KR101136633B1

KR101136633B1 - 소마토스타틴 펩티드의 제법

Info

Publication number: KR101136633B1
Application number: KR1020067002613A
Authority: KR
Inventors: 헤리베르트 헬스테른; 베르너 파힌거; 발터 프리코스조비히; 베른하르트 비트펠트
Original assignee: 노파르티스 아게
Priority date: 2003-08-08
Filing date: 2004-08-06
Publication date: 2012-04-18
Also published as: RU2360921C2; EP1654280B1; US7615609B2; IL173272A; AU2004262570B2; TW200524955A; BRPI0413437A; WO2005014624A3; JP4580928B2; NO338367B1; IS8338A; ECSP066352A; JP2007526899A; MA27982A1; DK1654280T3; CN102127155A; NZ544961A; HRP20080350T3; PE20091210A1; CY1108775T1

Abstract

본 발명은 고리형 소마토스타틴 유사체의 제조 방법 및 이 방법에서 사용되는 선형 중간체를 제공한다.

소마토스타틴 펩티드, 선형 펩티드, 고리화, 탈보호화

Description

소마토스타틴 펩티드의 제법 {PREPARATION OF SOMATOSTATIN PEPTIDES}

본 발명은 고리형 소마토스타틴 유사체의 제조 방법 및 이 방법에서 사용되는 중간체에 관한 것이다.

더욱 구체적으로, 본 발명은 하기 화학식 I의 고리형 소마토스타틴 유사체 또는 이들의 염의 제조 방법을 제공한다.

상기 식 중,

R₁은 -C₂ _- ₆알킬렌-NR₃R₄, -C₂ _- ₆알킬렌-구아니딘 또는 -C₂ _- ₆알킬렌-COOH이고 (여기서, R₃ 및 R₄는 각각 독립적으로 H, C₁ _- ₄알킬, ω-히드록시-C₂ _- ₄알킬렌 또는 아실이거나, R₃ 및 R₄는 이들이 부착되어 있는 질소 원자와 함께 추가의 헤테로원자를 포함할 수 있는 헤테로시클릭기를 형성함),

R₂는 Z₁-CH₂-R₅, -CH₂-CO-O-CH₂-R₅,

이다 (여기서, Z₁은 O 또는 S이고, R₅는 임의로 치환된 페닐임).

임의의 아실은, 예를 들어 R_aCO-일 수 있고, 여기서 R_a는 H, C₁ _- ₄알킬, C_2-4알케닐, C₃ _- ₆시클로알킬 또는 벤질이다. NR₃R₄가 헤테로시클릭기를 형성하는 경우, 이러한 기는 방향족이거나 포화되어 있고, 1개의 질소 또는 1개의 질소와 질소 및 산소로부터 선택되는 제2 헤테로원자를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 헤테로시클릭기는, 예를 들어 피리딜 또는 모르폴리노이다. C₂ _- ₆알킬렌은 바람직하게는 -CH₂-CH₂-이다. R₅가 치환된 페닐인 경우, 페닐 고리는 예를 들어 오르토 및(또는) 파라 위치에서 할로겐, 메틸, 에틸, 메톡시 또는 에톡시로 치환될 수 있다. 바람직하게는, R₅는 비치환된 페닐이다.

2 및(또는) 5 위치에서의 아미노산은 D 또는 L 배열을 가질 수 있다. 이들 각각은 L 배열을 갖는 것이 바람직하다.

화학식 I의 화합물은 유리 또는 염 형태로 존재할 수 있다. 염에는 예를 들어 유기산, 중합산 또는 무기산, 예를 들어 염산, 아세트산, 락트산, 아스파르트산, 벤조산, 숙신산 또는 팜산과의 산 첨가 염, 또는 예를 들어 R₁이 COOH기를 포함하는 경우, 알칼리 금속염이 포함된다. 산 첨가 염은 예를 들어 유리 염기 형태의 화학식 I의 화합물에 첨가되는 산이 1 당량인지 2 당량인지에 따라서, 1가 또는 2 가 염으로서 존재할 수 있다. 바람직한 염은 아스파르테이트 이염 또는 파모에이트 일염이다.

본 발명에 따른 제조 방법은 보호된 형태의 상응하는 선형 펩티드의 고리화 단계를 포함한다. 놀랍게도, 상기 고리화 단계가 특히 상응하는 선형 펩티드의 2개의 말단 아미노산의 선택에 좌우된다는 사실을 본 발명에 와서 알게되었다. 놀랍게도, 6가지의 고리화 가능성 중에서, 3번과 4번, 또는 4번과 5번, 또는 6번과 1번 아미노산 간의 고리화가 매우 흥미로운 결과를 제공한다는 것을 알게되었다. 4번과 5번 아미노산 간의 고리화가 특히 바람직하다. 3번과 4번, 또는 4번과 5번, 또는 6번과 1번 아미노산 간의 본 발명에 따른 고리화는 키랄 부위에서의 이성질화가 감소된 개선된 수율를 제공한다. 또한, 이러한 고리화 단계는 덜 엄격한 조건 및 반응물로 수행될 수 있다: 예를 들어 아지드를 사용한 고리화를 피할 수 있다.

본 발명의 제1 실시양태에서, 하기 화학식 II, 화학식 III 또는 화학식 IV의 선형 소마토스타틴 유사체를 고리화하는 단계,

필요한 경우 보호기(들)를 제거하는 단계, 및

이렇게 얻어진 유리 형태 또는 염 형태의 화학식 I의 화합물을 회수하는 단계

를 포함하는, 상기 화학식 I의 화합물 또는 이들의 염의 제조 방법이 제공된다.

