DE19942624A1

DE19942624A1 - Verfahren zur Herstellung von zyklischen Peptidomimetika

Info

Publication number: DE19942624A1
Application number: DE19942624A
Authority: DE
Inventors: Dirk Scharn; Lothar Germeroth; Holger Wenschuh
Original assignee: CHEMOTOPIX GmbH
Current assignee: CHEMOTOPIX GmbH
Priority date: 1999-08-28
Filing date: 1999-08-28
Publication date: 2001-03-08
Also published as: AU7506100A; JP2003508408A; EP1212351A1; WO2001016162A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Synthese von zyklischen Peptiden oder Peptidomimetika durch sequentielle nukleophile Substitutionen an mehrfachhalogenierten Aromaten. Das Verfahren besitzt die folgenden Schritte: DOLLAR A (i) ein lineares Peptid oder Peptidomimetikum mit einer freien nukleophilen Funktionalität, DOLLAR A wobei die nukleophile Funktionalität ein Alkohol, Thiol oder Amin ist, DOLLAR A wird mit dem Aromaten im Sinne einer einfachen nukleophilen aromatischen Substitution umgesetzt, DOLLAR A (ii) die Schutzgruppe einer weiteren nukleophilen Funktionalität am gleichen Peptid oder Peptidomimetikum wird selektiv gespalten, DOLLAR A wobei die freigesetzte nukleophile Funktionalität ein Alkohol, Thiol oder Amin ist, und DOLLAR A (iii) Zyklisierung durch Zusetzen eines tertiären Amins oder einer anderen Base, DOLLAR A wobei die Zyklisierung durch nukleophile aromatische Substitution eines weiteren Halogenatoms des am Peptid-gebundenen Halogen-Aromaten durch die freigesetzte nukleophile Funktionalität erfolgt.

Description

Nahezu alle biochemischen Prozesse basieren auf spezifischen molekularen Erkennungen zwischen Peptiden oder Proteinen und anderen biologisch aktiven Molekülen. In den vergangenen 20 Jahren sind eine Vielzahl solcher Peptide entdeckt worden, die unter anderem als Hormone, Enzyminhibitoren, Enzymsubstraten, Neurotransmittern und Immunmodulatoren bedeutende biologische Funktionen besitzen.

Demzufolge sind umfangreiche Studien durchgeführt worden, um die physiologischen Effekte dieser peptidischen Wirkstoffe zu verstehen und neue peptidische Therapeutika zu entwickeln.

Leider sind die klinischen Anwendungsmöglichkeiten von Peptiden aus folgenden Gründen eingeschränkt:

a) Unter physiologischen Bedingungen werden Peptide durch viele spezifische und unspezifische Peptidasen abgebaut.
b) Peptide werden nur mäßig absorbiert und schnell wieder ausgeschieden.
c) Die konformationelle Flexibilität von Peptiden kann zur Bindung an mehr als einem Rezeptor und somit zu unerwünschten Nebeneffekten führen.
d) Peptide können immunogen sein.

Zahlreiche chemisch synthetische Modifikationen an Peptiden sind beschrieben worden, diese unvorteilhaften Eigenschaften zu umgehen. Neben dem Einbau von konformationell eingeschränkten Aminosäure Derivaten wie Cα-Alkylaminosäuren, Nα- Alkylaminosäuren, α,β-ungesättigten Aminosäuren und D-Aminosäuren [DeGrado, W. F. In: Advances in Protein Chemistry, Academic Press 1988], der Modifikation des Peptidrückgrates durch Amidbindungsisostere, der Synthese von nichtpeptidischen Analoga und der Verknüpfung von Pharmakophoren mit geeigneten Templaten, hat sich vor altem die Zyklisierung des Peptidrückgrates als sehr effektiver Ansatz im Design von peptidomimetischen Therapeutika erwiesen [Ladner, C. L. TIBTECH 1995, 13, 426).

Die resultierenden konformationell eingeschränkten Peptidanaloga können nicht nur zu einer erhöhten Avidität und Affinität zum Rezeptor führen [Ladner, C. L. TIBTECH 1995, 13, 426] sondern auch eine deutlich reduzierte Labilität gegenüber Proteasen und eine signifikant erhöhte Membrangängigkeit besitzen [Hruby, V. J. et al. Life Sci. 1982, 31, 189].

In den letzten Jahren wurden etliche Strategien beschrieben, die zu solchen zyklischen Peptiden führen. Besonders interessant sind dabei Verfahren, die mittels Festphasensynthesestrategie [Merrifield, R. B.; J. Am. Chem. Soc. 1963, 85, 2149] die Herstellung der zyklischen Zielverbindungen ermöglichen. Der Vorteil dieser Methode ist auf die sogenannte Pseudoverdünnung zurückzuführen, ein kinetisches Phänomen, das intramolekulare Reaktionen gegenüber intermolekularen Nebenreaktionen begünstigt. Zusätzlich kann durch die Verwendung überschüssiger löslicher Reagenzien die Zyklisierungsreaktion begünstigt werden, wobei die Methodik leicht zu automatisieren ist und biologische Testsysteme auch direkt an den polymeren Oberflächen anwendbar sind [Jakubke, H. D. In: Peptide: Chemie und Biologie, Spektrum Akad. Verlag Heidelberg, Berlin, Oxford, 1996].

Die Ringschlußreaktion bei Peptiden ist je nach verwendeter Prozedur in verschiedenen Richtungen möglich. Die folgenden Zyklisierungsvarianten sind untersucht worden: "Kopf zu Schwanz", "Kopf (Schwanz) zu Seitenkette", "Seitenkette zu Seitenkette", "Kopf (Schwanz) zu Rückgrat", "Rückgrat zu Rückgrat" und "Rückgrat zu Seitenkette" und die entsprechenden entgegengesetzten Richtungen [Gilon, C. et al. Biopolymers 1991, 31, 745] (Fig. 1).

