KR20010071853A - 비스-트리클로로메틸 카르보네이트를 이용하여 아미노산을결합하는 공정 - Google Patents

비스-트리클로로메틸 카르보네이트를 이용하여 아미노산을결합하는 공정 Download PDF

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요셉 살리트라
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카르몬 요람
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Abstract

본 방법은 보호된 아미노산으로부터 아미노산 염화물을 생성하여, 펩티드 합성동안에 트리포스진을 효과적인 결합시약으로 이용할 수 있다는 것을 설명한다. 이 공정은 특히, 공간적으로 방해를 받는 아미노산에 결합시에 유용하고, 또는 어려운 다른 결합에 이용할 수 있다. 또한, 동일한 시약을 펩티드상에 있는 자유 아민과 카르복실산사이에 아미노 결합을 만들어 펩티드 유도체 유도체를 만들거나 또는 고형 서포트에 아미노산을 결합시키는데에도 이용할 수 있다.

Description

비스-트리클로로메틸 카르보네이트를 이용하여 아미노산을 결합하는 공정{PROCESSES FOR COUPLING AMINO ACIDS USING BIS-(TRICHLOROMETHYL) CARBONATE}
펩티드 합성 분야에서, 특정 결합 가령, N 알킬화된 아미노산, C-알킬화된 아미노산, Cα-분지쇄 아미노산과 같은 큰 또는 공간적으로 방해를 받고 있는 아미노산에 결합시키는 것은 어려운 결합으로 알려져 있다. 이와 같은 결합을 실행할 경우에 상당한 수득율을 얻기 위해서, 다양한 특정 결합 시약이 개발되어 왔다. 다른 공지의 과정 가운데에는, 결합 반응의 수득율을 개선하기 위해, 미리-형성된 염화 아미노산을 이용한다. t-부틸(t-Bu), t-부톡시카르보닐(Boc), 트리틸(Trt)을 포함하나 이에 국한되지 않은산에 불안정한 보호기로 보호된 측쇄를 가지는 플로레닐메톡시카르보닐(Fmoc) 아미노산의 염화물이 저장안정성을 가지기 때문에 고형상 펩티드 합성(SPPS)시에 보호된 염화 아미노산을 이용하는 것이 주로 제한을 받는다. 예를 들면, t-Bu-보호된 측쇄를 가지는 Fmoc-아미노산(AAs) 염화물이 일반적으로 수용되는 것은 아니다. 일부 경우에(아스파르트산 및 글루타민산), 염화물이 수득되지 않으며, 다른 경우에(티로신, 세린, 트레오닌), 이들의 저장 안정성은 실제 이용하기에 부적합한 것으로 보인다. 또한, 곁반응 및 특정한 반응 조건, 정제과정을 요하기 때문에, Fmoc-리신(Boc), Fmoc-트립토판(Boc), Fmoc-시스테인(Trt), Fmoc-글루타민(Trt), Fmoc-아르기닌 2,2,5,7,8-펜타메틸 크로만-설포닐(Pmc)로부터 염화물을 만드는 것은 문제가 있다(Carpino et al.Acc. Chem. Res.29:268,1996). 이와 같은 문제로 자동 펩티드 합성에서 미리 만들어진 Fmoc 아미노산을 전반적으로 이용하는 것이 방해를 받는다. 이와 같은 제한에도 불구하고, 방해를 받은 2차 아미노산를 어셈블리하는 SPPS에 염산을 이용한다(Carpino et al. 1996 ibid and ref. within).
Nα-알킬화된 아미노산에 보호된 아미노산을 결합시키는 것은 용액 및 고체상에서 어려운 것으로 여겨져 왔다. 이와 같은 결합을 모델 펩티드에 이용하여, 새로운 좀더 효과적인 결합 방법을 설명한다. 이와 같은 모델에서, N-메틸화된 아미노산을 친핵체로 이용하는데, 그 이유는 Cα(N-메틸 발린 및 N-메틸 아미노이소부틸산)에 공간적인 방해물을 가지는 N-메틸화된 아미노산에 결합은 프롤린에 하는 것보다도 휠씬 느린 것으로 나타났다. N-알킬 아미노산에 결합을 시키기 위해서는 브로모-트리스-피롤리디노-포스포니움 핵사플로오르포스페이트(PyBroP)(Coste et al.Tetrahetron Lett.31 669, 1990); 1-하이드록시-7-아자벤조트리아졸(HOAt)/O-(7-아자벤조트리아졸-1-yl-)-1,1,3,3,테트라메틸우로니움 핵사플로오르포스페이트(HATU)(Carpinoet al., J. Chem. Soc., Chem. Commun.201, 1994); 우레탄-보호된 N-카르복시안하이드리드(UNCA)(Spencer et al.Int. J. Pep. Prot. Res.40:282,1992); 할로겐산(Carpion et al., 1996 ibid)과 같은 특정 결합 시약 및 활성화 방법을 특별히 이용하는 것을 권한다.
기본구조가 고리형인 펩티드의 SPPS 동안에 염산 방법은 보호된 아미노산을 N-알킬 아미노산과 같은 공간적으로 방해를 받는 아미노산 유도체에 결합시키는데 우수한 방법으로 보인다. 미리 형성된 염산 방법을 한계 및 SPPS에 이를 전반적으로 이용하기 위해, Fmoc-AAs 염화물을 만들기 위한 효과적이고 일반적으로 이용할 수 있는 방법이 유익하다.
비스-(트리클로로메틸)카르보네이트(BTC)(Councler, C.Ber. Dtsch. Chem. Ges.13:1697, 1880) 또는 탄산 헥사클로로디메틸염 또는 "트리포스진"이라고도 하는 시약은 3몰의 포스진에 등가인 고체 안정한 포스진 치환체이다. 트리포스진은 아자-알라닌, 아자-아스파르트산 및 아자-아스파라진 잔기를 포함하는 다양한 아자-펩티드 유도체의 액상 및 고체상 합성을 위한 효과적인 카르보닐화 시약으로 이용되어 왔다(Andre et al.J. Pep. Sci.3:429,1997).
펩티드 화학에서 유용한 이소시아네이트 형성 또는 다른 반응성이 있는 종을 만드는 시약으로 트리포스진을 이용하는 것에 대해 공개된 바 있다(Eckert DE3440141, Nippon Kayaku JP10007623). 제약용으로 이용할 수 있는 다양한 중간생성물을 만드는데 트리포스진을 이용하는 것에 대해서도 공개된 바있다(Hoffmanne et al. DD292452).
트리포스진 시약이 보호된 아미노산을 즉석에서 만드는데 적합하다는 것 즉, SPPS에서 결합 물질로 이용할 수 있다는 것에 대해서는 공개되거나 암시된 바가 없다(for review see Cotarca et al.Synthesis553,1996).
포스진은 실험실 및 공장규모의 작업에 가치있는 것으로 평가를 받아온 것은 사실이지만, 이를 이용할 경우에 특히 호흡에 유해하다는 것에 대해서는 알 알려진 바 있다. 액체 트리클로로메틸 클로로포르메이트 흔히 "디포스진"(Fridgen, L.N.Prol, J.J., J.Org. Chem.54:3231,1989)은 포스진 치환체로 이용되는 것으로 모든 공통의 포스진 반응에 유용하나, 이동 및 저장시에 액체로 운반되기 때문에 상당히 위험하다. 결정상태 BTC(mp 81-83℃)가 휠씬 안정적이고, 취급도 용이하여, 포스진 화학물질을 필요로하는 모든 분야에 시약으로 선택된다(Cotarca et al., ibid). 종합적으로보면, 1몰 BTC은 3몰 등가의 포스진을 생산하여, 하이드록실, 아민 또는 카르복실산 친핵체와 반응하여 클로로포르메이트, 이소시아네이트, 염화 아실을 형성한다. BTC가 포스진보다는 저렴하고, 가수분해에 덜 민감하다는 것과 다른 모든 사실을 고려할 때, 전반적인 결합 시약으로 BTC를 이용하지 않았다는 사실이 의외이다.
기본골격이 고리를 형성한 펩티드 유사체
기본골격의 고리화는 펩티드를 대사 안정성, 선택성 및 생체이용성의 개선등과 같은 원하는 역리학적 성질을 가지는 구조적으로 부자연스런 펩티드유사체로 전환되록 하는 것을 의미한다(Gilon et al.Biopolymers31:745,1991; Byk et al.J.Med.Chem. 39:3174,1996; Gilon et al.J. Med. Chem. 41:919,1998).
