CN114047269B - 一种乙酰基六肽-8的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种乙酰基六肽‑8的检测方法；属于分析检测领域；该检测方法包括柱前衍生化步骤和高效液相色谱分析步骤；柱前衍生化步骤包括：采用氨基衍生化试剂与乙酰基六肽‑8进行衍生化反应；氨基衍生化试剂由(2,8‑二甲基‑咪唑并[1,2‑A]吡啶‑3‑基)‑甲醇或(6‑(二甲氧基甲基)呋喃并[3,2‑b]吡啶‑2‑基)‑甲醇与双(三氯甲基)碳酸酯制得；其中柱前衍生化步骤为：将氨基衍生化试剂与乙酰基六肽‑8置于容器中，然后加入缓冲溶液，在恒温水浴中进行反应，再加入甲酸反应10~15 min，得到衍生化产物，再进行高效液相色谱分析步骤。该检测方法对乙酰基六肽‑8具有优良的检测灵敏度、准确度以及重复性。
Description
技术领域
本发明属于分析检测领域，具体涉及一种乙酰基六肽-8的检测方法。
背景技术
乙酰基六肽-8也叫乙酰基六肽-3，六胜肽，俗称阿基瑞林（Argireline），是一种优质的神经递质抑制类胜肽，其作用机理是通过参与竞争SNAP-25在融泡复合体的位点，从而影响复合体的形成。当融泡复合体稍有不稳定，囊泡便不能有效释放神经递质，使得肌肉收缩减弱，影响皮囊神经传导，以达到平抚动态纹、静态纹及细纹的效果，改善皮肤状态。
目前，对肽类物质序列、结构及含量的测定大多采用高效液相色谱法，也采用毛细管电泳法、高效液相色谱法、液质联用法等。现有技术如公开号CN110426476A公开了一种化妆品中乙酰基六肽-8含量的测定方法；其测定方法为在对化妆品进行预处理时，将三氟乙酸水溶液作为溶剂，再补充乙腈，能够最大限度提取化妆品中的乙酰基六肽-8，使测定方法准确、高效；同时，在对化妆品进行预处理时所采用的溶剂与进行梯度洗脱时采用的流动相溶剂相近，能够减少高效液相色谱法测定时干扰峰的数量，进而提高测定方法的准确度。
发明内容
本发明的目的在于提供一种对乙酰基六肽-8具有优良的检测灵敏度、准确度以及重复性的检测方法。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
一种氨基衍生化试剂，其结构式包括：
结构式 (Ⅰ) 所示：
一种乙酰基六肽-8的检测方法，包括柱前衍生化步骤和高效液相色谱分析步骤；
柱前衍生化步骤为：采用氨基衍生化试剂与乙酰基六肽-8进行衍生化反应。
需要说明的是，在本发明的实施例中，结构式 (Ⅰ) 所示氨基衍生化试剂由(2,8-二甲基-咪唑并[1,2-A]吡啶-3-基)-甲醇与双(三氯甲基)碳酸酯制得。
需要说明的是，在本发明的实施例中，结构式 (Ⅱ) 所示氨基衍生化试剂由(6-(二甲氧基甲基)呋喃并[3,2-b]吡啶-2-基)-甲醇与双(三氯甲基)碳酸酯制得。
本发明采用(2,8-二甲基-咪唑并[1,2-A]吡啶-3-基)-甲醇或(6-(二甲氧基甲基)呋喃并[3,2-b]吡啶-2-基)-甲醇与双(三氯甲基)碳酸酯制得氨基衍生化试剂，与乙酰基六肽-8衍生化，再进行高效液相色谱分析，该检测方法对乙酰基六肽-8具有优良的检测灵敏度；同时对乙酰基六肽-8具有优良的检测准确度以及重复性。
需要说明的是，在本发明的实施例中，乙酰基六肽-8包含乙酰基六肽-8标样、含有乙酰基六肽-8的样品。
进一步需要说明的是，在本发明的实施例中，氨基衍生化试剂的制备方法为：将双(三氯甲基)碳酸酯与催化剂置于容器中，加入溶剂溶解，加热回流，然后缓慢加入(2,8-二甲基-咪唑并[1,2-A]吡啶-3-基)-甲醇或(6-(二甲氧基甲基)呋喃并[3,2-b]吡啶-2-基)-甲醇，保温回流反应6~9 h，冷却至室温，用冰水洗涤3~5次，静置分层，用无水氯化钙干燥，常压蒸馏以除去溶剂，再减压蒸馏，得到产物，收率为94.7~96.5%。
