EP1212351A1 - Verfahren zur herstellung von zyklischen peptidomimetika - Google Patents

Verfahren zur herstellung von zyklischen peptidomimetika

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EP1212351A1
EP1212351A1 EP00963949A EP00963949A EP1212351A1 EP 1212351 A1 EP1212351 A1 EP 1212351A1 EP 00963949 A EP00963949 A EP 00963949A EP 00963949 A EP00963949 A EP 00963949A EP 1212351 A1 EP1212351 A1 EP 1212351A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
peptide
peptidomimetic
nucleophilic
cyclization
functionality
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP00963949A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Dirk Scharn
Lothar Germeroth
Holger Wenschuh
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Chemotopix GmbH
Original Assignee
Chemotopix GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Chemotopix GmbH filed Critical Chemotopix GmbH
Publication of EP1212351A1 publication Critical patent/EP1212351A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
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    • C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
    • C07K1/1077—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of residues other than amino acids or peptide residues, e.g. sugars, polyols, fatty acids
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    • C07K7/50—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link
    • C07K7/54—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring
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    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • peptides are limited for the following reasons: (i) Under physiological conditions, peptides are degraded by many specific and non-specific peptidases, (ii) peptides are only moderately absorbed and quickly excreted again. (iii) The conformational flexibility of peptides can lead to binding to more than one receptor and thus to undesirable side effects, (iv) peptides can be immunogenic.
  • the resulting conformationally restricted peptide analogs can not only lead to increased avidity and affinity for the receptor [Ladner, CL TIBTECH 1995, 13, 426] but also have a significantly reduced lability towards proteases and a significantly increased membrane passage [Hruby, VJ et al. Life Be. 1982, 31, 189].
  • the object is to produce peptides or peptidomimetics which no longer have the aforementioned disadvantageous properties of peptides for clinical applications.
  • cyclic peptides and peptidomimetics are to be synthesized, the backbone of which is modified by aromatic or heteroaromatic residues.
  • the object is achieved by a process for the synthesis of cyclic peptides or peptidomimetics by sequential nucleophilic substitutions on polyhalogenated aromatics with the following formula: (i) 2,4,6-trihalo-S-triazine or 2,4,6-trihalo-1 , 3,5-triazine; (see.
  • a linear peptide or peptidomimetic with a free nucleophilic functionality wherein the nucleophilic functionality is an alcohol, thiol or amine, and wherein the nucleophilic functionality is either at one end, in the side chain or on the backbone of the peptide or peptidomimetic implemented with the aromatic in the sense of a simple nucleophilic aromatic substitution, the peptide or peptidomimetic being in solution or in a state bound to a solid phase
  • the protective group of a further nucleophilic functionality on the same peptide or peptidomimetic is selectively cleaved, the nucleophilic functionality released being an alcohol, thiol or amine, and the nucleophilic functionality being at either end in which
  • the present method is a valuable tool for the synthesis of new bioactive compounds.
  • the following invention describes a new, versatile procedure for the production of such, not previously described, conformationally restricted connections.
  • a process according to the invention is preferred, the polyhalogenated aromatic being a cyanuric chloride or fluoride.
  • a cyanuric chloride is more preferred.
  • a method according to the invention is advantageous in which the remaining halogen atoms are reacted in further nucleophilic aromatic substitution reactions, the nucleophile being an alcohol, a thiol or an amine.
  • the nucleophile can be part of the same peptide or peptidomimetic or part of another molecule. This creates intramolecular or intermolecularly linked compounds.
  • the present invention relates to a process for the preparation of novel cyclic peptidomimetics by means of successive nucleophilic substitution on cyanuric chloride and other polyhalogenated aromatic compounds.
  • peptides or peptidomimetic oligomers which are built up by means of solid-phase or solution synthesis and initially have only one free nucleophilic functional group are reacted with cyanuric chloride.
  • cyanuric chloride The temperature-dependent tendency of substitution of the chlorine atoms present is exploited [Thurston, JT et al. J. Am. Chem. Soc. 1951, 73, 2981].
  • the complete reaction of amino, hydroxy, or thiol functions with excess cyanuric chloride at room temperature initially leads exclusively to dichloro-1, 3,5-triazinylpeptides (Scheme II) without the formation of 1,3,5-triazine-bridged peptide dimers.
  • the method according to the invention makes a large variety of conformationally restricted compounds accessible.
  • both the ring size and the molecular weight can be gradually changed.
  • Figure 1 shows possible ring closure reactions in peptides and peptidomimetics.
  • Figure 2 shows the schematic representation of the production of cyclic peptidomimetics by means of sequential aromatic substitution using the example of
  • Figure 3 shows a solid phase cyclization using cyanuric chloride to cycles of different ring sizes and molecular weights.
  • FIG. 4 shows the increase in the diversity of the cyclized compounds by nucleophilic substitution of the remaining chlorine atom on the ring system.
  • FIG. 5 shows the cyclization of dipeptides by means of cyanuric chloride in FIG.
  • FIG. 6 shows the representation of the solid phase cyclization of dipeptides in FIG.
  • FIG. 7 shows the “head to backbone” cyclization on peptomers.
  • FIG. 8 shows the representation of the nucleophilic substitution on cyclic monochloro-1,3,5-triazinylpeptides.
  • FIG. 9 shows a “head-to-tail” cyclization in solution.
  • FIG. 10 shows the aromatics of the process according to the invention, a chlorine atom being used as an example for the halogen.
  • the chlorine atom is to be replaced by halogen in the general formulas.
  • All peptides and peptidomimetics can optionally include protecting groups.
  • the protective group at the N terminus can consist of: alkyl, aryl, alkylaryl, arylalkyl, alkylcarbonyl, arylcarbonyl, alkylsulfonyl,
  • Carbon atoms preferably fluorenylmethoxycarbonyl, tert. butyloxycarbonyl,
  • the protecting group C - terminus can consist of: An alkoxy or aryloxy group with 1 to 10 carbon atoms or one
  • Peptide In the context of the present application, the term “peptide” also includes peptide derivatives and analogs which contain at least one peptide bond.
  • Oligo-N-alkyl-glycine in which formally the side chains of the peptides are transferred from the ⁇ -carbon atom of the amino acids to the amide function.
  • the side chain protecting groups were cleaved for 2.5 hours with a solution of 5% water, 5% phenol, 2.5% triisopropylsilane in TFA.
  • the orthogonal lysine protecting group (Mtt) could be cleaved in 1h using a solution of 1% TFA and 5% triisopropylsilane in DCM without affecting the other acid labile protecting groups.
  • Example 3 Studies on the solid phase cyclization of dipeptides using cyanuric chloride
  • the diverse application possibilities of the new method can be expanded if the cyclization is transferred to peptide-related oligomers.
