CN109912709A

CN109912709A - 一种酸敏感离子通道抑制剂的制备方法

Info

Publication number: CN109912709A
Application number: CN201910300618.2A
Authority: CN
Inventors: 陈超; 洪梅
Original assignee: Peking University Shenzhen Graduate School
Current assignee: Peking University Shenzhen Graduate School
Priority date: 2019-04-15
Filing date: 2019-04-15
Publication date: 2019-06-21
Anticipated expiration: 2039-04-15
Also published as: CN109912709B

Abstract

本发明公开了一种酸敏感离子通道抑制剂的制备方法，提供了一种新型固相合成法制备酸敏感离子通道抑制剂APETX2，其中，选择性在APETx2序列中特定的氨基酸残基处切断，以全保护多肽片段的形式进行偶联构建APETx2线性肽，该方法大大提高了合成效率、缩短了合成周期，同时，得到的APETx2纯品纯度高，其活性与野生型表现一致。

Description

一种酸敏感离子通道抑制剂的制备方法

技术领域

本发明属于生物制剂技术领域，具体地说，涉及一种酸敏感离子通道抑制剂及其制备方法。

背景技术

酸敏感的离子通道(Acid-sensing ion channels，ASICs)是一类由质子门控的离子通道，属于上皮通道蜕变蛋白离子通道超家族，在中枢与外周神经系统大量表达，主要由酸传感器介导痛觉反应，在感受体液pH值和调控痛觉、酸味觉等多项生理机能方面有着重要作用，炎症可诱导ASICs转录并产生转录后调节，从而影响神经元兴奋性，参与痛觉感受的敏感化过程。

选择性剪接5个编码(ASIC)基因可获得7种ASIC亚型通道(ASIC1a、1b,ASIC2a、2b,ASIC3-ASIC5)而分别组成两种同源三聚体和异源三聚体而发挥不同的功能。酸敏感离子通道中，ASIC3亚型通道对pH值的变化最为敏感(pH 0.5＝6.7)，在免疫疼痛、关节炎、手术后疼痛、偏头痛、心疼痛等生理调节中扮演重要的角色，是镇痛药物治疗的重要作用靶点。

从海葵毒素(Anthopleura elegantissima)中分离的APETx2，含42个氨基酸残基及三对二硫键组成的大环毒素，是当前报道的唯一高活性的抑制ASIC3大环多肽毒素，对小鼠同源三聚体和异源三聚体(r)ASIC3通道的IC50值分别为63nM和0.1-2μM。APETx2表现出多靶标的镇痛效应，该序列结构经改造和优化后具有开发成低副作用、高镇痛活性药物的潜力。因此高效构建APET系列大环多肽毒素具有重要的应用前景。

APETx2分子结构复杂，含42个氨基酸残基和三个大环，合成难度大，当前仅两篇文献报道APETx2的合成，方法基本一样，都以片段(Gly1-Ser19)-α-thioester与(Cys20-Asp42)进行连接，该方法为APETx2的获得提供了一条可行的途径。但目前仅有几篇文献报道采用定点突变的生物表达法获得APET类似物，且局限于少数的天然氨基酸之间的替换。由于表达获得的线性肽还需要在氧化还原的条件下折叠成环，而生物表达在该条件下难以进行，导致获得类似物数量与种类有限，且难以引入非天然氨基酸进行结构改造。

发明内容

为此，本发明正是要解决上述技术问题，从而提出一种酸敏感离子通道抑制剂的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：

本发明提供一种酸敏感离子通道抑制剂的制备方法，其包括如下步骤：

S1、提供氨基酸序列如下的APETx2线性肽：

H-Gly¹-Thr-Ala-Cys-Ser-Cys-Gly-Asn-Ser-Lys-Gly-Ile-Tyr-Trp-Phe-Tyr-Arg-Pro-Ser-Cys-Pro-Thr-Asp-Arg-Gly-Tyr-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Tyr-Phe-Leu-Gly-Thr-Cys-Cys-Thr-Pro-Ala-Asp⁴²-OH；

