CN107556363B - 肽或其盐及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及肽或其盐及其制备方法。所述肽具有例如4～8个氨基酸。本发明的制备方法包括如下步骤：以树脂作为起始原料，将具有保护基团的氨基酸连接至树脂，然后脱去保护基团，依次这样连接各个氨基酸，然后进行切肽和脱侧链保护基团得到粗品，经过纯化后得到所需的肽或其盐。
Description
技术领域
本发明涉及肽或其盐及其制备方法。
背景技术
肽是由多个氨基酸分子脱水缩合而成的化合物。作为多肽类药物已知有多种，例如，VVYP，是由氨基酸L-Val，L-Tyr和L-Pro按照L-val-L-val-L-Tyr-L-Pro的序列构成的四肽化合物，其最早是由日本的香川恭一教授利用酶解的方法制备的一种猪血蛋白混合物中的主要成分，见life science,1996,58(20):1745-1755，该猪蛋白混合物和VVYP具有降低胆固醇和血脂的作用。作为多肽类药物的制备方法，已知有生物合成和人工合成两种。例如，美国专利(US9233999B2)采用了一种重组蛋白的方法制备了VVYP。此外，美国专利(US5958885)中公开了一种VVYP的合成方法，但是该方法存在明显的缺陷，每一步都必须使用三氟乙酸，导致生产成本很高；三废比较多，使用氟化氢作为切割试剂将肽类从树脂上切割下来，氟化氢是剧毒的酸。
发明内容
为了克服上述现有技术中的问题，本发明人进行了长期锐意地研究，发现以树脂作为起始原料，将具有保护基团的氨基酸连接至树脂，然后脱去保护基团，依次连接各个氨基酸，然后进行切肽和脱侧链保护基团得到粗品，经过纯化后得到所需的肽或其盐，可以实现提供一种工艺简单、毒性低、产率高、纯度高的肽类化合物的制备方法，进一步地，利用本发明的制备方法，还可以提供新的肽化合物，例如VVYP；AVLP；IGFP；LLIIVP和STAP以及它们的盐，从而完成了本发明。
本发明涉及以下方面。
[1].肽或其盐的制备方法，该方法包括：
步骤A：以树脂作为起始原料，在碱性试剂的存在下，将具有α-氨基保护基团的构成肽的C端的氨基酸连接至树脂，
步骤B：用脱帽试剂将所述保护基团脱去，
步骤C：在碱性试剂的存在下，按照肽的从C端到N端的顺序依次连接组成肽的各个氨基酸进行反应，从而形成肽连接树脂，其中，每个氨基酸的连接都是先连接具有α-氨基保护基团的氨基酸进行接肽，然后用脱帽试剂将所述保护基团脱去进行脱帽，
步骤D：进行切肽，得到肽或其盐的粗品，
步骤E：纯化粗品，得到所述的肽或其盐。
[2].上述[1]的制备方法，其中，步骤A中的所述树脂为2-氯三苯甲基氯树脂，
[3]上述[1]-[2]中任一项的制备方法，其中，步骤A中的碱性试剂选自：N,N-二异丙基乙氨(DIEA)和N-甲基吗啉(NMM)；
[4]上述[1]-[3]中任一项的制备方法，其中，步骤A中，在将氨基酸连接至树脂后，还包括加入醇进一步反应。
[5]上述[1]-[4]的制备方法，其中，所述醇选自，甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇、庚醇和辛醇。
[6]上述[1]-[5]的制备方法，其中，步骤C中的碱性试剂选自：N,N-二异丙基乙氨(DIEA)和N-甲基吗啉(NMM)。；步骤C中偶联试剂选自O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸(TBTU),O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、1-羟基苯并三唑(HOBT)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBop)。
[7].上述[1]-[6]中任一项的制备方法，其中，所述各步骤中接肽反应的温度是10～35℃，反应时间是0.5～8小时，
[8].上述[1]-[7]中任一项的制备方法，其中，脱帽反应的温度是20～35℃，反应时间是5～60分钟；
[9].上述[1]-[8]中任一项的制备方法，其中，所述各步骤中切肽试剂是三氟乙酸(TFA)、三异丙基硅烷(TIS)和水的混合物，TFA的比例是90～95％，TIS的比例是0～5％，水的比例是0～5％，在20～35℃反应1～5小时。
[10].上述[1]-[9]中任一项的制备方法，其中，所述步骤E中的纯化是利用纳滤机进行的。
[11].上述[1]-[10]中任一项的制备方法，其中，所述步骤D中利用氮气吹干的方法得到了浓缩的粗品。
[12].上述[1]-[11]中任一项的制备方法，其中，
在步骤A和步骤C中，具有α-氨基保护基团的氨基酸的投料量为，以摩尔数计，是所连接的树脂的1.5～6倍；
[13].上述[1]-[12]中任一项的制备方法，其中，
在步骤A中，碱性试剂的投料量为，以摩尔数计，是所连接的树脂的2～10倍；
[14].上述[1]-[13]中任一项的制备方法，其中，
在步骤C中，在连接每个氨基酸的接肽反应中，偶联试剂HBTU的投料量与具有α-氨基保护基团的氨基酸的量相等；HOBT的投料量为，以摩尔数计，是具有α-氨基保护基团的氨基酸的1.1～5倍；DIEA的投料量为，以摩尔数计，是具有α-氨基保护基团的氨基酸的2～10倍
[15].上述[1]-[14]中任一项的制备方法，其中，