  • the synthesis of peptomers (hybrids of peptides and peptoids) or peptoids, which leads to N-alkylated compounds also opens up the possibility of carrying out cyclizations on the backbone of the peptidomimetic (see scheme I) [Gilon, C. et al. Biopolymers 1991, 31, 745].
  • the peptomers shown in Figure 6 were synthesized. For this purpose, as described in the general synthesis strategy, the cellulose membrane was first modified with the photolinker.
  • the BOC protecting groups of the amino functions of the peptoid building blocks could be removed by bathing the membrane for 30 minutes in a solution of 5% water in 90% TFA / DCM. After washing again, the cyclization with 30% DIEA in DMF at room temperature was achieved within 30 minutes. After washing the membrane (5xDMF, 3xMeOH, 1xDCM) and drying, the cyclized compounds were cleaved from the cellulose surface by UV irradiation at 365 nm (120 min). LC-MS analysis of the compounds showed that the desired product was obtained in all cases.
  • Example 5 Studies on the substitution of the chlorine atom on cyclic monochloro-1, 3,5-triazinyl peptides bound to the solid phase.
  • Example 6 Testing of different multi-halogenated azaaromatic compounds for solid phase cycling
  • the linear tripeptide AFK was synthesized as described in Example 1.
  • the excess of reagent was removed by washing with DMF, methanol and DCM (3 ⁇ 5 min each).
  • the membrane (5xDMF, 3xMeOH, 1xDCM)
  • the BOC protecting group of the ⁇ -amino function was removed from the lysine by bathing the membrane in a solution of 5% water in 90% TFA / DCM for 30 minutes.
  • Termini are anchored to the carrier, a "head to tail" cyclization must be carried out in solution.
  • the following example describes such a ring closure on one
  • the dichloro-triazine derivative thus obtained was cleaved from the membrane with 80% TFA in DCM for 30 min at RT (FIG. 9, compound 1).
  • the excess TFA and DCM were removed in vacuo and taken up in 50 ul of a 50% solution of acetonitrile in water. 10 ⁇ l of these were analyzed by LC-MS.
  • the cyclization was achieved by adding 2 ⁇ l DIEA and shaking at RT for 30 min (FIG. 9, compound 2).
  • the mixture was then evaporated to dryness again in vacuo and taken up in 50 ⁇ l of a 50% strength solution of acetonitrile in water and the reaction product was analyzed by means of LC-MS.

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Synthese von zyklischen Peptiden oder Peptidomimetika durch sequentielle nukleophile Substitutionen an mehrfachhalogenierten Aromaten. Das Verfahren besitzt die folgenden Schritte: (i) ein lineares Peptid oder Peptidomimetikum mit einer freien nukleophilen Funktionalität, wobei die nukleophile Funktionalität ein Alkohol, Thiol oder Amin ist, wird mit den Aromaten im Sinne einer einfachen nukleophilen aromatischen Substitution umgesetzt, (ii) die Schutzgruppe einer weiteren nukleophilen Funktionalität am gleichen Peptid oder Peptidomimetikum wird selektiv gespalten, wobei die freigesetzte nukleophile Funktionalität ein Alkohol, Thiol oder Amin ist, und (iii) Zyklisierung durch Zusetzen eines tertiären Amins oder einer anderen Base, wobei die Zyklisierung durch nukleophile aromatische Substitution eines weiteren Halogenatoms des am peptidgebundenen Halogenaromaten durch die freigesetzte nukleophile Funktionalität erfolgt.

Description

Verfahren zur Herstellung von zyklischen Peptidomimetika
Beschreibung des Standes der Technik
Nahezu alle biochemischen Prozesse basieren auf spezifischen molekularen Erkennungen zwischen Peptiden oder Proteinen und anderen biologisch aktiven Molekülen. In den vergangenen 20 Jahren sind eine Vielzahl solcher Peptide entdeckt worden, die unter anderem als Hormone, Enzyminhibitoren, Enzymsubstraten, Neurotransmittem und Immunmodulatoren bedeutende biologische Funktionen besitzen.
Demzufolge sind umfangreiche Studien durchgeführt worden, um die physiologischen Effekte dieser peptidischen Wirkstoffe zu verstehen und neue peptidische Therapeutika zu entwickeln.
Leider sind die klinischen Anwendungsmöglichkeiten von Peptiden aus folgenden Gründen eingeschränkt: (i) Unter physiologischen Bedingungen werden Peptide durch viele spezifische und unspezifische Peptidasen abgebaut, (ii) Peptide werden nur mäßig absorbiert und schnell wieder ausgeschieden. (iii) Die konformationelle Flexibilität von Peptiden kann zur Bindung an mehr als einem Rezeptor und somit zu unerwünschten Nebeneffekten führen, (iv) Peptide können immunogen sein.
Zahlreiche chemisch synthetische Modifikationen an Peptiden sind beschrieben worden, diese unvorteilhaften Eigenschaften zu umgehen. Neben dem Einbau von konformationell eingeschränkten Aminosäure Derivaten wie Cα-Alkylaminosäuren, Nα- Alkylaminosäuren, α,ß-ungesättigten Aminosäuren und D-Aminosäuren [DeGrado, W.F. In: Advances in Protein Chemistry, Academic Press 1988], der Modifikation des Peptidrückgrates durch Amidbindungsisostere, der Synthese von nichtpeptidischen Analoga und der Verknüpfung von Pharmakophoren mit geeigneten Templaten, hat sich vor allem die Zyklisierung des Peptidrückgrates als sehr effektiver Ansatz im Design von peptidomimetischen Therapeutika erwiesen [Ladner, C.L. TIBTECH 1995, 13, 426].
Die resultierenden konformationell eingeschränkten Peptidanaloga können nicht nur zu einer erhöhten Avidität und Affinität zum Rezeptor führen [Ladner, C.L. TIBTECH 1995, 13, 426] sondern auch eine deutlich reduzierte Labilität gegenüber Proteasen und eine signifikant erhöhte Membrangängigkeit besitzen [Hruby, V.J. et al. Life Sei. 1982, 31, 189].
In den letzten Jahren wurden etliche Strategien beschrieben, die zu solchen zyklischen Peptiden führen. Besonders interessant sind dabei Verfahren, die mittels Festphasensynthesestrategie [Merrifield, R.B.; J. Am. Chem. Soc. 1963, 85, 2149] die Herstellung der zyklischen Zielverbindungen ermöglichen. Der Vorteil dieser Methode ist auf die sogenannte Pseudoverdünnung zurückzuführen, ein kinetisches Phänomen, das intramolekulare Reaktionen gegenüber intermolekularen Nebenreaktionen begünstigt. Zusätzlich kann durch die Verwendung überschüssiger löslicher Reagenzien die Zyklisierungsreaktion begünstigt werden, wobei die Methodik leicht zu automatisieren ist und biologische Testsysteme auch direkt an den polymeren Oberflächen anwendbar sind [Jakubke, H.D. In: Peptide: Chemie und Biologie, Spektrum Akad. Verlag Heidelberg, Berlin, Oxford, 1996]. Die Ringschlußreaktion bei Peptiden ist je nach verwendeter Prozedur in verschiedenen Richtungen möglich. Die folgenden Zyklisierungsvarianten sind untersucht worden: „Kopf zu Schwanz", „Kopf (Schwanz) zu Seitenkette", „Seitenkette zu Seitenkette", „Kopf (Schwanz) zu Rückgrat ".„Rückgrat zu Rückgraf' und „Rückgrat zu Seitenkette" und die entsprechenden entgegengesetzten Richtungen [Gilon, C. et al. Biopolymers 1991 , 31 , 745] (Figur 1).
