CN112730689B - 2-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶液相色谱分析方法 - Google Patents
2-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶液相色谱分析方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种2‑氨基‑5,8‑二甲氧基[1,2,4]三唑并[1,5‑c]嘧啶液相色谱分析方法，包括用液相色谱对2‑氨基三唑嘧啶和1‑氨基三唑嘧啶进行分离分析，液相色谱的色谱柱为氨基柱，流动相中包括结构式中含有R1、R2、R3、R4的化合物：R1、R2、R3、R4相互独立地为氢、C1‑C6烷基、C2‑C6炔基或C3‑C8环烷基。本发明中利用液相色谱法对2‑氨基‑5,8‑二甲氧基[1,2,4]三唑并[1,5‑c]嘧啶进行分离分析，能测定出2‑氨基‑5,8‑二甲氧基[1,2,4]三唑并[1,5‑c]嘧啶的有效含量，保证下游产品的含量、转化率和收率。
Description
技术领域
本发明属于有机物分离和分析领域，具体涉及2-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶液相色谱分析方法。
背景技术
五氟磺草胺(penoxsulam)是由美国陶农科公司(Dow AgroSciences)所开发的苗后用除草剂，它是三唑并嘧啶磺酰胺除草剂，通过抑制乙酰乳酸合成酶(ALS)而起作用。其中，2-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶(简称化合物(2))和1-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶(简称化合物(1))是最为主要的中间体，化合物(2)是通过化合物(1)催化反应制备。
但是，2-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶和1-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶的性质极其接近，导致制得的2-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶中会混有1-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶杂质。而现有方法难以分离分析出二者的相对含量，导致2-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶产品的纯度无法精准确定，进而影响到需要用2-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶制备的最终产品五氟磺草胺品质和药效。因此找到一个合适的2-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶的分离分析方法就显得比较重要。
发明内容
本发明针对以上问题的提出，而研究设计一种2-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶与1-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶的液相色谱分离和分析方法，来解决传统方法难以分析2-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶含量的缺点。本发明采用的技术手段如下：
一种2-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶的液相色谱分离分析方法，用液相色谱对2-氨基三唑嘧啶和1-氨基三唑嘧啶进行分离分析，色谱柱为氨基柱，流动相中包括结构式如下的化合物：
其中R1、R2、R3、R4相互独立地为氢、C1-C6烷基、C2-C6炔基或C3-C8环烷基。
优选地，所述R1、R2、R3、R4相互独立地为氢、直链C1-C6烷基、直链C2-C6炔基或直链C3-C8环烷基。
优选地，R1、R2、R3、R4由至少一个基团Ra取代，Ra为卤素、氰基、硝基、C1-C6烷硫基、C1-C6烷基亚磺酰基、C1-C6烷基磺酰基、C3-C6三烷基甲硅烷基、苯基、苯氧基、五元或六元杂环。
优选地，Ra为C1-C6烷硫基、C1-C6烷基亚磺酰基、C1-C6烷基磺酰基、C3-C6三烷基甲硅烷基、苯基、苯氧基、5元或6元杂芳环，Ra由至少一个基团Rb取代，Rb为卤素、氰基、硝基、C1-C6烷基、C2-C6炔基、C3-C8环烷基、C1-C6卤烷基、C2-C6卤炔基、C3-C8卤环烷基、C1-C6烷硫基、C1-C6烷基亚磺酰基、C1-C6烷基磺酰基、C2-C6烷基羰基、苯基、苄基、五元或六元杂环。
优选地，Rb为C1-C6烷基、C2-C6炔基、C3-C8环烷基、C1-C6卤烷基、C2-C6卤炔基、C3-C8卤环烷基、C1-C6烷硫基、C1-C6烷基亚磺酰基、C1-C6烷基磺酰基、C2-C6烷基羰基、苯基、苄基、五元或六元杂环，Rb由至少一个基团Rc取代，Rc为卤素、氰基、硝基、C1-C6烷基、C2-C6炔基、C3-C8环烷基、C1-C6卤烷基、C2-C6卤炔基、C3-C8卤环烷基、C1-C6烷硫基、C1-C6烷基亚磺酰基、C1-C6烷基磺酰基、C2-C6烷基羰基或C1-C6三烷基甲硅烷基。
优选地，所述R1、R2、R3、R4相互独立地为氢、甲基或乙基。
优选地，所述色谱柱为Inert Sustain NH2 5um,4.6×250mm，所述流动相还包括水、水和甲醇或者水和乙腈，流动相运行采用梯度洗脱模式。
优选地，所述流动相中还包括活性剂。
优选地，所述活性剂为四丁基硫酸氢铵、庚烷磺酸钠、戊烷磺酸钠、十六烷基三甲基溴化胺、十二烷基硫酸钠和十二烷基苯磺酸中的一种或两种以上。
优选地，液相色谱检测波长为195-254nm。
