JP7400139B1 - 枝角種属由来を高速で鑑別する特徴的ポリペプチドライブラリー及びその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
上記の特徴的ポリペプチドにおいて、
ペプチドセグメント7は配列FFEHFGDLSSADAVmGNPKであり、mはMの酸化翻訳後修飾であり、
ペプチドセグメント9は配列FFEHFGDLSTPDAVmGNPKであり、mはMの酸化翻訳後修飾であり、
ペプチドセグメント10は配列VVAGVAnALAHRであり、nはNの脱アミド翻訳後修飾であり、
ペプチドセグメント11は配列FFEHFGDLSTADAVmGNPKであり、mはMの酸化翻訳後修飾である。
(1)サンプルにおいて、ヘラジカ対照生薬に対応するペプチドセグメント1又はペプチドセグメント2又はペプチドセグメント3を検出していると、サンプルはヘラジカ由来であり、
(2)サンプルにおいて、トナカイ対照生薬に対応するペプチドセグメント4又はペプチドセグメント5又はペプチドセグメント6を検出していると、サンプルはトナカイ由来であり、
(3)サンプルにおいて、オジロジカ対照生薬に対応するペプチドセグメント7を検出していると、サンプルはオジロジカ由来であり、
(4)サンプルにおいて、クチジロジカ対照生薬に対応するペプチドセグメント8を検出していると、サンプルはクチジロジカ由来であり、
(5)サンプルにおいて、ダマジカ対照生薬に対応するペプチドセグメント9を検出しているが、ペプチドセグメント8とペプチドセグメント11を検出していないと、サンプルはダマジカ由来であり、
(6)サンプルにおいて、ニホンジカ対照生薬に対応するペプチドセグメント10を検出しているとともに、ペプチドセグメント11を検出していると、サンプルはニホンジカ由来であり、
(7)サンプルにおいて、アカシカ対照生薬に対応するペプチドセグメント11を検出しているが、ペプチドセグメント10を検出していないと、サンプルはアカシカ由来であるとする使用を提供する。
サンプルを製造する際には、サンプルを粉砕して、篩にかけ、粉末50mgを秤量して、変性緩衝液10mLを加え、よく混ぜて、80℃で一晩処理し、取り出して室温まで放冷し、12000rで10分遠心分離し、サンプル抽出液を500μL取り、分子量3kDaの限外濾過遠心分離管を用いてサンプルに脱塩と酵素分解を行うステップ(1)と、
高速液体クロマトグラフィー-トリプル四重極質量分析計により同定を行うステップ(2)と、を含む。
シースガス流速は46L/hr、補助ガス流速は850L/hr;スプレー電圧は3.5KV;イオン源温度は150℃、補助ガス温度は400℃、コーン電圧は30V、衝突電圧は35V、溶媒遅延(solvent delay)は0~4min及び16~20minとする。
(1)本発明では、高速液体クロマトグラフィー-トリプル四重極質量分析方法を用いることで、7種類の鹿科動物を鑑別、同定することができ、効率が高く、特異性に優れる。
サンプル上澄み液をナノリットル液体クロマトグラフィー-高分解能質量分析にかけて、質量分析データをPEAKS 8.5ソフトウェアに導入し、「Adult-beta globin of deer」タンパク質データベースを用いて、ペプチドセグメントのすべてについてde novoシークエンシング及びペプチドセグメントマッチングを行った。合計33185本のペプチドセグメントまでde novoシークエンシングを行い、データベースにおいてマッチングさせたところ、合計333本のペプチドセグメントを同定した。高速液体クロマトグラフィー-トリプル四重極質量分析計により同定した333本のペプチドセグメントの、アカシカ、ニホンジカ、ヘラジカ、トナカイ、クチジロジカ、オジロジカ及びダマジカに対する特異性を検証して調べ、応答が最も強い親イオンと娘イオンを定性イオンと定量イオンとした。
(1)サンプルを製造する際に、アカシカ枝角、ニホンジカ枝角、ヘラジカ枝角、トナカイ枝角、ダマジカ枝角、オジロジカ枝角、クチジロジカ枝角サンプルを粉砕して、篩にかけ、粉末50mgを秤量して、変性緩衝液10mLを加え(6Mグアニジン塩酸塩、1M Tris、2.5mMエチレンジアミン四酢酸に濃塩酸を加えてpHを8.0に調整したもの)、よく混ぜて、80℃で一晩処理し、取り出して室温まで放冷し、12000rで10分遠心分離し、500μLを取り、分子量3kの限外濾過遠心分離管を用いてサンプルに脱塩と酵素分解を行った(12000rで10分遠心分離し、下層の溶液を捨てて、水500μLを加え、12000rで10分遠心分離し、下層の溶液を捨てて、水500μLを加え、12000rで10分遠心分離し、下層の溶液を捨てて、1% NH4HCO3溶液500μLとウシトリプシン溶液10μLを加え、37℃で15分酵素分解し、取り出して室温まで放冷し、遠心分離し、上澄み液を得る)。
(1)対照サンプルの製造方法はサンプルの製造方法と同様であった。
(3)液相条件:クロマトグラフィーカラムはAgilent SB C18 (2.1×100mm、1.8μm)、カラム温度は43℃、流速は0.3mL/min、移動相Aは0.1%ギ酸溶液、移動相Bは0.1%ギ酸アセトニトリル溶液とし、勾配溶出が行われ(0~9min、3%B→7.5%B;9~13min、7.5%B→25%B;13~14min、25%B→90%B;14~17min、90%B;17~17.5min、90%B →97%B、17.5~21min、97%B)、注入量は5μLであった。質量分析条件:質量分析検出器を用いて、エレクトロスプレーイオン化(ESI)を行い、プラスイオンモードで多重反応モニタリングを行い、シースガス流速は46L/hr、補助ガス流速は850 L/hr、スプレー電圧は3.5KV、イオン源温度は150℃、補助ガス温度は400℃。コーン電圧は30V、衝突電圧は35V、溶媒遅延(solvent delay)は0~4min及び16~20minとした。
