JP2014092523A - 液体クロマトグラフィー−ｍａｌｄｉ質量分析法 - Google Patents

Abstract

【課題】液体クロマトグラフィーの分離モードとして塩を含む移動相を必要とする分離モードを用いた簡便なＬＣ−ＭＡＬＤＩ−ＭＳ法を提供する。
【解決手段】分析対象物質を含む試料を、塩を含む移動相を用いた液体クロマトグラフィーに付し、溶出液を得て、得られた溶出液を、脱塩することなく、ホスホン酸基を有する有機化合物をマトリックス添加剤として用いてマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析に付すことを含む液体クロマトグラフィー−質量分析法。これまで塩によるイオン化抑制を回避するために非常に制約の大きかったＬＣ−ＭＡＬＤＩ−ＭＳ法におけるＬＣ分離モードが拡充される。
【選択図】図１

Description

本発明は、液体クロマトグラフィー−マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＬＣ−ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）法に関する。より詳しくは、本発明は、液体クロマトグラフィーの分離モードとして塩を含む移動相を必要とする分離モードを用いたＬＣ−ＭＡＬＤＩ−ＭＳ法に関する。本発明は、種々の分析対象物質に適用することができるが、特に、タンパク質、ペプチド、糖ペプチド、糖鎖、脂質、及び核酸などの生体関連物質の分析に好適に適用することができる。

マトリックス支援レーザー脱離イオン化（Matrix Assisted Laser Desorption Ionization; ＭＡＬＤＩ）質量分析法は、タンパク質、ペプチド、糖ペプチド、糖鎖、脂質、及び核酸などの生体関連物質をはじめ、種々の物質の分析に非常に有用である。しかしながら、試料中の塩類やその他の夾雑物に起因するイオン化抑制は深刻な問題となる。イオン化抑制されると、本来分析されるべき物質が検出されなくなってしまう。

このため、ＬＣ−ＭＡＬＤＩ−ＭＳ法を行う場合には、ＬＣの分離モードとしては、塩を使用しない逆相モードが専ら利用されている。

特開２００６−１８９３９１号公報には、ＭＡＬＤＩ質量分析法において、試料中に存在する無機塩、界面活性剤などの夾雑物によるイオン化抑制を抑止するために、ターゲットプレート上にて、分析対象物とマトリックス分子とをシリカゲルのような多孔性微粒子の存在下で共結晶化することが開示されている（請求項１、２、５）。

一方、特開２００９−１２１８５７号公報には、ＭＡＬＤＩにおいて検出感度が低いリン酸化ペプチドの検出感度を向上させると共に、マトリックス添加剤としてリン酸を用いた場合には検出不能なペプチドを検出するために、ホスホン酸基を有する化合物をマトリックスに添加することが開示されている（請求項１）。また、ラピッド・コミュニケーションズ・イン・マス・スペクトロメトリー（Rapid Communications in Mass Spectrometry）第２２巻、２００８年、１１０９−１１１６頁にも、同様のことが開示されている。

特開２００６−１８９３９１号公報 特開２００９−１２１８５７号公報

"Sensitive detection of phosphopeptides by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: use of alkylphosphonic acids as matrix additives", Rapid Commun. Mass Spectrom. 2008; 22: 1109-1116

特開２００６−１８９３９１号公報に開示の方法は、試料中の塩類やその他の夾雑物に起因するイオン化抑制の問題を解決する手法の一つではある。しかしながら、シリカゲルのような多孔性微粒子は、水及び一般的に利用される有機溶媒に不溶であり、試料がサスペンジョンとなるため扱いにくく、ＬＣ−ＭＡＬＤＩ−ＭＳの自動化にも不向きである。また、多孔性微粒子の利用はいわゆる分子ふるい効果に基づくものであり、すなわち、塩、界面活性剤などの夾雑物を粒子の内部に浸透又は吸着させ、一方、分析対象物及びマトリックス分子は粒子の表面に保持する性質に基づくものである（同号公報段落［００１７］）。多孔性微粒子の内部に入り込まないためには、分析対象となる物質は、およそ１，０００以上の分子量のものに限られてしまう。また、同号公報には、多孔性微粒子を用いた方法をＬＣ−ＭＡＬＤＩ−ＭＳに適用し得ることは開示されていない。

特開２００９−１２１８５７号公報には、トリプシン消化はＴｒｉｓ−ＨＣｌを用いて行われており（同号公報段落［００３０］、［００３２］）、ＬＣ−ＭＡＬＤＩ−ＭＳは開示されていない。

これまで、ＬＣ−ＭＡＬＤＩ−ＭＳ法を行う場合には、ＬＣの分離モードとしては、イオン化抑制を避けるために塩を使用しない逆相モードが専ら利用されてきたために、分析対象物に応じた的確なＬＣ分離を行うことができなかった。このために、所望の良好なマススペクトルは得られなかった。あるいは、ＬＣの溶出液について、ＭＡＬＤＩ質量分析を行う前に、脱塩操作を行う必要があった。このために、操作が煩雑となり迅速な操作が妨げられ、また、試料液の脱塩の過程で分析対象物のロスが起こり、Ｓ／Ｎ比の良好なマススペクトルを得ることは難しかった。

そこで、本発明の目的は、液体クロマトグラフィーの分離モードとして塩を含む移動相を必要とする分離モードを用いた簡便なＬＣ−ＭＡＬＤＩ−ＭＳ法を提供することにある。このことにより、これまで塩によるイオン化抑制を回避するために非常に制約の大きかったＬＣ−ＭＡＬＤＩ−ＭＳ法におけるＬＣ分離モードが拡充される。

本発明者は鋭意検討の結果、本発明を完成した。本発明は、以下の発明を含む。

（１） 分析対象物質を含む試料を、塩を含む移動相を用いた液体クロマトグラフィーに付し、溶出液を得て、
得られた溶出液を、脱塩することなく、ホスホン酸基を有する化合物をマトリックス添加剤として用いてマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析に付すこと
を含む液体クロマトグラフィー−質量分析法。

（２） 前記移動相に含まれる塩は、アルカリ金属及び窒素含有化合物からなる群から選ばれる陽イオン成分と、無機酸及び有機酸からなる群から選ばれる陰イオン成分とからなる少なくとも1種の塩である、上記（１）に記載の方法。

（３） 前記移動相に含まれる塩は、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、トリス、ビストリス、ピペラジン、イミダゾール、１−メチルピペラジン、及びエタノールアミンからなる群から選ばれる有機アミン化合物又はアンモニアと、無機酸又は有機酸とからなる少なくとも1種の塩である、上記（１）又は（２）に記載の方法。

（４） 前記移動相に含まれる塩は、アルカリ金属と、リン酸及びホウ酸からなる群から選ばれる無機酸とからなる少なくとも1種の塩である、上記（１）又は（２）に記載の方法。

（５） 前記ホスホン酸基を有する化合物は、分子内にホスホン酸基を１つ又は２つ以上有する有機化合物である、上記（１）〜（４）のうちのいずれかに記載の方法。

（６） マトリックスとして、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸、シナピン酸、２，５−ジヒドロキシ安息香酸及び１，５−ジアミノナフタレンからなる群から選ばれる質量分析用マトリックスを用いる、上記（１）〜（５）のうちのいずれかに記載の方法。

（７） 前記分析対象物質は、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、糖鎖、脂質、及び核酸からなる群から選ばれる、上記（１）〜（６）のうちのいずれかに記載の方法。

（８） 前記液体クロマトグラフィーの分離モードとして、クロマトフォーカシングを用いる、上記（１）〜（７）のうちのいずれかに記載の方法。

本発明によると、液体クロマトグラフィーの分離モードとして塩を含む移動相を必要とする分離モードを用いた簡便なＬＣ−ＭＡＬＤＩ−ＭＳ法が提供される。従来は、ＬＣ−ＭＡＬＤＩ−ＭＳ法を行う場合には、ＬＣの分離モードとしては、イオン化抑制を避けるために塩を使用しない逆相モードが専ら利用されてきたために、分析対象物に応じた的確なＬＣ分離を行うことができなかった。あるいは、ＬＣの溶出液について、ＭＡＬＤＩ質量分析を行う前に、逆相カラムや多孔性微粒子を用いた脱塩操作を行う必要があった。

