TWI345570B

TWI345570B - Preparation of somatostatin peptides

Info

Publication number: TWI345570B
Application number: TW093123701A
Authority: TW
Inventors: Heribert Hellstern; Werner Pachinger; Walter Priikoszovich; Bernhard Wietfeld
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2003-08-08
Filing date: 2004-08-06
Publication date: 2011-07-21
Also published as: IL173272A0; EP1654280B1; TW200524955A; GB0318682D0; NZ544961A; RU2360921C2; IS2894B; CN1832962A; PE20091210A1; CA2534224C; IS8338A; KR101136633B1; WO2005014624A2; KR20060070541A; NO20061125L; CN102127155B; RU2006106721A; BRPI0413437A; ATE394424T1; AU2004262570A1

Description

1345570

第093123701號專利申請案中文說明書替換頁(94年1月） / 九、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明係關於一種方法，其係用以製備環狀生長抑素類似物及該方法中所用之直鏈中間產物。【先前技術】

, 技術背景及/或技藝狀態於以下引證案中敘述：WO 02/010192 ； WO 99/65508 ； WO 98/04583 ； WO 97/28172 ； EP 0255224; US 6214316; US 4621073;赫須曼（Hirschmann) 等人發表於1996年第39冊之醫學化學期刊（J. Med. Chem.);布森（Beusen)等人發表於1995年第36冊之生物聚合物（Biopolymers);黃（Huang)等人發表於1992年第114冊之美國化學協會期刊（J. Am. Chem. Soc.)。【發明内容】更特定言之，本發明提供一種製備式I之環狀生長抑素類似物

或其鹽類之方法。其中

Ri為-C2-6伸烧基-NR3R4、-C2-6伸烧基-脈或-C2-6伸院基 -COOH，其中每個R3和R4獨立為H、CN4烧基、ω-經基-C2.4 94514-940114.doc 1345570 ,_______ 第093123701號專利申請案 ^ '丨八擎與更)正替換貞中文說明書替換頁(94年1月） *~~~ -- 伸烷基或醯基，或R_3和Re與其所連接之氮原子一起形成可包括另一雜環原子之雜環基團，及 R2為 Zi-CH2-R5、-CH2-CO-O-CH2-R5、

OH CH,RS 其中Z〖為氧或硫’且心為視情況經取代苯基，任一醯基可為（例如）RaC0·，其中1為11、Ci 4烷基、c2-4 烯基、C：3·6環烷基或苄基。當服3尺4形成一雜環基時，此基團可為芳香族或飽和基，且可包括一個氮原子，或一個氮原子及另一個選自氮和氧之雜環原子。較佳地，該雜環基為（例如）》比啶基或嗎啉基。較佳之C2-6伸烧基為 •CH2-CH2-。當115為經取代苯基時，該苯環可於（例如）鄰位及/或對位被鹵素、甲基、乙基、甲氧基或乙氧基取代。較佳之R5為非經取代苯基。第2位置及/或第5位置上之胺基酸可為右旋或左旋構型。較佳地每一者為左旋構型。式I化合物可以（例如）游離形式或鹽類形式存在。鹽類包括（例如）與有機酸、聚合酸或無機酸（例如與氫氯酸、乙酸、乳酸、天冬胺酸、苯甲酸、琥珀酸、或帕莫酸（pam〇ie acid)) 所形成之酸加成鹽或（例如）驗性金屬鹽（當&包括一 C〇〇H 基團時）。酸加成鹽可以單價鹽或二價鹽存在，（例如）端視i 或2價駿是否被加入到游離鹼形式之式j化合物中而定。較佳鹽類為天冬胺酸二價鹽或帕莫酸單價鹽。 94514-940114.doc