Dabei ist eine Vielzahl von Strukturen publiziert worden, die als "Brückenglieder" in der Synthese von zyklischen Peptiden und Peptidomimetika fungieren können. Die am weitesten verbreiteten Zyklisierungsarten sind die Amidverknüpfung (Laktambildung) sowie der Ringschluß über Lakton-, Thioether-, Dithioether-, Urethan-, Disulfid,- und Methylaminbrücken [Hruby, V. J. et al. Biochem. J. 1990, 268, 249 und dort zitierte Referenzen].

Obwohl als effektiver Ansatz zur Entwicklung neuer Leitstrukturen beschrieben [Kieber- Emmons, T. et al. Current Opinion in Biotechnology 1997, 8, 435], ist dagegen nur wenig über Zyklisierungstechniken bekannt, die zu zyklischen Peptidomimetika mit inkorporierten aromatischen und heteroaromatischen Resten führen. Die wenigen Beispiele beinhalten die Zyklisierung über den Einbau von aromatischen Systemen wie Aminobenzoesäure [Endo, K. und Takahashi, H. Heterozykles 1999, 51, 337], Bis(bromomethyl)arenen [Adrian, F. et al. Tetrahedron Lett. 1999, 40, 1039], Arylethern [Zhu, J. In: Methods in Molecular Medicine, Vol 23, Peptidomimetic Protocols, Humana Press, NJ, 1999], Tyrosin [Reid, C. R. et al., J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 8511] und 2- Fluoro-5-nitrobenzoesäure [Feng, Y. J. et al. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 10768) direkt in das Rückgrat der Peptide.

Weiterhin wurde kürzlich von zyklischen Peptiden mit im Rückgrat inkorporierten 1,3,5- Triazinen berichtet (D. A. Schefter et al. In: Programm and Abstract, 16 m American Peptide Symposium, Minneapolis, 1999, p 345). Diese Triazine wurden jedoch nicht mittels nukleophiler Substitutionsreaktion in das Rückrat der Peptide eingeführt, sondern es wurden zunächst in aufwendigen Reaktionen Fmoc - geschützte 1,3,5- Triazin - Aminosäuren als Bausteine generiert, die dann mittels klassischer Peptidkupplungschemie in das Peptidrückgrat eingefügt wurden. Darüber hinaus waren die 1,3,5 - Triazine nicht an der eigentlichen Zyklisierungsreaktion beteiligt. Auch diese wurde wiederum mittels klassischer Peptidkupplungschemie unter Bildung von Lactamen durchgeführt.

Obwohl diese Methoden zu interessanten zyklischen Verbindungen führen, besteht ausgehend vom jetzigen Stand der Technik zweifellos großes Interesse an neuen Verfahren, die die bisherigen Möglichkeiten zur Herstellung neVer zyklischer Peptidomimetika mit inkorporierten aromatischen Resten ergänzen.

Aufgabe und Lösung

Es stellt sich die Aufgabe, Peptide bzw. Peptidomimetika herzustellen, die die zuvor genannten nachteiligen Eigenschaften von Peptiden für klinische Anwendungen nicht mehr aufweisen. Dazu sollen zyklische Peptide und Peptidomimetika synthetisiert werden, deren Rückgrat durch aromatische bzw. heteroaromatische Reste modifiziert ist.

Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Synthese von zyklischen Peptiden oder Peptidomimetika durch sequentielle nukleophile Substitutionen an mehrfachhalogenierten Aromaten mit der folgenden Formel:

a) 2,4,6--Trihalogeno-S-triazin oder 2,4,6-Trihalogen-1,3, 5-triazin; (vgl. Fig. 10a)
b) 2,4,6,8 - Tetrahalogenopyrimido[5,4-d]pyrimidin; (vgl. Fig. 10b)
c) 2,4,6 - Trihalogeno - pyrimidin; (vgl. Fig. 10c)
d) 2,6,8 - Trihalogeno-7-methyl-7H purin; (vgl. Fig. 10d)
e) 2,4 - Dihalogeno - 6,7 - dimethoxy - quinazolin; (vgl. Fig. 10e)
f) 2,4 - Dihalogeno - pyrimidin; (vgl. Fig. 10f)
g) 2,6,8, - Thrihalogeno - 7H - purin; (vgl. Fig. 10g)
h) 2,4,6,7 - Tetrahalogeno - pteridine; (vgl. Fig. 10h)

dabei steht
Halogen für Chlor, Fluor Jod und Brom, bevorzugt Chlor,
wobei die Reaktion die folgenden Schritte umfaßt:

a) ein lineares Peptid oder Peptidomimetikum mit einer freien nukleophilen Funktionalität,
wobei die nukleophile Funktionalität ein Alkohol, Thiol oder Amin ist, und wobei sich die nukleophile Funktionalität entweder an einem Ende, in der Seitenkette oder am Rückgrat des Peptids oder Peptidomimetikums befindet,
wird mit dem Aromaten im Sinne einer einfachen nukleophilen aromatischen Substitution umgesetzt,
wobei sich das Peptid oder Peptidomimetikum in Lösung oder in einem festphasengebundenen Zustand befindet
b) die Schutzgruppe einer weiteren nukleophilen Funktionalität am gleichen Peptid oder Peptidomimetikum wird selektiv gespalten
wobei die freigesetzte nukleophile Funktionalität ein Alkohol, Thiol oder Amin ist, und
wobei sich die nukleophile Funktionalität entweder an einem Ende, in der Seitenkette oder am Rückgrat des Peptids oder Peptidomimetikums befindet,
c) Zyklisierung durch Zusetzen eines tertiären Amins oder einer anderen Base,
wobei die Zyklisierung durch nukleophile aromatische Substitution eines weiteren Halogenatoms des am Peptid oder Peptidomimetikum - gebundenen Halogen - Aromaten durch die freigesetzte nukleophile Funktionalität erfolgt

Die vorliegende Methode ist aufgrund ihrer breiten Anwendbarkeit und der zusätzlichen Möglichkeit die generierten Zyklen weiter systematisch zu modifizieren ein wertvolles Werkzeug zur Synthese neuer bioaktiver Verbindungen. Die folgende Erfindung beschreibt eine neue vielfältig einsetzbare Prozedur zur Herstellung solcher, bisher nicht beschriebener, konformationell eingeschränkter Verbindungen.

