BRPI0413437B1 - Process for preparing somatostatin peptide - Google Patents

Abstract

"preparação de peptídeos de somatostatina". a presente invenção refere-se a um processo para preparação de análogos cíclicos de somatostatina e intermediários lineares usados no processo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSO PARA PREPARAÇÃO DE PEPTÍDEOS DE SOMATOSTATINA". A presente invenção refere-se a um processo para preparação de análogos cíclicos de somatostatina e a intermediários usados nesse processo.

Mais particularmente, a invenção proporciona um processo para preparação de um análogo cíclico desomatostatina de fórmula (I): i em que: - Ri é -C2.ealquileno-NR3R4. -C^alquileno-guanidina or -C2^alquile- no-COOH onde cada um de R3 e R4, independentemente é H, Ci.4alquila, o> h i dróxi - C2-4a Iq ui leno ou acila ou R3 e R4 formam juntos com o átomo de nitrogênio ao qual se encontram fixados um grupo heterocíclico que pode compreender um adicional heteroátomo, e - Rs é Zi-CH2-R5, -CH2-CO-O-CH2-R5 ou onde Zi é O ou S e R5 é fenila opcionalmente substituído ou um sal do mesmo.

Qualquer acila pode ser, por exemplo, RaCO-, onde Ra é H, C1. 4alquila, Cs^alquenila, C3-6Cidoalquila ou benzila. Quando NR3R4 forma a grupo heterocíclico, tal grupo pode ser aromático ou saturado e pode compreender um nitrogênio ou um nitrogênio e um segundo heteroátomo selecionado de nitrogênio e oxigênio. Preferencialmente o grupo heterocíclico é, por exemplo, piridila ou morfolino. C2^alquíleno é preferencial mente -CH2-CHr· Quando R5 é fenila substituído, o anel de fenila pode ser substituído por halogênio, metila, etila, metóxi ou etóxi, por exemplo, na posição orto e/ou para. Preferencialmente, Rs é fenila não-substituído.

Os aminoácidos na posição 2 e/ou 5 podem apresentar a configuração D ou L. Preferencialmente, cada um de tais aminoácidos apresenta a configuração L.

Os compostos de fórmula (I), podem existir, por exemplo, na forma livre ou na forma de sal. Os sais incluem os sais de adição de ácido com, por exemplo, ácidos orgânicos, ácidos poliméricos ou ácidos inorgânicos, por exemplo, com ácido clorídrico, ácido acétíco, ácido láctico, ácido aspártico, ácido benzóico, ácido succínico ou ácido pamóico ou, por exemplo, sais de metal alcalino, quando R<\ compreender um grupo COOH. Os sais de adição de ácido podem existir como sais mono- ou divalentes, por exemplo, dependendo se são adicionados 1 ou 2 equivalentes de ácido ao composto de fórmula (I), na forma de base livre. Os sais preferidos são o di-sal aspartato ou o mono-sal pamoato. O processo de produção de acordo com a invenção compreende a etapa de ciclização de um correspondente peptídeo linear na forma protegida. Foi agora surpreendentemente descoberto que a etapa de ciclização é particularmente dependente da seleção de 2 aminoácidos terminais do correspondente peptídeo linear. Fora de 6 possibilidades de ciclização, foi surpreendentemente descoberto que a ciclização entre os aminoácidos 3 e 4, ou 4 e 5, ou 6 e 1, proporciona resultados significativamente interessantes. A ciclização entre os aminoácidos 4 e 5 é particularmente preferida. A ciclização de acordo com a invenção, entre os aminoácidos 3 e 4, ou 4 e 5, ou 6 e 1 leva a aperfeiçoados rendimentos com reduzida isomerização nos locais quirálicos. Além disso, essas etapas de ciclização podem ser realizadas sob condições menos severas e também mediante uso de reagentes moderados: por exemplo, a ciclização através do uso de uma azida pode ser evitada.

Em uma primeira modalidade da invenção, é proporcionado um processo para preparação de um composto de fórmula {I) ou um sal do mesmo, conforme indicado acima, compreendendo a ciclização de um análogo linear de somatostatina de fórmula (II): II ou de fórmula (III) III ou de fórmula (IV) IV onde: R-\ e R2 são como definido acima, cada um de Rn e Ri2, independentemente, é um grupo protetor amino, pelo que quando R1 compreender um terminal NH2l esse terminal NH2 é também protegido por um grupo protetor amino, e quando for requerida a remoção do(s) grupo(s) de proteção e recuperação de um composto de fórmula (I) assim obtido, este composto irá se apresentar na forma livre ou na forma de sal.