本発明によれば、ホスホン酸基を有する有機化合物をマトリックス添加剤として用いるので、ＬＣ移動相に使用される緩衝液（塩成分）が試料液中に含まれていても、イオン化抑制が起こることがなく、良好なマススペクトルが得られる。

このため、分析対象物に応じた的確なＬＣ分離を行うために適切な種々のＬＣ分離モード及び緩衝液（塩成分）を用いることができると共に、得られたＬＣ溶出液について、脱塩操作を行うことなく、ＭＡＬＤＩ質量分析を行うことができる。

従って、本発明の方法は、簡便且つ迅速であり、広範な種類の分析対象物に適用することができる。特に、ＬＣ分離モードとしてクロマトフォーカシングを採用し、等電点の異なるペプチドを検出できることは大きな利点である。

図１は、実施例１における結果を示す。図１（ａ）は、ＭＤＰＮＡ添加及びＭＤＰＮＡ無添加における[Glu1]-FibとACTH 18-39の各抽出イオンクロマトグラム及びｐＨ変化曲線を示す。図１（ｂ）は、[Glu1]-Fib（保持時間43分）とACTH 18-39（保持時間53分）の各マススペクトルを示す。 図２は、実施例２における結果を示す。図２（ａ）は、ＭＤＰＮＡ添加及びＭＤＰＮＡ無添加におけるＢＳＡのトリプシン消化物の各ベースピーククロマトグラムを示す。図２（ｂ）は、保持時間１６．０５分と保持時間１８．５５分の各マススペクトルを示す。 図３は、参考実験例１における結果を示す。図３（ａ−１）は、マトリックスＣＨＣＡを用いてＭＤＰＮＡ無添加の場合のマススペクトルを示し、図３（ａ−２）は、マトリックスＣＨＣＡを用いてＭＤＰＮＡ添加の場合のマススペクトルを示す。図３（ｂ−１）は、マトリックスＤＨＢを用いてＭＤＰＮＡ無添加の場合のマススペクトルを示し、図３（ｂ−２）は、マトリックスＤＨＢを用いてＭＤＰＮＡ添加の場合のマススペクトルを示す。 図４は、参考実験例２においてマトリックスＣＨＣＡを用いた場合の結果を示す。図４（１）は、基準用試料（塩なし）のマススペクトルを示し、図４（２）は、マトリックス添加剤の無添加の場合のマススペクトルを示し、図４（３）は、ＭＤＰＮＡ添加の場合のマススペクトルを示し、図４（４）は、ＥＤＰＮＡ添加の場合のマススペクトルを示し、図４（５）は、ＰＡＣ添加の場合のマススペクトルを示し、図４（６）は、ＨＥＤＰ添加の場合のマススペクトルを示す。 図５は、参考実験例２においてマトリックスＤＨＢを用いた場合の結果を示す。図５（１）は、基準用試料（塩なし）のマススペクトルを示し、図５（２）は、マトリックス添加剤の無添加の場合のマススペクトルを示し、図５（３）は、ＭＤＰＮＡ添加の場合のマススペクトルを示し、図５（４）は、ＥＤＰＮＡ添加の場合のマススペクトルを示し、図５（５）は、ＰＡＣ添加の場合のマススペクトルを示し、図５（６）は、ＨＥＤＰ添加の場合のマススペクトルを示す。 図６は、参考実験例３においてマトリックスＣＨＣＡを用いた場合の結果を示す。図６（ａ）は、ＢＳＡのトリプシン消化物についての配列包括度を示すグラフであり、図６（ｂ）は、Alcohol dehydrogenaseのトリプシン消化物についての配列包括度を示すグラフであり、図６（ｃ）は、Enolaseのトリプシン消化物についての配列包括度を示すグラフであり、図６（ｄ）は、Phosphorylase bのトリプシン消化物についての配列包括度を示すグラフである。 図７は、参考実験例３においてマトリックスＤＨＢを用いた場合の結果を示す。図７（ａ）は、ＢＳＡのトリプシン消化物についての配列包括度を示すグラフであり、図７（ｂ）は、Alcohol dehydrogenaseのトリプシン消化物についての配列包括度を示すグラフであり、図７（ｃ）は、Enolaseのトリプシン消化物についての配列包括度を示すグラフであり、図７（ｄ）は、Phosphorylase bのトリプシン消化物についての配列包括度を示すグラフである。 図８は、参考実験例４における結果を示す。図８（ａ）は、０．１％ＴＦＡ（塩なし）におけるＭＤＰＮＡ無添加（１）又はＭＤＰＮＡ添加（２）の場合のマススペクトルであり、図８（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）はそれぞれ、２５ｍＭ、３７５ｍＭ、７５０ｍＭの各濃度のピリジン／ギ酸におけるＭＤＰＮＡ無添加（１）又はＭＤＰＮＡ添加（２）の場合のマススペクトルである。 図９は、参考実験例５における結果を示す。図９（ａ−１）は、５０ｍＭのＮａＣｌ水溶液について、マトリックスＣＨＣＡを用い、ＭＤＰＮＡ無添加の場合のマススペクトルを示し、（ａ−２）は、５０ｍＭのＮａＣｌ水溶液について、マトリックスＣＨＣＡを用い、ＭＤＰＮＡ無添加の場合のマススペクトルを示す。図９（ｂ−１）は、５０ｍＭのＮａ₂ＰＯ₄水溶液について、マトリックスＣＨＣＡを用い、ＭＤＰＮＡ無添加の場合のマススペクトルを示し、（ｂ−２）は、５０ｍＭのＮａＣｌ水溶液について、マトリックスＣＨＣＡを用い、ＭＤＰＮＡ無添加の場合のマススペクトルを示す。図９（ｃ−１）は、５０ｍＭのＮａＣｌ水溶液について、マトリックスＤＨＢを用い、ＭＤＰＮＡ無添加の場合のマススペクトルを示し、（ｃ−２）は、５０ｍＭのＮａＣｌ水溶液について、マトリックスＣＨＣＡを用い、ＭＤＰＮＡ無添加の場合のマススペクトルを示す。図９（ｄ−１）は、５０ｍＭのＮａ₂ＰＯ₄水溶液について、マトリックスＤＨＢを用い、ＭＤＰＮＡ無添加の場合のマススペクトルを示し、（ｄ−２）は、５０ｍＭのＮａＣｌ水溶液について、マトリックスＣＨＣＡを用い、ＭＤＰＮＡ無添加の場合のマススペクトルを示す。

本発明のＬＣ−ＭＡＬＤＩ−ＭＳ法は、分析対象物質を含む試料を、塩を含む移動相を用いた液体クロマトグラフィー（ＬＣ）に付し、溶出液を得る工程と、
得られた溶出液を、脱塩することなく、ホスホン酸基を有する化合物をマトリックス添加剤として用いてマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）に付す工程と
を含む。

［分析対象物質］
分析対象物質は、特に限定されず、通常、質量分析の対象とされるべき種々の物質が含まれる。例えば、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、脂質、及び核酸等の生体関連物質、天然又は合成ポリマー、低分子化合物等が挙げられる。タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチドの消化されたペプチドフラグメントも分析対象となり得る。分析対象の分子量は問われない。１，０００未満の分子量のペプチドフラグメントも測定対象となり得る。１，０００未満の分子量の化合物も分析対象となることは、多孔性微粒子のふるい効果を用いる前記特開２００６−１８９３９１号公報に開示の方法に対する利点の一つである。

［液体クロマトグラフィー（ＬＣ）］
本発明においては、液体クロマトグラフィーの分離モードは、塩を含む移動相を必要とする分離モードを用いる。塩を含む移動相を必要とする分離モードであれば、その種類は問われない。例えば、逆相モード、順相モード、クロマトフォーカシング(Chromatofocusing)モード、親水性相互作用（ＨＩＬＩＣ）モード、イオン交換モード、配位子交換モード、イオン排除モード、サイズ排除モード、マルチモード、アフィニティーモード、光学分割モード等が挙げられる。

