CN104569262B - 一种同时检测几种植物油中α-生育酚和角鲨烯的含量测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同时检测几种植物油中α-生育酚和角鲨烯的含量测定方法，包括（1）供试品溶液的制备无需进行皂化处理，直接溶解后测定（2）α-生育酚和角鲨烯两种成分含量测定：利用高效液相色谱技术及二极管阵列检测器的双波长同时测定α-生育酚和角鲨烯的含量，分别对四种植物油的供试品溶液进行高效液相色谱分离并测定，分别得到285nm波长下α-生育酚的峰面积和210nm波长下角鲨烯的峰面积，根据标准曲线计算供试品中α-生育酚和角鲨烯的含量，并结合供试品的质量，经计算得到四种植物油中α-生育酚和角鲨烯的含量。该方法简单，可操作性强，重现性好，准确度高。
Description
技术领域
本发明属于药用辅料与食品领域，具体地说，涉及一种同时检测植物油中α-生育酚和角鲨烯两种成分的含量测定方法，植物油包括大豆油、特级初榨橄榄油、茶油、葵花籽油。
背景技术
大豆油、茶油、橄榄油以及葵花籽油，均含有大量的不饱和脂肪酸、微量元素、维生素、角鲨烯、黄酮类物质和多酚化合物，营养丰富，具有多种医疗保健功效，大豆油和橄榄油已应用于脂肪乳制剂。这四种功能性植物油中大量的不饱和脂肪酸，有学者已做过大量的研究，进行脂肪酸的定性和定量的检测，而生育酚和角鲨烯的含量测定，虽有文献报道，但是，一般是采用气相色谱法及GC-MS内标法[1～3]分别单独测定或者同时测定两种成分的含量。而本专利发明并建立了简便、快速、准确可靠的一种HPLC法，同时检测几种植物油中α-生育酚和角鲨烯两种成分的含量测定方法，实用性强，对植物油中活性成分的研究、筛选可以提供数据支持和参考。
参考文献：[1]耿树香，宁德鲁，张艳丽，陈海云，李勇杰.不同品种及成熟度橄榄油中角鲨烯的检测分析[J](英文).AgriculturalScience&Technology20131482～1485.[2]张东生，薛雅琳，金青哲，王兴国，张东，钟诚.油茶籽油中角鲨烯含量的测定[J]中国油脂.2013年年第卷第期.85-88.[3]毛多斌，贾春晓，孙晓丽，杨公明.几种功能性植物油中角鲨烯和维生素E分析[J].中国粮油学报.2007年3月第22卷第2期.79-82.
发明内容
本发明提供一种含量测定方法同时检测四种植物油(大豆油、特级初榨橄榄油、茶油、葵花籽油)中α-生育酚和角鲨烯的含量，该方法采用高效液相色谱分离技术，供试品无需进行皂化处理，直接用溶剂溶解后在同一种色谱条件下同时测定α-生育酚和角鲨烯两种成分的含量，为这几种植物油成分的分析研究提供参考数据，是一种更简便、快速、准确的质量分析方法，实用性强，也说明了该含量测定方法的科学性、先进性及测定结果的准确可靠性。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种同时检测几种植物油中α-生育酚和角鲨烯的含量测定方法，包括如下步骤：
(1)供试品溶液的制备：
取供试品(大豆油、茶油、特级初榨橄榄油、葵花籽油)各1.5g，精密称定，置25ml量瓶中，分别加甲醇-异丙醇-正已烷(体积比15:65:20)溶解并稀释至刻度，摇匀，即为供试品溶液；
(2)α-生育酚和角鲨烯的含量测定：
高效液相色谱实验条件如下：色谱柱为C18色谱柱；流动相系统：以甲醇-乙腈(70：30)为流动相A，以甲醇-异丙醇-正已烷(体积比15:65:20)为流动相B；洗脱梯度：0-25min：100％A；25-27min：100％-30％A；27-37min：30％A；37-39min：30％-100％A；39-50min：100％A；洗脱时间：50min；二极管阵列检测器检测波长：210nm和285nm；流速：1.2ml～1.6ml/min；柱温：32℃～38℃；样品进样量：20μl；
对照品溶液的制备：取α-生育酚对照品，制成每1ml分别含3μg、6μg、12μg、30μg、60μg的对照品溶液；
