合物(化合物SP720)(153mg、11%)。
LCMS(ESI)m/z=882.3(M+H)+
保持時間：0.40分(分析條件SQDAA05)
3-((第三丁氧羰基)胺基)丙酸氰基甲酯(化合物SP722)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1079-1732
與化合物SP702之製造例以同樣條件，並將2(-((第三丁氧羰基)(甲基)胺基)乙酸(化合物SP701)替換為使用3-((第三丁氧羰基)胺基)丙酸(化合物SP721)(5.00g、26.4mmol)，獲得3-((第三丁氧羰基)胺基)丙酸氰基甲酯(化合物SP722)(4.70g、78%)。
3-胺基丙酸氰基甲酯鹽酸鹽(化合物SP723)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1079-1733
與化合物SP703之製造例以同樣條件，並將2(-((第三丁氧羰基)(甲基)胺基)乙酸氰基甲酯(化合物SP702)替換為使用3-((第三丁氧羰基)胺基)丙酸氰基甲酯(化合物SP722)(4.70g、20.6mmol)，獲得3-胺基丙酸氰基甲酯鹽酸鹽(化合物SP723)(3.00g、88%)粗產物，直接用於其次之反應。
3-(戊-4-烯醯胺)丙酸氰基甲酯(化合物SP724)之合 成
Figure 107130626-A0101-12-1080-2363
與化合物SP704之製造例以同樣條件，將2-(甲胺基)乙酸氰基甲酯鹽酸鹽(化合物SP703)替換為使用3-胺基丙酸氰基甲酯鹽酸鹽(化合物SP723)(3.00g、18.2mmol)，獲得3-(戊-4-烯醯胺)丙酸氰基甲酯(化合物SP724)(2.80g、73%)。
LCMS(ESI)m/z=211(M+H)+
保持時間：1.37分(分析條件SMDmethod8)
3-(戊-4-烯醯胺)丙酸(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(Pen-βAla-pdCpA)(化合物SP725)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1080-2364
與化合物SP705之製造例以同樣條件，使用磷酸二氫((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)- 基)-3-(((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(羥基)磷氧基)氧基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物1h)(700mg、1.10mmol)，並將2-(N-甲基戊-4-烯醯胺)乙酸氰基甲酯(化合物SP704)替換為使用3-(戊-4-烯醯胺)丙酸氰基甲酯(化合物SP724)，獲得標題化合物(化合物SP725)(134mg、15%)。
LCMS(ESI)m/z=790.6(M+H)+
保持時間：0.41分(分析條件SQDAA05)
(S)-2-((第三丁氧羰基)(甲基)胺基)-3-(噻唑-4-基)丙酸(化合物SP727)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1081-2365
於氮氣氛圍下，於氫化鈉(470mg、11.8mmol、60%)之四氫呋喃(30ml)懸浮液中，滴加(S)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-3-(噻唑-4-基)丙酸(化合物SP726)(800mg、2.94mmol)之四氫呋喃(20ml)溶液。然後加入碘甲烷(1.67g、11.8mmol)，於室溫攪拌18小時。將反應液以6mol/l之鹽酸水調整為pH4，並以乙酸乙酯萃取。將獲得之’將有機萃取物以硫酸鈉乾燥後減壓濃縮，將殘渣以管柱層析(乙酸乙酯)精製，獲得(S)-2-((第三丁氧羰基)(甲基)胺基)-3-(噻唑-4-基)丙酸(化合物SP727)(560mg、67%)。
LCMS(ESI)m/z=287(M+H)+
保持時間：1.24分(分析條件SMDmethod7)
2-((第三丁氧羰基)(甲基)胺基)-3-(噻唑-4-基)丙酸(S)-氰基甲酯(化合物SP728)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1082-2366
與化合物SP702之製造例以同樣條件，並將2(-((第三丁氧羰基)(甲基)胺基)乙酸(化合物SP701)替換為使用(S)-2-((第三丁氧羰基)(甲基)胺基)-3-(噻唑-4-基)丙酸(化合物SP727)(3.94g、13.8mmol)，獲得2-((第三丁氧羰基)(甲基)胺基)-3-(噻唑-4-基)丙酸(S)-氰基甲酯(化合物SP728)(3.04g、68%)。
2-(甲胺基)-3-(噻唑-4-基)丙酸(S)-氰基甲酯鹽酸鹽(化合物SP729)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1082-1738
與化合物SP703之製造例以同樣條件，並將2(-((第三丁氧羰基)(甲基)胺基)乙酸氰基甲酯(化合物SP702)替換為使用2-((第三丁氧羰基)(甲基)胺基)-3-(噻唑-4-基)丙酸(S)-氰基甲酯(化合物SP728)(3.04g、9.34mmol)，獲得2-(甲胺基)-3-(噻唑-4-基)丙酸(S)-氰基甲酯鹽酸鹽(化合物 SP729)(1.85g、76%)粗產物，直接用在其次之反應。
2-(N-甲基戊-4-烯醯胺)-3-(噻唑-4-基)丙酸(S)-氰基甲酯(化合物SP730)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1083-2367
與化合物SP704之製造例以同樣條件，並將2-(甲胺基)乙酸氰基甲酯鹽酸鹽(化合物SP703)替換為使用2-(甲胺基)-3-(噻唑-4-基)丙酸(S)-氰基甲酯鹽酸鹽(化合物SP729)(1.85g、7.07mmol)，獲得標題化合物(化合物SP730)(1.48g、68%)。
LCMS(ESI)m/z=308(M+H)+
保持時間：1.28分(分析條件SMDmethod7)
2-(N-甲基戊-4-烯醯胺)-3-(噻唑-4-基)丙酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(Pen-MeAla(4-Thz)-pdCpA)(化合物SP731)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1084-1740
與化合物SP705之製造例以同樣條件，使用磷酸二氫((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-3-(((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(羥基)磷氧基)氧基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物1h)(700mg、1.10mmol)，並將2-(N-甲基戊-4-烯醯胺)乙酸氰基甲酯(化合物SP704)替換為使用2-(N-甲基戊-4-烯醯胺)-3-(噻唑-4-基)丙酸(S)-氰基甲酯(化合物SP730)，獲得標題化合物(化合物SP731)(60.9mg、6%)。
LCMS(ESI)m/z=887.4(M+H)+
保持時間：0.40分(分析條件SQDFA05)
(S)-2-((第三丁氧羰基)(甲基)胺基)-3-(3-氯苯基)丙酸(化合物SP733)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1085-1741
與化合物SP727之製造例以同樣條件，並將(S)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-3-(噻唑-4-基)丙酸(化合物SP726)替換為使用(S)-2-((第三丁氧羰基)胺基)-3-(3-氯苯基)丙酸(化合物SP732)(5.00g、16.7mmol)，獲得(S)-2-((第三丁氧羰基)(甲基)胺基)-3-(3-氯苯基)丙酸(化合物SP733)(5.10g、97%)。
2-((第三丁氧羰基)(甲基)胺基)-3-(3-氯苯基)丙酸(S)-氰基甲酯(化合物SP734)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1085-2368
與化合物SP702之製造例以同樣條件，並將2(-((第三丁氧羰基)(甲基)胺基)乙酸(化合物SP701)替換為使用(S)-2-((第三丁氧羰基)(甲基)胺基)-3-(3-氯苯基)丙酸(化合物SP733)(5.10g、16.3mmol)，獲得2-((第三丁氧羰基)(甲基)胺基)-3-(3-氯苯基)丙酸(S)-氰基甲酯(化合物SP734)(4.75g、83%)。
3-(3-氯苯基)-2-(甲胺基)丙酸(S)-氰基甲酯鹽酸鹽(化合物SP735)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1086-1743
與化合物SP703之製造例以同樣條件，並將2(-((第三丁氧羰基)(甲基)胺基)乙酸氰基甲酯(化合物SP702)替換為使用2-((第三丁氧羰基)(甲基)胺基)-3-(3-氯苯基)丙酸(S)-氰基甲酯(化合物SP734)(4.75g、13.5mmol)，獲得3-(3-氯苯基)-2-(甲胺基)丙酸(S)-氰基甲酯鹽酸鹽(化合物SP735)(3.31g、84%)粗產物，直接用在其次之反應。
3-(3-氯苯基)-2-(N-甲基戊-4-烯醯胺)丙酸(S)-氰基甲酯(化合物SP736、Pen-MePhe(3-Cl)-OCH2CN)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1086-1744
與化合物SP704之製造例以同樣條件，並將2-(甲胺基)乙酸氰基甲酯鹽酸鹽(化合物SP703)替換為使用3-(3-氯苯基)-2-(甲胺基)丙酸(S)-氰基甲酯鹽酸鹽(化合物SP735)(3.31g、11.4mmol)，獲得3-(3-氯苯基)-2-(N-甲基戊-4-烯醯胺)丙酸(S)-氰基甲酯(化合物SP736)(2.72g、71%)。
LCMS(ESI)m/z=335(M+H)+
保持時間：1.67分(分析條件SMDmethod4)
3-(3-氯苯基)-2-(N-甲基戊-4-烯醯胺)丙酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(Pen-MePhe(3-Cl)-pdCpA)(化合物SP737)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1087-2369
與化合物SP705之製造例以同樣條件，使用磷酸二氫((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-3-(((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(羥基)磷氧基)氧基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物1h)(1.00g、1.57mmol)，將2-(N-甲基戊-4-烯醯胺)乙酸氰基甲酯(化合物SP704)替換為使用3-(3-氯苯基)-2-(N-甲基戊-4-烯醯胺)丙酸(S)-氰基甲酯(化合物SP736)，獲得標題化合物(化合物SP737)(389mg、27%)。
LCMS(ESI)m/z=914.6(M+H)+
保持時間：0.75分(分析條件SQDAA05)
2-((第三丁氧羰基)(丙基)胺基)乙酸氰基甲酯(化 合物SP739)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1088-2371
與化合物SP702之製造例以同樣條件，並將2(-((第三丁氧羰基)(甲基)胺基)乙酸(化合物SP701)替換為使用2-((第三丁氧羰基)(丙基)胺基)乙酸(化合物SP738)(5.00g、23.0mmol)，獲得2-((第三丁氧羰基)(丙基)胺基)乙酸氰基甲酯(化合物SP739)(4.20g、71%)。
2-(丙胺基)乙酸氰基甲酯鹽酸鹽(化合物SP740)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1088-1747
與化合物SP703之製造例以同樣條件，並將2(-((第三丁氧羰基)(甲基)胺基)乙酸氰基甲酯(化合物SP702)替換為使用2-((第三丁氧羰基)(丙基)胺基)乙酸氰基甲酯(化合物SP739)(4.20g、16.4mmol)，獲得2-(丙胺基)乙酸氰基甲酯鹽酸鹽(化合物SP740)(2.50g、79%)粗產物，直接用在其次的反應。
2-(N-丙基戊-4-烯醯胺)乙酸氰基甲酯(化合物SP741、Pen-nPrGly-OCH2CN)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1089-1748
與化合物SP704之製造例以同樣條件，並將2-(甲胺基)乙酸氰基甲酯鹽酸鹽(化合物SP703)替換為使用2-(丙胺基)乙酸氰基甲酯鹽酸鹽(化合物SP740)(2.55g、13.2mmol)，獲得2-(N-丙基戊-4-烯醯胺)乙酸氰基甲酯(化合物SP741)(2.10g、67%)。
1H-NMR(Bruker AVANCE II、300MHz、CDCl3)δ ppm 6.19-6.32(1H、m)、5.38-5.49(2H、m)、5.17-5.22(2H、m)、4.49-4.55(2H、m)、3.70-3.78(2H、m)、2.78-2.90(4H、m)、1.84-2.07(2H、m)、1.34(3H、t、J=8.1Hz)
2-(N-丙基戊-4-烯醯胺)乙酸(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(Pen-nPrGly-pdCpA)(化合物SP742)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1090-1749
與化合物SP705之製造例以同樣條件，使用磷酸二氫((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-3-(((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(羥基)磷氧基)氧基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物1h)(1.00g、1.57mmol)，並將2-(N-甲基戊-4-烯醯胺)乙酸氰基甲酯(化合物SP704)替換為使用2-(N-丙基戊-4-烯醯胺)乙酸氰基甲酯(化合物SP741)，獲得標題化合物(化合物SP742)(314mg、24%)。
LCMS(ESI)m/z=818.4(M+H)+
保持時間：0.57分(分析條件SQDAA05)
4-乙氧基吡咯烷-1,2-二羧酸2-(氰基甲基)(2S，4R)-1-第三丁酯(化合物SP751)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1091-2372
與化合物SP702之製造例以同樣條件，並將2(-((第三丁氧羰基)(甲基)胺基)乙酸(化合物SP701)替換為使用(2S，4R)-1-(第三丁氧羰基)-4-乙氧基吡咯烷-2-羧酸(化合物SP750)(4.75g、18.3mmol)，獲得4-乙氧基吡咯烷-1,2-二羧酸2-(氰基甲基)(2S，4R)-1-第三丁酯(化合物SP751)(5.00g、91%)。
4-乙氧基吡咯烷-2-羧酸(2S，4R)-氰基甲基鹽酸鹽(化合物SP752)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1091-1751
與化合物SP703之製造例以同樣條件，並機2(-((第三丁氧羰基)(甲基)胺基)乙酸氰基甲酯(化合物SP702)替換為使用4-乙氧基吡咯烷-1,2-二羧酸2-(氰基甲基)(2S，4R)-1-第三丁基(化合物SP751)(5.00g、16.8mmol)
Figure 107130626-A0101-12-1091-1658
用
Figure 107130626-A0101-12-1091-1659
，獲得4-乙氧基吡咯烷-2-羧酸(2S，4R)-氰基甲基鹽酸鹽(化合 物SP752)(3.25g、83%)。
4-乙氧基-1-(戊-4-烯醯基)吡咯烷-2-羧酸(2S，4R)-氰基甲酯(Pen-Hyp(Et)-OCH2CN)(化合物SP753)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1092-2373
與化合物SP704之製造例以同樣條件，並將2-(甲胺基)乙酸氰基甲酯鹽酸鹽(化合物SP703)替換為使用4-乙氧基吡咯烷-2-羧酸(2S，4R)-氰基甲基鹽酸鹽(化合物SP752)(3.00g、12.8mmol)，獲得4-乙氧基-1-(戊-4-烯醯基)吡咯烷-2-羧酸(2S，4R)-氰基甲酯(化合物SP753)(2.75g、77%)。
LCMS(ESI)m/z=281(M+H)+
保持時間：1.45分(分析條件SMDmethod4)
4-乙氧基-1-(戊-4-烯醯基)吡咯烷-2-羧酸(2S，4R)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(Pen-Hyp(Et)-pdCpA)(化合物SP754)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1093-1753
與化合物SP705之製造例以同樣條件，使用磷酸二氫((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-3-(((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(羥基)磷氧基)氧基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物1h)(1.00g、1.57mmol)，並將2-(N-甲基戊-4-烯醯胺)乙酸氰基甲酯(化合物SP704)替換為使用4-乙氧基-1-(戊-4-烯醯基)吡咯烷-2-羧酸(2S，4R)-氰基甲酯(化合物SP753)，獲得標題化合物(化合物SP754)(154mg、11%)。
LCMS(ESI)m/z=860.4(M+H)+
保持時間：0.55分(分析條件SQDAA05)
(S)-3-(第三丁氧基)-2-(N-甲基戊-4-烯醯胺)丙酸(化合物SP746)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1093-2374
將(S)-2-(3-(9H-茀-9-基)-N-甲基丙醯胺)-3-(第三 丁氧基)丙酸(化合物SP745)(4，35g、11.0mmol)及二異丙基乙胺(EtN(iPr)2)(10.4mL、60.0mmol)溶於脫水二氯甲烷(46ml)，加入2-氯三苯甲基氯化物樹脂(100-200mesh、1%DVB、從渡邊化學購買、4.65g、7.30mmol)，於室溫振盪60分鐘，藉此使胺基酸載持於樹脂。將反應溶液除去，將樹脂以脫水二氯甲烷(46ml)洗滌4次。於樹脂加入20%哌啶N,N-二甲基甲醯胺溶液(15ml)，振盪90分鐘，進行Fmoc基之脫保護。將反應溶液除去，將樹脂以N,N-二甲基甲醯胺(15ml)洗滌3次。然後，將戊-4-烯酸(2.3ml、21.9mmol)、3H-(1,2,3)疊氮并(4,5-b)吡啶-3-醇(HOAt)(1.99g、14.6mmol)及N,N’-甲烷二亞基雙(丙烷-2-胺)(DIC、3.71ml、24.1mmol)溶於N,N-二甲基甲醯胺(15ml)，加入樹脂，於室溫振盪60分鐘，進行戊烯醯基化。將反應溶液除去，將樹脂以N,N-二甲基甲醯胺(15ml)洗滌3次後，再以二氯甲烷(15ml)洗滌3次。然後，將1%三氟乙酸二氯甲烷溶液(1% TFA in CH2Cl2)(40ml)加到前述樹脂，振盪30分鐘，從樹脂切出胺基酸。將反應溶液回收，將樹脂以二氯甲烷(40ml)洗滌3次。將回收之反應液減壓濃縮並將殘渣以逆相矽膠管柱層析(10mM乙酸銨水溶液/甲醇溶液)精製，獲得(S)-3-(第三丁氧基)-2-(N-甲基戊-4-烯醯胺)丙酸(化合物SP746)(1.02g、54%)。又，於此合成使用之二氯甲烷與N,N-二甲基甲醯胺，係使用胜肽合成用特製溶劑(從渡邊化學購買)。
LCMS(ESI)m/z=258(M+H)+
保持時間：0.71分(分析條件SQDAA05)
3-(第三丁氧基)-2-(N-甲基戊-4-烯醯胺)丙酸 (S)-氰基甲酯(化合物SP747)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1095-1755
於氮氣氛圍下，將(S)-3-(第三丁氧基)-2-(N-甲基戊-4-烯醯胺)丙酸(化合物SP746)(1.01g、3.92mmol)及N-乙基-異丙基丙烷-2-胺(EtN(iPr)2、1.37mL、7.85mmol)溶於N,N-二甲基甲醯胺(3.92ml)，加入2-溴乙腈(0.82ml、11.8mmol)，於室溫攪拌45分鐘。於反應液加入50ml乙酸乙酯，將有機層以50ml之氯化銨飽和水溶液與50ml之飽和食鹽水分液。將有機層回收，減壓濃縮，將殘渣以逆相矽膠管柱層析(10mM乙酸銨水溶液/甲醇溶液)精製，獲得3-(第三丁氧基)-2-(N-甲基戊-4-烯醯胺)丙酸(S)-氰基甲酯(化合物SP747)(1.00g、86%)。
LCMS(ESI)m/z=297.6(M+H)+
保持時間：0.77分(分析條件SQDFA05)
3-(第三丁氧基)-2-(N-甲基戊-4-烯醯胺)丙酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物SP748、Pen-MeSer(tBu)-pdCpA)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1096-1756
與化合物SP705之製造例以同樣條件，使用磷酸二氫((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-3-(((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(羥基)磷氧基)氧基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物1h)(519mg、0.816mmol)，並將2-(甲胺基)乙酸氰基甲酯鹽酸鹽(化合物SP704)替換為使用3-(第三丁氧基)-2-(N-甲基戊-4-烯醯胺)丙酸(S)-氰基甲酯(化合物SP747)，藉此獲得標題化合物(化合物SP748)(300mg、42%)。
LCMS(ESI)m/z=876.7(M+H)+
保持時間：0.47分(分析條件SQDFA05)
3-羥基-2-(N-甲基戊-4-烯醯胺)丙酸(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(Pen-MeSer-pdCpA)(化合物SP749)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1097-1757
將(2S)-(2R，3S，4R，5R)-2-((((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-2-((膦醯氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)氧基)(羥基)磷氧基)氧基)甲基)-5-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-3-酯(化合物SP748)(299mg、0.341mmol)以三氟乙酸(3.38ml、43.9mmol)溶解，攪拌30分鐘。將反應液減壓濃縮並將殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.1%甲酸水溶液/乙腈溶液)精製，獲得標題化合物(化合物SP749)(144mg、52%)。
LCMS(ESI)m/z=820.5(M+H)+
保持時間：0.31分(分析條件SQDFA05)
2.用以建構展示庫之轉錄tRNA及轉錄tRNA(CA欠缺)之合成
淘選使用之轉錄tRNA及轉錄tRNA(CA欠缺)依以下方式製備。
從模板DNA(序列編號DTL-1~14)，利用使用RiboMAX Large Scale RNA production System T7(Promega公司，P1300)之體外轉錄，合成3'端之CA欠缺之tRNA(-CA)(序 列編號MTL-1~12)及轉錄tRNA(序列編號MTL-13~14)，以RNeasy Maxi kit(Qiagen公司)精製。惟，體外轉錄係從Promega公司之標準實驗步驟將GTP濃度減少為3.75mM，並重新加入GMP7.5mM之條件下實施。ATP、CTP、UTP，係依標準實驗步驟，各加入7.5mM。
序列編號DTL-1(序列編號：99)tRNAGluCUG(-CA)CAG DNA序列：
Figure 107130626-A0101-12-1098-1758
序列編號DTL-2(序列編號：100)tRNAGluACG(-CA)CGU DNA序列：
Figure 107130626-A0101-12-1098-1759
序列編號DTL-3(序列編號：101)tRNAGluUUC(-CA)GAA DNA序列：
Figure 107130626-A0101-12-1098-1760
序列編號DTL-4(序列編號：102)tRNAGluCCU(-CA)AGG DNA序列：
Figure 107130626-A0101-12-1098-1761
CTAGGGGACGC
序列編號DTL-5(序列編號：103)tRNAGluCAA(-CA)UUG DNA序列：
Figure 107130626-A0101-12-1099-1762
序列編號DTL-6(序列編號：104)tRNAGluUAG(-CA)CUA DNA序列：
Figure 107130626-A0101-12-1099-1763
序列編號DTL-7(序列編號：105)tRNAGluCUA(-CA)UAG DNA序列：
Figure 107130626-A0101-12-1099-1764
序列編號DTL-8(序列編號：106)tRNAGluCCG(-CA)CGG DNA序列：
Figure 107130626-A0101-12-1099-1765
序列編號DTL-9(序列編號：107)tRNAGluAAG(-CA)CUU DNA序列：
Figure 107130626-A0101-12-1099-1766
Figure 107130626-A0101-12-1100-2375
序列編號DTL-10(序列編號：108)tRNAGluGCA(-CA)UGC DNA序列：
Figure 107130626-A0101-12-1100-1768
序列編號DTL-11(序列編號：109)tRNAGluCAU(-CA)AUG DNA序列：
Figure 107130626-A0101-12-1100-1769
序列編號DTL-12(序列編號：110)tRNAAsn-E2GUU(-CA)AAC DNA序列：
Figure 107130626-A0101-12-1100-1770
序列編號DTL-13(序列編號：111)tRNAAla1B DNA序列：
Figure 107130626-A0101-12-1100-1771
序列編號DTL-14(序列編號：112)tRNATyr1 DNA序列：
Figure 107130626-A0101-12-1101-1772
序列編號MTL-1(序列編號：113)tRNAGluCUG(-CA)RNA序列：
Figure 107130626-A0101-12-1101-1773
序列編號MTL-2(序列編號：114)tRNAGluACG(-CA)RNA序列：
Figure 107130626-A0101-12-1101-1774
序列編號MTL-3(序列編號：115)tRNAGluUUC(-CA)RNA序列：
Figure 107130626-A0101-12-1101-1775
序列編號MTL-4 tRNAGluCCU(-CA)RNA序列：(序列編號：116)
Figure 107130626-A0101-12-1101-1776
序列編號MTL-5(序列編號：117)tRNAGluCAA(-CA)RNA序列：
Figure 107130626-A0101-12-1101-1777
序列編號MTL-6(序列編號：118) tRNAGluUAG(-CA)RNA序列：
Figure 107130626-A0101-12-1102-1778
序列編號MTL-7(序列編號：119)tRNAGluCUA(-CA)RNA序列：
Figure 107130626-A0101-12-1102-1779
序列編號MTL-8(序列編號：120)tRNAGluCCG(-CA)RNA序列：
Figure 107130626-A0101-12-1102-1780
序列編號MTL-9(序列編號：121)tRNAGluAAG(-CA)RNA序列：
Figure 107130626-A0101-12-1102-1781
序列編號MTL-10(序列編號：122)tRNAGluGCA(-CA)RNA序列：
Figure 107130626-A0101-12-1102-1782
序列編號MTL-11(序列編號：123)tRNAGluCAU(-CA)RNA序列：
Figure 107130626-A0101-12-1102-1783
序列編號MTL-12(序列編號：124) tRNAAsn-E2GUU(-CA)RNA序列：
Figure 107130626-A0101-12-1103-1784
序列編號MTL-13(序列編號：125)tRNAAla1B RNA序列：
Figure 107130626-A0101-12-1103-1785
序列編號MTL-14(序列編號：126)tRNATyr1 RNA序列：
Figure 107130626-A0101-12-1103-1786
3.利用tRNA(CA欠缺)與pdCpA-胺基酸之反應所為之tRNA-胺基酸複合體之合成
利用胺基醯基化pdCpA與轉錄tRNA(CA欠缺)之接合(ligation)所為之淘選用胺基醯基化tRNA(化合物ATL-1~13)之合成、及胺基醯基化tRNA混合物之製備
首先個別製備胺基醯基化tRNA(化合物ATL-1~13)。接合係於接合緩衝液(50mM HEPES-KOH pH7.5,20mM MgCl2,1mM ATP)、25μM轉錄tRNA(-CA)(序列編號MTL-1~12、R-5)、0.6U/μl T4 RNA接合酶(New england bio lab.公司)、0.5mM胺基醯基化pdCpA之條件實施。25μM轉錄tRNA(-CA)與0.5mM胺基醯基化pdCpA之組合，依以下表20~22實施。
實施接合之前，將已混合接合緩衝液、轉錄tRNA(-CA)(序 列編號MTL-1~12、R-5)及無核酸酶之水者於95℃加熱2分鐘後，於室溫放置5分鐘，預先進行tRNA之重新折疊。之後，如上述添加T4 RNA接合酶、胺基醯基化pdCpA之DMSO溶液，於15℃進行45分鐘接合反應。
於接合反應液加入0.3M乙酸鈉與62.5mM碘(水：THF=1：1溶液)，於室溫進行1小時(惟，使用化合物SP749時係於室溫5分鐘)戊烯醯基之脫保護，獲得化合物ATL-1~12。當使用不具戊烯醯基之化合物6i-C時，不進行脫保護，實施直到接合反應，獲得化合物ATL-13。
其次製備轉譯液S用胺基醯基化tRNA混合物(Initiation suppression轉譯使用)、轉譯液S用Initiator胺基醯基化tRNA(Initiation suppression轉譯使用)、及轉譯液T用胺基醯基化tRNA混合物(Read through轉譯使用)。將獲得之化合物ATL-1~13以表20~22所示之混合比混合，以轉譯液S用胺基醯基化tRNA混合物、轉譯液S用Initiator胺基醯基化tRNA、轉譯液T用胺基醯基化tRNA混合物之形式進行苯酚萃取後，利用乙醇沉澱回收。製備之胺基醯基化tRNA在即將添加到轉譯液時溶於1mM乙酸鈉。之後，於轉譯使用時，製備轉譯液使成為表20~22所示之最終濃度。
Figure 107130626-A0101-12-1104-1787
Figure 107130626-A0101-12-1105-1788
Figure 107130626-A0101-12-1105-1789
Figure 107130626-A0101-12-1105-1790
化合物ATL-1(序列編號：127)
Figure 107130626-A0101-12-1106-1791
化合物ATL-2(序列編號：128)
Figure 107130626-A0101-12-1106-1792
化合物ATL-3(序列編號：129)
Figure 107130626-A0101-12-1106-1793
化合物ATL-4(序列編號：130)
Figure 107130626-A0101-12-1106-1794
化合物ATL-5(序列編號：131)
Figure 107130626-A0101-12-1106-1795
化合物ATL-6(序列編號：132)
Figure 107130626-A0101-12-1106-1796
化合物ATL-7(序列編號：133)
Figure 107130626-A0101-12-1107-1797
化合物ATL-8(序列編號：134)
Figure 107130626-A0101-12-1107-1798
化合物ATL-9(序列編號：135)
Figure 107130626-A0101-12-1107-1799
化合物ATL-10(序列編號：136)
Figure 107130626-A0101-12-1107-1800
化合物ATL-11(序列編號：137)
Figure 107130626-A0101-12-1107-1801
化合物ATL-12(序列編號：138)
Figure 107130626-A0101-12-1107-1802
化合物ATL-13(序列編號：139)
Figure 107130626-A0101-12-1108-1803
4.用以建構展示庫之無規DNA構建用的密碼子單元之合成
ATG，GTT，CCG，ACT，GCT，CAT，TGG，GGT，TAC，CAG，AAC，TGC，及GAA之各單元係從Glen Research購買。TTT(化合物SP779)、ATT(化合物SP780)、AGT(化合物SP768)、CGG(化合物SP781)、AGG(化合物SP782)、TTG(化合物SP775)、CTT(化合物SP776)、CTA(化合物SP777)、TAG(化合物SP778)Trimer Phosphoramidite之各單元依以下流程合成。又，上述化合物也可依文獻Yagodkin,A.；Azhayev,A.；Roivainen,J.：Antopolsky,M.；Kayushin,A.；Korosteleva,M.；Miroshnikov,A.；Randolph,J.；and Mackie,H.Nucleosides,Nucleotides,and Nucleic Acids 2007,26,473-497之合成法合成。密碼子單元，在本說明書中定義為以磷酸二酯鍵連結之DNA樣的三核苷酸所構成之化合物，且能應用於DNA之化學合成之化合物。例如CAG單元，係5'位之羥基以4,4'-二甲氧基三苯甲基(DMT)保護，且磷酸鹽以2-氯苯基保護，此外，於往下游從5'側連續具有定義之胺基受保護之核酸鹼基(C(Bz)、A(Bz),G(iBu))，於3'末端有經氰基乙基保護之N,N’-二異丙胺基亞磷醯胺(phosphoramidite)基之化合物。