在步骤A-E中，氨基酸的保护基团均为Fmoc；接肽试剂为：选自二氯甲烷，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，N,N-二甲基乙酰胺，四氢呋喃和乙酸乙酯中的一种或更多种。
[16].上述[1]-[15]中任一项的制备方法，其中，
脱帽试剂为哌啶(PIP):DMF等于1：2～10(体积比)；脱帽试剂的加入量和待脱帽的树脂的重量比例是5～25ml脱帽试剂/g树脂。
[17].上述[1]-[16]中任一项的制备方法，其中，
在步骤E中，是将粗品溶解在稀酸溶液中进行分离纯化。
[18].上述[1]-[17]中任一项的制备方法，其中，
其中，所述酸选自硫酸、盐酸、氢溴酸、甲烷基磺酸、萘磺、醋酸、富马酸、马来酸、酒石酸、2，5-二羟基苯甲酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸和对甲苯磺酸。
[19].上述[1]-[18]中任一项的制备方法，其中，所述肽选自：
VVYP；AVLP；IGFP；LLIIVP和STAP，
其中
Y代表：L-酪氨酸；
V代表：L-缬氨酸；
P代表：L-脯氨酸；
A代表：L-丙氨酸；
L代表：L-亮氨酸；
I代表：L-异亮氨酸；
G代表：L-甘氨酸；
F代表：L-苯丙氨酸；
S代表：L-丝氨酸；
T代表：L-苏氨酸；
所述肽的盐选自：硫酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、三氟乙酸盐、甲烷基磺酸盐、萘磺酸、乙酸盐、富马酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、2，5-二羟基苯甲酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐和对甲苯磺酸盐。
[20].上述[1]-[19]中任一项的制备方法，其中，所述用于接肽的氨基酸是侧链被保护基团保护的氨基酸，所述的侧链保护基团选自：Boc(叔丁氧羰基)，tBu(叔丁基)，Trt(三苯甲基)，且在步骤D中同步进行切肽和脱侧链保护基团。
[21].上述[1]-[20]中任一项的制备方法，其中，所述肽为VVYP，该方法包括：
步骤(1)：制备Fmoc-L-Pro-2-CTC树脂：
取2-CTC树脂，用干燥的二氯甲烷浸泡，然后加入用接肽溶剂溶解的Fmoc-L-Pro-OH和N,N-二异丙基乙氨(DIEA)的混合物进行反应，加入醇继续反应，抽干，洗涤，干燥，获得Fmoc-L-Pro-2-CTC树脂；
步骤(2)：制备Fmoc-L-Tyr(tBu)-L-Pro-2-CTC树脂：
在步骤(1)获得的Fmoc-L-Pro-2-CTC树脂中，加入脱帽试剂，脱帽试剂的加入量和Fmoc-L-Pro-2-CTC树脂的重量比例是5～25ml/g，反应，抽干，洗涤；加入用接肽溶剂溶解的Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH、HBTU、HOBT和N,N-二异丙基乙氨(DIEA)混合物进行反应，抽干，洗涤，干燥，获得Fmoc-L-Tyr(tBu)-L-Pro-2-CTC树脂；其中，
步骤(3)：制备Fmoc-L-val-L-Tyr(tBu)-L-Pro-2-CTC树脂：
在步骤(2)中获得的Fmoc-L-Tyr(tBu)-L-Pro-2-CTC树脂中，加入脱帽试剂进行反应，抽干，洗涤；加入接肽溶剂溶解的Fmoc-L-val-OH、HBTU、HOBT和N,N-二异丙基乙氨(DIEA)混合物进行反应，抽干，洗涤，干燥，获得Fmoc-L-val-L-Tyr(tBu)-L-Pro-2-CTC树脂；
步骤(4)：制备Fmoc-L-val-L-val-L-Tyr(tBu)-L-Pro-2-CTC树脂：
在步骤(3)获得的Fmoc-L-val-L-Tyr(tBu)-L-Pro-2-CTC树脂中，加入脱帽试剂进行反应，抽干，洗涤；加入接肽溶剂溶解的Fmoc-L-val-OH、HBTU、HOBT和N,N-二异丙基乙氨(DIEA)混合物进行反应，抽干，洗涤，干燥，获得Fmoc-L-val-L-val-L-Tyr(tBu)-L-Pro-2-CTC树脂；
步骤(5)：制备L-val-L-val-L-Tyr(tBu)-L-Pro-2-CTC树脂
在步骤(4)获得中的Fmoc-L-val-L-val-L-Tyr(tBu)-L-Pro-2-CTC树脂中，加入脱帽试剂进行反应，获得L-val-L-val-L-Tyr(tBu)-L-Pro-2-CTC树脂。
[22].根据上述[1]-[20]中任一项的方法制备得到的肽或其盐。
[23].一种肽或其盐，其选自下列：VVYP；AVLP；IGFP；LLIIVP和STAP以及它们的盐。
附图说明
图1：VVYP乙酸盐的13C-NMR图
图2：VVYP乙酸盐的HPLC图
图3：AVLP乙酸盐的MS图
图4：AVLP乙酸盐的HPLC图
图5：IGFP乙酸盐的MS图
图6：IGFP乙酸盐的HPLC图
具体实施方式
本发明采用固相合成法，把目的肽C端第一个氨基酸偶联在树脂上，然后以活化剂活化肽序列C-末端第二个氨基酸残基的羧基，并偶联于前一个氨基酸的氨基上形成肽键，依次类推直到合成整个目的肽。未反应的氨基酸衍生物原料可以用溶剂洗掉。
本发明的肽或其盐的制备方法包括以下步骤：
步骤A：以树脂作为起始原料，在碱性试剂的存在下，将具有α-氨基保护基团的构成肽的C端的氨基酸连接至树脂，
步骤B：用脱帽试剂将所述保护基团脱去，