取角鲨烯对照品，制成每1ml分别含60μg、120μg、240μg、360μg、600μg的对照品溶液；
高效液相色谱测定法：不同浓度的对照品溶液分别以20μl进样，测得210nm波长下角鲨烯的峰面积和285nm波长下α-生育酚的峰面积，；以所得各标准对照品峰面积为纵坐标，各对应标准对照品浓度为横坐标分别做标准曲线，分别计算α-生育酚和角鲨烯的线性回归方程；然后对四种植物油的供试品溶液进行高效液相色谱测定，得到210nm波长下角鲨烯的峰面积和285nm波长下α-生育酚的峰面积，根据各自的标准曲线计算供试品中α-生育酚和角鲨烯的含量，并结合供试品的质量，经计算得到α-生育酚的含量和角鲨烯的含量，结果见表6。
在上述含量测定方法中，所述步骤(2)的色谱条件中流动相系统：以甲醇-乙腈(70：30)为流动相A，以甲醇-异丙醇-正已烷(15:65:20)为流动相B；洗脱梯度：0-25min：100％A；25-27min：100％-30％A；27-37min：30％A；37-39min：30％-100％A；39-50min：100％A；洗脱时间：50min；二极管阵列检测器检测波长：210nm和285nm；样品进样量：20μl；
在上述含量测定方法中所述步骤(2)的色谱条件中流速为1.4ml/min。
在上述含量测定方法中所述步骤(2)的色谱条件中所用的色谱柱为：AgilentHC-C18(4.6mm×250mm，5μm)。
在上述含量测定方法中，所述步骤(2)的色谱条件中色谱柱温为35℃。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明利用一种高效液相色谱条件同时对四种植物油中α-生育酚和角鲨烯的含量进行了测定，供试品溶液无需进行皂化处理，直接溶解后经高效液相色谱分离测定，产品的甘油三酯成分能洗脱流出，不残留于色谱柱中，故该检测方法能准确的测定植物油中α-生育酚和角鲨烯两种成分的含量，既可对植物油这两种活性成分进行分析研究，也可为原料质量标准的制订提供参考，方法简单，可操作性强，重现性好，准确度高，是检测植物油中α-生育酚和角鲨烯含量的有效方法。
附图说明
图1为实施例6的210nm下的HPLC色谱图；
1角鲨烯对照品；2α-生育酚对照品；3溶剂；4橄榄油；5葵花籽油；6大豆油；7茶油。
图2为实施例6的285nm下的HPLC色谱图。
1溶剂；2α-生育酚对照品；3橄榄油；4葵花籽油；5茶油；6大豆油。
具体实施方式
实施例1
(1)供试品溶液的制备
取供试品(特级初榨橄榄油)1.5g，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇-异丙醇-正已烷(15:65:20)溶解并稀释至刻度，摇匀，即为供试品溶液；
(2)α-生育酚和角鲨烯的含量测定
高效液相色谱实验条件如下：C18色谱柱(AgilentHC-C184.6mm×250mm，5μm)；以甲醇-乙腈(70：30)为流动相A，以甲醇-异丙醇-正已烷(15:65:20)为流动相B；洗脱梯度：0-25min：100％A；25-27min：100％-30％A；27-37min：30％A；37-39min：30％-100％A；39-50min：100％A；洗脱时间：50min；二极管阵列检测器检测波长：210nm和285nm；流速：1.4ml/min；柱温：32℃；样品进样量：20μl；
α-生育酚和角鲨烯的含量测定方法如下：取α-生育酚对照品，制成每1ml分别含3μg、6μg、12μg、30μg、60μg的对照品溶液；
取角鲨烯对照品，制成每1ml分别含60μg、120μg、240μg、360μg、600μg的对照品溶液；
高效液相色谱测定法：不同浓度的对照品溶液分别以20μl进样，测得210nm波长下角鲨烯的峰面积和285nm波长下α-生育酚的峰面积，；以所得各标准对照品峰面积为纵坐标，各对应标准对照品浓度为横坐标分别做标准曲线，分别计算α-生育酚和角鲨烯的线性回归方程；然后对供试品溶液进行高效液相色谱测定，得到210nm波长下角鲨烯的峰面积和285nm波长下α-生育酚的峰面积，根据各自的标准曲线计算供试品中α-生育酚和角鲨烯的含量，并结合供试品的质量，经计算得到α-生育酚的含量为0.016％，角鲨烯的含量为0.32％。