Die Vorzüge der vorliegenden Methode im Vergleich zum Stand der Technik liegen vor allem in der deutlich erhöhten Flexibilität hinsichtlich der zu zyklisierenden Funktionalitäten. So können alle im Peptid oder Peptidomimetikum zur Verfügung stehenden nukleophilen Gruppen an Seitenketten, an den Enden und am Rückgrat intramolekular verknüpft werden. Abgesehen von entsprechenden kommerziell erhältlichen orthogonalen Schutzgruppen müssen keinerlei Veränderungen an den Standardsynthesebedingungen vorgenommen werden. Durch die unterschiedliche Substitutionstendenz der Halogenatome am Aromaten ist es darüber hinaus nicht notwendig, die zur Zyklisierung eingesetzte Verbindung zu modifizieren oder eine der reaktiven Halogene zu schützen. Da die Halogenatome selektiv in Abhängigkeit von den Reaktionsbedingungen reagieren, wird es möglich, die Zyklisierung am Ende der Synthese des Peptids oder Peptidomimetikums in einer zweistufigen Reaktion durchzuführen.

Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei der mehrfachhalogenierte Aromat ein Cyanurchlorid oder fluorid ist. Mehr bevorzugt ist ein Cyanurchlorid.

Vorteilhaft ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, bei dem die verbleibenden Halogenatome in weiteren nukleophilen aromatischen Substitutionsreaktionen umgesetzt werden, wobei das Nukleophil ein Alkohol, ein Thiol oder ein Amin ist.

Dabei kann das Nukleophil Teil desselben Peptids oder Peptidomimetikums sein oder Teil eines anderen Moleküls sein. Dadurch entstehen intramolekular oder intermolekular verknüpfte Verbindungen.

Inhalt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von neuartigen zyklischen Peptidomimetika mittels sukzessiver nukleophiler Substitution an Cyanurchlorid und anderen mehrfachhalogenierten aromatischen Verbindungen.

Erfindungsgemäß werden Peptide oder peptidomimetische Oligomere, die mittels Festphasen- oder Lösungssynthese aufgebaut werden und zunächst nur eine freie nukleophile Funktionalgruppe besüzen mit Cyanurchlorid umgesetzt. Dabei wird die temperaturabhängige Substitutionstendenz der vorhandenen Chloratome ausgenutzt fThurston, J. T. et al. J. Am. Chem. Soc. 1951, 73, 2981]. Die vollständige Reaktion von Amino-, Hydroxy-, oder Thiolfunktionen mit überschüssigem Cyanurchlorid bei Raumtemperatur führt so zunächst ausschließlich zu Dichlor-1,3,5-triazinylpeptiden (Schema 11), ohne daß 1,3,5-Triazin-verbrückte Peptiddimere entstehen. Die selektive Abspaltung einer orthogonalen Schutzgruppe an einer weiteren nukleophilen Funktionalität vorzugsweise einem Amin am Rückgrat oder in der Seitenkette ("Side Chain") ermöglicht die nachfolgende Zyklisierung über die vollständige nukleophile Substitution des zweiten Chloratoms, die ebenfalls bei Raumtemperatur stattfindet. Die intramolekulare Zyklisierung ist dabei gegenüber der intermolekularen Verbrückung klar bevorzugt. In keinem der untersuchten Fälle wurden Verbrückungen beobachtet. (vergleiche Fig. 2)

Vorausgesetzt es stehen mindestens zwei nukleophile Funktionalitäten zur Verfügung wird durch das erfindungsgemäße Verfahren eine große Vielfalt an konformationell eingeschränkten Verbindungen zugänglich.

So kann einerseits durch die Variation der Kettenlänge und der Stellung der nukleophilen Funktionalitäten zueinander sowohl die Ringgröße, als auch das Molekulargewicht schrittweise verändert werden. Andererseits wird es möglich, durch die verschiedenen zur Verfügung stehenden nukleophilen Funktionalgruppen Art und Anzahl der Heteroatome im Ring zu variieren (Fig. 3, Beispiele 1 und 2).

Von besonderem Interesse ist dabei die Möglichkeit auch kleine rigide Ringsysteme mit inkorporierten Aromaten bzw. Heteroaromaten zu generieren. Selbst Zyklen aus Dipeptiden sind effektiv mit hoher Reinheit zu erhalten, wobei durch die Wahl der Seitenkettenlänge, der in die Zyklisierung einbezogenen Aminosäure, die Ringgröße sehr fein abgestimmt werden kann (Beispiel 3B). Dies geschieht nahezu unabhängig von der Natur der nicht in die Zyklisierung einbezogenen Aminosäuren im Ring, vorausgesetzt nukleophile Funktionalitäten sind mit herkömmlichen orthogonalen Schutzgruppen gegenüber dem Angriff des Halogenids geschützt (Beispiel 3A).