步骤C：在碱性试剂的存在下，按照肽的从C端到N端的顺序依次连接组成肽的各个氨基酸进行反应，从而形成肽连接树脂，其中，每个氨基酸的连接都是先连接具有α-氨基保护基团的氨基酸进行接肽，然后用脱帽试剂将所述保护基团脱去进行脱帽，
步骤D：进行切肽，得到肽或其盐的粗品，
步骤E：纯化粗品，得到所述的肽或其盐。
作为树脂，可以采用例如2-氯三苯甲基氯树脂(即，2-CTC树脂)。
作为氨基酸的α-氨基的保护基团，可以是Fmoc基团或Boc基团，优选以Fmoc基团保护每一个氨基酸或其衍生物的α-氨基。
本发明的氨基酸可以是侧链被保护的氨基酸，作为侧链保护基团可以采用如Boc(叔丁氧羰基)，tBu(叔丁基)，Trt(三苯甲基)等采用三氟乙酸(TFA)可脱去的基团，优选Boc(叔丁氧羰基)。
在步骤A中，在将氨基酸连接至树脂后，还包括加入醇进一步反应，封闭未反应的位点。所述醇选自，甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇、庚醇和辛醇，优选甲醇。所述醇可以是以与碱性试剂的混合物的形式加入，例如与DIEA的混合比例为1:5～10，优选1:9
在步骤A中，可以采用Fmoc-OSu试剂作为对照，测定氨基酸的上载率。
作为脱帽试剂，例如脱去Fmoc基团的试剂，可以采用哌啶溶液，例如，哌啶(PIP)的二甲基甲酰胺(DMF)溶液，其中，PIP:DMF可以为1：2～10(体积比)，优选1：2～5(体积比)。
作为接肽反应温度，可以为例如35℃以下，优选10～35℃，进一步优选10～25℃。作为反应时间，可以为0.5～8h。
作为碱性试剂，可以选自例如N,N-二异丙基乙胺(DIEA)、N-甲基吗啉(NMM)，优选N,N-二异丙基乙胺(DIEA)。
作为溶剂，可以选自例如二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、四氢呋喃、乙酸乙酯，优选二氯甲烷。
作为用于将肽从树脂上切割下来的切肽试剂，可采用例如包含三氟乙酸(TFA)的溶剂，例如三氟乙酸(TFA)、三异丙基硅烷(TIS)和水的混合物，TFA的比例是90～95％，TIS的比例是0～5％，水的比例是0～5％，切肽反应可以在20～35℃反应1～5小时，优选在25℃，反应4小时。
当氨基酸的侧链存在保护基团时，可以在切肽反应进行的同时，将所述侧链保护基团脱去。
作为浓缩肽粗品的方法，可以采用例如过滤树脂，用氮气吹干溶剂的方法等。
作为肽的纯化方法，可以采用例如纳滤机。例如，将粗品溶解在稀酸中，搅拌，过滤，滤液经过纳滤机纯化。所述酸选自例如硫酸、盐酸、氢溴酸、甲烷基磺酸、萘磺、醋酸、富马酸、马来酸、酒石酸、2，5-二羟基苯甲酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸和对甲苯磺酸等。也可以采用C18柱进行分离。
具有α-氨基保护基团的氨基酸的投料量为，以摩尔数计，是所连接的树脂的1.5～6倍，优选4倍。
在步骤A中，碱性试剂的投料量为，以摩尔数计，是所连接的树脂的2～10倍，优选8倍。
在步骤C中，在连接每个氨基酸的接肽反应中，碱性试剂HBTU的投料量与具有α-氨基保护基团的氨基酸的量相等。
HOBT的投料量为，以摩尔数计，是具有α-氨基保护基团的氨基酸的1.1～5倍，优选1.1倍；DIEA的投料量为，以摩尔数计，是具有保护基团的氨基酸的2～10倍，优选8倍
在上述各反应接肽中，可以采用以下方式来考察反应是否完成，即，取少许树脂做茚三酮检测，呈阴性，则表示反应完成。
根据本发明的制造方法，可以工艺简单、毒性低、产率高、纯度高的制备肽类化合物或其盐，例如VVYP；YPYP；YPVYP；VYPVYP；YPYPVYP和YPVYPVYP，其中Y代表：L-酪氨酸；V代表：L-缬氨酸；P代表：L-脯氨酸。
进一步地，利用本发明的制备方法，还可以提供新的肽化合物，例如VVYP；AVLP；IGFP；LLIIVP和STAP。
上述的肽的盐选自：硫酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、三氟乙酸盐、甲烷基磺酸盐、萘磺酸、乙酸盐、富马酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、2，5-二羟基苯甲酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐和对甲苯磺酸盐。
以下，以VVYP为例，对本发明的制备方法进行说明。
作为本发明的VVYP的制备方法的一个实施方式，包括如下步骤:
(1)制备Fmoc-L-Pro-2-CTC树脂：
取2-CTC树脂，用干燥的二氯甲烷浸泡，使树脂充分溶胀，然后加入用接肽溶剂溶解的Fmoc-L-Pro-OH和N,N-二异丙基乙氨(DIEA)混合物，25℃反应4小时，然后加入甲醇和DIEA的混合溶剂(9：1，体积比)继续反应1h，封闭未反应的位点，抽干，分别用DMF和二氯甲烷洗涤，真空干燥，获得Fmoc-L-Pro-2-CTC树脂。
所述的2-CTC树脂取代值为0.2～1.6mmol/g；
所述的接肽溶剂是DMF；
2-CTC树脂的重量体积浓度是5～25ml/g；
Fmoc-L-Pro-OH的投料量(摩尔数)是树脂的1.5～6倍；
DIEA的投料量(摩尔数)是树脂的2～10倍。
(2)制备Fmoc-L-Tyr(tBu)-L-Pro-2-CTC树脂：