Dabei ist eine Vielzahl von Strukturen publiziert worden, die als „Brückenglieder" in der Synthese von zyklischen Peptiden und Peptidomimetika fungieren können. Die am weitesten verbreiteten Zyklisierungsarten sind die Amidverknüpfung (Laktambildung) sowie der Ringschluß über Lakton-, Thioether-, Dithioether-, Urethan-, Disulfid,- und Methylaminbrücken [Hruby, V.J. et al. Biochem. J. 1990, 268, 249 und dort zitierte Referenzen].
Obwohl als effektiver Ansatz zur Entwicklung neuer Leitstrukturen beschrieben [Kieber- Emmons, T. et al. Current Opinion in Biotechnology 1997, 8, 435], ist dagegen nur wenig über Zyklisierungstechniken bekannt, die zu zyklischen Peptidomimetika mit inkorporierten aromatischen und heteroaromatischen Resten führen. Die wenigen Beispiele beinhalten die Zyklisierung über den Einbau von aromatischen Systemen wie Aminobenzoesäure [Endo, K. und Takahashi, H. Heterozykles 1999, 51 , 337], Bis(bromomethyl)arenen [Adrian, F. et al. Tetrahedron Lett. 1999, 40, 1039], Arylethern [Zhu, J. In: Methods in Molecular Medicine, Vol 23, Peptidomimetic Protocols, Humana Press, NJ, 1999], Tyrosin [Reid, C.R. et al., J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 8511] und 2- Fluoro-5-nitrobenzoesäure [Feng, Y. J. et al. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 10768] direkt in das Rückgrat der Peptide.
Weiterhin wurde kürzlich von zyklischen Peptiden mit im Rückgrat inkorporierten 1,3,5 - Triazinen berichtet (D.A. Schefter et al. In: Programm and Abstract, 16* American Peptide Symposium, Minneapolis, 1999, p 345). Diese Triazine wurden jedoch nicht mittels nukleophiler Substitutionsreaktion in das Rückrat der Peptide eingeführt, sondern es wurden zunächst in aufwendigen Reaktionen Fmoc - geschützte 1,3,5 - Triazin - Aminosäuren als Bausteine generiert, die dann mittels klassischer Peptidkupplungschemie in das Peptidrückgrat eingefügt wurden. Darüber hinaus waren die 1,3,5 - Triazine nicht an der eigentlichen Zyklisierungsreaktion beteiligt. Auch diese wurde wiederum mittels klassischer Peptidkupplungschemie unter Bildung von Lactamen durchgeführt.
Obwohl diese Methoden zu interessanten zyklischen Verbindungen führen, besteht ausgehend vom jetzigen Stand der Technik zweifellos großes Interesse an neuen Verfahren, die die bisherigen Möglichkeiten zur Herstellung neuer zyklischer Peptidomimetika mit inkorporierten aromatischen Resten ergänzen.
Aufgabe und Lösung
Es stellt sich die Aufgabe, Peptide bzw. Peptidomimetika herzustellen, die die zuvor genannten nachteiligen Eigenschaften von Peptiden für klinische Anwendungen nicht mehr aufweisen. Dazu sollen zyklische Peptide und Peptidomimetika synthetisiert werden, deren Rückgrat durch aromatische bzw. heteroaromatische Reste modifiziert ist.
Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Synthese von zyklischen Peptiden oder Peptidomimetika durch sequentielle nukleophile Substitutionen an mehrfachhalogenierten Aromaten mit der folgenden Formel: (i) 2,4,6-Trihalogeno-S-triazin oder 2,4,6-Trihalogen-1,3,5-triazin; (vgl.
Figur 10a)
(ii) 2,4,6,8 - Tetrahalogenopyrimido[5,4- ]pyrimidin; (vgl. Figur 10b)
(iii) 2,4,6 - Trihalogeno - pyrimidin; (vgl. Figur 10c)
(iv) 2,6,8 - Trihalogeno-7-methyl-7H-purin; (vgl. Figur 10d) (v) 2,4 - Dihalogeno - 6,7 - dimethoxy - quinazolin; (vgl. Figur 10e)
(vi) 2,4 - Dihalogeno - pyrimidin; (vgl. Figur 10f) (vii) 2,6,8, - Thrihalogeno - 7H - purin; (vgl. Figur 10g) (viii) 2,4,6,7 - Tetrahalogeno - pteridine; (vgl. Figur 10h) dabei steht
Halogen für Chlor, Fluor Jod und Brom, bevorzugt Chlor, wobei die Reaktion die folgenden Schritte umfaßt:
(i) ein lineares Peptid oder Peptidomimetikum mit einer freien nukleophilen Funktionalität, wobei die nukleophile Funktionalität ein Alkohol, Thiol oder Amin ist, und wobei sich die nukleophile Funktionalität entweder an einem Ende, in der Seitenkette oder am Rückgrat des Peptids oder Peptidomimetikums befindet, wird mit dem Aromaten im Sinne einer einfachen nukleophilen aromatischen Substitution umgesetzt, wobei sich das Peptid oder Peptidomimetikum in Lösung oder in einem festphasengebundenen Zustand befindet
(ii) die Schutzgruppe einer weiteren nukleophilen Funktionalität am gleichen Peptid oder Peptidomimetikum wird selektiv gespalten wobei die freigesetzte nukleophile Funktionalität ein Alkohol, Thiol oder Amin ist, und wobei sich die nukleophile Funktionalität entweder an einem Ende, in der
Seitenkette oder am Rückgrat des Peptids oder Peptidomimetikums befindet, (iii) Zyklisierung durch Zusetzen eines tertiären Amins oder einer anderen Base, wobei die Zyklisierung durch nukleophile aromatische Substitution eines weiteren Halogenatoms des am Peptid oder Peptidomimetikum - gebundenen Halogen - Aromaten durch die freigesetzte nukleophile Funktionalität erfolgt
Die vorliegende Methode ist aufgrund ihrer breiten Anwendbarkeit und der zusätzlichen Möglichkeit die generierten Zyklen weiter systematisch zu modifizieren ein wertvolles Werkzeug zur Synthese neuer bioaktiver Verbindungen. Die folgende Erfindung beschreibt eine neue vielfältig einsetzbare Prozedur zur Herstellung solcher, bisher nicht beschriebener, konformationell eingeschränkter Verbindungen.