Figure 107130626-A0101-12-1109-1804
4-側氧基戊酸[(2R，3S，5R)-2-(羥基甲基)-5-(5-甲基-2,4-二側氧基嘧啶-1-基)四氫呋喃-3-酯](化合物SP762)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1109-1805
於氮氣氛圍下，將1-[(2R，4S，5R)-5-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基甲氧基]甲基]-4-羥基四氫呋喃-2-基]-5-甲基嘧啶 -2,4-二酮(化合物SP761)(1.09g、2mmol)、乙醯丙酸(levulinic acid)(0.29ml、2.8mmol)、N,N-二甲基-4-胺基吡啶(DMAP)(73mg、0.6mmol)、及1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二醯亞胺鹽酸鹽(EDC‧HCl、538mg、2.8mmol)溶於二氯甲烷(2ml)，於室溫攪拌15分鐘。於反應液加入0.6ml之甲醇，加入對甲苯磺酸(532mg、2.8mmol)，於室溫攪拌1分鐘。在上述反應溶液中加入3ml之磷酸緩衝液(pH=6，1M)，攪拌2分鐘。在反應溶液中加入10ml之二氯甲烷/乙醇溶液(5：1)，以7ml之磷酸緩衝液(pH=6，1M)進行分液操作。將有機層回收，將水層以15ml之二氯甲烷/乙醇溶液(5：1)進行2次分液操作，將有機層回收。合併回收的有機層，加入硫酸鈉，乾燥後，以過濾去除硫酸鈉，減壓濃縮，將殘渣以矽膠管柱層析(乙酸乙酯：己烷=65：35→100：0)精製，獲得標題化合物(化合物SP762)(632.5mg、93%)。
LCMS(ESI)m/z=341.3(M+H)+
保持時間：0.52分(分析條件SQDAA05)
4-側氧基戊酸[(2R，3S，5R)-2-[[(2-氯苯氧基)-[(2R，3S，5R)-2-(羥基甲基)-5-[2-(2-甲基丙醯基胺基)-6-側氧基-1H-嘌呤-9-基]四氫呋喃-3-基]氧基磷氧基]氧基甲基]-5-(5-甲基-2,4-二側氧基嘧啶-1-基)四氫呋喃-3-酯](化合物SP764)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1111-1806
於氮氣氛圍下，將化合物SP763(328mg、0.97mmol)及化合物SP762(862mg、0.92mmol)溶於脫水吡啶(2.5ml)。將1-(2-均三甲苯磺醯基)-3-硝基-1H-1,2,4-三唑(MSNT)(681mg、2.3mmol)之脫水吡啶(2.5ml)溶液費時10分鐘滴加於上述反應液，於室溫攪拌2小時。將反應溶液減壓濃縮，將殘渣溶於6ml之二氯甲烷/甲醇(5：1)，加入對甲苯磺酸(350mg、1.84mmol)，於室溫攪拌1分鐘。於上述反應溶液中加入8ml之磷酸緩衝液(pH=6，1M)，攪拌2分鐘。於反應溶液中加入10ml之二氯甲烷/乙醇溶液(5：1)，進行分液操作。將有機層回收，將水層以10ml之二氯甲烷/乙醇溶液(5：1)進行2次分液操作，將有機層回收。合併回收之有機層，加入硫酸鈉，乾燥後，以過濾去除硫酸鈉，將有機層減壓濃縮，將殘渣以矽膠管柱層析(乙酸乙酯：己烷=50：50→100：0)精製，獲得標題化合物(化合物SP764)(725.4mg、93%)。
LCMS(ESI)m/z=850.4(M+H)+
保持時間：0.62分(分析條件SQDFA05)
磷酸(2-氯苯基)[(2R，3S，5R)-3-[(2-氯苯氧基)-[[(2R，3S，5R)-3-羥基-5-(5-甲基-2,4-二側氧基嘧啶-1-基)四氫呋喃-2-基]甲氧基]磷氧基]氧基-5-[2-(2-甲基丙醯基胺 基)-6-側氧基-1H-嘌呤-9-基]四氫呋喃-2-基]甲基[(2R，3S，5R)-5-(6-苯甲醯胺嘌呤-9-基)-2-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基甲氧基]甲基]四氫呋喃-3-酯](化合物SP766)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1112-2376
於氮氣氛圍下，將化合物SP765(1.0g、1.05mmol)及化合物SP764(850mg、1.0mmol)溶於脫水吡啶(2.5ml)。將1-(2-均三甲苯磺醯基)-3-硝基-1H-1,2,4-三唑(MSNT)(740mg、2.5mmol)之脫水吡啶(2.5ml)溶液以10分鐘滴加於上述反應液，於室溫攪拌2小時。將反應溶液冷卻至0℃，滴加乙酸(1.0ml)。於反應溶液中加入聯胺一水合物(0.24ml、5.0mmol)，攪拌5分鐘。於上述反應溶液中加入10ml之磷酸緩衝液(pH=6，1M)及二氯甲烷(5ml)，攪拌1分鐘。將反應溶液以10ml之二氯甲烷/乙醇溶液(10：1)進行3次分液操作，將有機層回收。於回收之有機層加入硫酸鈉並乾燥。以過濾去除硫酸鈉，將有機層減壓濃縮，將殘渣以逆相矽膠管柱層析(10mM乙酸銨水溶液/甲醇)精製，獲得標題化合物(化合物SP766)(1.22g、77%)。
LCMS(ESI)m/z=1581.8(M+H)+
保持時間：1.11分(分析條件SQDAA05)
磷酸(2-氯苯基)[(2R，3S，5R)-3-[(2-氯苯氧基)-[[(2R，3S，5R)-3-[2-氰基乙氧基-[二(丙烷-2-基)胺基]phosphanyl]氧基-5-(5-甲基-2,4-二側氧基嘧啶-1-基)四氫呋喃-2-基]甲氧基]磷氧基]氧基-5-[2-(2-甲基丙醯基胺基)-6-側氧基-1H-嘌呤-9-基]四氫呋喃-2-基]甲基[(2R，3S，5R)-5-(6-苯甲醯胺-1，6-二氫嘌呤-9-基)-2-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基甲氧基]甲基]四氫呋喃-3-酯](化合物SP768、AGT單元)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1113-2377
於氮氣氛圍下，將化合物766(2.5g、1.71mmol)與5-乙硫基-1H-四唑(667mg、5.13mmol)溶於二氯甲烷(17ml)，加入2-氰基乙基-N,N，N’，N’-四異丙基亞磷二醯胺(化合物767)(5.43ml、17.1mmol)，於室溫攪拌15分鐘。於反應液加入三乙胺(0.71ml、5.13mmol)，將反應液減壓濃縮並將殘渣以逆相矽膠管柱層析(乙腈水溶液)精製，獲得標題化合物(化合物768、AGT單元)(1.84g、60%)。
又，AGT單元，在本說明書中，係定義為：具有AGT部位，且如上列化合物(SP768)，其5'位之羥基以4,4'-二甲氧基三苯甲基(DMT)保護，磷酸鹽以2-氯苯基保護，此外，從5' 側起連續具有胺基經保護之核酸鹼基(A(Bz)、G(iBu)、T，於3'末端具有經氰基乙基保護之N,N’-二異丙胺基亞磷醯胺(phosphoramidite)基之化合物。以下，例如TTT單元等其他名稱，亦定義為：具有TTT部位且同樣核酸部受保護，具有N,N’-二異丙胺基亞磷醯胺(phosphoramidite)基之化合物。LCMS(ESI)
m/z=1781.8(M+H)+
保持時間：1.17分(分析條件SQDAA05)
4-側氧基戊酸[(2R，3S，5R)-2-(羥基甲基)-5-[2-(2-甲基丙醯基胺基)-6-側氧基-1H-嘌呤-9-基]四氫呋喃-3-酯](化合物SP770)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1114-1809
與化合物SP762之製造例以同樣條件，將1-[(2R，4S，5R)-5-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基甲氧基]甲基]-4-羥基四氫呋喃-2-基]-5-甲基嘧啶-2,4-二酮(化合物761)替換為使用N-[9-[(2R，4S，5R)-5-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基甲氧基]甲基]-4-羥基四氫呋喃-2-基]-6-側氧基-1H-嘌呤-2-基]-2-甲基丙醯胺(化合物769)，藉此獲得4-側氧基戊酸[(2R，3S，5R)-2-(羥基甲基)-5-[2-(2-甲基丙醯基胺基)-6-側氧基-1H-嘌呤-9-基]四氫呋喃-3-酯](化合物SP770)(2.9g、85%)。
LCMS(ESI)m/z=435.9(M+H)+
保持時間：1.205分(分析條件SMDMethod9)
4-側氧基戊酸[(2R，3S，5R)-5-(6-苯甲醯胺嘌呤-9-基)-2-(羥基甲基)四氫呋喃-3-酯](化合物SP772)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1115-1810
與(化合物SP762)之製造例以同樣條件，並將1-[(2R，4S，5R)-5-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基甲氧基]甲基]-4-羥基四氫呋喃-2-基]-5-甲基嘧啶-2,4-二酮(化合物SP761)替換為使用N-[9-[(2R，4S，5R)-5-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基甲氧基]甲基]-4-羥基四氫呋喃-2-基]嘌呤-6-基]苯甲醯胺(化合物SP771)，藉此獲得4-側氧基戊酸[(2R，3S，5R)-5-(6-苯甲醯胺嘌呤-9-基)-2-(羥基甲基)四氫呋喃-3-酯](化合物SP772)(50.0g、56%)。
LCMS(ESI)m/z=454.2(M+H)+
保持時間：1.177分(分析條件SMDMethod4)
4-側氧基戊酸[(2R，3S，5R)-5-(4-苯甲醯胺-2-側氧基嘧啶-1-基)-2-(羥基甲基)四氫呋喃-3-酯](化合物SP774)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1115-1811
與(化合物SP762)之製造例以同樣條件，並將1-[(2R，4S，5R)-5-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基甲氧基]甲基]-4-羥基四氫呋喃-2-基]-5-甲基嘧啶-2,4-二酮(化合物SP761)替換為使用N-[1-[(2R，4S，5R)-5-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基甲氧基]甲基]-4-羥基四氫呋喃-2-基]-2-側氧基嘧啶-4-基]苯甲醯胺(化合物SP773)，藉此獲得4-側氧基戊酸[(2R，3S，5R)-5-(4-苯甲醯胺-2-側氧基嘧啶-1-基)-2-(羥基甲基)四氫呋喃-3-酯](化合物SP774)(2.4g、89%)。
LCMS(ESI)m/z=430.2(M+H)+
保持時間：3.193分(分析條件SMDMethod10)
磷酸(2-氯苯基)[(2R，3S，5R)-3-[(2-氯苯氧基)-[[(2R，3S，5R)-3-[2-氰基乙氧基-[二(丙烷-2-基)胺基]phosphanyl]氧基-5-[2-(2-甲基丙醯基胺基)-6-側氧基-1H-嘌呤-9-基]四氫呋喃-2-基]甲氧基]磷氧基]氧基-5-(5-甲基-2,4-二側氧基嘧啶-1-基)四氫呋喃-2-基]甲基[(2R，3S，5R)-2-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基甲氧基]甲基]-5-(5-甲基-2,4-二側氧基嘧啶-1-基)四氫呋喃-3-酯](化合物SP775、TTG單元)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1117-1812
與化合物SP761至SP768之製造例以同樣條件，獲得磷酸(2-氯苯基)[(2R，3S，5R)-3-[(2-氯苯氧基)-[[(2R，3S，5R)-3-[2-氰基乙氧基-[二(丙烷-2-基)胺基]phosphanyl]氧基-5-[2-(2-甲基丙醯基胺基)-6-側氧基-1H-嘌呤-9-基]四氫呋喃-2-基]甲氧基]磷氧基]氧基-5-(5-甲基-2,4-二側氧基嘧啶-1-基)四氫呋喃-2-基]甲基[(2R，3S，5R)-2-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基甲氧基]甲基]-5-(5-甲基-2,4-二側氧基嘧啶-1-基)四氫呋喃-3-酯](化合物SP775，TTG單元)。
LCMS(ESI)m/z=1668.8(M+H)+
保持時間：1.15分(分析條件SQDAA05)
磷酸(2-氯苯基)[(2R，3S，5R)-3-[(2-氯苯氧基)-[[(2R，3S，5R)-3-[2-氰基乙氧基-[二(丙烷-2-基)胺基]phosphanyl]氧基-5-(5-甲基-2,4-二側氧基嘧啶-1-基)四氫呋喃-2-基]甲氧基]磷氧基]氧基-5-(5-甲基-2,4-二側氧基嘧啶-1-基)四氫呋喃-2-基]甲基[(2R，3S，5R)-5-(4-苯甲醯胺-2-側氧 基嘧啶-1-基)-2-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基甲氧基]甲基]四氫呋喃-3-酯](化合物SP776、CTT單元)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1118-2378
與化合物SP761至SP768之製造例以同樣條件，獲得磷酸(2-氯苯基)[(2R，3S，5R)-3-[(2-氯苯氧基)-[[(2R，3S，5R)-3-[2-氰基乙氧基-[二(丙烷-2-基)胺基]phosphanyl]氧基-5-(5-甲基-2,4-二側氧基嘧啶-1-基)四氫呋喃-2-基]甲氧基]磷氧基]氧基-5-(5-甲基-2,4-二側氧基嘧啶-1-基)四氫呋喃-2-基]甲基[(2R，3S，5R)-5-(4-苯甲醯胺-2-側氧基嘧啶-1-基)-2-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基甲氧基]甲基]四氫呋喃-3-酯](化合物SP776，CTT單元)。
LCMS(ESI)m/z=1662.4(M+H)+
保持時間：1.18分(分析條件SQDAA05)
磷酸(2-氯苯基)[(2R，3S，5R)-3-[[(2R，3S，5R)-5-(6-苯甲醯胺嘌呤-9-基)-3-[2-氰基乙氧基-[二(丙烷-2-基)胺基]phosphanyl]氧基四氫呋喃-2-基]甲氧基-(2-氯苯氧基)磷 氧基]氧基-5-(5-甲基-2,4-二側氧基嘧啶-1-基)四氫呋喃-2-基]甲基[(2R，3S，5R)-5-(4-苯甲醯胺-2-側氧基嘧啶-1-基)-2-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基甲氧基]甲基]四氫呋喃-3-酯](化合物SP777、CTA單元)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1119-2379
與化合物SP761至SP768之製造例以同樣條件，獲得磷酸(2-氯苯基)[(2R，3S，5R)-3-[[(2R，3S，5R)-5-(6-苯甲醯胺嘌呤-9-基)-3-[2-氰基乙氧基-[二(丙烷-2-基)胺基]phosphanyl]氧基四氫呋喃-2-基]甲氧基-(2-氯苯氧基)磷氧基]氧基-5-(5-甲基-2,4-二側氧基嘧啶-1-基)四氫呋喃-2-基]甲基[(2R，3S，5R)-5-(4-苯甲醯胺-2-側氧基嘧啶-1-基)-2-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基甲氧基]甲基]四氫呋喃-3-酯](化合物SP777，CTA單元)。
LCMS(ESI)m/z=1775.9(M+H)+
保持時間：1.20分(分析條件SQDAA05)
磷酸[(2R，3S，5R)-3-[2-氰基乙氧基-[二(丙烷-2- 基)胺基]phosphanyl]氧基-5-[2-(2-甲基丙醯基胺基)-6-側氧基-1H-嘌呤-9-基]四氫呋喃-2-基]甲基(2-氯苯基)[(2R，3S，5R)-5-(6-苯甲醯胺嘌呤-9-基)-2-[[[(2R，3S，5R)-2-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基甲氧基]甲基]-5-(5-甲基-2,4-二側氧基嘧啶-1-基)四氫呋喃-3-基]氧基-(2-氯苯氧基)磷氧基]氧基甲基]四氫呋喃-3-酯](化合物SP778、TAG單元)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1120-2380
與化合物SP761至SP768之製造例以同樣條件，獲得磷酸[(2R，3S，5R)-3-[2-氰基乙氧基-[二(丙烷-2-基)胺基]phosphanyl]氧基-5-[2-(2-甲基丙醯基胺基)-6-側氧基-1H-嘌呤-9-基]四氫呋喃-2-基]甲基(2-氯苯基)[(2R，3S，5R)-5-(6-苯甲醯胺嘌呤-9-基)-2-[[[(2R，3S，5R)-2-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基甲氧基]甲基]-5-(5-甲基-2,4-二側氧基嘧啶-1-基)四氫呋喃-3-基]氧基-(2-氯苯氧基)磷氧基]氧基甲基]四氫呋喃-3-酯](化合物SP778，TAG單元)。
LCMS(ESI)m/z=1781.9(M+H)+
保持時間：1.17分(分析條件SQDAA05)
磷酸(2-氯苯基)[(2R，3S，5R)-3-[(2-氯苯氧基)-[[(2R，3S，5R)-3-[2-氰基乙氧基-[二(丙烷-2-基)胺基]phosphanyl]氧基-5-(5-甲基-2,4-二側氧基嘧啶-1-基)四氫呋喃-2-基]甲氧基]磷氧基]氧基-5-(5-甲基-2,4-二側氧基嘧啶-1-基)四氫呋喃-2-基]甲基[(2R，3S，5R)-2-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基甲氧基]甲基]-5-(5-甲基-2,4-二側氧基嘧啶-1-基)四氫呋喃-3-酯](化合物SP779，TTT單元)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1121-2381
與化合物SP761至SP768之製造例以同樣條件，獲得磷酸(2-氯苯基)[(2R，3S，5R)-3-[(2-氯苯氧基)-[[(2R，3S，5R)-3-[2-氰基乙氧基-[二(丙烷-2-基)胺 基]phosphanyl]氧基-5-(5-甲基-2,4-二側氧基嘧啶-1-基)四氫呋喃-2-基]甲氧基]磷氧基]氧基-5-(5-甲基-2,4-二側氧基嘧啶-1-基)四氫呋喃-2-基]甲基[(2R，3S，5R)-2-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基甲氧基]甲基]-5-(5-甲基-2,4-二側氧基嘧啶-1-基)四氫呋喃-3-酯](化合物SP779，TTT單元)。
LCMS(ESI)m/z=1573.8(M+H)+
保持時間：1.15分(分析條件SQDAA05)
磷酸(2-氯苯基)[(2R，3S，5R)-3-[(2-氯苯氧基)-[[(2R，3S，5R)-3-[2-氰基乙氧基-[二(丙烷-2-基)胺基]phosphanyl]氧基-5-(5-甲基-2,4-二側氧基嘧啶-1-基)四氫呋喃-2-基]甲氧基]磷氧基]氧基-5-(5-甲基-2,4-二側氧基嘧啶-1-基)四氫呋喃-2-基]甲基[(2R，3S，5R)-5-(6-苯甲醯胺嘌呤-9-基)-2-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基甲氧基]甲基]四氫呋喃-3-酯](化合物SP780、ATT單元)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1123-1817
與化合物SP761至SP768之製造例以同樣條件，獲得磷酸(2-氯苯基)[(2R，3S，5R)-3-[(2-氯苯氧基)-[[(2R，3S，5R)-3-[2-氰基乙氧基-[二(丙烷-2-基)胺基]phosphanyl]氧基-5-(5-甲基-2,4-二側氧基嘧啶-1-基)四氫呋喃-2-基]甲氧基]磷氧基]氧基-5-(5-甲基-2,4-二側氧基嘧啶-1-基)四氫呋喃-2-基]甲基[(2R，3S，5R)-5-(6-苯甲醯胺嘌呤-9-基)-2-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基甲氧基]甲基]四氫呋喃-3-酯](化合物SP780、ATT單元)。
LCMS(ESI)m/z=1686.4(M+H)+
保持時間：1.16分(分析條件SQDAA05)
磷酸(2-氯苯基)[(2R，3S，5R)-3-[(2-氯苯氧 基)-[[(2R，3S，5R)-3-[2-氰基乙氧基-[二(丙烷-2-基)胺基]phosphanyl]氧基-5-[2-(2-甲基丙醯基胺基)-6-側氧基-1H-嘌呤-9-基]四氫呋喃-2-基]甲氧基]磷氧基]氧基-5-[2-(2-甲基丙醯基胺基)-6-側氧基-1H-嘌呤-9-基]四氫呋喃-2-基]甲基[(2R，3S，5R)-5-(4-苯甲醯胺-2-側氧基嘧啶-1-基)-2-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基甲氧基]甲基]四氫呋喃-3-酯](化合物SP781、CGG單元)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1124-2382
與化合物SP761至SP768之製造例以同樣條件，獲得磷酸(2-氯苯基)[(2R，3S，5R)-3-[(2-氯苯氧基)-[[(2R，3S，5R)-3-[2-氰基乙氧基-[二(丙烷-2-基)胺基]phosphanyl]氧基-5-[2-(2-甲基丙醯基胺基)-6-側氧基-1H-嘌呤-9-基]四氫呋喃-2-基]甲氧基]磷氧基]氧基-5-[2-(2-甲基丙醯基胺基)-6-側氧基-1H-嘌呤-9-基]四氫呋喃-2-基]甲基[(2R， 3S，5R)-5-(4-苯甲醯胺-2-側氧基嘧啶-1-基)-2-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基甲氧基]甲基]四氫呋喃-3-酯](化合物SP781、CGG單元)。
LCMS(ESI)m/z=1852.5(M+H)+
保持時間：0.87分(分析條件SQDAA50)
磷酸(2-氯苯基)[(2R，3S，5R)-3-[(2-氯苯氧基)-[[(2R，3S，5R)-3-[2-氰基乙氧基-[二(丙烷-2-基)胺基]phosphanyl]氧基-5-[2-(2-甲基丙醯基胺基)-6-側氧基-1H-嘌呤-9-基]四氫呋喃-2-基]甲氧基]磷氧基]氧基-5-[2-(2-甲基丙醯基胺基)-6-側氧基-1H-嘌呤-9-基]四氫呋喃-2-基]甲基[(2R，3S，5R)-5-(6-苯甲醯胺嘌呤-9-基)-2-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基甲氧基]甲基]四氫呋喃-3-酯](化合物SP782、AGG單元)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1125-2383
與化合物SP761至SP768之製造例以同樣條件，獲得磷酸(2-氯苯基)[(2R，3S，5R)-3-[(2-氯苯氧 基)-[[(2R，3S，5R)-3-[2-氰基乙氧基-[二(丙烷-2-基)胺基]phosphanyl]氧基-5-[2-(2-甲基丙醯基胺基)-6-側氧基-1H-嘌呤-9-基]四氫呋喃-2-基]甲氧基]磷氧基]氧基-5-[2-(2-甲基丙醯基胺基)-6-側氧基-1H-嘌呤-9-基]四氫呋喃-2-基]甲基[(2R，3S，5R)-5-(6-苯甲醯胺嘌呤-9-基)-2-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基甲氧基]甲基]四氫呋喃-3-酯](化合物SP782、AGG單元)。
LCMS(ESI)m/z=1876.5(M+H)+
保持時間：0.84分(分析條件SQDAA50)
5.展示庫使用之DNA之經無規化部分之化學合成
使用上述記載之方法或購買獲得之密碼子單元，依以下方法合成經無規化之高多樣性之DNA。
化合物SP791 5'-GAA GGA GAT ATA CAT ATG(PPP)7 CGT(XXX)(PPP)AGC GGC TCT GGC TCT GGC TCT-3'(序列編號：140)
使用DNA/RNA合成機(NTS H-6、Japan TechnoService(股)公司製)，以亞磷醯胺法合成無規DNA合成。脫水乙腈及解阻(deblocking)溶液-1(3w/v%三氯乙酸 二氯甲烷溶液)係從和光純藥購買，亞磷醯胺試藥(dA,dC,dG,dT-CE phosphoramidite)、Cap Mix A(THF/Pyridine/Acetic anhydride)、Cap Mix B(16% 1-Me-Imidazole/THF)、Oxidizing Solution(0.02M I2 in THF/Pyridine/H2O)、Activator(5-Benzylthio-1H-tetrazole in MeCN)、三聚物亞磷醯胺試藥(GTT、CCG、ACT、ATG、GCT、CAT、TGG、GGT、TAC、CAG、AAC、TGC、GAA Trimer Phosphoramidite)係從 Glen Research公司購買。又，三聚物亞磷醯胺試藥(TTT(化合物SP779)、ATT(化合物SP780)、AGT(化合物SP768)、CGG(化合物SP781)、AGG(化合物SP782)、TTG(化合物SP775)、CTT(化合物SP776)、CTA(化合物SP777)、TAG(化合物SP778)Trimer Phosphoramidite)，係使用依上述記載合成者。
序列中以(PPP)代表之處，應用混合三聚物亞磷醯胺試藥(TTT、ATT、GTT、AGT、CCG、ACT、GCT、CAT、TGG、GGT、TAC、CAG、AAC、CGG、AGG、TTG、CTT、CTA、TAG、TGC、GAA Trimer Phosphoramidite)者，以(XXX)代表之處，應用混合三聚物亞磷醯胺試藥(TTT、CCG、GCT、CAT、AAC、CGG、AGG、TTG、TAG、GAA Trimer Phosphoramidite)者。因此PPP不是僅意指TTT，而意指ATT或TAC等。又，(PPP)7意指任意PPP鍵結7次，不是僅意指(ATT)7，例如示意代表從21種選擇則會產生217之多樣性。
又，針對操作之詳細程序，依合成機附帶的手冊進行。
於附有濾器之反應容器中裝入GlenUnySupport CPG(1000□、44μmol/g、5.2mg、0.229μmol)，安放於合成機，將DNA進行固相合成。在此，不將5'末端羥基之保護基(DMT：4,4'-二甲氧基三苯甲基)脫保護，而結束合成機所為之伸長反應。
伸長反應結束後，將固相擔體移到附螺蓋的玻璃管，加入30%氨水溶液(0.4ml)，於60℃攪拌6小時，進行從CPG切出DNA及脫保護，分取反應混合液，以HPLC精製(分析條件LC05)。將HPLC級分冷凍乾燥，將獲得之殘渣溶於水(0.8ml)， 於其中加入乙酸(3ml)，於室溫攪拌10分鐘，將5'末端羥基之DMT基予以脫保護。將反應液以水(10ml)稀釋，以乙酸乙酯(10ml)進行5次萃取操作後，將獲得之水層冷凍乾燥，獲得目的之無規化DNA(化合物SP791)(6.7%)。又，針對產率，係從260nm之吸光度算出。
保持時間：8.55分(分析條件LC04)
化合物SP792 5'-GAA GGA GAT ATA CAT ATG(PPP)8 CGT(XXX)(PPP)AGC GGC TCT GGC TCT GGC TCT-3'(序列編號：141)
與化合物SP791以同樣方法，獲得目的之無規化DNA(化合物SP792)(7.6%)。
保持時間：8.71分(分析條件LC04)
化合物SP793 5'-GAA GGA GAT ATA CAT ATG(PPP)9 CGT(XXX)(PPP)AGC GGC TCT GGC TCT GGC TCT-3'(序列編號：142)
與化合物SP791以同樣方法，獲得目的之無規化DNA(化合物SP793)(5.8%)。
保持時間：8.67分(分析條件LC04)
化合物SP794 5'-GAA GGA GAT ATA CAT ATG TGC(QQQ)7 CGT(QQQ)2 AGC GGC TCT GGC TCT GGC TCT-3'(序列編號：143)
與化合物SP791以同樣方法，獲得目的之無規化DNA(化合物SP794)(6.5%)。序列中以(QQQ)表示之處，係應用已混合三聚物亞磷醯胺試藥(TTT、ATT、ATG、GTT、AGT、 CCG、ACT、GCT、CAT、TGG、GGT、TAC、CAG、AAC、CGG、AGG、TTG、CTT、CTA、TAG、GAA Trimer Phosphoramidite)者。因此QQQ不是僅意指TTT，而意指ATT或TAC等。又，(QQQ)7意指任意QQQ鍵結7次，不是僅意指(ATT)7，例如從21種選擇，則示意表示會產生217之多樣性。
保持時間：8.56分(分析條件LC04)
化合物SP795 5'-GAA GGA GAT ATA CAT ATG TGC(QQQ)8 CGT(QQQ)2 AGC GGC TCT GGC TCT GGC TCT-3'(序列編號：144)
與化合物SP791以同樣方法，獲得目的之無規化DNA(化合物SP795)(6.0%)。
保持時間：8.54分(分析條件LC04)
化合物SP796 5'-GAA GGA GAT ATA CAT ATG TGC(QQQ)9 CGT(QQQ)2 AGC GGC TCT GGC TCT GGC TCT-3'(序列編號：145)
與化合物SP791以同樣方法，獲得目的之無規化DNA(化合物SP796)(4.5%)。
保持時間：8.80分(分析條件LC04)
【表23】
Figure 107130626-A0101-12-1130-1820
6.展示庫使用之DNA庫之製備
使用合成寡聚DNA(化合物SP791、SP792、SP793、SP794、SP795、SP796)與合成寡聚NA(序列編號DOL-1)，以ExTaq(Takara公司)實施伸長反應。於95℃進行二分鐘改性後，於50℃一分鐘、72℃一分鐘，將此循環重複5至10次。然後，以此伸長反應產物作為模板，使用合成寡聚NA(序列編號DOL-1)與合成寡聚NA(序列編號DOL-2)，以ExTaq(Takara公司)實施PCR。於95℃進行二分鐘改性後，於95℃一分鐘、於50℃一分鐘、72℃一分鐘，將此循環重複5至10次，建構DNA庫(序列編號DML-1~DML-6)。
序列中(PPP)表示之處，係代表TTT、ATT、GTT、AGT、CCG、ACT、GCT、CAT、TGG、GGT、TAC、CAG、AAC、CGG、AGG、TTG、CTT、CTA、TAG、TGC、GAA無規出現， (XXX)表示之處，代表TTT、CCG、GCT、CAT、AAC、CGG、AGG、TTG、TAG、GAA無規出現，(QQQ)表示之處，代表TTT、ATT、ATG、GTT、AGT、CCG、ACT、GCT、CAT、TGG、GGT、TAC、CAG、AAC、CGG、AGG、TTG、CTT、CTA、TAG、GAA無規出現。
序列編號DOL-1(序列編號：146)TTTGTCCCCGCCGCCCTAAGAGCCAGAGCCAGAGCCGCT
序列編號DOL-2(序列編號：147)
Figure 107130626-A0101-12-1131-1821
序列編號DML-1(序列編號：148)
Figure 107130626-A0101-12-1131-1822
序列編號DML-2(序列編號：149)
Figure 107130626-A0101-12-1131-1823
序列編號DML-3(序列編號：150)
Figure 107130626-A0101-12-1131-1824
序列編號DML-4(序列編號：151)
Figure 107130626-A0101-12-1132-2385
序列編號DML-5(序列編號：152)
Figure 107130626-A0101-12-1132-1825
序列編號DML-6(序列編號：153)
Figure 107130626-A0101-12-1132-1826
7.mRNA-嘌呤黴素連結子接合產物製備
將由PCR製備之DNA庫(序列編號DML-1~DML-3(Initiation suppression轉譯用)、DML-4~DML-6(Read throuth轉譯用))作為模板，以體外轉錄製備以下之mRNA(序列編號MML-1~MML-3(Initiation suppression轉譯用)、序列編號MML-4~MML-6(Read throuth轉譯用))，並使用RNeasy mini kit(Qiagen公司)精製。於10μM之mRNA加入15μM之嘌呤黴素連結子(Sigma公司)(序列編號C-1)、1X T4 RNA接合酶反應緩衝液(New england bio lab.公司)、1mM ATP、10% DMSO、0.625unit/μl T4 RNA接合酶(New england bio lab.公司)，於37℃進行30分鐘接合反應後，利用RNeasy Mini kit(Qiagen公司)精製。將序列編號MML-1與MML-4以30μl等級、序列編號MML-2與MML-5 以60μl等級、序列編號MML-3與MML-6以240μl等級進行接合並精製。混合嘌呤黴素連結子(序列編號C-1)與連結之MML-1，MML-2，MML-3使莫耳比為1：21：441，混合嘌呤黴素連結子(序列編號C-1)與連結之MML-4，MML-5，MML-6使莫耳比為1：21：441，前者作為initiation suppression轉譯用mRNA-嘌呤黴素連結子接合產物混合物，後者作為Read throuth轉譯用mRNA-嘌呤黴素連結子接合產物混合物。
序列中以(RRR)表示處，代表UUU、AUU、GUU、AGU、CCG、ACU、GCU、CAU、UGG、GGU、UAC、CAG、AAC、CGG、AGG、UUG、CUU、CUA、UAG、UGC、GAA無規出現，(YYY)表示之處，代表UUU、CCG、GCU、CAU、AAC、CGG、AGG、UUG、UAG、GAA無規出現、(SSS)表示之處，表示UUU、AUU、AUG、GUU、AGU、CCG、ACU、GCU、CAU、UGG、GGU、UAC、CAG、AAC、CGG、AGG、UUG、CUU、CUA、UAG、GAA無規出現。
序列編號MML-1(序列編號：154)
Figure 107130626-A0101-12-1133-1827
序列編號MML-2(序列編號：155)
Figure 107130626-A0101-12-1133-1828
序列編號MML-3(序列編號：156)
Figure 107130626-A0101-12-1134-1829
序列編號MML-4(序列編號：157)
Figure 107130626-A0101-12-1134-1830
序列編號MML-5(序列編號：158)
Figure 107130626-A0101-12-1134-1831
序列編號MML-6(序列編號：159)
Figure 107130626-A0101-12-1134-1832
生物素化標的蛋白質之製備