在步骤(1)中的Fmoc-L-Pro-2-CTC树脂中，加入脱帽试剂，在20～35℃反应5～60分钟，抽干，然后用DMF洗涤；加入用接肽溶剂溶解的Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH、HBTU、HOBT和N,N-二异丙基乙氨(DIEA)混合物，20～35℃反应1～5小时，取少许树脂做茚三酮检测，呈阴性，抽干，然后用DMF和二氯甲烷洗涤，真空干燥，获得Fmoc-L-Tyr(tBu)-L-Pro-2-CTC树脂；
所述的脱帽试剂是PIP:DMF等于1：2～10，体积比，下同；
接肽溶剂是DMF；
Fmoc-L-Pro-2-CTC树脂的重量体积浓度是5～25ml/g；
Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH的投料量(摩尔数)是树脂的1.5～6倍；
HBTU的投料量(摩尔数)和Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH相等；
HOBT的投料量(摩尔数)是Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH的1.1～5倍；
DIEA的投料量(摩尔数)是Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH的2～10倍；
脱帽试剂的加入量和Fmoc-L-Pro-2-CTC树脂的重量比例是5～25ml/g。
(3)制备Fmoc-L-val-L-Tyr(tBu)-L-Pro-2-CTC树脂：
在步骤(2)中的Fmoc-L-Tyr(tBu)-L-Pro-2-CTC resin树脂中，加入脱帽试剂，在20～35℃反应时间是5～60分钟，抽干，然后用DMF洗涤；加入接肽溶剂溶解的Fmoc-L-val-OH、HBTU、HOBT和N,N-二异丙基乙氨(DIEA)混合物，20～35℃反应1～5小时，取少许树脂做茚三酮检测，呈阴性，抽干，然后用DMF和二氯甲烷洗涤，真空干燥，获得Fmoc-L-val-L-Tyr(tBu)-L-Pro-2-CTC树脂；
Fmoc-L-Tyr(tBu)-L-Pro-2-CTC树脂的重量体积浓度是5～25ml/g；
Fmoc-L-val-OH的投料量(摩尔数)是树脂的1.5～6倍；
HBTU的投料量(摩尔数)和Fmoc-L-val-OH相等；
HOBT的投料量(摩尔数)是Fmoc-L-val-OH的1.1～5倍；
DIEA的投料量(摩尔数)是Fmoc-L-val-OH的2～10倍；
脱帽试剂的加入量和Fmoc-L-Tyr(tBu)-L-Pro-2-CTC树脂的重量比例是5～25ml/g。
(4)制备Fmoc-L-val-L-val-L-Tyr(tBu)-L-Pro-2-CTC树脂：
在步骤(3)中的Fmoc-L-val-L-Tyr(tBu)-L-Pro-2-CTC树脂中，加入脱帽试剂，在20～35℃反应5～60分钟，抽干，然后用DMF洗涤；加入接肽溶剂溶解的Fmoc-L-val-OH、HBTU、HOBT和N,N-二异丙基乙氨(DIEA)混合物，20～35℃反应1～5小时，取少许树脂做茚三酮检测，呈阴性，抽干，然后用DMF和二氯甲烷洗涤，真空干燥，获得Fmoc-L-val-L-val-L-Tyr(tBu)-L-Pro-2-CTC树脂；
Fmoc-L-val-L-Tyr(tBu)-L-Pro-2-CTC树脂的重量体积浓度是5～25ml/g；
Fmoc-L-val-OH的投料量(摩尔数)是树脂的1.5～6倍；
HBTU的投料量(摩尔数)和Fmoc-L-val-OH相等；
HOBT的投料量(摩尔数)是Fmoc-L-val-OH的1.1～5倍；
DIEA的投料量(摩尔数)是Fmoc-L-val-OH的2～10倍；
脱帽试剂的加入量和Fmoc-L-val-L-Tyr(tBu)-L-Pro-2-CTC树脂的重量比例是5～25ml/g。
(5)制备制备L-val-L-val-L-Tyr(tBu)-L-Pro-2-CTC树脂
在步骤(4)中的Fmoc-L-val-L-val-L-Tyr(tBu)-L-Pro-2-CTC树脂中，加入脱帽试剂，在20～35℃反应5～60分钟，抽干，然后用DMF洗涤，真空干燥，获得L-val-L-val-L-Tyr(tBu)-L-Pro-2-CTC树脂。
(6)切肽
将上述步骤(5)所获得的L-val-L-val-L-Tyr(tBu)-L-Pro-2-CTC树脂加入到切肽试剂中；切肽试剂是TFA、三异丙基硅烷(TIS)和水的混合物，TFA的比例是90～95％，TIS的比例是0～5％，水的比例是0～5％；在20～35℃反应1～5小时，减压蒸去溶剂，得到切肽后的VVYP·TFA粗品。
(7)浓缩和纯化
在100～35℃反应1～5小时，用氮气吹干溶剂，得到切肽后的粗品。
可以将VVYP的粗品溶解在稀酸中，搅拌，过滤，滤液经过纳滤机纯化。
还可以将粗品经过C18柱分离纯化，例如将VVYP的粗品溶解在5％稀醋酸中，搅拌5小时，过滤，滤液经过C18柱分离纯化。
粗品如果溶解在不同的稀酸中，如硫酸、盐酸、三氟乙酸、氢溴酸、甲烷基磺酸、萘磺、醋酸、富马酸、马来酸、酒石酸、2，5-二羟基苯甲酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸和对甲苯磺酸等中，可以得到不同的VVYP盐的纯品。
