JPS6078996A - ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はペプチド類に関する。

さらに詳しくは、本発明は生理活性ペプチドに関する研
究の一環としてなされたものであり、ヒト・アセチルコ
リンリセプター−αのアミノ酸配列より、活性を予測・
決定されたペプチド類に関する。

本発明者の一人は、最近、ヒト　アセヂルコリンリセブ
ター−α（ヒト−Ａ　Ｃｘ＋−α）がｔｌｉ／ａ、／ｂ
に示す塩基配列及びアミノ酸配１Ｊ１１に有することを
見出した。すなわち＋　”４気／ピノエイ（Ｔｏｒｐｅ
ｄｏ　ｃａｌｆｏｒｎｉｃａ　）　の発電器部より抽出
されたＡＯＲ−αのｍＲＮＡよりイ４ノら７ＬシたＣＤ
ＮＡを用いてウシＣＤＮＡを得、これを用論てヒ）ＡＣ
ｉＲ−α遺、伝子の配列を決定した。

一方、蛋白の二次構造（α−へリソクス、β−シート、
折れ曲シ構造等）、親水性部位等を考慮して、アミノ酸
配列中の抗原活性部位を予測、決定する方法が知られて
いる（たとえば、Ｕ、Ｓ、Ａ、Ｖｏｌ、７Ｊ’、　３ｆ
２グー３と訝π／２と／）、Ｃｈｏｕ　＆（／？ンと）
。　）。

本発明者らは、この方法を用いて、’ｌ！　’Ｍ　’７
）ペプチド類がＡＯＲと類似の免疫的活性を不すること
を見出し、本発明に到達した。

すなわち、本発明の要旨は、下記（１）〜（Ｖｌｌ）の
いずれかの一つで示されるアミノ酸配タロを有するペプ
チド類にある。

Ｖａｌ−（ｎｕ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ　（
１）Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｓｐ
　（１）Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｇｙｓ−８
ｅｒ　（ｌ１１　）ｃｎｕ−ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−
ｐｒｏ−Ａｓｐ　（ＩＶ）工１ｅ−Ｌｙ８−Ｇｌｕ−６
ｅｒ−Ａｒｇ−Ｇ１７　（Ｖ）Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ
−Ｃ）Ｉｎ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ　（ｖｌ）Ｌｙｓ−８ｅｒ
−ＡＳｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−８ｅｒ　（％１ｌｌ）なお
、アミノ酸残基の上方のν字はＡＣＲ−αのアミノ酸配
列中のア・ミノ酸残基の位置を示す（図／）。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明に係るペプチド類は、上記（１）〜（■）のいず
れかのアミノ酸配列をその全部又は一部として有する。

後者の場合において、このペプチド類は次式％式％ ここで、Ａは上記（１）〜（Ｖｌｌ）のｂずれかのアミ
ノ酸配列の残基を示し、各アミノ酸残基は通Ｘは、低級
アルキル、低級アシル、担体蛋白又はペプチドであ）、
これらの担体蛋白又はペプチドのアミノ酸残基はＬ−又
はＤ一体である。

Ｙはアミン、低級アルキルアミノ、ジ低級アルキルアミ
ノ、低級アルコ守シ、担体蛋白又はペプチドであシ、担
体蛋白又はペプチドのアミノ酸残基はＬ−又はＤ一体で
ある。

Ｘ及びＹは、結合して、ジスルフィド、エーテル又はエ
ステル結合を有する環を形成してｂてもよい。

Ｘ及び／又はＹにおける担体蛋白としては。

ヒト又ハウシアルブミン、コラーゲン、ヘモシアニン、
フィブリノーゲン、ヒトエリスロサイト、合成ポリアミ
ノ酸（たとえばポリグルタミン酸）等が挙げられる。

まだ、Ｘ及び／又はＹにおけるペプチドとし５ては、ヒ
）ＡＣＲ−αの配列中のＡに隣接し７た部分的なアミノ
酸配列と同一のアミノ酸配列を有するものであってもよ
いし、異なったものであってもよい。

Ｘ及びＹはもちろん、Ａで示されるアミノ酸配列を含む
ものであってもよい。

Ｘ及び／又はＹがペプチドである場合、そのアミノ酸残
基数は通常／〜１０＠度好１しくはｊ〜１０程度が選ば
れる。

Ｘ及び／又はＹの付加は、常法によって行なうことがで
きる。

本発明に係るペプチド類の抗原活性を高めるために、Ｘ
及びＹ間を、ジスルフィド、エステル又はエーテル結合
によって結合することができる。ジスルフィド結合は、
Ｘ及びＹ中に含まれるシスティン間で形成することがで
き、エステル結合は、Ｘ及びＹ中に含まれるヒドロキシ
ル基及びカルボキシル基間で形成される。このような環
状化も常法によることができる。