淘選使用之標的蛋白質，使用介白素6受容體(IL-6R)、Tumor Necrosis Factor-α(TNFα)、Tumor Necrosis Factor Receptor1(TNFR1)。IL-6R之生物素化，使用非專利文獻BMC biotechnology,2008,8,41、及非專利文獻Protein Science,1999,8,921-929之方法。IL-6R之製備，依非專利文獻J Biochem.1990；108(4)：673-6.實施。TNFα係購買Prospec公司之Rcombinant Human Tumor Necrosis Factor-alpha(Catalog Number #CYT-223)，TNFR1係購買SinoBiological公司之 Recombinant Human TNFR1/Fc Chimera(Catalog Number 10872-H03H)。各使用Thermo scientific公司之EZ-Link NHS-PEG4-Biotin(Catalog Number 21329)，進行生物素化。
‧淘選使用之轉譯液之定義
淘選使用之轉譯液S係用以下組成構成。1mM GTP，1mM ATP，20mM肌酸磷酸，50mM HEPES-KOH pH7.6，100mM乙酸鉀，10mM乙酸鎂，2mM亞精胺(spermidine)，1mM二硫蘇糖醇，0.5mg/ml E.coli MRE600(RNase陰性)來源tRNA(Roche公司)，4μg/ml肌酸激酶，3μg/ml肌激酶，2unit/ml無機焦磷解酶，1.1μg/ml核苷二磷酸激酶，0.26μM EF-G，2.7μM IF1，0.4μM IF2,1.5μM IF3,40μM EF-Tu，84μM EF-Ts，1.2μM核糖體，2.73μM AlaRS，0.09μM GlyRS，0.4μM IleRS，0.68μM PheRS，0.16μM ProRS，0.04μM SerRS，0.09μM ThrRS，0.03μM TrpRS，0.22μM TyrRS，0.02μM ValRS、3μM轉錄tRNA Ala1B(序列編號MTL-13)、3μM轉錄tRNA Tyr1(序列編號MTL-14)、250μM甘胺酸、250μM異白胺酸、250μM脯胺酸、250μM蘇胺酸、250μM色胺酸、250μM纈胺酸、100μM絲胺酸、5mM N-甲基丙胺酸、5mM N-甲基苯丙胺酸、2mM D-酪胺酸。再加入轉譯液S用胺基醯基化tRNA混合物及轉譯液S用Initiator胺基醯基化tRNA並製備。又，轉譯液T係於不含上述轉譯液S用胺基醯基化tRNA混合物及轉譯液S用Initiator胺基醯基化tRNA之轉譯液S中加入0.02μM CysRS、250μM半胱胺酸、及轉譯液T用胺基醯基化tRNA混合物而製備。
‧為了進行第1回合淘選之轉譯、環化，脫硫、反轉錄反應、淘選、PCR
製備含有1μM initiation suppression轉譯用或Read throuth轉譯用mRNA-嘌呤黴素連結子接合產物混合物之前述S用、T用各2ml轉譯液，於37℃保溫120分鐘後，於室溫放置12分鐘。對於該轉譯混合物加入200μl之200mM EDTA溶液(pH8.0、Nacalai公司、14362-24)及100μl之200mM TCEP溶液(pH7.0)，於37℃保溫120分鐘，進行環化反應。之後，對於轉譯混合物加入260μl之250mM Cys溶液及4000μl之400mM TCEP溶液(pH7.0)，於40℃保溫5分鐘。然後，加入1600μl之1M VA-044(Wako公司、CAS No.27776-21-2)，於40℃進行1小時脫硫反應後，以RNeasy mini kit(Qiagen公司)精製，製備1ml之胜肽-mRNA複合體溶液。於該溶液中，加入3μM引子(序列編號DOL-3)、M-MLV reverse transcriptase reaction buffer(Promega公司、M368B)、0.5mM dGTP，0.5mM dATP，0.5mM dCTP，0.5mM dTTP、8U/μl M-MLV Reverse transcriptase(H-)(Promega公司、M368B)，以無核酸酶之水加至刻度為2ml，42℃，保溫1小時，進行反轉錄反應。對反轉錄溶液中等量加入阻斷劑SuperBlock T20(Pierce公司、37516)，製得4ml之胜肽-mRNA複合體溶液。
對於上述溶液中加入生物素化標的蛋白質使成為200nM，於4℃進行30分鐘旋轉混合。之後，加入Dynabeads M-270 streptavidin(invitrogen公司、653-05)，於4℃進行5分鐘旋轉混合。去除上清，以1xTBST(Nacalai公司)洗滌2次。 將不含DNA聚合酶之含0.5μM引子(序列編號DOL-4)及0.5μM引子(序列編號DOL-5)之PCR溶液加到Dynabeads，於95℃進行10分鐘加熱溶出，將上清回收。對於上清加入DNA聚合酶Ex taq(Takara公司、RR001A-24)，以PCR將cDNA增幅後，以QIAquick PCR purification kit(Qiagen公司)將DNA精製。
序列編號DOL-3(序列編號：160)TTTGTCCCCGCCGCCCTAAGAGCCAGAGCCAGAGCCGCT
序列編號DOL-4(序列編號：161)GTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGA
序列編號DOL-5(序列編號：162)TTTGTCCCCGCCGCCcta
‧為了進行第2回合淘選之轉錄、接合、轉譯、環化，脫硫、反轉錄反應→淘選操作→PCR
從第1回合增幅之cDNA使用RiboMAX Express Large Scale RNA Production System(Promega公司，P1320)合成mRNA，以RNeasy MinElute kit(Qiagen公司)精製。其次利用T4 RNA ligase(NEB,M0204L)，將mRNA與嘌呤黴素連結子連結，以RNeasy MinElute kit(Qiagen公司)精製。製備含有1μM mRNA-嘌呤黴素連結子接合產物之前述100μl轉譯液，於37℃保溫60分鐘後，於室溫放置12分鐘。對該轉譯混合物為了進行環化反應，加入10μl之200mM EDTA溶液(pH8.0、Nacalai公司、14362-24)及5μl之200mM TCEP溶液(pH7.0)，於37℃保溫120分鐘。於轉譯液S加入0.5M KOH，調整為pH10後， 於42℃保溫30分鐘。之後，加入0.5M HCl，調整為pH7。之後，對於各轉譯混合物，加入13μl之250mM Cys溶液及200μl之400mM TCEP溶液(pH7.0)，於40℃保溫1分鐘。然後，加入80μl之1M VA-044(Wako公司、CAS No.27776-21-2)，於40℃進行1小時脫硫反應後，以RNeasy MinElute kit(Qiagen公司)精製，製備100μl之胜肽-mRNA複合體溶液。於該溶液中，加入3μM引子(序列編號DOL-3)、M-MLV reverse transcriptase reaction buffer(Promega公司、M368B)、0.5mM dGTP，0.5mM dATP，0.5mM dCTP，0.5mM dTTP、8U/μl M-MLV Reverse transcriptase(H-)(Promega公司、M368B)，以無核酸酶之水定量為200μl溶液，於42℃保溫15分鐘，進行反轉錄反應。對於反轉錄溶液中等量加入阻斷劑SuperBlock T20(Pierce公司、37516)，製得400μl之胜肽-mRNA複合體溶液。
對於上述溶液中加入Dynabeads M-270 streptavidin，於4℃進行5分鐘旋轉混合，將上清回收。對於上清加入生物素化標的蛋白質使成為200nM，於4℃進行30分鐘旋轉混合。之後，加入Dynabeads M-270 streptavidin，於4℃進行5分鐘旋轉混合，去除上清，以1xTBST(Nacalai公司)洗滌3次。將不含DNA聚合酶之含0.5μM引子(序列編號DOL-4)及0.5μM引子(序列編號DOL-5)之PCR溶液加到Dynabeads，於95℃進行10分鐘加熱溶出，並將上清回收。對上清加入DNA聚合酶Extaq(Takara公司、RR001A-24)，以PCR將cDNA增幅後，以QIAquick PCR purification kit(Qiagen 公司)將DNA精製。
‧為了進行第3回合淘選之轉錄、接合、轉譯、環化，脫硫、反轉錄反應→淘選操作→PCR
從第2回合增幅之cDNA使用RiboMAX Express Large Scale RNA Production System(Promega公司，P1320)合成mRNA，以RNeasy MinElute kit(Qiagen公司)精製。其次利用T4 RNA ligase(NEB,M0204L)將mRNA與嘌呤黴素連結子連結，以RNeasy MinElute kit(Qiagen公司)精製。製備含有1μM mRNA-嘌呤黴素連結子接合產物之前述10μl轉譯液，於37℃保溫60分鐘後，於室溫放置12分鐘。對該轉譯混合物為了環化反應，加入1μl之200mM EDTA溶液(pH8.0、Nacalai公司、14362-24)及0.5μl之200mM TCEP溶液(pH7.0)，於37℃保溫120分鐘。於轉譯液S加入0.5M KOH調整為pH10後，於42℃保溫30分鐘。之後，加入0.5M HCl調整為pH7。之後，對於各轉譯混合物，加入1.3μl之250mM Cys溶液及20μl之400mM TCEP溶液(pH7.0)，於40℃進行1分鐘保溫。然後加入8μl之1M VA-044(Wako公司、CAS No.27776-21-2)，於40℃進行1小時脫硫反應後，以RNeasy MinElute kit(Qiagen公司)精製，製備10μl之胜肽-mRNA複合體溶液。於該溶液中，加入3μM引子(序列編號DOL-3)、M-MLV reverse transcriptase reaction buffer(Promega公司、M368B)、0.5mM dGTP，0.5mM dATP，0.5mM dCTP，0.5mM dTTP、8U/μl M-MLV Reverse transcriptase(H-)(Promega公司、M368B)，以無核酸酶之水定量至200μl，於42℃保溫15分鐘，進行反轉錄 反應。對於反轉錄溶液中等量加入阻斷劑SuperBlock T20(Pierce公司、37516)，製得40μl之胜肽-mRNA複合體溶液。
對於上述溶液10μl加入Dynabeads M-270 streptavidin，於4℃進行5分鐘旋轉混合，將上清回收。對於已共計重複此操作3次之上清，添加生物素化標的蛋白質使成為200nM，於4℃進行30分鐘旋轉混合。之後，加入Dynabeads M-270 streptavidin，於4℃進行5分鐘旋轉混合。去除上清，以1xTBST(Nacalai公司)洗滌3次。將不含DNA聚合酶之含0.5μM引子(序列編號DOL-4)及0.5μM引子(序列編號DOL-5)之PCR溶液加到Dynabeads，於95℃進行10分鐘加熱溶出並將上清回收。對於上清加入DNA聚合酶Ex taq(Takara公司、RR001A-24)，以PCR將cDNA增幅後，以QIAquick PCR purification kit(Qiagen公司)將DNA精製。針對第4-6回合，係重複與第3回合相同操作，進行顯示標的蛋白質專一性鍵結之cDNA之濃縮。進行已濃縮之DNA池(pool)之鹼基序列解析，並鑑定經濃縮之胜肽序列。
利用計算機所為之活用模擬之假想庫所得之CLOGP值、NMe胺基酸數、分子量之平均值及分布之推測(圖81-1、81-2)
評價本次設計之展示庫之類藥之程度。亦即，利用計算模擬選擇之胺基酸被均等地無規提示之情形之CLogP值、NMe胺基酸在1個胜肽所含之數目之分布。
現實之展示庫之尺寸為1012種以上，即使電腦上 之假想庫也難全面地產生。因此，將展示庫轉譯合成之胜肽無規地產生5萬種胜肽，並近似地推測其CLOGP、NMe數、胺基酸數、分子量之分布及平均值。
無規胜肽之結構以程式製作，以SMILES形式輸出。此時C末端之結構設為哌啶。將輸出的胜肽之結構檔使用CLOGP(daylight公司)及PipelinePilot(accelrys公司)，計算各參數之分布及平均值。又，於CLOGP值之計算由於分子尺寸之限制，有約6.5%之胜肽無法計算，成為將此等除外之值(全體之93.5%有效)。
[實施例26]利用Electrochemiluminescence(ECL)之轉譯產物之篩選
針對以淘選濃縮之選殖體之一部分，實施使用各選殖體之轉譯產物胜肽之免疫分析。此時，為了以高感度檢測低濃度之胜肽產物，利用電化學發光法(ECL)測定裝置(SECTOR Imager 2400)。其結果，鑑定出對IL-6R、TNFα、TNFR1之結合胜肽。
1.Fl(urea)-dC-Puromycin(化合物SP806)之合成dC-Puromycin CPG(化合物SP802)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1142-1833
將以Puromycin CPG(化合物SP801)(Glen Research公司製，44μmol/g、450mg)以Deblocking Mix(Glen Research公司製，3%三氯乙酸/DCM)處理(3ml×4)，以乙腈洗滌(3ml×4)。
於獲得之CPG擔體添加dC-CE Phosphoramidite(Glen Research公司製，250mg、0.300mmol)之乙腈溶液(3.0ml)與Activator(Glen Research公司製，5-Benzylthio-1H-tetrazole in Acetonitrile、3ml)，於室溫使振盪10分鐘後，將反應液除去，將CPG擔體以乙腈洗滌(3ml×4)並使乾燥。
其次加入Oxidizing Solution(Glen Research公司製，0.02M Iodine in THF/Pyridine/Water、3ml)，於室溫使振盪後，將反應液除去。將擔體以乙腈洗滌(3ml×4)後使乾燥，獲得標題之dC-Puromycin CPG(化合物SP802)(450mg)。
於少量之dC-Puromycin CPG加入25%氨水溶液，於60℃攪拌1小時半，從擔體切出，將反應液以LC/MS分析，確認 反應之進行、及dC-Puromycin(化合物SP803)之生成。
Figure 107130626-A0101-12-1143-2386
LCMS(ESI)m/z=1061.4(M-H)-
保持時間：0.53分(分析條件SQDAA50)
Fl-dC-Puromycin CPG(化合物SP804)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1143-2388
將dC-Puromycin CPG(化合物SP802)(44μmol/g、450mg)以Deblocking Mix(Glen Research公司製，3%三氯乙酸/DCM)處理後，以乙腈洗滌。
於獲得之CPG擔體加入Fluorescein Phosphoramidite(Glen Research公司製，125mg、0.104mmol)之乙腈溶液(1.0ml)與Activator(Glen Research公司製， 5-Benzylthio-1H-tetrazole in Acetonitrile、1.0ml)，於室溫振盪30分鐘後，將反應液除去，將CPG擔體以乙腈洗滌並使乾燥。
其次加入Oxidizing Solution(Glen Research公司製，0.02M Iodine in THF/Pyridine/Water、3ml)，於室溫使振盪後，將反應液除去。將CPG擔體以乙腈洗滌後使乾燥，獲得標題之Fl-dC-Puromycin CPG(450mg)。
於少量之Fl-dC-Puromycin CPG加入25%氨水溶液，於60℃攪拌1小時半，從擔體切出，將反應液以LC/MS分析，確認了反應之進行、及Fl-dC-Puromycin(化合物SP805)之生成。
Figure 107130626-A0101-12-1144-1836
LCMS(ESI)m/z=1659.2(M-H)-
保持時間：0.94分(分析條件SQDAA05)
5-(3-(6-(((((2R，3S，5R)-5-(4-胺基-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-3-(((((2S，3S，4R，5R)-3-((S)-2-胺基-3-(4-甲氧基 苯基)丙醯胺)-5-(6-(二甲胺基)-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(羥基)磷氧基)氧基)四氫呋喃-2-基)甲氧基)(羥基)磷氧基)氧基)-7-羥基庚基)脲基)-2-(6-羥基-3-側氧基-3H-咕噸(xanthene)-9-基)苯甲酸(化合物SP806)(Fl(urea)-dC-Puromycin)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1145-2389
於Fl-dC-Puromycin CPG(化合物SP804)(44μmol/g、105mg)加入Oxidizing Solution(Glen Research公司製，0.02M Iodine in THF/Pyridine/Water、3ml)，於室溫振盪16小時。將反應液除去後，以乙腈洗滌，並使CPG擔體乾燥。
之後，將CPG擔體以Deblocking Mix(Glen Research 公司製，3%三氯乙酸/DCM)處理(3ml×4)後，以二氯甲烷洗滌並使乾燥。
其次對於CPG擔體加入25%氨水溶液(1.0ml)，於60℃攪拌1小時半。放冷後，將反應液以管柱層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)精製，獲得標題化合物(化合物SP806)(2.1mg、33.8%)黃色固體。
LCMS(ESI)m/z=1341.8(M-H)-
保持時間：0.44分(分析條件SQDFA05)
2.濃縮序列之解析
依序列解析之結果，合成序列編號DME-2至DME-11，DME-13至DME-15所示之模板DNA。將該等加到ECL用轉錄轉譯液，利用轉譯合成胜肽。ECL用轉錄轉譯液之組成如下。5%(v/v)T7 RNA polymerase RiboMAX Enzyme Mix(Promega公司，P1300)，2mM GTP，2mM ATP，1mM CTP，1mM UTP，20mM肌酸磷酸，50mM HEPES-KOH pH7.6，100mM乙酸鉀，15mM乙酸鎂，2mM亞精胺(spermidine)，1mM二硫蘇糖醇，0.5mg/ml E.coli MRE600(RNase陰性)來源tRNA(Roche公司)，3μM轉錄tRNA Ala1B(序列編號MTL-13)、3μM轉錄tRNA Tyr1(序列編號MTL-14)、4μg/ml肌酸激酶，3μg/ml肌激酶，2unit/ml無機焦磷解酶，1.1μg/ml核苷二磷酸激酶，0.26μM EF-G，0.24μM RF2，0.17μM RF3，0.5μM RRF，2.7μM IF1，0.4μM IF2,1.5μM IF3,53μM EF-Tu，112μM EF-Ts，1.2μM核糖體，2.73μM AlaRS，0.09μM GlyRS，0.4μM IleRS，0.68μM PheRS，0.16μM ProRS，0.04μM SerRS，0.09μM ThrRS，0.03μM TrpRS，0.22μM TyrRS，0.02μM ValRS，250μM甘胺酸、250μM異白胺酸、250μM脯胺酸、250μM蘇胺酸、250μM色胺酸、250μM纈胺酸、100μM絲胺酸、5mM N-甲基丙胺酸、5mM N-甲基苯丙胺酸、2mM D-酪胺酸，再者，S用ECL轉錄轉譯液中加入轉譯液S用胺基醯基化tRNA混合物及轉譯液S用Initiator胺基醯基化tRNA，T用ECL轉錄轉譯液加入0.02μM CysRS、250μM半胱胺酸、及轉譯液T用胺基醯基化tRNA混合物並製備。
於該ECL轉錄轉譯液加入0.05μM模板DNA，12.5μM FlPu(urea)(化合物SP806)，於37℃放置1小時、於室溫放置12分鐘，合成C末端以FlPu(urea)標定之胜肽。作為陰性對照使用之樣本，係將模板DNA替換為添加無核酸酶之水。對於該轉譯混合物5μL，加入0.5μl之200mM EDTA溶液(pH8.0、Nacalai公司、14362-24)及0.5μl之100mM TCEP溶液(pH6.6)，於37℃保溫120分鐘，進行環化反應。於環化產物加入11μL之脫硫緩衝液(15mM半胱胺酸，36mM TCEP)，於42℃加溫1分鐘後，加入1M VA-044(Wako公司、CAS No.27776-21-2)4μL，於42℃靜置1小時。為了使未反應之TCEP失活，加入125mM半胱胺酸3μL，再於42℃靜置1小時後，加入1μL之0.5M Tris、6μL SuperBlock T20(Pierce公司、37516)，製備ECL分析用胜肽溶液。
使用上述ECL分析用胜肽溶液，實施免疫分析。於MSD Streptavidin MULTI-ARRAY 384-well plate(Meso Scale Discovery、L25SB-1)，每1井添加10μL之500nM生物素化標的蛋白質，邊以500rpm振盪邊於室溫進行1小時，進行標的蛋白質之固定化。每1井添加50μL之2%脫脂乳PBS，於室溫靜置2小時，進行阻斷。將反應液除去，以含0.05%之Tween20的PBS(PBST)洗滌3次後，添加10μL之ECL分析用胜肽溶液，於室溫以500rpm振盪50分鐘。反應液之除去、以PBST之洗滌實施3次後，添加以2%脫脂乳PBS稀釋為0.5μg/mL之IgG Fraction Monoclonal Mouse Anti-Fluorescein(Jackson Immno Research，200-002-037)10μL，邊以500rpm振盪邊於室溫使反應50分鐘。反應液之除去、以PBST之洗滌實施3次後，添加以2%脫脂乳PBS稀釋為1μg/mL之SULFO-TAG Anti-Mouse Antibody(Meso Scale Discovery，R32AC-5)10μL，邊以500rpm振盪邊於室溫反應50分鐘。反應液之除去、以PBST之3次洗滌之後，添加35μL之2×Read Buffer T(Meso Scale Discovery，R92TC-3)，以SECTOR Imager 2400(Meso Scale Discovery)測定。各樣本之測定值如表24所示。
【表24】
Figure 107130626-A0101-12-1149-1838
[ECL模板DNA序列]
序列編號DME-2(序列編號：164)(IL-6R binder)DNA序列
Figure 107130626-A0101-12-1149-1839
序列編號DME-3(序列編號：165)(IL-6R binder)DNA序列
Figure 107130626-A0101-12-1149-1840
序列編號DME-4(序列編號：166)(TNFR1 binder)DNA序列
Figure 107130626-A0101-12-1150-1841
序列編號DME-5(序列編號：167)(TNFR1 binder)DNA序列
Figure 107130626-A0101-12-1150-1842
序列編號DME-6(序列編號：168)(TNFR1 binder)DNA序列
Figure 107130626-A0101-12-1150-1843
序列編號DME-7(序列編號：169)TNFα binder DNA序列
Figure 107130626-A0101-12-1150-1844
序列編號DME-8(序列編號：170)TNFα binder DNA序列
Figure 107130626-A0101-12-1150-1845
Figure 107130626-A0101-12-1151-1851
序列編號DME-9(序列編號：171)TNFα binder DNA序列
Figure 107130626-A0101-12-1151-1846
序列編號DME-10(序列編號：172)TNFα binder DNA序列
Figure 107130626-A0101-12-1151-1847
序列編號DME-11(序列編號：173)TNFα binder DNA序列
Figure 107130626-A0101-12-1151-1848
序列編號DME-13(序列編號：175)IL-6R binder DNA序列
Figure 107130626-A0101-12-1151-1849
序列編號DME-14(序列編號：176)IL-6R binder DNA序列
Figure 107130626-A0101-12-1151-1850
Figure 107130626-A0101-12-1152-1852
序列編號DME-15(序列編號：177)IL-6R binder DNA序列
Figure 107130626-A0101-12-1152-1853
[ECL胜肽序列]
以下所示胜肽，均為N末端之胺基與第11個殘基之天冬胺酸之側鏈之羧酸之間有胜肽鍵結形成之環狀胜肽。簡稱沿用通常之文獻或渡邊化學之商品型錄記載，其細節如下。
MeAla(4-Thz)：(S)-2-(甲胺基)-3-(噻唑-4-基)丙酸
MePhe(3-Cl)：(S)-3-(3-氯苯基)-2-(甲胺基)丙酸
Hyp(Et)：(2S，4R)-4-乙氧基吡咯烷-2-羧酸
γEtAbu：4-(乙胺基)丁酸
nPrGly：2-(丙胺基)乙酸
MePhe：(S)-2-(甲胺基)-3-苯基丙酸
MeAla：(S)-2-(甲胺基)丙酸
MeGly：2-(甲胺基)乙酸
Pro：(S)-吡咯烷-2-羧酸
Thr：(2S，3R)-2-胺基-3-羥基丁酸
Phg：(S)-2-胺基-2-苯基乙酸
Ile：(2S，3S)-2-胺基-3-甲基戊酸
Val：(S)-2-胺基-3-甲基丁酸
Asp：(S)-2-胺基琥珀酸
Trp：(S)-2-胺基-3-(1H-吲哚-3-基)丙酸
DTyr：(R)-2-胺基-3-(4-羥基苯基)丙酸
Phe(4-CF3)：(S)-2-胺基-3-(4-(三氟甲基)苯基)丙酸
Ser：(S)-2-胺基-3-羥基丙酸
Met(O2)：(S)-2-胺基-4-(甲基磺醯基)丁酸
βAla：3-胺基丙酸
Ala：(S)-2-胺基丙酸
Gly：2-胺基乙酸
MeSer：(S)-3-羥基-2-(甲胺基)丙酸
FlPu(urea)：化合物SP806
序列編號PE-2(IL-6R binder)胜肽序列
Figure 107130626-A0101-12-1153-2390
序列編號PE-3(IL-6R binder)胜肽序列
Figure 107130626-A0101-12-1153-2391
序列編號PE-4(TNFR1 binder)胜肽序列
Figure 107130626-A0101-12-1153-2392
序列編號PE-5(TNFR1 binder)胜肽序列
Figure 107130626-A0101-12-1154-2393
序列編號PE-6(TNFR1 binder)胜肽序列
Figure 107130626-A0101-12-1154-2394
序列編號PE-7(TNFα binder)胜肽序列
Figure 107130626-A0101-12-1154-2395
序列編號PE-8(TNFα binder)胜肽序列
Figure 107130626-A0101-12-1154-2396
序列編號PE-9(TNFα binder)胜肽序列
Figure 107130626-A0101-12-1154-2397
序列編號PE-10(TNFα binder)胜肽序列
Figure 107130626-A0101-12-1155-2398
序列編號PE-11(TNFα binder)胜肽序列
Figure 107130626-A0101-12-1155-2399
序列編號PE-13(IL-6R binder)胜肽序列
Figure 107130626-A0101-12-1155-2400
序列編號PE-14(IL-6R binder)胜肽序列
Figure 107130626-A0101-12-1155-2401
序列編號PE-15(IL-6R binder)胜肽序列
Figure 107130626-A0101-12-1155-2402
序列編號PE-2至PE-11、PE-13至PE-15表示之胜肽之特徵如以下所示。
排除共通序列Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-FlPu(urea)後的序列由13個胺基 酸構成，以11個胺基酸構成環狀胜肽部位，且以2個胺基酸構成直鏈部位。含有的胺基酸為α、β及γ胺基酸，胺基酸側鏈由烷基、環烷基、醚基取代環烷基、羥基(-OH)取代烷基、碸基(-SO2-R)取代烷基、芳基、芳烷基、羥基(-OH)取代芳烷基、鹵素基取代芳烷基、雜芳基構成，該等均為類藥(drug like)胜肽化合物理想的範圍。
表25顯示序列編號、含有之N-烷胺基酸之數目、排除共通區域Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-FlPu(urea)，將C末端設為哌啶醯胺之化合物之clogP值。
Figure 107130626-A0101-12-1156-1854
 ＊係分別求取主鏈與側鏈、直鏈部位的cLogP值並合計而算得。
PE-2至PE-11、PE13至PE-15之中，有2個以上的N-烷胺基酸且滿足cLogP為6以上之胜肽，有10個序列，滿足任意一者的有3個序列，此等標的結合胜肽係能足以期待 有類藥性的化合物群。
3.經濃縮且以ECL確認有鍵結之胜肽序列之化學合成
胜肽合成依流程J-1所示之Fmoc固相胜肽合成法實施。實施例中之胺基酸之簡稱使用通常文獻或商品型錄(渡邊化學)等記載之簡稱，細節如下。
MeAla(4-Thz)：(S)-2-(甲胺基)-3-(噻唑-4-基)丙酸
MePhe(3-Cl)：(S)-3-(3-氯苯基)-2-(甲胺基)丙酸
Hyp(Et)：(2S，4R)-4-乙氧基吡咯烷-2-羧酸
γEtAbu：4-(乙胺基)丁酸
nPrGly：2-(丙胺基)乙酸
MePhe：(S)-2-(甲胺基)-3-苯基丙酸
MeAla：(S)-2-(甲胺基)丙酸
MeGly：2-(甲胺基)乙酸
Pro：(S)-吡咯烷-2-羧酸
Thr：(2S，3R)-2-胺基-3-羥基丁酸
Phg：(S)-2-胺基-2-苯基乙酸
Ile：(2S，3S)-2-胺基-3-甲基戊酸
Val：(S)-2-胺基-3-甲基丁酸
Asp：(S)-2-胺基琥珀酸
Trp：(S)-2-胺基-3-(1H-吲哚-3-基)丙酸
DTyr：(R)-2-胺基-3-(4-羥基苯基)丙酸
Phe(4-CF3)：(S)-2-胺基-3-(4-(三氟甲基)苯基)丙酸
Ser：(S)-2-胺基-3-羥基丙酸
Met(O2)：(S)-2-胺基-4-(甲基磺醯基)丁酸
βAla：3-胺基丙酸
Ala：(S)-2-胺基丙酸
Gly：2-胺基乙酸
MeSer：(S)-3-羥基-2-(甲胺基)丙酸
Figure 107130626-A0101-12-1158-1855
實施例中之Fmoc胺基酸之保護基之結構如下述。又，下述結構中於＊記號處與各Fmoc胺基酸之極性基鍵結。
Figure 107130626-A0101-12-1159-1856
胜肽伸長使用之Fmoc胺基酸之中，Fmoc-MePhe-OH、Fmoc-MeAla-OH、Fmoc-MeGly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Thr(Trt)-OH、Fmoc-Phg-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OPis)-OH、Fmoc-Trp-OH、Fmoc-DTyr(tBu)-OH、Fmoc-Phe(4-CF3)-OH、Fmoc-Ser(Trt)-OH、Fmoc-Met(O2)-OH、Fmoc-βAla-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH使用從渡邊化學工業、美國Chempep公司、美國Chem-Impex公司中之任意者購買者。
Fmoc-MeAla(4-Thz)-OH(化合物SP811)、Fmoc-MePhe(3-Cl)-OH(化合物SP812)，係依流程K-1所示流程合成。Fmoc-Hyp(Et)-OH(化合物SP813)、Fmoc-γEtAbu-OH(化合物SP814)、Fmoc-nPrGly-OH(化合物SP815)，依流程K-2所示流程合成。Fmoc-MeSer(DMT)-OH(化合物SP816)，依流程K-3所示流程合成。
流程K-1
Figure 107130626-A0101-12-1160-1857
Figure 107130626-A0101-12-1160-1858
Figure 107130626-A0101-12-1160-1859
5-側氧基-4-(噻唑-4-基甲基)噁唑烷-3-羧酸 (S)-(9H-茀-9-基)甲酯(化合物SP817)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1161-2404
於氮氣氛圍下，將(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(噻唑-4-基)丙酸(Fmoc-Ala(4-Thz)-OH、化合物SP818)(50g、127mmol)、樟腦磺酸(2.10g、9.04mmol)及三聚甲醛(110g、3.66mol)溶於甲苯(21)，於80℃攪拌2日。將反應液以二乙醚稀釋，依序以碳酸氫鈉水溶液、飽和食鹽水洗滌。將獲得之有機萃取物以硫酸鈉乾燥後減壓濃縮，獲得5-側氧基-4-(噻唑-4-基甲基)噁唑烷-3-羧酸(S)-(9H-茀-9-基)甲基(化合物SP817)(40.0g、98%)粗產物。
(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)胺基)-3-(噻唑-4-基)丙酸(化合物SP811,Fmoc-MeAla(4-Thz)-OH)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1161-2405
於氮氣氛圍下，將5-側氧基-4-(噻唑-4-基甲基)噁 唑烷-3-羧酸(S)-(9H-茀-9-基)甲基(化合物SP817)(40.0g、98.4mmol)、三氟乙酸(245ml、3.18mol)及三乙基矽烷(160ml、1.00mol)溶於二氯甲烷(11)，於35℃攪拌2日。將反應液於減壓濃縮後，溶於二乙醚，以碳酸氫鈉水溶液洗滌有機層。將水層以硫酸氫鉀水溶液調整為pH3，以二氯甲烷萃取。將獲得之全部有機萃取物以飽和食鹽水洗滌，以硫酸鈉乾燥後減壓濃縮，獲得(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)胺基)-3-(噻唑-4-基)丙酸(化合物SP811,Fmoc-MeAla(4-Thz)-OH)(35g、87%)。
LCMS(ESI)m/z=409(M+H)+
保持時間：0.44分(分析條件SQDAA50)
4-(3-氯苄基)-5-側氧基噁唑烷-3-羧酸(S)-(9H-茀-9-基)甲酯(化合物SP819)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1162-2406
與化合物SP817之製造例以同樣條件，並將(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(噻唑-4-基)丙酸(化合物SP818)替換為使用(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(3-氯苯基)丙酸(化合物SP851)(60.0g、142mmol)，藉此獲得4-(3-氯苄基)-5-側氧基噁唑烷-3-羧酸(S)-(9H-茀-9-基) 甲酯(化合物SP819)(39.0g、63%)。