상기 식 중,

R₁ 및 R₂는 상기에 정의한 바와 같고,

R₁₁ 및 R₁₂는 각각 독립적으로 아미노 보호기이며,

R₁이 말단 NH₂를 포함하는 경우, 이 말단 NH₂도 아미노 보호기에 의해 보호된다.

적합한 아미노 보호기는, 예를 들어 문헌 ["Protective Groups in Organic Synthesis", T. W. Greene et al., John Wiley & Sons Inc., Second Edition 1991]에 기재된 바와 같다. 이러한 아미노 보호기는, 예를 들어 펩티드 합성에서 사용되는 아세틸기 또는 아미노기, 예를 들어 tert.-부톡시-카르보닐, 카르보벤족시, 플루오레닐메톡시카르보닐, 알록시카르보닐, 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로헥실리덴)에틸, 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로헥실리덴)-3-메틸부틸, 4-메틸트리틸이 다 (문헌 [W. C. Chan and P. D. White, Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Oxford University Press, 2000]).

고리화는 통상적으로, 동일계내에서 카르복시 활성화를 위해 아미늄계 또는 포스포늄계 유도체, 예를 들어 O-(벤조트리아졸-1-일)N,N,N',N'-테트라메틸우로늄-헥사플루오로포스페이트, 벤조트리아졸-1-일옥시트리스(피롤리디노) 포스포늄 헥사플루오로포스페이트, N-[(1H-벤조트리아졸-1-일)(디메틸아미노)메틸렌]-N-메틸 메탄아미늄 테트라플루오로보레이트 N-옥시드, N-[(디메틸아미노)-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리딘-1-일메틸렌]-N-메틸메탄아미늄, 7-아자벤조트리아졸-1일옥시트리스(피롤리디노)-포스포늄 헥사플루오로포스페이트의 존재하에 수행될 수 있다. 바람직하게는, 반응이 염기, 예를 들어 유기 아민, 예를 들어 N-에틸 디이소프로필 아민, N-메틸모르폴린, 트리에틸아민 또는 트리벤질 아민의 존재하, 및 보조 친핵체, 예를 들어 1-히드록시벤조트리아졸, N-히드록시숙신이미드, 3-히드록시-3,4-디히드로-1,2,3-벤조트리아진-4-온 또는 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸의 존재하에 수행될 수 있다.

화학식 II, III 또는 IV의 화합물을 고리화하면, 보호된 형태의 화학식 I의 화합물, 즉 분자 내에 존재하는 1개 이상 또는 모든 아미노기가 아미노 보호기에 의해 보호된 화학식 I의 화합물이 생성된다. 이러한 화합물은, 예를 들어 시클로[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH₂-CH₂-NH-CO-O)-Pro-Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-], 시클로[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH₂-CH₂-NH-CO-O)-Pro-Phg-D-Trp-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)- Phe-] 및 시클로[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH₂-CH₂-NH-CO-O)-Pro-DPhg-D-Trp-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-]이다.

아미노 보호기는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 트리플루오로아세트산; 3M HCI, EtOAc; Me₃CCl, 페놀, CH₂Cl₂; 10％ H₂SO₄, 디옥산; 및 브로모카테콜보란을 사용한 분해 (cleavage)에 의해 제거될 수 있다.

화학식 II, III 및 IV의 화합물 또는 이들의 염은 신규하며, 본 발명의 일부를 형성한다. 이러한 화합물은 두 펩티드 단위를 아미드 결합에 의해 서로 연결함으로써 제조될 수 있으며, 여기서 이들은 각각 보호된 또는 보호되지 않은 형태의 1종 이상의 아미노산을 함유하고, 아미드 결합은 화학식 II, III 또는 IV에서 정의된 바와 같은 목적하는 아미노산 서열이 얻어지는 방식으로 이루어진다.

합성은 당업계에 공지된 방법에 따라, 예를 들어 제1 아미노산으로 출발하는 용액 또는 고체상 합성에 의해 수행될 수 있다. 고체상 합성에서, 제1 아미노산은 수지, 예를 들어 구입가능한 폴리스티렌계 수지에, 임의로 적합한 결합제, 예를 들어 측쇄 보호가 완전하게 유지되는 온화한 조건하에서 분해될 수 있는 결합제, 예를 들어 임의로 치환된 트리틸계 결합제, 예를 들어 4-(히드록실-디페닐-메틸)-벤조산 (여기서, 페닐기 중 하나는 임의로 Cl 등에 의해 치환될 수 있음)을 통해 부착된다. 용액 합성이든 고체상 합성이든, 목적하는 펩티드 쇄의 제조는 통상적인 방법, 예를 들어 말단 아미노기가 Fmoc으로 보호되고, 측쇄 아미노기가 존재하는 경우 이것이 상이한 아미노 보호기, 예를 들어 Boc 또는 CBO로 보호되는 아미노산 을 사용하여 수행될 수 있다.

합성이 고체상 합성에 의해 수행되는 경우, 제조된 펩티드는 이후에 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 아세트산; 트리플루오르아세트산; 아세트산-트리플루오로에탄올-디클로로메탄; 및 디클로로메탄 중 헥사플루오로이소프로판올을 사용하여 수지로부터 제거된다. 고체상으로부터 제조된 펩티드를 제거하는 바람직한 방법은, 예를 들어 비-염소화 트리틸계 결합제를 사용하는 경우, 예를 들어 바람직하게는 실온에서 메탄올/디클로로메탄으로 처리하는 방법, 또는 바람직하게는 약 50 ℃의 온도에서 케톤, 예를 들어 에틸 메틸 케톤으로 처리하는 방법이다.

