ES2307039T3

ES2307039T3 - Preparacion de los peptidos de la somatostatina.

Info

Publication number: ES2307039T3
Application number: ES04763881T
Authority: ES
Inventors: Heribert Hellstern; Werner Pachinger; Walter Prikoszovich; Bernhard Wietfeld
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2003-08-08
Filing date: 2004-08-06
Publication date: 2008-11-16
Anticipated expiration: 2024-08-06
Also published as: CN1832962A; CA2534224A1; TNSN06045A1; HK1090065A1; CN102127155B; BRPI0413437A; NZ544961A; PT1654280E; RU2360921C2; KR20060070541A; EP1654280A2; MY141731A; CY1108775T1; MXPA06001525A; US7615609B2; AR045327A1; PL1654280T3; PE20050356A1; KR101136633B1; MA27982A1

Abstract

Un proceso para la producción de un compuesto de fórmula I (Ver fórmula) en donde R1 es un -alquileno C2-6-NR3R4, -alquileno C2-6-guanidina o-alquileno C2-6-COOH en donde cada uno de R3 y R4 independientemente es un H, alquilo C 1-4, infinito-hidroxi-alquileno C 2-4 o acil o R 3 y R 4 forman juntos con el átomo de nitrógeno al cual ellos se unen, un grupo heterocíclico que puede comprender otro heteroátomo, y R2 es Z1-CH2-R5, -CH2CO-O-CH2-R5, (Ver fórmula) en donde Z1 es O o S y R5 es opcionalmente un fenil sustituido, o una sal de estos, que comprende la ciclización de una análogo de somatostatina lineal de fórmula II (Ver fórmula) en donde R1 y R2 son como se definen anteriormente, cada uno de R 11 y R 12, independientemente, es un grupo protector amino Por lo cual cuando R1 comprende un terminal NH2, este terminal NH2 también se protege por un grupo protector amino, y donde se requiere retirar el o los grupos protectores, y la recuperación de un compuesto de fórmula I obtenido de esta manera en la forma libre o en la forma de sal.

Description

Preparación de los péptidos de la somatostatina.

La presente invención se relaciona con un proceso para preparar los análogos de somatostatina cíclica y los intermedios utilizados en este proceso.

Más particularmente la invención proporciona un proceso para preparar un análogo de la somatostatina cíclica de fórmula I

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en donde

R_{1} es un -alquileno C_{2-6}-NR_{3}R_{4}, -alquileno C_{2-6}-guanidina o -alquileno C_{2-6}-COOH en donde cada uno de R_{3} y R_{4} independientemente es un H, alquilo C_{1-4}, \infty-hidroxi-alquileno C_{2-4} o acil o R_{3} y R_{4} forman juntos con el átomo de nitrógeno al cual ellos están unidos un grupo heterocíclico que puede comprender otro heteroátomo, y

R_{2} es Z_{1}-CH_{2}-R_{5}, -CH_{2}-CO-O-CH_{2}-R_{5}

2

en donde Z_{1} es O o S y R_{5} es opcionalmente un fenil sustituido,

o una sal de estos.

Cualquier acil puede ser por ejemplo, R_{a}CO- en donde R_{a} es un H, alquilo C_{1-4}, alquenilo C_{2-4}, cicloalquilo C_{3-6} o bencil. Cuando NR_{3}R_{4} forma un grupo heterocíclico, tal grupo puede ser aromático o saturado y puede comprender un nitrógeno o un nitrógeno y un segundo heteroátomo seleccionado del nitrógeno y el oxígeno. Preferiblemente el grupo heterocíclico es por ejemplo, piridilo o morfolino. El alquileno C_{2-6} es preferiblemente -CH_{2}-CH_{2}-. Cuando R_{5} es un fenil sustituido, el anillo fenilo puede ser sustituido por un halógeno, metil, etil, metoxi o etoxi, por ejemplo, en orto y/o para. Preferiblemente R_{5} es un fenil no sustituido.

Los aminoácidos en la posición 2 y/o 5 pueden tener la configuración D o L. Preferiblemente cada uno de ellos tiene la configuración L.

Los compuestos de fórmula I pueden existir por ejemplo, en forma libre o de sal. Las sales incluyen sales de adición de ácido con por ejemplo, ácidos orgánicos, ácidos poliméricos o ácidos inorgánicos, por ejemplo con ácido clorhídrico, ácido acético, ácido láctico, ácido aspártico, ácido benzoico, ácido succínico o ácido pamoico, o por ejemplo, sales de metal alcalino cuando R_{1} comprende un grupo COOH. Las sales de adición de ácido pueden existir como sales mono o divalentes, por ejemplo, dependiendo si 1 o 2 equivalentes ácidos se adicionan al Compuesto de fórmula I en la forma de base libre. Las sales preferidas son la di-sal aspartato o la monosal pamoato.

El proceso de producción de acuerdo con la invención comprende una etapa de ciclización de un péptido lineal correspondiente en forma protegida. Se ha encontrado sorprendentemente que la etapa de ciclización particularmente es dependiente de la selección de los 2 aminoácidos terminales del péptido lineal correspondiente. Fuera de 6 posibles ciclizaciones, se ha encontrado sorprendentemente que la ciclización entre los aminoácidos 3 y 4, o 4 y 5, o 6 y 1 proporciona resultados significantemente interesantes. La ciclización entre los aminoácidos 4 y 5 particularmente se prefieren. La ciclización de acuerdo con la invención entre los aminoácidos 3 y 4, o 4 y 5, o 6 y 1 conducen a producciones mejoradas con reducida isomerización en los sitios quirales. Adicionalmente, estas etapas de ciclización se pueden realizar con condiciones y reactivos menos rigurosos: por ejemplo, la ciclización con el uso de una azida se pueden evitar.