기본 골격을 고리화시키는 과정에서, 펩티드에 있는 Nα및 Cα원자는 다양한 스페이스를 통하여 연결된다. N-기본골격이 고리화된 펩티드를 합성하기 위해서, 상당한 수직으로 보호된 기능을 하는 Nα알킬 아미노산(N-빌딩 유닛)을 준비한다(Bitan et al.,J. Chem. Soc., Perkin trans. I1501, 1997a; Muller et al.J.Org.Chem.62:411,1997). 이와 같은 유닛은 SPPS 또는 용액 방법을 이용하여 펩티드로 결합시키고, Nα-알킬상에 있는 ω-기능기로부터 보호기를 수직상에서 제거한 후에, 고리화된다. N-기본 골격이 고리화된 펩티드를 합성하는데 있어서, 중요한 단계는 펩티드 수지상에서 Nα(ω-기능을 가진 알킬)아미노산 잔기의 공간적으로 방해를 받는 제 2 아민에 보호된 아미노산을 결합시키는 단계이다.
Nα(ω-기능화된 알킬) 글리신 빌딩 유닛에 결합되는 N-기본골격 고리화 펩티드를 합성하는 것에 대해서는 이미 보고된 바 있다. 보호된 아미노산을 펩티드 수지상에 부착된 Gly 빌딩 유닛의 제 2 차 아민에 결합시키기 위해, 결합 시약으로 벤조트리아졸-1-yl-oxy-트리스-(디메틸아미노)-포스포니움 헥사플로오르포스페이트 BOP 또는 PyBrop(Bitan et al.,J. Pept. Res.49:421, 1997b; Byk et al., 1996 ibid)를 이용한 다중 결합 단계를 이용한다. 일반적으로 보호된 아미노산를 Glydldhl의 빌딩 유닛(Gly가 아닌 기본골격을 가지는 고리화된 빌딩 유닛)에 결합시키는 것은 어렵고, 거의 불가능한 것으로 안다.
펩티드 수지상에 부착된 Gly이외의 다른 다양한 빌딩 유닛을 포함한 공간적으로 방해를 받는 제 2 차 아민에 많은 Fmoc AAs을 결합은 염산 방법을 이용하는 경우에 중간 또는 높은 수득율을 얻는 것으로 보이나, 플로오르화 산(Carpino et al., 1996 ibid) 또는 PyBrOP(Coste et al., ibid); HOAt/HATU(Carpino 1994 ibid); 2-(2-Oxo-1(2H)-피리딜)-1,1,3,3-비스펜타-메틸렌우라니움 테트라플로오르보레이트(TOPPipU)(Henkleinet al.In""Peptides 1990"Proc. of the 21th European Peptide Symposium", E.Giralt and D. Andreu, eds, pp. 67. ESCOM Leiden, 1990), UNCA(Spencer et al., 1992); Mukaiyama 시약(Mukaiyama, T.Angew. Chem., Int. Ed. Ingl. 18:7078,1979)과 같은 다른 결합 시약을 이용할 경우에는 얻을 수 없다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 SPPS에서 결합이 어려운 것을 개선할 수 있는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 고형상 펩티드 합성에서 원하는 공간이성체의 수득율을 개선하는 방법을 제공한다. 본 발명의 또 다른 목적은 다수 병행 합성(MPS)을 실행하는 방법을 제공한다. 본 발명의 또 다른 목적은 보호된 아미노산을 기능을 가지는 고형상 서포트에 부착시키거나 또는 SPPS 동안에 펩티드 또는 펩티드 수지상에 생의학적으로 중요한 리간드를 부착시키는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 고형 서포트상에 부착된 펩티드를 고리화시키는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 고리화된 펩티드의 다리 또는 서열에 요소 결합을 만드는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따르면, 포스진, 디포스진 또는 트리포스진과 같은 시약을 이용함으로써 보호된 아미노산 염화물을 즉석에서 만드는 공정을 제공하는 것이다. 따라서, 만들어진 보호된 아미노산 염화물은 펩티드 사슬에 아미노산 잔기를 결합시키는데 특히 유용하다. 이를 이용하여 펩티드 사슬에 카르보하이드레이트를 결합시킬 수 있다.
본 발명의 방법을 이용하여, 산 염화물즐 만드는 것은 글루쿠로닌산, DTPA, DOTA을 포함하나 이에 국한시키지 않는 다른 생물학적으로 중요한 산을 아미노 기본 골격 또는 아미노산 기능을 이용하여 펩티드 사슬에 연결시키는 공정을 제공하는 것이다. 본 발명의 원리에 따르면, 3가 화학명 트리포스진으로 알려진 비스-(트리클로로메틸)카르보네이트를 이용하여 보호된 아미노산 염화물을 만드는 것이다. 이공정을 이용할 경우에, 공간적으로 방해를 받는 아미노산 잔기 또는 크기가 큰 아미노산 유사체가 관련되는 결합 단계등 SPPS에 난해한 결합 단계가 가지는 문제를 극복할 수 있다.
이 방법은 SPPS에서 난해한 결합을 편리하고, 효과적인 결합 시약으로 BTC를 이용하는 것이다. 이 방법은 원치 않는 곁 반응 없이 원하는 구조의 생성물을 SPPS상에서 많이 얻을 수 있도록 하고, 다중 병행 펩티드 합성을 실행할 수 있도록 한다. 이와 같은 방법은 또는 이중-, 삼중 고리 펩티드와 같은 다중 고리화된 복합 펩티드 유사체를 합성할 수 있게 한다.
본 발명에 따른 한 방법은 펩티드 사슬에 아미노산 잔기를 결합시키는 공정으로 다음과 같다;
(i) 자유 카르복실산기 및 차단된 아미노기, 선택적으로 추가 차단된 기능 측쇄를 가지는 아미노산 잔기를 제공하고;
(ii) 이 반응에 비활성인 용해상에서 차단된 아미노산과 비스-(트리클로로메틸)카르보네이트와 반응시켜, 아미노산 염화물을 얻고;
(iii) 유기 염기를 첨가하여, 자유 산을 중화시키고;
(iv) 아미노산 염화물을 포함하는 생성된 현탁액을 차단된 카르복실 말단, 자유 아미노산 말단, 적어도 한 개의 자유 아미노산 말단을 가지는 펩티드 수지에서 선택한 화합물에 첨가시키고;
(v) 펩티드에 아미노산 염화물을 결합시킬 수 있는 반응 조건을 제공하여, 한 개 아미노산 잔기에 의해 펩티드를 연장시킨다.
본 발명의 제 2 방법은 고형 서포트상에 아미노산 잔기를 결합시키는 공정을 제공하는 것으로 다음과 같다;
(i) 자유 카르복실산기 및 차단된 아미노기, 선택적으로 추가 차단된 기능 측쇄를 가지는 아미노산 잔기를 제공하고;
(ii) 이 반응에 비활성인 용해상에서 차단된 아미노산과 비스-(트리클로로메틸)카르보네이트와 반응시켜, 아미노산 염화물을 얻고;
(iii) 유기 염기를 첨가하여, 자유 산을 중화시키고;
(iv) 아미노산 염화물을 포함하는 생성된 현탁액을 적어도 한 개의 자유 아미노 말단을 가지는 수지, 염화물이 결합할 수 있는 기능기를 가지는 고형 서포트에서 선택된 화합물에 첨가시키고;
(v) 고형 서포트에 아미노산 염화물을 결합시킬 수 있는 반응 조건을 제공한다.
본 발명에 따른 가장 적합한 구체예는 다음의 반응식으로 요약할 수 있다;
본 발명은 통상적으로 트리포스진으로 알려진 비스-(트리클로로메틸) 카르보네이트를 이용한 염화 아미노산을 즉석에서 만드는 공정에 관계하고, 이 공정을 고형상 펩티드 합성 및 고형 서포트를 유도하는 공정에 이용하는 방법에 관계한다.
도 1은 실시예 38에 의해 수득한 생성물의 HPLC 크로마토그래피이다.
도 2는 실시예 38에 의해 수득한 생성물의 질량 스펙트럼 분석을 한 것이다.
도 3은 실시예 49에 의해 수득한 생성물의 HPLC 크로마토그래피이다.
도 4는 실시예 55에 의해 수득한 생성물의 HPLC 크로마토그래피이다.