Adequados grupos protetores amino são, por exemplo, descritos na publicação "Protective Groups in Organic Synthesis", T. W. Greene e outros, John Wiley & Sons Inc., Segunda Edição, 1991. Exemplos de tais grupos protetores amino incluem, os grupos acetila ou amino, conforme usados na síntese de peptídeos, por exemplo, terc-butóxi-carbonila, carbobenzóxi, fluorenil-metoxicarbonila, aloxicarbonila, 1 -(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohexilide-no)etila, 1 -(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohexylideno)-3-metilbutila, 4-metiltritila (W.C. Chan e P.D. White, "Fmoc solid Phase Peptide Synthesis", Oxford U-niversity Press, 2000). A cíclização pode convenientemente ser realizada na presença de um derivado à base de amino ou fosfônio para ativação de carbóxi in situ, por exemplo, 0-(benzotriazol-1-il)N,N,N',N'-tetrametilurônio-hexafluorofosfato, benzotriazoM-iloxitris(pirrolidino) fosfônio-hexafluorofosfato, N-[(1 H-benzo-triazol-1-il)(dimetilamino) metileno]-N-metil metanamínio tetrafluoroborate N-óxido, N-[(dimetilamino)-1 ΗΊ ,2,3-triazolo[4,5-b]pirÍdina-1-ilmetileno]-N-metil- metanamínio, 7-azabenzotríazol-1 -iloxitris(pirrolídino)-fosfônio hexafluorofos-fato.

Preferencialmente, a reação pode ser realizada na presença de uma base, por exemplo, uma amina orgânica, por exemplo, N-etil diisopropil-amina, N-metilmorfolina, trietilamina, ou tribenzilamina, e na presença de um nucleófilo auxiliar, por exemplo, 1-hidróxi-benzotriazol, N-hidróxi-succinimida, 3-hidróxi-3,4-diidra-1,2,3-benzotriazin-4-ona ou 1 -hidróxi-7-azabenzotriazol. A ciclização de um composto de fórmulas (II), (III) ou (IV) leva a um composto de fórmula (I) na forma protegida, isto é, um composto de fórmula (I) em que ou mais ou todos ao grupos amino presentes na molécula são protegidos por um grupo protetor amino. Exemplos de tais compostos incluem: ciclo[(2S,4R)-4-{Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-], cÍclo[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-Phg-D-Trp-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-] e ciclo[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-DPhg-D-Trp-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-].

Os grupos protetores amino podem ser removidos de acordo com métodos conhecidos na técnica, por exemplo, mediante divagem, por exemplo, com ácido trifluoroacético; HCI 3M, EtOAc; Me3CCI, fenol, CH2CI2; H2S04 a 10%, dioxano; bromocatecolborano.

Os compostos de fórmulas (II), (III) e (IV) ou sais dos mesmos são novos e fazem parte da invenção. Esses compostos podem ser preparados mediante união conjunta através de uma ligação de amida de duas unidades de peptídeo, cada uma delas contendo pelo menos um aminoácido na forma protegida ou não-protegida, onde a ligação da amida é de uma tal maneira que a desejada sequência de aminoácidos, conforme definida pelas fórmulas (II), (III) ou (IV), é obtida. A síntese pode ser executada de acordo com métodos conhecidos na técnica, por exemplo, em solução ou por síntese de fase sólida, partindo do primeiro aminoácido. Na síntese de fase sólida, o primeiro aminoácido é fixado a uma resina, por exemplo, uma resina à base de poliestireno comercialmente disponível, opcionalmente através de um adequado ligante, por exemplo, um ligante que pode ser clivado sob condições moderadas, de modo a manter intacta a proteção da cadeia lateral, por exemplo, um agente de ligação à base de tritila opcionalmente substituído, como, por exemplo, o ácido 4-(hidroxil-difenil-metil)-benzóico, onde um dos grupos fenila pode ser opcionalmente substituído, por exemplo, por Cl. A construção da desejada cadeia de peptídeo, se em síntese de solução ou síntese de fase sólida, pode ser efetuada de uma maneira convencional, por exemplo, usando amino-ácidos em que os grupos terminais amina são protegidos por Fmoc e os grupos amina de cadeia lateral quando presentes sendo protegidos por um diferente grupo protetor amina, por exemplo, Boc ou CBO.

Quando a síntese é efetuada mediante a síntese de fase sólida, o peptídeo construído é depois removido da resina em conformidade com métodos conhecidos na técnica, por exemplo, com ácido acético, ácido tri-fluoroacético, ácido acético-trifluoroetanol-diclorometano, hexafluoro-isopro-panol em diclorometano. Um processo preferido para remoção do peptídeo construído a partir da fase sólida, por exemplo, quando do uso de um agente de ligação à base de tritila não-clorado, é, por exemplo, o tratamento com metanol/diclorometano, preferencialmente, à temperatura ambiente ou um tratamento com uma cetona, por exemplo, etil-metil cetona, preferencialmente, a uma temperatura de cerca de 50°C.

Exemplos de compostos de fórmulas (II), (III) e (IV), são: H-Lys(Boc)-D-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-Phg-D-T rp(Boc)-OH; H-Lys(Boc)-D-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH- CO-0)-Pro-Phg-D-Trp-OH; H-(2S ,4R)-4-(Boc-N H-CH2-CH2-N H-CO-0)-Pro-Phg-D-T rp(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-OH; H-Tyr(Bzi)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-DPhg-DT rp(Boc)-Lys(Boc)-OH; H-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-Phg-DT rp-Lys(Boc)-OH; H-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-Phg-D-T rp(Boc)Lys(Boc)-OH.

Os compostos de fórmulas (II), (III) ou (IV) podem existir na forma de um sal, conforme descrito acima, para os compostos de fórmula (I).