实施例2
(1)供试品溶液的制备
取供试品(特级初榨橄榄油)1.5g，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇-异丙醇-正已烷(15:65:20)溶解并稀释至刻度，摇匀，即为供试品溶液；
(2)α-生育酚和角鲨烯的含量测定
高效液相色谱实验条件如下：C18色谱柱(AgilentHC-C184.6mm×250mm，5μm)；以甲醇-乙腈(70：30)为流动相A，以甲醇-异丙醇-正已烷(15:65:20)为流动相B；洗脱梯度：0-25min：100％A；25-27min：100％-30％A；27-37min：30％A；37-39min：30％-100％A；39-50min：100％A；洗脱时间：50min；二极管阵列检测器检测波长：210nm和285nm；流速：1.4ml/min；柱温：38℃；样品进样量：20μl；
α-生育酚和角鲨烯的含量测定方法如下：取α-生育酚对照品，制成每1ml分别含3μg、6μg、12μg、30μg、60μg的对照品溶液；
取角鲨烯对照品，制成每1ml分别含60μg、120μg、240μg、360μg、600μg的对照品溶液；
高效液相色谱测定法：不同浓度的对照品溶液分别以20μl进样，测得210nm波长下角鲨烯的峰面积和285nm波长下α-生育酚的峰面积，；以所得各标准对照品峰面积为纵坐标，各对应标准对照品浓度为横坐标分别做标准曲线，分别计算α-生育酚和角鲨烯的线性回归方程；然后对供试品溶液进行高效液相色谱测定，得到210nm波长下角鲨烯的峰面积和285nm波长下α-生育酚的峰面积，根据各自的标准曲线计算供试品中α-生育酚和角鲨烯的含量，并结合供试品的质量，经计算得到α-生育酚的含量为0.015％，角鲨烯的含量为0.35％。
实施例3
(1)供试品溶液的制备
取供试品(特级初榨橄榄油)1.5g，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇-异丙醇-正已烷(15:65:20)溶解并稀释至刻度，摇匀，即为供试品溶液；
(2)α-生育酚和角鲨烯的含量测定
高效液相色谱实验条件如下：C18色谱柱(AgilentHC-C184.6mm×250mm，5μm)；以甲醇-乙腈(70：30)为流动相A，以甲醇-异丙醇-正已烷(15:65:20)为流动相B；洗脱梯度：0-25min：100％A；25-27min：100％-30％A；27-37min：30％A；37-39min：30％-100％A；39-50min：100％A；洗脱时间：50min；二极管阵列检测器检测波长：210nm和285nm；流速：1.2ml/min；柱温：35℃；样品进样量：20μl；
α-生育酚和角鲨烯的含量测定方法如下：取α-生育酚对照品，制成每1ml分别含3μg、6μg、12μg、30μg、60μg的对照品溶液；
取角鲨烯对照品，制成每1ml分别含60μg、120μg、240μg、360μg、600μg的对照品溶液；
高效液相色谱测定法：不同浓度的对照品溶液分别以20μl进样，测得210nm波长下角鲨烯的峰面积和285nm波长下α-生育酚的峰面积，；以所得各标准对照品峰面积为纵坐标，各对应标准对照品浓度为横坐标分别做标准曲线，分别计算α-生育酚和角鲨烯的线性回归方程；然后对供试品溶液进行高效液相色谱测定，得到210nm波长下角鲨烯的峰面积和285nm波长下α-生育酚的峰面积，根据各自的标准曲线计算供试品中α-生育酚和角鲨烯的含量，并结合供试品的质量，经计算得到α-生育酚的含量为0.015％，角鲨烯的含量为0.38％。
实施例4
(1)供试品溶液的制备
取供试品(特级初榨橄榄油)1.5g，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇-异丙醇-正已烷(15:65:20)溶解并稀释至刻度，摇匀，即为供试品溶液；