화학식 II, III 및 IV의 화합물은, 예를 들어

이다.

화학식 II, III 또는 IV의 화합물은 상기에 화학식 I의 화합물에서 기재된 바와 같이 염 형태로 존재할 수 있다.

화학식 I의 화합물은 유용한 소마토스타틴 길항제이고, 예를 들어 WO 97/01579호 또는 WO 02/10192호 (약리학적 특성을 개시한 이들의 내용이 본원에서 참고로 포함됨)에 개시된 바와 같이 흥미로운 약리학적 특성을 갖는다. 바람직한 화합물은 시클로[{(4-NH₂-C₂H₄-NH-CO-O)-Pro}-Phg-DTrp-Lys-Tyr(4-벤질)-Phe] 또는 그의 염이다. 바람직한 염은 아스파르테이트(모노- 또는 디-아스파르테이트) 또는 파모에이트이다.

본 발명의 방법을 사용할 때, 화학식 II, III 또는 IV의 상응하는 선형 펩티드의 고리화 수율이 70 ％ 초과로 달성될 수 있다.

하기 실시예에서 본 발명을 예시한다. 모든 온도는 섭씨 기준이다.

하기 약어를 사용하였다:

Bzl = 벤질

DAEM = 디에틸아민

DICI = 디이소프로필 카르보디이미드

DMF = N,N-디메틸포름아미드

DPPA = 디페닐포스포릴 아지드

EDIPA = N-에틸 디이소프로필 아민

HBTU = O-(벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄-헥사플루오로포스페이트

HOBT = 1-히드록시-벤조트리아졸

IPA = 이소프로필 알코올

Phg = 페닐글리신

RT = 실온

TBME = tert-부틸메틸 에테르

실시예 1: [H- Tyr ( Bzl )- Phe -(2S,4R)-4-( Boc -NH- CH ₂ - CH ₂ -NH-CO-O)-Pro- Phg -D-Trp- Lys ( Boc )-OH]

(FMOC-Tyr(Bzl)-Phe-[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH₂-CH₂-NH-CO-O)]-Pro-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OH) 10.4 g을 100 ml DMF 중에 용해하였다. RT에서 2.0 ml 디에틸아민을 첨가하고, RT에서 4시간 동안 교반을 계속하였다. 40 ℃에서 투명한 황색 용액을 증발시켰다. 잔사에 150 ml 이소프로필 아세테이트를 첨가하였다. 시딩하고 RT에서 18 시간 동안 교반하고, 여과하고 20 ml 이소프로필 아세테이트로 세척하였다. 40 ℃에서 건조시켰다.

출발 물질로서 사용되는 화합물을 하기와 같이 제조하였다:

a) Z-D-Trp- Lys ( BOC )- OMe

230 ml THF 중 Z-D-Trp-OH 23.7 g 용액에 RT에서 HOBt 9.5 g을 첨가하였다. 투명 무색 용액이 형성되었다. 이후, RT에서 H-Lys(BOC)-OMe.HCl 20.8 g을 첨가하고, 이어서 N-메틸모르폴린 7.7 ml를 첨가하였다. 미세 현탁액을 0 ℃로 냉각하고, 디이소프로필카르보디이미드 11.4 ml를 첨가하였다. 0 ℃에서 1 시간 동안 교반한 후, RT에서 3 시간 동안 교반하였다. 120 ml 물 중 진한 황산 용액 7.0 g을 현탁액에 첨가하였다. 150 ml 에틸 아세테이트로 추출하고, 상을 분리하고, 포화 염수 100 ml, 25％ 염수 100 ml, 및 5％ 중탄산 나트륨 용액으로 연속해서 유기상을 세척하였다. 이어서, 유기상을 MgSO4로 건조시키고 증발시켰다. 잔사를 250 ml 이소프로필 아세테이트 중에 녹이고, RT에서 2 시간 동안 교반하였다. 여과하고 40 ℃에서 건조하여 백색 물질인 Z-D-Trp-Lys(BOC)-OMe 40.9 g을 수득하였다. HPLC 조건: MN 뉴클레오실 (Nucleosil) 100 A/C18; 5 마이크론; 250 x 4 mm; 상 A: 0.24％ 인산, 상 B 아세토니트릴; 구배: 30 분에 걸쳐 B를 20에서 80％로; 파장 220 nm; 유속 1.3 ml/분; 온도 35 ℃: 순도 97.8％ b.a. (24.2 분).

b) H-D-Trp- Lys ( BOC )- OMe

Z-D-Trp-Lys(BOC)-OMe 19.8 g (34.1 mmol)을 220 ml 메탄올 중에 용해하고, PdC 10％ 촉매 2.2 g을 첨가하고, RT에서 수소화하였다. RT에서 1 시간 후 수소화를 종료하고, 촉매를 여과 제거하고, 여액을 30 ℃에서 증발시켰다: 백색 고형물. HPLC: 98.1％ b.a. (16.2 분).