进一步需要说明的是，在本发明的实施例中，氨基衍生化试剂的制备中所用原料的重量份分别为：双(三氯甲基)碳酸酯为10~15份、催化剂为0.15~0.2份、溶剂为25~50份、(2,8-二甲基-咪唑并[1,2-A]吡啶-3-基)-甲醇为18~24份、(6-(二甲氧基甲基)呋喃并[3,2-b]吡啶-2-基)-甲醇为22~28份。
进一步需要说明的是，在本发明的实施例中，氨基衍生化试剂的制备中加热回流温度为75~85℃。
进一步需要说明的是，在本发明的实施例中，氨基衍生化试剂的制备中所用催化剂为三乙胺、吡啶、N,N-二甲基苯胺中的一种或几种混合。
进一步需要说明的是，在本发明的实施例中，氨基衍生化试剂的制备中所用溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷、甲苯中的一种或几种混合。
需要说明的是，在本发明的实施例中，柱前衍生化步骤为：将氨基衍生化试剂与乙酰基六肽-8置于容器中，然后加入缓冲溶液，在恒温水浴中进行反应，再加入甲酸反应10~15 min，得到衍生化产物。
进一步需要说明的是，在本发明的实施例中，将结构式 (Ⅰ) 所示氨基衍生化试剂与乙酰基六肽-8置于容器中，然后加入缓冲溶液，在恒温水浴中进行反应，再加入甲酸反应10~15min，得到衍生化产物。
进一步需要说明的是，在本发明的实施例中，将结构式 (Ⅱ) 所示氨基衍生化试剂与乙酰基六肽-8置于容器中，然后加入缓冲溶液，在恒温水浴中进行反应，再加入甲酸反应10~15 min，得到衍生化产物。
进一步需要说明的是，在本发明的实施例中，氨基衍生化试剂与乙酰基六肽-8的摩尔比例为10~20：1。
进一步需要说明的是，在本发明的实施例中，恒温水浴温度为40~60℃，反应时间15~20 min。
进一步需要说明的是，在本发明的实施例中，缓冲溶液为碳酸钠-碳酸氢钠溶液、硼酸-硼砂溶液中的一种。
需要说明的是，在本发明的实施例中，高效液相色谱分析步骤中，分析条件为：采用C18色谱柱，柱温为32~38℃；流动相A：0.05~0.1%乙酸-乙腈溶液；流动相B为：0.05~0.1%乙酸-水溶液；其中流动相A与流动相B的体积比为10~80：20~90；流速为1~1.5 mL/min，进样量为10~20 μL，检测波长为205~220 nm。
需要说明的是，在本发明的实施例中，流动相B中还包括柠檬酸，其中流动相B中乙酸与柠檬酸的质量比为3~5：1。
本发明由于采用(2,8-二甲基-咪唑并[1,2-A]吡啶-3-基)-甲醇或(6-(二甲氧基甲基)呋喃并[3,2-b]吡啶-2-基)-甲醇与双(三氯甲基)碳酸酯制得氨基衍生化试剂，与乙酰基六肽-8衍生化，再进行高效液相色谱分析，该检测方法对乙酰基六肽-8具有优良的检测灵敏度；同时对乙酰基六肽-8具有优良的检测准确度以及重复性。因此，本发明是一种对乙酰基六肽-8具有优良的检测灵敏度、准确度以及重复性的检测方法。
附图说明
图1为氨基衍生化试剂的红外谱图。
具体实施方式
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明进行详细描述，但是应当理解，这些实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制，本发明的保护范围也不限于下述的实施例。