Die Vorzüge der vorliegenden Methode im Vergleich zum Stand der Technik liegen vor allem in der deutlich erhöhten Flexibilität hinsichtlich der zu zyklisierenden Funktionalitäten. So können alle im Peptid oder Peptidomimetikum zur Verfügung stehenden nukleophilen Gruppen an Seitenketten, an den Enden und am Rückgrat intramolekular verknüpft werden. Abgesehen von entsprechenden kommerziell erhältlichen orthogonalen Schutzgruppen müssen keinerlei Veränderungen an den Standardsynthesebedingungen vorgenommen werden. Durch die unterschiedliche Substitutionstendenz der Halogenatome am Aromaten ist es darüber hinaus nicht notwendig, die zur Zyklisierung eingesetzte Verbindung zu modifizieren oder eine der reaktiven Halogene zu schützen. Da die Halogenatome selektiv in Abhängigkeit von den Reaktionsbedingungen reagieren, wird es möglich, die Zyklisierung am Ende der Synthese des Peptids oder Peptidomimetikums in einer zweistufigen Reaktion durchzuführen.
Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei der mehrfachhalogenierte Aromat ein Cyanurchlorid oder -fluorid ist. Mehr bevorzugt ist ein Cyanurchlorid.
Vorteilhaft ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, bei dem die verbleibenden Halogenatome in weiteren nukleophilen aromatischen Substitutionsreaktionen umgesetzt werden, wobei das Nukleophil ein Alkohol, ein Thiol oder ein Amin ist.
Dabei kann das Nukleophil Teil desselben Peptids oder Peptidomimetikums sein oder Teil eines anderen Moleküls sein. Dadurch entstehen intramolekular oder intermolekular verknüpfte Verbindungen.
Inhalt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von neuartigen zyklischen Peptidomimetika mittels sukzessiver nukleophiler Substitution an Cyanurchlorid und anderen mehrfachhalogenierten aromatischen Verbindungen.
Erfindungsgemäß werden Peptide oder peptidomimetische Oligomere, die mittels Festphasen- oder Lösungssynthese aufgebaut werden und zunächst nur eine freie nukleophile Funktionalgruppe besitzen mit Cyanurchlorid umgesetzt Dabei wird die temperaturabhängige Substitutionstendenz der vorhandenen Chloratome ausgenutzt [Thurston, J.T. et al. J. Am. Chem. Soc. 1951, 73, 2981]. Die vollständige Reaktion von Amino-, Hydroxy-, oder Thiolfunktionen mit überschüssigem Cyanurchlorid bei Raumtemperatur führt so zunächst ausschließlich zu Dichlor-1 ,3,5-triazinylpeptiden (Schema II), ohne daß 1, 3, 5-Triazin- verbrückte Peptiddimere entstehen. Die selektive Abspaltung einer orthogonalen Schutzgruppe an einer weiteren nukleophilen Funktionalität vorzugsweise einem Amin am Rückgrat oder in der Seitenkette („Side Chain") ermöglicht die nachfolgende Zyklisierung über die vollständige nukleophile Substitution des zweiten Chloratoms, die ebenfalls bei Raumtemperatur stattfindet. Die intramolekulare Zyklisierung ist dabei gegenüber der intermolekularen Verbrückung klar bevorzugt. In keinem der untersuchten Fälle wurden Verbrückungen beobachtet, (vergleiche Figur 2)
Vorausgesetzt es stehen mindestens zwei nukleophile Funktionalitäten zur Verfügung wird durch das erfindungsgemäße Verfahren eine große Vielfalt an konformationell eingeschränkten Verbindungen zugänglich.
So kann einerseits durch die Variation der Kettenlänge und der Stellung der nukleophilen Funktionalitäten zueinander sowohl die Ringgröße, als auch das Molekulargewicht schrittweise verändert werden. Andererseits wird es möglich, durch die verschiedenen zur Verfügung stehenden nukleophilen Funktionalgruppen Art und Anzahl der Heteroatome im Ring zu variieren (Figur 3, Beispiele 1 und 2).
Von besonderem Interesse ist dabei die Möglichkeit auch kleine rigide Ringsysteme mit inkorporierten Aromaten bzw. Heteroaromaten zu generieren. Selbst Zyklen aus Dipeptiden sind effektiv mit hoher Reinheit zu erhalten, wobei durch die Wahl der Seitenkettenlänge, der in die Zyklisierung einbezogenen Aminosäure, die Ringgröße sehr fein abgestimmt werden kann (Beispiel 3B). Dies geschieht nahezu unabhängig von der Natur der nicht in die Zyklisierung einbezogenen Aminosäuren im Ring, vorausgesetzt nukleophile Funktionalitäten sind mit herkömmlichen orthogonalen Schutzgruppen gegenüber dem Angriff des Halogenids geschützt (Beispiel 3A).
Durch die Wahl geeigneter Monomerbausteine und Schutzgruppenstrategien sind alle in Figur 1 dargestellten Zyklisierungsrichtungen möglich. Neben der Verknüpfung von „Kopf" und „Seitenkette" (Beispiele 1-3), „Kopf" und Schwanz" (Beispiel 7) sowie „Seitenkette" und „Seitenkette" werden nach dem Einbau N - Alkylaminosäuren Peptomere bzw. Peptoide gebildet die auch Zyklisierungen vom oder auf das Rückgrat zulassen (Beispiel 4). Weitere zyklische Peptidomimetika bzw. Hybride aus Peptidomimetika und Peptiden sind problemlos zugänglich vorausgesetzt, es stehen zwei nukleophile Funktionalitäten zur Zyklisierung zur Verfügung und weitere sind orthogonal geschützt (Beispiel 7). Die zusätzliche Möglichkeit eine weitere nukleophile Substitution am verbleibenden Chloratom durchzuführen und somit die Diversität im Sinne kombinatorisch chemischer Prozesse zu erhöhen, macht die Methode zu einer wertvollen Ergänzung des Methodenrepertoirs gezielt maßgeschneiderte Moleküleigenschaften zu erzeugen. Da die Substitution des verbleibenden Chloratoms höhere Temperaturen oder Mikrowellenassistenz erfordert, bleibt dieses Atom während der gesamten Zyklisierungsprozedur unberührt und steht für zusätzliche Modifikationen zur Verfügung. So kann dieses Chloratom mit weiteren Amino-, Hydroxy-, oder Thiolfunktionen in einer nachfolgenden nukleophilen Substitution umgesetzt werden (Beispiel 5). Die Reaktion mit monogeschützten bifunktionellen Verbindungen wie z.B. Mono-BOC-geschützten Diaminen ermöglichen sogar den Aufbau weiterer peptidischer oder peptidomimetischer Sequenzen (Figur 4).