En una primera modalidad de la invención, se proporciona un proceso para preparar un compuesto de fórmula I o una sal de estos como se indica arriba, que comprende la ciclización de un análogo de somatostatina lineal de fórmula II

3

o de fórmula III

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o de fórmula IV

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en donde R_{1} y R_{2} son como se definen,

cada uno de R_{11} y R_{12}, independientemente, es un grupo protector amino.

Por lo cual cuando R_{1} comprende un terminal NH_{2}, este terminal NH_{2} también se protege por un grupo protector amino,

y donde se requiere retirar el o los grupos protectores,

y la recuperación de un compuesto de fórmula I obtenido de esta manera en la forma libre o en la forma de sal.

Los grupos protectores amino apropiados son por ejemplo, como se describen, por ejemplo, en "Protective Groups in Organic Synthesis", T. W. Greene et al., John Wiley & Sons Inc., Second Edition 1991. Ejemplos de tales grupos protectores amino son por ejemplo, grupos acetil o amino como se utiliza en la síntesis de péptidos, por ejemplo, ter-butoxi-carbonil, carbobenzoxi, fluorenilmetoxicarbonil, aloxicarbonil, 1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohexilideno)etil, 1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohexilideno)-3-metilbutil, 4-metiltritil. (W.C. Chan y P.D. White, Fmoc solid Phase Peptide Synthesis, Oxford University Press, 2000).

La ciclización se puede realizar convenientemente en la presencia de un derivado basado en aminio- o fosfonio- por activación carboxi in situ por ejemplo, O-(benzotriazol-1-il)N,N,N',N'-tetrametiluronio-hexafluorofosfato, benzotriazol-1-iloxitris(pirrolidino) fosfonio hexafluorofosfato, N-[(1H-benzotriazol-1-il)(dimetilamino) metileno]-N-metil metanaminio tetrafluoroborato N-óxido, N-[(dimetilamino)-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridina-1-ilmetileno]-N-metilmetanaminio, 7-azabenzotriazol-1il-oxitris(pirrolidino)-fosfonio hexafluorofosfato. Preferiblemente la reacción se puede realizar en la presencia de una base, por ejemplo, una amina orgánica, por ejemplo, N-etil diisopropil amina, N-metilmorfolina, trietilamina, o tribencil amina, y en la presencia de un nucleofilo auxiliar, por ejemplo, 1-hidroxibenzotriazol, N-hidroxisuccinamida, 3-hidroxi-3,4-dihidro-1, 2,3-benzotriazina-4-ona o 1-hidroxi-7-azabenzotriazol.

La ciclización de un compuesto de fórmula II, III o IV conduce a un compuesto de fórmula I en forma protegida, i.e. un compuesto de fórmula I en donde uno o más o todos los grupos amino presentes en la molécula se protegen por un grupo protector amino. Ejemplos de tales compuestos son por ejemplo, ciclo[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-CO-O)-Pro-Phg-D-Trp (Boc)-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-], ciclo[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-CO-O)-Pro-Phg-D-Trp-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-] y ciclo[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-CO-O)-Pro-DPhg-D-Trp-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-].

Los grupos protectores amino se pueden eliminar de acuerdo con métodos conocidos en el oficio, por ejemplo, por división, por ejemplo, con ácido trifluoroacético; 3M HCl, EtOAc; Me_{3}CCl, fenol, CH_{2}Cl_{2}; H_{2}SO_{4} al 10%, dioxano; bromocatecolborano.

Los compuestos de fórmulas II, III y IV o las sales de estos son novedosos y forman parte de la invención. Estos compuestos se pueden preparar por la unión con dos unidades peptídicas de un enlace amida, cada uno de ellos que contiene al menos un aminoácido en forma protegida o desprotegida, en donde el enlace amida es de tal manera, que se obtiene la secuencia de aminoácido deseada como se define en las fórmulas II, III o IV.

La síntesis se puede realizar de acuerdo con métodos conocidos en el oficio, por ejemplo, en solución o por síntesis de fase sólida, iniciando con el primer aminoácido. En la síntesis de fase sólida, el primer aminoácido se une a una resina, por ejemplo, una resina basada en el poliestireno disponible comercialmente, opcionalmente a través de un ligador apropiado, por ejemplo, un ligador que se divide bajo condiciones suaves para mantener la protección de la cadena lateral intacta, por ejemplo, un ligador basado en un tritil opcionalmente sustituido, por ejemplo 4-(hidroxil-difenil-metil)-ácido benzoico en donde uno de los grupos fenilo puede ser opcionalmente sustituido, por ejemplo, por un Cl. La creación de la cadena peptídica deseada, tanto en solución como por síntesis de fase sólida, se puede llevar a cabo de manera convencional, por ejemplo, utilizando los aminoácidos en donde los grupos amino terminal son Fmoc-protegidos, los grupos amino de cadena lateral donde se presentan que son protegidos con un grupo protector amino diferente, por ejemplo, Boc o CBO.

Cuando la síntesis se realiza por síntesis de fase sólida, el péptido creado luego se elimina de la resina de acuerdo con métodos conocidos en el oficio, por ejemplo, con ácido acético; ácido trifluoracético; ácido acético-trifluoroetanol-diclorometano; hexafluoroisopropanol en diclorometano. Un proceso preferido para remover el péptido creado de la fase sólida, por ejemplo, cuando se utiliza un ligador basado en tritil no-clorinado, es por ejemplo, el tratamiento con metanol/diclorometano, preferiblemente a temperatura ambiente, o un tratamiento con una cetona, por ejemplo, etil metil cetona, preferiblemente a una temperatura de aproximadamente 50ºC.