上記のペプチドセグメントの配列及びイオンの帰属を図2~6に示す。
特異性の検証:アカシカ枝角、ニホンジカ枝角、ヘラジカ枝角、トナカイ枝角、ダマジカ枝角、オジロジカ枝角、クチジロジカ枝角サンプルをそれぞれ実験したところ、各鹿科動物の枝角に特異的なペプチドセグメントはいずれも検出可能であり、しかも、他の鹿科動物においては検出されておらず、このため、該方法は特異性に優れたと確認できた。
Claims (8)
- 枝角種属由来を高速で鑑別する特徴的ポリペプチドライブラリーであって、
前記特徴的ポリペプチドライブラリーは以下:
に示され、
前記特徴的ポリペプチド配列において、
ペプチドセグメント7は配列FFEHFGDLSSADAVmGNPKであり、mはMの酸化翻訳後修飾であり、
ペプチドセグメント9は配列FFEHFGDLSTPDAVmGNPKであり、mはMの酸化翻訳後修飾であり、
ペプチドセグメント10は配列VVAGVAnALAHRであり、nはNの脱アミド翻訳後修飾であり、
ペプチドセグメント11は配列FFEHFGDLSTADAVmGNPKであり、mはMの酸化翻訳後修飾である
各配列のポリペプチドからなることを特徴とする特徴的ポリペプチドライブラリー。 - 請求項1に記載の特徴的ポリペプチドライブラリーの、枝角種属由来の高速鑑別における使用であって、
判定原則として、
(1)サンプルにおいて、ヘラジカ対照生薬に対応するペプチドセグメント1又はペプチドセグメント2又はペプチドセグメント3を検出していると、サンプルはヘラジカ由来であり、
(2)サンプルにおいて、トナカイ対照生薬に対応するペプチドセグメント4又はペプチドセグメント5又はペプチドセグメント6を検出していると、サンプルはトナカイ由来であり、
(3)サンプルにおいて、オジロジカ対照生薬に対応するペプチドセグメント7を検出していると、サンプルはオジロジカ由来であり、
(4)サンプルにおいて、クチジロジカ対照生薬に対応するペプチドセグメント8を検出していると、サンプルはクチジロジカ由来であり、
(5)サンプルにおいて、ダマジカ対照生薬に対応するペプチドセグメント9を検出しているが、ペプチドセグメント8とペプチドセグメント11を検出していないと、サンプルはダマジカ由来であり、
(6)サンプルにおいて、ニホンジカ対照生薬に対応するペプチドセグメント10を検出しているとともに、ペプチドセグメント11を検出していると、サンプルはニホンジカ由来であり、
(7)サンプルにおいて、アカシカ対照生薬に対応するペプチドセグメント11を検出しているが、ペプチドセグメント10を検出していないと、サンプルはアカシカ由来であるとすることを特徴とする使用。 - 具体的には、
サンプルを製造する際には、サンプルを粉砕して、篩にかけ、粉末50mgを秤量して、変性緩衝液10mLを加え、よく混ぜて、80℃で一晩処理し、取り出して室温まで放冷し、12000rで10分遠心分離し、サンプル抽出液を500μL取り、分子量3kDaの限外濾過遠心分離管を用いてサンプルに脱塩と酵素分解を行うステップ(1)と、
高速液体クロマトグラフィー-トリプル四重極質量分析計により同定を行うステップ(2)と、を含むことを特徴とする請求項2に記載の使用。 - 前記変性緩衝液は6Mグアニジン塩酸塩、1M Tris、2.5mMエチレンジアミン四酢酸に濃塩酸を加えてpHを8.0に調整したものであることを特徴とする請求項3に記載の使用。
- 前記脱塩と酵素分解は、具体的には、サンプル抽出液を限外濾過遠心分離管の上層に加え、12000rで10分遠心分離し、下層の溶液を捨てて、水500μLを加え、12000rで10分遠心分離し、下層の溶液を捨てて、水500μLを加え、12000rで10分遠心分離し、下層の溶液を捨てて、1% NH4HCO3溶液500μLと10mg/mLのウシトリプシン溶液10μLを加え、37℃で15分酵素分解し、取り出して室温まで放冷し、遠心分離して上澄み液を得ることであることを特徴とする請求項3又は4に記載の使用。
- 液相条件として、クロマトグラフィーカラムはAgilent SB C18 (2.1×100mm、1.8μm)、カラム温度は43℃、流速は0.3mL/min、移動相Aは0.1%ギ酸溶液、移動相Bは0.1%ギ酸アセトニトリル溶液であり、勾配溶出が行われ、注入量は5μLであることを特徴とする請求項3に記載の使用。
- 前記勾配溶出条件は、0~9min、3%B→7.5%B;9~13min、7.5%B→25%B;13~14min、25%B→90%B;14~17min、90%B;17~17.5min、90%B→97%B、17.5~21min、97%Bであることを特徴とする請求項6に記載の使用。
- 前記質量分析条件としては、質量分析検出器を用いて、エレクトロスプレーイオン化(ESI)を行い、プラスイオンモードで多重反応モニタリングを行い、
シースガス流速は46L/hr、補助ガス流速は850L/hr、スプレー電圧は3.5KV、イオン源温度は150℃、補助ガス温度は400℃、コーン電圧は30V、衝突電圧は35V、溶媒遅延(solvent delay)は0~4min及び16~20minとすることを特徴とする請求項6又は7に記載の使用。
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