移動相は、各分離モードに合わせて適宜選択するとよい。通常、移動相は、水、緩衝剤（塩類）、及び水溶性有機溶媒を含んでいる。前記移動相に含まれる塩は、例えば、アルカリ金属及び窒素含有化合物からなる群から選ばれる陽イオン成分と、無機酸及び有機酸からなる群から選ばれる陰イオン成分とからなる少なくとも1種の塩である。陽イオン成分の窒素含有化合物としては、例えば、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、トリス、ビストリス、ピペラジン、イミダゾール、１−メチルピペラジン、及びエタノールアミン等の有機アミン化合物；アンモニア等が挙げられる。陰イオン成分の無機酸としては、ＨＣｌ、Ｈ_３ＰＯ_４、Ｈ_３ＢＯ_３、Ｈ_２ＳＯ_４、ＨＮＯ_３、Ｈ_２ＣｒＯ_４、ＨＢｒ、ＨＳＣＮ、Ｈ_２ＣＯ_３等が挙げられ、有機酸としては、ギ酸、酢酸、クエン酸、シュウ酸、フタル酸、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）等が挙げられる。また、前記移動相に含まれる塩は、例えば、Ｎａ、Ｋ等のアルカリ金属と、リン酸、ホウ酸等の無機酸とからなる少なくとも1種の塩である。

これらの塩の内から、分析対象物質に応じて適切な塩を選択して、移動相溶液のｐＨを調整するとよい。前記特開２００９−１２１８５７号公報に開示されているＴｒｉｓ−ＨＣｌでは、緩衝液のｐＨを８〜９程度の範囲には調整できるが、それ以外のｐＨ領域には調整することはできない。本発明においては、上記の塩の内から適切なものを選択することにより、非常に広範囲の例えばｐＨ２〜１０程度に調整することができる。広範囲のｐＨに調整可能なことにより、対象物質の等電点を考慮して、適切なＬＣ分離を行うことができる。特に、ＬＣ分離モードとしてクロマトフォーカシングを採用し、等電点の異なるペプチドを分離検出できることは大きな利点である。

このようにして、分析対象物質に応じた的確なＬＣ分離を行い、溶出液を得ることができる。

次に、得られた溶出液を、脱塩することなく、ホスホン酸基を有する化合物をマトリックス添加剤として用いてＭＡＬＤＩ質量分析を行う。

［マトリックス］
マトリックス（マトリクス）として、特に限定されることはなく、公知のものから適宜選択して用いるとよい。マトリックスとして、例えば、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）、シナピン酸、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）、１，５−ジアミノナフタレン等が挙げられる。

［マトリックス添加剤］
本発明において、マトリックス添加剤としてホスホン酸基を有する化合物を用いる。前記ホスホン酸基を有する化合物には、ホスホン酸（亜リン酸）も含まれるが、ホスホン酸基を有する有機化合物が好ましい。前記ホスホン酸基を有する有機化合物は、分子内にホスホン酸基を１つ有している化合物であってもよいし、又は、分子内にホスホン酸基を２つ以上有する化合物であってもよい。

分子内にホスホン酸基を１つ有している化合物として、具体的には、下記の構造式で示されるメタンホスホン酸（Methanephosphonic acid; ＭＰＮＡ）、ベンゼンホスホン酸（Benzenephosphonic acid;ＢＰＮＡ）、ホスホノ酢酸（Phosphonoacetic acid;ＰＡＣ）等が挙げられる。

分子内にホスホン酸基を２つ以上有している化合物として、具体的には、下記の構造式で示されるメタンジホスホン酸（Methanediphosphonic acid;ＭＤＰＮＡ）、エタン−１−ヒドロキシ−１，１−ジホスホン酸（Ethane-1-hydroxy-1,1-diphosphonic acid;ＨＥＤＰ）、１，２−エタンジホスホン酸（1,2-Ethanediphosphonic acid;ＥＤＰＮＡ）、ニトリロトリス（メタンホスホン酸）（Nitrilotris(methanephosphonic acid);ＮＴＭＰＮＡ）、エチレンジアミンテトラキス（メタンホスホン酸）（Ethylenediaminetetrakis(methanephosphonic acid);ＥＤＴＭＰＮＡ）等が挙げられる。これらの内でも、メタンジホスホン酸ＭＤＰＮＡ（メチレンジホスホン酸）は安価であり好ましい。

マトリックス添加剤としてホスホン酸基含有化合物を用いることにより、種々の塩が含まれているＬＣ分離された溶出液を、脱塩することなく、ＭＡＬＤＩ質量分析に付すことができる。すなわち、ＬＣで汎用されている一般的な緩衝剤に対して、ＭＡＬＤＩの耐塩性が増強され、イオン化抑制が起こることがなく、良好なマススペクトルが得られる。さらに、マススペクトルのバックグラウンドノイズとなるアルカリ金属アダクトイオンの生成が抑制される。また、これらホスホン酸基含有化合物は、いずれも水に可溶であるため、ＬＣ−ＭＡＬＤＩ−ＭＳ用自動スポッチィング装置等の装置への適用も容易である。

本発明において、マトリックス添加剤とマトリックスとの組み合わせの比率は特に制限はないが、添加剤／マトリックスのモル比が、例えば０．０１〜５０、好ましくは０．０１〜１の範囲となるようにすることができる。

本発明において、マトリックス添加剤としてのホスホン酸基含有化合物のマトリックスへの添加は、特に限定されず、ＭＡＬＤＩ質量分析装置のサンプルプレート上で、前記添加剤とマトリックスとが共存している状態となるようにすればよい。質量分析すべきＬＣ分離された溶出液、マトリックス溶液、及び前記添加剤溶液を適宜の順序でサンプルプレート上に滴下してもよい。あるいは、マトリックス添加剤とマトリックスとの混合溶液を調製しておき、質量分析すべきＬＣ分離された溶出液、前記添加剤／マトリックス混合溶液を適宜の順序でサンプルプレート上に滴下してもよい。

マトリックス添加剤及びマトリックスの混合溶液は、通常、マトリックス溶液と前記添加剤溶液とをそれぞれ調製しておき、両溶液を混合することによって調製することができる。溶媒としては、例えば、アセトニトリル（ＡＣＮ）−トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液、アセトニトリル水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液などを用いることができる。アセトニトリル−トリフルオロ酢酸水溶液におけるアセトニトリルの濃度は例えば１０〜９０体積％程度であり、トリフルオロ酢酸の濃度は例えば０．０５〜１体積％程度とするとよい。

マトリックス添加剤溶液は、例えば、０．５〜５０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは５〜１０ｍｇ／ｍＬ、例えば５ｍｇ／ｍＬの濃度の溶液に調製することができる。マトリックス溶液は、例えば、１ｍｇ／ｍＬ〜飽和濃度、好ましくは１〜１０ｍｇ／ｍＬ、例えば１０ｍｇ／ｍＬの濃度の溶液に調製することができる。これらマトリックス添加剤溶液及びマトリックス溶液は、前記の添加剤／マトリックスのモル比となるように、例えば、１０：１〜１：１０、例えば１：１の体積比で混合するとよい。

本発明において使用される質量分析装置としては、ＭＡＬＤＩイオン源と組み合わされたものであれば特に限定されない。例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間）型質量分析装置、ＭＡＬＤＩ−ＩＴ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−イオントラップ）型質量分析装置、ＭＡＬＤＩ−ＩＴ−ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−イオントラップ−飛行時間）型質量分析装置、ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴）型質量分析装置等が挙げられる。

以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。

以下において、質量分析は、ＭＡＬＤＩ分析用ターゲットプレート（島津製作所製ＡＸＩＭＡシリーズ用ＳＵＳ３０４ターゲットプレート、又はＨｕｄｓｏｎ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、島津製作所ＭＡＤＬＩ ＡＸＩＭＡ用μＦｏｃｕｓ ＭＡＬＤＩプレート）を用いて、ＡＸＩＭＡ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（島津製作所製）、又はＡＸＩＭＡ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ（島津製作所製）を用いて行った。