c) Z- Phg -D-Trp- Lys ( BOC )- OMe

H-D-Trp-Lys(BOC)-OMe 17.0 g을 80 ml THF와 혼합하였다. Z-Phg-OH 9.2 g을 RT에서 회색 현탁액에 첨가하였다. 4.4 g HOBt를 첨가하고, 20 ml THF로 린스하였다. 탁한 황색 용액을 0 ℃로 냉각시키고, 15 ml THF 중 5.3 ml DICI 용액을 10 분 이내에 첨가하였다. 0 ℃에서 2 시간 동안 교반한 후, RT에서 2 시간 동안 교반하였다. 이어서, 57 ml 물 중 3.6 황산 용액을 첨가하고, 70 ml 에틸 아세테이트로 추출하고, 물, 포화 염수, 5％ 중탄산 나트륨, 25％ 염수로 세척하고, MgS04 로 건조시키고, 증발시켰다. 백색 잔사를 40 ℃에서 2 시간 동안 125 ml 이소프로필 아세테이트 중에 교반하고, 현탁액을 여과하였다. 잔사를 40 ℃에서 건조하였다: 약간 황색인 물질. HPLC: 96.3％ b.a. (25.3 분).

d) H- Phg -D-Trp- Lys ( BOC )- OMe

(Z-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OMe) 23.4 g (23.8 mmol)을 260 ml 메탄올 중에 용해하고, Pd/C 10％ 2.6 g을 첨가하고, RT 및 상압에서 수소화하였다. 3 시간 후에, 촉매를 여과 제거하고, 여액을 30 ℃에서 증발시켰다: 백색 고형물. HPLC 95.9％ b.a. (17.6 분).

e) Z-[(2S,4R)-4-( Boc -NH- CH ₂ - CH ₂ -NH-CO-O)]-Pro- Phg -D-Trp- Lys ( BOC )- OMe

(2S,4R)-4-(2-tert-부톡시카르보닐아미노에틸카르바모일옥시)-피롤리딘-1-카 르복실산 벤질 에스테르-2-카르복실산 11.1 g 및 H-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OMe 19.0 g을 RT에서 290 ml THF 중에 용해하였다. HOBt 3.32 g을 첨가하고, 탁한 용액을 0 ℃로 냉각시켰다. 90 ml THF 중 4.56 ml DICI 용액을 첨가하였다. 0 ℃에서 24 시간 동안 교반하였다. 이어서 22 ml 물 중 2.2 g 황산의 용액을 RT에서 첨가하고, 약간 오팔 (opal)색인 용액을 15 분 동안 교반한 후, 500 ml 물에 적하하였다. 더 이상 THF가 증류되지 않을 때까지 백색 현탁액을 50 ℃에서 증발시켰다. 현탁액을 여과하고, 잔사를 각각 80 ml 물로 4회 세척한 후, 250 ml 메탄올로 세척하고, 이어서 총 80 ml 메탄올로 2회 세척하였다. 50 ℃에서 하룻밤 건조시켰다. HPLC 91.0％ b.a. (19.5 분).

f) H-[(2S,4R)-4-( Boc -NH- CH ₂ - CH ₂ -NH-CO-O)]-Pro- Phg -D-Trp- Lys ( BOC )- OMe

Z-[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH₂-CH₂-NH-CO-O)]-Pro-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OMe 22.0 g (12.7 mmol)을 220 ml DMF 중에 용해하고, Pd/C 10％ 4.4 g을 첨가하였다. RT에서 4 시간 동안 수소화하였다. 그후, 촉매를 여과 제거하고, 여액을 600 g 얼음 및 400 ml 물의 혼합물에 첨가하였다. 침전된 생성물을 여과 제거하고, 수세하였 다. 30 ℃에서 건조시켜 회색 고형물을 수득하였다. HPLC: 97.0％ b.a. (12.3 분).

g) Z- Phe -[(2S,4R)-4-( Boc -NH- CH ₂ - CH ₂ -NH-CO-O)]-Pro- Phg -D-Trp- Lys ( BOC )-OMe

Z-Phe-OH 5.1 g 및 H-[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH₂-CH₂-NH-CO-O)]-Pro-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OMe 16.5 g을 250 ml THF 중에 용해하고, HOBT 2.29 g을 첨가하고, 암색 용액을 0 ℃로 냉각시켰다. DICI 3.1 ml를 80 ml THF 중에 용해하고, 0 ℃에서 반응 혼합물에 첨가하였다. 0 ℃에서 24 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 10％ 황산 200 ml에 첨가하고, 침전된 고형물을 여과 제거하고, 수세하였다. 여과 후, 잔사를 200 ml 메탄올과 혼합하고, 현탁액을 여과 제거하였다. 40 ℃에서 건조시켰다. HPLC: 97.2％ b.a. (21.1 분).

h) (H- Phe -[(2S,4R)-4-( Boc -NH- CH ₂ - CH ₂ -NH-CO-O)]-Pro- Phg -D-Trp- Lys ( BOC )-OMe)

Z-Phe-[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH₂-CH₂-NH-CO-O)]-Pro-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OMe 8.5 g을 180 ml DMF 중에 용해하고, Pd/C 10％ 4.25 g을 첨가하고, 혼합물을 RT에서 6 시간 동안 수소화하였다. 그후, 촉매를 여과 제거하고, 여액을 40 ℃에서 증발시켰다. RT에서 잔사 (30 g)에 600 ml t-부틸 메틸 에테르를 적하하고, 현탁액을 여과하고, 잔사를 300 ml TBME로 세척하였다. 40 ℃에서 건조시켰다. HPLC 93.1％ b.a. (16.6 분).

i) FMOC - Tyr ( Bzl )- Phe -[(2S,4R)-4-( Boc -NH- CH ₂ - CH ₂ -NH-CO-O)]-Pro- Phg -D-Trp-Lys(BOC)-OMe