Ejemplos de los compuestos de fórmulas II, III y IV son por ejemplo,

H-Lys(Boc)-D-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-CO-O)-Pro-Phg-D-Trp(Boc)-OH

H-Lys(Boc)-D-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-CO-O)-Pro-Phg-D-Trp-OH

H-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-CO-O)-Pro-Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-OH

H-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-CO-O)-Pro-DPhg-DTrp(Boc)-Lys(Boc)-OH

H-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-CO-O)-Pro-Phg-DTrp-Lys(Boc)-OH

H-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-CO-O)-Pro-Phg-D-Trp(Boc)Lys (Boc)-OH.

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Los compuestos de fórmula II, III o IV pueden existir en una forma de sal como se revela anteriormente para los compuestos de fórmula I.

Los compuestos de fórmula I son preciados agonistas de la somatostatina, y tienen propiedades farmacológicas interesantes como se revela por ejemplo, en WO 97/01579 o WO 02/10192, los contenidos de estos que revelan las propiedades farmacológicas, se incorporan aquí por referencia. Un compuesto preferido es el ciclo [{(4-NH_{2}-C_{2}H_{4}-NH-CO-O)-Pro}-Phg-DTrp-Lys- Tyr(4-Bencil)-Phe], o una sal de estos. Las sales preferidas son el aspartato (mono- o di-aspartato) o pamoato.

Cuando se utiliza el proceso de la invención, se puede obtener, un rendimiento de la ciclización del péptido lineal correspondiente de fórmula II, III o IV mayor del 70%.

Los siguientes ejemplos son ilustrativos de la invención. Todas las temperaturas se dan en ºC.

Se utilizaron las siguientes abreviaturas:

Bzl = bencil

DAEM = dietilamina

DICI = diisopropil carbodiimida

DMF = N,N-dimetilformamida

DPPA = difenilfosforil azida

EDIPA = N-etil diisopropil amina

HBTU = O-(benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio-hexafluorofosfato

HOBT = 1-hidroxi-benzotriazol

IPA = alcohol isopropílico

Phg = fenilglicina

RT = temperatura ambiente

TBME = ter-butilmetil éter

Ejemplo 1 [H-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-CO-O)-Pro-Phg-D-Trp-Lys(Boc)-OH]

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10,4 g (FMOC-Tyr(Bzl)-Phe-[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-CO-O)]-Pro-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OH) se disolvieron en 100 ml de DMF. A RT se adicionan 2,0 ml de dietilamina y se agitan continuamente por 4 horas a RT. La solución de color amarillo claro se evapora a 40º. Al residuo se le adicionan 150 ml de isopropil acetato. Que se siembran y se agitan por 18 horas a RT, se filtra y se lava con 20 ml de isopropil acetato. Secando a 40º. HPLC 87,5% b.a. (17,6 min).ESI-MS: 1287,5(M+Na)^{+}; ^{1}HNMR (DMSO) (\delta, DMSO): 1.14(2H, m), 1.33 (2H, m), 1.37(18H, m), 1.53(1H, m), 1.64(1H, m), 2.06(1H, m), 2.22(1H, m), 2.78-3.15(12H, m), 3.38(1H, m), 3.79(2H, br), 4.12(1H, m), 4.55-4.75(3H, m), 5.06(2H, s), 5.15(1H, d), 5.54(1 H, d), 6.75(1H, br), 6.83(1H, br), 6.89(2H, d), 6.94(1 H, t), 6.99(1 H, s), 7.43(2H, d), 7.10-7.50(arom.H), 7.59(1H, d), 8.14(1H, d), 8.45-8.55(2H, m), 8.60(1H, d), 10.71 (1 H, br).

El compuesto utilizado como materia prima se prepara como sigue:

a) Z-D-Trp-Lys(BOC)-OMe

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A una solución de 23,7 g de Z-D-Trp-OH en 230 ml de THF se le adicionan 9,5 g de HOBt a RT. Una solución incolora clara se forma. Luego 20,8 g de H-Lys(BOC)-OMe.HCl se adicionan a RT, seguido por 7,7 ml de N-metilmorfolina. La suspensión fina se enfría a 0º y se adicionan 11,4 ml de diisopropilcarbodiimida. Se agita 1 hora a 0º, luego 3 horas a RT. Una solución de 7,0g de ácido sulfúrico concentrado en 120 ml de agua se adiciona a la suspensión. Se extrae con 150 ml de acetato de etilo, las fases se separan y se lava la fase orgánica consecutivamente con 100 ml de salmuera saturada, 100 ml de salmuera al 25%, solución de bicarbonato de sodio al 5%. Luego la fase orgánica se seca sobre MgSO_{4} y se evapora. El residuo se lleva en 250 ml de isopropil acetato y se agita 2 horas a RT. La filtración y el secado a 40º dan 40,9 g de Z-D-Trp-Lys (BOC)-OMe, sustancia de color blanco. Condiciones de HPLC: MN Nucleosil 100 A/C18; 5 micron; 250 x 4 mm; fase A: 0,24% de ácido fosfórico, fase B acetonitrilo; gradiente: de 20 a 80% de B en 30 minutos; longitud de onda 220 nm; velocidad de flujo 1,3 ml/min; Temperatura 35º: pureza 97,8% b.a. (24,2 min).