(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)胺基)-3-(3-氯苯基)丙酸(化合物SP812,Fmoc-MePhe(3-Cl)-OH)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1163-2407
與化合物SP811之製造例以同樣條件，將5-側氧基-4-(噻唑-4-基甲基)噁唑烷-3-羧酸(S)-(9H-茀-9-基)甲酯(化合物SP817)替換為使用4-(3-氯苄基)-5-側氧基噁唑烷-3-羧酸(S)-(9H-茀-9-基)甲酯(化合物SP819)(20.0g、46.1mmol)，藉此獲得(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)胺基)-3-(3-氯苯基)丙酸(化合物SP812)(17.0g、85%)。
LCMS(ESI)m/z=436(M+H)+
保持時間：0.66分(分析條件SQDAA50)
(2S,4R)-1-(((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)-4-乙氧基吡咯烷-2-羧酸(化合物SP813、Fmoc-Hyp(Et)-OH)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1164-1864
將(2S,4R)-4-乙氧基吡咯烷-2-羧酸 鹽酸鹽(化合物SP820)(45g、230mmol)溶於1,4-二噁烷(500ml)與水(500ml)之混合液，加入碳酸鉀(79.4g、574mmol)及碳酸(2,5-二側氧基吡咯烷-1-基)(9H-茀-9-基)甲酯(Fmoc-OSu、69.8g、207mmol)，於室溫攪拌2小時。將反應液以二乙醚洗滌，將水層以硫酸氫鉀水溶液調整為pH3，以乙酸乙酯萃取。將獲得之有機萃取物以飽和食鹽水洗滌，以硫酸鈉乾燥後減壓濃縮，獲得(2S,4R)-1-(((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)-4-乙氧基吡咯烷-2-羧酸(化合物SP813、Fmoc-Hyp(Et)-OH)(90.7g、103%)。
LCMS(ESI)m/z=382(M+H)+
保持時間：0.92分(分析條件SQDAA05)
4-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)(乙基)胺基)丁酸(化合物SP814、Fmoc-γEtAbu-OH)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1164-1865
與化合物SP813之製造例以同樣條件，將(2S,4R)-4-乙氧基吡咯烷-2-羧酸(化合物SP820)替換為使用4-(乙胺基)丁酸 鹽酸鹽(化合物SP852)(7.00g、41.8mmol)，獲得4-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)(乙基)胺基)丁酸(化合物SP814、Fmoc-γEtAbu-OH)(9.60g、65%)。
LCMS(ESI)m/z=354(M+H)+
保持時間：0.93分(分析條件SQDAA05)
(2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)(丙基)胺基)乙酸(化合物SP815)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1165-1866
與化合物SP813之製造例以同樣條件，將(2S，4R)-4-乙氧基吡咯烷-2-羧酸(化合物SP820)替換為使用2-(丙胺基)乙酸 鹽酸鹽(化合物SP821)(105g、684mmol)，獲得(2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)(丙基)胺基)乙酸(化合物SP815、Fmoc-nPrGly-OH)(215g、93%)。
LCMS(ESI)m/z=340(M+H)+
保持時間：0.94分(分析條件SQDAA05)
(2S)-2-[9H-茀-9-基甲氧羰基(甲基)胺基]-3-羥基丙酸(化合物SP823)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1166-1867
於氮氣氛圍下，將FmocCl(1.35g、5.21mmol)之四氫呋喃(5mL)溶液於室溫添加到N-甲基-L-絲胺酸(化合物SP822)(621mg、5.21mmol)及碳酸鈉(580mg、5.47mmol)之四氫呋喃(15mL)-水(20mL)溶液中。將反應混合物於同溫度攪拌20分鐘後，添加二乙醚(10mL)及己烷(5mL)。將獲得之混合物以水萃取，將水相以醚(15mL)洗滌後，添加濃鹽酸(1mL)。將獲得之混合物以乙酸乙酯萃取3次，將有機層以硫酸鈉乾燥後，減壓濃縮。將獲得之粗產物以逆相矽膠管柱層析(0.05%三氟乙酸水溶液/0.05%三氟乙酸乙腈溶液)精製，獲得(化合物SP823)(1.49g、84%)。
LCMS(ESI)m/z=342(M+H)+
保持時間：0.67分(分析條件SQDFA05)
N-乙基-N-異丙基丙烷-2-銨鹽(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)胺基)-3-(雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)丙酸鹽(化合物SP816)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1167-1868
將(2S)-2-[9H-茀-9-基甲氧羰基(甲基)胺基]-3-羥基丙酸(化合物SP823)(920mg、2.70mmol)溶於脫水吡啶(2.5mL)，於減壓下濃縮。重複此操作2次後，於氮氣氛圍下，溶於脫水吡啶(2.5mL)，於室溫加入4,4'-二甲氧基三苯甲基氯化物(931mg、2.75mmol)。將反應混合物於同溫度攪拌13小時後，減壓濃縮。將獲得之殘渣溶於氯仿(15mL)，以飽和碳酸氫鈉(5mL)洗滌。將有機層以硫酸鈉乾燥後，減壓濃縮，將獲得之粗產物以順相矽膠管柱層析(含1%二異丙基乙胺之二氯甲烷/甲醇)精製，獲得(N-乙基-N-異丙基丙烷-2-銨鹽(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)胺基)-3-(雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)丙酸鹽(化合物SP816)(1.92g、92%)。
LCMS(ESI)m/z=642(M-H)-
保持時間：0.72分(分析條件SQDAA50)
胜肽合成之開始原料，採用載持有羧酸經1-異丙基-4-(三氟甲基)苯基(Pis(4-CF3)基)保護、胺基經Fmoc基保護 之Ser之樹脂。其合成如以下所示。
胜肽合成使用之載持有Fmoc胺基酸之樹脂，依流程L所示流程進行。
Figure 107130626-A0101-12-1168-1869
2-[4-(三氟甲基)苯基]丙烷-2-醇(化合物SP824)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1168-1870
於氮氣氛圍下，使4-(三氟甲基)苯甲酸甲酯(化合物SP825)(37.1g、181mmol)溶於脫水THF(90ml)，於0℃費時2小時滴加甲基鋰之二乙醚溶液(1.5M、360ml、544mmol)，於室 溫攪拌30分鐘。緩慢添加50%氯化銨水溶液後，以乙酸乙酯(200ml×2)萃取。將其以硫酸鈉乾燥後，於減壓下濃縮，將獲得之殘渣以矽膠管柱層析(己烷/DCM=100/0→25/75)精製，獲得2-[4-(三氟甲基)苯基]丙烷-2-醇(化合物SP824)(84%、31.0g)。
保持時間：0.73分(分析條件SQDFA05)
1H-NMR(Varian 400-MR，400MHz，DMSO-D6)δ ppm 7.69(2H，d，8.7Hz)，7.65(2H，8.7Hz)，5.24(1H，s)，1.45(6H，s)
2,2,2-三氯乙醯亞胺酸2-(4-(三氟甲基)苯基)丙烷-2-酯(化合物SP853)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1169-1871
將2-[4-(三氟甲基)苯基]丙烷-2-醇(化合物SP824)(27.0g、132mmol)以THF(54ml)進行3次共沸。於氮氣氛圍下，將其溶於脫水THF(270ml)，加入雙(三甲基矽基)醯胺鈉之脫水THF溶液(1.9M、13.9ml、26.4mmol)，於室溫攪拌30分鐘。於其中於0℃加入三氯乙腈(13.3ml、132mmol)，攪拌30分鐘。將反應混合物於減壓下濃縮，將獲得之殘渣以胺基矽膠管柱層析(己烷)精製，獲得2,2,2-三氯乙醯亞胺酸2-(4-(三氟甲基)苯基)丙烷-2-酯(化合物SP853)(86%、39.7g)。
保持時間：0.75分(分析條件SQDAA50)
1H-NMR(Varian 400-MR，400MHz，DMSO-D6)δ ppm 9.17(1H，s)，7.73(2H，d，8.5Hz)，7.63(2H，d，8.5Hz)，1.84(6H，s)
2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-羥基丙酸(S)-2-(4-(三氟甲基)苯基)丙烷-2-酯(化合物SP826、Fmoc-Ser-OPis(4-CF3))之合成
Figure 107130626-A0101-12-1170-1872
將(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-羥基丙酸(化合物SP827、Fmoc-Ser-OH)(96.0g、292mmol)以THF(100ml)進行8次共沸。於氮氣氛圍下，使其溶於脫水THF(200ml)，加入2,2,2-三氯乙醯亞胺酸2-(4-(三氟甲基)苯基)丙烷-2-酯(化合物SP853)(67.9g、195mmol)，於室溫攪拌3小時。將反應混合物直接以胺基矽膠管柱層析(DCM)精製，於減壓下濃縮。再以逆相矽膠管柱層析(10mM乙酸銨水溶液/甲醇=95/5→0/100)精製，獲得2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-羥基丙酸(S)-2-(4-(三氟甲基)苯基)丙烷-2-酯(化合物SP826、Fmoc-Ser-OPis(4-CF3)(38%、38.4g)。
LCMS(ESI)m/z=536(M+Na)+
保持時間：0.72分(分析條件SQDAA50)
2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-羥基丙酸(S)-2-(4-(三氟甲基)苯基)丙烷-2-基-三苯甲酯樹脂(化合物SP828、Fmoc-Ser(Trt-Resin)-OPis(4-CF3))之合成
又，本說明書中，聚合物(例如樹脂)與化合物鍵結之情形，結構式有時將聚合物部以○表示。有時會顯示○具有之反應性官能基(以下的情形為三苯甲基)而使聚合物與化合物之反應點易理解的方式記載。以下例中，樹脂之三苯甲基與絲胺酸之羥基係以醚鍵鍵結，故記載樹脂之三苯甲基與絲胺酸之醚鍵鍵結部位。
Figure 107130626-A0101-12-1171-1873
於附有濾器之反應容器中，放入三苯甲基氯樹脂(100-200mesh、從ChemPep公司購買、23.0g、25.3mmol)與脫水二氯甲烷(200ml)，於室溫進行10分鐘振盪。施以氮壓去除二氯甲烷後，於反應容器中添加在2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-羥基丙酸(S)-2-(4-(三氟甲基)苯基)丙烷-2-基(化合物SP826)(6.49g)之脫水二氯甲烷(150ml)溶液中加入了DIPEA(11.0ml)而得的混合液，振盪3小時。施以氮壓去除反應液後，於反應容器中添加於脫水二氯甲烷(300ml)加入了脫水甲醇(30.0ml)及二異丙基乙胺(11ml)而得之混合液，振盪90分鐘。施以氮壓去除反應液後，放入二氯甲烷(300ml)，進行5分鐘振盪。施以氮壓去除反應液後，再度裝入二氯甲烷 (300ml)，進行5分鐘振盪。施以氮壓去除反應液後，於減壓下使樹脂終夜乾燥，獲得2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-羥基丙酸(S)-2-(4-(三氟甲基)苯基)丙烷-2-基-三苯甲酯樹脂(化合物SP828、Fmoc-Ser(Trt-Resin)-OPis(CF3))(25.7g、裝載率：0.347mmol、34.7%)。
(S)-3-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-4-(第三丁氧基)-4-側氧基丁酸2-氯三苯甲酯樹脂(化合物SP864)之合成
Figure 107130626-A0101-12-1172-1874
與化合物SP402之製造例以同樣條件，並將(S)-3-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-4-側氧基-4-(哌啶-1-基)丁酸(化合物SP401)替換為使用(S)-3-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-4-(第三丁氧基)-4-側氧基丁酸(化合物SP863)，藉此獲得(S)-3-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-4-(第三丁氧基)-4-側氧基丁酸2-氯三苯甲酯樹脂(化合物SP864)。
化合物SP842、SP844、SP845、SP846、SP848、 SP854、SP855、SP856之合成。
為了確認從序列編號PE-2至序列編號PE-15之結構當中，能獲得在無規區域之13個殘基附加有C末端側之Ser的化合物(合計14個殘基之胜肽)為目的化合物而合成。再者，針對數化合物，也合成已去除相當於直鏈部1之部分的11個殘基的胜肽。
使用聚苯乙烯樹脂(化合物SP828)，且作為Fmoc胺基酸使用Fmoc-MeAla(4-Thz)-OH(化合物SP811)、Fmoc-MePhe(3-Cl)-OH(化合物SP812)、Fmoc-MePhe-OH、Fmoc-MeSer(DMT)-OH(化合物SP816)、Fmoc-MeAla-OH、Fmoc-nPrGly-OH(化合物SP815)、Fmoc-MeGly-OH、Fmoc-Hyp(Et)-OH(化合物SP813)、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Thr(Trt)-OH、Fmoc-Phg-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(Pis)-OH、Fmoc-Trp-OH、Fmoc-DTyr(tBu)-OH、Fmoc-Phe(4-CF3)-OH、Fmoc-Ser(Trt)-OH、Fmoc-Met(O2)-OH、Fmoc-γEtAbu-OH(化合物SP814)、Fmoc-βAla-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH，進行合成。
縮合劑使用二異丙基碳二醯亞胺、並使用1-羥基-7-氮雜苯并三唑(HOAt)或乙基(羥基亞胺基)氰基乙酸酯(Oxyma)，Fmoc脫保護劑使用含5%之尿素之20%哌啶之二甲基甲醯胺溶液、洗滌溶劑使用含5%之尿素之二甲基甲醯胺，進行胜肽鏈之伸長。胜肽之伸長後，將N末端之Fmoc基脫保護，依序將樹脂以二甲基甲醯胺、三氟乙醇、二氯甲烷洗滌。 以鹽酸(相對於胜肽為10當量)之三異丙基矽烷/二氯乙烷(=5/95、v/v)，將胜肽從樹脂切出。反應結束後，將管內溶液以合成用管柱過濾，將樹脂去除，將反應液與二異丙基乙胺(相對於胜肽為10當量)混合，將鹽酸中和。樹脂以二甲基甲醯胺洗滌，將所有的溶液混合。
於獲得之溶液中，加入O-(7-氮雜-1H苯并三唑-1-基)-N,N，N,N四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)與二異丙基乙胺，進行胜肽之環化。反應結束後，於減壓下將溶劑餾去。
將獲得之殘渣溶於二氯乙烷，加入第丁基甲醚，使胜肽沉澱。以離心分離將上清除去，於殘渣加入三氟乙酸/三異丙基矽烷/二氯乙烷(=5/5/90)，進行含Pis(4-CF3)之側鏈保護基之脫保護。於減壓下將溶劑餾去，將獲得之粗產物以高速逆相層析(HPLC)精製。
化合物SP842序列編號PE-7為來源之胜肽
Figure 107130626-A0101-12-1174-2409
(於2個＊部位環化)
Figure 107130626-A0101-12-1175-1875
LCMS(ESI)m/z=1945(M+H)+
保持時間：0.81分(分析條件SQDFA05)
化合物SP844序列編號PE-8為來源之胜肽
Figure 107130626-A0101-12-1175-2410
(於2個＊部位環化)
Figure 107130626-A0101-12-1176-1876
LCMS(ESI)m/z=1678(M+H)+
保持時間：0.64分(分析條件SQDFA05)
化合物SP845序列編號PE-9為來源之胜肽
Figure 107130626-A0101-12-1176-2411
(於2個＊部位環化)
Figure 107130626-A0101-12-1177-1877
LCMS(ESI)m/z=1955(M+H)+
保持時間：0.82分(分析條件SQDFA05)
化合物SP846序列編號PE-10為來源之胜肽
Figure 107130626-A0101-12-1177-2412
(於2個＊部位環化)
Figure 107130626-A0101-12-1178-1878
LCMS(ESI)m/z=1952(M+H)+
保持時間：0.75分(分析條件SQDFA05)
化合物SP848序列編號PE-11為來源之胜肽
Figure 107130626-A0101-12-1178-2413
(於2個＊部位環化)
Figure 107130626-A0101-12-1179-1879
LCMS(ESI)m/z=1774(M+H)+
保持時間：0.81分(分析條件SQDFA05)
化合物SP854序列編號PE-13為來源之胜肽
Figure 107130626-A0101-12-1179-2414
(於2個＊部位環化)
Figure 107130626-A0101-12-1180-1880
LCMS(ESI)m/z=1630(M+H)+
保持時間：0.70分(分析條件SQDFA05)
化合物SP855序列編號PE-14為來源之胜肽
Figure 107130626-A0101-12-1180-2415
(於2個＊部位環化)
Figure 107130626-A0101-12-1181-1881
LCMS(ESI)m/z=1836(M+H)+
保持時間：0.80分(分析條件SQDFA05)
化合物SP856序列編號PE-15為來源之胜肽
Figure 107130626-A0101-12-1181-2416
(O2)-Asp＊-MeAla(4-Thz)-MeAla-Ser-OH(於2個＊部位環化)
Figure 107130626-A0101-12-1182-1882
LCMS(ESI)m/z=1944(M+H)+
保持時間：0.76分(分析條件SQDFA05)
化合物SP859之合成。Ala ＊
Figure 107130626-A0101-12-1183-2417
(於2個＊部位環化)
Figure 107130626-A0101-12-1183-1883
將SP854(Ala ＊-Pro-Val-Ile-MePhe-Met(O2)-Pro-MePhe(3-Cl)-Val-Met(O2)-Asp＊-Pro-MeGly-Ser-OH)溶於DMF(200μl)，加入N1,N1-二甲基乙烷-1,2-二胺(1.43μl、13.0mmol)、二異丙基乙胺(3.82μl、22.0μmol)、O-(7-氮雜-1H苯并三唑-1-基)-N,N，N,N四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)(5.00mg、13.0μmol)之二甲基亞碸(10.0μl)溶液，攪拌30分鐘。將獲得之殘渣以逆相矽膠管柱層析(10mM 乙酸銨水溶液/甲醇)精製，獲得化合物SP859(Ala ＊-Pro-Val-Ile-MePhe-Met(O2)-Pro-MePhe(3-Cl)-Val-Met(O2)-Asp＊-Pro-MeGly-Ser-NH(CH2)2NMe2)(6.8mg、91%)。
LCMS(ESI)m/z=1698(M-H)-
保持時間：0.59分(分析條件SQDFA05)
4.利用Surface plasmon resonance(SPR)評價合成胜肽對標的蛋白質之結合
4-1.對於TNFα之結合評價
試藥使用以下物質。Dimethylsulfoxyde(DMSO),phosphate buffered saline(以上Sigma-Aldrich Co.LLC.),surfactant P-20(GE healthcare)
合成胜肽與TNFα之交互作用解析之SPR實驗，係使用BiacoreT200(GE healthcare)，於20℃實施。針對固定化之蛋白質，添加合成胜肽，評價交互作用。
運行緩衝液，使用在上述phosphate buffered saline添加Surfactant P-20及DMSO各使終濃度成為0.01vol%、5vol%者。在Biacore用感測晶片Series S sensor chip CAP(GE healthcare)上依操作指示書將CAP reagent固定化，使經生物素化之TNFα固定。為了測定解離常數(KD)，將各合成胜肽以多數濃度添加，獲得對於固定化TNFα之結合之感測圖。
獲得之感測圖之解析，使用T200 evaluation software(GE healthcare)或Scrubber2(Biologic software)進行。首先進行對DMSO之溶劑校正及雙重參考(減去對於TNFα未固定化之流式胞之感測圖、及減去已添加緩衝液之情形之感 測圖所為之校正)，其次對校正後之感測圖進行曲線擬合，算得鍵結速度常數(kon)、解離速度常數(koff)，並將KD使用KD=koff/kon之關係式決定。依以上方式解析獲得之KD，如以下表26。
Figure 107130626-A0101-12-1185-1884
4-2.對於IL-6R之結合評價
試藥使用以下物質。Dimethylsulfoxyde(DMSO)(Sigma-Aldrich Co.LLC.),HBS-EP,Surfactant P-20(以上GE healthcare)
合成胜肽與IL-6R之交互作用解析之SPR實驗，係使用BiacoreT200(GE healthcare)，於20℃實施。針對固定化之IL-6R，添加合成胜肽，評價交互作用。
運行緩衝液，使用在上述HBS-EP添加Surfactant P-20及DMSO各使終濃度成為0.01vol%、1vol%者。
在Biacore用感測晶片Series S sensor chip CAP(GE healthcare)上依操作指示書將CAP reagent固定化，使經生物素化之IL-6R固定。
為了測定解離常數(KD)，將各合成胜肽以多數濃度添加，獲得對於固定化IL-6R之鍵結之感測圖。
獲得之感測圖之解析，使用T200 evaluation software(GE healthcare)或Scrubber2(Biologic software)進行。首先進行對DMSO之溶劑校正及雙重參考(減去對於IL-6R未固定化之流式胞之感測圖、及減去已添加緩衝液之情形之感測圖所為之校正)，其次對校正後之感測圖進行曲線擬合，算得鍵結速度常數(kon)、解離速度常數(koff)，並將KD使用KD=koff/kon之關係式決定。依以上方式解析獲得之KD，如以下表27。
Figure 107130626-A0101-12-1186-1885
5.使用細胞之IL-6R抑制實驗
[實施例27]使用Human gp130表現Ba/F3細胞之合成胜肽之中和活性評價
於實施例26確認之具有human IL-6 receptor(hIL-6R)結合活性之合成胜肽之抑制活性，使用導入human gp130 cDNA並使強制表現而依存於hIL-6及可溶型hIL-6R(shIL-6R)用量而增殖之Ba/F3細胞株(gp130 Ba/F3細胞)進行評價。又，計數分析，係評價gp130 Ba/F3細胞，合成胜肽對於mouse IL-3(mIL-3)用量依存的增殖之影響。
首先將gp130 Ba/F3細胞以含有培養液(10%FBS(Moregate Biotech)、100units/mL Penicillin-100 μg/mL Streptomycin(GIBCO)之RPMI1640(GIBCO))，製備為1.5×105個/mL，於96井圓底板(CORNING)各接種50μL。然後，各添加含60ng/mL之hIL-6(KAMACURA Technoscience)及shIL-6R(中外製藥(股)公司)或100pg/mL之mIL-3(R&D Systems)之培養液25μL。然後，使用DMSO及培養基稀釋公比2製備於實施例26選擇、合成之合成胜肽，合計6個系列(終濃度；≦100μmol/L)。各添加製備之合成胜肽25μL使DMSO之最終濃度成為0.25%，於37℃在5% CO2培養箱培養3日。培養結束後，於各井各加入20μL將Cell Counting Kit-8(DOJINDO)與PBS(-)等量混合之溶液，以微平板讀取儀(Bio-Rad Laboratories,Inc.)測定吸光度(450nm/620nm)(前值)。3~4小時後，再度使用平板讀取儀測定吸光度(後值)。將後值減前值而得之值作為細胞增殖算出值，計算抑制率。
將於hIL-6、shIL-6R、mIL-3不存在下且合成胜肽不存在下之細胞增殖算出值之平均值(A)設定為100%抑制，於hIL-6及shIL-6R或mIL-3存在下且合成胜肽不存在下之細胞增殖算出值之平均值(B)設定為0%抑制，從hIL-6及shIL-6R或mIL-3存在下且合成胜肽存在下之細胞增殖算出值(C)計算合成胜肽之各濃度之抑制率。抑制率(%)=(B-C)/(B-A)x 100其結果，可知：於實施例26選擇、合成之合成胜肽會以濃度依存地抑制gp130 Ba/F3細胞之hIL-6及shIL-6R所為之細胞增殖，顯示對於人類IL-6信息傳遞(signaling)有專一性的抑制活性(圖82)。
<110> 中外製藥股份有限公司(CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA)
<120> 胜肽化合物之環化方法(Methods of cyclization of胜肽compounds)
<130> C1-A1116Y1-TW
<150> JP 2011-288865
<151> 2011-12-28
<150> JP 2012-156943
<151> 2012-07-12
<160> 185
<170> PatentIn version 3.4
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<211> 95
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<220>
<223> 模板DNA D-2
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Figure 107130626-A0101-12-1189-1887
Figure 107130626-A0101-12-1190-1888
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<220>
<223> 模板DNA D-10
<400> 10
Figure 107130626-A0101-12-1192-1896
<210> 11
<211> 96
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 模板DNA D-11
<400> 11
Figure 107130626-A0101-12-1192-1897
<210> 12
<211> 96
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 模板DNA D-12
<400> 12
Figure 107130626-A0101-12-1193-1898
<210> 13
<211> 96
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 模板DNA D-13
<400> 13
Figure 107130626-A0101-12-1193-1899
<210> 14
<211> 96
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 模板DNA D-14
<400> 14
Figure 107130626-A0101-12-1193-1900
<210> 15
<211> 96
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 模板DNA D-15
<400> 15
Figure 107130626-A0101-12-1194-1901
<210> 16
<211> 96
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 模板DNA D-16
<400> 16
Figure 107130626-A0101-12-1194-1902
<210> 17
<211> 96
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 模板DNA D-17
<400> 17
Figure 107130626-A0101-12-1194-1903
<210> 18
<211> 96
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 模板DNA D-18
<400> 18
Figure 107130626-A0101-12-1195-1906
<210> 19
<211> 96
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 模板DNA D-19
<400> 19
Figure 107130626-A0101-12-1195-1904
<210> 20
<211> 96
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 模板DNA D-20
<400> 20
Figure 107130626-A0101-12-1195-1905
<210> 21
<211> 96
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 模板DNA D-21
<400> 21
Figure 107130626-A0101-12-1196-1907
<210> 22
<211> 96
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 模板DNA D-23
<400> 22
Figure 107130626-A0101-12-1196-1908
<210> 23
<211> 96
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 模板DNA D-24
<400> 23
Figure 107130626-A0101-12-1196-1909
<210> 24
<211> 96
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 模板DNA D-25
<400> 24
Figure 107130626-A0101-12-1196-1910
Figure 107130626-A0101-12-1197-1911
<210> 25
<211> 96
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 模板DNA D-26
<400> 25
Figure 107130626-A0101-12-1197-1912
<210> 26
<211> 96
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 模板DNA D-27
<400> 26
Figure 107130626-A0101-12-1197-1913
<210> 27
<211> 96
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 模板DNA D-28
<400> 27
Figure 107130626-A0101-12-1197-1914
<210> 28
<211> 88
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 模板DNA D-32
<400> 28
Figure 107130626-A0101-12-1198-1915
<210> 29
<211> 95
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 模板DNA D-34
<400> 29
Figure 107130626-A0101-12-1198-1916
<210> 30
<211> 74
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> tRNA R-1
<400> 30
Figure 107130626-A0101-12-1198-1917
<210> 31
<211> 76
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> tRNA R-1+dCA
<400> 31
Figure 107130626-A0101-12-1199-1918
<210> 32
<211> 75
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> tRNA R-5
<400> 32
Figure 107130626-A0101-12-1199-1919
<210> 33
<211> 77
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> tRNA R-5+dCA
<400> 33
Figure 107130626-A0101-12-1199-1920
<210> 34
<211> 11
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 胜肽P-3
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(7)
<223> aspartimide formation
<400> 34
Figure 107130626-A0101-12-1200-1921
<210> 35
<211> 13
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 胜肽P-6
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(9)
<223> aspartimide formation