需要说明的是，为了优化对乙酰基六肽-8的检测灵敏度、准确度与重复性，采取的优选措施还包括：在流动相B中添加柠檬酸，其中乙酸与柠檬酸的质量比为3~5：1。柠檬酸的添加，其与乙酸按特定比例协同使用作为流动相B，使检测样品能够从色谱柱上分离，以提高检测的灵敏度、准确度与重复性。
需要说明的是，在本发明的一些实施例中，乙酰基六肽-8定性检测方法如下：
将乙酰基六肽-8标样与氨基衍生化试剂进行柱前衍生化，将衍生后的标样进行高效液相色谱分析，得到乙酰基六肽-8标样色谱峰的保留时间；
将待测样品与氨基衍生化试剂进行柱前衍生化，将衍生后的待测样品进行高效液相色谱分析，且待测样品的色谱峰与乙酰基六肽-8标样色谱峰的保留时间应一致，说明检测到乙酰基六肽-8。
需要说明的是，在本发明的一些实施例中，乙酰基六肽-8定量的检测方法如下：
将不同浓度的乙酰基六肽-8标样与氨基衍生化试剂进行柱前衍生化，将衍生后的试样进行高效液相色谱分析，建立检测标准检测曲线；
将待测样品与氨基衍生化试剂进行柱前衍生化，将衍生后的待测样品进行高效液相色谱分析，待测样品的色谱峰面积对比乙酰基六肽-8的标准曲线进行外标法定量测定。
进一步需要说明的是，上述乙酰基六肽-8标样的检测方法：精确称取0.0500~0.1000 g乙酰基六肽-8置于容量瓶中，加入乙腈-水（V乙腈：V水=5~10：90~95）溶液定容，得到乙酰基六肽-8标样。
在本实施例中，上述乙酰基六肽-8标样的制备方法为：精确称取0.0550 g乙酰基六肽-8置于容量瓶中，加入乙腈-水（V乙腈：V水=10:90）溶液分别定容0.02、0.05、0.10、0.20、0.40 g/L不同浓度，得到乙酰基六肽-8标样。
需要说明的是，上述在本发明的一些实施例中，乙酰基六肽-8标样与氨基衍生化试剂的具体步骤为：
将氨基衍生化试剂与乙酰基六肽-8标样按摩尔比为10~20：1置于容器中，然后加入缓冲溶液，调节体系pH为9~11，在40~60℃的恒温水浴中反应15~20 min，再加入甲酸反应10~15 min，反应体系中有机溶剂与水的体积比为1~3：7~9，得到衍生化产物。
需要说明的是，上述在本发明的一些实施例中，乙酰基六肽-8标样的高效液相色谱分析条件为：
采用C18色谱柱，柱温为32~38℃；流动相A：0.05~0.25%乙酸-乙腈溶液；流动相B为：0.05~0.1%乙酸-水溶液；其中流动相A与流动相B的体积比为10~80：20~90；流速为1~1.5mL/min，进样量为10~20 μL，检测波长为205~220 nm。
需要说明的是，上述在本发明的一些实施例中，待测样品与氨基衍生化试剂的具体步骤为：
将氨基衍生化试剂与待测样品按待测样品与衍生化试剂的质量比为3~8：1置于容器中，然后加入缓冲溶液，调节体系pH为9~11，在40~60℃的恒温水浴中反应15~20 min，再加入甲酸反应10~15 min，反应体系中有机溶剂与水的体积比为1~3：7~9，得到衍生化产物。
需要说明的是，上述在本发明的一些实施例中，待测样品的高效液相色谱分析条件为：
采用C18色谱柱，柱温为32~38℃；流动相A：0.05~0.25%乙酸-乙腈溶液；流动相B为：0.05~0.1%乙酸-水溶液；其中流动相A与流动相B的体积比为10~80：20~90；流速为1~1.5mL/min，进样量为10~20 μL，检测波长为205~220 nm。
以下结合具体实施方式和附图对本发明的技术方案作进一步详细描述：
实施例1：