b) H-D-Trp-Lys(BOC)-OMe

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19,8 (34,1 mmol) g de 2-D-Trp-Lys(BOC)-OMe se disolvieron en 220 ml de metanol, se adicionan 2,2 g del catalizador de PdC al 10% y se hidrogenan a RT. La hidrogenación se termina después de 1 hora a RT, el catalizador se filtra completamente y el filtrado se evapora a 30º: sólido de color blanco. HPLC: 98,1% b.a.(16,2 min).

c) Z-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OMe

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17,0 g de H-D-Trp-Lys(BOC)-OMe se mezclan con 80 ml de THF. 9,2 g de Z-Phg-OH se adicionan a la suspensión de color gris a RT. La adición de 4,4 g de HOBt, se aclara con 20 ml de THF. La solución de color amarillo turbio se enfría a 0º y se adiciona una solución de 5,3 ml de DICI en 15 ml de THF en 10 minutos. Se agita 2 horas a 0º, luego 2 horas a RT. Luego se adiciona una solución de ácido sulfúrico 3,6 en 57 ml de agua, se extrae con 70 ml de acetato de etilo, se lava con agua, salmuera saturada, 5% de bicarbonato de sodio, 25% de salmuera, se seca sobre MgSO_{4} y se evapora. El residuo de color blanco se agita en 125 ml de isopropil acetato 2 horas a 40º y la suspensión se filtra. El secado del residuo a 40º: sustancia de color ligeramente amarilla. HPLC: 96,3% b.a. (25,3 min).

d) H-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OMe

10

23,4 g (23,8 mmol) (Z-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OMe) se disolvieron en 260 ml de metanol, se adicionan 2,6 g de Pd/C al 10% y se hidrogenan a RT y presión normal. Después de 3 horas el catalizador se filtra completamente y el filtrado se evapora a 30º: sólido de color blanco. HPLC 95,9% b.a.(17,6 min).

e) Z-[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-CO-O)]-Pro-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OMe

11

11,1 g (2S,4R)-4-(2-ter-Butoxicarbonilaminoetilcarbamoiloxi)-pirrolidina-1-ácido carboxílico bencil ester-2- ácido carboxílico y 19,0 g de H-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OMe se disolvieron en 290 ml de THF a RT. se adicionan 3,32 g de HOBt y la solución turbia se enfría a 0º. Una solución de 4,56 ml de DICI en 90 ml de THF se adiciona. Se agita 24 horas a 0º. Luego una solución de 2,2 g de ácido sulfúrico en 22 ml de agua se adiciona a RT, la solución ligeramente ópalo se agita por 15 minutos y luego se adiciona gota a gota en 500 ml de agua. La suspensión de color blanco se evapora a 50º hasta que no destile más el THF. Se filtra la suspensión y se lava el residuo 4 veces con 80 ml de agua cada uno, luego con 250 ml de metanol y luego dos veces con completamente 80 ml de metanol. Se seca durante la noche a 50º. HPLC 91,0% b.a.(19,5 min).

f) H-[(2S,4R)-4-(BoC-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-CO-O)]-Pro-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OMe

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22,0 g (12,7 mmol) de Z-[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-CO-O)]-Pro-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OMe se disolvieron en 220 ml de DMF y se adicionan 4,4 g de Pd/C al 10%. Hidrogenación 4 h a RT. Luego el catalizador se filtra completamente y el filtrado se adiciona a una mezcla de 600 g de hielo y 400 ml de agua. El producto precipitado se filtra completamente y se lava con agua. Secando a 30º da un sólido de color gris. HPLC: 97,0% b.a. (12,3 min).

g) Z-Phe-[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-CO-O)]-Pro-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OMe

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5,1 g de Z-Phe-OH y 16,5 g H-[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-O)]-Pro-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OMe se disolvieron en 250 ml de THF, se adicionan 2,29 g HOBT y la solución oscura se enfría a 0º. 3,1 ml de DICI se disolvieron en 80 ml de THF y se adicionan a la mezcla de reacción a 0º. Se agita 24 horas a 0º. La mezcla de reacción se adiciona a 200 ml de ácido sulfúrico al 10%, los sólidos precipitados se filtran completamente y se vierten con agua, Después de la filtración el residuo se mezcla con 200 ml de metanol y la suspensión se filtra completamente. Secado a 40º.HPLC: 97,2% b.a. (21,1 min).

h) (H-Phe-[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-CO-O)]-Pro-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OMe)

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8,5 g de Z-Phe-[(2S,4R)-4-(BoC-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-CO-O)]-Pro-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OMe se disolvieron en 180 ml de DMF, se adicionan 4,25 g de Pd/C al 10% y la mezcla se hidrogena a RT por 6 horas. Luego el catalizador se filtra completamente y el filtrado se evapora a 40º. Al residuo (30 g) se le adicionan gota a gota, 600 ml de t-butil metil éter a RT, la suspensión se filtra y el residuo se lava con 300 ml de TBME. Secado a 40º HPLC 93,1% b.a.
(16,6 min).

i) FMOC-Tyr(Bzl)-Phe-[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-CO-O)]-Pro-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OMe

