CN110426476A - 一种化妆品中乙酰基六肽-8含量的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种化妆品中乙酰基六肽‑8含量的测定方法，属于化学物质的检测技术领域。本发明的测定方法在对化妆品进行预处理时，将三氟乙酸水溶液作为溶剂，再补充乙腈，能够最大限度提取化妆品中的乙酰基六肽‑8，使测定方法准确、高效；同时，在对化妆品进行预处理时所采用的溶剂与进行梯度洗脱时采用的流动相溶剂相近，能够减少高效液相色谱法测定时干扰峰的数量，进而提高测定方法的准确度。实施例数据表明：本发明的测定方法回收率为100.17～103.83％，精密度相对标准偏差为0.09～1.76％；符合GBT 27404‑2008文件对方法验证的要求：回收率在95～105％之间，精密度小于等于2％。
Description
技术领域
本发明涉及化学物质的检测技术领域，尤其涉及一种化妆品中乙酰基六肽-8含量的测定方法。
背景技术
功能型化妆品日渐走俏，其中的功能性成分，特别是多肽类添加物，以其安全、稳定、易吸收、效果好等优点扮演着越来越重要的角色。活性肽是指对生物体的生命活动具有生理活性的肽类化合物，一般是指由2到20个氨基酸残基组成的特定的蛋白质片段，因为构成的不同也具有不同的生理功能和生理效应，例如：抗氧化、抗菌、降血压、补充肌肤营养、抗皱、抗衰老等等。乙酰基六肽-8也叫乙酰基六肽-3，六胜肽，俗称阿基瑞林，是一种神经递质抑制类胜肽，其抗皱活性高，通常，加入一定量乙酰基六肽-8的化妆品能够去除皱纹、改善皮肤状态。
目前，尚未有适用于化妆品中肽类物质检测的相关标准；消费者对含有多肽成分的化妆品也比较盲从。因此，化妆品中乙酰基六肽-8含量检测方法的建立，可以为化妆品企业开发含有乙酰基六肽-8的产品提供科学检测结果，为消费者提供购买依据。然而，国内外对化妆品中乙酰基六肽-8含量的检测方法未见报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种化妆品中乙酰基六肽-8含量的测定方法，本发明的测定方法可以准确、快速、高效地测定化妆品中乙酰基六肽-8的含量，对评估皮肤状况有重要意义。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种化妆品中乙酰基六肽-8含量的测定方法，包括以下步骤：
建立乙酰基六肽-8的质量浓度-峰面积标准曲线；
将化妆品样品、三氟乙酸水溶液和乙腈混合，得到化妆品样品溶液；
将所述化妆品溶液进行高效液相色谱法测定，得到化妆品中乙酰基六肽-8的峰面积；
将所述化妆品中乙酰基六肽-8的峰面积代入所述乙酰基六肽-8的质量浓度-峰面积标准曲线中，得到化妆品中乙酰基六肽-8的含量；
所述高效液相色谱法采用流动相进行梯度洗脱；
所述流动相包括A相和B相，所述A相为三氟乙酸水溶液；所述B相为三氟乙酸乙腈溶液；所述三氟乙酸水溶液的质量浓度均为0.05～0.15％；所述三氟乙酸乙腈溶液的质量浓度为0.08～0.1％；
所述梯度洗脱的程序具体为：
0～8min：A相和B相的体积比为90：10；
8～10min：A相和B相的体积比由90：10调整为20：80；
10～20min：A相和B相的体积比为20：80；
20～25min：A相和B相的体积比由20：80调整为90：10；
25min：A相和B相的体积比为90：10。
优选地，所述三氟乙酸水溶液的质量浓度均0.10％。
优选地，制备化妆品样品溶液过程中所用化妆品样品与三氟乙酸水溶液的用量比为0.5g～1.5g：8mL。
优选地，制备化妆品样品溶液过程中，所用化妆品样品与三氟乙酸水溶液的用量比为1.0g：8mL。
优选地，将化妆品样品、三氟乙酸水溶液和乙腈混合，得到化妆品样品溶液的具体过程包括以下步骤：
将化妆品样品溶于三氟乙酸水溶液，然后用乙腈定容至10mL，得到化妆品样品溶液。
优选地，所述流动相的pH值为2.0～3.0。
优选地，所述高效液相色谱法的参数包括：