Os compostos de fórmula (I) são valiosos agonistas de somatos-tatina e apresentam interessantes propriedades farmacológicas, conforme descrito, por exemplo, nos documentos de patentes WO 97/01579 ou WO 02/10192, cujos conteúdos dos mesmos divulgando as propriedades farmacológicas são aqui incorporados por meio dessas referências. Um composto preferido é o ciclo[{(4-NH2-C2H4-NH-CO-0)-Pro}-Phg-DTrp-Lys-Tyr(4-Ben-zil)-Phe], ou um sal do mesmo. Os sais preferidos são o aspartato (mono- ou dí-aspartato) ou pamoato.

Ao se utilizar o processo da invenção, pode ser obtido um rendimento de ciclização do correspondente peptídeo linear de fórmulas (II), (III) ou (IV) superior a 70%.

Os Exemplos seguintes são ilustrativos da invenção. Todas as temperaturas se encontram em graus °C.

As seguintes abreviações são usadas: Bzl = benzila DAEM = dietilamina DICI = diisopropil carbodiimida DMF = N,N-dimetilformamida DPPA = difenilfosforil azida EDIPA = N-etil-diisopropil amina HBTU = 0-(benzotriazol-1-il)-N,N,N',N,-tetrametilurônio-hexafluorofos- fato HOBT = 1-hidróxi-benzotriazol IPA = álcool isopropílico Phg = fenilglicina RT = temperatura ambiente TBME = terc-butilmetil éter Examole 1: [ H-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-Phg-D-T rp-Lys(Boc)-OH] 10,4 g do composto de (FMOC-Tyr(Bzl)-Phe-[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)]-Pro-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OH) são dissolvidos em 100 ml de DMF. Sob à temperatura ambiente, 2,0 ml de dietilamina são adicionados e a agitação continuou por 4 horas à RT. A solução amarela transparente é evaporada à temperatura de 40°. Ao resíduo são adicionados 150 ml de acetato de isopropila. Em seguida se procede à semeadura e agitação por 18 horas à RT, filtração e lavagem com 20 ml de acetato de isopropila. A seguir, foi efetuado um procedimento de secagem à temperatura de 40°. HPLC 87,5% b.a. {17,6 min).ESI-MS : 1287,5(M+Na)+; 1H-RMN(DMSO) (d, DMSO): 1,14(2H, m), 1,33 (2H, m), 1,37(18H, m), 1,53(1H, m), 1,64{1H, m), 2,06(1 H, m), 2,22(1 H, m), 2,78-3,15(12H, m), 3,38(1 H, m), 3,79(2H, br), 4,12(1 H, m), 4,55-4,75(3H, m), 5,06(2H, s), 5,15(1 H, d), 5,54(1 H, d), 6,75(1 H, br), 6,83(1 H, br), 6,89(2H, d), 6,94(1 H, t), 6,99(1 H, s), 7,43(2H, d), 7,10-7,50(arom.H), 7,59(1 H, d), 8,14(1 H, d), 8,45-8,55(2H, m), 8,60(1 H, d), 10,71(1H, br). O composto usado como material de partida é preparado como segue: a) Z-D-Trp-Lys(BOC)-OMe A uma solução de 23,7 g de Z-D-Trp-OH em 230 ml de THF, são adicionados 9,5 g HOBt à temperatura ambiente. Uma solução sem cor transparente é formada. Depois, são adicionados 20,8 g de H-Lys(BOC)-OMe.HCI à RT, seguido de 7,7 ml de N-metilmorfolina. A suspensão fina é resfriada para a temperatura de 0°C e 11,4 ml de diisopropilcarbodiimida são adicionados. Em seguida, agitação durante 1 hora à temperatura de 0°C, depois, 3 horas à RT. Em seguida, se adiciona uma solução de 7,0 g de ácido sulfúrico concentrado em 120 ml de água à suspensão. A seguir, é feita a extração com 150 ml de acetato de etila, separação das fases e lavagem da fase orgânica sucessivamente com 100 ml de salmoura saturada, 100 ml de salmoura a 25%, e solução de carbonato ácido de sódio a 5%. Em seguida, a fase orgânica é seca sobre MgSC>4 e evaporada. O resíduo é tomado em 250 ml de acetato de isopropila e agitado 2 horas à RT. Os procedimentos de filtração e secagem à temperatura de 40°C proporciona 40,9 g de Z-D-Trp-Lys(BOC)-OMe, na forma de uma substância branca.