S2、将所述线性肽中的Gly残基处切断，得到侧链全保护的如式Ⅲ﹑Ⅴ﹑Ⅷ﹑Ⅺ所示的多肽片段；

S3、采用多肽固相合成法制备如式Ⅲ﹑Ⅳ﹑Ⅶ和X所示的多肽树脂片段，其中，如式Ⅳ﹑Ⅶ和X的多肽树脂片段在弱酸性条件下裂解得到带全保护的肽片段Ⅴ﹑Ⅷ和Ⅺ；

S4、将式V、Ⅷ和Ⅺ所示的多肽片段分别按次序偶联于多肽树脂III上，并脱除Fmoc，得到如式XII所示的线型肽树脂；

S5、将线性肽树脂Ⅻ用裂解液处理得到APETx2线性肽XIII；

S6、将线性肽XIII氧化和纯化得到APETx2抑制剂。

作为优选，所述APETx2线性肽含42个氨基酸残基，第42位为羧基结尾，其具有3对二硫键配对，配对位点为：Cys4-Cys37、Cys6-Cys30以及Cys20-Cys38。

作为优选，步骤S3中，制备如式Ⅲ所示的多肽树脂片段时采用Wang树脂或2-CTC树脂，制备如式Ⅳ﹑Ⅶ和X所示多肽树脂片段采用酸敏感树脂。

作为优选，所述步骤S3中，所述如式Ⅳ﹑Ⅶ和X的多肽树脂片段在弱酸性条件下裂解得到带全保护的肽片段Ⅴ﹑Ⅷ和Ⅺ，所述弱酸性条件由含0.1％-10％三氟乙酸的二氯甲烷溶液或四氟乙烯、六氟异丙醇、乙酸及二氯甲烷的混合溶液。

作为优选，所述步骤S4中，所述式V、Ⅷ和Ⅺ所示的多肽片段通过如下至少一种偶联剂分别按次序偶联于多肽树脂III：DIC、HATU、TBTU、HBTU、PyBop、HOBt、Cl-HOBt、DIPEA、NMM。

作为优选，所述步骤S4中，脱除Fmoc的方法为：采用20％哌啶的DMF溶液，所述溶液中含有0.5-10％的HOBt，或采用5％哌啶、1.25％DBU和1％HOBt混合物脱除Fmoc2-4次，每次时间为2-30min。

作为优选，所述步骤S5中所述裂解液为以下组分的一种：

a、体积比为90-95:2-5:2-5:1-3的三氟乙酸、1,2-乙二硫醇、三异丙基硅烷、水混合溶液；

b、体积比为90-95：2-5：2-5：1-3的三氟乙酸、1,2-乙二硫醇、苯甲硫醚、苯甲醚混合溶液；

c、体积比为80-85：2-5：2-5：2-5：2-5的三氟乙酸、1,2-乙二硫醇、水、苯酚、苯甲硫醚混合溶液。

作为优选，所述步骤S6中，氧化采用H₂O、CH₃CN、GSSG和GSH混合物。

作为优选，所述步骤S6中，纯化过程为：采用0.05～0.1％TFA/H₂O、0.5-3％AcOH/H₂O或者纯水作为水相，0.1％TFA/ACN、0.1％TFA/MeOH、ACN或者MeOH作为油相，在10-65％的梯度下洗脱60min。

本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：

本发明所述的酸敏感离子通道抑制剂的制备方法，提供了一种新型固相合成法制备酸敏感离子通道抑制剂APETX2，其中，APETx2线性肽中间的是一个氨基酸可以以全保护多肽片段的形式进行偶联，而不是逐个氨基酸的偶联，大大提高了合成效率、缩短了合成周期，同时，氨基酸偶联反应完全。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中

图1是本发明实施例所述的方法中切割线型肽的位点示意图；

图2是本发明实施例5中H-[1-42]-OH的HPLC图谱；

图3是本发明实施例5中H-[1-42]-OH的质谱图谱；

图4是本发明实施例5中APETX2(3对二硫键成环)的HPLC纯品图谱；

图5是本发明实施例5中APETX2(3对二硫键成环)的质谱图谱。

定义

除非另有指示或定义，否则所有所用术语均具有本领域中的通常含义，该含义将为本领域技术人员所了解，以下为本专利中所用到的缩略语及其具体名称：

本发明所采用的“固相合成”或“多肽固相合成(solid phase peptidesynthesis)”是一种常规多肽合成技术，包括但不限于以下方法：将一个氨基被保护的氨基酸共价连接(键合)在固相载体上；在去保护剂存在下，脱掉氨基的保护基，使第一个氨基酸接到固相载体上；然后氨基被封闭(保护)的第二个氨基酸的羧基活化，羧基被活化的第二个氨基酸再与已接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应(缩合)形成肽键，这样在固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽；重复上述肽键形成反应，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要的肽链长度；最后脱去氨基的保护基，水解肽链和固相载体之间的酯键(切割)，得到粗肽。