さらに、本発明に係るペプチド類を診断・検査の目的に
用いる場合、又又はＹ中に含まれる７個以上のアミノ酸
が標識化される。たとえば。

Ｘとして、チロシン、ヒドロキシフェニルプロピオニル
基、ヒスチジン又はシスティンを含む場合、１２５工又
は１３＋１によし好適に標識化される。

また、本発明に係るペプチドは、アフイニテる方法を適
宜選定して製造することができる。

すなわち、液相法、同相法のいずれによっても得ること
ができ１反応に関与しないアミン基及びカルボキシル鳥
、さらには側鎖反応性基を保護したアミノ酸が反応に供
され、る。

反応に関与しなりアミノ基の保護基としては、１）−）
ルエンスル系ニル紙ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）基
、ｔ−ブトキシカルボニルＯＣ基）、ンタロイル基等が
挙けられる。

一方．反応に関与しないカルボキシル基の保護基として
は、通常、ブチルエステル ルエステル（ＯＢｚｌ）等が挙げられる。

また、側鎖反応性基の保護基としては，トシル（ＴＯｌ
ｉ＋）基．（グアニジノの保諒）、べ／゛シルＢｚｆ）
基（イミダゾールの保護）、等が挙げられる。

さらに、アミン基と反応させるカルボキシル基に、塩化
物、ヒドラジド、アジド、治機酸との混合無水物、チオ
エステル智に変えて活性化しておくことが望−ましい。

保護基を治するペプチドの保護基脱離も常法によること
ができる。たとえば、ドリブルオロ酢酸等による加水分
解、全編すトリウム等による還元、白金等の触媒を用す
る接触還ノｃ、等である また、得られるペプチドの分離・精製は、抽出、クロマ
トグラフィー等によシ行なうことができる。

このようにして得られたペプチド類は、通常用いられる
各種の無機酸又は治機酸の酸付加塩とすることができる
し、金属化合物等との錯化合物とすることができる。

本発明に係るペプチド類は、ヒトＡＣＲ−αと類似の抗
原活性を有する。したがって、たとえば、ＡＣＨに対す
る自己免疫反応（抗ＡＣＲ有用である。

以下、実施例によりさらに本発明の詳細な説明する。

実施例／ 式（ＩＶ）で示されるペプチドを含むペプチドＨ−Ｔｈ
ｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−８ｅｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ
−Ａｌａ−１１ｅ−Ａｓ、ｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−８ｅｒ
−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−８ｅｒ−
Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−８ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｏ
Ｒの合成： Ｂｏｃ−Ｇｌｙの樹脂へのエステル化は次のように行な
われ、る。

乾燥したＭｅ、、Ｓｏ　（，３￥　ｍｅ　）に溶解した
ＢＯｅ　−Ｇｌｙ　（ｄ、／　２　ｍｍｏｌ、／／９３
ｍｙ　）にクロルメチル化ポリスチレン（ジビニルベン
ゼン２％。

２０θ−Ｚθθメツシュ、０１：θ−＆　、２ｍｅｑｕ
ＩＶ　−Ａ←≠；樹脂）　（！、００　ｆ　）を加え、
さらにＫＯ−ｔ−Ｂｕ　（ｔｉ　／ｍｍｏ１）を加える
。混合物を強く振とうし、と０℃で２時間保持する。

つｖで樹脂をＭｅ２Ｓｏ　＋ｘメタノールびａｎ２ｃ、
ｉ＜２で洗浄する。

合成は、固相法の常法によ）行にわれる。

合成はＢ　Ｏｃ　−Ｇｌｙ　−０ＣＲ２−樹脂ｓ、ｔｚ
ｏｙをペプチド合成装置（”　Ｂｅｃｋｍａｎ　９９θ
Ｂｕ”）の反応器に入れて開始され、順次アミノ酸を合
成さルで３θ分間処理して行ない、引続き０Ｈ２Ｃ１，
２中の７０％トリエタノールアミン（Ｅｔ３Ｎ　）で中
和される。

各アミノ酸（３，／　Ｏｍｍｏｌ　）の連続的カンプリ
ングは、ＣＨ２Ｃｌ２中、２時１ｔ４ｊでジシクロへキ
シルカルボジイミド（Ｄｅｃｉ　）　（３，／　Ｏｍｍ
ｏｌ　）によってなされる。溶媒量は１）ＣＧが乙、コ
ｒｎｌ（０，５Ｍ）である以外は、３６−である。