VVYP的纯品可以以盐的形式存在，包括硫酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、三氟乙酸盐、甲烷基磺酸盐、萘磺酸、乙酸盐、富马酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、2，5-二羟基苯甲酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐和对甲苯磺酸盐等。
实施例
下面参照实施例来详细说明本发明，但本发明并不限定于此，可以在本发明范围内进行变化。
实施例中所采用的原料列表如下：
在以下各实施例中：
所述的接肽试剂是DMF；
所述的脱帽试剂是PIP:DMF＝1:4；体积比。
实施例1：VVYP的合成
1)制备Fmoc-L-Pro-2-CTC树脂：
取100g 2-CTC树脂(1.1mmol/g树脂，140mmol)用800mL干燥的二氯甲烷浸泡，使树脂充分溶胀，抽除二氯甲烷。
取70.8g Fmoc-L-Pro-OH(FW:337.4,210mmol)和180mL N,N-二异丙基乙氨(DIEA,1190mmol)，用800毫升无水DMF溶解，加入反应器中，25℃反应2小时，然后加入200mL甲醇和DIEA的混合溶剂(9：1，体积比)继续反应1h，封闭未反应的位点，抽干，分别用DMF、甲醇和二氯甲烷各洗涤三遍，真空干燥，获得Fmoc-L-Pro-2-CTC resin树脂。
采用Fmoc-OSu试剂作为对照，测定氨基酸的上载率是0.98mmol/g树脂。收率是89％。
2)制备Fmoc-L-Tyr(tBu)-L-Pro-2-CTC树脂：
用800mL脱帽试剂加入到Fmoc-L-Pro-2-CTC resin中，25℃反应10min，重复操作2次。用无水的DMF洗涤，抽干；
取183.8g Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH(FW:459.5,400mmol)、151.7g HBTU(FW:379.24,400mmol)、59.5g HOBT(FW:135.13,440mmol)和121mL N,N-二异丙基乙氨(DIEA，800mmol)混合物，25℃反应60min，取少许树脂做茚三酮检测，呈阴性。抽干，然后用DMF和二氯甲烷洗涤，获得Fmoc-L-Tyr(tBu)-L-Pro-2-CTC树脂。
3)制备Fmoc-L-val-L-Tyr(tBu)-L-Pro-2-CTC树脂：
用800mL脱帽试剂加入到Fmoc-L-Tyr(tBu)-L-Pro-2-CTC树脂中，25℃反应10min，重复操作2次。用无水的DMF洗涤，抽干；
取135.8g Fmoc-L-Val-OH(FW:339.4,400mmol)、151.7g HBTU(FW:379.24,400mmol)、59.5g HOBT(FW:135.13,440mmol)和121mL N,N-二异丙基乙氨(DIEA，800mmol)混合物，25℃反应60min，取少许树脂做茚三酮检测，呈阴性。抽干，然后用DMF和二氯甲烷洗涤，获得Fmoc-L-Val-L-Tyr(tBu)-L-Pro-2-CTC树脂。
4)制备Fmoc-L-val-L-val-L-Tyr(tBu)-L-Pro-2-CTC树脂：
用800mL脱帽试剂加入到Fmoc-L-Val-L-Tyr(tBu)-L-Pro-2-CTC树脂中，25℃反应10min，重复操作2次。用无水的DMF洗涤，抽干；
取135.8g Fmoc-L-Val-OH(FW:339.4,400mmol)、151.7g HBTU(FW:379.24,400mmol)、59.5g HOBT(FW:135.13,440mmol)和121mL N,N-二异丙基乙氨(DIEA，800mmol)混合物，25℃反应60min，取少许树脂做茚三酮检测，呈阴性。抽干，然后用DMF和二氯甲烷洗涤，获得Fmoc-L-val-L-val-L-Tyr(tBu)-L-Pro-2-CTC树脂。
5)制备L-val-L-val-L-Tyr(tBu)-L-Pro-2-CTC树脂
用800mL脱帽试剂加入到Fmoc-L-val-L-val-L-Tyr(tBu)-L-Pro-2-CTC resin中，25℃反应10min，重复操作2次。用无水的DMF洗涤，抽干，得到L-val-L-val-L-Tyr(tBu)-L-Pro-2-CTC resin树脂。
6)切肽
将L-val-L-val-L-Tyr(tBu)-L-Pro-2-CTC resin加入1000mL的切肽试剂(TFA:TSI:H2O等于95：2.5：2.5，体积比)，25℃反应4h，抽滤，收集滤液，氮气吹干，得到切肽后的VVYP粗品。
7)VVYP分离纯化
将VVYP粗品溶解在5％的醋酸仲，搅拌5h，用纳滤机纯化，氮气吹干浓缩液，冻干，得到VVYP纯品(以VVYP乙酸盐的形式存在，VVYP·CH3COOH，见图1)，纯度是99.3％(见图2)。得到VVYP纯品48.3克，收率是82％
实施例2：AVLP的合成
1)制备Fmoc-L-Pro-2-CTC resin：
取100g 2-CTC树脂(1.4mmol/g树脂，140mmol)用800mL干燥的DMF浸泡，使树脂充分溶胀，抽除二氯甲烷。