色谱柱：Agilent TC-C18柱，4.6mm×250mm，5μm；
检测波长：215nm；
柱温：35℃；
进样量：10μL。
优选地，所述建立乙酰基六肽-8的质量浓度-峰面积标准曲线的具体步骤包括：
将0.5～1.5g乙酰基六肽-8标准品溶解于8mL质量浓度为0.05～0.15％的三氟乙酸水溶液，然后加入乙腈定容至10mL，得到标准储备液；将所述标准储备液稀释不同倍数，得到系列乙酰基六肽-8标准溶液；
对所述系列乙酰基六肽-8标准溶液进行高效液相色谱法测定，得到系列乙酰基六肽-8标准样品的峰面积，得到所述乙酰基六肽-8的质量浓度-峰面积标准曲线。
本发明提供了一种化妆品中乙酰基六肽-8含量的测定方法，包括以下步骤：建立乙酰基六肽-8的质量浓度-峰面积标准曲线；将化妆品样品、三氟乙酸水溶液和乙腈混合，得到化妆品样品溶液；将所述化妆品溶液进行高效液相色谱法测定，得到化妆品中乙酰基六肽-8的峰面积；将所述化妆品中乙酰基六肽-8的峰面积代入所述乙酰基六肽-8的质量浓度-峰面积标准曲线中，得到化妆品中乙酰基六肽-8的含量；所述高效液相色谱法采用流动相进行梯度洗脱；所述流动相包括A相和B相，所述A相为三氟乙酸水溶液；所述B相为三氟乙酸乙腈溶液；所述三氟乙酸水溶液的质量浓度均为0.05～0.15％；所述三氟乙酸乙腈溶液的质量浓度为0.08～0.1％；所述梯度洗脱的程序具体为：0～8min：A相和B相的体积比为90：10；8～10min：A相和B相的体积比由90：10调整为20：80；10～20min：A相和B相的体积比为20：80；20～25min：A相和B相的体积比由20：80调整为90：10；25min：A相和B相的体积比为90：10。
本发明的测定方法在对化妆品进行预处理时，将三氟乙酸水溶液作为溶剂，再补充乙腈，能够最大限度提取化妆品中的乙酰基六肽-8，使测定方法准确、高效；同时，本发明对化妆品进行预处理时所采用的溶剂与进行梯度洗脱时采用的流动相溶剂相近，能够减少高效液相色谱法测定时干扰峰数量、减小干扰峰的高度，进而提高测定方法的准确度。本发明测定方法的检测限、加标回收率和精密度均符合要求。通过本发明的测定方法可以准确、快速、高效地测定化妆品中乙酰基六肽-8的含量，对评估皮肤状况有重要意义。实施例的数据表明：本发明提供的测定方法回收率为100.17％～103.83％，精密度相对标准偏差为0.09％～1.76％；符合GBT 27404-2008文件对方法验证的要求：回收率在95％～105％之间，精密度小于等于2％，由此说明：本发明提供的测定方法结果准确可靠、精密度高且重现性好。
附图说明
图1为pH值为2.5的流动相检测空白样的色谱图；
图2为pH值为6.5的流动相检测乙酰基六肽-8标准品的色谱图；
图3为pH值为2.5的流动相检测乙酰基六肽-8标准品的色谱图；
图4为本发明建立的乙酰基六肽-8的质量浓度-峰面积标准曲线图。
具体实施方式
本发明提供了一种化妆品中乙酰基六肽-8含量的测定方法，包括以下步骤：
建立乙酰基六肽-8的质量浓度-峰面积标准曲线；
将化妆品样品、三氟乙酸水溶液和乙腈混合，得到化妆品样品溶液；
将所述化妆品溶液进行高效液相色谱法测定，得到化妆品中乙酰基六肽-8的峰面积；
将所述化妆品中乙酰基六肽-8的峰面积代入所述乙酰基六肽-8的质量浓度-峰面积标准曲线中，得到化妆品中乙酰基六肽-8的含量；
所述高效液相色谱法采用流动相进行梯度洗脱；
所述流动相包括A相和B相，所述A相为三氟乙酸水溶液；所述B相为三氟乙酸乙腈溶液；所述三氟乙酸水溶液的质量浓度均为0.05～0.15％；所述三氟乙酸乙腈溶液的质量浓度为0.08～0.1％；
所述梯度洗脱的程序具体为：
0～8min：A相和B相的体积比为90：10；
8～10min：A相和B相的体积比由90：10调整为20：80；
10～20min：A相和B相的体积比为20：80；
20～25min：A相和B相的体积比由20：80调整为90：10；
25min：A相和B相的体积比为90：10。
本发明建立乙酰基六肽-8的质量浓度-峰面积标准曲线。