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6,5 g de H-Phe-[(2S,4R)-4-(Boe-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-CO-O)]-Pro-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OMe y 3,1 g de FMOC-Tyr (Bzl)-OH y 0,86 g de HOBT se suspendieron en 180 ml de THF y se enfrían a 0º. Se adicionan 5,5 g de LiBr y luego 20 ml de THF. Luego se adicionan 1,18 ml de DICI disueltos en 50 ml de THF y la suspensión oscura se agita a 0º por 2 horas. El baño de enfriamiento se retira y se agita continuamente por 24 horas. Luego una solución de 0,65 g de ácido sulfúrico y 6,5 ml de agua se adicionan, luego 160 ml de agua. Se evapora a 40º, se filtra el residuo, se lava con agua hasta que el agua última tuvo un pH de 4,0. La torta de filtrado se agita en 30 ml de metanol, la suspensión se filtra y el residuo se lava con 10 ml de metanol. El secado a 35º da una sustancia de color gris. HPLC 95,4% b.a. (26,0 min).

j) FMOC-Tyr(Bzl)-Phe-[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-CO-O)]-Pro-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OH

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13,0 g de FMOC-Tyr(Bzl)-Phe-[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-CO-O)]-Pro-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OMe se suspendieron en 250 ml de THF. Se adicionan 7,3 g de LiBr y 75 ml de THF. Luego 8,7 ml de NaOH 1 molar se adiciona lentamente a RT dentro de 20 minutos. La agitación se continúa a RT por 3 horas, luego 5 ml adicionales de NaOH 1 molar se adicionan dentro de las próximas 15 horas. La solución de reacción final se adiciona a una solución de 1,7 g de ácido sulfúrico en 34 ml de agua. La mezcla resultante de 2 fases se adiciona a 50 ml de acetato de etilo. Después de la separación de las fases, la fase orgánica se lava 3 veces con salmuera y luego se evapora. Al residuo se le adicionan 25 ml de DIF. La solución resultante de DIF clara, se adiciona a 260 ml de agua. La suspensión resultante se filtra y la torta de filtrado se lava tres veces con agua y se seca durante la noche a 40º. HPLC 71,9% b.a.(28,6 min).

Ejemplo 2 Preparación de la resina de poliestireno 4-(Cloro(difenil)metil)benzoil aminometil

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La síntesis se lleva a cabo en un reactor de mezcla por lote de 1 L, equipado con una frita de vidrio operado manualmente sinterizado bajo nitrógeno. La resina de aminometilpoliestireno comercialmente disponible (30.4 g, 41.07 mmol), pretratada con DMF, se hace reaccionar a RT durante la noche con una solución de ácido 4-(hidroxil-difenil-metil) benzoico (15.0 g, 49.28 mmol, 1.2 equiv.), hidroxibenzotriazol (HOBT) (7.54 g, 49.28 mmol, 1.2 equiv.) y DICI (12.43 g, 98.57 mmol, 2.4 equiv.) en DMF (140 ml). El solvente se retira por filtración a través de la frita de vidrio bajo presión reducida, y la resina se lava por turnos cinco veces con DMF y cinco veces con metanol. El secado con vacío a 40º produce 44.69 g de resina. Esta resina se utiliza como materia prima para la siguiente síntesis de los hexapéptidos.

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Procedimiento para la síntesis del péptido lineal protegido

Los hexapéptidos lineales unidos con la resina, se ensamblan manualmente en el C-con dirección de N, mediante reacciones de acoplamiento iterativas en un reactor de mezcla por lote equipado con una frita de vidrio sinterizado bajo nitrógeno. 4-(Cloro(difenil)metil)benzoil aminometil poliestireno resina se utiliza como materia prima y se realiza un protocolo estándar que consiste de ciclos repetitivos de N\alpha-desprotección (20% v/v de dietilamina (DAEM) en DMF), lavados repetidos con DMF y

IPK a su vez, y los acoplamientos (DIPCI/HOBT, DIEPA y DMF) a RT. En la modificación ligera de este procedimiento de acoplamiento, especial cuidado se toma para minimizar la racemización de la fenilglicina mediante el acoplamiento que se realiza de este aminoácido a 0º. Antes de la división del péptido lineal protegido asamblado completamente a su soporte de resina, la protección N\alpha-Fmoc se retira.

El Fmoc-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-CO-O)-Pro-OH se sintetiza como se revela en WO02/101192. Todos los otros aminoácidos son comercialmente disponibles.

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Síntesis del H-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-CO-O)-Pro-Phg-D-Trp(Boc)Lys(Boc)-OH

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a) Síntesis de la Fmoc-Lys(Boc)-O-resina

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La resina 4-(Cloro(difenil)metil)benzoil aminometil poliestireno (20 g, 19.4 mmol), pretratada con tolueno, se trata por 4 horas con acetil cloruro (7.6 g, 97 mmol) en tolueno a RT. Después de la filtración, el procedimiento se repite durante la noche, después de esto, la resina se filtra y se lava con tolueno y diclorometano. El acoplamiento se lleva a cabo con una mezcla de Fmoc-Lys(Boc)-OH (18.2 g, 38.8 mmol; 2 equiv.) y N-metilmorfolina (3.94g, 38.8 mmol, 2 equiv.) por 4 horas a RT. Después de la filtración, la resina se lava con DMF y IPA 3 veces en turnos y se seca con vacío para conseguir 26.5 g de una Fmoc-Lys(Boc)-O-resina amarillenta con una capacidad de 0.566 mmol/g (determinada con el método-Fmoc). (Lit. Fmocmethod: Meienhofer, J.; Waki, M; Heimer, E.P.; Lambros, T.J.; Makofske, R.C.; Chang, C. D. Int. J. Pep. Prot. Res. 1979, 13, 35).

b) Resina-O-Lys(Boc)-D-T rp(Boc)-Phg-(2S,4 R)-4-(Boc-N H-CH_{2}-CH_{2}-NH-C O-O)-Pro-Phe-Tyr(Bzl)-H

La Fmoc-Lys(Boc)-O-resina (28.0 g, 19.96 mmol) se suspende en DMF y se trata con una solución de DAEM en DMF (20% v/v) por 10 minutos a RT. Después de que se filtra, el procedimiento se repite y luego se lava con DMF e IPA 3 veces en turnos, seguido por lavados de 3 veces con DMF. Este procedimiento de N\alpha-Fmoc-desprotección y se repiten los lavados después de cada etapa de acoplamiento.

