CN109507353A - 一种黑小麦麸皮中花色苷的高效液相色谱检测方法 - Google Patents

一种黑小麦麸皮中花色苷的高效液相色谱检测方法 Download PDF

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Abstract

一种黑小麦麸皮中花色苷的高效液相色谱检测方法，包括黑小麦麸皮中花色苷的提取、标准曲线的绘制和高效液相测定。高效液相测定时的色谱柱：C18柱，250mm×4.6mm，5μm；流动相：A为乙腈，B为0.2％甲酸水溶液；检测波长：525nm；柱温：25℃；进样量：10μL，进行梯度洗脱。比较样品和标准品的高效液相色谱图，依组份保留时间进行定性分析，与标准品的高效液相色谱图中相同时间的峰面积与标准曲线比较进行定量分析。本发明方法简单，测定结果准确、灵敏、重现性好。线性试验结果表明，在一定浓度范围内，花色苷标准曲线呈极显著正相关，近似于线性关系(R2≥0.99)。

Description

一种黑小麦麸皮中花色苷的高效液相色谱检测方法
技术领域
本发明涉及一种黑小麦麸皮中花色苷的高效液相色谱检测方法，属于化学分析检测技术领域。
背景技术
黑粒小麦因其种皮及糊粉层富含天然花色苷类化合物而呈现黑色，所含有的天然花色苷在促进人类身体健康和预防心血管疾病方面有重要作用，是珍贵的种质资源。
花青素为彩粒小麦中的主要黄酮类物质，在自然状态下常与各种糖结合形成糖苷，称为花色苷。花色苷作为一种天然色素，具有一定的营养和药理作用，在食品、化妆品、医药、保健等方面有着巨大的应用潜力。大量研究结果表明，花色苷具有抗氧化，抗癌，抗炎症，预防心血管疾病等多种生理功能。然而，由于花色苷类色素的成分极其复杂多样，目前，这类色素的质量标准依旧采用分光光度计测定色素色价的方法，已经无法满足对色素成分定量分析的要求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种黑小麦麸皮中花色苷的高效液相色谱检测方法。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种黑小麦麸皮中花色苷的高效液相色谱检测方法，包括下列步骤：
步骤1、黑小麦麸皮中花色苷的提取
将黑小麦麸皮加入酸化甲醇提取剂中，超声提取15-25min，然后对提取液进行离心，得到上清液；
步骤2、标准曲线的绘制
S1、将矢车菊-3,0-葡萄糖苷作为标准对照品，加入至体积分数为70％的甲醇溶液中溶解，定容后即得标准对照品储备液，放入-20℃冰箱中冷藏，备用；
S2、然后将所述标准对照品储备液稀释不同倍数，用高效液相法，在波长525nm下测定其吸收峰，以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线；
步骤3、高效液相测定
色谱柱：C18柱，250mm×4.6mm，5μm；流动相：A为乙腈，B为体积分数为0.2％的甲酸水溶液；检测波长：525nm；柱温：25℃；进样量：10μL，进行梯度洗脱；将上清液用 0.22μm滤膜过滤，然后注入高效液相色谱仪，比较样品和标准品的高效液相色谱图，依组份保留时间进行定性分析，与标准品的高效液相色谱图中相同时间的峰面积与标准曲线比较进行定量分析；
按公式(1)计算黑小麦麸皮中矢车菊-3,0-葡萄糖苷含量；
公式(1)中，ω为花色苷质量分数，单位为mg/g；p为测定的花色苷浓度，单位为mg/mL； V为样品提取液的体积，单位为mL；m为样品总质量，单位为g。
优选的技术方案为：所述酸化甲醇提取液的体积分数为70％，由甲醇、盐酸和水按照体积比70：0.5：29.5混合后制得；所述盐酸的体积分数为36％。
优选的技术方案为：所述梯度洗脱方法如下表：
时间min 流速mL/min 流动相A％ 流动相B％
0.0 0.4 18.0 82.0
8.0 0.4 24.0 76.0
10.0 0.4 28.0 72.0
11.0 0.4 18.0 82.0
18.0 0.4 18.0 82.0
。
优选的技术方案为：步骤1中，将0.5克黑小麦麸皮样品，加入2mL体积分数为70％的酸化甲醇提取剂中，60℃条件下超声提取20min，5000r/min离心15min，重复提取3次，合并后得到上清液，放入-20℃冰箱中冷藏，备用。
优选的技术方案为：所述色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C18色谱柱。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：
本发明采用高效液相色谱法，通过加标定性测定了黑小麦麸皮酸性甲醇粗提液中花色苷的组成及含量。避免了以往测定花色苷单体组成需要对提取物进行多次分离纯化的复杂前处理过程,为花色苷类物质的分析测定提供一种准确且简便易行的方法。
附图说明
图1黑小麦麸皮样品的高效液相色谱图。
图2花色苷矢车菊-3,0-葡萄糖苷(25μg/ml)的高效液相色谱图。
图3为花色苷矢车菊-3,0-葡萄糖苷标准曲线。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
请参阅图1～图3。须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。
实施例1：一种黑小麦麸皮中花色苷的高效液相色谱检测方法
主要实验仪器及色谱条件：
Waters600型高效液相色谱仪，配自动进样器和紫外(UV)检测器。色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C18色谱柱，150×4.6mm，3.5μm；流动相组成体积比：乙腈：0.2％ (v/v)甲酸水溶液＝18：82；流速：0.4mL/min；柱温：25℃；检测波长：525nm；进样量：10μL。
试剂与药品：
矢车菊-3,0-葡萄糖苷(C-3-G)标准对照品(＞99.0％)，黑小麦安农1601样品，乙腈(色谱纯)，甲醇(色谱纯)，甲酸(色谱纯)，盐酸(分析纯)，超纯水。
实施步骤1：黑小麦麸皮中花色苷的提取
取0.5克黑小麦麸皮样品，加入2mL 70％酸化甲醇(甲醇：盐酸(36％,v/v)：水体积比＝70：0.5：29.5)提取液，60℃条件下超声提取20min，5000r/min离心15min,重复提取3次，合并上清液，放入-20℃冰箱中冷藏，备用。进样时用0.22μm滤膜过滤。
实施步骤2：标准品溶液的制备
称取矢车菊-3,0-葡萄糖苷标准对照品5mg，加70％的甲醇溶解，定容于5mL容量瓶中即得1.0mg/mL标准对照品储备液，放入-20℃冰箱中冷藏，备用。
实施步骤3：高效液相测定：色谱柱：C18柱，250mmX4.6mmX5μm；流动相：A为乙腈，B为0.2％甲酸水溶液；检测波长：525nm柱温：25℃；进样量：10μL，进行梯度洗脱：
表1梯度洗脱一览表
时间min 流速mL/min 流动相A％ 流动相B％
0.0 0.4 18.0 82.0
8.0 0.4 24.0 76.0
10.0 0.4 28.0 72.0
11.0 0.4 18.0 82.0
18.0 0.4 18.0 82.0
实施步骤4：标准曲线的绘制
分别吸取不同体积的矢车菊-3,0-葡萄糖苷标准对照品储备液，用70％甲醇溶液进行稀释，最后得到浓度为100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL的C-3-G标准溶液，用HPLC 法，在波长525nm下测定其吸收峰，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，计算校准线性曲线回归方程为Y＝18845X+19694，R2＝0.999。试验表明，表明C-3-G浓度和峰面积在12.5μg/mL～100μg/mL范围内呈良好的线性关系。
实施步骤5：样品的测定
吸取10μL过0.22μm滤膜的黑小麦麸皮样品花色苷提取液，注入高效液相色谱仪，比较样品和标准品的高效液相色谱图，依组份保留时间进行定性分析，如图1和图2所示，检测的样品中含有花色苷。与标准品的高效液相色谱图中相同时间的峰面积与标准曲线比较进行定量分析。按公式(1)计算黑小麦麸皮中矢车菊-3,0-葡萄糖苷含量。
公式(1)中，ω为花色苷质量分数(mg/g)，p为测定的花色苷浓度(mg/mL)，V为样品定容体积(mL)，m样品总质量(g)。
测得的黑小麦安农1601麸皮样品中花色苷矢车菊-3,0-葡萄糖苷含量为0.51mg/g。
以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图具以对本发明做任何形式上之限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本发明意图保护之范畴。