［実施例１］
この実施例１では、メチレンジホスホン酸（ＭＤＰＮＡ）をマトリックス添加剤として使用することで、通常は移動相に不揮発性の塩を要求するためにＬＣ−ＭＡＬＤＩ−ＭＳでは使用できないクロマトフォーカシング(Chromatofocusing)を、ＬＣ−ＭＡＬＤＩ−ＭＳのＬＣ分離モードとして使用できたことを示す。

手順：
(1) ＭＡＬＤＩ分析用ターゲット（Ｈｕｄｓｏｎ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）のすべてのウェルに２，５−ジヒドロキシ安息香酸２．５μｇとメチレンジホスホン酸１０μｇとを塗布したターゲット（ＭＤＰＮＡ添加）と、ターゲットのすべてのウェルに２，５−ジヒドロキシ安息香酸２．５μｇのみを塗布したターゲット(ＭＤＰＮＡ無添加)をそれぞれ作成した。
(2) ２５ｍＭピペラジン、及び１２．５ｍＭ １−メチルピペラジンを含む緩衝溶液を調製した。この緩衝溶液をそれぞれｐＨ５、又はｐＨ３となるように塩酸で調整した２種の緩衝溶液（ｐＨ５、又はｐＨ３）を調製した。
(3) 測定試料として、以下のペプチド：
副腎皮質刺激ホルモンフラグメントＡＣＴＨ（１８−３９）：adrenocorticotropic hormone fragment (18-39); Arg Pro Val Lys Val Tyr Pro Asn Gly Ala Glu Asp Glu Ser Ala Glu Ala Phe Pro Leu Glu Phe（配列番号１）；モノアイソトピック(monoisotopic)質量 ２４６４．２０；（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製），
繊維素ペプチドＢ：[Glu1]-Fibrinopeptide; Glu Gly Val Asn Asp Asn Glu Glu Gly Phe Phe Ser Ala Arg（配列番号２）；モノアイソトピック質量 １５６９．６７；（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）
をそれぞれ２０ｆｍｏｌ／μＬ（配列番号１）、８０ｆｍｏｌ／μＬ（配列番号２）となるように上記(2)の緩衝溶液ｐＨ５に溶解させた。
(4) 上記(2)の緩衝溶液ｐＨ５で平衡化させた弱陰イオンカラム（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＡＸ １５０ｍｍｘ０．５ｍｍ，５μｍ；ジーエルサイエンス社製）に上記(3)の測定試料０．１μＬを打ち込み、上記(2)の緩衝溶液ｐＨ３で溶出させた (クロマトフォーカシング)。液体クロマトグラフィー装置は、Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ｎａｎｏ（島津製作所製）を用いた。カラムからの溶出液を７秒ごとに上記(1)で作成した各ＭＡＬＤＩ分析用ターゲット（ＭＤＰＮＡ添加又は無添加）にウェルを順次ずらしながら塗布した。
(5) 上記(4)で溶出液を塗布したターゲット（ＭＤＰＮＡ添加、及びＭＤＰＮＡ無添加）を風乾し、ＡＸＩＭＡ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ（島津製作所製）のＭｉｄ、ポジティブモ−ドでそれぞれ計測した。

図１（ａ）に、ＭＤＰＮＡ添加及びＭＤＰＮＡ無添加における[Glu1]-FibとACTH 18-39の各抽出イオンクロマトグラム及びｐＨ変化曲線を示す。図１（ａ）において、横軸は保持時間（分）、縦軸（図示しない）はマススペクトルでのイオンの強度を表し、図中に強度１００ｍＶのスケールを示している。また、右側の縦軸は、ｐＨを表している。

図１（ｂ）に、[Glu1]-Fib（保持時間４３分）とACTH 18-39（保持時間５３分）の各マススペクトルを示す。図１（ｂ）において、横軸はｍ／ｚ、縦軸はイオンの相対強度（％）を表す。すなわち、各マススペクトル１（ＭＤＰＮＡ添加）及び３(ＭＤＰＮＡ無添加)においては、[Glu1]-Fibのイオン強度を１００％とした相対強度（％）を表し、各マススペクトル２（ＭＤＰＮＡ添加）及び４(ＭＤＰＮＡ無添加)においては、ACTH 18-39のイオン強度を１００％とした相対強度（％）を表す。

弱陰イオン交換カラムからの溶出液は多量の塩を含むため、ＭＤＰＮＡ無添加ではほとんど検出することができなかった(図１（ａ）における「無添加」：３，４)。しかし、ＭＤＰＮＡ添加ではACTH 18-39、及び[Glu1]-Fibを感度よく検出することができた(図１（ａ）における「添加」：１，２)。図１（ｂ）から、ＭＤＰＮＡを添加すると、ＬＣ溶出液サンプルのＳ／Ｎ比が著しく改善していた。クロマトフォーカシングではその保持時間から分析対象の等電点がわかるために、この等電点とマススペクトルの情報を組み合わせることで、未知の測定対象の同定に効果を発揮できる。

［実施例２］
この実施例２では、メチレンジホスホン酸（ＭＤＰＮＡ）をマトリックス添加剤として使用し、移動相に塩を要求する親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）をＬＣ分離モードとするＬＣ−ＭＡＬＤＩ−ＭＳを行った。

手順：
(1) ＭＡＬＤＩ分析用ターゲット（Ｈｕｄｓｏｎ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）のすべてのウェルに２，５−ジヒドロキシ安息香酸１．２５μｇとメチレンジホスホン酸１０μｇとを塗布したターゲット（ＭＤＰＮＡ添加）と、ターゲットのすべてのウェルに２，５−ジヒドロキシ安息香酸１．２５μｇのみを塗布したターゲット(ＭＤＰＮＡ無添加)をそれぞれ作成した。
(2) 移動相Ａ：２０ｍＭギ酸アンモニウムを含む８０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル／水 （ｐＨ４．５）と、移動相Ｂ：２０ｍＭギ酸アンモニウムの水溶液（ｐＨ４．５）を調製した。
(3) 測定試料として、市販の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）のトリプシン消化物（Ｗａｔｅｒｓ社製）を２０ｍＭ ギ酸アンモニウムを含む８０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル／水に１００ｆｍｏｌ／ｍＬとなるように溶解した。
(4) 上記(3)で調製したサンプル０．１μＬをＨＩＬＩＣカラム（ＳｅＱｕａｎｔ^ＴＭ ＺＩＣ−ＨＩＬＩＣ，１００ｍｍｘ０．１ｍｍ，３．５μｍ，２０オングストローム；メルクミリポア社製）に打ち込み、２００ｎＬ／ｍｉｎの流速で溶出させた（０−１０分，移動相Ｂ １００％；１０−３０分，移動相Ｂ ０−５０％のリニアグラジエント；３０−３５分，移動相Ｂ ５０−９５％のリニアグラジエント； ３５−４０分，移動相Ｂ ９５％)。液体クロマトグラフィー装置は、Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ｎａｎｏ（島津製作所製）を用いた。カラムからの溶出液を３０秒ごとに上記(1)で作成した各ＭＡＬＤＩ分析用ターゲット（ＭＤＰＮＡ添加又は無添加）にウェルを順次ずらしながら塗布した。
(5) 上記(4)で溶出液を塗布したターゲット（ＭＤＰＮＡ添加、及びＭＤＰＮＡ無添加）を風乾し、ＡＸＩＭＡ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ（島津製作所製）のＭｉｄ、ポジティブモ−ドでそれぞれ計測した。

図２（ａ）に、ＭＤＰＮＡ添加及びＭＤＰＮＡ無添加におけるＢＳＡのトリプシン消化物の各ベースピーククロマトグラムを示す。図２（ａ）において、横軸は保持時間（分）、縦軸（図示しない）はマススペクトルでのイオンの強度を表し、図中に強度５０ｍＶのスケールを示している。