氨基衍生化试剂的制备方法为：按重量份计，在装有搅拌、温度计、球形冷凝管、恒压加料漏斗的反应烧瓶中加入11.5份双(三氯甲基)碳酸酯与0.18份三乙胺，用40份二氯甲烷溶解，然后加热至80℃进行回流反应，再缓慢加入20.5份(2,8-二甲基-咪唑并[1,2-A]吡啶-3-基)-甲醇，保温回流反应8 h，冷却至室温，用冰水洗涤3次，静置分出油层，用无水氯化钙干燥，常压蒸馏以除去溶剂，再减压蒸馏，得到产物，收率为95.7%，其结构式为：
；
采用Varian-400型核磁共振仪对上述氨基衍生化试进行结构表征；1H NMR（CDCl3，400MHz）：8.48（d，1H，CH）、7.26（d，1H，CH）、6.79（t，1H，CH）、5.51（d，2H，CH2）、2.64（s，3H，CH3）、2.33（s，3H，CH3）。
实施例2：
氨基衍生化试剂的制备方法，与实施例1不同的是，在反应烧瓶中加入14.5份双(三氯甲基)碳酸酯与0.2份三乙胺，用50份二氯甲烷溶解，然后加热至80℃进行回流反应，再缓慢加入25份(2,8-二甲基-咪唑并[1,2-A]吡啶-3-基)-甲醇，保温回流反应8 h，冷却至室温，用冰水洗涤3次，静置分出油层，用无水氯化钙干燥，常压蒸馏以除去溶剂，再减压蒸馏，得到产物，收率为96.2%，其结构式为：
；
采用Varian-400型核磁共振仪对上述氨基衍生化试进行结构表征；1H NMR（CDCl3，400MHz）：8.56（s，1H，CH）、7.92（s，1H，CH）、6.17（s，1H，CH）、5.52（s，1H，CH）、5.19（s，2H，CH2）、3.34（s，6H，CH3）。
实施例3：
一种乙酰基六肽-8的检测方法，包括以下步骤：
（1）柱前衍生化
将实施例1中的氨基衍生化试剂与乙酰基六肽-8的不同浓度标样分别按摩尔比为10：1置于容器中，然后加入碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液，调节体系pH为10.5，在50℃的恒温水浴中反应15 min，再加入甲酸反应10 min，反应体系中有机溶剂与水的体积比为2：8，得到衍生化产物；其衍生化反应方程如下：
其中R为乙酰基六肽-8中除去-NH2的剩余部分结构。
（2）高效液相色谱分析
将上述衍生化产物进行高效液相色谱分析；具体分析条件为：采用C18色谱柱，柱温为35℃；流动相A：0.1%乙酸-乙腈溶液；流动相B为：0.1%乙酸-水溶液；其中流动相A与流动相B的体积比为10：90；流速为1.0 mL/min，进样量为15 μL，检测波长为215 nm，建立标准检测曲线；将待测样品与衍生化试剂按上述柱前衍生化条件进行柱前衍生化，其中待测样品与衍生化试剂的质量比为5：1；将衍生后的试样按上述高效液相色谱分析条件进行分析，通过已建立的标准曲线计算待测样品中的乙酰基六肽-8浓度。
实施例4：
一种乙酰基六肽-8的检测方法，与实施例3不同的是：
步骤（1）柱前衍生化中，将实施例2中的氨基衍生化试剂与乙酰基六肽-8的不同浓度标样按摩尔比为10：1置于容器中，然后加入碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液，调节体系pH为10.5，在50℃的恒温水浴中反应15 min，再加入甲酸反应10 min，反应体系中有机溶剂与水的体积比为2：8，得到衍生化产物；其衍生化反应方程如下：
其中R为乙酰基六肽-8中除去-NH2的剩余部分结构。
实施例5：
一种乙酰基六肽-8的检测方法，与实施例4不同的是：
步骤（1）柱前衍生化中，将实施例2中的氨基衍生化试剂与乙酰基六肽-8的不同浓度标样分别按摩尔比为15：1置于容器中，然后加入碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液，调节体系pH为10，在45℃的恒温水浴中反应20 min，再加入甲酸反应10 min，反应体系中有机溶剂与水的体积比为1：9，得到衍生化产物。