Durch die Wahl geeigneter Monomerbausteine und Schutzgruppenstrategien sind alle in Fig. 1 dargestellten Zyklisierungsrichtungen möglich. Neben der Verknüpfung von "Kopf" und "Seitenkette" (Beispiele 1-3), "Kopf" und Schwanz" (Beispiel 7) sowie "Seitenkette" und "Seitenkette" werden nach dem Einbau N - Alkylaminosäuren Peptomere bzw. Peptoide gebildet die auch Zyklisierungen vom oder auf das Rückgrat zulassen (Beispiel 4). Weitere zyklische Peptidomimetika bzw. Hybride aus Peptidomimetika und Peptiden sind problemlos zugänglich vorausgesetzt, es stehen zwei nukleophile Funktionalitäten zur Zyklisierung zur Verfügung und weitere sind orthogonal geschützt (Beispiel 7).

Die zusätzliche Möglichkeit eine weitere nukleophile Substitution am verbleibenden Chloratom durchzuführen und somit die Diversität im Sinne kombinatorisch chemischer Prozesse zu erhöhen, macht die Methode zu einer wertvollen Ergänzung des Methodenrepertoirs gezielt maßgeschneiderte Moleküleigenschaften zu erzeugen. Da die Substitution des verbleibenden Chloratoms höhere Temperaturen oder Mikrowellenassistenz erfordert, bleibt dieses Atom während der gesamten Zyklisierungsprozedur unberührt und steht für zusätzliche Modifikationen zur Verfügung. So kann dieses Chloratom mit weiteren Amino-, Hydroxy-, oder Thiolfunktionen in einer nachfolgenden nukleophilen Substitution umgesetzt werden (Beispiel 5). Die Reaktion mit monogeschützten bifunktionellen Verbindungen wie z. B. Mono-BOC-geschützten Diaminen ermöglichen sogar den Aufbau weiterer peptidischer oder peptidomimetischer Sequenzen (Fig. 4).

Die vielfältigen Möglichkeiten die sich aus der sequentiellen nukleophilen aromatischen Substitution ergeben, machen eine systematische Variation von Molekülparametern möglich. Aufgrund der klaren und einfachen Reaktionsabläufe eignet sich das Verfahren hervorragend für kombinatorisch chemische Technologien zur Auffindung neuer therapeutischer Leitstrukturen bzw. Optimierung von bereits bekannten linearen oder zyklischen oligomeren Verbindungen.

Die Erfindung wird beispielhaft durch die Figuren erläutert. Die einzelnen Figuren zeigen das folgende:

Fig. 1 zeigt mögliche Ringschlußreaktionen in Peptiden und Peptidomimetika.

Fig. 2 zeigt die schematische Darstellung der Herstellung von zyklischen Peptidomimetika mittels sequentieller aromatischer Substitution am Beispiel des Cyanurchlorides und einer "Kopf zu Seitenkette" Zyklisierung.

Fig. 3 zeigt eine Festphasenzyklisierung mittels Cyanurchlorid zu Zyklen verschiedener Ringgröße und Molekulargewichte.

Fig. 4 zeigt die Erhöhung der Diversität der zyklisierten Verbindungen durch nukleophile Substitution des verbleibenden Chloratoms am Ringsystem.

Fig. 5 zeigt die Darstellung der Zyklisierung von Dipeptiden mittels Cyanurchlorid in Abhängigkeit vom Einfluß der Aminosäureseitenketten.

Fig. 6 zeigt die Darstellung der Festphasenzyklisierung von Dipeptiden in Abhängigkeit von der Länge der in der Zyklisierung involvierten Aminosäureseitenketten.

Fig. 7 zeigt die "Kopf zu Rückgrat" Zyklisierung an Peptomeren.

Fig. 8 zeigt die Darstellung der nukleophilen Substitution an zyklischen Monochlor- 1,3,5-triazinylpeptiden.

Fig. 9 zeigt eine "Kopf zu Schwanz" Zyklisierung in Lösung.

Fig. 10 zeigt die Aromaten des erfindungsgemäßen Verfahrens, wobei beispielhaft für das Halogen ein Chloratom eingesetzt wurde. Das Chloratom soll in den allgemeinen Formeln durch Halogen ersetzt werden.

Alle Peptide und Peptidomimetika können gegebenenfalls Schutzgruppen umfassen.

Die Schutzgruppe an N - Terminus kann bestehen aus:
Alkyl-, Aryl-, Alkylaryl-, Arylalkyl-, Alkylcarbonyl-, Arylcarbonyl-, Alkylsulfonyl-, Arylsulfonyl-, Alkyloxycarbonyl- oder Aryloxycarbonylgruppen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, bevorzugt sind Fluorenylmethoxycarbonyl-, tert. Butyloxycarbonyl-, Benzoyloxycarbonyl- oder eine Tritylgruppe.

Die Schutzgruppe C - Terminus kann bestehen aus:
Eine Alkoxy- oder Aryloxygruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder aus einer Aminogruppe.

Weitere Schutzgruppen sind in Houben-Weyl (1974) Georg Thieme Verlag, 4. Auflage beschrieben. Die Beschreibung der Schutzgruppen in der zitierten Literaturangabe ist Teil der Offenbarung.

Begriffsdefinitionen Peptid

Im Kontext der vorliegenden Anmeldung beinhaltet der Terminus "Peptid" auch Peptidderivate und Analoga, die mindestens eine Peptidbindung enthalten.

Peptidomimetikum

Verbindungen in denen eine oder mehrere physiologisch labile Peptidfunktionalitäten durch chemische Module mit erhöhter Stabilität und Zellgängigkeit modifiziert wurden. (Kaznierski, W. M. (Ed) Peptidomimetics Protocols, Methods in Molecular Medicine, Human Press, Totowa, NJ, 1999 and Soth, M. J. et al. Current Opinion in Chemical Biol. 1997, Vol 1 page 120 and Thompson, L. A. et al. Chem. Rev. (1996) Vol 96, page 555.