図２（ｂ）に、図２（ａ）のＭＤＰＮＡ添加で観測された最も強度の強い方から２つのピーク：
ピーク１：保持時間１６．０５分，ＬＧＥＹＧＦＱＮＡＬＩＶＲ，Ｍ＋Ｈ：１４７９．８
ピーク２：保持時間１８．５５分，ＹＬＹＥＩＡＲ，Ｍ＋Ｈ：９２７．５
の各マススペクトルを示す（図２（ｂ）のスペクトル１，２）。また、ＭＤＰＮＡ無添加での保持時間１６．０５分、及び保持時間１８．５５分でのマススペクトルを示す（図２（ｂ）のスペクトル３，４）。横軸はｍ／ｚ、縦軸はイオンの相対強度（％）を表す。

ＨＩＬＩＣカラムからの溶出液は２０ｍＭギ酸アンモニウムを含むため、ＭＤＰＮＡ無添加ではＢＳＡのトリプシン消化物に由来するピークをベースピーククロマトグラムでは確認することができなかった（図２（ａ）の「無添加」）。しかし、ＭＤＰＮＡ添加ではＢＳＡのトリプシン消化物に由来する複数のピークを感度よく検出することができた（図２（ａ）の「添加」）。図２（ｂ）に示すように、ＭＤＰＮＡ添加ではＢＳＡのトリプシン消化物であるＬＧＥＹＧＦＱＮＡＬＩＶＲ、及びＹＬＹＥＩＡＲのピークをマスクロマトグラム上でも明確にＳ／Ｎ比よく確認できた。一方、ＭＤＰＮＡ無添加では、これらのピークを確認できなかった。また、ＭＳ／ＭＳイオンサーチによりＭＤＰＮＡ添加サンプルではＢＳＡを同定することができたが、ＭＤＰＮＡ無添加サンプルではＢＳＡトリプシン消化物に由来するピークを一切検出できなかった。

ＨＩＬＩＣは近年、糖鎖や糖ペプチド等の逆相カラムに保持しにくい測定対象の保持を可能にする分離モードとして注目を集めている。本発明の方法は、ＨＩＬＩＣをＬＣ分離モードとしたＬＣ−ＭＡＬＤＩ−ＭＳにも有用であることが示された。

［参考実験例１］
この参考実験例１では、ＬＣの各種分離モードにおける移動相に使用され得る塩類を用いた場合に、メチレンジホスホン酸（ＭＤＰＮＡ）をマトリックス添加剤として使用し、マトリクスとしてα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）又は２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）を使用して、ＭＡＬＤＩ−ＭＳを行った。

手順：
(1) トリスヒドロキシメチルアミノメタン、ビストリス、ピペラジン、イミダゾール、１−メチルピペラジン、及びジエタノールアミンの混合緩衝溶液（各５ｍＭ）を調製し、塩酸でｐＨ８．０に調整した。
(2)測定対象となる７種類のペプチド：
アンジオテンシンＩ(Ａｎｇ Ｉ); Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe His Leu（配列番号３）； モノアイソトピック(monoisotopic)質量 １２９５．６８；（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製），
アンジオテンシンII （Ａｎｇ II）; Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe（配列番号４）； モノアイソトピック質量 １０４５．５４；（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製），
繊維素ペプチドＢ：[Glu1]-Fibrinopeptide; Glu Gly Val Asn Asp Asn Glu Glu Gly Phe Phe Ser Ala Arg（配列番号２）； モノアイソトピック質量 １５６９．６７；（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製），
Ｎ−アセチル−レニン基質 テトラデカペプチド：N-Acetyl-Renin; NAc-Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe His Leu Leu Val Tyr Ser（配列番号５）； モノアイソトピック質量 １７９９．９４；（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製），
副腎皮質刺激ホルモンフラグメントＡＣＴＨ（１−１７）：adrenocorticotropic hormone fragment (1-17); Ser Tyr Ser Met Glu His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Val Gly Lys Lys Arg（配列番号６）； モノアイソトピック質量 ２０９２．０８；（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製），
副腎皮質刺激ホルモンフラグメントＡＣＴＨ（１８−３９）：adrenocorticotropic hormone fragment (18-39); Arg Pro Val Lys Val Tyr Pro Asn Gly Ala Glu Asp Glu Ser Ala Glu Ala Phe Pro Leu Glu Phe（配列番号１）； モノアイソトピック質量 ２４６４．２０；（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製），
副腎皮質刺激ホルモンフラグメントＡＣＴＨ（７−３８）：adrenocorticotropic hormone fragment (7-38); Phe Arg Trp Gly Lys Pro Val Gly Lys Lys Arg Arg Pro Val Lys Val Tyr Pro Asn Gly Ala Glu Asp Glu Ser Ala Glu Ala Phe Pro Leu Glu（配列番号７）； モノアイソトピック質量 ３６５６．９３；（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）

を上記(1)の塩を含む混合緩衝溶液に溶解させ、ペプチド混合試料溶液を調製した。この際、ＡＣＴＨ（７−３８）は３００ｆｍｏｌ／μＬ、その他の各ペプチドは２００ｆｍｏｌ／μＬとなるようにペプチド混合試料溶液を調製した。
(3) マトリックスとして、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）を５ｍｇ／ｍＬとなるように０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル／水溶液に溶解した。
また、別途、マトリックスとして、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）を５ｍｇ／ｍＬとなるように０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル／水溶液に溶解した。
(4) メチレンジホスホン酸（ＭＤＰＮＡ）を１％（ｗ／ｖ）となるように水に溶解した。
(5) ＭＡＬＤＩ分析用ターゲット（島津製作所製）のウェル上に、上記(2)のペプチド混合試料溶液０．５μＬと上記(3)のマトリックス溶液（ＣＨＣＡ又はＤＨＢ）０．５μＬとを滴下し混合した(on-target mix法)。
(6)上記(4)のＭＤＰＮＡ水溶液０．５μＬをさらに各ウェルに滴下したものをＭＤＰＮＡ添加試料とした。ＭＤＰＮＡ水溶液０．５μＬの代わりに超純水０．５μＬを各ウェルに滴下したものをＭＤＰＮＡ無添加試料とした。
(7) 上記(6)のターゲット（ＭＤＰＮＡ添加、及びＭＤＰＮＡ無添加）を風乾し、ＡＸＩＭＡ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（島津製作所製）のリニア、ポジティブモ−ドで計測した。

図３（ａ−１）は、マトリックスＣＨＣＡを用いてＭＤＰＮＡ無添加の場合のマススペクトルを示し、図３（ａ−２）は、マトリックスＣＨＣＡを用いてＭＤＰＮＡ添加の場合のマススペクトルを示す。図３（ｂ−１）は、マトリックスＤＨＢを用いてＭＤＰＮＡ無添加の場合のマススペクトルを示し、図３（ｂ−２）は、マトリックスＤＨＢを用いてＭＤＰＮＡ添加の場合のマススペクトルを示す。横軸はｍ／ｚ、縦軸はイオンの相対強度（％）を表す。

図３（ａ−１）、及び（ｂ−１）に示すように、ＭＤＰＮＡ無添加ではいずれのマトリックスＣＨＣＡ及びＤＨＢの場合にもサンプルのイオン化抑制が起こると共に、プロトン付加イオン［Ｍ＋Ｈ］⁺のみならず、カリウム付加イオン［Ｍ＋Ｋ］⁺ が生じ複雑なマススペクトルとなっている。一方、図３（ａ−２）、及び（ｂ−２）に示すように、ＭＤＰＮＡ添加することで、いずれのマトリックスＣＨＣＡ及びＤＨＢの場合にも顕著にＳ／Ｎ比が改善され、カリウム付加イオン［Ｍ＋Ｋ］⁺ 等もほとんど生じずに単純な明快なマススペクトルを得ることができた。