合成の一サイクルは１次の操作よシなる。

（１）　０Ｈ２０ｆ２で洗浄（／、！分間、３回）（２
）　＋２ｔチＴ　Ｆ’　Ａ　／　ＣＨ２Ｃｌ−２及び／
チ／、コーエタジチオールで脱保睦基（ハタ分間予備洗
浄、ついで３０分間処理） （３）ＣＨ２Ｃｌ、２で洗浄（／、５分間、６回）（４
）／θチＥｔ３Ｎ／ＣＨ２Ｃ認、で中和（／、５分間、
３回） （５）　ＣＨ２”２で洗浄（へよ分間、６回）（６）　
ＢＯＣ−アミノ酸（３，２にｍｅｑｕｉｖ、、　ＣＨ２
０１２中、５分間）処理 （７）　ろ過なしに、Ｄ　ＣＣ（３，ｉｏ　ｍｅｑｕｉ
ｖ、）を添加し、７．２θ分間カップリングさせる。

（３）　ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄（／、Ｓ分間、６回）（９
）それぞれＪ、／　Ｏｍｅｑｕｉｖ、の１３ｏｃ−アミ
ノ酸及びＤＣＣで上記（４）〜（８）の工程をくりかえ
す− 二番目のサイクル以降におりて、くりかえし。

工程における反応は、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾー
ル（ＨＯＢｔ　）　（３，／　０．、ｍｍｏｌ、　’ｌ
　／　９ｑ）の存在下に行なわれる。

一カップリング反応後、ペプチド−樹脂は、ＤＭＦ　（
３Ｊ、ｍ、／　５分間、２回）、メタノール（３乙−１
／！分間、−回）及びＣＨ２Ｃｌ、２（３ざｍｅ、７５
分間、−回）で洗浄される。

ＨＯＢｔ及びＪ３ｏｃ−アミノ酸はＤＭＦ（７０ｙｉ　
）及びａｎ２ｃｒ−２（、ｔ　ｏ　ｍ　）に溶解さオＬ
る。Ｅｌｏｃ−アミノ酸はａｎ、、ｃ、ｐ、２（３ｏ　
ｍｅ　）に溶解される。

たたし、Ｂｏ　ｃ　−Ｌｅｕ　、−Ｈ２ＯはＤｙ＋Ｆ（
１０ｙｉ）及びｃＨ２ＣＪＩ２（２０ｍｌ　）に溶解さ
ハる。

Ｂｏｃ−Ｇｌｎ及びＢｏｃ−Ａｓｎは、ＤＭＦｆ（１０
ｎｆ）及びａｎ２ａｘ２（，２ｏ　ＴｎＩＶ）に溶解さ
れ１等モル量のＨＯＢｔの存在下にカップリングされる
。

反応容器は、空気による酸化を最小限にするだめに１合
成時に蟹素雰囲気下に保持される。

各カップリング反応後に洗浄工程を行な−、未反応の遊
離アミン基の存在をニンヒドリンテストによりモニター
する。

アミノ酸としては、次のような保護アミノ酸が使用され
る。

Ｂｏｃ−Ａｌａ、　Ｂｏｃ−Ｍｅｔ、　Ｂｏｃ−１１ｅ
−％Ｈ２０，Ｂｏｃ−Ｖａｌ、　Ｂｏｃ−Ｔｂｒ（Ｂｚ
ｆ）、　Ｂｏｃ−Ａｓｐ（’０ＢｚＪ）、　Ｂｏｃ−Ｐ
ｈｅ、　Ｂｏｃ−Ｌｅｕ、Ｈ２Ｏ，Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（０
１３ｚｆ）、　Ｂｏｃ−Ｇｌｙ、　Ｂｏｃ−８ｅｒ（Ｂ
ｚｊｊ）、　Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（ＯＢｚ２−Ｏｆ、、）。

Ｂｏｃ−Ａｓｎ、Ｂｏｃ−Ｐｒｏ、Ｂｏｃ−０１＋〕。

全サイクルを終了し、／／、乙グ０１ｉ′の保護ベグチ
ドｌ樹脂を得る。

その一部（ｓ、ｏ、；を乙？）葡アニソール（ｓ、ｏ、
雇）及びメチルエチルサルファイド（’　ｉ、Ｏｍｅ　
）のイｆ在下にＨＦ　（、ｇθｍｌ　）で０℃、６０分
間、′話法てより処理する。ＨＦは真空ポンプにより０
℃で除去される。生じる黄色の樹脂は、酢酸エチルで数
回洗浄される。