Die vielfältigen Möglichkeiten die sich aus der sequentiellen nukleophilen aromatischen Substitution ergeben, machen eine systematische Variation von Molekülparametern möglich. Aufgrund der klaren und einfachen Reaktionsabläufe eignet sich das
Verfahren hervorragend für kombinatorisch chemische Technologien zur Auffindung neuer therapeutischer Leitstrukturen bzw. Optimierung von bereits bekannten linearen oder zyklischen oligomeren Verbindungen.
Die Erfindung wird beispielhaft durch die Figuren erläutert. Die einzelnen Figuren zeigen das folgende:
Figur 1 zeigt mögliche Ringschlußreaktionen in Peptiden und Peptidomimetika.
Figur 2 zeigt die schematische Darstellung der Herstellung von zyklischen Peptidomimetika mittels sequentieller aromatischer Substitution am Beispiel des
Cyanurchlorides und einer „Kopf zu Seitenkette" Zyklisierung.
Figur 3 zeigt eine Festphasenzyklisierung mittels Cyanurchlorid zu Zyklen verschiedener Ringgröße und Molekulargewichte.
Figur 4 zeigt die Erhöhung der Diversität der zyklisierten Verbindungen durch nukleophile Substitution des verbleibenden Chloratoms am Ringsystem.
Figur 5 zeigt die Darstellung der Zyklisierung von Dipeptiden mittels Cyanurchlorid in
Abhängigkeit vom Einfluß der Aminosäureseitenketten.
Figur 6 zeigt die Darstellung der Festphasenzyklisierung von Dipeptiden in
Abhängigkeit von der Länge der in der Zyklisierung involvierten Aminosäureseitenketten.
Figur 7 zeigt die „Kopf zu Rückgrat" Zyklisierung an Peptomeren. Figur 8 zeigt die Darstellung der nukleophilen Substitution an zyklischen Monochlor- 1 ,3,5-triazinylpeptiden.
Figur 9 zeigt eine „Kopf zu Schwanz" Zyklisierung in Lösung.
Figur 10 zeigt die Aromaten des erfindungsgemäßen Verfahrens, wobei beispielhaft für das Halogen ein Chloratom eingesetzt wurde. Das Chloratom soll in den allgemeinen Formeln durch Halogen ersetzt werden.
Alle Peptide und Peptidomimetika können gegebenenfalls Schutzgruppen umfassen.
Die Schutzgruppe an N - Terminus kann bestehen aus: Alkyl-, Aryl-, Alkylaryl-, Arylalkyl-, Alkylcarbonyl-, Arylcarbonyl-, Alkylsulfonyl-,
Arylsulfonyl-, Alkyloxycarbonyl- oder Aryloxycarbonylgruppen mit 1 bis 10
Kohlenstoffatomen, bevorzugt sind Fluorenylmethoxycarbonyl-, tert. Butyloxycarbonyl-,
Benzoyloxycarbonyl- oder eine Tritylgruppe.
Die Schutzgruppe C - Terminus kann bestehen aus: Eine Alkoxy- oder Aryloxygruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder aus einer
Aminogruppe.
Weitere Schutzgruppen sind in Houben-Weyl (1974) Georg Thieme Verlag, 4. Auflage beschrieben. Die Beschreibung der Schutzgruppen in der zitierten Literaturangabe ist Teil der Offenbarung.
Begriffsdefinitionen:
Peptid: Im Kontext der voriiegenden Anmeldung beinhaltet der Terminus „Peptid" auch Peptidderivate und Analoga, die mindestens eine Peptidbindung enthalten.
Peptidomimetikum
Verbindungen in denen eine oder mehrere physiologisch labile Peptidfunktionaiitäten durch chemische Module mit erhöhter Stabilität und Zellgängigkeit modifiziert wurden. (Kaznierski, W.M. (Ed) Peptidomimetics Protocols, Methods in Molecular Medicine, Human Press, Totowa, NJ, 1999 and Soth, M.J. et al. Current Opinion in Chemical Biol. 1997, Vol 1 page 120 and Thompson, L.A. et al. Chem. Rev. (1996) Vol 96, page 555.
Peptoid:
Oligo-N-alkyl-glycin bei dem formell betrachtet die Seitenketten der Peptide vom α- Kohlenstoffatom der Aminosäuren auf die Amidfunktion übertragen werden. Peptomer:
Hybrid oder Konjugat aus Peptid- und Peptoidbausteinen
Abkürzungsliste:
Beispiele
Anhand der folgenden Synthesebeispiele soll aufgezeigt werde, daß es sich bei der Methode um ein generell anwendbares neues Verfahren handelt, mit dem es gelingt, in einer sehr effektiven Art und Weise peptidomimetische zyklische Verbindungen mit einer außergewöhnlichen strukturellen Vielfalt zu erzeugen.
Allgemeine Peptidsynthese:
Alle Peptide (falls nicht anders vermerkt), die in der voriiegenden Anmeldung für Zyklisierungsuntersuchungen verwendet wurden, wurden mittels schrittweiser Festphasensynthese unter Verwendung der SPOT-Synthesetechnologie [Frank, R. Tetrahedron, 1992, 48, 9217] an Amin-fuπktionalisierten Zellulosemembranen (Whatman 50, Whatman, Maidstone, UK) hergestellt. Dabei wurden die Membranen zunächst mit einem photolysierbaren Linker (4-2[-Methoxy-4-(1-Fmoc-aminoethyl)-5- nitrophenoxyj-butansäure) modifiziert [Ast, T. Tetrahedron Lett. 1999, 40, 4317]. Alle Peptide wurden dann mitttels Fmoc-geschützten Aminosäure-Pentafluorphenylestern unter identischen Bedingungen schrittweise aufgebaut (spotten von 2 μl einer 0,3 M Lösung in NMP, Doppelkupplung 2 x 15 min, Fmoc-Abspaltung mittels 20%iger Piperidin-Lösung in DMF). Dabei kamen die folgenden Seitenkettenschutzgruppen zum Einsatz: Arg(Pbf), Asn(Trt), Asp(OtBu), Cys(Trt), Glu(OtBu), GlnfTrt), His(Trt), Lys(BOC) oder Lys(Mtt), Ser(tBu), Thr(tBu), Tηp(BOC), Tyr(tBu). Die Seitenkettenschutzgruppen wurden 2,5h mit einer Lösung aus 5%Wasser, 5%Phenol, 2,5% Triisopropylsilan in TFA gespalten. Die orthogonale Lysin- Schutzgruppe (Mtt) konnte in 1h unter Verwendung einer Lösung aus 1% TFA und 5% Triisopropylsilan in DCM gespalten werden, ohne die anderen säurelabilen Schutzgruppen zu beeinträchtigen.