このように、本発明は、ＬＣの各種分離モードにおける移動相に使用され得る塩類を用いた場合に適用できることが示された。

［参考実験例２］
この参考実験例２では、ホスホン酸基含有マトリックス添加剤として、メチレンジホスホン酸（ＭＤＰＮＡ）の他に、１，２−エタンジホスホン酸（ＥＤＰＮＡ）、ホスホノ酢酸（ＰＡＣ）、又はエタン−１−ヒドロキシ−１，１−ジホスホン酸（ＨＥＤＰ）をそれぞれ用いて、マトリクスとしてα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）又は２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）を使用して、ＭＡＬＤＩ−ＭＳを行った。

手順：
(1) トリスヒドロキシメチルアミノメタン、ビストリス、ピペラジン、イミダゾール、１−メチルピペラジン、及びジエタノールアミンの混合緩衝溶液（各５ｍＭ）を調製し、塩酸でｐＨ８．０に調整した。
(2) 測定対象となる７種類のペプチド：
Ａｎｇ Ｉ（配列番号３），
Ａｎｇ II（配列番号４），
[Glu1]-Fib（配列番号２），
N-Acetyl-Renin（配列番号５），
ＡＣＴＨ（１−１７）（配列番号６），
ＡＣＴＨ（１８−３９）（配列番号１），
ＡＣＴＨ（７−３８）（配列番号７）
を上記(1)の塩を含む混合緩衝溶液に溶解させ、ペプチド混合試料溶液を調製した。この際、ＡＣＴＨ（７−３８）は３００ｆｍｏｌ／μＬ、その他の各ペプチドは２００ｆｍｏｌ／μＬとなるようにペプチド混合試料溶液を調製した。
また、別途、上記７種類のペプチドを、基準用として、上記(1)の塩を含む混合緩衝溶液の代わりに０．１％ＴＦＡ水溶液（塩を含まない）に溶解させたペプチド混合試料溶液を調製した。
(3) マトリックスとして、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）を５ｍｇ／ｍＬとなるように０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル／水溶液に溶解した。
また、別途、マトリックスとして、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）を５ｍｇ／ｍＬとなるように０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル／水溶液に溶解した。
(4) メチレンジホスホン酸（ＭＤＰＮＡ）を１％（ｗ／ｖ）となるように水に溶解した。
また、別途、１，２−エタンジホスホン酸（ＥＤＰＮＡ）を１％（ｗ／ｖ）となるように水に溶解した。ホスホノ酢酸（ＰＡＣ）を１％（ｗ／ｖ）となるように水に溶解した。エタン−１−ヒドロキシ−１，１−ジホスホン酸（ＨＥＤＰ）を１％（ｗ／ｖ）となるように水に溶解した。このようにして、各添加剤溶液を調製した。
(5) ＭＡＬＤＩ分析用ターゲットのウェル上に、上記(2)のペプチド混合試料溶液０．５μＬと上記(3)のマトリックス溶液（ＣＨＣＡ又はＤＨＢ）０．５μＬを滴下し混合した(on-target mix法)。
(6)上記(4)のＭＤＰＮＡ水溶液０．５μＬをさらに各ウェルに滴下したものをＭＤＰＮＡ添加試料とした。同様に、ＥＤＰＮＡ水溶液０．５μＬをさらに各ウェルに滴下したものをＥＤＰＮＡ添加試料とした。ＰＡＣ水溶液０．５μＬをさらに各ウェルに滴下したものをＰＡＣ添加試料とした。ＨＥＤＰ水溶液０．５μＬをさらに各ウェルに滴下したものをＨＥＤＰ添加試料とした。
ＭＤＰＮＡ水溶液０．５μＬの代わりに超純水０．５μＬを各ウェルに滴下したものを無添加試料とした。
また、上記(5)で得られた基準用のペプチド混合試料溶液にも、超純水０．５μＬを各ウェルに滴下し、これを基準用試料（塩なし）とした。
(7) 上記(6)のターゲット（ＭＤＰＮＡ添加、及びＭＤＰＮＡ無添加）を風乾し、ＡＸＩＭＡ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（島津製作所製）のリニア、ポジティブモ−ドで計測した。

図４にマトリックスＣＨＣＡを用いた場合の結果を示す。
図４（１）は、基準用試料（塩なし）のマススペクトルを示し、図４（２）は、マトリックス添加剤の無添加の場合のマススペクトルを示し、図４（３）は、ＭＤＰＮＡ添加の場合のマススペクトルを示し、図４（４）は、ＥＤＰＮＡ添加の場合のマススペクトルを示し、図４（５）は、ＰＡＣ添加の場合のマススペクトルを示し、図４（６）は、ＨＥＤＰ添加の場合のマススペクトルを示す。横軸はｍ／ｚ、縦軸はイオンの相対強度（％）を表す。

図５にマトリックスＤＨＢを用いた場合の結果を示す。
図５（１）は、基準用試料（塩なし）のマススペクトルを示し、図５（２）は、マトリックス添加剤の無添加の場合のマススペクトルを示し、図５（３）は、ＭＤＰＮＡ添加の場合のマススペクトルを示し、図５（４）は、ＥＤＰＮＡ添加の場合のマススペクトルを示し、図４（５）は、ＰＡＣ添加の場合のマススペクトルを示し、図５（６）は、ＨＥＤＰ添加の場合のマススペクトルを示す。横軸はｍ／ｚ、縦軸はイオンの相対強度（％）を表す。

マトリックスＣＨＣＡを用いた場合に、図４（１）に示すように、０．１％ＴＦＡを用いた基準用試料には塩が含まれていないイオン化抑制が起こらずに良好なマススペクトルが得られた。しかしながら、図４（２）に示すように、ホスホン酸基含有マトリックス添加剤が無添加の場合には、緩衝剤塩類によりイオン化が抑制されＳ／Ｎ比が低くなり、且つ、７種のペプチドの内のいくつかのペプチドは検出されなかった。これに対して、ホスホン酸基含有マトリックス添加剤を用いた場合には、図４（３）〜（６）に示すように、いずれも、イオン化抑制は起こらず、Ｓ／Ｎ比よく、７種の全てのペプチドが検出された。

マトリックスＤＨＢを用いた場合にも、図５（１）〜（６）に示すように、ホスホン酸基含有マトリックス添加剤による同様の効果が見られた。

このように、ホスホン酸基含有マトリックス添加剤によって、ＭＡＬＤＩの耐塩性が増強された。

［参考実験例３］
この参考実験例３では、メチレンジホスホン酸（ＭＤＰＮＡ）をマトリックス添加剤として使用し、マトリクスとしてα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）又は２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）を使用して、種々のタンパク質のトリプシン消化物 (複数のペプチドの混合物) をサンプルとして、ＭＡＬＤＩ−ＭＳを行った。ホスホン酸基含有マトリックス添加剤が、種々のペプチドに対して効果を発揮できることを示す。

手順：
(1) トリスヒドロキシメチルアミノメタン、ビストリス、ピペラジン、イミダゾール、１−メチルピペラジン、及びジエタノールアミンの混合緩衝溶液（各５ｍＭ）を調製し、塩酸でｐＨ６．０、又はｐＨ８．０に調整した２種の緩衝溶液（ｐＨ６、又はｐＨ８）を調製した。
(2) 測定対象となる４種類のタンパク質：
牛血清アルブミン（ＢＳＡ），
酵母アルコール脱水素酵素 (Alcohol dehydrogenase),
酵母エノラーゼ (Enolase),
ウサギグリコーゲンホスホリラーゼｂ (Phosphorylase b)
の各トリプシン消化物（すべてＷａｔｅｒｓ社製）を、２００ｆｍｏｌ／μＬとなるようにそれぞれ上記(1)の塩を含む緩衝溶液ｐＨ６又はｐＨ８に溶解させ、各試料溶液（ｐＨ６又はｐＨ８）とした。
また、別途、上記４種類のタンパク質の各トリプシン消化物を、基準用として、上記(1)の塩を含む混合緩衝溶液の代わりに０．１％ＴＦＡ水溶液（塩を含まない）に溶解させた試料溶液を調製した。
(3) マトリックスとして、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）を５ｍｇ／ｍＬとなるように０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル／水溶液に溶解した。
また、別途、マトリックスとして、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）を５ｍｇ／ｍＬとなるように０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル／水溶液に溶解した。
(4) メチレンジホスホン酸（ＭＤＰＮＡ）を１％（ｗ／ｖ）となるように水に溶解した。
(5) ＭＡＬＤＩ分析用ターゲットのウェル上に、上記(2)の各試料溶液０．５μＬと上記(3)のマトリックス溶液（ＣＨＣＡ又はＤＨＢ）０．５μＬを滴下し混合した(on-target mix法)。
(6) 上記(4)のＭＤＰＮＡ水溶液０．５μＬをさらに各ウェルに滴下したものをＭＤＰＮＡ添加試料とした。ＭＤＰＮＡ水溶液０．５μＬの代わりに超純水０．５μＬを各ウェルに滴下したものをＭＤＰＮＡ無添加試料とした。
(7) 上記(6)のターゲット（ＭＤＰＮＡ添加、及びＭＤＰＮＡ無添加）を風乾し、ＡＸＩＭＡ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（島津製作所製）のリフレクトロン、ポジティブモ−ドで計測した。
(8) ペプチドマスフィンガープリンティング法により、配列包括度を算出した。