取70.8g Fmoc-L-Pro-OH(FW:337.4,210mmol)和131mL N-甲基吗啉(NMM,1190mmol)，用800毫升无水DMF溶解，加入反应器中，10℃反应4小时，然后加入200mL甲醇继续反应1h，封闭未反应的位点，抽干，用DMF洗涤六遍，真空干燥，获得Fmoc-L-Pro-2-CTCresin。
采用Fmoc-OSu试剂作为对照，测定氨基酸的上载率是1.26mmol/g。
2)制备Fmoc-L-Leu-L-Pro-2-CTC resin：
用800mL脱帽试剂加入到Fmoc-L-Pro-2-CTC resin中，25℃反应10min，重复操作2次。用无水的DMF洗涤，抽干；
取2178.1g Fmoc-L-Leu-OH(FW:353.4,504mmol)、191.3g HBTU(FW:379.24,504mmol)、74.3g HOBT(FW:135.13,550mmol)和111mL N-甲基吗啉(NMM,1010mmol)混合物，10℃反应4小时，取少许树脂做茚三酮检测，呈阴性。抽干，然后用DMF洗涤，获得Fmoc-L-Leu-L-Pro-2-CTC resin。
3)制备Fmoc-L-Val-L-Leu-L-Pro-2-CTC resin：
用800mL脱帽试剂加入到Fmoc-L-Leu-L-Pro-2-CTC resin中，25℃反应10min，重复操作2次。用无水的DMF洗涤，抽干；
取183.2g Fmoc-L-Val-OH(FW:339.4，504mmol)、191.3g HBTU(FW:379.24,504mmol)、74.3g HOBT(FW:135.13,550mmol)和111mL N-甲基吗啉(NMM,1010mmol)混合物，10℃反应4小时，取少许树脂做茚三酮检测，呈阴性。抽干，然后用DMF洗涤，获得Fmoc-L-Val-L-Leu-L-Pro-2-CTC resin。
4)制备Fmoc-L-ala-L-Val-L-Leu-L-Pro-2-CTC resin：
用800mL脱帽试剂加入到Fmoc-L-Val-L-Tyr(tBu)-L-Pro-2-CTC树脂中，25℃反应10min，重复操作2次。用无水的DMF洗涤，抽干；
取156.9g Fmoc-L-ala-OH(FW:311.33,504mmol)、191.3g HBTU(FW:379.24,504mmol)、74.3g HOBT(FW:135.13,550mmol)和111mL N-甲基吗啉(NMM,1010mmol)混合物，10℃反应4小时，取少许树脂做茚三酮检测，呈阴性。抽干，然后用DMF和二氯甲烷洗涤，获得Fmoc-L-ala-L-Val-L-Leu-L-Pro-2-CTC resin。
5)制备L-ala-L-Val-L-Leu-L-Pro-2-CTC resin
用800mL脱帽试剂加入到Fmoc-L-ala-L-Val-L-Leu-L-Pro-2-CTC resin中，25℃反应10min，重复操作2次。用无水的DMF洗涤，抽干，得到L-ala-L-Val-L-Leu-L-Pro-2-CTCresin。
6)切肽
将L-ala-L-Val-L-Leu-L-Pro-2-CTC resin加入1000mL的切肽试剂(TFA:H2O等于90：5，体积比)，25℃反应4h，抽滤，收集滤液，用氮气吹干溶剂，得到切肽后的AVLP粗品。
7)AVLP纯化
将AVLP粗品溶解在5％的醋酸中，搅拌5h，过滤，用300Da纳滤膜纯化AVLP粗品，收率AVLP的精制品溶液，用氮气吹干溶剂，冷冻干燥，得到AVLP纯品(以AVLP乙酸盐的形式存在，AVLP·CH3COOH，见图3)，纯度是98.5％，AVLP的收率是82.1％(见图4)。
实施例3：IGFP的合成
1)制备Fmoc-L-Pro-2-CTC resin：
取100g 2-CTC树脂(1.4mmol/g树脂，140mmol)用800mL干燥的DMF浸泡，使树脂充分溶胀，抽除二氯甲烷。
取70.8g Fmoc-L-Pro-OH(FW:337.4,210mmol)和131mL N-甲基吗啉(NMM,1190mmol)，用800毫升无水DMF溶解，加入反应器中，10℃反应4小时，然后加入200mL甲醇继续反应1h，封闭未反应的位点，抽干，用DMF洗涤六遍，真空干燥，获得Fmoc-L-Pro-2-CTCresin。
采用Fmoc-OSu试剂作为对照，测定氨基酸的上载率是1.21mmol/g树脂。
2)制备Fmoc-L-phe-L-Pro-2-CTC resin：
用800mL脱帽试剂加入到Fmoc-L-Pro-2-CTC resin中，25℃反应10min，重复操作2次。用无水的DMF洗涤，抽干；
取187.6g Fmoc-L-phe-OH(FW:387.5,484mmol)、183.6g HBTU(FW:379.24,484mmol)、71.9g HOBT(FW:135.13,532.4mmol)和106mL N-甲基吗啉(NMM,968mmol)混合物，10℃反应4小时，取少许树脂做茚三酮检测，呈阴性。抽干，然后用DMF洗涤，获得Fmoc-L-phe-L-Pro-2-CTC resin。
3)制备Fmoc-Gly-L-phe-L-Pro-2-CTC resin：