Condições de HPLC: MN Nucleosil 100 A/C18; 5 mícron; 250 x 4 mm; fase A: ácido fosfórico 0,24%; fase B: acetonitrila; gradiente: de 20 a 80% de B em 30 minutos; comprimento de onda 220 nm; vazão 1,3 ml/min; Temperatura 35°C: pureza: 97,8% b.a.(24,2 min). b) H-D-T rp-Lys{BOC)-OMe 19,8 g (34,1 mmoles) de Z-D-Trp-Lys(BOC)-OMe são dissolvidos em 220 ml de metanol, adicionados 2,2 g de catalisador de Pd/C a 10% e hidrogenadas à RT. A hidrogenação é terminada depois de 1 hora à RT; o catalisador é filtrado e o filtrado evaporado à temperatura de 30°C, com a obtenção de um sólido branco; HPLC: 98,1% b.a.(16,2 min). c) Z-Phg-D-T rp-Lys(BOC)-OMe 17,0 g de H-D-Trp-Lys(BOC)-OMe são misturados com 80 ml de THF. 9,2 g de Z-Phg-OH são adicionados à suspensão cinza à temperatura ambiente. Em seguida, se adiciona 4,4 g de HOBt, com posterior lavagem com 20 ml de THF. A solução amarela turva é resfriada para a temperatura de 0°C e uma solução de 5,3 ml de DICI em 15 ml de THF é adicionada dentro de 10 minutos. Em seguida, se promove agitação por 2 horas à temperatura de 0°C, depois, 2 horas à RT. Em seguida, se adiciona uma solução de 3,6 g de ácido sulfúrico em 57 ml de água, se promove a extração com 70 ml de acetato de etila, lavagem com água, salmoura saturada, solução de carbonato ácido de sódio a 5%, salmoura a 25%, secagem sobre MgS04 e evaporação. O resíduo branco é agitado em 125 ml de acetato de isopropila durante 2 horas à temperatura de 40°C e a suspensão é filtrada. A seguir, se promove a secagem do resíduo à temperatura de 40°C, com obtenção de uma substância ligeiramente amarela. HPLC: 96,3% b.a.(25,3 min), d) H-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OMe 23,4 g (23,8 mmoles) de (Z-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OMe) são dissolvidos em 260 ml de metanol, adicionados 2,6 g de Pd/C a 10% e hidrogenado à RT sob pressão normal. Depois de 3 horas, o catalisador é filtrado e o filtrado evaporado à temperatura de 30°C, com obtenção de uma substância sólida branca. HPLC 95,9% b.a.(17,6 min). e) Z-[(2S,4R)-4.(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)]-Pro-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OMe 11,1 g do éster benzílico do ácido (2S,4R)-4-(2-terc-butoxicarbonil-aminoetil-carbamoilóxi)-pirrolidina-1 -carboxílico e 2-carboxílico e 19,0 g de H-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OMe são dissolvidos em 290 ml de THF à RT. Em seguida, 3,32 g de HOBt são adicionados e a solução turva é resfriada para a temperatura de 0°C. Depois, se adiciona uma solução de 4,56 ml de DICI em 90 ml de THF, com agitação durante 24 horas à temperatura de 0°C. Em seguida, uma solução de 2,2 g de ácido sulfúrico em 22 ml de água é adicionada à RT, a solução ligeiramente opalina agitada por 15 minutos e depois derramada em 500 ml de água. A suspensão branca é evaporada à temperatura de 50°C até que mais nenhuma quantidade de THF seja destilada. A filtra-ção da suspensão e lavagem do resíduo 4 vezes com 80 ml de água a cada vez, depois, com 250 mi de metanol e depois duas vezes com um total de 80 ml de metanol. A secagem foi feita durante a noite à temperatura de 50°C. HPLC 91,0% b.a.(19,5 min). f) H-[{2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)]-Pro-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OMe 22,0 g (12,7 mmol) de Z-[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CHrCH2-NH-CO-0)]-Pro-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OMe são dissolvidos em 220 ml de DMF e 4,4 g de Pd/C a 10% são adicionadas. A hidrogenação se realiza durante 4 h à RT. Depois, o catalisador é filtrado e o filtrado é adicionado a uma mistura de 600 g de gelo e 400 ml de água. O produto precipitado é filtrado e lavado com água. A secagem à temperatura de 30°C proporciona um sólido de cor cinza. HPLC: 97,0% b.a. (12,3 min). g) Z-Phe*[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)]-Pro-Phg-D-Trp-Lys (BOC)-OMe 5,1 g de Z-Phe-OH e 16,5 g de H-[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)]- Pro-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OMe são dissolvidos em 250 ml de THF, se adi- > cionam 2,29 g de HOBT e a solução escura é resfriada para a temperatura de 0°C. Em seguida, 3,1 ml de DICI são dissolvidos em 80 ml de THF e adicionados à mistura reacional à temperatura de 0°C, com procedimento de agitação durante 24 horas à esta mesma temperatura. A mistura reacional é adicionada a 200 ml de ácido sulfúrico a 10%, os precipitados sólidos são filtra- dos e lavados com água. Após a filtração, o resíduo é misturado com 200 ml de metanol e a suspensão filtrada. A secagem é feita à temperatura de 40°C. HPLC: 97,2% b.a. (21,1 min). h) (H-Phe-I(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)]-Pro-Phg-D-Trp-Lys (BOC)-OMe) 8.5 g de Z-Phe-[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)]-Pro-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OMe são dissolvidos em 180 ml de DMF, se adicionam 4,25 g de Pd/C a 10% e a mistura é hidrogenada à RT por 6 horas. Depois, o catalisador é filtrado e o filtrado evaporado à temperatura de 40°C. Ao resíduo (30 g), são derramados 600 ml de éter t-butil metílico à RT, depois, a suspensão é filtrada e o resíduo lavado com 300 ml de TBME. A secagem é feita à temperatura de 40°C. HPLC 93,1% b.a. (16,6 min). i) FMOC-Tyr(Bzl)-Phe-[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CHz-NH-CO-0)]-Pro-Phg. D-Trp-Lys(BOC)-OMe 6.5 g de H-Phe-[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)]-Pro-Phg-D-Trp- Lys(BOC)-OMe e 3,1 g de FMOC-Tyr(Bzl)-OH e 0,86 g de HOBT são colocados em suspensão em 180 ml de THF e resfriados para a temperatura de 0°C. Em seguida, se adicionam 5,5 g de LiBr e depois 20 ml de THF. Depois, 1,18 ml de DICI dissolvido em 50 ml de THF é adicionado e a suspensão escura é agitada na temperatura de 0°C por 2 horas. O banho de resfriamento é removido a agitação é continuada por 24 horas. Depois, são adicionadas uma solução de 0,65 g de ácido sulfúrico e 6,5 ml de água, em seguida, 160 ml de água. A evaporação à temperatura de 40°C, filtração do resíduo, lavagem com água até a última porção de água ter um pH de 4,0. A torta do filtro é agitada em 30 ml de metanol, a suspensão filtrada e o resíduo lavado com 10 ml de metanol. O procedimento de secagem à temperatura de 35°C proporciona uma substância de cor cinza. HPLC 95,4% b.a.(26,0 min).