实施例6：
一种乙酰基六肽-8的检测方法，与实施例4不同的是：
步骤（2）高效液相色谱分析中，将上述衍生化产物进行高效液相色谱分析；具体分析条件为：采用C18色谱柱，柱温为35℃；流动相A：0.1%乙酸-乙腈溶液；流动相B为：0.1%乙酸-水溶液；其中流动相A与流动相B的体积比为80：20；流速为1.0 mL/min，进样量为15 μL，检测波长为215 nm，建立标准检测曲线，将待测样品与衍生化试剂按上述柱前衍生化条件进行柱前衍生化，其中待测样品与衍生化试剂的质量比为5：1；将衍生后的试样按上述高效液相色谱分析条件进行分析，通过已建立的标准曲线计算待测样品中的乙酰基六肽-8浓度。
实施例7：
一种乙酰基六肽-8的检测方法，与实施例4不同的是：
步骤（2）高效液相色谱分析中，将上述衍生化产物进行高效液相色谱分析；具体分析条件为：采用C18色谱柱，柱温为35℃；流动相A：0.1%乙酸-乙腈溶液；流动相B为：0.1%乙酸-水溶液；其中流动相A与流动相B的体积比为70：30；流速为1.0 mL/min，进样量为15 μL，检测波长为215 nm，建立标准检测曲线；将待测样品与衍生化试剂按上述柱前衍生化条件进行柱前衍生化，其中待测样品与衍生化试剂的质量比为5：1；将衍生后的试样按上述高效液相色谱分析条件进行分析，通过已建立的标准曲线计算待测样品中的乙酰基六肽-8浓度。
实施例8：
一种乙酰基六肽-8的检测方法，与实施例4不同的是：
步骤（2）高效液相色谱分析中，流动相B为：0.1%乙酸-柠檬酸-水溶液；其中乙酸与柠檬酸的体积比为3：1，流动相A与流动相B的体积比为10：90；流速为1.0 mL/min，进样量为15 μL，检测波长为215 nm，建立标准检测曲线；将待测样品与衍生化试剂按上述柱前衍生化条件进行柱前衍生化，其中待测样品与衍生化试剂的质量比为5：1；将衍生后的试样按上述高效液相色谱分析条件进行分析，通过已建立的标准曲线计算待测样品中的乙酰基六肽-8浓度。
实施例9：
一种乙酰基六肽-8的检测方法，与实施例8不同的是：
步骤（2）高效液相色谱分析中，流动相B为：0.1%乙酸-柠檬酸-水溶液；其中乙酸与柠檬酸的质量比为5：1。
实施例10：
一种乙酰基六肽-8的检测方法，与实施例8不同的是：
步骤（2）高效液相色谱分析中，流动相B为：0.1%乙酸-柠檬酸-水溶液；其中乙酸与柠檬酸的质量比为2：1。
实施例11：
一种乙酰基六肽-8的检测方法，与实施例8不同的是：
步骤（2）高效液相色谱分析中，流动相B为：0.1%乙酸-柠檬酸-水溶液；其中乙酸与柠檬酸的质量比为6：1。
对比例1：
一种乙酰基六肽-8的检测方法，包括以下步骤：
将乙酰基六肽-8标样进行高效液相色谱分析；具体分析条件为：采用C18色谱柱，柱温为35℃；流动相A：0.1%乙酸-乙腈溶液；流动相B为：0.1%乙酸-水溶液；其中流动相A与流动相B的体积比为10：90；流速为1.0 mL/min，进样量为15 μL，检测波长为215 nm，建立标准检测曲线；将待测样品与衍生化试剂按上述柱前衍生化条件进行柱前衍生化，其中待测样品与衍生化试剂的质量比为5：1；将衍生后的试样按上述高效液相色谱分析条件进行分析，通过已建立的标准曲线计算待测样品中的乙酰基六肽-8浓度。
试验例1：
1. 氨基衍生化试剂红外光谱测定
采用美国Necolit5D×B傅立叶变换红外光谱仪对氨基衍生化试剂的结构进行表征。