H-Phe-[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH₂-CH₂-NH-CO-O)]-Pro-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OMe 6.5 g, FMOC-Tyr(Bzl)-OH 3.1 g 및 HOBT 0.86 g을 180 ml THF 중에 현탁시키고, 0 ℃로 냉각시켰다. LiBr 5.5 g을 첨가한 후, THF 20 ml를 첨가하였다. 이어서, 50 ml THF 중에 용해한 1.18 ml DICI를 첨가하고, 암색 현탁액을 0 ℃에서 2 시간 동안 교반하였다. 냉각조를 제거하고, 24 시간 동안 교반을 계속하였다. 이어서, 0.65 g 황산 및 6.5 ml 물을 첨가한 후, 160 ml 물을 첨가하였다. 40 ℃에서 증발시키고, 잔사를 여과하고, 최종 세척수의 pH가 4.0이 될 때까지 수세하였다. 여과 케이크를 30 ml 메탄올 중에 교반하고, 현탁액을 여과하고, 잔사를 10 ml 메탄올로 세척하였다. 35 ℃에서 건조시켜, 회색 물질을 수득하였다. HPLC 95.4％ b.a. (26.0 분).

j) FMOC-Tyr(Bzl)-Phe-[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH ₂ -CH ₂ -NH-CO-O)]-Pro-Phg-D-Trp- Lys ( BOC )-OH

FMOC-Tyr(Bzl)-Phe-[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH₂-CH₂-NH-CO-O)]-Pro-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OMe 13.0 g을 250 ml THF 중에 현탁시켰다. LiBr 7.3 g 및 THF 75 ml를 첨가하였다. 이어서, 1몰 NaOH 8.7 ml를 RT에서 20 분 내에 서서히 첨가하였다. RT에서 3 시간 동안 교반을 계속한 후, 다음 15 시간 내에 1몰 NaOH 5 ml를 추가로 첨가하였다. 최종 반응 용액을 34 ml 물 중 1.7 g 황산 용액에 첨가하였다. 생성된 2상-혼합물을 50 ml 에틸 아세테이트에 첨가하였다. 상을 분리한 후, 유기 상을 염수로 3회 세척하고, 이어서 증발시켰다. 잔사에 25 ml DIF를 첨가하였다. 생성된 투명한 DIF 용액을 260 ml 물에 첨가하였다. 생성된 현탁액을 여과하고, 여과 케이크를 3회 수세하고, 40 ℃에서 하룻밤 동안 건조시켰다. HPLC 71.9％ b.a. (28.6 분).

실시예 2:

4-( 클로로(디페닐)메틸 ) 벤조일 아미노메틸 폴리스티렌 수지의 제조

합성은 수동으로 작동되는 질소하 소결 유리 프릿이 장착된 1 L 교반 회분식 반응기 중에서 수행하였다. DMF로 예비처리한 시판되는 아미노메틸폴리스티렌 수지 (30.4 g 41.07 mmol)와, DMF (140 ml) 중 4-(히드록실-디페닐-메틸)벤조산 (15.0 g, 49.28 mmol, 1.2 당량), 히드록시벤조트리아졸 (HOBT) (7.54 g, 49.28 mmol, 1.2 당량) 및 DICI (12.43 g, 98.57 mmol, 2.4 당량)의 용액을 RT에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 감압하에서 프릿을 통해 여과함으로써 용매를 제거하고, 수지를 차례로 DMF로 5회, 메탄올로 5회 세척하였다. 40 ℃에서 진공하에 건조하여 44.69 g 수지를 수득하였다. 상기 수지는 하기 헥사펩티드의 합성에서 출발 물질 로서 사용된다.

보호된 선형 펩티드의 합성 절차

수지가 결합된 선형 헥사펩티드를 질소하 소결 유리 프릿이 장착된 교반 회분식 반응기 중에서 반복적인 커플링 반응에 의해 C-에서 N 방향으로 수동으로 조립하였다. 4-(클로로(디페닐)메틸)벤조일 아미노메틸 폴리스티렌 수지를 출발 물질로서 사용하고, Nα-탈보호화의 반복 사이클로 구성된 표준 프로토콜 (DMF 중 20％ v/v 디에틸 아민 (DAEM))을 통해 운반하고, DMF 및 IPK로 차례로 세척 및 RT에서 커플링 (DIPCI/HOBT, DIEPA 및 DMF)을 반복하였다. 상기 커플링 절차를 약간 변경하여, 상기 아미노산을 0 ℃에서 커플링하는 특수 처리를 실시하여 페닐글리신의 라세미화를 최소화하였다. 완전히 조립된 보호된 선형 펩티드가 수지 지지체로부터 분해되기 전에, Nα-Fmoc 보호기를 제거한다.

Fmoc-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH₂-CH₂-NH-CO-O)-Pro-OH를 WO02/101192호에 개시된 바와 같이 합성하였다. 다른 모든 아미노산은 구입가능하다.