本发明中，“去保护剂”或“脱保护剂”可以互换使用，都是指可以将连接在氨基酸上的氨基保护剂去除的化学试剂，所述的氨基保护剂可以使本领域熟知的，例如但不限于：Fmoc，Boc。

本发明中，“缩合剂”、“活化剂”或“缩合活化剂”可以互换使用，都是指使一个氨基酸的氨基和另一个氨基酸的羧基缩合形成肽键的化学试剂，可以使本领域熟知的，例如但不限于：DIC、HATU、TBTU、DIPEA。

本发明中，“切割剂”是指将同树脂键合的多肽和树脂分离的化学试剂，可以使本领域熟知的，例如但不限于，含有TFA的弱酸性溶液、HCl溶液。

本发明中，“APETX2粗品”是指HPLC纯度在40％-65％的APETX2产品。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。

本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶质的重量。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

具体实施方式

本发明提供一种通过固相合成法制备酸敏感离子通道抑制剂(APETX2)的方法，其包括如下步骤：

S1、提供氨基酸序列如下的APETx2线性肽：

H-Gly¹-Thr-Ala-Cys-Ser-Cys-Gly-Asn-Ser-Lys-Gly-Ile-Tyr-Trp-Phe-Tyr-Arg-Pro-Ser-Cys-Pro-Thr-Asp-Arg-Gly-Tyr-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Tyr-Phe-Leu-Gly-Thr-Cys-Cys-Thr-Pro-Ala-Asp⁴²-OH。

所述APETx2线性肽含42个氨基酸残基，第42位为羧基结尾，其具有3对二硫键配对，配对位点为：Cys4-Cys37、Cys6-Cys30以及Cys20-Cys38，第4、6、20、30、37、38位为Cys残基。

S2、将所述线性肽中的Gly残基处切断，得到侧链全保护的如式Ⅲ﹑Ⅴ﹑Ⅷ﹑Ⅺ所示的多肽片段。通过在线型肽分子中Gly¹¹、Gly²⁵、Gly³⁵位点切断的策略(如图1所示),构建侧链全保护的如式Ⅲ﹑Ⅴ﹑Ⅺ所示的多肽片段。

S3、采用多肽固相合成法制备如式Ⅲ﹑Ⅳ﹑Ⅶ和X所示的多肽树脂片段，其中，如式Ⅳ﹑Ⅶ和X的多肽树脂片段在弱酸性条件下裂解得到带全保护的肽片段Ⅴ﹑Ⅷ和Ⅺ。制备如式Ⅲ所示的多肽树脂片段时采用Wang树脂或2-CTC树脂，制备含式Ⅳ﹑Ⅶ和X所示片段的多肽树脂片段采用酸敏感树脂。

具体地，如式Ⅲ所示的多肽树脂片段的合成是通过将0.2-1.0mmol/g的Wangresin与Fmoc-Asp(OtBu)反应，得到Fmoc-Asp(OtBu)Wang resin树脂；利用固相合成的方法依次偶联带有保护基团的氨基酸：Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Thr(^tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Thr(^tBu)-OH然后脱除Fmoc，得到侧链带保护基的肽树脂H-[36-42]-Wang resin(式Ⅲ)。

如式Ⅳ所示的多肽树脂片段的合成是通过将Fmoc-Gly-OH和0.5-1.5mmol/g的CTCresin在DIPEA的作用下缩合，再脱除Fmoc，得到H₂N-Gly-CTC resin；然后用缩合剂依次偶联Fmoc保护的氨基酸Fmoc-Leu-OH﹑Fmoc-Phe-OH﹑Fmoc-Tyr(^tBu)-OH﹑Fmoc-Arg(Pbf)-OH﹑Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ser(^tBu)-OH得到Fmoc-[26-35]-CTC resin(式Ⅳ)。