도 5는 실시예 63에 의해 수득한 PTR3227의 HPLC 크로마토그래피이다.
도 6은 실시예 64에 의해 수득한 PTR3229의 질량 스펙트럼 분석을 한 것이다.
도 7은 실시예 65A에 의해 수득한 PTR3237의 질량 스펙트럼 분석을 한 것이다.
도 8은 실시예 65A에 의해 수득한 PTR3241의 HPLC 크로마토그래피 및 질량 스펙트럼 분석을 한 것이다.
도 9는 실시예 66에 의해 수득한 MPS 펩티드 #20의 HPLC 크로마토그래피 및 질량 스펙트럼 분석을 한 것이다.
도 10은 실시예 67에 의해 합성된 사이클로스포린의 HPLC 크로마토그래피 및 질량 스펙트럼 분석을 한 것이다.
본 발명에 따르면, 스포진, 디포스진, 트리포스진과 같은 시약을 이용하여 보호된 아미노산 염화물을 즉석에서 합성하는 공정을 제공한다. 여기에서 설명하는 모든 특정 구체예에서는 고형상 펩티드 합성을 이용하여 예시하나, 이와 같은 공정은 당업자에 공지된 것과 같이 용액상에서 펩티드를 합성하는데에도 적합하다는 것을 알 수 있을 것이다. 또한, 동일한 공정을 이용하여, 펩티드 사슬에 카르보하이드레이트를 결합하는 것을 포함하여 다른 부분을 결합하고, 다중 병행 펩티드 합성 방법에도 이용할 수 있다. 본 발명의 공정은 이중 고리 및 삼중 고리 펩티드와 같은 복합 펩티드 유사체를 합성하는 것에 적합하고, 7개의 공간적으로 방해를 받은 N-메틸 아미노산으로 구성된 사이클로스포린 유사체 합성에도 이용할 수 있다. 이 공정은 또한 서열에서 또는 고리화된 펩티드의 다리상에서 요소 결합을 형성하는데 적합하다.
약어
여기에서 설명하는 일부 약어는 본 발명을 설명하기 위해 이용된 것이다.
예를 들면, AA는 아미노산을 말하는 것이고;
ACN는 아세토니트릴을 말하는 것이고;
Alloc는 아릴옥시카르보닐을 말하는 것이고;
Boc는 t-부톡시카르보닐을 말하는 것이고;
BOP는 벤조트리아졸-1-yl-oxy-트리스-(디메틸아미노_포스포니움 헥사플로오르포스페이트를 말하는 것이고;
BTC는 비스-(트리클로로메틸)카르보네이트를 말하는 것이고;
DCM는 디클로로메탄을 말하는 것이고;
DIEA는 디이소프로필에틸아민을 말하는 것이고;
DOTA는 테트라아자사이클로데칸테트라아세트산을 말하는 것이고;
DTPA는 디에틸렌트리아민펜타아세트산을 말하는 것이고;
eq는 등가를 말하는 것이고;
Fmoc는 플로레닐메톡시카르보닐을 말하는 것이고;
Gln은 글루타민을 말하는 것이고;
HATU는 O-(7-아자벤조트리아졸-1-yl)-1,1,3,3-테트라메틸우라니움 핵사플로오르포스페이트를 말하는 것이고;
HOAt는 1-하이드록시-7-아자벤조트리아졸을 말하는 것이고;
HPPA는 파라하이드록시 페닐 프로피온산을 말하는 것이고;
MBHA는 메틸벤지하이드라민을 말하는 것이고;
Me는 메틸을 말하는 것이고;
MPS는 다중 병행 합성을 말하는 것이고;
NMP는 N-메틸 피롤리돈을 말하는 것이고;
Pmc는 2,2,5,7,8-펜타메틸 클로만-6-설포닐을 말하는 것이고;
PyBrOP는 브로모-트리스-피롤리디노-포스포니움 헥사플로오르포스페이트를 말하는 것이고;
SPPS는 고형상 펩티드 합성을 말하는 것이고;
t-Bu는 t-부틸을 말하는 것이고;
TFA는 트리플로오르아세트산을 말하는 것이고;
THF는 테트라하이드로퓨란을 말하는 것이고;
TIS는 트리이소프로필실란을 말하는 것이고;
TOPPipU는 2-(2-Oxo-1(2H)-피리딜)-1,1,3,3-비스펜타-메틸렌우라니움 테트라플로오르보레이트를 말하는 것이고;
Trt는 트리틸을 말하는 것이고;
UNCA는 우레탄-보호된 N-카르복시안하이드리드를 말하는 것이다.
아미노산
본 발명에 이용된 아미노산은 일상의 합성 방법에 의해 만들거나 시판되는 것을 이용한다. 자연 아미노산 및 이들의 유도체는 IUPAC 회의에서 정한 3문자 코드로 나타내었다. 아무런 표시가 없는 것은 L-이성체를 이용한다는 의미이고, 아미노산 앞에 D-가 있는 것은 D-이성체를 이용한다는 의미이다.
코드에 없는 아미노산은 각각 다음과 같다;
Abu는 2-아미노부틸산을 말하는 것이고;
Aib는 2-아미노-이소부틸산을 말하는 것이고;
β-Ala는 β-알라닌을 말하는 것이고;
Amb는 3 아미노 메틸 벤조익산을 말하는 것이고;
ChxGly는 사이클로헥실 글리신을 말하는 것이고;
Dab는 Di 아미노 부틸산을 말하는 것이고;
GABA는 감마 아미노 부틸산을 말하는 것이고;
Hcys는 호모시스테인을 말하는 것이고;
1Nal은 1-나프틸알라닌을 말하는 것이고;
2Nal는 2-나프틸알라닌을 말하는 것이고;
Nva는 노르발린을 말하는 것이고;
(p-Cl)Phe는 파라 클로로 페닐알라닌을 말하는 것이고;
(p-NH2)Phe는 파라 아미노 페닐알라닌을 말하는 것이고;
(p-F)Phe는 파라 플로오르 페닐알라닌을 말하는 것이고;
(p-NO2)Phe는 파라 인트로 페닐알라닌을 말하는 것이고;
Sar는 사르코신을 말하는 것이고;
Thi는 티에닐알라닌을 말하는 것이다.
명세서 및 청구항에서 이용된 바와 같이, "차단된 아미노산"은 반응기가 특정 차단 또는 보호기로 보호된 것으로 이와 같은 차단 또는 보호기는 선택적으로 제거될 수 있으며, 이를 "보호된 아미노산"으로 표현할 수 있음을 인지할 것이다.
여기에서 이용된 것과 같이, "기본 골격 고리화된 펩티드"는 서열상에서 다른 빌딩 유닛 또는 다른 아미노산에 펩티드의 기본 구조에 있는 알파 질소를 통하여 다리를 만들기 위해 연결된 적어도 한가지 빌딩 유닛을 포함하는 선형 펩티드 유사체를 말하는 것이다. "빌딩 유닛"은 아미노산의 Nα-ω-기능을 가진 유도체를 말한다.
기본 골격이 고리화된 펩티드의 합성에 이용되는 빌딩 유닛
"빌딩 유닛"은 다음의 화학식을 가지는 Nα-ω-기능화된 아미노산 유도체를 말하는 것이다.
이때, X는 알킬렌, 치환된 알킬렌, 아릴렌, 치환된 사이클로알킬렌에서 선택된 스페이스 기이고;
R'는 아미노산 측쇄이고, 선택적으로는 특정 보호기가 결합되어 있고;
B는 알킬옥시, 치환된 알킬옥시, 아릴 카르보닐에서 선택된 보호기를 말하는 것이고;
G는 기능기로써 아민, 티올, 알코올, 카르복실산, 에스테르, 알데히드, 알코올, 알킬 할로겐화물에서 선택되고;
A는 G의 특정 보호기를 말하는 것이다.
펩티드 서열내에 결합된 빌딩 유닛은 다음의 구조를 가진다;
이때, X는 알킬렌, 치환된 알킬렌, 아릴렌, 치환된 사이클로알킬렌에서 선택된 스페이스 기이고;
R'는 아미노산 측쇄이고, 선택적으로는 특정 보호기가 결합되어 있고;
B는 알킬옥시, 치환된 알킬옥시, 아릴 카르보닐에서 선택된 보호기를 말하는것이고;
G는 기능기로써 아민, 티올, 알코올, 카르복실산, 에스테르, 알데히드, 알코올, 알킬 할로겐화물에서 선택되고;
이와 같은 빌딩 유닛은 펩티드 서열내에 결합되는데, 기능기 G를 통하여 펩티드 서열내에 아미노산 측쇄중에 하나와 또는 또다른 ω-기능화된 아미노산 유도체와 선택적으로 고리화된다.