本发明分离分析方法的原理为：虽然1-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶和2-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶的性质比较接近，很难用常规的HPLC分析方法分析和分离。但是，1-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶中的氨基(-NH2)和某些化学物质容易形成分子间氢键，从而生成超分子化合物，如结构式(1)。
相反，由于2-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶的-NH2位置在2位，无法形成分子间氢键。在这种情况下，在流动相中添加某些物质会使1-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶的物理化学性质发生改变。从而使得2-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶在某种情况下更容易与1-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶分离，可以用HPLC进行定性和定量分析。
与现有技术比较，本发明所述的2-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶液相色谱分析方法的有益效果为：本发明中利用液相色谱法对2-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶与1-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶进行分离，并且测定出2-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶的有效含量，从而避免了在生产2-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶过程中，将1-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶杂质误认为是2-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶而影响后续产品品质的问题，采用本发明方法能够保证生产2-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶过程中实时控制产品的质量，使得下游产品的含量、转化率、收率都有大幅度的提高。
附图说明
图1是2-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑[1,5-c]嘧啶的色谱图；
图2是1-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑[1,5-c]嘧啶的色谱图；
图3是2-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑[1,5-c]嘧啶与1-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑[1,5-c]嘧啶的分离谱图。
具体实施方式
选用的液相色谱分离分析条件如下表1-a至表1-c：
表1-a、液相色谱分析条件
表1-b、液相色谱分析条件
表1-c、液相色谱分析条件
图1、图2和图3是按照表1-a条件的液相色谱定性分析谱图，其中：图1中的色谱峰为2-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑[1,5-c]嘧啶的峰，其保留时间为2.584分钟。图2中的色谱峰为1-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑[1,5-c]嘧啶的峰，其保留时间为2.367分钟。图3是2-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶+1-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶的液相色谱定性分析谱图，结合图1-3可以明显看出两者分离效果良好。按照表1-b、1-c条件进行液相色谱定性分析，所得谱图与上述图1-3几乎相同，可看出2-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶和1-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶明显分离。
根据表1-a至1-c的条件，用甲醇分别溶解标准物质和待测样品，得到标样和试样；将高效液相色谱的检测波长设定为223nm，仪器基线稳定后，按标样、试样、试样、标样的顺序依次进样，得到四条扫描曲线，分别对标样和试样的峰面积进行平均，得其峰面积平均值；按照式(1)对2-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑[1,5-c]嘧啶的质量分数进行计算：
式中：
A1—标样中，2-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶峰面积的平均值；
A2—试样中，2-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶峰面积的平均值；
m1—标样的质量，g；
m2—试样的质量，g；
P1—标样中2-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶的质量百分数。
实施例1：准确性试验：
液相色谱操作条件如表1-a，区别在于检测波长不同。
标样溶液配制：准确称取2-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑[1,5-c]嘧啶标样0.01429g，置于100mL容量瓶中，加30mL甲醇，超声波振荡溶解，冷至室温后，用甲醇稀释至刻度，得到标样溶液备用。
