CN114019062B - 一种利福平中有关物质的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及药物分析技术领域，具体公开一种利福平中有关物质的检测方法。所述方法包括：配制供试品溶液和对照品溶液，采用液相色谱‑质谱联用法进行检测，所述液相色谱采用C18色谱柱，以体积浓度为0.8‰~1.2‰的甲酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱；所述质谱采用ESI离子源，正离子检测，SIM模式。本申请提供的检测方法具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好等优点，能够快速、准确地对利福平原料药中的杂质N‑甲基哌嗪和1‑氨基‑4‑甲基哌嗪进行检测，整个操作过程可靠、可控，适于实际应用和推广，具有广阔的应用前景。

Description

一种利福平中有关物质的检测方法
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，尤其涉及一种利福平中有关物质的检测方法。
背景技术
利福平(Rifampicin)，分子式为C43H58N4O12，发明于1965年，是利福霉素类半合成广谱抗生素，为一重要抗结核药物。利福平的发现使结核病的治疗又发生了一次更大的飞跃，它除对结核杆菌具有很高的活性外；对金黄色葡萄球菌、非肠球菌型的链球菌及单核细胞增生利斯特氏菌等也具有很高的活性；它对非肺结核包括结核性脑膜炎也是最有效的治疗药物。
在现有工艺合成利福平原料药的过程中可能会引入副产物或未反应的原料，如N-甲基哌嗪和1-氨基-4-甲基哌嗪，且目前并没有相关文献报道N-甲基哌嗪和1-氨基-4-甲基哌嗪的检测方法。因此，开发一种能够实现对N-甲基哌嗪和1-氨基-4-甲基哌嗪的检测方法，对提高用药安全和利福平的质量控制具有重要意义。
发明内容
鉴于此，本申请提供一种利福平中有关物质的检测方法，具有优异的灵敏度、精密度和线性关系，能够满足利福平原料药中N-甲基哌嗪和1-氨基-4-甲基哌嗪的检测。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
一种利福平中有关物质的检测方法，所述检测方法至少包括以下步骤：
步骤一、配制供试品溶液和对照品溶液：
对照品溶液的配制：取N-甲基哌嗪对照品和1-氨基-4-甲基哌嗪对照品，用溶剂配制成对照品溶液；
供试品溶液的配制：取利福平样品，用溶剂配制成供试品溶液；
步骤二、采用液相色谱-质谱联用法对所述供试品溶液和所述对照品溶液进行检测，所述液相色谱的色谱条件为：
采用C18色谱柱，以体积浓度为0.8‰~1.2‰的甲酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱；
所述质谱采用ESI离子源，正离子检测，SIM模式，干燥器温度为350℃，干燥器流速为12L/min，雾化气压力为45psi，毛细管电压为3500V。
相对于现有技术，本申请提供的利福平中有关物质的检测方法具有以下优势：
本申请提供的利福平中有关物质的检测方法，实现对利福平原料药中N-甲基哌嗪、1-氨基-4-甲基哌嗪的定量和定性分析，该方法专属性强，检测限低，N-甲基哌嗪的检测限为0.203µg/mL，定量限为0.508µg/mL，1-氨基-4-甲基哌嗪的检测限为0.197µg/mL，定量限为0.492µg/mL，满足利福平原料药中N-甲基哌嗪和1-氨基-4-甲基哌嗪的检测要求，而且，其线性关系良好，重复性高，标准曲线的线性范围内的相关系数都大于0.99；此外，该检测方法还具有分析时间快，需样量少的优点，能够大大提高样品分析效率。
本发明采用液相色谱-质谱联用法对利福平中N-甲基哌嗪、1-氨基-4-甲基哌嗪进行检测，具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好等优点，能够快速、准确地对利福平原料药中的杂质N-甲基哌嗪、1-氨基-4-甲基哌嗪进行检测，整个操作过程可靠、可控，适于实际应用和推广，具有广阔的应用前景。
可选的，所述梯度洗脱的程序如下：
0min→2.8~3.2min，95%→0% 流动相A，5%→100%流动相B。
进一步可选的，所述梯度洗脱的程序如下：
0min→3min，95%→0% 流动相A，5%→100%流动相B。
梯度洗脱对检测目标物的分离效果和峰形有着显著影响，因此，本申请优选的梯度洗脱顺序不但能将N-甲基哌嗪、1-氨基-4-甲基哌嗪与利福平、或其他干扰物进行分离，分离效果优异，同时还能兼顾检测分析时间短，在0.5min内即可出现N-甲基哌嗪、1-氨基-4-甲基哌嗪的色谱峰。
可选的，所述N-甲基哌嗪的定量离子为101.0m/z，所述1-氨基-4-甲基哌嗪的定量离子为116.0m/z。