图1为氨基衍生化试剂的红外谱图。曲线a、b分别为结构式(Ⅰ)所示氨基衍生化试剂与结构式 (Ⅱ) 所示氨基衍生化试剂的红外谱图。结构式 (Ⅰ) 所示氨基衍生化试剂在2974 cm-1附近出现C-H的伸缩振动峰，在1750 cm-1附近出现特征吸收峰为酯基的伸缩振动；在1683 cm-1、1575 cm-1附近出现的特征吸收峰为C=C、C=N的伸缩振动；因此，采用(2,8-二甲基-咪唑并[1,2-A]吡啶-3-基)-甲醇与双(三氯甲基)碳酸酯成功制得结构式 (Ⅰ) 所示氨基衍生化试剂；结构式 (Ⅱ) 所示氨基衍生化试剂在2973 cm-1、2876 cm-1附近的较强的特征吸收峰为C-H中的伸缩振动；在1750 cm-1附近也出现酯基的特征吸收峰；因此，采用(6-(二甲氧基甲基)呋喃并[3,2-b]吡啶-2-基)-甲醇与双(三氯甲基)碳酸酯成功制得结构式(Ⅱ)的氨基衍生化试剂。
2. 检测方法的灵敏度
根据实施例3~11、对比例1的检测建立的标准曲线得到各实施例中的检出限，即检测灵敏度。
表1 检出限测试结果
由表1可以看出，实施例3-7的检出限低于3.02 μg/g，具有较好的检测灵敏度；对比实施例3、实施例4与对比例1，实施例3、实施例4的检出限低于对比例1，这说明采用(2,8-二甲基-咪唑并[1,2-A]吡啶-3-基)-甲醇或(6-(二甲氧基甲基)呋喃并[3,2-b]吡啶-2-基)-甲醇与双(三氯甲基)碳酸酯制得氨基衍生化试剂，与乙酰基六肽-8衍生化，再进行高效液相色谱分析，该检测方法对乙酰基六肽-8具有优良的检测灵敏度；实施例8-9的检出限低于1.65 μg/g，对比实施例4、实施例8-9、实施例10-11，实施例8-9的检出限低于实施例4、实施例10-11，这说明在高效液相色谱分析的流动相B溶液中添加柠檬酸，且乙酸与柠檬酸的质量比为3~5：1，使检测方法对乙酰基六肽-8具有更为优良的检测灵敏度。
3. 检测化妆品中乙酰基六肽-8的含量
（1）制备化妆品样品溶液
称取样品1.00 g，加入0.25 g鲸蜡醇磷酸酯钾，置于100 mL烧杯中，加入80 mL加乙腈-水（V乙腈：V水= 10：90），常温超声提取15 min，摇匀，用备好的乙腈-水溶液定容至刻度，取上层清液经0.45 μm滤膜后备用；并采用实施例3-11的柱前衍生化与高效液相色谱条件进行分析；若测定出样品中乙酰基六肽-8的浓度不在标准溶液浓度范围内，进行稀释或者重新配制浓度高的样品溶液。其中乙酰基六肽-8含量的计算公式如下：
W=nC0V/m×100%
式中：W为乙酰基六肽-8含量，%；n为样品稀释倍数；C0为乙酰基六肽-8质量浓度测定值，g/L；V为样品溶液体积，L；m为样品质量，g。
（2）加标回收率与精密度测试
采用加标样回收法，取配制好的乳液（购自广州嘉工生物科技有限公司）分为2组，每组各三份，分别取各样品溶液0.20、1.00、2.00 mL于10 mL容量瓶中，其中一组加入备用的乙腈-水溶液（V乙腈：V水=10：90）定容，另一组分别加入质量浓度为0.40 g/L的乙酰基六肽-8标准液0.50、2.50、5.00 mL，再用乙腈-水定容，混合均匀后，测定各样品中乙酰基六肽-8含量，平均回收率的计算如下：
回收率(%)=(测定值-原含量)/加标量×100%
表2 加标回收率测试结果