H- Tyr ( Bzl )- Phe -(2S,4R)-4-( Boc -NH- CH ₂ - CH ₂ -NH-CO-O)-Pro- Phg -D-Trp(Boc)Lys(Boc)-OH의 합성

a) Fmoc-Lys(Boc)-O-수지의 합성

톨루엔으로 예비처리한 4-(클로로(디페닐)메틸)벤조일 아미노메틸 폴리스티렌 수지 (20 g, 19.4 mmol)와 아세틸 클로라이드 (7.6 g, 97 mmol)를 톨루엔 중에 RT에서 4 시간 동안 처리하였다. 여과 후, 상기 절차를 하룻밤 동안 반복하고, 이어서 수지를 여과하고 톨루엔과 디클로로메탄으로 세척하였다. Fmoc-Lys(Boc)-OH (18.2 g, 38.8 mmol; 2 당량) 및 N-메틸모르폴린 (3.94 g, 38.8 mmol, 2 당량)의 혼합물로 RT에서 4 시간 동안 커플링을 수행하였다. 여과 후, 수지를 DMF 및 IPA로 차례로 3회 세척하고, 진공하에 건조하여 용량이 0.566 mmol/g (Fmoc법으로 결정함)인 황색 Fmoc-Lys(Boc)-O-수지 26.5 g을 수득하였다 (문헌 [Lit. Fmoc-method: Meienhofer, J.; Waki, M; Heimer, E.P.; Lambros, T.J.; Makofske, R.C.; Chang, C.D. Int. J. Pep. Prot. Res. 1979, 13, 35]).

b) 수지-O-Lys(Boc)-D-Trp(Boc)-Phg-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH₂-CH₂-NH-CO-O)-Pro-Phe-Tyr(Bzl)-H

Fmoc-Lys(Boc)-O-수지 (28.0 g, 19.96 mmol)를 DMF 중에 현탁시키고, DMF 중 DAEM (20％ v/v)의 용액으로 RT에서 10 분 동안 처리하였다. 여과한 후, 상기 절차를 반복하고, 이어서 DMF 및 IPA로 차례로 3회 세척한 후, DMF로 3회 세척하였다. 상기 Nα-Fmoc-탈보호화 및 세척 절차를 각 커플링 단계 후에 반복하였다.

RT에서 30 분 동안 교반한 아미노산, HOBT 및 DICI의 혼합물로 커플링을 실시한 후, 한꺼번에 수지에 첨가하였다. 완결할 때까지, 즉 음성 "카이저 (Kaiser)" 닌하이드린 시험으로 모니터링하여 잔류 아미노기가 완전히 사라질 때까지 커플링을 계속하였다. 커플링한 후, 수지를 DMF로 5회 세척하여, Fmoc-보호용으로 준비하였다.

하기 아미노산-유도체를 순차적으로 커플링하였다:

Fmoc -D-Trp( Boc )-OH (16.81 g, 31.92 mmol, 2 당량), DIF (100 ml), HOBT (4.93 g, 32.24 mmol, 2.02 당량), DICI (5.35 g, 42.45 mmol, 2.66 당량).

Fmoc - Phg -OH (11.92 g, 31.92 mmol, 2 당량), THF (70 ml), HOBT (4.93 g, 32.24 mmol, 2.02 당량), DICI (5.35 g, 42.45 mmol, 2.66 당량). 상기 아미노산을 0 ℃에서 커플링하는 특수 처리를 실시하여 페닐글리신의 라세미화를 최소화하였다.

Fmoc -(2S,4R) 4-( Boc -NH- CH ₂ - CH ₂ -NH-CO-O)-Pro-OH (17.26 g, 31.92 mmol, 2 당량), DIF (100 ml), HOBT (4.93 g, 32.24 mmol, 2.02 당량), DICI (5.35 g, 42.45 mmol, 2.66 당량).

Fmoc - Phe -OH (12.36 g, 31.92 mmol, 2 당량), DIF (100 ml), HOBT (4.93 g, 32.24 mmol, 2.02 당량), DICI (5.35 g, 42.45 mmol, 2.66 당량).

Fmoc - Tyr ( Bzl )-OH (15.75 g, 31.92 mmol, 2 당량), DIF (100 ml), HOBT (4.93 g, 32.24 mmol, 2.02 당량), DICI (5.35 g, 42.45 mmol, 2.66 당량).

완전히 조립된 보호된 선형 펩티드가 수지 지지체로부터 분해되기 전에, 수지를 RT에서 10 분 동안 DMF 중 DAEM (20％ v/v) 용액으로 처리함으로써 Nα-Fmoc 보호기를 제거하였다. 여과한 후, 상기 절차를 반복하고, DMF 및 IPA로 차례로 3회 세척한 후, DMF로 3회 세척하였다.

(40 ℃에서 진공하에 수지를 건조시켜 황색 수지를 수득하였음).

c) 수지 지지체로부터의 선형 펩티드의 분해:

H-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH₂-CH₂-NH-CO-O)-Pro-Phg-D-Trp(Boc)Lys(Boc)-OH

Ca) AcOH/CH₂Cl₂/H₂0 45/45/5 v/v/v를 사용한 방법

완전히 조립된 보호된 선형 펩티드 수지-O-Lys(Boc)-D-Trp(Boc)-Phg-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH₂-CH₂-NH-CO-O)-Pro-Phe-Tyr(Bzl)-H (24.5 g)를 AcOH/CH₂Cl₂/H₂O 45/45/5 v/v/v (150 ml)의 혼합물 중에 현탁시키고, RT에서 1 시간 동안 교반하고, 여과하고, CH₂Cl₂로 세척하였다. 여액을 증발하여 건조시키고, TBME 및 헵탄 7/3 v/v의 혼합물과 함께 잔사를 1 시간 동안 교반하고, 여과하고, 진공하에 건조시켰다. 황색 고형물을 수득하였다; 함량: 93.5％ HPLC g/g; 순도 91.6％ (F)-HPLC 및 2.5％ (F)-HPLC D-Phg-에피머.

수지 (4-(클로로(디페닐)메틸)벤조일 아미노메틸 폴리스티렌 수지)를 메탄올로 3회 세척하고, 건조시켜, 재사용이 가능하게 하였다.