El acoplamiento se lleva a cabo con una mezcla de aminoácido, HOBT y DICI que se agita 30 minutos a RT, y luego se adiciona a la resina de inmediato. El acoplamiento se continua hasta la finalización, i.e. hasta completar la desaparición de los grupos residuales amino se monitorea por el test de Nihidrina negativa "Kaiser". Después de que se acopla, la resina se lava 5 veces con DMF, y luego se acondiciona para la Fmoc-protección.

Los siguientes derivados de aminoácido se acoplan secuencialmente:

Fmoc-D-Trp(Boc)-OH (16.81 g, 31.92 mmol, 2 equiv.), DIF (100 ml), HOBT (4.93 g, 32.24 mmol, 2.02 equiv.), DICI (5.35 g, 42.45 mmol, 2.66 equiv.).

Fmoc-Phg-OH (11.92 g, 31.92 mmol, 2 equiv.), THF (70 ml), HOBT (4.93 g, 32.24 mmol, 2.02 equiv.), DICI (5.35 g, 42.45 mmol, 2.66 equiv.). Se toma cuidado especial para minimizar la racemización de la fenilglicina por la realización del acoplamiento de este aminoácido a 0ºC.

Fmoc-(2S,4R) 4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-O)-Pro-OH (17.26 g, 31.92 mmol, 2 equiv.), DIF (100 ml), HOBT (4.93 g, 32.24 mmol, 2.02 equiv.), DICI (5.35 g, 42.45 mmol, 2.66 equiv.).

Fmoc-Phe-OH (12.36 g, 31.92 mmol, 2 equiv.), DIF (100 ml), HOBT (4.93 g, 32.24 mmol, 2.02 equiv.), DICI (5.35 g, 42.45 mmol, 2.66 equiv.).

Fmoc-Tyr(Bzl)-OH (15.75 g, 31.92 mmol, 2 equiv.), DIF (100 ml), HOBT (4.93 g, 32.24 mmol, 2.02 equiv.), DICI (5.35 g, 42.45 mmol, 2.66 equiv.).

Antes de la división del péptido lineal protegido asamblado completamente a partir de su soporte de resina, la N\alpha-Fmoc protección se retira tratando la resina con una solución de DAEM en DMF (20% v/v) por 10 minutos a RT. Después de que se filtra, el procedimiento se repite y se lava con DMF e IPA 3 veces en turnos, seguido por lavados de 3 veces con DMF.

(El secado de la resina con vacío a 40ºC da una resina amarillenta).

c) División del péptido lineal de su soporte de resina H-Tyr (Bzl)-Phe-(25,4R)-4-(Boc-N H-CH_{2}-CH_{2}-NH-C O-O)-Pro-Phg-D-Trp(Boc)Lys(Boc)-OH Ca) Método con AcOH/CH_{2}Cl_{2}/H_{2}O 45/45/5 v/v/v

El péptido lineal protegido asamblado completamente de la resina-O-Lys(Boc)-D-Trp(Boc)-Phg-(2S,4R)-4-(Boc-NHCH_{2}-CH_{2}-NH-CO-O)-Pro-Phe-Tyr(Bzl)-H (24.5 g) se suspende en una mezcla de AcOH/CH_{2}Cl_{2}/H_{2}O 45/45/5 v/v/v (150 ml) y se agita por una hora a RT, se filtra y se lava con CH_{2}CI_{2}. El filtrado se evapora a sequedad, el residuo se agita por una hora con una mezcla de TBME y heptano 7/3 v/v, se filtra y se seca con vacío. Un sólido amarillento se obtiene; contenido: 93.5% HPLC g/g; pureza 91.6% (F)-HPLC y 2.5% (F)-HPLC D-Phg-Epimer.

La resina (4-(Cloro(difenil)metil)benzoil aminometil poliestireno resina) se lava 3 veces con metanol y se seca y se podría reutilizar.

Cb) Método con CH_{2}Cl_{2} y MeOH

El péptido lineal protegido asamblado completamente de la resina-O-Lys(Boc)-D-Trp(Boc)-Phg-(2S,4R)-4-(Boc-NHCH_{2}-CH_{2}-NH-CO-O)-Pro-Phe-Tyr(Bzl)-H (6.2 g) se suspende en una mezcla de CH_{2}Cl_{2}/MeOH 1/ 1 v/v (115 ml) y se agita por 3 días a RT, se filtra y se lava con CH_{2}Cl_{2}. El filtrado se evapora a sequedad, el residuo se agita por una hora con una mezcla de TBME y heptano 7/3 v/v (60 ml), se filtra y se seca con vacío. Contenido: 93.5% HPLC g/g; pureza 92.6% (F)-HPLC y 1.1% (F)-HPLC D-Phg-Epimer.