빌딩 유닛은 상응하는 변형된 아미노산의 3문자 코드 다음에 반응기 형(예를 들면, 아민의 경우에는 N, 카르복실의 경우에는 C)을 쓰고, 그 다음 공간을 차지하는 메틸렌 기의 수를 쓰는 것으로 표시한다. 예를 들면, GlyC2는 Gly에 크로복실 반응기와 2개의 탄소 메틸린 스페이스를 가지는 변형된 Gly를 말하는 것이고, PheN3는 아미노 반응기와 3개의 탄소 메틸렌 스페이스를 가지는 변형된 페닐알라닌을 나타내는 것이다.
빌딩 유닛을 만드는 방법은 WO 95/33765; WO 98/04583; US 특허 5,723,575; 5,811392; 5,883,293; 5,874,529; 5,770,687에서 설명하고 있고, 이를 참고문헌으로 전문 첨부한다.
전반적인 과정
다음의 대부분의 실시예에서, 특정 과정을 이용하는데, 이는 간단하여, 다음의 제목의 전반적인 과정으로 요약할 수 있다.
일반 과정 A; 모델 펩티드의 SPPS
신터드 유리 바닥이 있는 반응 용기를 교반기상에 얹고, 1g의 링크 아미드메틸벤르하이드릴아민(MBHA) 수지(0.55 mmol/g)를 1.5시간 동안 N-메틸 피롤리돈(NMP)에서 팽창시킨다. Fmoc 보호는 20% 피페리딘/NMP(15분간 2회, 각 8㎖씩)으로 제거한다. NMP(5회, 2분간 8㎖)으로 세척한 후에, Kaiser 테스트를 이용하여 Fmoc가 제거되는 것을 모니터한다.
결합 과정은 1시간 동안 실온에서, Fmoc AA, Fmoc N-Me AA, Fmoc-빌딩 유닛(3당량) PyBrOP(3당량) 디오소프로필에틸아민(DIEA)(6당량)/NMP(8mL)에서 실행하였다. 반응이 완료되는 것은 Kaiser 테스트를 이용하여 모니터하고, 용매는 여과시켜 제거한다. 수지는 NMP(5회, 2분간 8㎖)으로 세척한다. Fmoc 보호기는 상기에서 설명한 것과 같이 제거한다. AA-수지에 Fmoc AA, Fmoc N-Me AA, Fmoc-빌딩 유닛을 결합시키는 것도 상기에서 설명한 방식으로 결합시약으로 PyBrOP를 이용하여 실시한다. N-Me 또는 빌딩 유닛-수지상에 Fmoc AA, Fmoc N-Me AA, Fmoc-빌딩 유닛을 결합시키는 것은 과정 B에서 설명하는 것과 같이 실행하였다. Fmoc 보호기를 제거하고, 상기에서 설명하는 결합 과정을 반복하여, 펩티드를 연장시킨다. 최종 Fmoc를 제거한 다음에 세척한다((NMP로 5회, 8㎖ 2분간; 디클로로메탄(DCM)으로 3회, 8㎖씩 2분간). 진공상에서 펩티드 수지를 건조시킨다. 신속한 절단; 소량의 펩티드 수지를 95% 트리플로오르아세트산(TFA)(1% 트리이소프로필실란(TIS) 및 4% H2O를 포함)로 처리한다. 용매는 질소 기류하에서 제거하고, 잔기는 물:아세토니트릴(0.1% TFA를 포함하는 ACN)에 넣는다. 여과후에, 용액을 HPLC 또는 질량 분광계로 주입한다.
일반 과정 B; AA 펩티딜 수지 및 N-알킬화된 AA 펩티딜 수지상에 BTC를 이용하여 Fmoc-AA을 결합
Fmoc AA, Fmoc N-Me AA, Fmoc-빌딩 유닛(5eq, 0.275 mmol) 및 BTC(1.65 eq,0.09 mmol)를 테트라하이드로퓨란(THF), 디옥산, 디글림 또는 1,3-디클로로프로판에 용해시켜, 0.15M용액을 만드는데, 이때 2,4,6-콜리딘(14 eq, 0.75 mmol)을 첨가하여 흰색의 현탁액을 만든다. 이 현탁액을 적절한 용매로 미리 세척한 N-Me AA 또는 빌딩 유닛-펩티딜 수지에 넣는다. 혼합물은 1시간동안 50℃상에서 교반시키고, 여과시킨다. 펩티딜 수지는 DCM로 세척시키고, 적절한 반응 용매를 이용하여 팽창시킨다음, 결합을 한 번 더 반복시킨다. 결합을 Fmoc-AA를 이용하여 AA 펩티딜 수지상에 결합시키는 경우에, 3eq Fmoc-AA's, 1eq BTC, 8eq 2,4,6-콜리딘만을 디옥산에서 1시간동안 실온에서 이용한다.
일반 과정 C: Fmoc-AA, N-Me AA, 빌딩 유닛을 기능화된 고형 서포트상에 결합시키는 경우
과정 B에서 설명한 것과 같이 Fmoc AA, Fmoc NMeAA, Fmoc-빌딩 유닛 염화물을 준비하였다. 디옥산 현탁액을 미리활성화시킨 유리 또는 하이드록시메틸화된 폴리스테린상에 넣는다. 혼합물은 1시간동안 50℃상에서 교반시키고, 여과시킨다. 유도된 서포트는 DCM으로 세척한다. Fmoc 피페리딘 방법으로 유도화 정도를 결정한다.
일반 과정 D; 아미노 또는 하이드록시 펩티딜 수지의 유도화반응
과정 B에서 설명하는 것과 같이 BTC를 이용하여 1,2,3,4-테트라-O-아실 글루쿠로닌산, 디에틸렌트리아민펜타 아세트산(DTPA), 테트라아자사이클로데칸테트라아세트산(DOTA), 파라하이드록시 페닐 프로피온산(HPPA)과 같은 산은 이에 상응하는 산 염화물로 전환된다. 현탁액을 아미노 또는 하이드록시 펩티딜 수지상에 넣고, 50℃에서 1시간동안 가열한다. 여과 및 세척후에, 유도화된 펩티딜 수지를 절단하고, 과정 A, G, H에서 설명한 것과 같이 특징을 조사한다.
과정 E; 기본 골격 고리화된 펩티드의 SPPS-고리화 및 절단
두 개의 빌딩 유닛을 포함하는 펩티드 수지는 일반 과정 A & B에 따라 합성하였다. Allyl/Alloc 보호기는 테트라키스/트리페닐포스핀)-팔라디움, 아세트산 5%, N-메틸몰핀 2.5%/DCM을 이용하여 아르곤하에서 실온, 1.5시간 동안 반응시켜 제거한다. 펩티드 수지는 클로로포름으로 세척한 후에, NMP로 세척한다. 고리화반응은 NMP에서 PyBOP(3당량), DIEA(6당량)을 이용하여 실온에서 1시간동안 세척한다. NMP로 세척한 후, 고리화 반응을 반복한다. 기본 골격 고리 펩티드에서 보호기를 떼어내고, 0.5시간 동안 0℃에서 그리고 실온에서 1~3시간 동안 10㎖ TFA 94%, 물 2.5%, TIS 1%, 에탄디티올 2.5%로 처리하여 수지로부터 잘라낸다. 수지는 여과로 제거하고, 추가 TFA로 세척하여, 복합된 용액은 질소 기류를 이용하여 기화시켜, 오일을 얻고, 이는 차가운 에테르(40㎖)로 처리하여, 고체화시킨다. 에테르는 원심분리를 이용하여 제거하고, 고체는 진공하에서 건조시킨 후에 정제안된 펩티드를 얻는다.
일반 공정 F; BTC를 이용하여 두 개의 N-빌딩 유닛을 포함하는 펩티드의 고리화반응
일반 공정 A, B, E에 따라 두 개의 N-빌딩 유닛을 포함하는 펩티드-수지를 합성할 수 있다. 고리화반응은 실온에서 1시간동안 BTC(0.33eq)을 이용하여 디옥산에서 실시한다. 일반 공정 E, G, H에서 설명하는 것과 같이 화학 과정 및 특징 조사를 한다.