如式Ⅶ所示的多肽树脂片段的合成是通过将Fmoc-Gly-OH和0.5-1.5mmol/g的CTCresin在DIPEA的作用下缩合，再脱除Fmoc，得到H₂N-Gly-CTC resin；然后用缩合剂依次偶联Fmoc保护的氨基酸Fmoc-Thr(^tBu)-OH﹑Fmoc-Tyr(^tBu)-OH﹑Fmoc-Gly-OH﹑moc-Arg(Pbf)-OH﹑Fmoc-Asp(O^tBu)-OH﹑Fmoc-Thr(^tBu)-OH﹑Fmoc-Pro-OH﹑Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ser(^tBu)-OH﹑Fmoc-Pro-OH﹑Fmoc-Arg(Pbf)-OH﹑Fmoc-Tyr(^tBu)-OH﹑Fmoc-Phe-OH﹑Fmoc-Trp(Boc)-OH﹑Fmoc-Tyr(^tBu)-OH﹑Fmoc-Ile-OH得到Fmoc-[11-25]-CTC resin(式Ⅶ)。

如式X所示的多肽树脂片段的合成是通过将Fmoc-Gly-OH和0.5-1.5mmol/g的CTCresin在DIPEA的作用下缩合，再脱除Fmoc，得到H2N-Gly-CTC resin；然后用缩合剂依次偶联Fmoc保护的氨基酸Fmoc-Lys(Boc)-OH﹑Fmoc-Ser(^tBu)-OH﹑Fmoc-Asn(Trt)-OH﹑Fmoc-Gly-OH﹑Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ser(^tBu)-OH﹑Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Thr(^tBu)-OH和Boc-Gly-OH。

所述如式Ⅳ﹑Ⅶ和X的多肽树脂片段在弱酸性条件下裂解得到带全保护的肽片段Ⅴ﹑Ⅷ和Ⅺ，所述弱酸性条件由含0.1％-10％三氟乙酸(TFA)的二氯甲烷(DCM)溶液或四氟乙烯(TFE)、六氟异丙醇(HFIP)、乙酸(HOAc)及二氯甲烷(DCM)的混合溶液，优选为1％TFA的DCM溶液。

S4、将式V、Ⅷ和Ⅺ所示的多肽片段分别按次序偶联于多肽树脂III上，并脱除Fmoc，得到如式XII所示的线型肽树脂，所述多肽片段通过如下至少一种偶联剂偶联于多肽树脂III：DIC、HATU、TBTU、HBTU、PyBop、HOBt、Cl-HOBt、DIPEA、NMM。优选为DIC/HOBt的偶联剂组合。脱除Fmoc的过程为：采用20％哌啶的DMF溶液，所述溶液中含有0.5-10％的HOBt，或采用5％哌啶、1.25％DBU和1％HOBt混合物脱除Fmoc2-4次，每次时间为2-30min。

S5、将线性肽树脂Ⅻ用裂解液处理得到APETx2线性肽XIII；所述裂解液可选自以下成分的任一祖：

c、体积比为80-85：2-5：2-5：2-5：2-5的三氟乙酸、1,2-乙二硫醇、水、苯酚、苯甲硫醚混合溶液。上述组分a、b、c中还加入相当于多肽当量3-20倍的碘化铵和二甲硫醚。

S6、将线性肽XIII氧化和纯化得到APETx2抑制剂，其中对线型肽XIII的氧化通过H₂O、CH₃CN、GSSG和GSH混合物进行，混合物中，H₂O的含量为330ml，CH₃CN含量为30ml，GSSG含量为200mg，GSH含量为100mg。然后用冰冻乙醚或甲基叔丁基醚沉淀，得到粗肽，粗肽经过高效液相色谱纯化、冻干得到纯化的如式Ⅰ所示的APETX2，纯化过程为：采用0.05～0.1％TFA/H₂O、0.5-3％AcOH/H₂O或者纯水作为水相，0.1％TFA/ACN、0.1％TFA/MeOH、ACN或者MeOH作为油相，在10-65％的梯度下洗脱60min。

本发明中，所述APETX2纯度检测方法为：

流动相：A：H₂O+0.1％TFA；

B：ACN+0.1％TFA；

柱子：XBridge C18 5μm 4.6*250mm，柱温：25℃。

分析参数如表1所示：

表1

Time(min)	A(％)	B(％)
			0	75	25
20	45	55
			25	5	95
30	5	95

各编号代表的序列如表2所示：

表2

实施例1

侧链带保护基的肽树脂H-[36-42]-Wang resin

1、Fmoc-Asp(O^tBu)-Wang resin的合成

(1)Wang resin(西安蓝晓科技新材股份有限公司，替代度为1.0-1.1mmol/g，20g)投入固相反应柱，用DMF洗两次，DMF溶胀30分钟。

(2)将Fmoc-Asp(O^tBu)-OH(9.20g,22.35mmol)、HOBt(3.02g,22.35)用DMF(30mL)、DCM(30mL)溶解，加入DIPCDI(7.52ml,47.99mmol)，于冰浴中预反应10分钟。