10) FMOC-Tyr(Bzl)-Phe-[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)]-Pro-Phg-D-T rp-LvsíBOC)-OH 13,0 g de FMOC-Tyr(Bzl)-Phe-[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)]-Pro-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OMe são colocados em suspensão em 250 ml de THF. Em seguida, 7,3 g de UBr e 75 ml de THF são adicionados. Depois, 8,7 ml de NaOH 1 molar é lentamente adicionado à RT no período de 20 minutos. A agitação à RT é continuada por 3 horas, em seguida, um adicional de 5 ml de NaOH 1 molar é adicionado dentro do período das próximas 15 horas. A solução reacional final é adicionada a uma solução de 1,7 g de ácido sulfúrico em 34 ml de água. A mistura de 2 fases resultante é adicionada a 50 ml de acetato de etila. Após a separação de fase, a fase orgânica é 3 vezes lavada com salmoura e depois evaporada. Ao resíduo são adicionados 25 ml de DIF. A solução de DIF transparente resultante é adicionada a 260 ml de água. A suspensão resultante é filtrada e a torta do filtro lavada três vezes com água e seca durante a noite à temperatura de 40°C. HPLC71,9%b.a.(28t6 min).

Example 2: Preparação de resina de 4-(Cloro(difenil)metil)benzoil aminometil poliestireno A síntese é realizada em um reator de 1 L, operado manualmente, com agitação na batelada, dotado de frita de vidro sinterizada sob atmosfera de nitrogênio. A resina de aminometil-poliestireno comercialmente disponível (30,4 g, 41,07 mmoles), previamente tratada com DMF, reagiu à RT durante a noite com uma solução de ácido 4-(hidroxil-difenil-metil)benzóico (15,0 g, 49,28 mmoles, 1,2 equiv.), hydróxi-benzotriazol (HOBT) (7,54 g, 49,28 mmoles, 1,2 equiv.) e DICI (12,43 g, 98,57 mmoles, 2,4 equiv.) em DMF (140 ml). O solvente é removido mediante filtração através da frita sob pressão reduzida, e a resina é lavada em ciclos de cinco vezes com DMF e cinco vezes com metanol. O procedimento de secagem a vácuo sob temperatura de 40°C produz 44,69 g de resina. Esta resina é usada como material de partida para as síntese seguintes de hexapeptídeos.

Procedimento para a síntese de peptídeo linear protegido Os hexapeptídeos lineares ligados à resina são construídos manualmente na direção de C para N, mediante reações de acoplamento itera-tivas em um reator de batelada com agitação, dotado de frita de vidro sinterizada sob atmosfera de nitrogênio. A resina de 4-(cloro(difenil)metil)benzoil aminometil poliestireno é usada como material de partida e conduzida através de um protocolo padrão que consiste em ciclos repetitivos de desprote-ção de Na (20% v/v dietilamina (DAEM) em DMF), lavagens repetidas com DMF e IPK em ciclos, e acoplamentos (DIPCI/HOBT, DIEPA e DMF) à RT.

Em ligeira modificação desse procedimento de acoplamento, um especial cuidado é tomado para minimizar a racemização da fenilglicina ao se realizar o acoplamento desse aminoácido à temperatura de 0°C. Antes da divagem do peptídeo linear protegido e completamente construído a partir de sua resina suporte, a proteção de Να-Fmoc é removida.

Fmoc-(2$,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-OH é sintetizado conforme divulgado no documento de patente WO 02/101192. Todos os outros aminoácidos são comercialmente disponíveis.