일반 공정 G; 정제안된 펩티드의 HPLC 분석
정제안된 펩티드 샘플을 용매 A(물 + 0.1% TFA)에 용해시키고, HPLC(컬럼 C18 250X4mm, 유속 1㎖/분)으로 주입시킨다. 용출 용매 A 및 B (ACN, 0.1% TFA). 35분간 동안에 90% 내지 10% A를 이용하여 소수성 펩티드를 용출시킨다. 친수성 펩티드는 35분간 100% 내지 10% A의 선형 농도를 이용하여 용출시킨다. 214nm에서 온라인 UV 감지기를 이용하여 펩티드를 감지하였다.
일반 공정 H; 펩티드의 질량 스펙트럼 분석
HPLC에서 수득된 정제안된 펩티드 또는 분취물은 사중극 또는 이온 트랩 질량 분광광도계를 이용하여 분석하였다.
본 발명은 특정 펩티드 및 펩티드유사체를 통하여 예시한다. 이와 같은 실시예는 이에 한정하지 않으며, 본 발명은 실시예에 한정시키지 않으며, 실시예에 이어서 나오는 청구항에 국한된다.
촉매로써 DMF 또는 3차 아민 존재하에서 실온보다 약간 높은 온도에서 재환류 온도 범위에서 BTC에 비활성 용매에 있는 카르복실산과 BTC가 반응하면, 카르복실산 염화물이 가장 흔히 만들어진다. 원하는 합성결과를 얻기 위해 BTC에 비활성인 용매를 이용하는 것이 가장 중요하다.
미리-준비된 Fmoc-AA 염화물의 경우에, NMP에서 가열하면 최상의 변환을 얻을 수 있고, 다음의 조건에서 BTC를 이용한 예비 연구를 실시하였다; Fmoc-AA's(3 eq), BTC(1.2eq)가 NMP와 반응하고, 그 다음 DIEA(12eq)를 첨가한다. 실온에서 30분 반응 후에, 활성화된 AA을 1시간동안 65℃에서 팽창된 펩티드 수지에 넣는다. 이와 같은 조건하에서 이중 결합으로 원하는 펩티드를 얻지만, 일부 손실된다. 염기를 공간적으로 방해를 덜 받는 2,4,6-콜리딘으로 바꾼다 해도 표 1에서 볼 수 있는 것과 같은 결합 공간일체성이 상당히 개선되지는 않는다.
당분야에 잘 공지된 바와 같이 고체 상 합성의 일반 공정에서 매우 효과적인 것으로 알려진 용매 NMP는 BTC 중개된 결합에 대해 적절한 시약이 아니라는 결론을 얻었다.
NMP에서 빌딩 유닛-펩티드-수지에 효과적으로 BTC 중개된 결합을 하는 동안에 Fmoc AA의 라셈화반응을 설명하기 위해, 우리는 과량의 NMP이 BTC와 반응하여, 포스진과 CO2가 공급된 Vilsmayer형 중간생성물 2인 화합물(1)을 얻는 기작(Scheme 2)을 제시한다. 선택적으로 순수한 Fmoc-AA를 클로로이미늄 이온(2)에 첨가하면, 염소가 떨어져 나가고, 활성 에스테르 3를 얻고, 이는 펩티드 수지에 결합된다. 한편, 염기 촉매하에서 N-알콕시카르보닐 보호된 아미노 활성 에스테르(3)는 라셈체인 옥사졸론(4)으로 변형시키는 것으로 알려져 있다. 표 2에서 볼 수 있는 것과 같이 공간적으로 방해를 받는 극성 아미노산으로 실험하면, 보호된 측쇄를 가지는 경우에 만족스러운 결과를 얻지 못한다.
이들 아미노산과 다른 극성 및 방향족 Fmoc-AA's을 좀더 공간적으로 방해를 받는 빌딩 유닛-펩티드-수지에 결합시키는 것이 안되는 사실과 NMP에서 Ala-빌딩 유닛-펩티드-수지를 이용할 경우에도 Fmoc-Asn(Trt) 및 Fmoc-His(Trt)로 반응을 얻을 수 없는 사실로 이 반응에 비활성인 용매로 바꾸어야 한다는 것이다. 또한, 1시간동안 50℃에서 THF상에서 BTC를 이용하여 Fmoc-Val, Fmoc-Ile를 Nα-(ω-카르보알릴옥시프로필)-Ala(AlaC3로 나타냄)와 Nα-(ω-카르보아릴옥시프로필)-Leu(LeuC3로 나타냄)-펩티드-수지에 이중 결합시키면, 100% 원하는 펩티드로 전환되고, 라셈화 반응이 감지되지 않았다. 이 결과는 모든 프로테인에서 만들어진 Fmoc-AA's(Gly 제외)를 매우 다양한 빌딩 유닛-펩티드-수지 및 N-Me-Ala 및 N-Me-Phe-펩티드-수지에 결합하는 것을 포함하는 광역의 합성을 하도록 자극하였는데, 이때 펩티드의 크기 및 서열은 상당히 다양하다. 그 결과를 표 3 및 표 4에 나타내었다.
생성물 양 데이터
17,18,19,20,22,31,37,44,45,46,57의 경우에, 데이터는 고리 펩티드에 상응한다.
42,51,52,56의 경우에, 데이타는 Allyl/Alloc 보호된 펩티드에 상응한다.
22,41,48,51,52의 경우에, 선형 펩티드에 상응한다.
43,47의 경우에, Ac-N 3가-펩티드에 상응한다.
펩티드 서열
HPLC 분석 방법
X소수성 펩티드의 경우에 일반 과정 G에 따라 분석함.
Y친수성 펩티드의 경우에 일반 과정 G에 따라 분석함.
표 3에서 볼 수 있는 것과 같이, 대부분의 결합 전환율은 유입되는 Fmoc-AA, 빌딩 유닛의 구조, 펩티드의 서열 및 크기와 무관하게 상당히 정량적이다. 다음의 설명에서 ()안의 굵은 글자는 표 3에서 볼 수 있는 것과 같이 실시예 번호를 나타낸다.
3개 펩티드(26,36,53)는 70% 전환율을 나타낸다. 이와 같은 결합은 적합하지 않다고 볼 수 있다.
측쇄 보호기의 불안정성으로 인한 문제가 있는 미리 형성된 산 염화물 방법과는 반대로, 본 발명의 방법을 이용하면 다음의 Fmoc-AAs 결합이 실제 환전하게 전환된다;Arg(Pmc)(23),Asp(t-Bu)(24),Cys(Trt)(25),Lys(Boc)(34,35),Ser(t-Bu)(50),Thr(t-Bu)(51,52),Trp(Boc)(54),Tyr(t-Bu)(56,57). 측쇄 보호기는 산에 의해 쉽게 제거되기 때문에, Boc에 의해 Fmoc-Lys(Boc)(34, 39) 결합동안에 Keiser 테스트를 이용하여 이들의 안정성을 모니터할 수 있다. 이와 같은 결합동안에, Keiser 테스트는 음성으로 나타나고, 원하는 기본골격이 고리화된 펩티드는 정제안된 상태에서는 부산물없이 우수한 수득율로 얻을 수 있다. 이와 같은 결과로부터, 상기에서 설명하는 조건하에서 결합은 Fmoc 화학물질을 이용한 고형상 합성에 통상 이용한 감응성 측쇄 보호기를 제거하지 않는다는 결론을 얻을 수 있다.