(3)将上述反应液加入固相反应釜中，机械搅拌，室温下反应3hrs，茚三酮检测，树脂无色透明。

(4)抽干溶液，树脂用DMF洗三次，DCM洗三次，甲醇收缩三次，真空充分抽干，即得到Fmoc-Asp(O^tBu)-Wang resin，测得替代度为0.35mmol/g。

2：H-[36-42]-Wang resin的合成

(1)Fmoc-Asp(O^tBu)-Wang resin 20.0g(7mmol)投入固相反应釜中，用DMF洗三次，DMF溶胀20分钟。

(2)抽干溶液，以20％的哌啶的DMF溶液，加入2％(g/mL)的HOBt，室温下，去Fmoc两次，时间分别为5min和5min。

(3)抽干溶液，树脂用DMF洗五次，DCM洗涤两次，茚三酮检测呈阳性。

(4)将Fmoc-Ala-OH(6.54g,21mmol)、HOBt(2.84g,21mmol)，用DMF(60mL)溶解，加入DIPCDI(6.61ml,42mmol)，于冰浴中预反应10分钟。

(5)上述反应液加入固相反应柱中，机械搅拌，室温下反应3小时，用茚三酮检测，树脂无色透明。

(6)抽干溶液，树脂用DMF洗三次。

(7)重复上述(2)至(6)的步骤，依次偶联Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Thr(^tBu)-OH﹑Fmoc-Cys(Trt)-OH﹑Fmoc-Cys(Trt)-OH﹑Fmoc-Thr(^tBu)-OH。

然后脱除Fmoc，得到侧链带保护基的肽树脂H-[36-42]-Wang resin。

实施例2

侧链带保护基的肽树脂Fmoc-[11-21]-CTC resin

1、Fmoc-Gly-CTC resin的合成

称取替代度为1.1mmol/g的CTC树脂10g，加到固相反应釜中，用DMF洗涤两次。称取Fmoc-Gly-OH 4.45g(15mmol)，加入120mL的DMF溶解，再加入9.9mL(60mmol)DIPEA，搅拌5min后，加到固相反应釜中，反应2小时。抽干反应液，用DMF洗涤三次。加入20mL甲醇和60mLDMF及5mL的DIPEA的混合液，封闭30min。用DMF洗涤3次，DCM洗涤两次，甲醇洗涤两次，抽干。得到12.3g的Fmoc-Gly-CTC resin，经测量，替代度为0.75mmol/g。

2、Fmoc-[26-35]-CTC resin的合成

(1)20g的Fmoc-Gly-CTC resin投入固相反应釜中，用DMF洗三次，DMF溶胀20分钟。

(2)抽干溶液，以20％的哌啶的DMF溶液，加入2％(g/mL)的HOBt，室温下，去Fmoc两次，时间分别为10min和20min。

(4)将Fmoc-Leu-OH(10.6g,30mmol)、HOBt(4.06g,30mmol)，用DMF(200mL)溶解，加入于DIPCDI(7.6ml)，冰浴中预反应10分钟。

(6)抽干溶液，树脂用DMF洗三次。

(7)重复上述步骤(2)-(6)，依次偶联Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Tyr(^tBu)-OH﹑Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(^tBu)-OH﹑Fmoc-Tyr(^tBu)-OH，得到32g Fmoc-[26-35]-CTC resin。

(8)重复以上的操作步骤，合成Fmoc-[12-25]-CTC和Boc-[1-11]-CTC。

实施例3

把Fmoc-[26-35]-OH从Fmoc-[26-35]-CTC Resin上切割下来：

往30g Fmoc-[26-35]-CTC resin中加入1％的TFA的DCM溶液200mL，搅拌反应2小时。反应结束后，过滤树脂，收集滤液，加入含20％的DIPEA/DCM溶液中和至pH值为7左右。旋转掉DCM，用水和乙醚洗涤沉淀，离心、干燥，得到12g Fmoc-[26-35]-OH。