ペプチドを３Ｍ酢酸（／ｓｏｍｅ）で抽出し、牟士立＝
２であった。

つぎに、粗ペプチド（７ｏ　ｏ　ｍｙ　）を３Ｍ酢１１
段（０，０２％エタンジチオールを含む）（１０ｙｉ）
に溶解し、゛セファデックスＧ　−２５”カラム（３，
０×／り２　ｃｍ　）にかけ、０．０２係エクノ／チオ
ールを含む３Ｍ酢酸で溶出する。

溶出物を／θ２ごとに集め、各フラクショ／を分光光度
計（２Ｊ’Ｏｎｍ）及びＴｒ、ｃ（？Ｊ媒糸：　／−Ｂ
ｕＯＨ：ＡｃＯＨ：Ｈ２Ｏ＝　’ｌ　：　／　：　６　
）にょってモニターする。

主要成分を含むフラクンヨ７クグ〜ｇ乙を集め、凍結乾
燥して、グ６／ｍ９の部分昂′製物を得る。

さらに、液滴向流分配に付し、／！０カラム（３，０×
り００ｍｍ　）で精製される（溶媒系：／−ＢｕＯＨ：
ＡｃＯＨ二Ｈ，、Ｏ−Ｙ　：　／　二ｊ　）。溶出物は
３２ごとに集められ、分光光度計（２Ｌ？θｎｍ　）及
びＨＰＬＣ（”　ＴＳＫ　ＧＥＬ　ｌ′ＯＤＳ　−／、
２θ、カラムニθ、り乙Ｘ２ｊｃｎｒ、溶媒：θ、θ／
　ＮＨＣｌ、／ＣＨ３ＣＮ　−、？０／２０−）ｔ　Ｏ
／￥　０、直線濃度勾配、３０分、流速二／ｒｎｌ！／
分）でモニターちれる。

目的物はフラクション／θθ〜／／トに溶出され、凍結
乾燥すると７３，９８１ｇの白い粉末が得られた。ＨＰ
ＬＣによると、／９．！分で溶出された。

得られたペプチドのアミノ酸組成は次のとおりであった
。なお分析にペプチド加水分解物（乙ＮＨＣ，ｆＬ、２
り時間、７１０℃）について行なった。

Ａｓｐ　ｊ、２０　（５）　Ｔｈｒ　ｏ、９／　（１）
。

Ｓｅｒ　３．７．５’　（４）、　Ｇｌｕ　３．θ”（
’３）１Ｇｌｙ　２．／７　（２＋、　Ａｌａ　／、０
乙　（Ｉ）。

Ｖａｌ　／、７３　（２１、Ｍｅｔ　０．９≦　（１）
。

１１ｅ　ｉ、ｏ、：ｚ　（１）、　Ｌｅｕ　／、ｏ２（
１）。

Ｔｙｒ　／、θ３　（１）、　Ｐｈｅ　／、θｊ（１）

【図面の簡単な説明】 図７（ａ、ｂ）はヒトＡＣＲ−α遺伝子を含むＤＮＡン
ラグメントの塩基配列及びそハ、より想定されたアミノ
酸配列を示す（下段は、ランＣＤＮＡの配列を示す。）
。（なお、図／ａにおける３′側木端が、図／ｂのｊ′
側末端にわ°Ｃく。）。 出　願　人　三菱化成工業株式会社 代　理　人　弁理士　長谷用　− ほか／名 −ｙ日・続ｔにｉｔｓ　ｉｌ三（ｔμ５１　（〕”ノ式
）ロｊイ和と）９　（，１−２月２１　日１　“Ｊｉ　
ｆ’ｌの表示 昭和５８年特ＨＱ願第１８６４０２弓 ２　発明の名称 ベブヂド類 ３　？ｉｌｉ正をする者 事件との関係　特許出願人 （５９６）三菱化成工業株式会社 ４代理人　〒１００ 東京都千代ぽ１区丸の内二］１５番２号三菱化成工業株
式会社内

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の式（１）〜（■）のいずれかの一つで示さ
   れるアミノ酸配列を有するペプチド類。 Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ　（
   １）Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｓｐ
   　（１）Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−８
   ｅｒ　（Ｉｌｌ）Ｇｌｕ−８ｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｐ
   ｒｏ−Ａｓｐ　（ＩＶ　）１１ｅ−Ｌｙｅ−Ｇｌｕ−８
   ｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ　（Ｖ）Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ
   −Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ　（ｖｌ）Ｌｙｓ−８ｅｒ−
   Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−８ｅｒ　（■ｌ）