优选的定量离子使得N-甲基哌嗪和1-氨基-4-甲基哌嗪在检测条件下具有较高的响应值，提高检测的准确性。
可选的，所述流动相A为体积浓度为1‰的甲酸水溶液。
可选的，所述色谱柱的型号为Waters XBridge BEH C18。
可选的，所述色谱柱的规格为50mm×2.1mm×2.5µm。
不同的色谱柱对化合物的保留性能差别较大，因此本申请采用Waters XBridgeBEH C18柱，规格为50mm×2.1mm×2.5µm，能够实现N-甲基哌嗪和1-氨基-4-甲基哌嗪的快速有效分离，且峰形较好。
可选的，流速为0.35 mL/min ~0.45mL/min，柱温为28℃~32℃，进样体积为1μL。
进一步可选的，流速为0.4mL/min，柱温为30℃，进样体积为1μL。
优选的流速和柱温，能够使得N-甲基哌嗪和1-氨基-4-甲基哌嗪既能在短时间内出峰，减少分析时间，且分离效果优异，峰型较好。
可选的，所述溶剂为乙腈。
优选乙腈为溶剂，不仅保证能尽量少的提取除N-甲基哌嗪和1-氨基-4-甲基哌嗪之外的物质，还能尽可能的将利福平原料药中的N-甲基哌嗪和1-氨基-4-甲基哌嗪提取出来，且对液相色谱和质谱的检测无干扰，保证本发明提供的液相色谱-质谱联用法检测结果更准确。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1提供的检测N-甲基哌嗪的空白溶液的高效液相色谱图；
图2是本发明实施例1提供的检测N-甲基哌嗪的供试品溶液的高效液相色谱图；
图3是本发明实施例1提供的检测N-甲基哌嗪的对照品溶液的高效液相色谱图；
图4是本发明实施例1提供的检测N-甲基哌嗪的100%供试品加标溶液的高效液相色谱图；
图5是本发明实施例1提供的检测1-氨基-4-甲基哌嗪的空白溶液的高效液相色谱图；
图6是本发明实施例1提供的检测1-氨基-4-甲基哌嗪的供试品溶液的高效液相色谱图；
图7是本发明实施例1提供的检测1-氨基-4-甲基哌嗪的对照品溶液的高效液相色谱图；
图8是本发明实施例1提供的检测1-氨基-4-甲基哌嗪的100%供试品加标溶液的高效液相色谱图；
图9是本发明实施例5提供的N-甲基哌嗪的线性回归曲线；
图10是本发明实施例5提供的1-氨基-4-甲基哌嗪的线性回归曲线。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
本申请实施例提供一种利福平中有关物质的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
步骤一、配制空白溶液、供试品溶液、对照品溶液和100%供试品加标溶液：
空白溶液为乙腈溶剂；
供试品溶液的配制：取利福平样品50mg，精密称定，置于5mL容量瓶，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
对照品储备液的配制：分别取N-甲基哌嗪对照品和1-氨基-4-甲基哌嗪对照品62mg，精密称定，置于50mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀；再移取上述溶液1.0mL至50mL容量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液；
对照品溶液：移取上述对照品储备液2.0mL至5mL容量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；
100%供试品加标溶液：取利福平样品50mg，精密称定，置于5mL容量瓶，精密加入2.0mL对照品储备液，再加乙腈定容至刻度，摇匀，作为100%供试品加标溶液；
步骤二、检测利福平中的N-甲基哌嗪，采用液相色谱-质谱联用法对上述空白溶液、上述供试品溶液、上述对照品溶液和上述100%供试品加标溶液进行检测，记录谱图，其色谱图分别如图1、图2、图3和图4所示；
检测利福平中的1-氨基-4-甲基哌嗪，采用液相色谱-质谱联用法对上述空白溶液、上述供试品溶液、上述对照品溶液和上述100%供试品加标溶液进行检测，记录谱图，其色谱图分别如图5、图6、图7和图8所示：
上述液相色谱的色谱条件为：
采用规格为50mm×2.1mm×2.5µm的Waters XBridge BEH C18色谱柱，以体积浓度为1‰的甲酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱，流速为0.4mL/min，柱温为30℃，进样体积为1μL，其中梯度洗脱的程序如下：
0min→3min，95%→0% 流动相A，5%→100%流动相B；
所述质谱采用ESI离子源，正离子检测，SIM模式，干燥器温度为350℃，干燥器流速为12L/min，雾化气压力为45psi，毛细管电压为3500V，所述N-甲基哌嗪的定量离子为101.0m/z，所述1-氨基-4-甲基哌嗪的定量离子为116.0m/z。