대부분의 Fmoc-AA 염화물은 다양한 용매에서 염기로 콜리딘의 유무에 관계없이 빌딩 유닛-펩티드-수지에 결합하는 동안에 라셈체화되지 않는다는 것을 보여주었다. 반응에 비활성인 용매에서 BTC에 의해 중개되는 결합 동안에 라셈체화되는 정도의 평가는 다음 결과에 기초한다; (a) 라셈체화반응이 일어날 때 표 1에서 볼 수 있는 것과 같이, 동일한 양을 가지는 두 개 피크가 HPLC에 나타났다. 표 3에서 볼 수 있는 모든 펩티드(수득율이 낮은 펩티드(21,23,26,28,33,36,53,58,59)포함)에서, 주요 피크만이 원하는 물질을 제공한다. (b)PheN2 빌딩 유닛에 Fmoc-Lys(Boc) 및 Fmoc-D-Lys(Boc)가 결합, 펩티드의 어셈블리, Allyl/Alloc 보호기제거, 고리화반응, 수지로부터 제거등에 의해 정량적으로 전환된 두 개의 거울상이성체 기본골격 고리화 펩티드(37,38)를 얻는다. 각 개별 정제안된 거울상이성체의 HPLC 프로파일에서는 동일한 양의 한 개 피크 및 서로 다른 보유 시간을 나타낸다. 또한, 두 개의 거울상이성질체 37 및 38을 Capillary Electrophoresis에 공동 주입하면 두 개 별개 피크를 얻을 수 있다. 빌딩 유닛-펩티드-수지상에 Fmoc-AAs 염화물을 결합시키는 동안에 라셈화반응이 부족한 것은 느린 옥사졸론 형성과 비교할 때, 산 염화물이 친핵성 아실 치환체에 대해 높은 반응성을 가지기 때문이다. 반응에 비활성인 용매에서 BTC에 의한 결합은in-situ산 염화물 형성을 통하여 진행되는데, 라셈화반응없이 이와같은 결합이 진행된다는 것이 놀라운 것은 아니다.
어려운 결합을 촉진시키기 위해 BTC 한계에 대해 조사하기 위해, 우리는 펩티드(44~46)을 합성하였는데, 다양한 Phe 빌딩 유닛이 N-Me-Ala-펩티드 수지에 결합되었다. 또한, 펩티드 43에서, Fmoc-Phe는 N-Me-Phe-N-Me-Phe-수지에 결합되고, 펩티드 48에서는 Fmoc-N-Me-Phe가 N-Me-Phe-N-Me-Phe-수지에 결합된다. 이들 각 모두의 결합은 정량적인 전환과 함께 짧은 시간내에 진행되어, BTC가 SPPS에서 어려운 결합을 촉진시킬 수 있는 시약이라는 결론을 얻을 수 있다.
표 3에 나타낸 대부분의 펩티드에서, 결합은 이중-펩티드 빌딩 유닛-수지상에서 실행되었다. 펩티드 사슬을 따라 다른 위치에 부착된 빌딩 유닛에 BTC의 결합 효과 능력을 테스트하기 위해, 위치 4-6, 11(펩티드 56,41,22,51,52)에서 결합을 실행하였다.
표 4에서는 BTC 결합에 의해 합성된 펩티드를 전반적으로 나타내고, 이는 펩티드 사슬을 따라 결합 위치와 유입되는 빌딩 유닛 형을 나타낸 것이다. 정상적인 조건하에서 위치 4~6에서는 결합이 진행되고, 위치11에의 결합에는 정량적인 전환을 얻기 위해 6개 고리가 필요하다.
표4에 각주
표에 있는 숫자는 HPLC에 기초하고 MS에 의해 확인된 80%>전환율로 AA가 결합되는 빌딩 유닛 위치(C-말단에서부터)를 나타낸다.
*1시간 동안 50℃에서 비활성용매(0.14M)에서 5eq AA, 1.5eq BTC(0.33eq perAA)을 이용하여 이중 결합.
**에미머반응과 함께 20%만 전환
nr=반응이 없음
()=결합 과정 횟수
# = 5-10%
***=50%
a는 BTSA로 미리 활성화시킴.
b는 BTSA로 빌딩 유닛을 미리 활성화시키고, 4-7회 결합 횟수, AgCN를 첨가하였음.
Fmoc-His(Trt) 및 FmocAsn(Trt)의 결합에 BTC를 이용한 결과 실패하였다. Fmoc-His(Trt)의 결합은 총 라셈체중에서 20%만 전환되었고, Fmoc-Asn(Trt)을 이용한 경우에는 결합이 일어나지 않았다.
실시예 62; 이중 고리 펩티드 PTR 32045의 합성
교반기가 부착되어 있고, 신터드 유리 바닥으로 된 반응기에서 2g Rink Amide(MBHA resin, NOVA, 0.46 mmol/gram)를 NMP에서 하룻밤동안 팽창시킨다. Fmoc는 25% 피페리딘/NMP(16㎖)을 이용하여 15분간 2회 씻어내오 수지로부터 제거한다. 각 2분씩 7회 NMP(10-15㎖)을 이용하여 조심하여 씻어낸 후, Phe-N3결합은 Fmoc-Phe-N3-OH(3eq, 2.76 mmol. 1.46 gram)을 이용하는데, 이는 NMP(16㎖)에 용해시키고, PybBroP(2.76 mmol, 1.28 gram) 및 DIEA(6eq, 5.52mmol, 0.95㎖)으로 4분간 실온에서 활성화시킨 것으로써, 실온에서 결합을 위해 반응기로 옮긴다. 결합후에, 펩티드-수지는 각 2분간 NMP(10-15㎖)으로 7회 세척한다. 반응이 완료되었는지는 Kaiser 테스트를 이용하여 모니터한다. Fmoc 제거 및 세척은 상기에서 설명하는 것과 같이 실시하고, 이어서 각 2분간 3회 THF(10-15㎖)로 씻어낸 다음, 1시간동안 50℃에서 Fmoc-Cys(Acm)-OH(5 eq, 4.6mmol, 1.9 gram)를 빌딩 유닛-펩티드-수지에 결합시키는데, 비스-(트리클로로메틸)카르보네이트(1.65eq, 1.518 mmol, 0.45gram), 콜리딘(14eq, 12.88mmol, 1.7㎖)/THF(30-35㎖, 0.14M 혼합물을 제공)을 이용한다. 이와 같은 결합 과정은 반복한다. 각 결합 과정에서 Thr, Lys. (D)Trp, Phy, Cys, PheC3의 어셈블리는 결합 과정에서(정량적인 Kaiser 테스트를 이용) Fmoc-Thr(tBu)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-(D)Trp(Boc)-OH,Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Cys(Acm)-OH, Fmoc-Phe3-OH를 이용하여 얻을 수 있는데, 각 결합 과정에서는 아미노산이 NMP에 용해되고, 이는 PyBroP 및 DIEA으로 활성화시키고, 결합 후에는 펩티드-수지를 세척하여, Fmoc를 제거하고, 제 1 결합에서 설명한 것과 같이 NMP를 이용하여 과도하게 세척한다. 어셈블리 마지막 단계에서, 펩티드-수지는 다음과 같은 조건하에서 ally/alloc 보호기 제거하는데; 펩티드 수지는 각 2분간 3회 DCM(10-15㎖)으로 세척하고, DCM-AcOH-NMM혼합물(각 92.5%, 5%, 2.5%)을 이용하여 각 2분간 3회 세척한다. 3gram Pd(P(Ph)3)4은 상기 혼합물(80㎖)에 용해시키고, 얻어지는 노란색 현탁액을 반응기로 옮기고, 혼합물과 펩티드-수지에서 기체를 제거하고(반응기의 신터드 유리 바닥을 통하여 아르곤을 주입), 어두운 상태에서 2시간 동안 활발하게 교반시킨다. 펩티드-수지는 DCM, CHCl3, NMP(각 2분간 총 15회)을이용하여 세척한다. 실온에서 1시간동안 PyBOP(3eq, 2.76mmol, 1.436gram), DIEA(6eq, 5,52mmol, 0.95㎖)/NMP(20㎖)을 이용하여 고리화반응을 하고, 그 다음 하룻밤동안 동일한 조건하에서 제2고리화 반응을 실시한다. 펩티드 수지는 NMP로 세척한 후에, DMF-물(15㎖,4:1)로 각 2분간 3회 세척하고, I2용액(5 eq, 4.6mmol, 1.16gram)/DMF-물(23㎖, 4:1)을 펩티드-수지에 첨가하고, 이는 40분간 실온에 두어, Cys-Cys 고리화반응을 제공한다. 펩티드 수지를 여과시키고, DMF/물, DMF,NMP,DCM,CHCl3및 2% 아스코르브신/DMF로 세척한다. 최종적으로 Fmoc를 제거하고, 상기에서 설명한 것과 같이 세척하고, 또한 MeOH로 세척하고, 진공하에서 20분간 펩티드 수지를 건조시켜, 95% TFA, 2.5% TIS, 2.5% 물(총30㎖ 칵테일 혼합물)을 이용하여 30분간 0℃에서 아르곤하에 그리고 1.5시간 동안 실온하에서 수지로부터 펩티드를 떼어낸다. 용액은 추출 필터를 이용하여 폴리프로필렌 튜브로 여과시키고, 수지는 5-6㎖ 칵테일 및 4-5㎖ TFA로 세척하고, 용액에 N2기류를 제공하여, 오일성 잔류물을 제공하고, 이는 차가운 Et2O로 고형화시킨다. Et2O 층의 원심분리 및 제거 그리고, 추가 차가운 Et2O 첨가 및 원심분리 및 제거, 진공하에서 흰색 고체를 하룻밤동안 건조시키면, 다음의 구조를 가지는 PTR 3205(0.388 gram)를 얻는다.