<400> 35
Figure 107130626-A0101-12-1200-1922
<210> 36
<211> 10
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 胜肽P-11
<400> 36
Figure 107130626-A0101-12-1201-1923
<210> 37
<211> 15
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 胜肽P-13
<400> 37
Figure 107130626-A0101-12-1201-1924
<210> 38
<211> 11
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 胜肽P-14
<400> 38
Figure 107130626-A0101-12-1201-1925
<210> 39
<211> 11
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 胜肽P-15
<400> 39
Figure 107130626-A0101-12-1202-1926
<210> 40
<211> 11
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 胜肽P-16
<400> 40
Figure 107130626-A0101-12-1202-1927
<210> 41
<211> 11
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 胜肽P-17
<400> 41
Figure 107130626-A0101-12-1202-1928
<210> 42
<211> 11
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 胜肽P-18
<400> 42
Figure 107130626-A0101-12-1203-1929
<210> 43
<211> 11
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 胜肽P-19
<400> 43
Figure 107130626-A0101-12-1203-1930
<210> 44
<211> 11
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 胜肽P-20
<400> 44
Figure 107130626-A0101-12-1203-1931
<210> 45
<211> 11
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 胜肽P-21
<400> 45
Figure 107130626-A0101-12-1203-1932
<210> 46
<211> 11
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 胜肽P-22
<400> 46
Figure 107130626-A0101-12-1204-1933
<210> 47
<211> 11
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 胜肽P-23
<400> 47
Figure 107130626-A0101-12-1204-1934
<210> 48
<211> 11
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 胜肽P-24
<400> 48
Figure 107130626-A0101-12-1204-1935
<210> 49
<211> 11
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 胜肽P-25
<400> 49
Figure 107130626-A0101-12-1205-1936
<210> 50
<211> 11
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 胜肽P-26
<400> 50
Figure 107130626-A0101-12-1205-1937
<210> 51
<211> 11
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 胜肽P-27
<400> 51
Figure 107130626-A0101-12-1205-1938
<210> 52
<211> 11
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 胜肽P-28
<400> 52
Figure 107130626-A0101-12-1206-1939
<210> 53
<211> 11
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 胜肽P-29
<400> 53
Figure 107130626-A0101-12-1206-1940
<210> 54
<211> 11
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 胜肽P-30
<400> 54
Figure 107130626-A0101-12-1206-1941
<210> 55
<211> 11
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 胜肽P-31
<400> 55
Figure 107130626-A0101-12-1207-1942
<210> 56
<211> 11
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 胜肽P-32
<400> 56
Figure 107130626-A0101-12-1207-1943
<210> 57
<211> 11
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 胜肽P-33
<400> 57
Figure 107130626-A0101-12-1207-1944
<210> 58
<211> 11
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 胜肽P-51
<400> 58
Figure 107130626-A0101-12-1208-1945
<210> 59
<211> 11
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 胜肽P-53
<220>
<221> CROSSLINK
<222> (1)..(6)
<223> isoaspartyl cysteine(Cys-Asp)
<400> 59
Figure 107130626-A0101-12-1208-1946
<210> 60
<400> 60 000
<210> 61
<211> 13
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 61
Figure 107130626-A0101-12-1208-1947
Figure 107130626-A0101-12-1209-1948
<210> 62
<211> 12
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 胜肽DP-3
<220>
<221> CROSSLINK
<222> (1)..(12)
<223> isoaspartyl alanine(Ala-Asp)
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa=MeVal
<400> 62
Figure 107130626-A0101-12-1209-1949
<210> 63
<211> 10
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 胜肽DP-330
<220>
<221> CROSSLINK
<222> (1)..(10)
<223> isoaspartyl alanine(Ala-Asp)
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa=MeGly
<400> 63
Figure 107130626-A0101-12-1210-1950
<210> 64
<211> 95
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 模板DNA D-40
<400> 64
Figure 107130626-A0101-12-1210-1951
<210> 65
<211> 74
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> tRNA R-40
<400> 65
Figure 107130626-A0101-12-1210-1952
<210> 66
<211> 76
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> tRNA R-40+dCA
<400> 66
Figure 107130626-A0101-12-1211-1953
<210> 67
<211> 73
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 模板RNA R-41
<400> 67
Figure 107130626-A0101-12-1211-1954
<210> 68
<211> 11
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 胜肽P-143
<220>
<221> CROSSLINK
<222> (1)..(6)
<223> isoaspartyl glycine(Gly-Asp)
<400> 68
Figure 107130626-A0101-12-1211-1955
<210> 69
<211> 10
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的核苷酸序列
<400> 69
Figure 107130626-A0101-12-1212-1956
<210> 70
<211> 20
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的核苷酸序列
<400> 70
Figure 107130626-A0101-12-1212-1957
<210> 71
<211> 79
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> mRNA R-41
<400> 71
Figure 107130626-A0101-12-1212-1958
<210> 72
<211> 88
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> mRNA R-42
<400> 72
Figure 107130626-A0101-12-1213-1959
<210> 73
<211> 88
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> mRNA R-43
<400> 73
Figure 107130626-A0101-12-1213-1960
<210> 74
<211> 124
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 模板DNA D-50
<400> 74
Figure 107130626-A0101-12-1213-1961
<210> 75
<211> 106
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> mRNA
<400> 75
Figure 107130626-A0101-12-1214-1962
<210> 76
<211> 16
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> linker序列C-1
<400> 76
Figure 107130626-A0101-12-1214-1963
<210> 77
<211> 39
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 引子序列C-2
<400> 77
Figure 107130626-A0101-12-1214-1964
<210> 78
<211> 73
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> RNA序列RM-D1
<400> 78
Figure 107130626-A0101-12-1214-1965
<210> 79
<211> 73
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> RNA序列RM-D2
<400> 79
Figure 107130626-A0101-12-1215-1966
<210> 80
<211> 11
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 胜肽P-D3
<220>
<221> CROSSLINK
<222> (1)..(6)
<223> isoaspartyl phenylalanine(Phe-Asp)
<400> 80
Figure 107130626-A0101-12-1215-1967
<210> 81
<211> 11
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 胜肽P-D4
<220>
<221> CROSSLINK
<222> (1)..(6)
<223> isoaspartyl alanine(Ala-Asp)
<400> 81
Figure 107130626-A0101-12-1216-1968
<210> 82
<211> 104
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> DNA序列DM-D1
<400> 82
Figure 107130626-A0101-12-1216-1969
<210> 83
<211> 104
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> DNA序列DM-D2
<400> 83
Figure 107130626-A0101-12-1216-1970
<210> 84
<211> 104
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> DNA序列DM-D3
<400> 84
Figure 107130626-A0101-12-1217-1971
<210> 85
<211> 86
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> RNA序列RM-D3
<400> 85
Figure 107130626-A0101-12-1217-1972
<210> 86
<211> 86
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> RNA序列RM-D4
<400> 86
Figure 107130626-A0101-12-1217-1973
<210> 87
<211> 86
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> RNA序列RM-D5
<400> 87
Figure 107130626-A0101-12-1218-1977
<210> 88
<211> 95
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> DNA序列DT-H2
<400> 88
Figure 107130626-A0101-12-1218-1974
<210> 89
<211> 74
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> RNA序列RT-H2
<400> 89
Figure 107130626-A0101-12-1218-1975
<210> 90
<211> 76
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> tRNAGluCUG
<400> 90
Figure 107130626-A0101-12-1218-1976
Figure 107130626-A0101-12-1219-1978
<210> 91
<211> 87
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> RNA序列RM-H1
<400> 91
Figure 107130626-A0101-12-1219-1979
<210> 92
<211> 139
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> DNA序列DM-H1
<400> 92
Figure 107130626-A0101-12-1219-1980
<210> 93
<211> 118
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> RNA序列RM-H2
<400> 93
Figure 107130626-A0101-12-1219-1981
Figure 107130626-A0101-12-1220-1982
<210> 94
<211> 95
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> DNA序列DT-H3
<400> 94
Figure 107130626-A0101-12-1220-1983
<210> 95
<211> 74
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> RNA序列RT-H3
<400> 95
Figure 107130626-A0101-12-1220-1984
<210> 96
<211> 76
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> tRNAAsn-E2GUU
<400> 96
Figure 107130626-A0101-12-1220-1985
<210> 97
<211> 71
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> RNA序列RM-H3
<400> 97
Figure 107130626-A0101-12-1221-1986
<210> 98
<211> 12
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 胜肽P-H6
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> FORMYLATION
<400> 98
Figure 107130626-A0101-12-1221-1987
<210> 99
<211> 95
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> DNA序列DTL-1
<400> 99
Figure 107130626-A0101-12-1222-1988
<210> 100
<211> 95
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> DNA序列DTL-2
<400> 100
Figure 107130626-A0101-12-1222-1989
<210> 101
<211> 95
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> DNA序列DTL-3
<400> 101
Figure 107130626-A0101-12-1222-1990
<210> 102
<211> 95
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> DNA序列DTL-4
<400> 102
Figure 107130626-A0101-12-1222-1991
Figure 107130626-A0101-12-1223-1992
<210> 103
<211> 95
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> DNA序列DTL-5
<400> 103
Figure 107130626-A0101-12-1223-1993
<210> 104
<211> 95
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> DNA序列DTL-6
<400> 104
Figure 107130626-A0101-12-1223-1994
<210> 105
<211> 95
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> DNA序列DTL-7
<400> 105
Figure 107130626-A0101-12-1223-1995
<210> 106
<211> 95
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> DNA序列DTL-8
<400> 106
Figure 107130626-A0101-12-1224-1996
<210> 107
<211> 95
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> DNA序列DTL-9
<400> 107
Figure 107130626-A0101-12-1224-1997
<210> 108
<211> 95
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> DNA序列DTL-10
<400> 108
Figure 107130626-A0101-12-1224-1998
<210> 109
<211> 95
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> DNA序列DTL-11
<400> 109
Figure 107130626-A0101-12-1225-1999
<210> 110
<211> 95
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> DNA序列DTL-12
<400> 110
Figure 107130626-A0101-12-1225-2000
<210> 111
<211> 97
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> DNA序列DTL-13
<400> 111
Figure 107130626-A0101-12-1225-2001
<210> 112
<211> 106
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> DNA序列DTL-14
<400> 112
Figure 107130626-A0101-12-1226-2002
<210> 113
<211> 74
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> RNA序列MTL-1
<400> 113
Figure 107130626-A0101-12-1226-2003
<210> 114
<211> 74
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> RNA序列MTL-2
<400> 114
Figure 107130626-A0101-12-1226-2004
<210> 115
<211> 74
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> RNA序列MTL-3
<400> 115
Figure 107130626-A0101-12-1227-2005
<210> 116
<211> 74
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> RNA序列MTL-4
<400> 116
Figure 107130626-A0101-12-1227-2006
<210> 117
<211> 74
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> RNA序列MTL-5
<400> 117
Figure 107130626-A0101-12-1227-2007
<210> 118
<211> 74
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> RNA序列MTL-6
<400> 118
Figure 107130626-A0101-12-1228-2008
<210> 119
<211> 74
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> RNA序列MTL-7
<400> 119
Figure 107130626-A0101-12-1228-2009
<210> 120
<211> 74
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> RNA序列MTL-8
<400> 120
Figure 107130626-A0101-12-1228-2010
<210> 121
<211> 74
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> RNA序列MTL-9
<400> 121
Figure 107130626-A0101-12-1229-2011
<210> 122
<211> 74
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> RNA序列MTL-10
<400> 122
Figure 107130626-A0101-12-1229-2012
<210> 123
<211> 74
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> RNA序列MTL-11
<400> 123
Figure 107130626-A0101-12-1229-2013
<210> 124
<211> 74
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> RNA序列MTL-12
<400> 124
Figure 107130626-A0101-12-1229-2014
Figure 107130626-A0101-12-1230-2015
<210> 125
<211> 76
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> RNA序列MTL-13
<400> 125
Figure 107130626-A0101-12-1230-2016
<210> 126
<211> 85
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> RNA序列MTL-14
<400> 126
Figure 107130626-A0101-12-1230-2017
<210> 127
<211> 76
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> tRNAGluCUG
<400> 127
Figure 107130626-A0101-12-1230-2018
<210> 128
<211> 76
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> tRNAGluACG
<400> 128
Figure 107130626-A0101-12-1231-2019
<210> 129
<211> 76
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> tRNAGluUUC
<400> 129
Figure 107130626-A0101-12-1231-2020
<210> 130
<211> 76
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> tRNAGluCCU
<400> 130
Figure 107130626-A0101-12-1231-2021
<210> 131
<211> 76
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> tRNAGluCAA
<400> 131
Figure 107130626-A0101-12-1232-2022
<210> 132
<211> 76
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> tRNAGluUAG
<400> 132
Figure 107130626-A0101-12-1232-2023
<210> 133
<211> 76
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> tRNAGluCUA
<400> 133
Figure 107130626-A0101-12-1232-2024
<210> 134
<211> 76
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> tRNAGluCCG
<400> 134
Figure 107130626-A0101-12-1233-2025
<210> 135
<211> 76
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> tRNAGluAAG
<400> 135
Figure 107130626-A0101-12-1233-2026
<210> 136
<211> 76
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> tRNAGluGCA
<400> 136
Figure 107130626-A0101-12-1233-2027
<210> 137
<211> 76
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> tRNAGluCAU
<400> 137
Figure 107130626-A0101-12-1234-2028
<210> 138
<211> 76
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> tRNAAsn-E2GUU
<400> 138
Figure 107130626-A0101-12-1234-2029
<210> 139
<211> 77
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> tRNAfMetCAU
<400> 139
Figure 107130626-A0101-12-1234-2030
<210> 140
<211> 69
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的核苷酸序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(21)
<223> nnn代表ttt,att,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag,tgc or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(24)
<223> nnn代表ttt,att,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag,tgc or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(27)
<223> nnn代表ttt,att,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag,tgc or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(30)
<223> nnn代表ttt,att,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cgg,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag,tgc or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(33)
<223> nnn代表ttt,att,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag,tgc or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(36)
<223> nnn代表ttt,att,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag,tgc or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (37)..(39)
<223> nnn代表ttt,att,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag,tgc or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)..(45)
<223> nnn代表ttt,ccg,gct,cat,aac,cgg,agg,ttg,tag or gaa
<220>
<221> misc_feature
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<223> nnn代表ttt,att,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag,tgc or gaa
<400> 140
Figure 107130626-A0101-12-1236-2031
<210> 141
<211> 72
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的核苷酸序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(21)