从图3-图4以及图7-图8中可以看出，在保留时间为0.425min左右时出现了N-甲基哌嗪对照品和1-氨基-4-甲基哌嗪的色谱峰，且色谱峰分离度良好。
从图1-图8中可以看出，乙腈溶剂和利福平原料药对N-甲基哌嗪和1-氨基-4-甲基哌嗪的检测无干扰，说明本发明提供的液相色谱-质谱联用法专属性良好。
实施例2重复性
N-甲基哌嗪的重复性：取同一批样品，平行配制6份100%供试品加标溶液，采用液相色谱-质谱联用法进行检测，液相色谱和质谱的具体条件如实施例1所述，结果如表1所示。
其中，上述100%供试品加标溶液的配制方法为：取利福平样品50mg左右，精密称定，置于5mL容量瓶，精密加入2.0mL对照品储备液，再加乙腈定容至刻度，摇匀，作为100%供试品加标溶液。
1-氨基-4-甲基哌嗪的重复性：取同一批样品，平行配制6份100%供试品加标溶液，采用液相色谱-质谱联用法进行检测，液相色谱和质谱的具体条件如实施例1所述，结果如表1所示。
其中，上述100%供试品加标溶液的配制方法为：取利福平样品40mg左右，精密称定，置于5mL容量瓶，精密加入2.0mL对照品储备液，再加乙腈定容至刻度，摇匀，作为100%供试品加标溶液。
表1 重复性结果
Figure 460624DEST_PATH_IMAGE001
从表1中可以看出，6份分析重复性溶液中N-甲基哌嗪、1-氨基-4-甲基哌嗪的含量的RSD值分别为2.5%、6.5%，均小于10.0%，表明本申请提供的检测方法的重复性良好。
实施例3中间精密度
中间精密度溶液：取同一批样品，平行配制6份100%供试品加标溶液，分别在不同的时间在同一实验室内采用不同仪器进行液质联用检测，液相色谱和质谱的具体条件如实施例1所述，结果如表2所示。
上述100%供试品加标溶液的配制方法为：取利福平样品40mg左右，精密称定，置于5mL容量瓶，精密加入2.0mL对照品储备液，再加乙腈定容至刻度，摇匀，作为100%供试品加标溶液。
表2 中间精密度结果
Figure 708853DEST_PATH_IMAGE002
从表2中可以看出，6份中间精密度溶液中各待测物含量的RSD≤10.0%，表明本申请提供的检测方法的中间精密度良好。
实施例4 定量限和检测限
定量限溶液：移取0.5mL实施例1制备的对照品溶液至10mL容量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，作为定量限溶液。采用液相色谱-质谱联用法对上述定量限溶液进行检测，连续进样3次，结果如下表3所示，其中，液相色谱和质谱的具体条件如实施例1所述。
表3 定量限结果
Figure 382411DEST_PATH_IMAGE003
检测限溶液：移取2mL上述定量限溶液至5mL容量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，作为检测限溶液。采用液相色谱-质谱联用法对上述检测限溶液进行检测，连续进样3次，结果如下表4所示，其中，液相色谱和质谱的具体条件如实施例1所述。
表4检出限结果
Figure 846890DEST_PATH_IMAGE004
实施例5 线性关系
线性溶液：精密移取如下表5所示的不同体积的对照品储备液或对照品溶液于不同体积的容量中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得一系列不同浓度的线性溶液。其中，对照品储备液和对照品溶液的配制方法与实施例1中的一致。
表5 线性溶液
浓度水平 LOQ(5%) 10% 50% 100% 150%
对照品储备液(mL) \ \ 1.0 2.0 3.0
对照品溶液(mL) 0.5 1.0 \ \ \
容量瓶(mL) 10 10 5 5 5
将上述制备的线性溶液采用液相色谱-质谱联用法进行检测，每个浓度进样2次，其中，液相色谱和质谱的具体条件如实施例1所述，记录谱图。以N-甲基哌嗪或1-氨基-4-甲基哌嗪的浓度（μg/mL）为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程，结果见表6，线性关系图见图9和图10。从结果中可以看出，N-甲基哌嗪在0.51μg/mL~15.24μg/mL的浓度范围内线性关系良好，1-氨基-4-甲基哌嗪在0.49μg/mL~14.76μg/mL的浓度范围内线性关系良好。
表6 线性结果
Figure 46927DEST_PATH_IMAGE005
实施例6 准确度
准确度溶液：包括50%加标溶液、100%加标溶液和150%加标溶液。
50%加标溶液：取供试品50.0mg左右，置于5mL容量瓶中，加入实施例1制备的对照品储备液1.0mL，用乙腈稀释至刻度线，摇匀，即得，平行制备三份。
100%加标溶液：取供试品50.0mg左右，置于5mL容量瓶中，加入实施例1制备的对照品储备液2.0mL，用乙腈稀释至刻度线，摇匀，即得，平行制备三份。