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Cc) Método con etil metil cetona/ MeOH

El péptido lineal protegido asamblado completamente de la resina-O-Lys(Boc)-D-Trp(Boc)-Phg-(2S,4R)-4-(Boc-NHCH_{2}-CH_{2}-NH-CO-O)-Pro-Phe-Tyr(Bzi)-H (4.0 g) se suspende en una mezcla de dietil metil cetona 1/1 v/v (24 ml) y se agita por 15 horas a 50ºC, se filtra y se lava con MeOH. El filtrado se evapora a sequedad, el residuo se agita por una hora con una mezcla de TBME y heptano 7/3 v/v (60 ml), se filtra y se seca con vacío. Contenido: 88.1% HPLC g/g; pureza 95.2% (F)-HPLC y 1.8% (F)-HPLC D-Phg-epimer.

Purificación

Para propósitos analíticos los péptidos lineales se purificaron por cromatografía RP.

Caracterización

La estructura de una muestra analítica purificada por RP-cromatografía se confirma por FAB-MS, LC-MS y datos de NMR (DMSO en ppm, 1.16, 1.34, 1.55, 1.61 (3H), 1.66, 2.05, 2.20, 2.51, 2.83 (2H),2.91, 2.96, 2.98, 3.02, 3.41, 3.78, 4.13, 4.61, 5.13, 5.51, 6.74, 6.83, 6.88 (2H), 7.01 (2H), 7.11 (2H),7.38, 7.42 (2H), 7.49, 7.72, 8.01, 8.29, 8.48, 8.62, 8.75).

La configuración del aminoácido se determina por análisis de aminoácidos: el compuesto se hidroliza bajo condiciones ácidas, se convierte en derivados y la configuración de cada aminoácido individual se asigna por cromatografía de gases enantioselectiva/espectrometría de masas por ionización química.

Una prueba adicional de la estructura es la conversión de los diferentes péptidos lineales hasta caracterizar bien el péptido cíclico.

Los siguientes compuestos se sintetizaron de acuerdo con el procedimiento descrito.

H-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-CO-O)-Pro-Phg-D-Trp(Boc)-OH;

H-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH_{2}-CHZ-NH-CO-O)-Pro-Phg-D-Trp-OH;

H-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-CO-O)-Pro-Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-OH;

H-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-CO-O)-Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Try(Bzl)-OH;

Ejemplo 3 La ciclización de los péptidos protegidos lineales para sintetizar el Ciclo[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-CO-O)-Pro-Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-]

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Ciclización de H-Phe-(2S,4 R)-4-(Boc-N H-CH_{2}-CH_{2}-NH-C O-O)-Pro-P hg-D-T rp(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-OH Método-azida

Para la ciclización, el fragmento lineal (2.5 g, 1.83 mmol) se disuelve en DMF (391 ml), se enfría a -5º, se trata con EDIPA (0.47 g, 3.66 mmol, 2 equiv.) y DPPA (0.75 g, 2.75 mmol, 1.5 equivalente), y se agita a esta temperatura hasta la finalización (app. 20 h). Se adiciona agua (391 ml) gota a gota a la mezcla de reacción, el precipitado se filtra y se lava con agua hasta que ninguna azida se detecte. Se obtienen 4.9 g de sólido de color blanco húmedo (Rf de HPLC idéntico a la referencia), que se utiliza en la reacción de desprotección sin otra purificación. El compuesto se caracteriza por comparación directa con un compuesto referencia por HPLC.

Ciclización del H-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4 R)-4-(Boc-N H-CH_{2}-CH_{2}-NH-C O-O)-Pro-P hg-D-T rp(Boc)Lys(Boc)-OH a) Método HBTU a

Para la ciclización del fragmento lineal (6.0 g, 3.5 mmol) se disuelve en DMF (780 ml), se enfría a -5º, se trata con EDIPA (1.13 g, 8.75 mmol, 2.5 equiv.), HOBT (1.18 g, 8.75 mmol, 2.5 equiv.), HBTU (3.3 g, 8.78 mmol, 2.5 equiv.) y se agita a esta temperatura hasta la finalización (app. 2 h). Se adiciona agua (391 ml) gota a gota a la mezcla de reacción a RT, el precipitado se filtra y se lava con agua y heptano y se seca con vacío durante la noche. Se obtienen 5.4 g sólido de color amarillo, blanco. El compuesto se caracteriza por comparación directa con un compuesto de referencia por HPLC. Contenido 55% peso/peso HPLC, pureza 78 (A%)-HPLC.

b) Método HBTU b

Para la ciclización, el fragmento lineal (6.0 g, 4.16 mmol) se disuelve en DMF (60 ml) y se adiciona gota a gota en una mezcla de HOBT (4.15 g, 10.4 mmol, 2.5 equiv.), HBTU (4.15 g, 10.4 mmol, 2.5 equiv.) y EDIPA (1.41 g, 10.4 mmol, 2.5 equiv.) en DMF (135 ml) a -5º y se agita a esta temperatura hasta la finalización (aprox. 2 h). Se adiciona agua (559 ml) gota a gota a la mezcla de reacción a RT, el precipitado se filtra y se lava con agua y heptano y se seca con vacío durante la noche. Un sólido de color amarillo, blanco se obtiene. El compuesto se caracteriza por comparación directa con un compuesto referencia por HPLC. Contenido 77% peso/peso HPLC, pureza 84 (A%)-HPLC.