Nach ausgiebiger Wäsche mit DCM und Methanol wurden die Membranen getrocknet und die Peptide entweder den Zyklisierungsreaktionen zugeführt oder durch Bestrahlung mit UV-Licht (2 h, 365 nm) von der Oberfläche gespalten. Die adhäsiv auf der Membran gebundenen Verbindungen konnten nach dem Ausstanzen und Überführen in Mikrotiterplatten mittels Puffer abgelöst und der Analytik zugeführt werden. Die durchschnittliche Peptidbeladung pro Spot betrug ca. 200 nmol. Beispiel 1 : Zyklisierung von Modelipeptiden mit schrittweise verkürzten Kettenlängen mittels Cyanurchlorid.
Die folgenden Modellpeptide unterschiedlicher Kettenlänge wurden nach der allgemeinen Peptidsynthesestrategie mittels SPOT-Synthese an Photolinker- modifizierten Zellulosemembranen aufgebaut:
1. Gly Ala Phe Gly Ala Phe Gly Ala Phe Lys
2. Ala Phe Gly Ala Phe Gly Ala Phe Lys 3. Phe Gly Ala Phe Gly Ala Phe Lys
4. Gly Ala Phe Gly Ala Phe Lys
5. Ala Phe Gly Ala Phe Lys
6. Phe Gly Ala Phe Lys
7. Gly Ala Phe Lys 8. Ala Phe Lys
9. Phe Lys
Nach Deblockierung der N-terminalen Fmoc-Schutzgruppe mittels 20% Piperidin/DMF und Wäsche (5xDMF, 3xMeOH, 1xDCM) wurden die freien N-Termini der festphasengebundenen Peptide mittels einer 3 M Cyanurchlorid-Lösung in DCM bei Raumtemperatur für 15 min alkyliert. Nach Waschen der Membran (5xDMF, 3xMeOH, 1xDCM) wurde die BOC-Schutzgruppe der ε-Aminofunktion vom Lysin durch 30 minütiges Baden der Membran in einer Lösung aus 5% Wasser in 90% TFA/DCM entfernt. Nach einer erneuten Wäsche (2xDCM, 2xDMF) gelang die Zyklisierung mit 30%iger DIEA in DMF bei Raumtemperatur innerhalb von 30min. Nach Wäsche der Membran (5xDMF, 3xMeOH, 1xDCM) und Trocknen erfolgte die Spaltung der zyklisierten Verbindungen von der Zelluloseoberfläche durch UV-Bestrahlung bei 365 nm (120 min). Die adhäsiv auf der Membran gebundenen Verbindungen konnten nach dem Ausstanzen und Überführen in Mikrotiterplatten mittels Puffer abgelöst und der HPLC/MS-Analytik zugeführt werden. In allen Fällen konnte das gewünschte zyklische Zielpeptid mit hoher Reinheit identifiziert werden. Es wurden keinerlei 1,3,5-Triazin- verbrückte lineare oder verbrückte, zyklische Peptide beobachtet. Beispiel 2: Synthese von zyklischen Peptiden mit systematisch verkleinerten Ringgrößen durch unterschiedliche Positionierung der nukleophilen Reaktionspartner in linearen Vorgängermolekül gleicher Kettenlänge.
Die folgenden Modellpeptide wurden wie unter Beispiel 1. beschrieben schrittweise synthetisiert und unter identischen Bedingungen mit Cyanurchlorid umgesetzt und nach Abspaltung der BOC-Schutzgruppe am Lysin analog zu Beispiel 1 zyklisiert:
10. Gly Ala Phe Gly Ala Phe Gly Ala Phe Lys 11. Gly Ala Phe Gly Ala Phe Gly Ala Lys Phe
12. Gly Ala Phe Gly Ala Phe Gly Lys Ala Phe
13. Gly Ala Phe Gly Ala Phe Lys Gly Ala Phe
14. Gly Ala Phe Gly Ala Lys Phe Gly Ala Phe
15. Gly Ala Phe Gly Lys Ala Phe Gly Ala Phe 16. Gly Ala Phe Lys Gly Ala Phe Gly Ala Phe
17. Gly Ala Lys Phe Gly Ala Phe Gly Ala Phe
18. Gly Lys Ala Phe Gly Ala Phe Gly Ala Phe
19. Lys Gly Ala Phe Gly Ala Phe Gly Ala Phe
Nach photolytischer Spaltung zeigten die resultierenden HPLC-MS Analysen, daß alle Peptide, unabhängig von der Ringgröße, mit hohen Reinheiten hergestellt werden konnten. Eine Ausnahme bildet das Peptid 19, bei dem aufgrund der sterischen Hinderung keine Zyklisierung von der α-Aminogruppe des Lysins auf die entsprechende ε-Aminofunktion möglich war.
Beispiel 3: Untersuchungen zur Festphasenzyklisierung von Dipeptiden mittels Cyanurchlorid
A.) Einfluß der Seitenketten auf die Zyklisierungstendenz
Die bisherigen Untersuchungen zur Zyklisierung an Modellpeptiden waren darauf gerichtet, die Limitierungen hinsichtlich der erreichbaren Ringgrößen zu detektieren. Dabei wurden neben dem Lysin als Zyklisierungspartner keine weiteren Aminosäuren verwendet, die durch zusätzliche Seitenkettenfunktionalitäten die Zyklisierungsreaktionen hätten beeinträchtigen können. Um die generelle Anwendbarkeit der Methode in Abhängigkeit der Seitenketten proteinogener Aminosäuren und die Kompatibilität mit kommerziellen Schutzgruppenstrategien zu testen, wurden Dipeptide der Struktur NH∑-AS-LysfMtt)- Träger bzw. Tripeptide der Struktur NHr-Ala-AS-Lys( f -TAao;er (AS = proteinogene Aminosäuren außer Cys) gemäß der unter Beispiel 1 beschriebenen Synthesestrategie synthetisiert (Figur 5). Die freien N-terminalen Aminofunktionalitäten wurden wie unter Beispiel 1 beschrieben mit Cyanurchlorid umgesetzt. Im Anschluß wurde die Mtt- Schutzgruppe in Gegenwart der beschriebenen Schutzgruppen selektiv entschützt (siehe allgemeine Peptidsynthese). Die Anwendung der genannten Zyklisierungsbedingungen, nachfolgende Entschützung der verbleibenden orthogonalen Schutzgruppen und photolytische Spaltung der Zyklen vom Träger führte zu Produkten die nach LC-MS Analytik in allen Fällen dem entsprechenden konformationell eingeschränkten zyklischen Dipeptid, bzw. Tripeptid entsprachen.