<223> nnn代表ttt,att,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag,tgc or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(24)
<223> nnn代表ttt,att,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag,tgc or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(27)
<223> nnn代表ttt,att,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag,tgc or gaa
<220>
<221> misc_feature
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<223> nnn代表ttt,att,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag,tgc or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(33)
<223> nnn代表ttt,att,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag,tgc or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(36)
<223> nnn代表ttt,att,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag,tgc or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (37)..(39)
<223> nnn代表ttt,att,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag,tgc or gaa
<220>
<221> misc_feature
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<223> nnn代表ttt,att,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag,tgc or gaa
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<400> 141
Figure 107130626-A0101-12-1237-2032
Figure 107130626-A0101-12-1238-2033
<210> 142
<211> 75
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的核苷酸序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(21)
<223> nnn代表ttt,att,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag,tgc or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(24)
<223> nnn代表ttt,att,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag,tgc or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(27)
<223> nnn代表ttt,att,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag,tgc or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(30)
<223> nnn代表ttt,att,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag,tgc or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(33)
<223> nnn代表ttt,att,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag,tgc or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(36)
<223> nnn代表ttt,att,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag,tgc or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (37)..(39)
<223> nnn代表ttt,att,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag,tgc or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (40)..(42)
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<220>
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<400> 142
Figure 107130626-A0101-12-1239-2034
<210> 143
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<221> misc_feature
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<400> 143
Figure 107130626-A0101-12-1241-2035
<210> 144
<211> 75
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的核苷酸序列
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<222> (22)..(24)
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<220>
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<222> (28)..(30)
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<220>
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<222> (31)..(33)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(36)
<223> nnn代表ttt,att,atg,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (37)..(39)
<223> nnn代表ttt,att,atg,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (40)..(42)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (43)..(45)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (49)..(51)
<223> nnn代表ttt,att,atg,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (52)..(54)
<223> nnn代表ttt,att,atg,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag or gaa
<400> 144
Figure 107130626-A0101-12-1243-2036
<210> 145
<211> 78
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(27)
<223> nnn代表ttt,att,atg,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(30)
<223> nnn代表ttt,att,atg,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(33)
<223> nnn代表ttt,att,atg,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(36)
<223> nnn代表ttt,att,atg,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg, ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (37)..(39)
<223> nnn代表ttt,att,atg,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (40)..(42)
<223> nnn代表ttt,att,atg,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)..(45)
<223> nnn代表ttt,att,atg,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (46)..(48)
<223> nnn代表ttt,att,atg,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (52)..(54)
<223> nnn代表ttt,att,atg,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (55)..(57)
<223> nnn代表ttt,att,atg,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag or gaa
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Figure 107130626-A0101-12-1244-2037
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Figure 107130626-A0101-12-1245-2038
<210> 147
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Figure 107130626-A0101-12-1245-2039
<210> 148
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<221> misc_feature
<222> (65)..(67)
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<221> misc_feature
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<221> misc_feature
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<221> misc_feature
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<400> 148
Figure 107130626-A0101-12-1246-2040
Figure 107130626-A0101-12-1247-2041
<210> 149
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<220>
<221> misc_fcature
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<220>
<221> misc_feature
<222> (56)..(58)
<223> nnn代表ttt,att,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag,tgc or gaa
<220>
<221> misc_feature
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (65)..(67)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (68)..(70)
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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Figure 107130626-A0101-12-1248-2042
<210> 150
<211> 124
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<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(55)
<223> nnn代表ttt,att,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag,tgc or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (56)..(58)
<223> nnn代表ttt,att,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag,tgc or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(61)
<223> nnn代表ttt,att,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag,tgc or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (62)..(64)
<223> nnn代表ttt,att,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag,tgc or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (65)..(67)
<223> nnn代表ttt,att,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag,tgc or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (68)..(70)
<223> nnn代表ttt,att,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag,tgc or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (71)..(73)
<223> nnn代表ttt,att,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag,tgc or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (74)..(76)
<223> nnn代表ttt,att,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag,tgc or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (80)..(82)
<223> nnn代表ttt,ccg,gct,cat,aac,cgg,agg,ttg,tag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (83)..(85)
<223> nnn代表ttt,att,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag,tgc or gaa
<400> 150
Figure 107130626-A0101-12-1250-2043
<210> 151
<211> 121
<212> DNA
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<220>
<223> DNA序列DML-4
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(55)
<223> nnn代表ttt,att,atg,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (56)..(58)
<223> nnn代表ttt,att,atg,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(61)
<223> nnn代表ttt,att,atg,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (62)..(64)
<223> nnn代表ttt,att,atg,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (65)..(67)
<223> nnn代表ttt,att,atg,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (68)..(70)
<223> nnn代表ttt,att,atg,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (71)..(73)
<223> nnn代表ttt,att,atg,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (77)..(79)
<223> nnn代表ttt,att,atg,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (80)..(82)
<223> nnn代表ttt,att,atg,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag or gaa
<400> 151
Figure 107130626-A0101-12-1252-2044
<210> 152
<211> 124
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> DNA序列DML-5
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(55)
<223> nnn代表ttt,att,atg,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (56)..(58)
<223> nnn代表ttt,att,atg,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(61)
<223> nnn代表ttt,att,atg,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (62)..(64)
<223> nnn代表ttt,att,atg,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg, ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (65)..(67)
<223> nnn代表ttt,att,atg,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (68)..(70)
<223> nnn代表ttt,att,atg,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (71)..(73)
<223> nnn代表ttt,att,atg,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (74)..(76)
<223> nnn代表ttt,att,atg,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (80)..(82)
<223> nnn代表ttt,att,atg,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (83)..(85)
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<400> 152
Figure 107130626-A0101-12-1253-2045
<210> 153
<211> 127
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<220>
<221> misc_feature
<222> (56)..(58)
<223> nnn代表ttt,att,atg,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(61)
<223> nnn代表ttt,att,atg,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (62)..(64)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (65)..(67)
<223> nnn代表ttt,att,atg,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (68)..(70)
<223> nnn代表ttt,att,atg,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (71)..(73)
<223> nnn代表ttt,att,atg,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (74)..(76)
<223> nnn代表ttt,att,atg,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag or gaa
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
<222> (83)..(85)
<223> nnn代表ttt,att,atg,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (86)..(88)
<223> nnn代表ttt,att,atg,gtt,agt,ccg,act,gct,cat,tgg,ggt,tac,cag,aac,cgg,agg,ttg,ctt,cta,tag or gaa
<400> 153
Figure 107130626-A0101-12-1255-2046
<210> 154
<211> 100
<212> RNA
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<220>
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (35)..(37)
<223> nnn代表uuu,auu,guu,agu,ccg,acu,gcu,cau,ugg,ggu,uac,cag,aac,cgg,agg,uug,cuu,cua,uag,ugc or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (38)..(40)
<223> nnn代表uuu,auu,guu,agu,ccg,acu,gcu,cau,ugg,ggu,uac,cag,aac,cgg,agg,uug,cuu,cua,uag,ugc or gaa
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<223> nnn代表uuu,auu,guu,agu,ccg,acu,gcu,cau,ugg,ggu,uac,cag,aac,cgg,agg,uug,cuu,cua,uag,ugc or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (50)..(52)
<223> nnn代表uuu,auu,guu,agu,ccg,acu,gcu,cau,ugg,ggu,uac,cag,aac,cgg,agg,uug,cuu,cua,uag,ugc or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (56)..(58)
<223> nnn代表uuu,ccg,gcu,cau,aac,cgg,agg,uug,uag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(61)
<223> nnn代表uuu,auu,guu,agu,ccg,acu,gcu,cau,ugg,ggu,uac,cag,aac,cgg,agg,uug,cuu,cua,uag,ugc or gaa
<400> 154
Figure 107130626-A0101-12-1257-2047
<210> 155
<211> 103
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> RNA序列MML-2
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(34)
<223> nnn代表uuu,auu,guu,agu,ccg,acu,gcu,cau,ugg,ggu,uac,cag,aac,cgg,agg,uug,cuu,cua,uag,ugc or gaa
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
<222> (38)..(40)
<223> nnn代表uuu,auu,guu,agu,ccg,acu,gcu,cau,ugg,ggu,uac,cag,aac,cgg,agg,uug,cuu,cua,uag,ugc or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)..(43)
<223> nnn代表uuu,auu,guu,agu,ccg,acu,gcu,cau,ugg,ggu,uac,cag,aac,cgg,agg,uug,cuu,cua,uag,ugc or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (44)..(46)
<223> nnn代表uuu,auu,guu,agu,ccg,acu,gcu,cau,ugg,ggu,uac,cag,aac,cgg,agg,uug,cuu,cua,uag,ugc or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (47)..(49)
<223> nnn代表uuu,auu,guu,agu,ccg,acu,gcu,cau,ugg,ggu,uac,cag,aac,cgg,agg,uug,cuu,cua,uag,ugc or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (50)..(52)
<223> nnn代表uuu,auu,guu,agu,ccg,acu,gcu,cau,ugg,ggu,uac,cag,aac,cgg,agg,uug,cuu,cua,uag,ugc or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(55)
<223> nnn代表uuu,auu,guu,agu,ccg,acu,gcu,cau,ugg,ggu,uac,cag,aac,cgg,agg,uug,cuu,cua,uag,ugc or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(61)
<223> nnn代表uuu,ccg,gcu,cau,aac,cgg,agg,uug,uag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (62)..(64)
<223> nnn代表uuu,auu,guu,agu,ccg,acu,gcu,cau,ugg,ggu,uac,cag,aac,cgg,agg,uug,cuu,cua,uag,ugc or gaa
<400> 155
Figure 107130626-A0101-12-1259-2048
<210> 156
<211> 106
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> RNA序列MML-3
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(34)
<223> nnn代表uuu,auu,guu,agu,ccg,acu,gcu,cau,ugg,ggu,uac,cag,aac,cgg,agg,uug,cuu,cua,uag,ugc or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (35)..(37)
<223> nnu代表uuu,auu,guu,agu,ccg,acu,gcu,cau,ugg,ggu,uac,cag,aac,cgg,agg,uug,cuu,cua,uag,ugc or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (38)..(40)
<223> nnn代表uuu,auu,guu,agu,ccg,acu,gcu,cau,ugg,ggu,uac,cag,aac,cgg,agg,uug,cuu,cua,uag,ugc or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)..(43)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (44)..(46)
<223> nnn代表uuu,auu,guu,agu,ccg,acu,gcu,cau,ugg,ggu, uac,cag,aac,cgg,agg,uug,cuu,cua,uag,ugc or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (47)..(49)
<223> nnn代表uuu,auu,guu,agu,ccg,acu,gcu,cau,ugg,ggu,uac,cag,aac,cgg,agg,uug,cuu,cua,uag,ugc or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (50)..(52)
<223> nnn代表uuu,auu,guu,agu,ccg,acu,gcu,cau,ugg,ggu,uac,cag,aac,cgg,agg,uug,cuu,cua,uag,ugc or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(55)
<223> nnn代表uuu,auu,guu,agu,ccg,acu,gcu,cau,ugg,ggu,uac,cag,aac,cgg,agg,uug,cuu,cua,uag,ugc or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (56)..(58)
<223> nnn代表uuu,auu,guu,agu,ccg,acu,gcu,cau,ugg,ggu,uac,cag,aac,cgg,agg,uug,cuu,cua,uag,ugc or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (62)..(64)
<223> nnn代表uuu,ccg,gcu,cau,aac,cgg,agg,uug,uag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (65)..(67)
<223> nnn代表uuu,auu,guu,agu,ccg,acu,gcu,cau,ugg,ggu,uac,cag,aac,cgg,agg,uug,cuu,cua,uag,ugc or gaa
<400> 156
Figure 107130626-A0101-12-1260-2049
<210> 157
<211> 103
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> RNA序列MML-4
<220>
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<222> (35)..(37)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (38)..(40)
<223> nnn代表uuu,auu,aug,guu,agu,ccg,acu,gcu,cau,ugg,ggu,uac,cag,aac,cgg,agg,uug,cuu,cua,uag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)..(43)
<223> nnn代表uuu,auu,aug,guu,agu,ccg,acu,gcu,cau,ugg,ggu,uac,cag,aac,cgg,agg,uug,cuu,cua,uag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (44)..(46)
<223> nnn代表uuu,auu,aug,guu,agu,ccg,acu,gcu,cau,ugg,ggu,uac,cag,aac,cgg,agg,uug,cuu,cua,uag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (47)..(49)
<223> nnn代表uuu,auu,aug,guu,agu,ccg,acu,gcu,cau,ugg,ggu,uac,cag,aac,cgg,agg,uug,cuu,cua,uag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (50)..(52)