Claims (5)

1.一种黑小麦麸皮中花色苷的高效液相色谱检测方法，其特征在于：包括下列步骤：
步骤1、黑小麦麸皮中花色苷的提取
将黑小麦麸皮加入酸化甲醇提取剂中，超声提取15-25min，然后对提取液进行离心，得到上清液；
步骤2、标准曲线的绘制
S1、将矢车菊-3,0-葡萄糖苷作为标准对照品，加入至体积分数为70％的甲醇溶液中溶解，定容后即得标准对照品储备液，放入-20℃冰箱中冷藏，备用；
S2、然后将所述标准对照品储备液稀释不同倍数，用高效液相法，在波长525nm下测定其吸收峰，以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线；
步骤3、高效液相测定
色谱柱：C18柱，250mm×4.6mm，5μm；流动相：A为乙腈，B为体积分数为0.2％的甲酸水溶液；检测波长：525nm；柱温：25℃；进样量：10μL，进行梯度洗脱；将上清液用0.22μm滤膜过滤，然后注入高效液相色谱仪，比较样品和标准品的高效液相色谱图，依组份保留时间进行定性分析，与标准品的高效液相色谱图中相同时间的峰面积与标准曲线比较进行定量分析；
按公式(1)计算黑小麦麸皮中矢车菊-3,0-葡萄糖苷含量；
公式(1)中，ω为花色苷质量分数，单位为mg/g；p为测定的花色苷浓度，单位为mg/mL；V为样品提取液的体积，单位为mL；m为样品总质量，单位为g。
2.根据权利要求1所述的黑小麦麸皮中花色苷的高效液相色谱检测方法，其特征在于：所述酸化甲醇提取液的体积分数为70％，由甲醇、盐酸和水按照体积比70∶0.5∶29.5混合后制得；所述盐酸的体积分数为36％。
3.根据权利要求1所述的黑小麦麸皮中花色苷的高效液相色谱检测方法，其特征在于：所述梯度洗脱方法如下表：
。
4.根据权利要求1所述的黑小麦麸皮中花色苷的高效液相色谱检测方法，其特征在于：步骤1中，将0.5克黑小麦麸皮样品，加入2mL体积分数为70％的酸化甲醇提取剂中，60℃条件下超声提取20min，5000r/min离心15min，重复提取3次，合并后得到上清液，放入-20℃冰箱中冷藏，备用。
5.根据权利要求1所述的黑小麦麸皮中花色苷的高效液相色谱检测方法，其特征在于：所述色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C18色谱柱。
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