试样溶液配制：准确称取2-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑[1,5-c]嘧啶试样0.01408g，置于100mL容量瓶中，加30mL甲醇，超声波振荡溶解，冷至室温后，用甲醇稀释至刻度，得到试样溶液备用。
测试与数据处理：开启液相色谱仪自检通过后，在规定的操作条件下，待仪器基线稳定后，连续注入数针标样溶液，计算各针相对响应值，达到相邻两针相对响应值变化小于1.5％时，按标样、试样、试样、标样的顺序依次进样，在235nm波长下检测，结果如表2：
表2
将测得的2针试样溶液以及其前后2针标准溶液中2-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑[1,5-c]嘧啶峰面积分别进行平均，以质量分数表示2-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑[1,5-c]嘧啶的含量X1。按式(1)计算，可得样品的质量分数为98.76％。
实施例2：准确性试验：
液相色谱操作条件如表1-a，区别在于检测波长不同。
标样溶液配制：准确称取2-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑[1,5-c]嘧啶标样0.01418g，置于100mL容量瓶中，加30mL甲醇，超声波振荡溶解，冷至室温后，用甲醇稀释至刻度，得到标样溶液备用。
试样溶液配制：准确称取2-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑[1,5-c]嘧啶试样0.01410g，置于100mL容量瓶中，加30mL甲醇，超声波振荡溶解，冷至室温后，用甲醇稀释至刻度，得到试样溶液备用。
测试与数据处理：开启液相色谱仪自检通过后，在规定的操作条件下，待仪器基线稳定后，连续注入数针标样溶液，计算各针相对响应值，达到相邻两针相对响应值变化小于1.5％时，按标样、试样、试样、标样的顺序依次进样，在254nm波长下检测，结果如表3：
表3
将测得的2针试样溶液以及其前后2针标样溶液中2-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑[1,5-c]嘧啶峰面积分别进行平均，以质量分数表示2-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑[1,5-c]嘧啶的含量X1。按式(1)计算，可得样品的质量分数为98.90％。
实施例3：准确性试验：
液相色谱操作条件如表1-a，区别在于检测波长不同。
标样溶液配制：准确称取2-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑[1,5-c]嘧啶标样0.0496g，置于100mL容量瓶中，加30mL甲醇，超声波振荡溶解，冷至室温后，用甲醇稀释至刻度，得到标样溶液备用。
试样溶液配制：准确称取试样0.0510g，置于100mL容量中，加30mL甲醇，超声波振荡溶解，冷至室温后，用甲醇稀释至刻度，得到试样溶液备用。
测试与数据处理：开启液相色谱仪自检通过后，在规定的操作条件下，待仪器基线稳定后，连续注入数针标样溶液，计算各针相对响应值，达到相邻两针相对响应值变化小于1.5％时，按标样、试样，试样、标样的顺序依次进样，在230nm波长下检测，结果如表4：
表4
将测得的2针试样溶液以及其前后2针标样溶液中2-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑[1,5-c]嘧啶峰面积分别进行平均，以质量分数表示2-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑[1,5-c]嘧啶的含量X1。按式(1)计算，可得样品的质量分数为98.69％。
实施例4：重复性实验：
液相色谱操作条件如表1-a。与实施例1的不同之处在于，
试样配制：准确称取6份2-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑[1,5-c]嘧啶试样0.014g(精确至0.00002g)，分别置于100mL容量瓶中，加30mL甲醇，超声波振荡溶解，冷至室温后，用甲醇稀释至刻度，得到平行试样备用。
测试与数据处理：开启液相色谱仪自检通过后，在规定的操作条件下，仪器基线稳定后，连续注入数针标样，计算各针相对响应值，达到相邻两针相对响应值变化小于1.5％时，按标样、试样、试样、标样的顺序依次进样，在235nm进行扫描，杂质分离完全，峰形良好。按式(1)计算试样的有效成分含量，结果如表5：
表5
由表5中数据可见，本发明方法的测定结果重复性良好。
实施例5：线性关系试验：
液相色谱操作条件如表1-a。
精密称取2-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑[1,5-c]嘧啶含量99.45％的纯品样0.47470g，加甲醇溶解并稀释至100mL，摇匀，作为线性试验贮备液。精密量取1、2、3、4、5mL贮备液置于100mL容量瓶中，用甲醇溶剂并稀释至刻度，摇匀，制得浓度分别为47.47ug/mL、94.94ug/mL、142.41ug/mL、189.88ug/mL、237.35ug/mL的一组2-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑[1,5-c]嘧啶试样备用。
测试与数据处理：在223nm下进行液相色谱测定，以峰面积对样品浓度作线性回归，得到回归方程为：y＝192247x+32423，相关系数R＝0.9999。
可见2-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑[1,5-c]嘧啶线性关系良好。
实施例6：精密度试验：
液相色谱操作条件如表1-a，区别在于检测波长不同。
标样如表6。