Los siguientes péptidos lineales se someten a ciclización de acuerdo con el anterior procedimiento:

H-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-CO-O)-Pro-Phg-D-Trp(Boc)-OH

H-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-CO-O)-Pro-Phg-D-Trp-OH

H-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-CO-O)-Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Try(Bzl)-OH

Ejemplo 4 Síntesis de la sal del ácido Ciclo [(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-CO-O)-Pro-Phg-D-Trp-Lys-Tyr(Bzl)-Phe-]tri- fluoroacético

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Para completar la desprotección, el residuo (1.5 g, 0.79 mmol) se disuelve a 0º en TFA/H_{2}O 95:5 (8.3 ml), y la mezcla se agita en frío por 30 minutos. La mezcla de reacción fría se adiciona gota a gota en una mezcla de TBME (29 ml) y heptano (13 ml) a RT, y se agita por 2 horas. El precipitado se filtra, se lava con TBME/heptano 1:1 (v/v) y se seca con vacío. Se obtiene un sólido de color beige, contenido 53% peso/peso HPLC, pureza: 79 (A%)-HPLC.

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Referencias citadas en la descripción Esta lista de referencias citadas por el aspirante es solamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento de la patente Europea. Aún cuando se ha tenido gran cuidado en recopilar las referencias, los errores u omisiones no se pueden excluir y la EPO desconoce toda responsabilidad a este respecto. Documentos de Patentes citados en la descripción

\bullet WO 9701579 A [0017]

\bullet WO 0210192 A [0017]

\bullet WO 02101192 A [0027].

Literatura no-patente citada en la descripción

\bullet T. W. GREENE et al. Protective Groups in Organic Síntesis. John Wiley & Sons Inc, 1991 [0008]

\bullet W.C. CHAN; P.D. WHITE. Fmoc solid Phase Peptide Síntesis. Oxford University Press, 2000 [0008]

\bulletMEIENHOFER, J.; WAKI, M; HEIMER, E.P.; LAMBROS, T.J.; MAKOFSKE, R.C.; CHANG, C. D. Int. J. Pep. Prot. Res., 1979, vol. 13, 35 [0029].

Claims

1. Un proceso para la producción de un compuesto de fórmula I

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en donde

R_{1} es un -alquileno C_{2}-_{6}-NR_{3}R_{4}, -alquileno C_{2-6}-guanidina o-alquileno C_{2-6}-COOH en donde cada uno de R_{3} y R_{4} independientemente es un H, alquilo C_{1-4}, \infty-hidroxi-alquileno C_{2-4} o acil o R_{3} y R_{4} forman juntos con el átomo de nitrógeno al cual ellos se unen, un grupo heterocíclico que puede comprender otro heteroátomo, y

R_{2} es Z_{1}-CH_{2}-R_{5}, -CH_{2}CO-O-CH_{2}-R_{5},

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en donde Z_{1} es O o S y R_{5} es opcionalmente un fenil sustituido,

o una sal de estos,

que comprende la ciclización de una análogo de somatostatina lineal de fórmula II

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en donde R_{1} y R_{2} son como se definen anteriormente,

cada uno de R_{11} y R_{12}, independientemente, es un grupo protector amino

Por lo cual cuando R_{1} comprende un terminal NH_{2}, este terminal NH_{2} también se protege por un grupo protector amino, y donde se requiere retirar el o los grupos protectores,

2. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende la ciclización de un análogo de somatostatina lineal de fórmula II

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en donde R_{1} es -CH_{2}-CH_{2}-NR_{3}R_{4}, R_{2} es el 4-benciloxi-fenil, y R_{3}, R_{4}, R_{11} y R_{12} son como se definen en la reivindicación 1,

y la recuperación de un compuesto de fórmula I obtenido de esta manera, en la forma libre o en la forma de sal en donde R_{1} es -CH_{2}-CH_{2}-NR_{3}R_{4} y R_{2} es el 4-benciloxi-fenil.

3. Un compuesto de fórmula II

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en donde R_{1} y R_{2} son como se definen en la reivindicación 1,

cada uno de R_{11} y R_{12}, independientemente, es un grupo protector amino

Por lo cual cuando R_{1} comprende un terminal NH_{2}, este terminal NH_{2} también puede ser protegido por un grupo protector amino, o una sal de estos.

4. Un compuesto de fórmula II de acuerdo con la reivindicación 3 en donde R_{1} es -CH_{2}-CH_{2}-NR_{3}R_{4}, R_{2} es el 4-benciloxi-fenil y cada uno de R_{11} y R_{12}, independientemente, es un grupo protector amino, Por lo cual cuando R_{1} comprende un terminal NH_{2}, este terminal NH_{2} también se puede proteger por un grupo protector amino, o una sal de estos.

5. Un compuesto de fórmula II de acuerdo con la reivindicación 3 que se selecciona de H-Tyr(Bzi)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NHCH_{2}CH_{2}NH- CO-O)-Pro-DPhg-DTrp(BOC)-Lys(Boc)-OH, H-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-COO)-Pro-Phg-DTrp-Lys(Boc)-OH y H-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH_{2}-CH_{2}NH-CO-O)-Pro-Phg-D-Trp(Boc) Lys(Boc)-OH o una de sus sales.

6. Un proceso para la producción de un compuesto de fórmula II como se define en la reivindicación 3, que comprende la unión por un enlace amida de dos unidades peptídicas, cada una de ellas que contiene al menos un aminoácido en la forma protegida o desprotegida, en donde el enlace amida es de tal manera que se obtiene, la secuencia de aminoácido deseada como se define en la fórmula II, y donde se requiere retirar al menos un grupo protector,

Y la recuperación de un compuesto de fórmula 11 obtenido de esta manera en la forma libre o en la forma de sal.

7. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el compuesto de fórmula I es el ciclo [{(4-NH_{2}-C_{2}H_{4}-NH-CO-O)-Pro}-Phg-DTrp-Lys-Tyr(4-Bencil)-Phe].