<223> nnn代表uuu,auu,aug,guu,agu,ccg,acu,gcu,cau,ugg,ggu,u.ac,cag,aa.c,cgg,agg,uug,cuu,cua,uag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(55)
<223> nnn代表uuu,auu,aug,guu,agu,ccg,acu,gcu,cau,ugg,ggu,uac,cag,aac,cgg,agg,uug,cuu,cua,uag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(61)
<223> nnn代表uuu,auu,aug,guu,agu,ccg,acu,gcu,cau,ugg,ggu,uac,cag,aac,cgg,agg,uug,cuu,cua,uag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (62)..(64)
<223> nnn代表uuu,auu,aug,guu,agu,ccg,acu,gcu,cau,ugg,ggu,uac,cag,aac,cgg,agg,uug,cuu,cua,uag or gaa
<400> 157
Figure 107130626-A0101-12-1262-2050
<210> 158
<211> 106
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (35)..(37)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (38)..(40)
<223> nnn代表uuu,auu,aug,guu,agu,ccg,acu,gcu,cau,ugg,ggu,uac,cag,aac,cgg,agg,uug,cuu,cua,uag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)..(43)
<223> nnn代表uuu,auu,aug,guu,agu,ccg,acu,gcu,cau,ugg,ggu,uac,cag,aac,cgg,agg,uug,cuu,cua,uag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (44)..(46)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (47)..(49)
<223> nnn代表uuu,auu,aug,guu,agu,ccg,acu,gcu,cau,ugg,ggu,uac,cag,aac,cgg,agg,uug,cuu,cua,uag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (50)..(52)
<223> nnn代表uuu,auu,aug,guu,agu,ccg,acu,gcu,cau,ugg,ggu,uac,cag,aac,cgg,agg,uug,cuu,cua,uag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(55)
<223> nnn代表uuu,auu,aug,guu,agu,ccg,acu,gcu,cau,ugg,ggu,uac,cag,aac,cgg,agg,uug,cuu,cua,uag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (56)..(58)
<223> nnn代表uuu,auu,aug,guu,agu,ccg,acu,gcu,cau,ugg,ggu,uac,cag,aac,cgg,agg,uug,cuu,cua,uag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (62)..(64)
<223> nnn代表uuu,auu,aug,guu,agu,ccg,acu,gcu,cau,ugg,ggu,uac,cag,aac,cgg,agg,uug,cuu,cua,uag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (65)..(67)
<223> nnn代表uuu,auu,aug,guu,agu,ccg,acu,gcu,cau,ugg,ggu,uac,cag,aac,cgg,agg,uug,cuu,cua,uag or gaa
<400> 158
Figure 107130626-A0101-12-1264-2051
<210> 159
<211> 109
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
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<220>
<221> misc_faature
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<220>
<221> misc_feature
<222> (38)..(40)
<223> nnn代表uuu,auu,aug,guu,agu,ccg,acu,gcu,cau,ugg,ggu,uac,cag,aac,cgg,agg,uug,cuu,cua,uag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)..(43)
<223> nnn代表uuu,auu,aug,guu,agu,ccg,acu,gcu,cau,ugg,ggu,uac,cag,aac,cgg,agg,uug,cuu,cua,uag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (44)..(46)
<223> nnn代表uuu,auu,aug,guu,agu,ccg,acu,gcu,cau,ugg,ggu,uac,cag,aac,cgg,agg,uug,cuu,cua,uag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (47)..(49)
<223> nnn代表uuu,auu,aug,guu,agu,ccg,acu,gcu,cau,ugg,ggu,uac,cag,aac,cgg,agg,uug,cuu,cua,uag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (50)..(52)
<223> nnn代表uuu,auu,aug,guu,agu,ccg,acu,gcu,cau,ugg,ggu,uac,cag,aac,cgg,agg,uug,cuu,cua,uag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(55)
<223> nnn代表uuu,auu,aug,guu,agu,ccg,acu,gcu,cau,ugg,ggu,uac,cag,aac,cgg,agg,uug,cuu,cua,uag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (56)..(58)
<223> nnn代表uuu,auu,aug,guu,agu,ccg,acu,gcu,cau,ugg,ggu,uac,cag,aac,cgg,agg,uug,cuu,cua,uag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(61)
<223> nnn代表uuu,auu,aug,guu,agu,ccg,acu,gcu,cau,ugg,ggu,uac,cag,aac,cgg,agg,uug,cuu,cua,uag cr gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (65)..(67)
<223> nnn代表uuu,auu,aug,guu,agu,ccg,acu,gcu,cau,ugg,ggu,uac,cag,aac,cgg,agg,uug,cuu,cua,uag or gaa
<220>
<221> misc_feature
<222> (68)..(70)
<223> nnn代表uuu,auu,aug,guu,agu,ccg,acu,gcu,cau,ugg,ggu,uac,cag,aac,cgg,agg,uug,cuu,cua,uag or gaa
<400> 159
Figure 107130626-A0101-12-1265-2052
Figure 107130626-A0101-12-1266-2053
<210> 160
<211> 39
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
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<400> 160
Figure 107130626-A0101-12-1266-2054
<210> 161
<211> 39
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> DNA序列DOL-4
<400> 161
Figure 107130626-A0101-12-1266-2055
<210> 162
<211> 18
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> DNA序列DOL-5
<400> 162
Figure 107130626-A0101-12-1266-2056
<210> 163
<400> 163 000
<210> 164
<211> 109
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> DNA序列DME-2
<400> 164
Figure 107130626-A0101-12-1267-2057
<210> 165
<211> 109
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> DNA序列DME-3
<400> 165
Figure 107130626-A0101-12-1267-2058
<210> 166
<211> 109
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> DNA序列DME-4
<400> 166
Figure 107130626-A0101-12-1267-2059
<210> 167
<211> 109
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> DNA序列DME-5
<400> 167
Figure 107130626-A0101-12-1268-2060
<210> 168
<211> 109
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> DNA序列DME-6
<400> 168
Figure 107130626-A0101-12-1268-2061
<210> 169
<211> 106
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> DNA序列DME-7
<400> 169
Figure 107130626-A0101-12-1268-2062
<210> 170
<211> 109
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> DNA序列DME-8
<400> 170
Figure 107130626-A0101-12-1269-2063
<210> 171
<211> 109
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> DNA序列DME-9
<400> 171
Figure 107130626-A0101-12-1269-2064
<210> 172
<211> 109
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> DNA序列DME-10
<400> 172
Figure 107130626-A0101-12-1269-2065
<210> 173
<211> 109
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> DNA序列DME-11
<400> 173
Figure 107130626-A0101-12-1270-2066
<210> 174
<400> 174 000
<210> 175
<211> 109
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> DNA序列DME-13
<400> 175
Figure 107130626-A0101-12-1270-2067
<210> 176
<211> 109
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> DNA序列DME-14
<400> 176
Figure 107130626-A0101-12-1270-2068
<210> 177
<211> 106
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> DNA序列DME-15
<400> 177
Figure 107130626-A0101-12-1271-2069
<210> 178
<211> 10
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> an artificially synthesized RNA序列
<400> 178
Figure 107130626-A0101-12-1271-2070
<210> 179
<211> 95
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> DNA序列DT-E1
<400> 179
Figure 107130626-A0101-12-1271-2071
<210> 180
<211> 74
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> RNA序列RT-E1
<400> 180
Figure 107130626-A0101-12-1272-2072
<210> 181
<211> 76
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> tRNAGluAAG
<400> 181
Figure 107130626-A0101-12-1272-2073
<210> 182
<211> 73
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> RNA序列RM-E1
<400> 182
Figure 107130626-A0101-12-1272-2074
<210> 183
<211> 12
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 胜肽P-E1
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> FORMYLATION
<220>
<221> THIOLEST
<222> (2)..(7)
<400> 183
Figure 107130626-A0101-12-1273-2075
<210> 184
<211> 11
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 胜肽P-E2
<220>
<221> CROSSLINK
<222> (1)..(6)
<223> isoaspartyl cysteine(Cys-Asp)
<400> 184
Figure 107130626-A0101-12-1273-2076
<210> 185
<211> 97
<212> RNA
<213> 人造序列
<220>
<223> RNA序列RM-H4
<400> 185
Figure 107130626-A0101-12-1274-2077

Claims (63)

  1. 一種具有環狀部之胜肽化合物的製造方法，包括以下之1或多數步驟：A)提供將化合物C-1予以胺基醯基化而得之pdCpA之步驟，
    Figure 107130626-A0305-02-1277-1
     (式中，R25表示OH、鹵素原子、OR、或SR1(R表示Bt、At、NSu或Pfp，且R1表示氫原子、可具有取代基之烷基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之環烷基、可具有取代基之雜芳基、可具有取代基之烯基、可具有取代基之伸烷基)；R26表示可具有取代基之伸烷基、可具有取代基之伸芳基或可具有取代基之2價之芳烷基；以及R2、R3各自獨立地表示氫原子或可具有取代基之烷基)，B)提供3'末端之CA欠缺之tRNA之步驟，C)使步驟A)之該pdCpA與前述步驟B)之該tRNA連結，提供化合物C-1經胺基醯基化之開始tRNA之步驟，D)提供包含步驟C)之該tRNA且不包含甲硫胺酸、甲硫胺醯基tRNA合成酵素(methionyl tRNA synthetase， MetRS)、甲硫胺酸用轉譯開始tRNA、甲醯基提供者或甲硫胺醯基tRNA轉移酶中之任一者之無細胞轉譯系之步驟，E)提供包含於啟動子之下游接續於轉譯開始ATG之半胱胺酸密碼子UGU或UGC、於其下游為步驟C)之該tRNA之反密碼子對應之密碼子之編碼為胜肽序列的模板DNA庫之步驟，F)從步驟E)之該模板DNA庫提供mRNA庫之步驟，G)使步驟F)之該mRNA庫之3'末端與間隙子鍵結之步驟，H)於步驟D)之該無細胞轉譯系，加入步驟G)之該間隙子鍵結之mRNA庫並轉譯，而提供環化前胜肽化合物-mRNA複合體展示庫之步驟，以及I)形成環狀結構之步驟。
  2. 如申請專利範圍第1項之具有環狀部之胜肽化合物的製造方法，更包括在步驟G)之後，以黏合於該mRNA庫之3'區域的引子合成cDNA之步驟。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之具有環狀部之胜肽化合物的製造方法，更包括以下1或多數步驟：J)以淘選濃縮mRNA庫中與藥物鍵結的化合物之步驟，K)以反轉錄酶合成cDNA之步驟，以及L)解析鹼基序列之步驟。
  4. 一種具有環狀部之胜肽化合物的製造方法，包括以下之1或多數步驟：A)提供將化合物C-1予以胺基醯基化而得之pdCpA之步驟，
    Figure 107130626-A0305-02-1279-2
     (式中，R25表示OH、鹵素原子、OR、或SR1(R表示Bt、At、NSu或Pfp，且R1表示氫原子、可具有取代基之烷基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之環烷基、可具有取代基之雜芳基、可具有取代基之烯基、可具有取代基之伸烷基)；R26表示可具有取代基之伸烷基、可具有取代基之伸芳基或可具有取代基之2價之芳烷基；R2、R3各自獨立地表示氫原子或可具有取代基之烷基)，B)提供3'末端之CA欠缺之tRNA之步驟，C)使步驟A)之該pdCpA與前述步驟B)之該tRNA連結，提供化合物C-1經胺基醯基化之開始tRNA之步驟，D)提供包含步驟C)之該tRNA之無細胞轉譯系之步驟，E)提供包含於啟動子之下游接續於轉譯開始ATG之半胱胺酸密碼子UGU或UGC、於其下游為步驟C)之該tRNA之反密碼子對應之密碼子之編碼為胜肽序列的模板DNA庫之步驟，F)從步驟E)之該模板DNA庫提供mRNA庫之步驟，G)使步驟F)之該mRNA庫之3'末端與間隙子鍵結之步驟， H)於步驟D)之該無細胞轉譯系，加入步驟G)之該間隙子鍵結之mRNA庫並轉譯，而提供環化前胜肽化合物-mRNA複合體展示庫之步驟，I)使胜肽去甲醯基酶、甲硫胺酸 胺基肽酶作用於步驟H)之該資料庫之步驟，以及J)形成環狀結構之步驟。
  5. 如申請專利範圍第4項之具有環狀部之胜肽化合物的製造方法，更包括在步驟H)或步驟I)之後，以黏合於該mRNA庫之3'區域的引子合成cDNA之步驟。
  6. 如申請專利範圍第4或5項之具有環狀部之胜肽化合物的製造方法，更包括以下1或多數步驟：J)以淘選濃縮mRNA庫中與藥物標的鍵結的序列之步驟，K)以反轉錄酶合成cDNA之步驟，以及L)解析該鹼基序列之步驟。
  7. 一種具有環狀部之胜肽化合物的製造方法，包括以下之1或多數步驟：A)提供將化合物C-3予以胺基醯基化而得之pdCpA之步驟，
    Figure 107130626-A0305-02-1280-3
     (R2=R3=R28=R29=H、L-天冬胺酸衍生物)， B)提供3'末端之CA欠缺之tRNA之步驟，C)使步驟A)之該pdCpA與步驟B)之該tRNA連結，提供化合物C-3經胺基醯基化之開始tRNA之步驟，D)提供包含步驟C)之該tRNA且不包含甲硫胺酸、甲硫胺醯基tRNA合成酵素(MetRS)、甲硫胺酸用轉譯開始tRNA、甲醯基提供者、甲硫胺醯基tRNA轉移酶中之任一者之無細胞轉譯系之步驟，E)提供於啟動子之下游，在轉譯開始密碼子ATG之後有半胱胺酸密碼子且於其下游具有與步驟C)之該tRNA之反密碼子對應之密碼子的模板DNA庫，且係編碼為胜肽序列之模板DNA庫之步驟，F)從步驟E)之該模板DNA庫提供mRNA庫之步驟，G)使步驟F)之該mRNA庫之3'末端與間隙子鍵結之步驟，H)於步驟D)之該無細胞轉譯系，加入步驟G)之間隙子鍵結之mRNA庫並轉譯，而提供環化前胜肽化合物-mRNA複合體展示庫之步驟，以及I)形成環狀結構後進行脫硫反應之步驟。
  8. 如申請專利範圍第7項之具有環狀部之胜肽化合物的製造方法，更包括在步驟G)之後，以黏合於該mRNA庫之3'區域的引子合成cDNA之步驟。
  9. 如申請專利範圍第7或8項之具有環狀部之胜肽化合物的製造方法，更包括以下1或多數步驟：J)以淘選濃縮mRNA庫中與藥物標的鍵結的序列之步驟，K)以反轉錄酶合成cDNA之步驟，以及 L)解析該鹼基序列之步驟。
  10. 一種具有環狀部之胜肽化合物的製造方法，包括以下之1或多數步驟：A)提供將化合物C-3予以胺基醯基化而得之pdCpA之步驟，
    Figure 107130626-A0305-02-1282-4
     (R2=R3=R28=R29=H、L-天冬胺酸衍生物)，B)提供3'末端之CA欠缺之tRNA之步驟，C)使步驟A)之該pdCpA與步驟B)之該tRNA連結，提供化合物C-3經胺基醯基化之開始tRNA之步驟，D)提供包含步驟C)之該tRNA之無細胞轉譯系之步驟，E)提供於啟動子之下游，在轉譯開始密碼子ATG之後有半胱胺酸密碼子且於其下游具有與步驟C)之該tRNA之反密碼子對應之密碼子的模板DNA庫，且係編碼為胜肽序列之模板DNA庫之步驟，F)從步驟E)之該模板DNA庫提供mRNA庫之步驟，G)使步驟F)之該mRNA庫之3'末端與間隙子鍵結之步驟，H)於步驟D)之該無細胞轉譯系，加入步驟G)之該間隙子鍵結之mRNA庫並轉譯，而提供環化前胜肽化合物-mRNA複合體展示庫之步驟， I)使胜肽去甲醯基酶、甲硫胺酸胺基肽酶作用於步驟H)之該資料庫之步驟，以及I)形成環狀結構後，進行脫硫反應之步驟。
  11. 如申請專利範圍第10項之具有環狀部之胜肽化合物的製造方法，更包括在步驟G)之後，以黏合於該mRNA庫之3'區域的引子合成cDNA之步驟。
  12. 如申請專利範圍第10或11項之具有環狀部之胜肽化合物的製造方法，更包括以下1或多數步驟：J)以淘選濃縮mRNA庫中與藥物標的鍵結的序列之步驟，K)以反轉錄酶合成cDNA之步驟，以及L)解析該鹼基序列之步驟。
  13. 一種建構藉由將轉譯伸長反應不易容許之tBSSEtGABA、tBSSEtβAla作為N末端而能獲得之醯胺環化胜肽化合物資料庫之方法，包括以下之1或多數步驟：A)提供tBSSEtGABA或tBSSEtβAla予以胺基醯基化而得之pdCpA之步驟，B)提供3'末端之CA欠缺之開始tRNA之步驟，C)使步驟A)之該pdCpA與步驟B)之該tRNA連結，提供tBSSEtGABA或tBSSEtβAla經胺基醯基化之開始tRNA之步驟，D)提供將化合物C-1予以胺基醯基化而得之pdCpA之步驟，
    Figure 107130626-A0305-02-1284-5
     (式中，R25表示OH、鹵素原子、OR、或SR1(R表示Bt、At、NSu或Pfp，且R1表示氫原子、可具有取代基之烷基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之環烷基、可具有取代基之雜芳基、可具有取代基之烯基、可具有取代基之伸烷基)；R26表示可具有取代基之伸烷基、可具有取代基之伸芳基或可具有取代基之2價之芳烷基；R2、R3各自獨立地表示氫原子或可具有取代基之烷基)，E)提供3'末端之CA欠缺之tRNA之步驟，F)使步驟D)之該pdCpA與步驟E)之該3'末端之tRNA連結，提供化合物C-1經胺基醯基化之tRNA之步驟，G)提供包含步驟C)之該開始tRNA與步驟F)之該tRNA且不包含甲硫胺酸、甲硫胺醯基tRNA合成酵素(MetRS)、甲硫胺酸用轉譯開始tRNA、甲醯基提供者、甲硫胺醯基tRNA轉移酶中之任一者之無細胞轉譯系之步驟，H)提供於啟動子之下游具有ATG作為第1位密碼子，並於其下游包含步驟F)之該tRNA之反密碼子對應之密碼子，於其3'側包含成為脯胺酸或其他ARS之基質之N-甲基 胺基酸之密碼子的編碼為胜肽序列的模板DNA庫之步驟，I)從步驟H)之該模板DNA庫提供mRNA庫之步驟，J)使步驟I)之該mRNA庫之3'末端與間隙子鍵結之步驟，K)於步驟G)之該無細胞轉譯系，加入步驟J)之該間隙子鍵結之mRNA庫並轉譯，而提供環化前胜肽化合物-mRNA複合體展示庫之步驟，以及L)形成環狀部位及直鏈部位2之步驟。
  14. 如申請專利範圍第13項之方法，更包括步驟J)之後，以黏合於該mRNA庫之3'區域的引子合成cDNA之步驟。
  15. 如申請專利範圍第13或14項之方法，更包括以下1或多數步驟：M)以淘選濃縮mRNA庫中與藥物標的鍵結的序列之步驟，N)以反轉錄酶合成cDNA之步驟，以及O)解析該鹼基序列之步驟。
  16. 一種建構藉由將轉譯伸長反應不易容許之tBSSEtGABA、tBSSEtβAla作為N末端而能獲得之醯胺環化胜肽化合物資料庫之方法，包括以下之1或多數步驟：A)提供tBSSEtGABA或tBSSEtβAla予以胺基醯基化而得之pdCpA之步驟，B)提供3'末端之CA欠缺之開始tRNA之步驟，C)使步驟A)之該pdCpA與步驟B)之該開始tRNA連結，提供將tBSSEtGABA或tBSSEtβAla予以胺基醯基化而得之開始tRNA之步驟，D)提供將化合物C-1予以胺基醯基化而得之pdCpA之步 驟，
    Figure 107130626-A0305-02-1286-6
     (式中，R25表示OH、鹵素原子、OR、或SR1(R表示Bt、At、NSu或Pfp，且R1表示氫原子、可具有取代基之烷基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之環烷基、可具有取代基之雜芳基、可具有取代基之烯基、可具有取代基之伸烷基)；R26表示可具有取代基之伸烷基、可具有取代基之伸芳基或可具有取代基之2價之芳烷基；R2、R3各自獨立地表示氫原子或可具有取代基之烷基)，E)提供3'末端之CA欠缺之tRNA之步驟，F)使步驟D)之該pdCpA與步驟E)之該3'末端之tRNA連結，提供將化合物C-1予以胺基醯基化而得之tRNA，並提供將任意之N-甲基胺基酸予以胺基醯基化而得之pdCpA後，提供3'末端之CA欠缺之tRNA，使此等pdCpA與tRNA連結，提供將N-甲基胺基酸予以胺基醯基化而得之tRNA之步驟，G)提供包含步驟C)之該開始tRNA與步驟F)之該tRNA 且不包含甲硫胺酸、甲硫胺醯基tRNA合成酵素(MetRS)、甲硫胺酸用轉譯開始tRNA、甲醯基提供者、甲硫胺醯基tRNA轉移酶中之任一者之無細胞轉譯系之步驟，H)提供於啟動子之下游具有ATG作為第1位密碼子，並於其下游包含步驟F)之該tRNA之反密碼子對應之密碼子，於其3'側包含步驟F)之該N-甲胺基醯基化tRNA對應之密碼子的編碼為胜肽序列的模板DNA庫之步驟，I)從步驟H)之該模板DNA庫提供mRNA庫之步驟，J)使步驟I)之該mRNA庫之3'末端與間隙子鍵結之步驟，K)於步驟G)之該無細胞轉譯系，加入步驟J)之該間隙子鍵結之mRNA庫並轉譯，而提供環化前胜肽化合物-mRNA複合體展示庫之步驟，以及L)形成環狀部位及直鏈部位2之步驟。
  17. 如申請專利範圍第16項之方法，更包括步驟J)之後，以黏合於該mRNA庫之3'區域的引子合成cDNA之步驟。
  18. 如申請專利範圍第16或17項之方法，更包括以下1或多數步驟：M)以淘選濃縮mRNA庫中與藥物標的鍵結的序列之步驟，N)以反轉錄酶合成cDNA之步驟，以及O)解析該鹼基序列之步驟。
  19. 一種建構藉由將轉譯伸長反應不易容許之tBSSEtGABA、tBSSEtβAla作為N末端而能獲得之醯胺環化胜肽化合物資料庫之方法，包括以下之1或多數步驟：A)提供tBSSEtGABA或tBSSEtβAla予以胺基醯基化而得 之pdCpA之步驟，B)提供3'末端之CA欠缺之開始tRNA之步驟，C)使步驟A)之該pdCpA與步驟B)之該開始tRNA連結，提供將tBSSEtGABA或tBSSEtβAla予以胺基醯基化而得之開始tRNA之步驟，D)提供將Asp(SBn)予以胺基醯基化而得之pdCpA之步驟，E)提供3'末端之CA欠缺之tRNA之步驟，F)使步驟D)之該pdCpA與步驟E)之該3’末端之tRNA連結，提供將Asp(SBn)予以胺基醯基化而得之tRNA之步驟，G)提供包含步驟C)之該開始tRNA與步驟F)之該tRNA且不包含甲硫胺酸、甲硫胺醯基tRNA合成酵素(MetRS)、甲硫胺酸用轉譯開始tRNA、甲醯基提供者、甲硫胺醯基tRNA轉移酶中之任一者之無細胞轉譯系之步驟，H)提供於啟動子之下游具有ATG作為第1位密碼子，並於其下游包含步驟F)之該tRNA之反密碼子對應之密碼子，於其3'側包含成為脯胺酸或其他ARS之基質之N-甲基胺基酸之密碼子的編碼為胜肽序列的模板DNA庫之步驟，I)從步驟H)之該模板DNA庫提供mRNA庫之步驟，J)使步驟I)之該mRNA庫之3’末端與間隙子鍵結之步驟，K)於步驟G)之該無細胞轉譯系，加入步驟J)之該間隙子鍵結之mRNA庫並轉譯，而提供環化前胜肽化合物-mRNA複合體展示庫之步驟，以及L)形成環狀部位及直鏈部位2之步驟。
  20. 如申請專利範圍第19項之方法，更包括步驟J)之後，以黏合於該mRNA庫之3'區域的引子合成cDNA之步驟。
  21. 如申請專利範圍第19或20項之方法，更包括以下1或多數步驟：M)以淘選濃縮mRNA庫中與藥物標的鍵結的序列之步驟，N)以反轉錄酶合成cDNA之步驟，以及O)解析該鹼基序列之步驟。
  22. 一種建構藉由將轉譯伸長反應不易容許之tBSSEtGABA、tBSSEtβAla作為N末端而能獲得之醯胺環化胜肽化合物資料庫之方法，包括以下之1或多數步驟：A)提供tBSSEtGABA或tBSSEtβAla予以胺基醯基化而得之pdCpA之步驟，B)提供3’末端之CA欠缺之開始tRNA之步驟，C)使步驟A)之該pdCpA與步驟B)之該開始tRNA連結，提供將tBSSEtGABA或tBSSEtβAla予以胺基醯基化而得之開始tRNA之步驟，D)提供將Asp(SBn)予以胺基醯基化而得之pdCpA之步驟，E)提供3’末端之CA欠缺之tRNA之步驟，F)使步驟D)之該pdCpA與步驟E)之該3’末端之tRNA連結，提供將Asp(SBn)予以胺基醯基化而得之tRNA，並提供將任意之N-甲基胺基酸予以胺基醯基化而得之pdCpA後，提供3'末端之CA欠缺之tRNA，使此等pdCpA與tRNA連結，提供將N-甲基胺基酸予以胺基醯基化而得之tRNA之 步驟，G)提供包含步驟C)之該開始tRNA與步驟F)之該tRNA且不含甲硫胺酸、甲硫胺醯基tRNA合成酵素(MetRS)、甲硫胺酸用轉譯開始tRNA、甲醯基提供者、甲硫胺醯基tRNA轉移酶中之任一者之無細胞轉譯系之步驟，H)提供於啟動子之下游具有ATG作為第1位密碼子，並於其下游包含步驟F)之該tRNA之反密碼子對應之密碼子，於其3'側包含步驟F)之該N-甲胺基醯基化tRNA對應之密碼子的編碼為胜肽序列的模板DNA庫之步驟，I)從步驟H)之該模板DNA庫提供mRNA庫之步驟，J)使步驟I)之該mRNA庫之3’末端與間隙子鍵結之步驟，K)於步驟G)之該無細胞轉譯系，加入步驟J)之該間隙子鍵結之mRNA庫並轉譯，而提供環化前胜肽化合物-mRNA複合體展示庫之步驟，以及L)形成環狀部位及直鏈部位2之步驟。
  23. 如申請專利範圍第22項之方法，更包括步驟J)之後，以黏合於該mRNA庫之3’區域的引子合成cDNA之步驟。
  24. 如申請專利範圍第22或23項之方法，更包括以下1或多數步驟：M)以淘選濃縮mRNA庫中與藥物標的鍵結的序列之步驟，N)以反轉錄酶合成cDNA之步驟，以及O)解析該鹼基序列之步驟。
  25. 一種建構藉由將於轉譯伸長反應不易容許之胺基酸作為N末端而能獲得之醯胺環化胜肽資料庫之方法，包括以下1 或多數步驟：A)提供將化合物N-1予以胺基醯基化而得之pdCpA之步驟，
    Figure 107130626-A0305-02-1291-8
     (式中，R1表示氫原子、S-R23(R23表示可具有取代基之烷基、芳基或芳烷基)、或HS基之保護基；R2、R3各自獨立地表示氫原子、或可具有取代基之烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基或環烷基；或R2與R3表示形成環之取代基、或R2或R3表示與R4形成環之取代基；R4表示可具有取代基之伸烷基、可具有取代基之伸芳基或可具有取代基之2價之芳烷基；R12表示單鍵、可具有取代基之伸烷基、可具有取代基之伸芳基或可具有取代基之2價芳烷基)，B)提供3’末端之CA欠缺之開始tRNA之步驟，C)使步驟A)之該pdCpA與步驟B)之該開始tRNA連結，提供將化合物N-1或化合物N-2予以胺基醯基化之開始 tRNA之步驟，
    Figure 107130626-A0305-02-1292-9
     (式中，R1表示氫原子、S-R23(R23表示可具有取代基之烷基、芳基或芳烷基)、或HS基之保護基；R2、R3各自獨立地表示氫原子、或可具有取代基之烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基或環烷基；或R2與R3表示形成環之取代基、或R2或R3表示與R4形成環之取代基；R4表示可具有取代基之伸烷基、可具有取代基之伸芳基或可具有取代基之2價之芳烷基；R11、R12各自獨立地表示單鍵、可具有取代基之伸烷基、可具有取代基之伸芳基或可具有取代基之2價芳烷基)，D)提供將化合物C-1予以胺基醯基化而得之pdCpA，
    Figure 107130626-A0305-02-1292-10