试样配制：不同人员在不同实验室准确称取6份2-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑[1,5-c]嘧啶试样0.0014g(精确至0.00002g)，分别置于100mL容量瓶中，加30mL甲醇，超声波振荡溶解，冷至室温后，用甲醇稀释至刻度，得到一组中间精密度试验用试样备用。
测试与数据处理：在254nm下进行液相色谱扫描测定，杂质分离完全，峰形良好，按式(1)计算试样的有效成分含量，结果如表6：
表6
由表6中数据可见，本发明方法测定结果中间精密度良好。
实施例7：稳定性试验：
液相色谱操作条件如表1-a。
准确称取2-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑[1,5-c]嘧啶0.01418g试样，置于100mL容量瓶中，加30mL甲醇，超声波振荡溶解，冷至室温后，用甲醇稀释至刻度，得到试样备用。
在不同时间下，检测波长为223nm进行液相色谱扫描测定，杂质分离完全，峰形良好，峰面积结果如表7：
表7
| 时间(h) | 0 | 1 | 2 | 3 | 6 | 12 | RSD/％ |
| 峰面积 | 27472695 | 27498249 | 27447141 | 27478249 | 27467141 | 27479249 | 0.06 |
由表7中数据可见，本发明方法测定结果时间稳定性良好。
实施例8：加标回收率试验：
液相色谱操作条件如表1-a。
以已知质量分数的2-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑[1,5-c]嘧啶产品为底样，加入2-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑[1,5-c]嘧啶纯品，定容做加标回收试验。
在223nm进行液相色谱扫描测定，杂质分离完全，峰形良好，加标回收率按式(2)对2-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑[1,5-c]嘧啶进行计算，结果如表8：
式中：
P---加标回收率，％；
C1---样品含量，mg；
C2---加标后含量，mg；
C3---加标量，mg。
表8
由表8中数据可见，回收率在99.84％-100.16％，平均为99.94％，相对标准偏差为0.31％，结果良好。说明本发明方法适合测定2-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑[1,5-c]嘧啶，并能确保分析数据准确、可靠。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (3)
1.2-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶液相色谱分析方法，其特征在于：用液相色谱对2-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶和1-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑[1,5-c]嘧啶进行分离分析，所述液相色谱采用梯度洗脱模式，液相色谱条件包括：
色谱柱：氨基柱Inert Sustain NH2 5um,4.6×250mm；
柱温：30℃；
进样量：20μL；
流速：1.0mL/min；
检测波长为：195-254nm；
流动相A为：含1%乙醇胺和0.3%四丁基硫酸氢铵的缓冲液300mL和乙腈700mL；
流动相B为：含1%乙醇胺和0.3%四丁基硫酸氢铵的缓冲液400mL和甲醇600mL；
梯度洗脱的时间和响应的比例包括：0min，100%A，0%B；25min，0%A，100%B；30min，0%A，100%B；35min，100%A，0%B；36min，停止。
2.2-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶液相色谱分析方法，其特征在于：用液相色谱对2-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶和1-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑[1,5-c]嘧啶进行分离分析，所述液相色谱采用梯度洗脱模式，液相色谱条件包括：
色谱柱：氨基柱Inert Sustain NH2 5um,4.6×250mm；
柱温：30℃；
进样量：20μL；
流速：1.0mL/min；
检测波长为：195-254nm；
流动相A为：含1%1-氨基-2丙醇和0.3%四丁基硫酸氢铵的缓冲液300mL和乙腈700mL；
流动相B为：含1%1-氨基-2丙醇和0.3%四丁基硫酸氢铵的缓冲液400mL和甲醇600mL；
梯度洗脱的时间和响应的比例包括：0min，100%A，0%B；25min，0%A，100%B；30min，0%A，100%B；35min，100%A，0%B；36min，停止。
3.2-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶液相色谱分析方法，其特征在于：用液相色谱对2-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶和1-氨基-5,8-二甲氧基[1,2,4]三唑[1,5-c]嘧啶进行分离分析，所述液相色谱采用梯度洗脱模式，液相色谱条件包括：
色谱柱：氨基柱Inert Sustain NH2 5um,4.6×250mm；
柱温：30℃；
进样量：20μL；
流速：1.0mL/min；
检测波长为：195-254nm；
流动相A为：含1%2-氨基丙醇和0.3%四丁基硫酸氢铵的缓冲液300mL和乙腈700mL；
流动相B为：含1%2-氨基丙醇和0.3%四丁基硫酸氢铵的缓冲液400mL和甲醇600mL；
梯度洗脱的时间和响应的比例包括：0min，100%A，0%B；25min，0%A，100%B；30min，0%A，100%B；35min，100%A，0%B；36min，停止。
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