Síntese de H-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-Phg-D-Trp(Boc)Lys(Boc)-OH a) Síntese de Resina-O-Fmoc-Lys(Boc) A resina de 4-(cloro(difenil)metil)benzoil aminometil poliestireno (20 g, 19,4 mmoles), previamente tratada com tolueno, é tratada durante 4 horas com cloreto de acetila (7,6 g, 97 mmoles) em tolueno à RT. Após fil-tração, o procedimento é repetido durante a noite, após isso, a resina é filtrada e lavada com tolueno e diclorometano. O acoplamento é realizado com uma mistura de Fmoc-Lys(Boc)-OH (18,2 g, 38,8 mmoles; 2 equiv.) e N-metilmorfolina (3,94g, 38,8 mmol, 2 equiv.) durante 4 horas à RT. Após a filtração, a resina é lavada com DMF e IPA 3 vezes em ciclos e seca a vácuo para a obtenção de 26,5 g de uma resina-O-Fmoc-Lys(Boc)-, com uma capacidade de 0,566 mmol/g (determinada pelo método de Fmoc); (Lit. Fmoc-method: Meienhofer, J.; Waki, M; Heímer, E.P.; Lambros, T.J.; Makofske, R.C.; Chang, C. D. Int. J. Pep. Prot. Res. 1979,13, 35) b) Resina-0-Lys(Boc)-D-Trp(Boc)-Phg-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-Phe-Tyr(Bzl)-H

Uma resina-O-Fmoc-Lys(Boc)- (28,0 g, 19,96 mmoles) é colocada em suspensão em DMF e tratada com uma solução de DAEM em DMF (20% v/v) por 10 minutos à RT. Após ser filtrada, o procedimento é repetido e depois a resina é lavada com DMF e IPA, 3 vezes em ciclos, seguido de três etapas de lavagens com DMF, Esse procedimento de desproteção de Na- Fmoc- e de lavagens é repetido após cada etapa de acoplamento. O acoplamento é realizado com uma mistura de aminoácido, HOBT e DICI, a qual é agitada por 30 minutos à RT, depois, adicionada à resina, imediatamente. O acoplamento é continuado até se completar, isto é, até completar o desaparecimento dos grupos amino residuais, o que é monitorado pelo teste de Ninidrina negativo "Kaiser". Após ser acoplada, a resina é lavada 5 vezes com DMF, estando então pronta para a proteção de Fmoc.

Os seguintes derivados de aminoácidos são seqüencialmente acoplados: - Fmoc-D-Trp(Boc)-OH (16,81 g, 31,92 mmoles, 2 equiv.), DIF (100 ml), HOBT (4,93 g, 32,24 mmoles, 2,02 equiv.), DICI (5,35 g, 42,45 mmoles, 2,66 equiv.); - Fmoc-Phg-OH (11,92 g, 31,92 mmoles, 2 equiv.), THF (70 ml), HOBT (4,93 g, 32,24 mmoles, 2,02 equiv.), DICI (5,35 g, 42,45 mmoles, 2.66 e-quiv.). Um cuidado especial é tomado para minimizar a racemização da fe-nilglicina através da realização do acoplamento desse aminoácido à temperatura de 0 °C; - Fmoc-(2S,4R) 4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-C0-0)-Pro-0H (17,26 g, 31,92 mmoles, 2 equiv.), DIF (100 ml), HOBT (4,93 g, 32,24 mmoles, 2,02 equiv.), DICI (5,35 g, 42,45 mmoles, 2,66 equiv.); - Fmoc-Phe-OH (12,36 g, 31,92 mmoles, 2 equiv.), DIF (100 ml), HOBT (4,93 g, 32,24 mmoles, 2,02 equiv.), DICI (5,35 g, 42,45 mmoles, 2,66 e-quiv.); - Fmoc-Tyr(Bzl)-OH (15,75 g, 31,92 mmoles, 2 equiv.), DIF (100 ml), HOBT (4,93 g, 32,24 mmoles, 2,02 equiv.), DICI (5,35 g, 42,45 mmoles, 2,66 e-quiv.).

Antes da divagem do peptídeo linear protegido e completamente construído a partir de sua resina suporte, a proteção Να-Fmoc é removida mediante tratamento da resina com uma solução de DAEM em DMF (20% v/v) durante 10 minutos à RT. Após ser filtrada, o procedimento é repetido e lavado com DMF e IPA 3 vezes em ciclos, seguido de mais 3 etapas de lavagens com DMF. A secagem da resina a vácuo sob temperatura de 40°C proporciona uma resina amarelada.

c) Clivagem do peptideo linear a partir de sua resina suporte: H-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-Phg-D-Trp(Boc)Lys(Boc)-OH

Ca) Método com Ac0H/CH2CI2/H20 45/45/5 (v/v/v) O peptideo linear protegido completamente construído de resina-0-Lys(Boc)-D-Trp(Boc)-Phg-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-Phe-Tyr(Bzl)-H (24,5 g) é suspenso em uma mistura de Ac0H/CH2CI2/H20 (45/45/5) (v/v/v) (150 ml) e agitado por uma hora à RT, filtrado e lavado com CH2CI2. O filtrado é evaporado à secura, o resíduo agitado por uma hora com uma mistura de TBME e heptano, (7/3) (v/v), depois, filtrado e seco a vácuo. Um sólido amarelado é obtido; teor: 93.5 % por HPLC g/g; pureza: 91.6 % (F)-HPLC e 2.5% (F)-HPLC D-Phg-Epímeno. A resina de (4-(cloro(difenil)metil)benzoil aminometil poliestireno) é lavada 3 vezes com metanol e seca, podendo ser novamente usada.