図６にマトリックスＣＨＣＡを用いた場合の結果を示す。
図６（ａ）は、ＢＳＡのトリプシン消化物についての配列包括度を示すグラフであり、図６（ｂ）は、Alcohol dehydrogenaseのトリプシン消化物についての配列包括度を示すグラフであり、図６（ｃ）は、Enolaseのトリプシン消化物についての配列包括度を示すグラフであり、図６（ｄ）は、Phosphorylase bのトリプシン消化物についての配列包括度を示すグラフである。各横軸に、塩なし（基準用）、緩衝溶液ｐＨ６、緩衝溶液ｐＨ８それぞれについて、ＭＤＰＮＡ添加及びＭＤＰＮＡ無添加を示し、縦軸は配列包括度（％）を表している。なお、Ｎ．Ｄ．は、ペプチドマスフィンガープリンティング法で同定できなかったことを示す。

図７にマトリックスＤＨＢを用いた場合の結果を示す。
図７（ａ）は、ＢＳＡのトリプシン消化物についての配列包括度を示すグラフであり、図７（ｂ）は、Alcohol dehydrogenaseのトリプシン消化物についての配列包括度を示すグラフであり、図７（ｃ）は、Enolaseのトリプシン消化物についての配列包括度を示すグラフであり、図７（ｄ）は、Phosphorylase bのトリプシン消化物についての配列包括度を示すグラフである。各横軸に、塩なし（基準用）、緩衝溶液ｐＨ６、緩衝溶液ｐＨ８それぞれについて、ＭＤＰＮＡ添加及びＭＤＰＮＡ無添加を示し、縦軸は配列包括度（％）を表している。なお、Ｎ．Ｄ．は、ペプチドマスフィンガープリンティング法で同定できなかったことを示す。

図６（ａ）〜（ｄ）に示すように、マトリックスＣＨＣＡを用いた場合に、各タンパク質のトリプシン消化物について、緩衝溶液ｐＨ６又はｐＨ８に溶解したサンプルでは、ＭＤＰＮＡ無添加では緩衝溶液に含まれる塩によるイオン化抑制が起こり、「塩なし」に比べて極端に配列包括度が下がっていた。一方、ＭＤＰＮＡ添加すると、イオン化抑制が抑制されたので、緩衝溶液ｐＨ６又はｐＨ８に溶解したサンプルであっても、「塩なし」と同等レベルの高い配列包括度が達成された。

図７（ａ）〜（ｄ）に示すように、マトリックスＤＨＢを用いた場合に、各タンパク質のトリプシン消化物について、ＭＤＰＮＡ無添加では緩衝溶液に含まれる塩によるイオン化抑制が起こり、同定不能となった。一方、ＭＤＰＮＡ添加すると、イオン化抑制が抑制されたので、緩衝溶液ｐＨ６又はｐＨ８に溶解したサンプルであっても、「塩なし」と同等レベルの高い配列包括度が達成された。これらの結果から、ＭＤＰＮＡマトリックス添加剤は幅広い種類のペプチドに対して効果を発揮できることが示された。

［参考実験例４］
この参考実験例４では、試料溶液中の塩濃度を変化させて、メチレンジホスホン酸（ＭＤＰＮＡ）をマトリックス添加剤として使用することにより、ＭＡＬＤＩ−ＭＳにおける耐塩性が向上したことを示す。

手順：
(1)０．１％ＴＦＡ水溶液（塩を含まない）を調製した。また、２５ｍＭ、３７５ｍＭ、７５０ｍＭの各濃度のピリジン／ギ酸水溶液（ｐＨ３．５）をそれぞれ調製した。
(2) 測定対象となる５種類のタンパク質：
牛血清アルブミン（ＢＳＡ），
酵母アルコール脱水素酵素 (Alcohol dehydrogenase),
酵母エノラーゼ (Enolase),
ウサギグリコーゲンホスホリラーゼ ｂ(Phosphorylase b)，
牛ヘモグロビン (Bovine Hemoglobin)
の各トリプシン消化物（すべてＷａｔｅｒｓ社製）をそれぞれ８０ｆｍｏｌ／μＬとなるように上記(1)の各溶液に溶解させ、各試料溶液とした。
(3) マトリックスとして、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）を５ｍｇ／ｍＬとなるように０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル／水溶液に溶解した。
(4) メチレンジホスホン酸（ＭＤＰＮＡ）を１％（ｗ／ｖ）となるように水に溶解した。
(5) ＭＡＬＤＩ分析用ターゲットのウェル上に、上記(2)の各試料溶液０．５μＬと上記(3)のマトリックス溶液（ＣＨＣＡ）０．５μＬを滴下し混合した(on-target mix法)。
(6) 上記(4)のＭＤＰＮＡ水溶液０．５μＬをさらに各ウェルに滴下したものをＭＤＰＮＡ添加試料とした。ＭＤＰＮＡ水溶液０．５μＬの代わりに超純水０．５μＬを各ウェルに滴下したものをＭＤＰＮＡ無添加試料とした。
(7) 上記(6)のターゲット（ＭＤＰＮＡ添加、及びＭＤＰＮＡ無添加）を風乾し、ＡＸＩＭＡ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（島津製作所製）のリフレクトロン、ポジティブモ−ドで計測した。

図８は、５種類のタンパク質のトリプシン消化物をＭＡＬＤＩ−ＭＳで測定したときのマススペクトルである。図８（ａ）は、０．１％ＴＦＡ（塩なし）におけるＭＤＰＮＡ無添加（１）又はＭＤＰＮＡ添加（２）の場合のマススペクトルであり、図８（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）はそれぞれ、２５ｍＭ、３７５ｍＭ、７５０ｍＭの各濃度のピリジン／ギ酸におけるＭＤＰＮＡ無添加（１）又はＭＤＰＮＡ添加（２）の場合のマススペクトルである。