     (式中，R25表示OH、鹵素原子、OR、或SR1(R表示Bt、 At、NSu或Pfp，R1表示氫原子、可具有取代基之烷基、可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之環烷基、可具有取代基之雜芳基、可具有取代基之烯基、可具有取代基之伸烷基)；R26表示可具有取代基之伸烷基、可具有取代基之伸芳基或可具有取代基之2價之芳烷基；R2、R3各自獨立地表示氫原子或可具有取代基之烷基)。 E)提供3’末端之CA欠缺之tRNA，F)使步驟D)之該pdCpA與步驟E)之該tRNA連結，提供化合物C-1予以胺基醯基化而得之tRNA，G)提供包含步驟C)之該開始tRNA與步驟F)之該tRNA且不含甲硫胺酸、甲硫胺醯基tRNA合成酵素(MetRS)、甲硫胺酸用轉譯開始tRNA、甲醯基提供者、甲硫胺醯基tRNA轉移酶中之任一者之無細胞轉譯系，H)提供於啟動子之下游具有步驟C)之該轉譯開始tRNA之反密碼子對應之密碼子作為第1位密碼子，並於其下游包含步驟F)之該tRNA之反密碼子對應之密碼子，於其3'側包含步驟F)之該tRNA之反密碼子對應之密碼子的編碼為胜肽序列的模板DNA庫，I)從步驟H)之該模板DNA庫提供mRNA庫之步驟，J)使步驟I)之該mRNA庫之3’末端與間隙子鍵結之步驟，K)於步驟G)之該無細胞轉譯系，加入步驟J)之該間隙子鍵結之mRNA庫並轉譯，而提供環化前胜肽化合物-mRNA複合體展示庫之步驟，以及 L)形成環狀部位之步驟。
  26. 如申請專利範圍第25項之方法，更包括步驟J)之後，以黏合於該mRNA庫之3’區域的引子合成cDNA之步驟。
  27. 如申請專利範圍第25或26項之方法，更包括以下1或多數步驟：M)以淘選濃縮與標的物質鍵結之mRNA庫之步驟，N)以反轉錄酶合成cDNA之步驟，以及O)解析該鹼基序列之步驟。
  28. 一種建構藉由將於轉譯伸長反應不易容許之胺基酸作為N末端而能獲得之醯胺環化胜肽資料庫之方法，包含以下1或多數步驟：A)提供將化合物N-2予以胺基醯基化而得之pdCpA之步驟，
    Figure 107130626-A0305-02-1294-11
     (式中，R1表示氫原子、S-R23(R23表示可具有取代基之烷基、芳基或芳烷基)、或HS基之保護基；R4表示可具有取代基之伸烷基、可具有取代基之伸芳基或可具有取代基之2價之芳烷基；以及 R11表示單鍵、可具有取代基之伸烷基、可具有取代基之伸芳基或可具有取代基之2價芳烷基)，B)提供3’末端之CA欠缺之開始tRNA之步驟，C)使步驟A)之該pdCpA與步驟B)之該開始tRNA連結，提供將化合物N-1或化合物N-2予以胺基醯基化而得之開始tRNA之步驟，
    Figure 107130626-A0305-02-1295-12
     (式中，R1表示氫原子、S-R23(R23表示可具有取代基之烷基、芳基或芳烷基)、或HS基之保護基；R2、R3各自獨立地表示氫原子、或可具有取代基之烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基或環烷基；或R2與R3表示形成環之取代基、或R2或R3表示與R4形成環之取代基；R4表示可具有取代基之伸烷基、可具有取代基之伸芳基或可具有取代基之2價之芳烷基；R11、R12各自獨立地表示單鍵、可具有取代基之伸烷基、可具有取代基之伸芳基或可具有取代基之2價芳烷基)，D)提供將化合物C-1予以胺基醯基化而得之pdCpA之步驟，
    Figure 107130626-A0305-02-1296-13
     (式中，R25表示OH、鹵素原子、OR、或SR1(R表示Bt、At、NSu或Pfp，R1表示氫原子、可具有取代基之烷基、可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之環烷基、可具有取代基之雜芳基、可具有取代基之烯基、可具有取代基之伸烷基)；R26表示可具有取代基之伸烷基、可具有取代基之伸芳基或可具有取代基之2價之芳烷基；R2、R3各自獨立地表示氫原子或可具有取代基之烷基)，E)提供3’末端之CA欠缺之tRNA之步驟，F)使步驟D)之該pdCpA與步驟E)之該tRNA連結，提供將化合物C-1予以胺基醯基化而得之tRNA之步驟，G)提供包含步驟C)之該開始tRNA與步驟F)之該tRNA且不含甲硫胺酸、甲硫胺醯基tRNA合成酵素(MetRS)、甲硫胺酸用轉譯開始tRNA、甲醯基提供者、甲硫胺醯基tRNA轉移酶中之任一者之無細胞轉譯系之步驟，H)提供於啟動子之下游具有步驟C)之該轉譯開始tRNA之反密碼子對應之密碼子作為第1位密碼子，並於其下游包含步驟F)之該tRNA之反密碼子對應之密碼子，於其3' 側包含成為脯胺酸或其他ARS之基質之N-甲基胺基酸之密碼子的編碼為胜肽序列的模板DNA庫之步驟，I)從步驟H)之該模板DNA庫提供mRNA庫之步驟，J)使步驟I)之該mRNA庫之3’末端與間隙子鍵結之步驟，K)於步驟G)之該無細胞轉譯系，加入步驟J)之該間隙子鍵結之mRNA庫並轉譯，而提供環化前胜肽化合物-mRNA複合體展示庫之步驟，以及L)形成環狀部位之步驟。
  29. 如申請專利範圍第28項之方法，更包括步驟J)之後，以黏合於該mRNA庫之3’區域的引子合成cDNA之步驟。
  30. 如申請專利範圍第28或29項之方法，更包括以下1或多數步驟：M)以淘選濃縮mRNA庫中與藥物標的鍵結的序列之步驟，N)以反轉錄酶合成cDNA之步驟，以及O)解析該鹼基序列之步驟。
  31. 一種建構藉由將於轉譯伸長反應不易容許之胺基酸作為N末端而能獲得之醯胺環化胜肽庫之方法，包含以下1或多數步驟：A)提供將化合物N-2予以胺基醯基化而得之pdCpA之步驟，
    Figure 107130626-A0305-02-1298-14
     (式中，R1表示氫原子、S-R23(R23表示可具有取代基之烷基、芳基或芳烷基)、或HS基之保護基；R4表示可具有取代基之伸烷基、可具有取代基之伸芳基或可具有取代基之2價之芳烷基；以及R11表示單鍵、可具有取代基之伸烷基、可具有取代基之伸芳基或可具有取代基之2價芳烷基)，B)提供3’末端之CA欠缺之開始tRNA之步驟，C)使步驟A)之該pdCpA與步驟B)之該開始tRNA連結，提供將化合物N-1或化合物N-2予以胺基醯基化而得之開始tRNA之步驟，
    Figure 107130626-A0305-02-1298-15
     (式中，R1表示氫原子、S-R23(R23表示可具有取代基之烷基、芳基或芳烷基)、或HS基之保護基； R2、R3各自獨立地表示氫原子、或可具有取代基之烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基或環烷基；或R2與R3表示形成環之取代基、或R2或R3表示與R4形成環之取代基；R4表示可具有取代基之伸烷基、可具有取代基之伸芳基或可具有取代基之2價之芳烷基；R11、R12各自獨立地表示單鍵、可具有取代基之伸烷基、可具有取代基之伸芳基或可具有取代基之2價芳烷基)，D)提供將化合物C-1予以胺基醯基化而得之pdCpA之步驟，
    Figure 107130626-A0305-02-1299-16
     (式中，R25表示OH、鹵素原子、OR、或SR1(R表示Bt、At、NSu或Pfp，R1表示氫原子、可具有取代基之烷基、可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之環烷基、可具有取代基之雜芳基、可具有取代基之烯基、可具有取代基之伸烷基)；R26表示可具有取代基之伸烷基、可具有取代基之伸芳基或可具有取代基之2價之芳烷基；R2、R3各自獨立地表示氫原子或可具有取代基之烷基)。 E)提供3’末端之CA欠缺之tRNA之步驟，F)使步驟D)之該pdCpA與步驟E)之該tRNA連結，提供將化合物C-1予以胺基醯基化而得之tRNA，再者提供將任意之N-甲基胺基酸予以胺基醯基化而得之pdCpA，並提供3’末端之CA欠缺之tRNA，再使該pdCpA與該tRNA連結，提供將該N-甲基胺基酸予以胺基醯基化而得之tRNA之步驟，G)提供包含步驟C)之該開始tRNA與步驟F)之該tRNA、不含甲硫胺酸、甲硫胺醯基tRNA合成酵素(MetRS)、甲硫胺酸用轉譯開始tRNA、甲醯基提供者、甲硫胺醯基tRNA轉移酶中之任一者之無細胞轉譯系之步驟，H)提供於啟動子之下游具有步驟C)之該轉譯開始tRNA之反密碼子對應之密碼子作為第1位密碼子，並於其下游包含步驟F)之該tRNA之反密碼子對應之密碼子，於其3'側包含步驟F)之該tRNA之反密碼子對應之密碼子的編碼為胜肽序列的模板DNA庫之步驟，I)從步驟H)之該模板DNA庫提供mRNA庫之步驟，J)使步驟I)之該mRNA庫之3’末端與間隙子鍵結之步驟，K)於步驟G)之該無細胞轉譯系，加入步驟J)之該間隙子鍵結之mRNA庫並轉譯，而提供環化前胜肽化合物-mRNA複合體展示庫之步驟，以及L)形成環狀部位之步驟。
  32. 如申請專利範圍第31項之方法，更包括步驟J)之後，以黏合於該mRNA庫之3’區域的引子合成cDNA之步驟。
  33. 如申請專利範圍第31或32項之方法，更包括以下1或多數步驟：M)以淘選濃縮mRNA庫中與藥物標的鍵結的序列之步驟，N)以反轉錄酶合成cDNA之步驟，以及O)解析該鹼基序列之步驟。
  34. 一種建構藉由將N末端胺基酸不同之多種胜肽同時轉譯而能獲得之環化部位之結構不同之醯胺環化胜肽資料庫之方法，包括以下1或多數步驟：A)提供將化合物C-1、化合物C-2或化合物C-3予以胺基醯基化而得之pdCpA之步驟，
    Figure 107130626-A0305-02-1301-17
     B)提供3’末端之CA欠缺之tRNA之步驟，C)使步驟A)之該pdCpA與前述步驟B)之該tRNA連結，提供將化合物C-1、化合物C-2或化合物C-3予以胺基醯基化而得之開始tRNA之步驟，D)提供包含步驟C)之該tRNA之無細胞轉譯系之步驟，E)提供於啟動子之下游具有步驟C)之該tRNA之反密碼子對應之密碼子，於其3'側在中途含有成為脯胺酸或其他ARS之基質之N-甲基胺基酸之密碼子的編碼為胜肽序列的 模板DNA庫之步驟，F)從步驟E)之該模板DNA庫提供mRNA庫之步驟，G)使步驟F)之該mRNA庫之3'末端與間隙子鍵結之步驟，H)於步驟D)之該無細胞轉譯系，加入步驟G)之該間隙子鍵結之mRNA庫並轉譯，而提供環化前胜肽化合物-mRNA複合體展示庫之步驟，I)使胜肽去甲醯基酶、甲硫胺酸胺基肽酶作用於步驟H)之該資料庫之步驟，以及J)形成環狀結構之步驟。
  35. 如申請專利範圍第34項之方法，更包括步驟H)或步驟I)之後，以黏合於該mRNA庫之3’區域的引子合成cDNA之步驟。
  36. 如申請專利範圍第34或35項之方法，更包括以下1或多數步驟：J)以淘選濃縮mRNA庫中與藥物標的鍵結的序列之步驟，K)以反轉錄酶合成cDNA之步驟，以及L)解析該鹼基序列之步驟。
  37. 一種建構藉由將N末端胺基酸不同之多種胜肽同時轉譯而能獲得之環化部位之結構不同之醯胺環化胜肽資料庫之方法，包括以下1或多數步驟：A)提供將化合物C-1、化合物C-2或化合物C-3予以胺基醯基化而得之pdCpA之步驟，
    Figure 107130626-A0305-02-1303-18
     B)提供3’末端之CA欠缺之tRNA之步驟，C)使步驟A)之該pdCpA與前述步驟B)之該tRNA連結，提供將化合物C-1、化合物C-2或化合物C-3予以胺基醯基化而得之開始tRNA之步驟，D)提供包含步驟C)之該tRNA之無細胞轉譯系之步驟，E)提供於啟動子之下游具有轉譯開始ATG之正後的甘胺酸、丙胺酸、苯丙胺酸中任意者的密碼子、步驟C)之該tRNA之反密碼子對應之密碼子，其3'側具有在中途包含成為脯胺酸或其他ARS之基質之N-甲基胺基酸之密碼子之編碼為胜肽序列之模板DNA庫之步驟，F)從步驟E)之該模板DNA庫提供mRNA庫之步驟，G)使步驟F)之該mRNA庫之3'末端與間隙子鍵結之步驟，H)於步驟D)之無細胞轉譯系，加入步驟G)之間隙子鍵結之mRNA庫並轉譯，而提供環化前胜肽化合物-mRNA複合體展示庫之步驟，I)使胜肽去甲醯基酶、甲硫胺酸 胺基肽酶作用於步驟H)之該資料庫之步驟，以及J)形成環狀結構之步驟。
  38. 如申請專利範圍第37項之方法，更包括步驟H)或步驟I)之後，以黏合於該mRNA庫之3’區域的引子合成cDNA之步驟。
  39. 如申請專利範圍第37或38項之方法，更包括以下1或多數步驟：J)以淘選濃縮mRNA庫中與藥物標的鍵結的序列之步驟，K)以反轉錄酶合成cDNA之步驟，以及L)解析該鹼基序列之步驟。
  40. 一種建構藉由將N末端胺基酸不同之多種胜肽同時轉譯而能獲得之環化部位之結構不同之醯胺環化胜肽資料庫之方法，包括以下1或多數步驟：A)提供將Asp(SBn)予以胺基醯基化而得之pdCpA之步驟，B)提供3’末端之CA欠缺之tRNA之步驟，C)使步驟A)之該pdCpA與前述步驟B)之該tRNA連結，提供將Asp(SBn)予以胺基醯基化而得之開始tRNA之步驟，D)提供包含步驟C)之該tRNA之無細胞轉譯系之步驟，E)提供於啟動子之下游具有步驟C)之該tRNA之反密碼子對應之密碼子、其3'側在中途含有成為脯胺酸或其他ARS之基質之N-甲基胺基酸之密碼子之編碼為胜肽序列的模板DNA庫之步驟，F)從步驟E)之該模板DNA庫提供mRNA庫之步驟，G)使步驟F)之該mRNA庫之3'末端與間隙子鍵結之步驟，H)於步驟D)之該無細胞轉譯系，加入步驟G)之該間隙子 鍵結之mRNA庫並轉譯，而提供環化前胜肽化合物-mRNA複合體展示庫之步驟，I)使胜肽去甲醯基酶、甲硫胺酸 胺基肽酶作用於步驟H)之資料庫之步驟，以及J)形成環狀結構之步驟。
  41. 如申請專利範圍第40項之方法，更包括步驟H)或步驟I)之後，以黏合於該mRNA庫之3’區域的引子合成cDNA之步驟。
  42. 如申請專利範圍第40或41項之方法，更包括以下1或多數步驟：J)以淘選濃縮mRNA庫中與藥物標的鍵結的序列之步驟，K)以反轉錄酶合成cDNA之步驟，以及L)解析該鹼基序列之步驟。
  43. 一種建構環狀分支胜肽庫之方法，包括以下1或多數步驟：A)提供將化合物N-1或化合物N-2予以胺基醯基化而得之pdCpA之步驟，
    Figure 107130626-A0305-02-1305-19
     (式中，R1表示氫原子、S-R23(R23表示可具有取代基之烷基、芳基或芳烷基)、或HS基之保護基；R2、R3各自獨立地表示氫原子、或可具有取代基之烷基、 烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基或環烷基；或R2與R3表示形成環之取代基、或R2或R3表示與R4形成環之取代基；R4表示可具有取代基之伸烷基、可具有取代基之伸芳基或可具有取代基之2價之芳烷基；R11、R12各自獨立地表示單鍵、可具有取代基之伸烷基、可具有取代基之伸芳基或可具有取代基之2價芳烷基)，B)提供3’末端之CA欠缺之開始tRNA之步驟，C)使步驟A)之該pdCpA與步驟B)之該開始tRNA連結，提供將化合物N-1或化合物N-2予以胺基醯基化而得之開始tRNA之步驟，D)提供將化合物C-1予以胺基醯基化而得之pdCpA，
    Figure 107130626-A0305-02-1306-20
     (式中，R25表示OH、鹵素原子、OR、或SR1(R表示Bt、At、NSu或Pfp，R1表示氫原子、可具有取代基之烷基、可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之環烷基、可具有取代基之雜芳基、可具有取代基之烯基、可具有取代基之伸烷基)；R26表示可具有取代基之伸烷基、可具有取代基之伸芳基或 可具有取代基之2價之芳烷基；R2、R3各自獨立地表示氫原子或可具有取代基之烷基)。 E)提供3’末端之CA欠缺之tRNA之步驟，F)使步驟D)之該pdCpA與步驟E)之該tRNA連結，提供將化合物C-1予以胺基醯基化而得之tRNA之步驟，G)提供包含步驟C)之該開始tRNA與步驟F)之該tRNA、不含甲硫胺酸、甲硫胺醯基tRNA合成酵素(MetRS)、甲硫胺酸用轉譯開始tRNA、甲醯基提供者、甲硫胺醯基tRNA轉移酶中之任一者之無細胞轉譯系之步驟，H)提供於啟動子之下游具有步驟C)之該轉譯開始tRNA之反密碼子對應之密碼子作為第1位密碼子，且於其下游具有以HOGly之密碼子與離胺酸之密碼子夾持的0個至2個任意之密碼子(較丙胺酸更為N末端側)，又，其下游之步驟F)之該tRNA之反密碼子對應之密碼子、化合物N-1或化合物N-2之SH基受保護之情形，其3'側包含成為脯胺酸或其他ARS之基質之N-甲基胺基酸之密碼子的編碼為胜肽序列之模板DNA庫之步驟，I)從步驟H)之該模板DNA庫提供mRNA庫之步驟，J)使步驟I)之該mRNA庫之3’末端與間隙子鍵結之步驟，K)步驟J)之該無細胞轉譯系已有步驟J)之該間隙子鍵結之mRNA庫並轉譯，而提供環化前胜肽化合物-mRNA複合體展示庫之步驟，L)形成環之步驟， M)使由HOGly及正前之N末端側之胺基酸形成之酯活化而生成硫酯之步驟，以及N)使與離胺酸側鏈胺基形成醯胺鍵而生成直鏈部位2之步驟。
  44. 如申請專利範圍第43項之方法，更包括步驟J)之後，以黏合於該mRNA庫之3’區域的引子合成cDNA之步驟。
  45. 如申請專利範圍第43或44項之方法，更包括以下1或多數步驟：O)以淘選濃縮mRNA庫中與藥物標的鍵結的序列之步驟，P)以反轉錄酶合成cDNA之步驟，以及Q)解析該鹼基序列之步驟。
  46. 一種建構環狀分支胜肽庫之方法，包括以下1或多數步驟：A)提供將化合物N-1或化合物N-2予以胺基醯基化而得之pdCpA之步驟，
    Figure 107130626-A0305-02-1308-21
     (式中，R1表示氫原子、S-R23(R23表示可具有取代基之烷基、芳基或芳烷基)、或HS基之保護基；R2、R3各自獨立地表示氫原子、或可具有取代基之烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基或環烷基；或R2與R3表示形成環之取代基、或R2或R3表示與R4形成環之 取代基；R4表示可具有取代基之伸烷基、可具有取代基之伸芳基或可具有取代基之2價之芳烷基；R11、R12各自獨立地表示單鍵、可具有取代基之伸烷基、可具有取代基之伸芳基或可具有取代基之2價芳烷基)，B)提供3’末端之CA欠缺之tRNA之步驟，C)使步驟A)之該pdCpA與步驟B)之該tRNA連結，提供將化合物N-1或化合物N-2予以胺基醯基化而得之tRNA之步驟，D)提供將化合物C-1予以胺基醯基化而得之pdCpA之步驟，
    Figure 107130626-A0305-02-1309-22
     (式中，R25表示OH、鹵素原子、OR、或SR1(R表示Bt、At、NSu或Pfp，R1表示氫原子、可具有取代基之烷基、可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之環烷基、可具有取代基之雜芳基、可具有取代基之烯基、可具有取代基之伸烷基)；R26表示可具有取代基之伸烷基、可具有取代基之伸芳基或可具有取代基之2價之芳烷基； R2、R3各自獨立地表示氫原子或可具有取代基之烷基)，E)提供3’末端之CA欠缺之tRNA之步驟，F)使步驟D)之該pdCpA與步驟E)之該tRNA連結，提供將化合物C-1予以胺基醯基化而得之tRNA之步驟，G)提供包含步驟C)之該tRNA與步驟F)之該tRNA與乳酸之無細胞轉譯系之步驟，H)提供編碼為胜肽序列之模板DNA庫，其於啟動子之下游，具有步驟C)之該tRNA之反密碼子對應之密碼子作為第2位密碼子，並於其下游具有半胱胺酸、脯胺酸、與乳酸相應之密碼子，並於其下游包含離胺酸之密碼子，再於其下游具有與步驟F)之該tRNA之反密碼子對應之密碼子，化合物N-1或化合物N-2之SH基經保護之情形，其3'側包含成為脯胺酸或其他ARS之基質之N-甲基胺基酸之密碼子之步驟，I)從步驟H)之該模板DNA庫提供mRNA庫之步驟，J)使步驟I)之該mRNA庫之3’末端與間隙子鍵結之步驟，K)於步驟J)之該無細胞轉譯系，加入步驟J)之該間隙子鍵結之mRNA庫並轉譯，而提供環化前胜肽化合物-mRNA複合體展示庫之步驟，L)形成環之步驟，M)從半胱胺酸、脯胺酸、乳酸部位產生活性硫酯之步驟，以及N)使生成之活性硫酯與離胺酸側鏈胺基形成醯胺鍵，並 生成直鏈部位2，再實施脫硫反應之步驟。
  47. 如申請專利範圍第46項之方法，更包括步驟J)之後，以黏合於該mRNA庫之3’區域的引子合成cDNA之步驟。
  48. 如申請專利範圍第46或47項之方法，更包括以下1或多數步驟：O)以淘選濃縮mRNA庫中與藥物標的鍵結的序列之步驟，P)以反轉錄酶合成cDNA之步驟，以及Q)解析該鹼基序列之步驟。
  49. 一種建構環狀分支胜肽庫之方法，包括以下1或多數步驟：A)提供將化合物N-1或化合物N-2予以胺基醯基化而得之pdCpA之步驟，
    Figure 107130626-A0305-02-1311-23
     (式中，R1表示氫原子、S-R23(R23表示可具有取代基之烷基、芳基或芳烷基)、或HS基之保護基；R2、R3各自獨立地表示氫原子、或可具有取代基之烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基或環烷基；或R2與R3表示形成環之取代基、或R2或R3表示與R4形成環之取代基；R4表示可具有取代基之伸烷基、可具有取代基之伸芳基或可具有取代基之2價之芳烷基； R11、R12各自獨立地表示單鍵、可具有取代基之伸烷基、可具有取代基之伸芳基或可具有取代基之2價芳烷基)，B)提供3’末端之CA欠缺之tRNA之步驟，C)使步驟A)之該pdCpA與步驟B)之該tRNA連結，提供將化合物N-1或化合物N-2予以胺基醯基化而得之tRNA之步驟，D)提供將化合物C-1予以胺基醯基化而得之pdCpA之步驟，
    Figure 107130626-A0305-02-1312-24
     (式中，R25表示OH、鹵素原子、OR、或SR1(R表示Bt、At、NSu或Pfp，R1表示氫原子、可具有取代基之烷基、可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之環烷基、可具有取代基之雜芳基、可具有取代基之烯基、可具有取代基之伸烷基)；R26表示可具有取代基之伸烷基、可具有取代基之伸芳基或可具有取代基之2價之芳烷基；R2、R3各自獨立地表示氫原子或可具有取代基之烷基)，E)提供3’末端之CA欠缺之tRNA之步驟，F)使步驟D)之該pdCpA與步驟E)之該tRNA連結，提供 將化合物C-1予以胺基醯基化而得之tRNA之步驟，G)提供包含步驟C)之該tRNA與步驟F)之該tRNA與乳酸之無細胞轉譯系之步驟，H)提供編碼為胜肽序列之模板DNA庫，其於啟動子之下游具有步驟C)之該tRNA之反密碼子對應之密碼子作為第2位密碼子，並於其下游具有半胱胺酸、脯胺酸、與乳酸相連之密碼子，於其下游具有離胺酸之密碼子，再於其下游具有步驟F)之該tRNA之反密碼子對應之密碼子、其3'側具有成為脯胺酸或其他ARS之基質之N-甲基胺基酸之密碼子之步驟，I)從步驟H)之該模板DNA庫提供mRNA庫之步驟，J)使步驟I)之該mRNA庫之3’末端與間隙子鍵結之步驟，K)於步驟J)之該無細胞轉譯系，加入步驟J)之該間隙子鍵結之mRNA庫並轉譯，而提供環化前胜肽化合物-mRNA複合體展示庫之步驟，L)使胜肽去甲醯基酶、甲硫胺酸 胺基肽酶作用於步驟K)之該資料庫之步驟，M)形成環狀結構之步驟，N)從半胱胺酸、脯胺酸、乳酸單元產生活性硫酯，以及O)將生成之羧酸活性酯化，使與離胺酸側鏈胺基形成醯胺鍵，而生成直鏈部位2，再視需要進行脫硫反應之步驟。
  50. 如申請專利範圍第49項之方法，更包括步驟J)之後，以黏合於該mRNA庫之3’區域的引子合成cDNA之步驟。
  51. 如申請專利範圍第49或50項之方法，更包括以下1或多 數步驟：P)以淘選濃縮mRNA庫中與藥物標的鍵結的序列之步驟，P)以反轉錄酶合成cDNA之步驟，以及Q)解析該鹼基序列之步驟。
  52. 一種建構環狀分支胜肽庫之方法，包括以下1或多數步驟：A)提供化合物C-1予以胺基醯基化而得之pdCpA之步驟，
    Figure 107130626-A0305-02-1314-25
     (式中，R25表示OH、鹵素原子、OR、或SR1(R表示Bt、At、NSu或Pfp，R1表示氫原子、可具有取代基之烷基、可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之環烷基、可具有取代基之雜芳基、可具有取代基之烯基、可具有取代基之伸烷基)；R26表示可具有取代基之伸烷基、可具有取代基之伸芳基或可具有取代基之2價之芳烷基；R2、R3各自獨立地表示氫原子或可具有取代基之烷基)，E)提供3’末端之CA欠缺之tRNA之步驟，F)使步驟D)之該pdCpA與步驟E)之該tRNA連結，提供將化合物C-1予以胺基醯基化而得之tRNA之步驟， G)提供包含步驟C)之該tRNA與步驟F)之該tRNA與乳酸之無細胞轉譯系之步驟，H)提供編碼為胜肽序列之模板DNA庫，其於啟動子之下游，具有半胱胺酸密碼子作為第2番位密碼子，並於其下游具有半胱胺酸、脯胺酸、與乳酸相連之密碼子、及經保護之胺化合物Na-4之密碼子，並於其下游具有步驟F)之該tRNA之反密碼子對應之密碼子、其3'側包含成為脯胺酸或其他ARS之基質之N-甲基胺基酸之密碼子之步驟，
    Figure 107130626-A0305-02-1315-26
     I)從步驟H)之該模板DNA庫提供mRNA庫之步驟，J)使步驟I)之該mRNA庫之3’末端與間隙子鍵結之步驟，K)於步驟J)之該無細胞轉譯系，加入步驟J)之該間隙子鍵結之mRNA庫並轉譯，而提供環化前胜肽化合物-mRNA複合體展示庫之步驟，L)形成環之步驟，M)使化合物Na-4之側鏈胺基脫保護、及從半胱胺酸、脯胺酸、乳酸單元產生活性硫酯之步驟，以及N)使生成之活性硫酯與化合物Na-4之側鏈胺基形成醯胺鍵，使直鏈部位2生成之步驟。
  53. 如申請專利範圍第52項之方法，更包括步驟J)之後，以黏 合於該mRNA庫之3’區域的引子合成cDNA之步驟。
  54. 如申請專利範圍第52或53項之方法，更包括以下1或多數步驟：O)以淘選濃縮mRNA庫中與藥物標的鍵結的序列之步驟，P)以反轉錄酶合成cDNA之步驟，以及Q)解析該鹼基序列之步驟。
  55. 一種建構環狀分支胜肽庫之方法，包括以下1或多數步驟：A)提供將化合物N-1或化合物N-2予以胺基醯基化而得之pdCpA之步驟，
    Figure 107130626-A0305-02-1316-27
     (式中，R1表示氫原子、S-R23(R23表示可具有取代基之烷基、芳基或芳烷基)、或HS基之保護基；R2、R3各自獨立地表示氫原子、或可具有取代基之烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基或環烷基；或R2與R3表示形成環之取代基、或R2或R3表示與R4形成環之取代基；R4表示可具有取代基之伸烷基、可具有取代基之伸芳基或可具有取代基之2價之芳烷基；R11、R12各自獨立地表示單鍵、可具有取代基之伸烷基、可具有取代基之伸芳基或可具有取代基之2價芳烷基)， B)提供3’末端之CA欠缺之tRNA之步驟，C)使步驟A)之該pdCpA與步驟B)之該tRNA連結，提供將化合物N-1或化合物N-2予以胺基醯基化而得之tRNA之步驟，D)提供將化合物C-1予以胺基醯基化而得之pdCpA之步驟，
    Figure 107130626-A0305-02-1317-28
     (式中，R25表示OH、鹵素原子、OR、或SR1(R表示Bt、At、NSu或Pfp，R1表示氫原子、可具有取代基之烷基、可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之環烷基、可具有取代基之雜芳基、可具有取代基之烯基、可具有取代基之伸烷基)；R26表示可具有取代基之伸烷基、可具有取代基之伸芳基或可具有取代基之2價之芳烷基；R2、R3各自獨立地表示氫原子或可具有取代基之烷基)，E)提供3’末端之CA欠缺之tRNA之步驟，F)使步驟D)之該pdCpA與步驟E)之該tRNA連結，提供將化合物C-1予以胺基醯基化而得之tRNA之步驟，G)提供將胺基及視需要硫醇基經保護之化合物Na-4或化 合物Na-10(Na-7基)或化合物Na-11(Na-7基)予以胺基醯基化而得之pdCpA之步驟，
    Figure 107130626-A0305-02-1318-29
     H)提供3’末端之CA欠缺之tRNA之步驟，I)使步驟G)之該pdCpA與步驟H)之該tRNA連結，提供將胺基及視需要硫醇基亦經保護之化合物Na-4或化合物Na-10(Na-7基)或化合物Na-11(Na-7基)予以胺基醯基化而得之tRNA之步驟，J)提供包含步驟C)之該tRNA與步驟F)之該tRNA與步驟I)之該tRNA之無細胞轉譯系之步驟，K)提供編碼為胜肽序列之模板DNA庫，其在啟動子之下游，具有步驟C)之該tRNA之反密碼子對應之密碼子作為第2位密碼子，及其下游之Cys、Pro、乳酸之tRNA之反密碼子對應之密碼子、於其下游具有步驟G)之該tRNA之反密碼子對應之密碼子，再於其下游包含步驟D)之該tRNA之反密碼子對應之密碼子、其3'側包含成為脯胺酸或其他ARS之基質之N-甲基胺基酸之密碼子之步驟， L)從步驟K)之該模板DNA庫提供mRNA庫之步驟，M)使步驟L)之該mRNA庫之3’末端與間隙子鍵結之步驟，N)於步驟M)之該無細胞轉譯系，加入步驟J)之該間隙子鍵結之mRNA庫並轉譯，而提供環化前胜肽化合物-mRNA複合體展示庫之步驟，O)使胜肽去甲醯基酶、甲硫胺酸 胺基肽酶作用於步驟K)之該資料庫之步驟，P)形成環狀結構之步驟，Q)將胺基及視需要硫醇基亦經保護之化合物Na-4或化合物Na-10(Na-7基)或化合物Na-11(Na-7基)予以脫保護之步驟，以及R)生成直鏈部位2之步驟。
  56. 如申請專利範圍第55項之方法，更包括步驟J)之後，以黏合於該mRNA庫之3’區域的引子合成cDNA之步驟。
  57. 如申請專利範圍第55或56項之方法，更包括以下1或多數步驟：S)以淘選濃縮mRNA庫中與藥物標的鍵結的序列之步驟，T)以反轉錄酶合成cDNA之步驟，以及U)解析該鹼基序列之步驟。
  58. 一種(i)利用在N末端具有甲硫胺酸以外之胺基酸之胜肽之環化建構環狀分支胜肽庫之方法或(ii)藉由將N末端胺基酸不同之多種胜肽同時轉譯而得到之建構環化部位之結構不同之醯胺環化胜肽資料庫之方法，包括以下1或多數步驟： A)提供將化合物C-1予以胺基醯基化而得之pdCpA之步驟，
    Figure 107130626-A0305-02-1320-30
     (式中，R25表示OH、鹵素原子、OR、或SR1(R表示Bt、At、NSu或Pfp，R1表示氫原子、可具有取代基之烷基、可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之環烷基、可具有取代基之雜芳基、可具有取代基之烯基、可具有取代基之伸烷基)；R26表示可具有取代基之伸烷基、可具有取代基之伸芳基或可具有取代基之2價之芳烷基；R2、R3各自獨立地表示氫原子或可具有取代基之烷基)，B)提供3’末端之CA欠缺之tRNA之步驟，C)使步驟A)之該pdCpA與步驟B)之該tRNA連結，提供將化合物C-1予以胺基醯基化而得之tRNA之步驟，D)提供將化合物之胺基及視需要硫醇基亦經保護之化合物Na-4或化合物Na-10(Na-7基)或化合物Na-11(Na-7基)予以胺基醯基化而得之pdCpA之步驟，
    Figure 107130626-A0305-02-1321-31
     E)提供3’末端之CA欠缺之tRNA之步驟，F)使步驟D)之該pdCpA與步驟E)之該tRNA連結，提供將胺基及視需要硫醇基經保護之化合物Na-4或化合物Na-10(Na-7基)或化合物Na-11(Na-7基)予以胺基醯基化而得之tRNA之步驟，G)提供包含步驟C)之該tRNA與步驟F)之該tRNA與步驟I)之該tRNA之無細胞轉譯系之步驟，H)提供編碼為胜肽序列之模板DNA庫，其於啟動子之下游，具有步驟F)之該tRNA之反密碼子對應之密碼子、於其下游具有Cys、Pro、乳酸之tRNA之反密碼子對應之密碼子、更於其下游具有步驟C)之該tRNA之反密碼子對應之密碼子、其3'側具有成為脯胺酸或其他ARS之基質之N-甲基胺基酸之密碼子之步驟，I)從步驟H)之該模板DNA庫提供mRNA庫之步驟，J)使步驟I)之該mRNA庫之3’末端與間隙子鍵結之步驟，K)於步驟J)之該無細胞轉譯系，加入步驟J)之該間隙子 鍵結之mRNA庫並轉譯，而提供環化前胜肽化合物-mRNA複合體展示庫之步驟，L)使胜肽去甲醯基酶、甲硫胺酸 胺基肽酶作用於步驟K)之該資料庫之步驟，L)形成環狀結構之步驟，M)將胺基及視需要硫醇基經保護之化合物Na-4或化合物Na-10(Na-7基)或化合物Na-11(Na-7基)予以脫保護之步驟，以及N)生成直鏈部位2之步驟。
  59. 如申請專利範圍第58項之方法，更包括步驟J)之後，以黏合於該mRNA庫之3’區域的引子合成cDNA之步驟。
  60. 如申請專利範圍第58或59項之方法，更包括以下1或多數步驟：O)以淘選濃縮mRNA庫中與藥物標的鍵結的序列之步驟，P)以反轉錄酶合成cDNA之步驟，以及Q)解析該鹼基序列之步驟。
  61. 一種(i)利用在N末端具有甲硫胺酸以外之胺基酸之胜肽之環化建構環狀分支胜肽庫之方法或(ii)藉由將N末端胺基酸不同之多種胜肽同時轉譯而得到之建構環化部位之結構不同之醯胺環化胜肽資料庫之方法，包括以下1或多數步驟：A)提供將化合物C-1予以胺基醯基化而得之pdCpA之步驟，
    Figure 107130626-A0305-02-1323-32
     (式中，R25表示OH、鹵素原子、OR、或SR1(R表示Bt、At、NSu或Pfp，R1表示氫原子、可具有取代基之烷基、可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之環烷基、可具有取代基之雜芳基、可具有取代基之烯基、可具有取代基之伸烷基)；R26表示可具有取代基之伸烷基、可具有取代基之伸芳基或可具有取代基之2價之芳烷基；R2、R3各自獨立地表示氫原子或可具有取代基之烷基)，B)提供3’末端之CA欠缺之tRNA之步驟，C)使步驟A)之該pdCpA與步驟B)之該tRNA連結，提供將化合物C-1予以胺基醯基化而得之tRNA之步驟，D)提供將化合物胺基及視需要硫醇基經保護之化合物Na-4或化合物Na-10(Na-7基)或化合物Na-11(Na-7基)予以胺基醯基化而得之pdCpA之步驟，
    Figure 107130626-A0305-02-1324-33
     E)提供3’末端之CA欠缺之tRNA之步驟，F)使步驟D)之該pdCpA與步驟E)之該tRNA連結，提供將化合物胺基及視需要硫醇基亦經保護之化合物Na-4或化合物Na-10(Na-7基)或化合物Na-11(Na-7基)予以胺基醯基化而得之tRNA之步驟，G)提供包含步驟C)之該tRNA與步驟F)之該tRNA與乳酸之無細胞轉譯系之步驟，H)提供編碼為胜肽序列之模板DNA庫，其於啟動子之下游具有步驟C)之該tRNA之反密碼子對應之密碼子作為第2位密碼子，並於其下游具有半胱胺酸、脯胺酸、與乳酸相應之密碼子，更於其下游具有步驟F)之該tRNA之反密碼子對應之密碼子、其3'側具有成為脯胺酸或其他ARS之基質之N-甲基胺基酸之密碼子之步驟，I)從步驟H)之該模板DNA庫提供mRNA庫之步驟，J)使步驟I)之該mRNA庫之3’末端與間隙子鍵結之步驟，K)於步驟J)之該無細胞轉譯系，加入步驟J)之該間隙子 鍵結之mRNA庫並轉譯，而提供環化前胜肽化合物-mRNA複合體展示庫之步驟，L)使胜肽去甲醯基酶、甲硫胺酸 胺基肽酶作用於步驟K)之該資料庫之步驟，M)形成環狀結構之步驟，N)使化合物Na-4或化合物Na-10(Na-7基)或化合物Na-11(Na-7基)之側鏈保護基脫保護、及從Cys、Pro、乳酸單元產生活性硫酯之步驟，以及O)使生成之活性硫酯化與側鏈胺基形成醯胺鍵，使直鏈部位2生成之步驟。
  62. 如申請專利範圍第61項之方法，更包括步驟J)之後，以黏合於該mRNA庫之3’區域的引子合成cDNA之步驟。
  63. 如申請專利範圍第61或62項之方法，更包括以下1或多數步驟：P)以淘選濃縮mRNA庫中與藥物標的鍵結的序列之步驟，Q)以反轉錄酶合成cDNA之步驟，以及R)解析該鹼基序列之步驟。
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