Cb) Método com CH2CI2 e MeOH O peptideo linear protegido completamente construído de resina-0-Lys(Boc)-D-Trp(Boc)-Phg-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-Phe-Tyr(Bzl)-H (6,2 g) é suspenso em uma mistura de CH2CI2/MeOH (1/1) (v/v) (115 ml) e agitado por 3 dias à RT, filtrado e lavado com CH2CI2. O filtrado é evaporadoà secura, o resíduo é agitado por uma hora com uma mistura de TBME e heptano (7/3) (v/v) (60 ml), filtrado e seco a vácuo. Teor: 93.5 % por HPLC g/g; pureza: 92.6 % (F)-HPLC e 1.1% (F)-HPLC D-Phg-Epímero. A resina de (4-(cloro(difenil)metil)benzoíl aminometil poliestireno) é lavada 3 vezes com metanol e seca, podendo ser novamente usada.

Cc) Método com etil-metil cetona/ MeOH 0 peptídeo linear protegido completamente construído de resina-0-Lys(Boc)-D-Trp(Boc)-Phg-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-Phe-Tyr{Bzi)-H (4,0 g) é suspenso em uma mistura de dietil-metil cetona (1/1) (v/v) (24 ml) e agitado por 15 horas à temperatura de 50 °C, filtrado e lavado com MeOH. O filtrado é evaporado à secura, o resíduo é agitado por uma hora com uma mistura de TBME e heptano (7/3) (v/v) (60 ml), filtrado e seco a vácuo. Teor: 88.1 % por HPLC g/g; pureza: 95.2 % (F)-HPLC e 1.8% (F)-HPLC D-Phg-epímero. A resina de (4-(cíoro(difenil)metil)benzoil aminometil poliestireno) é lavada 3 vezes com metanol e seca, podendo ser novamente usada. Purificação Para fins analíticos os peptídeos lineares foram purificados por meio de cromatografia de RP.

Caracterização A estrutura de uma amostra analítica purificada por cromatografia de RP é confirmada por FAB-MS, LC-MS e dados de RMN (DMSO em ppm, 1,16,1,34,1,55,1,61 (3H), 1,66,2,05,2,20,2,51,2,83 (2H), 2,91,2,96, 2,98,3,02,3,41,3,78,4,13, 4,61,5,13, 5,51,6,74,6,83,6,88 (2H), 7,01 <2H), 7,11 (2H),7,38, 7,42 (2H), 7,49, 7,72,8,01,8,29,8,48, 8,62,8,75.) A configuração de aminoácido é determinada por meio de análise de aminoácido: o composto é hidrolisado sob condições acídicas, convertido a derivados e a configuração de cada aminoácido individual é atribuída por meio de cromatografia gasosa enantiomérica seletiva/espectrometria de massa por ionização química.

Uma adicional prova da estrutura é a conversão de diferentes peptídeos lineares em peptídeos cíclicos bem caracterizados.

Os seguintes compostos foram sintetizados de acordo com o procedimento descrito: H-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-Phg- [)-Trp(Boc)-OH; H-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-Phg- D-Trp-OH; H-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)- Tyr(Bzl)-Phe-OH; H-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)- Try(Bzl)-OH; H-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-DPhg- DTrp(Boc)-Lys(Boc)-OH

Exemplo 3: Ciclização dos peptídeos lineares protegidos para sintetização Ciclo[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro»Phg-D-Trp(Boc)- Lys{Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-] Ciclização de H-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-Phg-D- Trp(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-OH Método através de Azida Para ciclização, o fragmento linear (2,5 g, 1,83 mmoles) é dissolvido em DMF (391 ml), resfriado para a temperatura de -5°C, tratado com EDIPA (0,47 g, 3,66 mmoles, 2 equiv.) e DPPA (0,75 g, 2,75 mmoles, 1,5 equv.), e agitado nessa temperatura até completar a reação (aproximadamente 20 horas). Em seguida, se adiciona água (391 ml) na forma de gotas à mistura reacional e a precipitação é filtrada e lavada com água até que nenhuma azida seja detectável. Assim, são obtidas 4.9 g de um sólido branco umedecido com água (Rf de HPLC idêntica à referência), que são usadas na reação de desproteção sem posterior purificação. O composto é caracterizado mediante comparação direta com um composto de referência através de HPLC.