図８に示すように、２５ｍＭから７５０ｍＭと緩衝溶液の塩濃度が上がるにつれてＭＤＰＮＡ無添加（１）ではほとんどペプチド由来のピークが検出されなくなった。一方、ＭＤＰＮＡを添加すると、３７５ｍＭ（図ｃ）、７５０ｍＭ（図ｄ）という非常に高い塩濃度の緩衝溶液であっても、イオン化抑制が抑制されたので、タンパク質のトリプシン消化物ペプチドに由来するピークが観察できた。例えば、上記５種類のタンパク質の各トリプシン消化物のうち、
ＢＳＡ消化物，ＹＬＹＥＩＡＲ(図中の記号：●)，Ｍ＋Ｈ：９２７．５８；
Ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ消化物，ＳＩＳＩＶＧＳＹＶＧＮＲ (図中の記号：▲)，Ｍ＋Ｈ：１２５２．１０, 及びＡＮＥＬＬＩＮＶＫ(図中の記号：■)，Ｍ＋Ｈ：１０１４．６８；
Ｅｎｏｌａｓｅ消化物，ＶＮＱＩＧＴＬＳＥＳＩＫ（図中の記号▼），Ｍ＋Ｈ：１２８８．９９；
Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ ｂ消化物，ＨＬＱＩＩＹＥＩＮＱＲ（図中の記号★），Ｍ＋Ｈ：１４２７．４３，ＶＡＡＡＦＰＧＤＶＤＲ（図中の記号○），Ｍ＋Ｈ：１１１７．７７，ＤＦＹＥＬＥＰＨＫ（図中の記号△），Ｍ＋Ｈ：１１７７．９４，ＬＬＳＹＶＤＤＥＡＦＩＲ（図中の記号□），Ｍ＋Ｈ：１４４１．３２，及びＶＩＦＬＥＮＹＲ（図中の記号▽），Ｍ＋Ｈ：１０５３．７５；
Ｂｏｖｉｎｅ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ消化物，ＶＶＡＧＶＡＮＡＬＡＨＲ（図中の記号☆），Ｍ＋Ｈ：１１７７．９４，及びＦＬＡＮＶＳＴＶＬＴＳＫ（図中の記号◎），Ｍ＋Ｈ：１２８０．０８
に由来するピークなどが観察できた。

［参考実験例５］
この参考実験例５では、試料溶液中の無機塩に対して、メチレンジホスホン酸（ＭＤＰＮＡ）をマトリックス添加剤として使用することにより、ＭＡＬＤＩ−ＭＳにおける耐塩性が向上したことを示す。

手順：
(1)５０ｍＭのＮａＣｌ水溶液、及び５０ｍＭのＮａ₂ＰＯ₄水溶液（ｐＨ９．０）をそれぞれ調製した。
(2) 測定対象となる７種類のペプチド：
Ａｎｇ Ｉ（配列番号３），
Ａｎｇ II（配列番号４），
[Glu1]-Fib（配列番号２），
N-Acetyl-Renin（配列番号５），
ＡＣＴＨ（１−１７）（配列番号６），
ＡＣＴＨ（１８−３９）（配列番号１），
ＡＣＴＨ（７−３８）（配列番号７）
を上記(1)の塩を含む各緩衝溶液（ＮａＣｌ、又はＮａ₂ＰＯ₄）に溶解させ、ペプチド混合試料溶液を調製した。この際、ＡＣＴＨ（７−３８）は６００ｆｍｏｌ／μＬ、その他の各ペプチドは４００ｆｍｏｌ／μＬとなるようにペプチド混合試料溶液を調製した。
(3) マトリックスとして、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）を５ｍｇ／ｍＬとなるように０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル／水溶液に溶解した。
また、別途、マトリックスとして、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）を５ｍｇ／ｍＬとなるように０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル／水溶液に溶解した。
(4) メチレンジホスホン酸（ＭＤＰＮＡ）を１％（ｗ／ｖ）となるように水に溶解した。
(5) ＭＡＬＤＩ分析用ターゲットのウェル上に、上記(2)の各試料溶液０．５μＬと上記(3)のマトリックス溶液（ＣＨＣＡ又はＤＨＢ）０．５μＬを滴下し混合した(on-target mix法)。
(6) 上記(4)のＭＤＰＮＡ水溶液０．５μＬをさらに各ウェルに滴下したものをＭＤＰＮＡ添加試料とした。ＭＤＰＮＡ水溶液０．５μＬの代わりに超純水０．５μＬを各ウェルに滴下したものをＭＤＰＮＡ無添加試料とした。
(7) 上記(6)のターゲット（ＭＤＰＮＡ添加、及びＭＤＰＮＡ無添加）を風乾し、ＡＸＩＭＡ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（島津製作所製）のリニアＴＯＦ、ポジティブモ−ドで計測した。

図９に得られたマススペクトルを示す。横軸はｍ／ｚ、縦軸はイオンの相対強度（％）を表す。

図９（ａ−１）は、５０ｍＭのＮａＣｌ水溶液について、マトリックスＣＨＣＡを用い、ＭＤＰＮＡ無添加の場合のマススペクトルを示し、（ａ−２）は、５０ｍＭのＮａＣｌ水溶液について、マトリックスＣＨＣＡを用い、ＭＤＰＮＡ無添加の場合のマススペクトルを示す。
図９（ｂ−１）は、５０ｍＭのＮａ₂ＰＯ₄水溶液について、マトリックスＣＨＣＡを用い、ＭＤＰＮＡ無添加の場合のマススペクトルを示し、（ｂ−２）は、５０ｍＭのＮａＣｌ水溶液について、マトリックスＣＨＣＡを用い、ＭＤＰＮＡ無添加の場合のマススペクトルを示す。
図９（ｃ−１）は、５０ｍＭのＮａＣｌ水溶液について、マトリックスＤＨＢを用い、ＭＤＰＮＡ無添加の場合のマススペクトルを示し、（ｃ−２）は、５０ｍＭのＮａＣｌ水溶液について、マトリックスＣＨＣＡを用い、ＭＤＰＮＡ無添加の場合のマススペクトルを示す。
図９（ｄ−１）は、５０ｍＭのＮａ₂ＰＯ₄水溶液について、マトリックスＤＨＢを用い、ＭＤＰＮＡ無添加の場合のマススペクトルを示し、（ｄ−２）は、５０ｍＭのＮａＣｌ水溶液について、マトリックスＣＨＣＡを用い、ＭＤＰＮＡ無添加の場合のマススペクトルを示す。なお、ｍ／ｚ：３６００−３８００の領域においては、相対強度のスケールを１０倍に拡大して表示している。

図９（ａ−１），（ｂ−１），（ｃ−１），（ｄ−１）に示すように、ＭＤＰＮＡ無添加の場合には、無機塩によりイオン化が抑制されＳ／Ｎ比が低くなり、且つ、７種のペプチドの内のいくつかのペプチドは検出されなかった。これに対して、ＭＤＰＮＡを添加すると、図９（ａ−２），（ｂ−２），（ｃ−２），（ｄ−２）に示すように、いずれも、イオン化抑制は起こらず、Ｓ／Ｎ比よく、７種の全てのペプチドが検出された。

このように、ホスホン酸基含有マトリックス添加剤によって、無機塩に対してもＭＡＬＤＩの耐塩性が増強された。

Claims (8)

1. 分析対象物質を含む試料を、塩を含む移動相を用いた液体クロマトグラフィーに付し、溶出液を得て、
   得られた溶出液を、脱塩することなく、ホスホン酸基を有する化合物をマトリックス添加剤として用いてマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析に付すこと
   を含む液体クロマトグラフィー−質量分析法。
2. 前記移動相に含まれる塩は、アルカリ金属及び窒素含有化合物からなる群から選ばれる陽イオン成分と、無機酸及び有機酸からなる群から選ばれる陰イオン成分とからなる少なくとも1種の塩である、請求項１に記載の方法。
3. 前記移動相に含まれる塩は、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、トリス、ビストリス、ピペラジン、イミダゾール、１−メチルピペラジン、及びエタノールアミンからなる群から選ばれる有機アミン化合物又はアンモニアと、無機酸又は有機酸とからなる少なくとも1種の塩である、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記移動相に含まれる塩は、アルカリ金属と、リン酸及びホウ酸からなる群から選ばれる無機酸とからなる少なくとも1種の塩である、請求項１又は２に記載の方法。
5. 前記ホスホン酸基を有する化合物は、分子内にホスホン酸基を１つ又は２つ以上有する有機化合物である、請求項１〜４のうちのいずれかに記載の方法。
6. マトリックスとして、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸、シナピン酸、２，５−ジヒドロキシ安息香酸及び１，５−ジアミノナフタレンからなる群から選ばれる質量分析用マトリックスを用いる、請求項１〜５のうちのいずれかに記載の方法。
7. 前記分析対象物質は、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、糖鎖、脂質、及び核酸からなる群から選ばれる、請求項１〜６のうちのいずれかに記載の方法。
8. 前記液体クロマトグラフィーの分離モードとして、クロマトフォーカシングを用いる、請求項１〜７のうちのいずれかに記載の方法。

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