Peptoid

Oligo-N-alkyl-glycin bei dem formell betrachtet die Seitenketten der Peptide vom α- Kohlenstoffatom der Aminosäuren auf die Amidfunktion übertragen werden.

Peptomer

Hybrid oder Konjugat aus Peptid- und Peptoidbausteinen

Abkürzungsliste

Beispiele

Anhand der folgenden Synthesebeispiele soll aufgezeigt werde, daß es sich bei der Methode um ein generell anwendbares neues Verfahren handelt, mit dem es gelingt, in einer sehr effektiven Art und Weise peptidomimetische zyklische Verbindungen mit einer außergewöhnlichen strukturellen Vielfalt zu erzeugen.

Allgemeine Peptidsynthese

Alle Peptide (falls nicht anders vermerkt), die in der vorliegenden Anmeldung für Zyklisierungsuntersuchungen verwendet wurden, wurden mittels schrittweiser Festphasensynthese unter Verwendung der SPOT-Synthesetechnologie [Frank, R. Tetrahedron, 1992, 48, 9217] an Amin-funktionalisierten Zellulosemembranen (Whatman 50, Whatman, Maidstone, UK) hergestellt. Dabei wurden die Membranen zunächst mit einem photolysierbaren Linker (4-2[-Methoxy-4-(1-Fmoc-aminoethyl)-5- nitrophenoxy]-butansäure) modifiziert [Ast, T. Tetrahedron Lett. 1999, 40, 4317]. Alle Peptide wurden dann mitttels Fmoc-geschützten Aminosäure-Pentafluorphenylestern unter identischen Bedingungen schrittweise aufgebaut (spotten von 2 µl einer 0,3 M Lösung in NMP, Doppelkupplung 2 × 15 min. Fmoc-Abspaltung mittels 20%iger Piperidin-Lösung in DMF). Dabei kamen die folgenden Seitenkettenschutzgruppen zum Einsatz: Arg(Pbf), Asn(Trt), Asp(OtBu), Cys(Trt), Glu(OtBu), Gln(Trt), His(Trt), Lys(BOC) oder Lys(Mtt), Ser(tBu), Thr(tBu), Trp(BOC), Tyr(tBu).

Die Seitenkettenschutzgruppen wurden 2,5 h mit einer Lösung aus 5%Wasser, 5%Phenol, 2,5% Triisopropylsilan in TFA gespalten. Die orthogonale Lysin- Schutzgruppe (Mtt) konnte in 1 h unter Verwendung einer Lösung aus 1% TFA und 5% Triisopropylsilan in DCM gespalten werden, ohne die anderen säurelabilen Schutzgruppen zu beeinträchtigen.

Nach ausgiebiger Wäsche mit DCM und Methanol wurden die Membranen getrocknet und die Peptide entweder den Zyklisierungsreaktionen zugeführt oder durch Bestrahlung mit UV-Licht (2 h, 365 nm) von der Oberfläche gespalten. Die adhäsiv auf der Membran gebundenen Verbindungen konnten nach dem Ausstanzen und Überführen in Mikrotiterplatten mittels Puffer abgelöst und der Analytik zugeführt werden.

Die durchschnittliche Peptidbeladung pro Spot betrug ca. 200 nmol.

Beispiel 1: Zyklisierung von Modellpeptiden mit schrittweise verkürzten Kettenlängen mittels Cyanurchlorid.

Die folgenden Modellpeptide unterschiedlicher Kettenlänge wurden nach der allgemeinen Peptidsynthesestrategie mittels SPOT-Synthese an Photolinker modifizierten Zellulosemembranen aufgebaut:

1. Gly Ala Phe Gly Ala Phe Gly Ala Phe Lys
2. Ala Phe Gly Ala Phe Gly Ala Phe Lys
3. Phe Gly Ala Phe Gly Ala Phe Lys
4. Gly Ala Phe Gly Ala Phe Lys
5. Ala Phe Gly Ala Phe Lys
6. Phe Gly Ala Phe Lys
7. Gly Ala Phe Lys
8. Ala Phe Lys
9. Phe Lys

Nach Deblockierung der N-terminalen Fmoc-Schutzgruppe mittels 20% PiperidiNDMF und Wäsche (5xDMF, 3xMeOH, 1xDCM) wurden die freien N-Termini der festphasengebundenen Peptide mittels einer 3 M Cyanurchlorid-Lösung in DCM bei Raumtemperatur für 15 min alkyliert. Nach Waschen der Membran (5xDMF, 3xMeOH, 1xDCM) wurde die BOC-Schutzgruppe der ε-Aminofunktion vom Lysin durch 30 minütiges Baden der Membran in einer Lösung aus 5% Wasser in 90% TFA/DCM entfernt. Nach einer erneuten Wäsche (2xDCM, 2xDMF) gelang die Zyklisierung mit 30%iger DIEA in DMF bei Raumtemperatur innerhalb von 30 min. Nach Wäsche der Membran (SxDMF, 3xMeOH, 1xDCM) und Trocknen erfolgte die Spaltung der zyklisierten Verbindungen von der Zelluloseoberfläche durch UV-Bestrahlung bei 365 nm (120 min).

Die adhäsiv auf der Membran gebundenen Verbindungen konnten nach dem Ausstanzen und Überführen in Mikrotiterplatten mittels Puffer abgelöst und der HPLC/MS-Analytik zugeführt werden. In allen Fällen konnte das gewünschte zyklische Zielpeptid mit hoher Reinheit identifiziert werden. Es wurden keinerlei 1,3,5-Triazin verbrückte lineare oder verbrückte, zyklische Peptide beobachtet.

Beispiel 2: Synthese von zyklischen Peptiden mit systematisch verkleinerten Ringgrößen durch unterschiedliche Positionierung der nukleophilen Reaktionspartner in linearen Vorgängermolekül gleicher Kettenlänge.