실시예 63: 삼중고리 펩티드 PTR 3227의 합성
PTR 3227는 다음의 구조를 가지는 삼중고리로 된 기본골격의 펩티드이다.
이 화합물에서, 한 개 고리는 빌딩 유닛(Gly-C2)이 Lys의 측쇄에 연결되어 있고, 두 번째 고리는 두 개 빌딩 유닛(Phe-N2, Phe-C2)이 연결되어 있고, 세 번째는 두 개 Cys사이에 이황화결합이 된 것이다. 이 유사체의 합성 과정을 설명한다.
교반기가 부착되어 있고, 신터드 유리 바닥으로 된 반응기에서 1g Rink Amide(MBHA resin, NOVA, 0.46 mmol/gram)를 NMP에서 하룻밤동안 팽창시킨다. Fmoc는 25% 피페리딘/NMP(16㎖)을 이용하여 15분간 2회 씻어내오 수지로부터 제거한다. 각 2분씩 7회 NMP(10-15㎖)을 이용하여 조심하여 씻어낸 후, Lys(Dde) 결합은 Fmoc-Lys(Dde)-OH(3eq, 1.38mmol. 0.735gram)을 이용하는데, 이는 NMP(8㎖)에 용해시키고, PybBroP(1.38mmol, 0.64gram) 및 DIEA(6eq, 2.76mmol, 0.47㎖)으로 4분간 실온에서 활성화시킨 것으로써, 1시간동안 실온에서 결합을 위해 반응기로 옮긴다. 결합 후에, 펩티드-수지는 각 2분간 NMP(10-15㎖)으로 7회 세척한다. 반응이 완료되었는지는 Kaiser 테스트를 이용하여 모니터한다. Fmoc 제거 및 세척은 상기에서 설명하는 것과 같이 Fmoc-PheN2-OH(3eq. 1.38mmol, 0.71gram)을 이용하여 실시하고, 결합 Fmco 제거 및 NMP 제거후에, 펩티드 수지는 각 2분간 3회 THF(10-15㎖)로 씻어낸 다음, 1시간동안 50℃에서 Fmoc-Cys(Acm)-OH(5 eq, 2.3mmol, 0.95gram)를 BU-펩티드-수지에 결합시키는데, BTC(1.65eq, 0.759mmol, 0.225gram), 콜리딘(14eq, 6.44mmol, 0.85㎖)/THF(30-35㎖, 0.14M 혼합물을 제공)을 이용한다. 이와 같은 결합 과정은 반복한다. 각 결합 과정에서 Thr, Lys. (D)Trp, Phy, Cys, PheC3의 어셈블리는 결합 과정에서(정량적인 Kaiser 테스트를 이용) Fmoc-Thr(tBu)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-(D)Trp(Boc)-OH,Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Cys(Acm)-OH, Fmoc-PheC2-OH를 이용하여 얻을 수 있는데, 각 결합 과정에서는 아미노산이 NMP에 용해되고, 이는 PyBroP 및 DIEA으로 활성화시키고, 결합 후에는 펩티드-수지를 세척하여, Fmoc를 제거하고, 제 1 결합에서 설명한 것과 같이 NMP를 이용하여 과도하게 세척한다. PheC2 어셈블리후에, 펩티드-수지는 다음과 같은 조건하에서 ally/alloc 보호기 제거하는데; 펩티드 수지는 각 2분간 3회 DCM(10-15㎖)으로 세척하고, DCM-AcOH-NMM혼합물(각 92.5%, 5%, 2.5%)을 이용하여 각 2분간 3회 세척한다. 1.5gram Pd(P(Ph)3)4은 상기 혼합물(40㎖)에 용해시키고, 얻어지는 노란색 현탁액을 반응기로 옮기고, 혼합물과 펩티드-수지에서 기체를 제거하고(반응기의 신터드 유리 바닥을 통하여 아르곤을 주입), 어두운 상태에서 2시간 동안 활발하게 교반시킨다. 펩티드-수지는 DCM, CHCl3, NMP(각 2분간 총 15회)을 이용하여 세척한다. 실온에서 1시간동안 PyBOP(3eq, 1.38mmol, 0.72gram), DIEA(6eq, 2.76mmol, 0.475㎖)/NMP(10㎖)을 이용하여 고리화반응을 하고, 그 다음 하룻밤동안 동일한 조건하에서 제2고리화 반응을 실시한다. 상기에서 설명하는 것과 같이, Fmoc 보호기 제거를 한 후에, NMP로 세척하고, 그 다음 Fmoc-GlyC2-OH는 5eq BU (2.3mmol, 0.94gram), BTC(1.65eq, 0.759mmol, 0.225gram), 콜리딘(14eq, 6.44mmol, 0.85㎖)/THF(16㎖, 0.14M 혼합물이 되게 함)을 이용하여 1시간동안 50℃에서 고리 펩티드에 결합시킨다음 이와 같은 어려운 결합 과정을 1회 더 실시한다. 데카펩티드-수지에 (D)-Phe를 결합시킬 때에는 결합시약으로 Boc-(D)-Phe-OH(4eq, 1.84mmol,0.4888gram), PyBrop(1.84mmol, 0.857gram)을 이용하고, 염기로 DIEA(8eq, 3.68mmol, 0.63ml)/(DMF/DCM)(1:1.8㎖)를 이용하여 1.5시간동안 실시한다. 실온에서 2시간동안 동일한 조건하에서 제2결합을 실시한다. 세척후에, Lys의 Nε측쇄로부터 Dde를 선택적으로 제거하기 위해, 2% 하이드라진/DMF(25㎖ x 3 min x 3)으로 실온에서 실시한다. DMF 및 NMP로 세척한후에, 펩티드 수지는 상기에서 설명한 것과 같이, 0.75g Pd(P(Ph)3)4를 이용하여, 아릴을 제거한다. 펩티드 수지는 CHCl3, DCM, NMP로 세척한 후에, 상기에서 설명한 것과 같이, PyBOP로 고리화반응을 시킨다(Kaiser 테스트는 네가티브로 나타남). DMF-물(12.5㎖, 4:1)로 각 2분간 3회 세척한다. I2용액(5 eq, 2.3mmol, 0.583gram)/DMF-물(12.5, 4:1)을 펩티드-수지에 첨가하고, 이는 40분간 실온에 두어, Cys-Cys 고리화반응을 제공한다. 펩티드 수지를 여과시키고, DMF/물, DMF,NMP,DCM,CHCl3및 2% 아스코르브신/DMF로세척한다. DCM으로 세척한 후에, MeOH로 세척하고, 진공하에서 20분간 펩티드 수지를 건조시켜, 95% TFA, 2.5% TIS, 2.5% 물(총30㎖ 칵테일 혼합물)을 이용하여 30분간 0℃에서 아르곤하에 그리고 1.5시간 동안 실온하에서 수지로부터 펩티드를 떼어낸다. 용액은 추출 필터를 이용하여 폴리프로필렌 튜브로 여과시키고, 수지는 5-6㎖ 칵테일 및 4-5㎖ TFA로 세척하고, 용액에 N2기류를 제공하여, 오일성 잔류물을 제공하고, 이는 차가운 Et2O로 고형화시킨다. Et2O 층의 원심분리 및 제거 그리고, 추가 차가운 Et2O 첨가 및 원심분리 및 제거, 진공하에서 흰색 고체를 하룻밤동안 건조시키면, 다음의 구조를 가지는 PTR-3227(72㎎)를 얻는다. 정제안된 펩티드의 HPLC 크로마토그래피는 도 5에 나타내었다.
실시예 64; PTR3229를 만들기 위해 기본골격이 고리로된 펩티드에 갈락토즈 유도체를 결합시킨다.