用800mL脱帽试剂加入到Fmoc-L-phe-L-Pro-2-CTC resin中，25℃反应10min，重复操作2次。用无水的DMF洗涤，抽干；取143.9g Fmoc-Gly-OH(FW:297.3，484mmol)、183.6gHBTU(FW:379.24,484mmol)、71.9g HOBT(FW:135.13,532.4mmol)和106mL N-甲基吗啉(NMM,968mmol)混合物，10℃反应4小时，取少许树脂做茚三酮检测，呈阴性。抽干，然后用DMF洗涤，获得Fmoc-Gly-L-phe-L-Pro-2-CTC resin。
4)制备Fmoc-L-Ile-Gly-L-phe-L-Pro-2-CTC resin：
用800mL脱帽试剂加入到Fmoc-Gly-L-phe-L-Pro-2-CTC resin树脂中，25℃反应10min，重复操作2次。用无水的DMF洗涤，抽干；
取171.0g Fmoc-L-Ile-OH(FW:353.4,484mmol)、183.6g HBTU(FW:379.24,484mmol)、71.9g HOBT(FW:135.13,532.4mmol)和106mL N-甲基吗啉(NMM,968mmol)混合物，10℃反应4小时，取少许树脂做茚三酮检测，呈阴性。抽干，然后用DMF和二氯甲烷洗涤，获得Fmoc-L-Ile-Gly-L-phe-L-Pro-2-CTC resin。
5)制备L-Ile-Gly-L-phe-L-Pro-2-CTC resin
用800mL脱帽试剂加入到Fmoc-L-Ile-Gly-L-phe-L-Pro-2-CTC resin中，25℃反应10min，重复操作2次。用无水的DMF洗涤，抽干，得到L-Ile-Gly-L-phe-L-Pro-2-CTCresin。
6)切肽
将L-Ile-Gly-L-phe-L-Pro-2-CTC resin加入1000mL的切肽试剂(TFA:H2O等于90：5，体积比)，25℃反应4h，抽滤，收集滤液，用氮气吹干溶剂，得到切肽后的IGFP粗品。
7)IGFP纯化
将IGFP粗品溶解在5％的醋酸中，搅拌5h，过滤，用300Da纳滤膜纯化IGFP粗品，收率IGFP的精制品溶液，用氮气吹干溶剂，冷冻干燥，得到IGFP纯品(以IGFP乙酸盐的形式存在，IGFP·CH3COOH，见图5)，纯度是99.8％(见图6)，IGFP的收率是82.6％。
本发明如上所述进行了描述。当然本发明在其范围中包含各种方式的变化，这些变化并不偏离本发明的范围。此外，对于对本领域技术人员而言明显是本发明的变形的改变，都包括在权利要求的范围内。
序列表
<110> 江西本草天工科技有限责任公司
<120> 肽或其盐及其制备方法
<130> PCJ02317
<140> 2016105034130
<141> 2016-06-30
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Val Val Tyr Pro
1
<210> 2
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Ala Val Leu Pro
1
<210> 3
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Ile Gly Phe Pro
1
<210> 4
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Leu Leu Ile Ile Val Pro
1 5
<210> 5
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Ser Thr Ala Pro
1
<210> 6
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Tyr Pro Tyr Pro
1
<210> 7
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Tyr Pro Val Tyr Pro
1 5
<210> 8
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Val Tyr Pro Val Tyr Pro
1 5
<210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 9
Tyr Pro Tyr Pro Val Tyr Pro
1 5
<210> 10
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 10
Tyr Pro Val Tyr Pro Val Tyr Pro
1 5
Claims (5)
1.肽或其盐的制备方法，所述肽选自VVYP、AVLP和IGFP，其中
Y代表：L-酪氨酸；
V代表：L-缬氨酸；
P代表： L-脯氨酸；
A代表：L-丙氨酸；
L代表：L-亮氨酸；
I代表：L-异亮氨酸；
G代表：L-甘氨酸；
F代表：L-苯丙氨酸；
该方法包括：
步骤A：以树脂作为起始原料，在碱性试剂的存在下，将具有α-氨基保护基团的构成肽的C端的氨基酸连接至树脂，其中，所述树脂为2-氯三苯甲基氯树脂；碱性试剂选自：N,N-二异丙基乙氨和N-甲基吗啉；所述具有α-氨基保护基团的构成肽的C端的氨基酸为Fmoc-L-Pro-OH，
步骤B：用脱帽试剂将所述保护基团脱去，