Ciclização de H-Tyr(Bzi)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CHrNH-CO-0)-Pro- Phg-D-Trp(Boc)Lys(Boc)-OH a) HBTU (Método (a)) Para ciclização, o fragmento linear (6,0g, 3,5 mmoles) é dissolvido em DMF (780 ml), resfriado para a temperatura de -5°C, tratado com E-DIPA (1,13 g, 8,75 mmoles, 2,5 equiv.), HOBT (1,18 g, 8,75 mmoles, 2,5 e-quiv.), HBTU (3,3 g, 8,78 mmoles, 2,5 equiv.) e agitado nessa temperatura até a reação se completar (aproximadamente 2 horas). Em seguida, se adiciona água (391 ml) na forma de gotas à mistura reacional sob a temperatura ambiente, a precipitação é filtrada e lavada com água e heptano e depois seca a vácuo durante a noite. Dessa forma, são obtidas 5,4 g de um sólido branco amarelado. O composto é caracterizado por comparação direta com um composto de referência através de HPLC. Teor: 55% peso/peso por H-PLC, pureza: 78 (A%)-HPLC. b) HBTU (Método b) Para ciclização, o fragmento linear (6,0 g, 4,16 mmoles) é dissolvido em DMF (60 ml) e derramado em uma mistura de HOBT (4,15 g, 10,4 mmoles, 2,5 equiv.), HBTU (4,15 g, 10,4 mmoles, 2,5 equiv.) e EDIPA (1,41 g, 10,4 mmoles, 2,5 equiv.) em DMF (135 ml) à temperatura de -5°C, sendo agitado nessa temperatura até se completar a ração (aproximadamente 2 horas). Em seguida, se adiciona água (559 ml) na forma de gotas à mistura reacional sob a temperatura ambiente e a precipitação é filtrada e lavada com água e heptano e seca a vácuo durante a noite. Assim, se obtém um sólido branco amarelado. O composto é caracterizado por comparação direta com um composto de referência, através de HPLC. Teor: 77% peso/peso por HPLC, pureza: 84 (A%)-HPLC.

Os seguintes peptídeos lineares são tornados cíclicos conforme o procedimento acima: H-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-Phg- D-Trp(Boc)-OH H-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-Phg- D-Trp-OH H-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)- Tyr(Bzl)-Phe-OH H-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)- Try(Bzl)-OH

H-TyKBzl)-Phe-(2S,4RH-(Boc-NH-CH2-CHrNH-CO-0)-Pro-DPhg-DT rp(Boc}-Lys(Boc)-OH

Exemplo 4: Synthesis of Cyclo[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CHrNH-CO-0)-Pro«Phg-D-Trp-Lys»Tyr(Bzl)-Phe-] trífluoroacetic acid salt Para uma completa desproteção, o resíduo (1,5 g, 0,79 mmol) é dissolvido à temperatura de 0°C em TFA/H20, 95:5 (8,3 ml), e a mistura é agitada sob resfriamento por 30 minutos. A mistura reacional fria é derramada em uma mistura de TBME (29 ml) e heptano (13 ml), à RT, e agitada por 2 horas. A precipitação é filtrada, lavada com TBME/heptano 1:1 (v/v) e seca a vácuo. Dessa forma, se obtém um sólido de cor bege, com teor de 53% peso/peso por HPLC, pureza: 79 (A%)-HPLC.

REIVINDICAÇÕES

Claims (3)

1. Processo para produção de um composto de fórmula (I): na qual r1 é -C2-ealquileno-NR3R4, -C2.6alquileno-guanidina or -C^alquile- no-COOH, sendo que cada R3 e R4, independentemente, é H, C^^ alquila, ω-hidróxi-C2.4 alquileno ou acila, ou R3 e R4 formam juntos com 0 átomo de nitrogênio ao qual estão ligados, um grupo heterocíclico, que pode compreender um outro heteroatomo, e R2 é Z1-CH2-R5, -CH2-CO-O-CH2-R5 sendo que Z1 é O ou S, e Rs é fenila opcionalmente substituída, ou um sal do mesmo; o referido processo sendo caracterizado pelo fato de que compreende a ciclização de um análogo linear de somatostatina de fórmula (II): II com um agente de ciclização selecionado dentre 0-(benzotriazol-1-il)-N,N,N\N1 -tetrametílurônio-hexa-flúor-fosfato e 1 -hidróxi-benzo-triazol, sendo que Ri e R2 são como definidos acima, cada R11 e R12, independentemente, é um grupo protetor amino, quando R1 compreender um NH2 terminal, esse NH2 terminal é também protegido por um grupo protetor amino, e quando requerido, se remove o(s) grupo(s) de proteção e se recupera um composto de fórmula (I) assim obtido, na forma livre ou na forma de sal.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende a ciclização de um análogo linear de somatostatina de fórmula (II): II na qual R1 é -CH2-CH2-NR3R4, R2é 4-benzilóxi-fenil, e R3, R4, R11 e R12 são como definidos na reivindicação 1, sendo que quando R1 compreender um NH2 terminal, esse NH2 terminal é também protegido por um grupo amino protetor, e quando requerido, se remove o(s) grupo(s) protetor(es) e se recupera 0 composto de fórmula (I) assim obtido, na forma livre ou na forma de sal, sendo que R1 é -CH2-CH2-NR3R4 e R2é 4-benzilóxi-fenil.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o composto de fórmula (II) é selecionado dentre: H-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-DPhg-DTrp (Boc)-Lys(Boc)-OH, H-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-Phg- DTrp-Lys (Boc)-OH, H-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-Phg- D-Trp (Boc)Lys(Boc)-OH, ou um sal dos mesmos.