B.) Schrittweise Verkleinerung der Ringgröße durch Verwendung nichtproteinogener Aminosäuren mit verkürzten Seitenketten
Nachdem gezeigt werden konnte, daß selbst kleine konformationell rigide zyklische
Peptidomimetika auf Dipeptidbasis zugänglich sind, sollte untersucht werden, inwieweit die Effektivität der Zyklisierung von der Länge der in der Zyklisierung involvierten
Seitenkette abhängig ist. Dazu wurden Dipeptide der in Figur. 16 gezeigten Struktur mit schrittweise verkürzter Seitenkette synthetisiert und unter den beschriebenen
Standardbediπgungen zyklisiert.
Die analytischen Daten der zyklischen, von der Cellulosemembran gespaltenen Verbindungen zeigten, daß sich die Reinheiten der zyklischen Produkte bei den kürzesten Seitenketten verschlechtern.
Beispiel 4. Zykliserung von Peptomeren
Die vielfältigen Anwendungsmöglichkeiten der neuen Methode sind erweiterbar, wenn die Zyklisierung auf Peptid-verwandte Oligomere übertragen wird. Beispielsweise eröffnet die Synthese von Peptomeren (Hybride aus Peptiden und Peptoiden) bzw. Peptoiden, die zu N-alkylierten Verbindungen führt, die Möglichkeit auch Zyklisierungen auf das Rückgrat des Peptidomimetikums durchzuführen (siehe Schema I) [Gilon, C. et al. Biopolymers 1991 , 31 , 745]. Um diese Zyklisierungsvariante zu testen, wurden die in Abbildung 6 dargestellten Peptomere synthetisiert. Dazu wurde wie in der allgemeinen Synthesestrategie beschrieben die Zellulosemembran zunächst mit dem Photolinker modifiziert. Die nach Fmoc-Abspaltung freigesetzte Aminofunktion wurde mit Bromessigsäure-2-4- dinitrophenylester unter Spotsynthesebedingungen umgesetzt (spotten von 2 μl einer 1 M Lösung in NMP, Doppelkupplung 2 x 15 min). Die Brommethyl-Gruppe wurde dann in einer nukleophilen Substitution mit den in Figur 7 gezeigten Mono-BOC-geschützten Diaminen umgesetzt (spotten von 2 μl einer 50%igen Lösung in NMP, 2 x15 min). Das entstehende sekundäre Amin wurde nach Wäsche (SxDMF, 3xMeOH, 1xDCM) mit Fmoc-Phe-OH/DIC (1 : 0,5) in NMP (O.5M) umgesetzt (spotten von 2 μl der voraktivierten Lösung, Voraktivierung: 10 min, Doppelkupplung 2 x 15 min). Nach Deblockierung der N-teπminalen Fmoc-Schutzgruppe mittels 20% Piperidin/DMF und Wäsche (5xDMF, 3xMeOH, 1xDCM) wurden die freien N-Termini der festphasengebundenen Peptomere wie in Beispiel 1 beschrieben mit Cyanurchlorid umgesetzt. Nach Waschen der Membran konnten die BOC-Schutzgruppen der Aminofunktionen der Peptoidbausteine durch 30 minütiges Baden der Membran in einer Lösung aus 5% Wasser in 90%TFA/DCM entfernt werden. Nach einer erneuten Wäsche gelang die Zyklisierung mit 30%iger DIEA in DMF bei Raumtemperatur innerhalb von 30min. Nach Wäsche der Membran (5xDMF, 3xMeOH, 1xDCM) und Trocknen erfolgte die Spaltung der zyklisierten Verbindungen von der Zelluloseoberfläche durch UV-Bestrahlung bei 365 nm (120 min). LC-MS Analyse der Verbindungen zeigte, daß in allen Fällen das gewünschte Produkt erhalten wurde.
Beispiel 5: Untersuchungen zur Substitution des Chloratoms an festphasengebundenen zyklischen Monochlor-1 ,3,5-Triazinylpeptiden.
Die Synthese des festphasengebundenen zyklisierten Modell-Tripeptides AFK erfolgte wie unter Beispiel 1 beschrieben. Anschließend wurden je 2μl 50%ige Aminlösung (p- Methoxybenzylamin, Anilin, 3-Aminopropanol, Zyklohexylamin, Mono-BOC-1,3- Diaminopropan und n-Butylamin), je 2 μl 1 M Cäsiumphenolatlösung (Vanilin und 4- Fluorphenol) bzw. je 2μl 50% Mercaptanlösung (Phenylethymercaptan und 3- Mercaptopropioπsäuremethylester) auf die luftgetrocknente Membran gespottet (Figur 8). Die gesamte Membran wurde drei Minuten in einer Haushaltsmikrowelle (650 W) erwärmt. Der Reagenzienüberschuß wurde durch waschen mit DMF, Methanol und DCM (je 3x 5 min) entfernt. Nach Abspaltung mittels UV-Bestrahlung zeigte die LC-MS Analyse der Verbindungen, daß in allen Fällen das gewünschte Produkt in hohen Reinheiten erhalten wurde.
Beispiel 6: Testung unterschiedlicher mehrfachhalogenierter azaaromatischer Verbindungen zur Festphasenzyklisierung
Die Synthese des linearen Tripeptides AFK erfolgte wie unter Beispiel 1 beschrieben. Auf den Fmoc entschützten N-Terminus wurde eine 2 M Lösung von 2,4,6,8 - Tetrachloropyrimido[5,4-d}pyrimidin oder eine 5 M Lösung von 2,4,6 - Trichloro- pyrimidin in NMP mit 1 eq DIEA gespottet. Nach 2 h bei Raumtemperatur wurde durch Waschen mit DMF, Methanol und DCM (je 3x ä 5 min) der Reagenzienüberschuß entfernt. Nach Waschen der Membran (5xDMF, 3xMeOH, 1xDCM) wurde die BOC - Schutzgruppe der ε - Aminofunktion vom Lysin durch 30 - minütiges Baden der Membran in einer Lösung aus 5% Wasser in 90 % TFA/DCM entfernt. Nach einer erneuten Wäsche (2xDCM, 2xDMF) gelangt die Zyklisierung mit 30% - iger DIEA in DMF bei Raumtemperatur innerhalb von 2 h (2,4,6,8 - Tetrachloro - pyrimido[5,4- d]pyrimidin) bzw. über Nacht (2,4,6 - Trichloro - pyrimidin). Nach Wäsche der Membran (5xDMF, 3xMEOH, 1xDCM) und Trocknen erfolgte die Spaltung der zyklisierten Verbindungen von der Zelluloseoberfläche durch UV - Bestrahlung bei 365 nm über 120 Minuten.
Beispiel 7: „Kopf zu Schwanz" -Zyklisierung von Peptidomimetika in Lösung
Alle bisherigen Untersuchungen beinhalteten Synthesen und Zyklisierungen von Peptiden und Peptidomimetika im festphasengebunden Zustand. Da in der Regel die C-
Termini am Träger verankert sind, muß eine „Kopf zu Schwanz"- Zyklisierung in Lösung erfolgen. Das folgende Beispiel beschreibt einen solchen Ringschluß an einem
Dipeptidmimetikum welches an einem Carbamat-Linker aufgebaut wurde.