Cb) CH₂Cl₂ 및 MeOH을 사용한 방법

완전히 조립된 보호된 선형 펩티드 수지-O-Lys(Boc)-D-Trp(Boc)-Phg- (2S,4R)-4-(Boc-NH-CH₂-CH₂-NH-CO-O)-Pro-Phe-Tyr(Bzl)-H (6.2 g)를 CH₂Cl₂/MeOH 1/1 v/v (115 ml)의 혼합물 중에 현탁시키고, RT에서 3일 동안 교반하고, 여과하고, CH₂Cl₂로 세척하였다. 여액을 증발하여 건조시키고, TBME 및 헵탄 7/3 v/v의 혼합물 (60 ml)과 함께 잔사를 1 시간 동안 교반하고, 여과하고, 진공하에 건조시켰다. 함량: 93.5％ HPLC g/g; 순도 92.6％ (F)-HPLC 및 1.1％ (F)-HPLC D-Phg-에피머.

Cc) 에틸 메틸 케톤/MeOH을 사용한 방법

완전히 조립된 보호된 선형 펩티드 수지-O-Lys(Boc)-D-Trp(Boc)-Phg-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH₂-CH₂-NH-CO-O)-Pro-Phe-Tyr(Bzl)-H (4.0 g)을 디에틸 메틸 케톤 1/1 v/v (24 ml) 중에 현탁시키고, 50 ℃에서 15 시간 동안 교반하고, 여과하고, MeOH로 세척하였다. 여액을 증발하여 건조시키고, TBME 및 헵탄 7/3 v/v의 혼합물 (60 ml)과 함께 잔사를 1 시간 동안 교반하고, 여과하고, 진공하에 건조시켰다. 함량: 88.1％ HPLC g/g; 순도 95.2％ (F)-HPLC 및 1.8％ (F)-HPLC D-Phg-에피머.

정제

분석을 목적으로 선형 펩티드를 RP 크로마토그래피로 정제하였다.

특성화

RP-크로마토그래피로 정제한 분석용 샘플의 구조를 FAB-MS, LC-MS 및 NMR-데이타로 확인하였다.

아미노산 배열을 아미노산 분석에 의해 결정하였다: 화합물을 산성 조건하에 가수분해하고, 유도체로 전환하고, 각각의 아미노산의 배열을 거울상선택적 가스 크로마토그래피/화학 이온화 질량 분광법에 의해 결정하였다.

구조의 추가적인 증거로서 상이한 선형 펩티드가 양호하게 특성화된 고리형 펩티드로 전환되는 것을 들 수 있다.

기재된 절차에 따라 하기 화합물을 합성하였다.

실시예 3: 시클로[(2S,4R)-4-( Boc -NH- CH ₂ - CH ₂ -NH-CO-O)-Pro- Phg -D-Trp( Boc )-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-]을 합성하기 위한 선형 보호된 펩티드의 고리화

H-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH₂-CH₂-NH-CO-O)-Pro-Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-OH의 고리화

아지드-방법

고리화를 위해, 선형 단편 (2.5 g, 1.83 mmol)을 DMF (391 ml) 중에 용해하고, - 5 ℃로 냉각시키고, EDIPA (0.47 g, 3.66 mmol, 2 당량) 및 DPPA (0.75 g, 2.75 mmol, 1.5 당량)로 처리하고, 완결될 때까지 이 온도에서 교반하였다 (약 20 시간). 물 (391 ml)을 반응 혼합물에 적하 첨가하고, 침전물을 여과하고, 아지드가 검출되지 않을 때까지 수세하였다. 추가의 정제없이 탈보호화 반응에 사용되는, 물로 습윤된 백색 고형물 4.9 g (참조 물질에 상응하는 HPLC의 Rf)을 수득하였다. 화합물을 HPLC에 의해 참조 화합물과 직접 비교하여 특성화하였다.

H-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH₂-CH₂-NH-CO-O)-Pro-Phg-D-Trp(Boc)Lys(Boc)-OH의 고리화

a) HBTU 방법 a

고리화를 위해, 선형 단편 (6.0 g, 3.5 mmol)을 DMF (780 ml) 중에 용해하고, - 5 ℃로 냉각시키고, EDIPA (1.13 g, 8.75 mmol, 2.5 당량), HOBT (1.18 g, 8.75 mmol, 2.5 당량) 및 HBTU (3.3 g, 8.78 mmol, 2.5 당량)로 처리하고, 완결될 때까지 이 온도에서 교반하였다 (약 2 시간). 물 (391 ml)을 RT에서 반응 혼합물에 적하 첨가하고, 침전물을 여과하고, 물과 헵탄으로 세척하고, 진공하에 하룻밤 동안 건조시켰다. 황백색 고형물 5.4 g을 수득하였다. 화합물을 HPLC에 의해 참조 화합물과 직접 비교하여 특성화하였다.

b) HBTU 방법 b

고리화를 위해, 선형 단편 (6.0 g, 4.16 mmol)을 DMF (60 ml) 중에 용해하고, - 5 ℃에서 DMF (135 ml) 중 HOBT (4.15 g, 10.4 mmol, 2.5 당량), HBTU (4.15 g, 10.4 mmol, 2.5 당량) 및 EDIPA (1.41 g, 10.4 mmol, 2.5 당량)의 혼합물 중에 적하하고, 완결될 때까지 이 온도에서 교반하였다 (약 2 시간). 물 (559 ml)을 RT에서 반응 혼합물에 적하 첨가하고, 침전물을 여과하고, 물과 헵탄으로 세척하고, 하룻밤 동안 진공하에 건조시켰다. 황백색 고형물을 수득하였다. 화합물을 HPLC에 의해 참조 화합물과 직접 비교하여 특성화하였다. 함량 77％ w/w HPLC, 순도 84 (A％)-HPLC.