(2)α-生育酚和角鲨烯的含量测定
高效液相色谱实验条件如下：C18色谱柱(AgilentHC-C184.6mm×250mm，5μm)；以甲醇-乙腈(70：30)为流动相A，以甲醇-异丙醇-正已烷(15:65:20)为流动相B；洗脱梯度：0-25min：100％A；25-27min：100％-30％A；27-37min：30％A；37-39min：30％-100％A；39-50min：100％A；洗脱时间：50min；二极管阵列检测器检测波长：210nm和285nm；流速：1.6ml/min；柱温：35℃；样品进样量：20μl；
α-生育酚和角鲨烯的含量测定方法如下：取α-生育酚对照品，制成每1ml分别含3μg、6μg、12μg、30μg、60μg的对照品溶液；
取角鲨烯对照品，制成每1ml分别含60μg、120μg、240μg、360μg、600μg的对照品溶液；
高效液相色谱测定法：不同浓度的对照品溶液分别以20μl进样，测得210nm波长下角鲨烯的峰面积和285nm波长下α-生育酚的峰面积，；以所得各标准对照品峰面积为纵坐标，各对应标准对照品浓度为横坐标分别做标准曲线，分别计算α-生育酚和角鲨烯的线性回归方程；然后对供试品溶液进行高效液相色谱测定，得到210nm波长下角鲨烯的峰面积和285nm波长下α-生育酚的峰面积，根据各自的标准曲线计算供试品中α-生育酚和角鲨烯的含量，并结合供试品的质量，经计算得到α-生育酚的含量为0.015％，角鲨烯的含量为0.30％。
实施例5
(1)供试品溶液的制备
取供试品(特级初榨橄榄油)1.5g，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇-异丙醇-正已烷(15:65:20)溶解并稀释至刻度，摇匀，即为供试品溶液；
(2)α-生育酚和角鲨烯的含量测定
高效液相色谱实验条件如下：C18色谱柱(WatersC184.6mm×250mm，5μm)；以甲醇-乙腈(70：30)为流动相A，以甲醇-异丙醇-正已烷(15:65:20)为流动相B；洗脱梯度：0-25min：100％A；25-27min：100％-30％A；27-37min：30％A；37-39min：30％-100％A；39-50min：100％A；洗脱时间：50min；二极管阵列检测器检测波长：210nm和285nm；流速：1.4ml/min；柱温：35℃；样品进样量：20μl；
α-生育酚和角鲨烯的含量测定方法如下：取α-生育酚对照品，制成每1ml分别含3μg、6μg、12μg、30μg、60μg的对照品溶液；
取角鲨烯对照品，制成每1ml分别含60μg、120μg、240μg、360μg、600μg的对照品溶液；
高效液相色谱测定法：不同浓度的对照品溶液分别以20μl进样，测得210nm波长下角鲨烯的峰面积和285nm波长下α-生育酚的峰面积，；以所得各标准对照品峰面积为纵坐标，各对应标准对照品浓度为横坐标分别做标准曲线，分别计算α-生育酚和角鲨烯的线性回归方程；然后对供试品溶液进行高效液相色谱测定，得到210nm波长下角鲨烯的峰面积和285nm波长下α-生育酚的峰面积，根据各自的标准曲线计算供试品中α-生育酚和角鲨烯的含量，并结合供试品的质量，经计算得到α-生育酚的含量为0.016％，角鲨烯的含量为0.34％。
实施例6
(1)供试品溶液的制备：
取供试品1.5g，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇-异丙醇-正已烷(15:65:20)溶解并稀释至刻度，摇匀，即为供试品溶液；
(2)α-生育酚和角鲨烯的含量测定：