Aufgrund der synthetischen Unzugänglichkeit von Carbamat-Linkem auf Cellulose wurde eine aminofunktionalisierte Polypropylen-Membran [Volkmer-Engert, R. et al. In
Peptides 1998, S. Bajus, F. Hudecz Ed., 1999 Akademiai Kiado Budapest, 118] mit
Bromessigsäurebromid unter Basenkatalyse acetyliert (2 M in DCM, kat. DABCO, 30 min, RT). Die so erhaltene Bromfunktion wurde mit einer 1 M Lösung des Cäsiumsalzes von p-Hydroxybenzaldehyd in DMSO bei RT innerhalb 1 h substituiert. Durch Reduktion mit Natriumborhydrid (2 M in Methanol) für 15 min wurde eine benzylische
Alkoholfunktion generiert, die mit 4-Nitrophenyl-chloroformiat (1 M in DCM, kat. NEM) bei RT für 1 h umgesetzt wurde. Das erhaltene Aktivcarbonat wurde mit Ethylendiamin (50% in DMF, RT 2h) zum entsprechenden Carbamat umgesetzt. An der ß- Aminofunktion wurde nach dem allgemeinen Spot-Syntheseprotokoll sukzessive Phenylalanin und Alanin gekuppelt. Nach Deblockierung der N-terminalen Fmoc- Schutzgruppe mittels 20% Piperidin/DMF und Wäsche (5xDMF, 3xMeOH, 1xDCM) wurde der freie N-Terminus des festphasengebundenen des Peptides wie in Beispiel 1 beschrieben mit Cyanurchlorid umgesetzt. Das so erhaltende Dichloro-Triazin-Derivat wurde mit 80% iger TFA in DCM für 30 min bei RT von der Membran abgespalten (Figur 9, Verbindung 1). Die überschüssige TFA und das DCM wurden in Vakuum entfernt und in 50 μl einer 50% igen Lösung von Acetonitril in Wasser aufgenommen. Davon wurden 10 μl mittels LC-MS analysiert. Die Zyklisierung gelang durch Zugabe von 2 μl DIEA und schütteln für 30 min bei RT (Figur 9, Verbindung 2). Anschließend wurde erneut im Vakuum zur Trockene eingeengt und in 50 μl einer 50% igen Lösung von Acetonitril in Wasser aufgenommen und das Reaktionsprodukt mittels LC-MS anaylsiert.
Beispiel 8: „Kopf zu Seitenkette" Zyklisierung unter Verwendung alternativer Amino-Seitenketten
Folgende Peptide wurden nach dem allgemeinen Syntheseprotokoll für Peptide der Spotsynthese aufgebaut: AFH(BOC), AFR(Pmc) und AFW(BOC). Nach Deblockierung der N-terminalen Fmoc-Schutzgruppe mittels 20% Piperidin/DMF und Wäsche (5xDMF, 3xMeOH, 1xDCM) wurden die freien N-Termini der festphasengebundenen Tripeptide wie in Beispiel 1 beschrieben mit Cyanurchlorid umgesetzt. Nach Waschen der Membran wurden BOC-Schutzgruppen bzw. die Pmc-Schutzgruppe der Aminofunktionen durch 30 minütiges Baden der Membran mit einer Lösung aus 5% Wasser in 90%TFA/DCM entfernt. Nach einer erneuten Wäsche gelang die Zyklisierung mit 30%iger DIPEA in DMF bei Raumtemperatur innerhalb von 60 min. Nach Wäsche der Membran (5xDMF, 3xMeOH, 1xDCM) und Trocknen erfolgte die Spaltung der zyklisierten Verbindungen von der Cellulose.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Synthese von zyklischen Peptiden oder Peptidomimetika durch sequentielle nukleophile Substitutionen an mehrfachhalogenierten Aromaten mit der folgenden Formel: mehrfachhalogenierten Aromaten mit der folgenden Formel:
(i) 2,4,6-Trihalogeno-S-triazin oder 2,4,6-Trihalogen-1,3,5-triazin; (ii) 2,4,6,8 - Tetrahalogenopyrimido[5,4-d]pyrimidin; (iii) 2,4,6 - Trihalogeno - pyrimidin; (iv) 2,6,8 - Trihalogeno-7-methyl-7rY-purin; (v) 2,4 - Dihalogeno - 6,7 - dimethoxy - quinazolin;
(vi) 2,4 - Dihalogeno - pyrimidin; (vii) 2,6,8, - Thrihalogeno - 7H- purin; (viii) 2,4,6,7 - Tetrahalogeno - pteridine; dabei steht Halogen für Chlor, Fluor Jod und Brom, bevorzugt Chlor, wobei die Reaktion die folgenden Schritte umfaßt:
(i) ein lineares Peptid oder Peptidomimetikum mit einer freien nukleophilen Funktionalität, wobei die nukleophile Funktionalität ein Alkohol, Thiol oder Amin ist, und wobei sich die nukleophile Funktionalität entweder an einem Ende, in der
Seitenkette oder am Rückgrat des Peptids oder Peptidomimetikums befindet, wird mit dem Aromaten im Sinne einer einfachen nukleophilen aromatischen Substitution umgesetzt, wobei sich das Peptid oder Peptidomimetikum in Lösung oder in einem festphasengebundenen Zustand befindet (ii) die Schutzgruppe einer weiteren nukleophilen Funktionalität am gleichen Peptid oder Peptidomimetikum wird selektiv gespalten wobei die freigesetzte nukleophile Funktionalität ein Alkohol, Thiol oder Amin ist, und wobei sich die nukleophile Funktionalität entweder an einem Ende, in der Seitenkette oder am Rückgrat des Peptids oder Peptidomimetikums befindet (iii) Zyklisierung durch Zusetzen eines tertiären Amins oder einer anderen Base, wobei die Zyklisierung durch nukleophile aromatische Substitution eines weiteren Halogenatoms des am Peptid oder Peptidomimetikum - gebundenen Halogen - Aromaten durch die freigesetzte nukleophile Funktionalität erfolgt
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der mehrfachhalogenierte Aromat ein Cyanurchlorid oder-fluorid ist Mehr bevorzugt ist ein Cyanurchlorid.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die verbleibenden Halogenatome in weiteren nukleophilen aromatischen Substitutionsreaktionen umgesetzt werden, wobei das Nukleophil ein Alkohol, ein Thiol oder ein Amin ist.
4. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Nukleophil ein Teil desselben Peptides oder Peptidomimetikums ist oder ein Teil eines anderen Moleküls ist.
5. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Peptid oder Peptidomimetikum mittels Festphasen- oder Lösungssynthese aufgebaut werden.
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