상기 절차에 따라 하기 선형 펩티드를 고리화하였다:

실시예 4: 시클로[(2S,4R)-4-( Boc -NH- CH ₂ - CH ₂ -NH-CO-O)-Pro- Phg -D-Trp- Lys -Tyr(Bzl)-Phe-]트리플루오로아세트산 염의 합성

탈보호화를 완결하기 위해, 잔사 (1.5 g, 0.79 mmol)를 0 ℃에서 TFA/H₂0 95:5 (8.3 ml) 중에 용해하고, 혼합물을 30 분 동안 차가운 상태로 교반하였다. 차가운 반응 혼합물을 RT에서 TBME (29 ml) 및 헵탄 (13 ml)의 혼합물에 적하하고, 2 시간 동안 교반하였다. 침전물을 여과하고, TBME/헵탄 1:1 (v/v)로 세척하고, 진공하에 건조시켰다. 베이지색 고형물을 수득하였다. 함량 53％ w/w HPLC, 순도: 79 (A％)-HPLC.

Claims

하기 화학식 II의 선형 소마토스타틴 유사체를 고리화하는 단계,

필요한 경우 보호기(들)을 제거하는 단계, 및

이렇게 얻어진 유리 형태 또는 염 형태의 화학식 I의 화합물을 회수하는 단계

를 포함하는, 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 염의 제조 방법.

<화학식 I>

(상기 식 중,

R₁은 -C_2-6알킬렌-NR₃R₄, -C_2-6알킬렌-구아니딘 또는 -C_2-6알킬렌-COOH이고 (여기서, R₃ 및 R₄는 각각 독립적으로 H, C_1-4알킬, ω-히드록시-C_2-4알킬렌 또는 아실이거나, R₃ 및 R₄는 이들이 부착되어 있는 질소 원자와 함께 추가의 헤테로원자를 포함할 수 있는 헤테로시클릭기를 형성함),

R₂는 Z₁-CH₂-R₅, -CH₂-CO-O-CH₂-R₅,
임 (여기서, Z₁은 O 또는 S이고, R₅는 임의로 치환된 페닐임))

<화학식 II>

(상기 식 중,

R₁ 및 R₂는 상기에 정의한 바와 같고,

R₁₁ 및 R₁₂는 각각 독립적으로 아미노 보호기이며,

R₁이 말단 NH₂를 포함하는 경우, 이 말단 NH₂도 아미노 보호기에 의해 보호됨)
제1항에 있어서, 하기 화학식 II의 선형 소마토스타틴 유사체를 고리화하는 단계,

필요한 경우 보호기(들)을 제거하는 단계, 및

이렇게 얻어진 유리 형태 또는 염 형태의 화학식 I의 화합물 (여기서, R₁은 -CH₂-CH₂-NR₃R₄이고, R₂는 4-벤질옥시-페닐임)을 회수하는 단계

를 포함하는 방법.

<화학식 II>

(상기 식 중,

R₁은 -CH₂-CH₂-NR₃R₄이고, R₂는 4-벤질옥시-페닐이며, R₃, R₄, R₁₁ 및 R₁₂는 제1항에서 정의한 바와 같고,

R₁이 말단 NH₂를 포함하는 경우, 이 말단 NH₂도 아미노 보호기에 의해 보호됨)
하기 화학식 II의 화합물 또는 그의 염.

<화학식 II>

(상기 식 중,

R₁ 및 R₂는 제1항에서 정의한 바와 같고,

R₁₁ 및 R₁₂는 각각 독립적으로 아미노 보호기이며,

R₁이 말단 NH₂를 포함하는 경우, 이 말단 NH₂도 아미노 보호기에 의해 보호될 수 있음)
제3항에 있어서, R₁이 -CH₂-CH₂-NR₃R₄이고; R₂가 4-벤질옥시-페닐이고; R₁₁ 및 R₁₂가 각각 독립적으로 아미노 보호기이고; R₁이 말단 NH₂를 포함하는 경우에 이 말단 NH₂도 아미노 보호기에 의해 보호될 수 있는 것인 화학식 II의 화합물 또는 그의 염.
제3항에 있어서, H-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH₂-CH₂-NH-CO-O)-Pro-DPhg-DTrp(Boc)-Lys(Boc)-OH, H-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH₂-CH₂-NH-CO-O)-Pro-Phg-DTrp-Lys(Boc)-OH 및 H-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH₂-CH₂-NH-CO-O)-Pro-Phg-D-Trp(Boc)Lys(Boc)-OH로부터 선택되는 화학식 II의 화합물 또는 그의 염.
각각이 보호되거나 보호되지 않은 형태의 1종 이상의 아미노산을 함유하는 2개의 펩티드 단위를, 제3항의 화학식 II에서 정의된 바와 같은 목적하는 아미노산 서열이 얻어지는 방식으로 아미드 결합에 의해 서로 연결하는 단계,

필요한 경우 하나 이상의 보호기를 제거하는 단계, 및

이렇게 얻어진 유리 형태 또는 염 형태의 화학식 II의 화합물을 회수하는 단계

를 포함하는, 제3항에서 정의된 화학식 II의 화합물의 제조 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 화학식 I의 화합물이 시클로[{(4-NH₂-C₂H₄-NH-CO-O)-Pro}-Phg-DTrp-Lys-Tyr(4-벤질)-Phe]인 방법.