高效液相色谱实验条件如下：C18色谱柱(AgilentHC-C184.6mm×250mm，5μm)；流动相系统：以甲醇-乙腈(70：30)为流动相A，以甲醇-异丙醇-正已烷(15:65:20)为流动相B；洗脱梯度：0-25min：100％A；25-27min：100％-30％A；27-37min：30％A；37-39min：30％-100％A；39-50min：100％A；洗脱时间：50min；二极管阵列检测器检测波长：210nm和285nm；流速：1.4ml/min；柱温：35℃；样品进样量：20μl；
对照品溶液的制备：取α-生育酚对照品，制成每1ml分别含3μg、6μg、12μg、30μg、60μg的对照品溶液；
取角鲨烯对照品，制成每1ml分别含60μg、120μg、240μg、360μg、600μg的对照品溶液；
1专属性
分别取溶剂甲醇-异丙醇-正已烷(15:65:20)、样品溶液、α-生育酚对照品溶液、角鲨烯对照品溶液各20μL按实施案例6色谱实验条件进样，记录色谱图。结果：空白溶剂对测定无干扰，色谱图见图1(210nm下HPLC图)和图2(285nm下HPLC图)；峰纯度分析结果中，样品溶液的α-生育酚峰纯度匹配值为994，角鲨烯峰纯度匹配值为990，匹配值均大于980，可确认两组分均为单一组分，专属性好。
2检测限与定量限
分别取α-生育酚对照品、角鲨烯对照品制成信噪比为10：1的溶液，作为定量限对照液，制成信噪比为3：1的溶液，作为检测限对照液，按实施案例6色谱实验条件进样，记录色谱图。计算出α-生育酚的定量限为0.09μg，检测限为0.02μg；角鲨烯的定量限为0.0025μg，检测限为0.0008μg。
3线性关系考察：
精密量取α-生育酚对照品溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。结果见表1，从结果可知，标准曲线相关系数R2＝0.9999，采用的方法在0.00307mg/ml～0.06135mg/ml范围内线性良好。
表1α-生育酚线性试验结果
精密量取角鲨烯对照品溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。结果见表2，从结果可知，标准曲线相关系数R2＝0.9997，采用的方法在0.006328mg/ml～0.6328mg/ml范围内线性良好。
表2角鲨烯线性试验结果
4精密度试验：
取同一批供试品(特级初榨橄榄油)样品6份，各1.5g，精密称定，按照“实施例6”项下供试品溶液制备操作，按“实施例6”色谱条件试验，记录色谱图，按样品中α-生育酚和角鲨烯的峰面积，根据标准曲线，算出样品中α-生育酚和角鲨烯的含量，测得α-生育酚含量平均值为0.015％，结果的RSD为2.2％，角鲨烯含量平均值为0.34％，结果的RSD为3.2％，RSD不超过5％时说明精密度良好，结果见表3。
表3供试品(特级初榨橄榄油)中α-生育酚和角鲨烯精密度测定结果
| 成分 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 平均％ | RSD％ |
| α-生育酚含量％ | 0.015 | 0.015 | 0.015 | 0.015 | 0.016 | 0.015 | 0.015 | 2.2 |
| 角鲨烯含量％ | 0.32 | 0.34 | 0.34 | 0.35 | 0.32 | 0.35 | 0.34 | 3.2 |
5稳定性试验：
取同一批供试品(特级初榨橄榄油)样品1份1.5g，精密称定，按照“实施例6”项下供试品溶液制备操作，按“实施例6”色谱条件分析，分别于0小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时注入液相色谱仪，记录色谱图，从结果可知，样品溶液在24小时内进行测定，α-生育酚峰面积的RSD为1.9％，角鲨烯峰面积的RSD为2.1％，RSD不超过5％时无明显差异，样品溶液相对稳定。稳定性峰面积见表4。
表4溶液稳定性的峰面积
6加样回收率：