重复以上操作，得到Fmoc-[12-25]-OH和Boc-[1-11]-OH。

实施例4

将Fmoc-[26-35]-OH偶联至H-[36-42]-Wang resin上：

将12g(2.7mmol)Fmoc-[26-36]-OH、HOBt(1.09g；8.1mmol)、DIC(2.55ml；16.2.mmol)，用DMF(120mL)溶解，冰浴中预反应10分钟。把该反应液加入到装有5.0g H-[36-42]-Wang resin的固相反应釜中，反应12小时。用茚三酮检测，树脂无色透明。抽干溶液，树脂用DMF洗三次，得到Fmoc-[26-42]-Wang resin，再经脱保护得到H-[26-42]-Wangresin。

按照上述步骤，将Fmoc-[12-25]-OH和Boc-[1-11]-OH依次偶联至H-[26-42]-Wangresin上，得到Boc-[1-42]-Wang resin。

实施例5

APETX2树脂的裂解

往装有5g APETX2树脂的固相反应器中加入100mL的裂解液，裂解液的比例为：TFA/EDT/TIS/H2O＝90/5/3/2，先在0-5℃反应20min，然后升至室温再反应1.5h。反应结束，过滤掉树脂，滤液旋转至小于10mL后，加到1L冷冻的乙醚中。离心、用乙醚洗涤2次，真空干燥，得到APETX2粗肽2.0g，然后经过反相柱纯度得到71.2％的纯肽。

测试H-[1-42]-OH的HPLC(高效液相色谱)，测试结果如图2所示，H-[1-42]-OH的质谱图谱如图3所示，APETX2(3对二硫键成环)的HPLC图谱如图4所示，APETX2(3对二硫键成环)的质谱图谱如图5所示。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims

1.一种酸敏感离子通道抑制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、提供氨基酸序列如下的APETx2线性肽：

S5、将线性肽树脂Ⅻ用裂解液处理得到APETx2线性肽XIII；

S6、将线性肽XIII氧化和纯化得到APETx2抑制剂。

2.根据权利要求1所述的酸敏感离子通道抑制剂的制备方法，其特征在于，所述APETx2线性肽含42个氨基酸残基，第42位为羧基结尾，其具有3对二硫键配对，配对位点为：Cys4-Cys37、Cys6-Cys30以及Cys20-Cys38。

3.根据权利要求2所述的酸敏感离子通道抑制剂的制备方法，其特征在于，步骤S3中，制备如式Ⅲ所示的多肽树脂片段时采用Wang树脂或2-CTC树脂，制备如式Ⅳ﹑Ⅶ和X所示多肽树脂片段采用酸敏感树脂。

4.根据权利要求1-3任一项所述的酸敏感离子通道抑制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中，所述如式Ⅳ﹑Ⅶ和X的多肽树脂片段在弱酸性条件下裂解得到带全保护的肽片段Ⅴ﹑Ⅷ和Ⅺ，所述弱酸性条件由含0.1％-10％三氟乙酸的二氯甲烷溶液或四氟乙烯、六氟异丙醇、乙酸及二氯甲烷的混合溶液。

5.根据权利要求4所述的酸敏感离子通道抑制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中，所述式V、Ⅷ和Ⅺ所示的多肽片段通过如下至少一种偶联剂偶联于多肽树脂III：DIC、HATU、TBTU、HBTU、PyBop、HOBt、Cl-HOBt、DIPEA、NMM。

6.根据权利要求5所述的酸敏感离子通道抑制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中，脱除Fmoc的方法为：采用20％哌啶的DMF溶液，所述溶液中含有0.5-10％的HOBt，或采用5％哌啶、1.25％DBU和1％HOBt混合物脱除Fmoc2-4次，每次时间为2-30min。

7.根据权利要求6所述的酸敏感离子通道抑制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S5中所述裂解液为以下组分的一种：

8.根据权利要求7所述的酸敏感离子通道抑制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S6中，氧化采用H₂O、CH₃CN、GSSG和GSH混合物。

9.根据权利要求8所述的酸敏感离子通道抑制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S6中，纯化过程为：采用0.05～0.1％TFA/H₂O、0.5-3％AcOH/H₂O或者纯水作为水相，0.1％TFA/ACN、0.1％TFA/MeOH、ACN或者MeOH作为油相，在10-65％的梯度下洗脱60min。