기본골격이 고리로된 펩티드는 Fmc를 제거하고, NMP 및 THF로 세척한다. 0.33eq BTC(0.379 mmol, 0.112gram)를 결합시약으로 그리고, 14eq 콜리딘(3.22mmol, 0.425㎖)/THF(15㎖)를 염기로 이용하여 실온에서 1,2:3,4-Di-O-이소프로필리덴 D-갈락토피라노즈(5eq, 1.15mmol, 0.3gram)으로 결합 과정을 1시간동안 실행한다. DCM, MeOH로 세척한 후에, TFA(95%), TIS(2.5%), 물(2.5%)(총 15㎖칵테일 혼합물)을 이용하여, 1.5시간동안 실온에서 수지로부터 펩티드를 떼어낸다. 작업 후에, 다음의 서열을 가지는 펩티드를 얻을 수 있다;
Galactose-Dab-Phe-Trp-(D)Trp-Lys-Thr-Phe-Gly(C3)-NH2
이 펩티드는 GlyC3 빌딩 유닛이 Dab 잔기와 연결된 것으로 구성된다. 질량 스펙트럼 분석을 도 6에 나타내었다.
실시예 65; BTC를 이용한 요소 결합을 형성
A. Ile(BTC에 의해 형성된 이소시아네이트 유도체)를 Lys-펩티드 수지에 결합시켜, 요소 결합을 만들어, 다음의 구조를 가지는 펩티드 유사체 PTR 3237를 얻는다;
이 펩티드의 질량 스펙트럼을 도 7에 나타내었다.
B. 다음과 같이 디아민을 이용하여 서열에 요소 결합을 만든다. 5eq 모노 Fmoc-디아민 염화수소/CH2Cl2(0.15M), 1eq DIEA(염화수소를 중화시키기 위해 이용)를 첨가한다. 1분 뒤에, 1.65eq BTC를 첨가하고, 현탁액은 2분간 교반시킨 다음, 14eq DIEA를 첨가한다. 1분 뒤에, 생성된 용액을 펩티드 수지에 첨가하고, 혼합물은 실온에서 1분간 교반시키고, CH2Cl2및 NMP으로 세척한다. 생성된 기본 골격이 고리를 이루고 있는 펩티드 유사체(PTR 3241라고 명함)는 다음의 구조를 가진다;
펩티드의 HPLC 크로마토그래피 및 질량 스펙트럼은 도 8에 나타내었다.
실시예 66; BTC를 이용한 다중 병행 합성
결합시약으로 BTC를 이용하여 MPS 포맷에서 약 500개 별개 펩티드를 합성하였다. 표 5에는 24개 펩티드의 합성 결과 예를 나타낸 것이다.
표 5의 각주
어려운 결합 공정; 자동 펩티드 합성기의 외측에 있는 AA를 미리 호라성화시킴(Advanced ChemTech사의 Labtech 4로 ACT396).
5eq AA/150㎕ 디옥산 + 1.65eq BTC/150㎕ 디클로로프로판, 혼합, 14분 후에, 14eq 콜리딘/디클로로프로판을 첨가함.
미리 활성화된 아미노산을 수작업으로 플레이트로 옮김.
60℃에서 1시간 동안 3회 반응
MPS 펩티드(표 5에 있는 20번)의 HPLC 크로마토그래피 및 질량 스펙트럼을 도 9에 나타내었다.
실시예 67; BTC를 이용하여 사이클로스포린 유사체의 합성
BTC 시약을 이용하여 다음의 서열을 가지는 사이클로스포린 합성에서 어려운 결합을 만든다;
Ala-NMeLeu-NMeLeu-NMeLeu-Abu-Sar-NMeLeu-Val-NMeLeu-Ala-NH2
이와 같은 펩티드 유사체는 Raman et al.J. Org. Chem. 63:5734, 1998에서 설명하는 사이클로스포린 유사체의 선형 유도체이다. 이 펩티드의 HPLC 및 질량 스펙트럼을 도 10에 나타내었다.

Claims (18)

  1. 펩티드 사슬에 아미노산 잔기를 결합하는 방법에 있어서,
    (i) 자유 카르복실산기 및 차단된 아미노기, 선택적으로 추가 차단된 기능 측쇄를 가지는 아미노산 잔기를 제공하고;
    (ii) 이 반응에 비활성인 용해상에서 차단된 아미노산과 비스-(트리클로로메틸)카르보네이트와 반응시켜, 아미노산 염화물을 얻고;
    (iii) 유기 염기를 첨가하여, 자유 산을 중화시키고;
    (iv) 아미노산 염화물을 포함하는 생성된 현탁액을 차단된 카르복실 말단, 자유 아미노산 말단, 적어도 한 개의 자유 아미노산 말단을 가지는 펩티드 수지에서 선택한 화합물에 첨가시키고;
    (v) 펩티드에 아미노산 염화물을 결합시킬 수 있는 반응 조건을 제공하여, 한 개 아미노산 잔기에 의해 펩티드를 연장시키는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 결합 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 펩티드 사슬은 N-말단 위치에서 공간적으로 방해를 받는 잔기로 구성된 것을 특징으로 하는 결합 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 펩티드에 아미노산 염화물을 결합하는 동안에 반응 혼합물을 가열시키는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 결합 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 아미노산 염화물 및 펩티드로 된 반응 혼합물에 촉매를 첨가하는 단계가 추가로 포함된 것을 특징으로 하는 결합 방법.
  5. 제 2 항에 있어서, 펩티드 사슬의 N 말단에 있는 공간적으로 방해를 받는 잔기는 공간적으로 방해를 받는 제2차 아민으로 구성된 것을 특징으로 하는 결합 방법.
  6. 제 2 항에 있어서, 펩티드 사슬의 N 말단에 있는 공간적으로 방해를 받는 잔기는 N-알파(ω-기능을 가지는)알킬 아미노산 잔기로 구성된 것을 특징으로 하는 결합 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 비활성 용매는 디옥산, 테트라하이드로퓨란, 디글림, 1,3-디클로로프로판에서 선택되는 것을 특징으로 하는 결합 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 펩티드 결합에는 다중 병행 펩티드 합성이 포함되는 것을 특징으로 하는 결합 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 결합 시약을 아미노산 잔기에 대해 적어도 ⅓당량으로 제공하는 것을 특징으로 하는 결합 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 염기는 콜리딘, 디이소프로필에틸아민, 피리딘, 디메틸 피리딘, 퀴날딘에서 선택되는 것을 특징으로 하는 결합 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 아미노산의 아미노기는 플로레닐메톡시카르보닐, 3가 부톡시카르보닐에서 선택된 차단기에 의해 차단된 것을 특징으로 하는 결합 방법.
  12. 고형 서포트상에 아미노산 잔기를 결합시키는 방법에 있어서,
    (i) 자유 카르복실산기 및 차단된 아미노기, 선택적으로 추가 차단된 기능 측쇄를 가지는 아미노산 잔기를 제공하고;
    (ii) 이 반응에 비활성인 용해상에서 차단된 아미노산과 비스-(트리클로로메틸)카르보네이트와 반응시켜, 아미노산 염화물을 얻고;
    (iii) 유기 염기를 첨가하여, 자유 산을 중화시키고;
    (iv) 아미노산 염화물을 포함하는 생성된 현탁액을 적어도 한 개의 자유 아미노 말단을 가지는 수지, 염화물이 결합할 수 있는 기능기를 가지는 고형 서포트에서 선택된 화합물에 첨가시키고;
    (v) 고형 서포트에 아미노산 염화물을 결합시킬 수 있는 반응 조건을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. in situ펩티드 합성동안에 아미노산 염화물을 합성하는데 결합 시약으로써비스-(트리클로로메틸)카르보네이트를 이용하는 것을 특징으로 하는 비스-(트리클로로메틸)카르보네이트.
  14. in situ펩티드 합성동안에 아미노산 염화물을 합성하는데 결합 시약으로써 포스진을 이용하는 것을 특징으로 하는 포스진.
  15. in situ펩티드 합성동안에 아미노산 염화물을 합성하는데 결합 시약으로써 디포스진을 이용하는 것을 특징으로 하는 디포스진.
  16. 펩티드와 탄수화물사이에 아미드 결합을 만드는데 있어서, 결합 시약으로 비스-(트리클로로메틸)카르보네이트를 이용하는 것을 특징으로 하는 비스-(트리클로로메틸)카르보네이트.
  17. 제 1 항에 따른 공정에 의해 합성된 것을 특징으로 하는 펩티드.
  18. 제 17 항에 있어서, 합성된 펩티드는 다음에서 선택된 것을 특징으로 하는 펩티드.
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