Die folgenden Modellpeptide wurden wie unter Beispiel 1. beschrieben schrittweise synthetisiert und unter identischen Bedingungen mit Cyanurchlorid umgesetzt und nach Abspaltung der BOC-Schutzgruppe am Lysin analog zu Beispiel 1 zyklisiert:

1. Gly Ala Phe Gly Ala Phe Gly Ala Phe Lys
2. Gly Ala Phe Gly Ala Phe Gly Ala Lys Phe
3. Gly Ala Phe Gly Ala Phe Gly Lys Ala Phe
4. Gly Ala Phe Gly Ala Phe Lys Gly Ala Phe
5. Gly Ala Phe Gly Ala Lys Phe Gly Ala Phe
6. Gly Ala Phe Gly Lys Ala Phe Gly Ala Phe
7. Gly Ala Phe Lys Gly Ala Phe Gly Ala Phe
8. Gly Ala Lys Phe Gly Ala Phe Gly Ala Phe
9. Gly Lys Ala Phe Gly Ala Phe Gly Ala Phe
10. Lys Gly Ala Phe Gly Ala Phe Gly Ala Phe

Nach photolytischer Spaltung zeigten die resultierenden HPLC-MS Analysen, daß alle Peptide, unabhängig von der Ringgröße, mit hohen Reinheiten hergestellt werden konnten. Eine Ausnahme bildet das Peptid 19, bei dem aufgrund der sterischen Hinderung keine Zyklisierung von der α-Aminogruppe des Lysins auf die entsprechende ε-Aminofunktion möglich war.

Beispiel 3: Untersuchungen zur Festphasenzyklisierung von Dipeptiden mittels Cyanurchlorid A.) Einfluß der Seitenketten auf die Zyklisierungstendenz

Die bisherigen Untersuchungen zur Zyklisierung an Modellpeptiden waren darauf gerichtet, die Limitierungen hinsichtlich der erreichbaren Ringgrößen zu detektieren. Dabei wurden neben dem Lysin als Zyklisierungspartner keine weiteren Aminosäuren verwendet, die durch zusätzliche Seitenkettenfunktionalitäten die Zyklisierungsreaktionen hätten beeinträchtigen können.

Um die generelle Anwendbarkeit der Methode in Abhängigkeit der Seitenketten proteinogener Aminosäuren und die Kompatibilität mit kommerziellen Schutzgruppenstrategien zu testen, wurden Dipeptide der Struktur NH₂-AS-Lys(Mtt)- Träger bzw. Tripeptide der Struktur NH₂-Ala-AS-Lys(Mtt)-Träger (AS = proteinogene Aminosäuren außer Cys) gemäß der unter Beispiel 1 beschriebenen Synthesestrategie synthetisiert (Fig. 5). Die freien N-terminalen Aminofunktionalitäten wurden wie unter Beispiel 1 beschrieben mit Cyanurchlorid umgesetzt. Im Anschluß wurde die Mtt- Schutzgruppe in Gegenwart der beschriebenen Schutzgmppen selektiv entschützt (siehe allgemeine Peptidsynthese). Die Anwendung der genannten Zyklisierungsbedingungen, nachfolgende Entschützung der verbleibenden orthogonalen Schutzgruppen und photolytische Spaltung der Zyklen vom Träger führte zu Produkten die nach LC-MS Analytik in allen Fällen dem entsprechenden konformationell eingeschränkten zyklischen Dipeptid, bzw. Tripeptid entsprachen.

B.) Schrittweise Verkleinerung der Ringgröße durch Verwendung nichtproteinogener Aminosäuren mit verkürzten Seitenketten

Nachdem gezeigt werden konnte, daß selbst kleine konformationell rigide zyklische Peptidomimetika auf Dipeptidbasis zugänglich sind, sollte untersucht werden, inwieweit die Effektivität der Zyklisierung von der Länge der in der Zyklisierung involvierten Seitenkette abhängig ist. Dazu wurden Dipeptide der in Fig. 16 gezeigten Struktur mit schrittweise verkürzter Seitenkette synthetisiert und unter den beschriebenen Standardbedingungen zyklisiert.

Die analytischen Daten der zyklischen, von der Cellulosemembran gespaltenen Verbindungen zeigten, daß sich die Reinheiten der zyklischen Produkte bei den kürzesten Seitenketten verschlechtern.

Beispiel 4: Zykliserung von Peptomeren

Die vielfältigen Anwendungsmöglichkeiten der neuen Methode sind erweiterbar, wenn die Zyklisierung auf Peptid-verwandte Oligomere übertragen wird. Beispielsweise eröffnet die Synthese von Peptomeren (Hybride aus Peptiden und Peptoiden) bzw. Peptoiden, die zu N-alkylierten Verbindungen führt, die Möglichkeit auch Zyklisierungen auf das Rückgrat des Peptidomimetikums durchzuführen (siehe Schema I) [Gilon, C. et al. Biopolymers 1991, 31, 745].