在本发明中，建立乙酰基六肽-8的质量浓度-峰面积标准曲线的具体步骤优选包括：
将0.5～1.5g乙酰基六肽-8标准品溶于8mL质量浓度为0.05～0.15％的三氟乙酸水溶液，然后用乙腈定容至10mL，得到标准储备液；将所述标准储备液稀释不同倍数，得到系列乙酰基六肽-8标准溶液；
对所述系列乙酰基六肽-8标准溶液进行高效液相色谱法测定，得到系列乙酰基六肽-8标准样品的峰面积，得到所述乙酰基六肽-8的质量浓度-峰面积标准曲线。
在本发明中，所述标准储备液的浓度与所述标准储备液的稀释倍数相匹配，优选使最终系列标准溶液的浓度范围为0.02～0.8g/L，因为本发明的测定方法，在该浓度范围内具有优异的线性相关性。在本发明的具体实施过程中，所述标准储备液的浓度优选为100g/L；所述浓度为100g/L的标准储备液的配制方法优选为：将1.0g乙酰基六肽-8标准品溶于8mL质量浓度为0.1％的三氟乙酸水溶液，然后用乙腈定容至10mL，得到标准储备液；然后优选将所述浓度为100g/L的标准储备液分别稀释125、250、500、1000、2000、5000倍。在本发明中，所述乙酰基六肽-8标准品的纯度优选≥98％。
在本发明中，所述高效液相色谱法采用流动相进行梯度洗脱；所述流动相包括A相和B相，所述A相为质量浓度为0.05～0.15％的三氟乙酸水溶液，优选为0.1％；所述B相为质量浓度为0.08～0.1％的三氟乙酸乙腈溶液，优选为0.09％。
在本发明中，所述梯度洗脱的程序具体优选为：
0～8min：A相和B相的体积比为90：10；
8～10min：A相和B相的体积比由90：10调整为20：80；
10～20min：A相和B相的体积比为20：80；
20～25min：A相和B相的体积比由20：80调整为90：10；
25min：A相和B相的体积比为90：10。
在本发明中，所述高效液相色谱法的参数优选包括：色谱柱优选为Agilent TC-C18柱，4.6mm×250mm，5μm；检测波长优选为215nm；柱温优选为35℃；进样量优选为10μL。
在本发明中，所述高效液相色谱法优选在购自安捷伦科技有限公司的Agilent1260高效液相色谱仪上进行。
本发明将化妆品样品、三氟乙酸水溶液和乙腈混合，得到化妆品样品溶液。
在本发明中，将化妆品样品、三氟乙酸水溶液和乙腈混合，得到化妆品样品溶液的具体过程优选为：
将化妆品样品溶于三氟乙酸乙酸水溶液，然后用乙腈定容至10mL，得到化妆品样品溶液。
在本发明中，所述三氟乙酸水溶液的质量浓度优选为0.05～0.15％，进一步优选为0.1％。在本发明中，所述化妆品样品与三氟乙酸水溶液的用量比优选为0.5～1.5g：8mL，优选为1.0g：8mL。本发明对所述乙腈的用量不做具体限定，只要能够使化妆品样品溶液的浓度优选为50～100g/L即可。
本发明对所述化妆品样品的形态没有特殊的限定，常规存在的膏状、霜态、乳液态、水态均可。
在本发明的具体实施例中，所述化妆品样品溶液的配制优选与标准储备液的过程一致，以减小误差。
在本发明中，所述化妆品样品、三氟乙酸水溶液和乙腈混合的方式优选为超声震荡，所述超声震荡的时间优选为≥15min，进一步优选15～30min。在本发明中，混合结束后，优选将所述混合溶液过滤，得到化妆品样品溶液；在本发明中，所述过滤用滤膜的孔径优选为0.45μm或0.22μm，进一步优选为0.45μm。
在本发明的具体实施例中，将化妆品样品、三氟乙酸水溶液和乙腈混合，得到化妆品溶液的具体步骤优选包括：
准确称取化妆品样品1.00g置于10mL具塞比色管中，加入8mL 0.1％的三氟乙酸水溶液，再加乙腈至刻度，超声震荡15min以上，经0.45μm滤膜过滤，得到化妆品样品溶液。
得到化妆品样品溶液后，本发明将所述化妆品样品溶液进行高效液相色谱法测定，得到化妆品中乙酰基六肽-8的峰面积。
本发明对所述化妆品溶液进行高效液相色谱法测定时的参数选择、流动相选择及梯度洗脱程度的设置与建立所述乙酰基六肽-8的质量浓度-峰面积标准曲线时的参数选择一致，在此不在赘述。