150%加标溶液：取供试品50.0mg左右，置于5mL容量瓶中，加入实施例1制备的对照品储备液3.0mL，用乙腈稀释至刻度线，摇匀，即得，平行制备三份。
供试品溶液的配制：取利福平样品50mg左右，精密称定，置于5mL容量瓶，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。供试品溶液配制2份。
将上述制备的供试品溶液和准确度溶液，采用液相色谱-质谱联用法进行检测，液相色谱和质谱的具体条件如实施例1所述，记录谱图。回收率结果见表7。
根据以下公式计算回收率：
回收率(％)＝测得量/理论量×100％
表7 准确度结果
Figure 696083DEST_PATH_IMAGE006
从表7中可以看出，N-甲基哌嗪回收率单值范围为89.9%~113.8%，1-氨基-4-甲基哌嗪回收率单值范围为82.5%~93.2%，均在80%~120.0%之间，RDS小于10%，由此说明本申请提供的利福平中有关物质的检测方法准确度良好。
实施例7 溶液稳定性
取实施例1制备的对照品溶液分别于0h、2.5h、3.5h时，各进样1针，采用液相色谱-质谱联用法进行检测，液相色谱和质谱的具体条件如实施例1所述，记录谱图，结果如下表8所示。从表8中可以看出，对照品溶液中各待测物峰面积与0h面积比值在0.90~1.10之间，由此说明本申请提供的对照品溶液的稳定性良好。
表8
Figure 981571DEST_PATH_IMAGE007
实施例8 耐用性
将实施例1制备的对照品溶液采用液相色谱-质谱联用法进行检测，质谱具体条件如实施例1所述，对液相色谱条件进行微调：
微调一、流速调整：流速为0.35mL/min，液相色谱的其他条件与实施例1的相同.
微调二、流速调整：流速为0.45mL/min，液相色谱的其他条件与实施例1的相同。
微调三、柱温调整：柱温为28℃，液相色谱的其他条件与实施例1的相同。
微调四、柱温调整：柱温为32℃，液相色谱的其他条件与实施例1的相同。
微调五、流动相调整：流动相A为体积浓度为0.8‰的甲酸水溶液，液相色谱的其他条件与实施例1的相同。
微调六、流动相调整：流动相A为体积浓度为1.2‰的甲酸水溶液，液相色谱的其他条件与实施例1的相同。
微调七、梯度洗脱调整：梯度洗脱的程序如下所示：
0min→2.8min，95%→0% 流动相A，5%→100%流动相B，
液相色谱的其他条件与实施例1的相同。
微调八、梯度洗脱调整：梯度洗脱的程序如下所示：
0min→3.2min，95%→0% 流动相A，5%→100%流动相B，
液相色谱的其他条件与实施例1的相同。
微调一到微调八中进行液质联用检测的结果与实施例1的分离效果基本相同，且色谱峰的分离度良好，由此说明，微调色谱条件对利福平中N-甲基哌嗪和1-氨基-4-甲基哌嗪的检测无影响。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种利福平中有关物质的检测方法，其特征在于：所述检测方法至少包括以下步骤：
步骤一、配制供试品溶液和对照品溶液：
对照品溶液的配制：取N-甲基哌嗪对照品和1-氨基-4-甲基哌嗪对照品，用溶剂配制成对照品溶液；
供试品溶液的配制：取利福平样品，用溶剂配制成供试品溶液；
步骤二、采用液相色谱-质谱联用法对所述供试品溶液和所述对照品溶液进行检测，所述液相色谱的色谱条件为：
采用C18色谱柱，以体积浓度为0.8‰~1.2‰的甲酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱，所述梯度洗脱的程序如下：
0min→2.8~3.2min，95%→0% 流动相A，5%→100%流动相B；
流速为0.35mL/min ~0.45mL/min，柱温为28℃~32℃，进样体积为1μL；
所述质谱采用ESI离子源，正离子检测，SIM模式，干燥器温度为350℃，干燥器流速为12L/min，雾化气压力为45psi，毛细管电压为3500V。
2.如权利要求1所述的利福平中有关物质的检测方法，其特征在于：所述梯度洗脱的程序如下：
0min→3min，95%→0% 流动相A，5%→100%流动相B。
3.如权利要求1所述的利福平中有关物质的检测方法，其特征在于：所述N-甲基哌嗪的定量离子为 101.0m/z，所述1-氨基-4-甲基哌嗪的定量离子为116.0m/z。
4.如权利要求1所述的利福平中有关物质的检测方法，其特征在于：所述流动相A为体积浓度为1‰的甲酸水溶液。
5.如权利要求1所述的利福平中有关物质的检测方法，其特征在于：所述色谱柱的型号为Waters XBridge BEH C18。
6.如权利要求5所述的利福平中有关物质的检测方法，其特征在于：所述色谱柱的规格为50mm×2.1mm×2.5µm。
7.如权利要求1~6任一项所述的利福平中有关物质的检测方法，其特征在于：所述溶剂为乙腈。
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