步骤C：在碱性试剂和偶联试剂存在下，按照肽的从C端到N端的顺序依次连接组成肽的各个氨基酸进行反应，从而形成肽连接树脂，其中，每个氨基酸的连接都是先连接具有α-氨基保护基团的氨基酸进行接肽，然后用脱帽试剂将所述保护基团脱去进行脱帽，其中，碱性试剂选自： N,N-二异丙基乙氨和N-甲基吗啉；偶联试剂为O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐和1-羟基苯并三唑；
在步骤A和步骤C中，具有α-氨基保护基团的氨基酸的投料量为，以摩尔数计，是所连接的树脂的1.5~6倍；
在步骤A中，碱性试剂的投料量为（以摩尔数计）是所连接的树脂的2~10倍；在步骤C中，在连接每个氨基酸的接肽反应中， HBTU的投料量与具有α-氨基保护基团的氨基酸的量相等；HOBT的投料量为，以摩尔数计，是具有α-氨基保护基团的氨基酸的1.1~5倍；碱性试剂的投料量为，以摩尔数计，是具有保护基团的氨基酸的2~10倍；
步骤D：进行切肽，得到肽或其盐的粗品，
步骤E：纯化粗品，得到所述的肽或其盐，其中，
在步骤A-E中，氨基酸的α-氨基保护基团均为Fmoc；接肽试剂选自二氯甲烷，N,N-二甲基甲酰胺，N,N-二甲基乙酰胺，四氢呋喃和乙酸乙酯中的一种或更多种；脱帽试剂为哌啶:N,N-二甲基甲酰胺等于1：2~10（体积比）；脱帽试剂的加入量和待脱帽的树脂的重量比例是5~25 ml脱帽试剂/g树脂，
其中，所述各步骤中接肽反应的温度是10~35 °C，反应时间是0.5~8 小时，脱帽反应的温度是20~35 °C，反应时间是5~60分钟，
所述各步骤中切肽试剂是三氟乙酸、三异丙基硅烷和水的混合物，三氟乙酸的比例是90~95%，三异丙基硅烷的比例是0~5%，水的比例是0~5%，在20~35 °C切肽反应1~5小时。
2.在权利要求1的制备方法，其中，所述步骤E中的纯化是利用纳滤机进行的。
3.权利要求1-2中任一项的制备方法，其中，所述步骤D中利用氮气吹干的方法得到了浓缩的粗品。
4.权利要求1-3中任一项的制备方法，其中，所述肽选自：
VVYP，
其中
Y代表：L-酪氨酸；
V代表：L-缬氨酸；
P代表： L-脯氨酸；
所述肽的盐选自：硫酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、三氟乙酸盐、甲烷基磺酸盐、萘磺酸、乙酸盐、富马酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、2，5-二羟基苯甲酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐和对甲苯磺酸盐。
5.权利要求1-4中任一项的制备方法，其中，所述肽为VVYP，该方法包括：
步骤(1)：制备Fmoc-L-Pro-2-CTC树脂：
取2-CTC 树脂，用干燥的二氯甲烷浸泡，然后加入用接肽溶剂溶解的Fmoc-L-Pro-OH和N,N-二异丙基乙氨的混合物进行反应后，加入醇继续反应，抽干，洗涤，干燥，获得Fmoc-L-Pro-2-CTC树脂；
步骤(2)：制备Fmoc-L-Tyr(tBu)-L-Pro-2-CTC树脂：
在步骤(1)获得的Fmoc-L-Pro-2-CTC树脂中，加入脱帽试剂，反应，抽干，洗涤；加入用接肽溶剂溶解的Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH、HBTU、HOBT和N,N-二异丙基乙氨的混合物进行反应，抽干，洗涤，干燥，获得Fmoc-L-Tyr(tBu)-L-Pro-2-CTC树脂；
步骤(3)：制备Fmoc-L-val-L-Tyr(tBu)-L-Pro-2-CTC树脂：
在步骤(2)中获得的Fmoc-L-Tyr(tBu)-L-Pro-2-CTC树脂中，加入脱帽试剂进行反应，抽干，洗涤；加入接肽溶剂溶解的Fmoc-L-val-OH、HBTU、HOBT和N,N-二异丙基乙氨混合物进行反应，抽干，洗涤，干燥，获得Fmoc-L-val-L-Tyr(tBu)-L-Pro-2-CTC树脂；
步骤(4)：制备Fmoc-L-val-L-val-L-Tyr(tBu)-L-Pro-2-CTC树脂：
在步骤(3)获得的Fmoc-L-val-L-Tyr(tBu)-L-Pro-2-CTC 树脂中，加入脱帽试剂进行反应，抽干，洗涤；加入接肽溶剂溶解的Fmoc-L-val-OH、HBTU、HOBT和N,N-二异丙基乙氨混合物进行反应，抽干，洗涤，干燥，获得Fmoc-L-val-L-val-L-Tyr(tBu)-L-Pro-2-CTC树脂；
步骤(5)：制备L-val-L-val-L-Tyr(tBu)-L-Pro-2-CTC 树脂：
在步骤(4)获得中的Fmoc-L-val-L-val-L-Tyr(tBu)-L-Pro-2-CTC树脂中，加入脱帽试剂进行反应，获得L-val-L-val-L-Tyr(tBu)-L-Pro-2-CTC树脂。
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| US5958885A (en) * | 1996-03-22 | 1999-09-28 | Hankyu Kyoei Bussan Co., Ltd. | Peptide and formulations thereof inhibiting elevations of triglyceride levels in blood |
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