得到化妆品中乙酰基六肽-8的峰面积后，本发明将所述化妆品中乙酰基六肽-8的峰面积代入所述乙酰基六肽-8的质量浓度-峰面积标准曲线中，得到化妆品中乙酰基六肽-8的含量。
本发明的测定方法在对化妆品进行预处理时，将三氟乙酸水溶液作为溶剂，再补充乙腈，能够最大提取化妆品中的乙酰基六肽-8，使测定方法准确、高效；同时，本发明对化妆品进行预处理时所采用的溶剂与进行梯度洗脱时采用的流动相溶剂相近，能够减少高效液相色谱法测定时干扰峰数量、减小干扰峰的高度，提高测定方法的准确度。
下面结合实施例对本发明提供的化妆品中乙酰基六肽-8含量的测定方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
在该实施例中，所述高效液相色谱法的参数包括：
色谱柱：Agilent TC-C18柱，4.6mm×250mm，5μm；
检测波长：215nm；
柱温：35℃；
进样量：10μL；
所述流动相包括A相和B相，所述A相为质量浓度为0.1％的三氟乙酸水溶液；所述B相为质量浓度为0.09％的三氟乙酸乙腈溶液。
所述梯度洗脱的程序具体优选为：
0～8min：A相和B相的体积比为90：10；
8～10min：A相和B相的体积比由90：10调整为20：80；
10～20min：A相和B相的体积比为20：80；
20～25min：A相和B相的体积比由20：80调整为90：10；
25min：A相和B相的体积比为90：10。
1、流动相pH值对检测结果的影响
将1g乙酰基六肽-8标准品溶于8mL质量浓度为0.1％的三氟乙酸水溶液，然后用乙腈定容至10mL，100g/L的标准储备液，将所述标准储备液稀释1000倍，得到浓度为0.1g/L的乙酰基六肽-8标准样品；
在10mL比色管中加入8mL质量浓度为0.1％的三氟乙酸水溶液，然后用乙腈定容至10mL，然后稀释1000倍，得到空白样；
将水和乙腈按照体积比20：80混合，作为基础流动相；
采用三氟乙酸将所述基础流动相的pH调节为2.5和6.5，得到pH值分别为2.5和6.5的流动相；
按照上述的高效液相色谱法参数，以pH值为2.5的流动相和pH值为6.5的流动相，分别对空白样和浓度为0.1g/L的乙酰基六肽-8标准样品进行高效液相色谱法测定，得到的色谱图分别如图1、图2和图3所示。
图1为pH值为2.5的流动相检测空白样的色谱图；图2为pH值为6.5的流动相检测乙酰基六肽-8标准品的色谱图；图3为pH值为2.5的流动相检测乙酰基六肽-8标准品的色谱图。
从图1～图3可以看出：流动相pH值为6.5时，无法检测出目标物质(乙酰基六肽-8)，且流动相pH值为2.5时，基线相对稳定。
2、线性关系
配制浓度为100g/L的乙酰基六肽-8标准储备液，将其分别稀释至0.02、0.05、0.10、0.20、0.40、0.80g/L六个浓度梯度采用该实施例所示的高效液相色谱法和梯度洗脱参数进样测定；以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标作图，绘制乙酰基六肽-8的质量浓度-峰面积的标准曲线，结果如图4所示。经拟合后得知，在0.02～0.80g/L浓度范围内，乙酰基六肽-8的质量浓度-峰面积标准曲线为：y＝7048.6x-9.8733，相关系数R2大于0.999，呈良好的线性关系。
3、方法的检出限和定量限
经过测定基线噪音，计算方法的检出限(S/N＝3)为5.67mg/kg，定量限(S/N＝10)为17.01mg/kg。
4、回收率及精密度分析：
在10mL比色管中，将1g不同剂型化妆品(水剂精华液、乳液和膏霜)溶解于8mL质量浓度为0.1％的乙酰基六肽-8中，然后加入乙腈定容至10mL，超声震荡15min，过45μm的滤膜，得到不同剂型化妆品溶液；对不同剂型化妆品溶液中的乙酰基六肽-8回收实验设定了三个添加水平；按本实施例提供的高效液相色谱和梯度洗脱参数，对每个添加浓度在不同剂型化妆品溶液中均进行3次试验，实验结果如表1所示：