Um diese Zyklisierungsvariante zu testen, wurden die in Abb. 6 dargestellten Peptomere synthetisiert. Dazu wurde wie in der allgemeinen Synthesestrategie beschrieben die Zellulosemembran zunächst mit dem Photolinker modifiziert. Die nach Fmoc-Abspaltung freigesetzte Aminofunktion wurde mit Bromessigsäure-2-4- dinitrophenylester unter Spotsynthesebedingungen umgesetzt (spotten von 2 µl einer 1 M Lösung in NMP, Doppelkupplung 2 × 15 min). Die Brommethyl-Gruppe wurde dann in einer nukleophilen Substitution mit den in Fig. 7 gezeigten Mono-BOC-geschützten Diaminen umgesetzt (spotten von 2 µl einer 50%igen Lösung in NMP, 2x15 min). Das entstehende sekundäre Amin wurde nach Wäsche (5xDMF, 3xMeOH, 1xDCM) mit Fmoc-Phe-OH/DIC (1 : 0,5) in NMP (0.5M) umgesetzt (spotten von 2 µl der voraktivierten Lösung, Voraktivierung: 10 min. Doppelkupplung 2 × 15 min). Nach Deblockierung der N-terminaien Fmoc-Schutzgruppe mittels 20% Piperidin/DMF und Wäsche (5xDMF, 3xMeOH, 1xDCM) wurden die freien N-Termini der festphasengebundenen Peptomere wie in Beispiel 1 beschrieben mit Cyanurchlorid umgesetzt. Nach Waschen der Membran konnten die BOC-Schutzgruppen der Aminofunktionen der Peptoidbausteine durch 30 minütiges Baden der Membran in einer Lösung aus 5% Wasser in 90%TFA/DCM entfernt werden. Nach einer erneuten Wäsche gelang die Zyklisierung mit 30%iger DIEA in DMF bei Raumtemperatur innerhalb von 30 min. Nach Wäsche der Membran (5xDMF, 3xMeOH, 1xDCM) und Trocknen erfolgte die Spaltung der zyklisierten Verbindungen von der Zelluloseoberfläche durch UV-Bestrahlung bei 365 nm (120 min).
LC-MS Analyse der Verbindungen zeigte, daß in allen Fällen das gewünschte Produkt erhalten wurde.

Beispiel 5: Untersuchungen zur Substitution des Chloratoms an festphasengebundenen zyklischen Monochlor-1,3,5-Triazinylpeptiden.

Die Synthese des festphasengebundenen zyklisierten Modell-Tripeptides AFK erfolgte wie unter Beispiel 1 beschrieben. Anschließend wurden je 2 µl 50%ige Aminlösung (p- Methoxybenzylamin, Anilin, 3-Aminopropanol, Zyklohexylamin, Mono-BOC-1,3- Diaminopropan und n-Butylamin), je 2 µl 1 M Cäsiumphenolatlösung (Vanilin und 4- Fluorphenol) bzw. je 2µl 50% Mercaptanlösung (Phenylethymercaptan und 3- Mercaptopropionsäuremethylester) auf die luftgetrocknente Membran gespottet (Fig. 8). Die gesamte Membran wurde drei Minuten in einer Haushaltsmikrowelle (650 W) erwärmt. Der Reagenzienüberschuß wurde durch waschen mit DMF, Methanol und DCM (je 3x 5 min) entfernt. Nach Abspaltung mittels UV-Bestrahlung zeigte die LC-MS Analyse der Verbindungen, daß in allen Fällen das gewünschte Produkt in hohen Reinheiten erhalten wurde.

Beispiel 6: Testung unterschiedlicher mehrfachhalogenierter azaaromatischer Verbindungen zur Festphasenzyklisierung

Die Synthese des linearen Tripeptides AFK erfolgte wie unter Beispiel 1 beschrieben. Auf den Fmoc entschützten N-Terminus wurde eine 2 M Lösung von 2,4,6,8- Tetrachloropyrimido[5,4-d}pyrimidin oder eine 5 M Lösung von 2,4,6 - Trichloro pyrimidin in NMP mit 1 eq DIEA gespottet. Nach 2 h bei Raumtemperatur wurde durch Waschen mit DMF, Methanol und DCM (je 3x a 5 min) der Reagenzienüberschuß entfernt. Nach Waschen der Membran (5xDMF, 3xMeOH, 1xDCM) wurde die BOC- Schutzgruppe der ε-Aminofunktion vom Lysin durch 30-minütiges Baden der Membran in einer Lösung aus 5% Wasser in 90% TFA/DCM entfernt. Nach einer erneuten Wäsche (2xDCM, 2xDMF) gelangt die Zyklisierung mit 30%-iger DIEA in DMF bei Raumtemperatur innerhalb von 2 h (2,4,6,8-Tetrachloro-pyrimido[5,4- d]pyrimidin) bzw. über Nacht (2,4,6-Trichloro-pyrimidin). Nach Wäsche der Membran (5xDMF, 3xMEOH, 1xDCM) und Trocknen erfolgte die Spaltung der zyklisierten Verbindungen von der Zelluloseoberfläche durch UV - Bestrahlung bei 365 nm über 120 Minuten.

Beispiel 7: "Kopf zu Schwanz" Zyklisierung von Peptidomimetika in Lösung

Alle bisherigen Untersuchungen beinhalteten Synthesen und Zyklisierungen von Peptiden und Peptidomimetika im festphasengebunden Zustand. Da in der Regel die C- Termini am Träger verankert sind, muß eine "Kopf zu Schwanz"- Zyklisierung in Lösung erfolgen. Das folgende Beispiel beschreibt einen solchen Ringschluß an einem Dipeptidmimetikum welches an einem Carbamat-Linker aufgebaut wurde.