取同一批供试品(特级初榨橄榄油)样品6份，约各1.5g，精密称定，按照“实施例6”项下供试品溶液制备操作，各精密取每份溶液2.0ml，分别加入α-生育酚对照品溶液2.0ml(加入对照品的量为0.06135mg/ml)，混合均匀，作为加样供试液A；同法另制备供试品溶液6份，各精密取每份溶液2.0ml，加入角鲨烯对照品溶液2.0ml(加入对照品的量为0.25312mg/ml)，混合均匀，作为加样供试液B。按照“实施例6”项下的色谱条件测定，记录色谱图，用加样供试液A计算样品中α-生育酚的回收率，用加样供试液B计算样品中角鲨烯的回收率，结果α-生育酚的回收率为85.98％～91.98％，测定结果的RSD为2.4％，角鲨烯的回收率为98.94％～105.9％，测定结果的RSD为2.5％。成分含量为0.1％～0.5％时，加样回收率范围在91％～108％认为准确度符合要求，成分含量为0.01％～0.05％时，加样回收率范围在85％～110％认为准确度符合要求。说明α-生育酚、角鲨烯测定方法准确度高。结果见表5。
表5供试品(特级初榨橄榄油)中α-生育酚和角鲨烯含量测定的加样回收率
7样品测定：
取四种植物油，按照“实施例6”项下供试品溶液制备操作，按“实施例6”色谱条件测定，测得四种植物油中α-生育酚和角鲨烯含量，结果见表6。
表6四种植物油中α-生育酚和角鲨烯含量测定结果
Claims (5)
1.一种植物油中α-生育酚和角鲨烯的含量测定方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）供试品溶液的制备：
取供试品1.5g，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇-异丙醇-正已烷，体积比15:65:20，溶解并稀释至刻度，摇匀，即为供试品溶液；
（2）α-生育酚和角鲨烯的含量测定：
高效液相色谱法测定色谱条件如下：C18色谱柱；流动相系统：以甲醇-乙腈，70：30，为流动相A，以甲醇-异丙醇-正已烷，体积比15:65:20，为流动相B；洗脱梯度：0-25min：100%A；25-27min：100%-30%A；27-37min：30%A；37-39min：30%-100%A；39-50min：100%A；洗脱时间：50min；二极管阵列检测器检测波长：210nm和285nm；流速：1.2ml～1.6ml/min;柱温：32℃～38℃；样品进样量：20μl；
对照品溶液的制备：取α-生育酚对照品，制成每1ml分别含3μg、6μg、12μg、30μg、60μg的对照品溶液；
取角鲨烯对照品，制成每1ml分别含60μg、120μg、240μg、360μg、600μg的对照品溶液；
高效液相色谱测定法：不同浓度的对照品溶液分别以20μl进样，测得210nm波长下角鲨烯的峰面积和285nm波长下α-生育酚的峰面积；以所得各标准对照品峰面积为纵坐标，各对应标准对照品浓度为横坐标分别做标准曲线，分别计算α-生育酚和角鲨烯的线性回归方程；然后对四种植物油的供试品溶液进行高效液相色谱测定，得到210nm波长下角鲨烯的峰面积和285nm波长下α-生育酚的峰面积，根据各自的标准曲线计算供试品中α-生育酚和角鲨烯的含量，并结合供试品的质量，经计算得到α-生育酚的含量和角鲨烯的含量。
2.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于，所述步骤（2）的色谱条件中流速为1.4ml/min。
3.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于，所述步骤（2）的色谱条件中色谱柱温为35℃。
4.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于，所述四种植物油为大豆油、特级初榨橄榄油、茶油和葵花籽油。
5.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于，所述步骤（2）的色谱条件中所用的色谱柱为：AgilengtHC-C18，4.6mm×250mm，5μm。
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