表1 样品回收率和精密度试验结果表
从表1可以看出，本发明提供的测定方法回收率为100.17％～103.83％，精密度相对标准偏差为0.09％～1.76％。
此外，还对本发明测定方法的重现性进行了验证，在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的10％。
综上所述，本发明提供的测定方法的回收率、精密度相对标准偏差均符合GBT27404-2008文件对方法验证的要求：回收率在95％～105％之间，精密度小于等于2％。由此说明：本发明提供的测定方法结果准确可靠、精密度高且重现性好。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种化妆品中乙酰基六肽-8含量的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
建立乙酰基六肽-8的质量浓度-峰面积标准曲线；
将化妆品样品、三氟乙酸水溶液和乙腈混合，得到化妆品样品溶液；
将所述化妆品溶液进行高效液相色谱法测定，得到化妆品中乙酰基六肽-8的峰面积；
将所述化妆品中乙酰基六肽-8的峰面积代入所述乙酰基六肽-8的质量浓度-峰面积标准曲线中，得到化妆品中乙酰基六肽-8的含量；
所述高效液相色谱法采用流动相进行梯度洗脱；
所述流动相包括A相和B相，所述A相为三氟乙酸水溶液；所述B相为三氟乙酸乙腈溶液；所述三氟乙酸水溶液的质量浓度均为0.05～0.15％；所述三氟乙酸乙腈溶液的质量浓度为0.08～0.1％；
所述梯度洗脱的程序具体为：
0～8min：A相和B相的体积比为90：10；
8～10min：A相和B相的体积比由90：10调整为20：80；
10～20min：A相和B相的体积比为20：80；
20～25min：A相和B相的体积比由20：80调整为90：10；
25min：A相和B相的体积比为90：10。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述三氟乙酸水溶液的质量浓度均为0.10％。
3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，制备化妆品样品溶液过程中所用化妆品样品与三氟乙酸水溶液的用量比为0.5g～1.5g：8mL。
4.根据权利要求3所述的测定方法，其特征在于，制备化妆品样品溶液过程中，所用化妆品样品与三氟乙酸水溶液的用量比为1.0g：8mL。
5.根据权利要求1或2或3或4所述的测定方法，其特征在于，将化妆品样品、三氟乙酸水溶液和乙腈混合，得到化妆品样品溶液的具体过程包括以下步骤：
将化妆品样品溶于三氟乙酸水溶液，然后用乙腈定容至10mL，得到化妆品样品溶液。
6.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述流动相的pH值为2.0～3.0。
7.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述高效液相色谱法的参数包括：
色谱柱：AgilentTC-C18柱，4.6mm×250mm，5μm；
检测波长：215nm；
柱温：35℃；
进样量：10μL。
8.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述建立乙酰基六肽-8的质量浓度-峰面积标准曲线的具体步骤包括：
将0.5～1.5g乙酰基六肽-8标准品溶于8mL质量浓度为0.05～0.15％的三氟乙酸水溶液，然后用乙腈定容至10mL，得到标准储备液；将所述标准储备液稀释不同倍数，得到系列乙酰基六肽-8标准溶液；
对所述系列乙酰基六肽-8标准溶液进行高效液相色谱法测定，得到系列乙酰基六肽-8标准样品的峰面积，得到所述乙酰基六肽-8的质量浓度-峰面积标准曲线。
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