由表2可以看出，实施例3-7的回收率高于102%，RSD值低于1.97%，因此，实施例3-7的检测方法具有良好的准确度；对比实施例3、实施例4与对比例1，实施例3、实施例4的回收率高于对比例1，RSD值低于对比例1，这说明采用(2,8-二甲基-咪唑并[1,2-A]吡啶-3-基)-甲醇或(6-(二甲氧基甲基)呋喃并[3,2-b]吡啶-2-基)-甲醇与双(三氯甲基)碳酸酯制得氨基衍生化试剂，与乙酰基六肽-8衍生化，再进行高效液相色谱分析，该检测方法对乙酰基六肽-8具有优良的检测准确度；实施例8-9的回收率不低于110%，RSD值低于1.32%，对比实施例4、实施例8-9、实施例10-11，实施例8-9的回收率高于实施例4、实施例10-11，RSD值低于实施例4、实施例10-11，这说明在高效液相色谱分析的流动相B溶液中添加柠檬酸，且乙酸与柠檬酸的质量比为3~5：1，使得本发明的检测方法对乙酰基六肽-8具有更为优良的检测准确度。
（3）重复性测试
配制5份样品溶液，分别测得峰面积，然后根据回归曲线峰面积与浓度的关系式计算乳液中乙酰基六肽-8质量浓度，以5次测定值考察该方法的重复性，计算RSD平均值。
表3 RSD测试结果
由表3可以看出，实施例3-7重复性实验中的RSD平均值低于0.8%，即实施例3-7的检测方法对乙酰基六肽-8检测重复性较好；对比实施例3、实施例4与对比例1，实施例3、实施例4的RSD平均值低于对比例1，这说明采用(2,8-二甲基-咪唑并[1,2-A]吡啶-3-基)-甲醇或(6-(二甲氧基甲基)呋喃并[3,2-b]吡啶-2-基)-甲醇与双(三氯甲基)碳酸酯制得氨基衍生化试剂，与乙酰基六肽-8衍生化，再进行高效液相色谱分析，该检测方法对乙酰基六肽-8具有优良的检测重复性；实施例8-9的RSD平均值低于0.58%，对比实施例4、实施例8-9、实施例10-11，实施例8-9的RSD平均值低于实施例4、实施例10-11，这说明在高效液相色谱分析的流动相B溶液中添加柠檬酸，且乙酸与柠檬酸的质量比为3~5：1，对乙酰基六肽-8检测重复性更好。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。
Claims (6)
1.一种氨基衍生化试剂，其结构式包括：
结构式 (Ⅰ) 所示：
2.权利要求1所述的氨基衍生化试剂在检测乙酰基六肽-8中的用途。
3.一种乙酰基六肽-8的检测方法，包括柱前衍生化步骤和高效液相色谱分析步骤；
所述柱前衍生化步骤为：将权利要求1所述的氨基衍生化试剂与乙酰基六肽-8标样按摩尔比为10 ~ 20：1置于容器中，然后加入缓冲溶液，调节体系pH为9 ~ 11，在40 ~ 60℃的恒温水浴中反应15 ~ 20 min，再加入甲酸反应10 ~ 15 min，反应体系中有机溶剂与水的体积比为1 ~ 3：7 ~ 9，得到衍生化产物；
所述高效液相色谱分析步骤中，分析条件为：采用C18色谱柱，柱温为32~38℃；流动相A：0.05~0.1%乙酸-乙腈溶液；流动相B为：0.05~0.1%乙酸-水溶液；其中流动相A与流动相B的体积比为10~80：20~90；流速为1~1.5 mL/min，进样量为10~20 μL，检测波长为205~220 nm。
4.根据权利要求3所述的一种乙酰基六肽-8的检测方法，其特征是：所述结构式 (Ⅰ)所示氨基衍生化试剂由(2,8-二甲基-咪唑并[1,2-A]吡啶-3-基)-甲醇与双(三氯甲基)碳酸酯制得。
5.根据权利要求3所述的一种乙酰基六肽-8的检测方法，其特征是：所述结构式 (Ⅱ)所示氨基衍生化试剂由(6-(二甲氧基甲基)呋喃并[3,2-b]吡啶-2-基)-甲醇与双(三氯甲基)碳酸酯制得。
6.根据权利要求5所述的一种乙酰基六肽-8的检测方法，其特征是：所述流动相B中还包括柠檬酸，其中流动相B中乙酸与柠檬酸的质量比为3~5：1。
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