Aufgrund der synthetischen Unzugänglichkeit von Carbamat-Linkern auf Cellulose wurde eine aminofunktionalisierte Polypropylen-Membran [Volkmer Engert, R. et al. In Peptides 1998, S. Bajus, F. Hudecz Ed., 1999 Akademiai Kiado Budapest, 118] mit Bromessigsäurebromid unter Basenkatalyse acetyliert (2 M in DCM, kat. DABCO, 30 min, RT). Die so erhaltene Bromfunktion wurde mit einer 1 M Lösung des Cäsiumsalzes von p-Hydroxybenzaldehyd in DMSO bei RT innerhalb 1 h substituiert. Durch Reduktion mit Natriumborhydrid (2 M in Methanol) für 15 min wurde eine benzylische Alkoholfunktion generiert, die mit 4-Nitrophenyl-chloroformiat (1 M in DCM, kat. NEM) bei RT für 1 h umgesetzt wurde. Das erhaltene Aktivcarbonat wurde mit Ethylendiamin (50% in DMF, RT 2 h) zum entsprechenden Carbamat umgesetzt. An der β- Aminofunktion wurde nach dem allgemeinen Spot-Syntheseprotokoll sukzessive Phenylalanin und Alanin gekuppelt. Nach Deblockierung der N-terminalen Fmoc- Schutzgruppe mittels 20% Piperidin/DMF und Wäsche (5xDMF, 3xMeOH, 1xDCM) wurde der freie N-Terminus des festphasengebundenen des Peptides wie in Beispiel 1 beschrieben mit Cyanurchlorid umgesetzt. Das so erhaltende Dichloro-Triazin-Derivat wurde mit 80%iger TFA in DCM für 30 min bei RT von der Membran abgespalten (Fig. 9, Verbindung 1). Die überschüssige TFA und das DCM wurden in Vakuum entfernt und in 50 µl einer 50%igen Lösung von Acetonitril in Wasser aufgenommen. Davon wurden 10 µl mittels LC-MS analysiert. Die Zyklisierung gelang durch Zugabe von 2 µl DIEA und schütteln für 30 min bei RT (Fig. 9, Verbindung 2). Anschließend wurde erneut im Vakuum zur Trockene eingeengt und in 50 µl einer 50%igen Lösung von Acetonitril in Wasser aufgenommen und das Reaktionsprodukt mittels LC-MS anaylsiert.

Beispiel 8: "Kopf zu Seitenkette" Zyklisierung unter Verwendung alternativer Amino-Seitenketten

Folgende Peptide wurden nach dem allgemeinen Syntheseprotokoll für Peptide der Spotsynthese aufgebaut: AFH(BOC), AFR(Pmc) und AFW(BOC). Nach Deblockierung der N-terminalen Fmoc-Schutzgruppe mittels 20% Piperidin/DMF und Wäsche (5xDMF, 3xMeOH, 1xDCM) wurden die freien N-Termini der festphasengebundenen Tripeptide wie in Beispiel 1 beschrieben mit Cyanurchlorid umgesetzt. Nach Waschen der Membran wurden BOC-Schutzgruppen bzw. die Pmc-Schutzgruppe der Aminofunktionen durch 30 minütiges Baden der Membran mit einer Lösung aus 5% Wasser in 90%TFA/DCM entfernt. Nach einer erneuten Wäsche gelang die Zyklisierung mit 30%iger DIPEA in DMF bei Raumtemperatur innerhalb von 60 min. Nach Wäsche der Membran (5xDMF, 3xMeOH, 1xDCM) und Trocknen erfolgte die Spaltung der zyklisierten Verbindungen von der Cellulose.

Sequenzprotokoll:

Claims

1. Verfahren zur Synthese von zyklischen Peptiden oder Peptidomimetika durch sequentielle nukleophile Substitutionen an mehrfachhalogenierten Aromaten mit der folgenden Formel:
mehrfachhalogenierten Aromaten mit der folgenden Formel:

a) 2,4,6-Trihalogeno-S-triazin oder 2,4,6-Trihalogen-1,3,5-triazin;
b) 2, 4,6,8-Tetrahalogenopyrimido[5,4-djpyrimidin;
c) 2,4,6-Trihalogeno - pyrimidin;
d) 2,6,8-Trihalogeno-7-methyl-7H purin;
e) 2,4-Dihalogeno-6,7-dimethoxy-quinazolin;
f) 2,4-Dihalogeno-pyrimidin;
g) 2,6,8,-Thrihalogeno-7H-purin;
h) 2,4,6,7-Tetrahalogeno-pteridine;

dabei steht
Halogen für Chlor, Fluor Jod und Brom, bevorzugt Chlor,
wobei die Reaktion die folgenden Schritte umfaßt

a) ein lineares Peptid oder Peptidomimetikum mit einer freien nukleophilen Funktionalität,
wobei die nukleophile Funktionalität ein Alkohol, Thiol oder Amin ist, und wobei sich die nukleophile Funktionalität entweder an einem Ende, in der Seitenkette oder am Rückgrat des Peptids oder Peptidomimetikums befindet,
wird mit dem Aromaten im Sinne einer einfachen nukleophilen aromatischen Substitution umgesetzt,
wobei sich das Peptid oder Peptidomimetikum in Lösung oder in einem festphasengebundenen Zustand befindet
b) die Schutzgruppe einer weiteren nukleophilen Funktionalität am gleichen Peptid oder Peptidomimetikum wird selektiv gespalten
wobei die freigesetzte nukleophile Funktionalität ein Alkohol, Thiol oder Amin ist, und
wobei sich die nukleophile Funktionalität entweder an einem Ende, in der Seitenkette oder am Rückgrat des Peptids oder Peptidomimetikums befindet
c) Zyklisierung durch Zusetzen eines tertiären Amins oder einer anderen Base, wobei die Zyklisierung durch nukleophile aromatische Substitution eines weiteren Halogenatoms des am Peptid oder Peptidomimetikum - gebundenen Halogen - Aromaten durch die freigesetzte nukleophile Funktionalität erfolgt

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der mehrfachhalogenierte Aromat ein Cyanurchlorid oder fluorid ist. Mehr bevorzugt ist ein Cyanurchlorid.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die verbleibenden Halogenatome in weiteren nukleophilen aromatischen Substitutionsreaktionen umgesetzt werden, wobei das Nukleophil ein Alkohol, ein Ihiol oder ein Amin ist.

4. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Nukleophil ein Teil desselben Peptides oder Peptidomimetikums ist oder ein Teil eines anderen Moleküls ist.

5. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Peptid oder Peptidomimetikum mittels Festphasen- oder Lösungssynthese aufgebaut werden.