界年/刀/p修(更)正替換百I 1345570 第093123701號專利申請案中文說明書替換頁(94年1月）根據本發明之製備方法包括一保護形式之對應直鏈肽之環化步驟。現在已驚奇地發現，該環化步驟尤視對該對應直鏈肽的兩個末端胺基酸之選擇而定。在6種環化可能性中，已驚奇地發現，在胺基酸3和4、或4和5、或6和1之間 • 的環化提供了著實令人感興趣之結果；在胺基酸4和5之間 • 的環化尤佳。根據本發明之胺基酸3和4、或4和5、或6和1 之間環化增加產量（其在對掌位置處之為低異構性）。而且，此等環化步驟用較不嚴格條件和較少反應物即可完成：例如，可避免使用疊氮化合物之環化作用。在本發明之第一個具體實施例中，提供一種製備上述一式I化合物或其一鹽類之方法，其包括：

環化一式II

H2N-CH-CO-Phe-{4-(RrNHCO-O)-Pr0}-(D or DPhg-DTrpCR^ )-Lys(4-NHR12)-OH II ch2-r2

或式III

H-Lys(4-NHR12} -HN-(pH-CO-Phe-{4-(RrNHCO-0)-Pr〇HD or L)Phg-DTrp(R.”)-〇H III ch2-r2

或式IV

H^-iR^NHCO-OJ-ProHD or LJPhg-DTrpiR,, )-Lys(4-NHR12)-NH-CH-CO-Phe-OH IV CH2-R2 之直鏈生長抑素類似物，其中心和R2如定義，每一 Rn和R12獨立為一胺基保護基，因此，當Ri包括一末端NH2時，此末端NH2亦經一胺基保護基保護， 94514-940ll4.doc 1345570 评：年/乃/p修(更)正静換頁j 第093123701號專利申請案中文說明書替換頁(94年1月）及去除需要處之保護基團，及回收因此所獲之游離或鹽形式之式I化合物。舉例而言，適當之胺基保護基闡述於（例如）||protective Groups in Organic Synthesis"(T.W.Greene等人，John Wiley & Sons Inc. ,1991年第二版）中。此等胺基保護基之實例為 (例如）肽合成中所用之乙醯基或胺基（例如，第三-丁氧基羰基、碳苄氧基、芴基曱氧幾基（fluorenylmethoxycarbonyl， F mo c)、炫氧幾基（aii 〇Xy carbonyl)、1-(4，4-二曱基-2,6-二氧環亞己基）乙基、1-(4，4-二甲基-2,6 -二氧環亞己基）-3 -甲基丁基、4-甲基三笨曱基（w.C. Chan and P.D. White，Fmoc solid Phase Peptide Synthesis, Oxford University Press, 2000) 〇環化可方便性地用於原位叛基活化作用以錄-或鱗為基礎之衍生物下進行，例如〇·(笨并三氮唑基）n，n，n，，n，_ 四甲基脲-六氟碟酸、苯并三氮唑-1_氧三比咯烧基）鱗六氣填酸、Ν-[(1Η-苯并三氮唑-1·基）（二曱胺基）亞甲基]_Ν-曱基甲烷銨四氟硼酸Ν-氧化物、Ν-[(二曱胺基三氮唑 [4,5-b]吡啶-1·曱基]-N-曱基甲烷銨、7_重氮苯并三氮唑·i 氧二（°比洛烧基）-鱗六氟填酸。較佳地，該反應係在—驗（例如’有機胺’例如，N-乙基二異丙基胺、N_甲基嗎琳、三乙基胺、或三苄基胺）及一輔助親核劑（例如，丨_羥基笨并= 氮唑、N-羥基琥珀醯亞胺、3-羥基-3,4-二氫· 1,2,3-笨并二氮嗜_4_酮或羥基_7_苯并三氮唑）存在下進行。 945l4-940114.doc -9· 1345570 f /乃/p)修(更)正替.叫 """^ …' "_ _，i 第093123701號專利申請案中文說明書替換頁(94年1月）環化式II、ΠΙ或IV化合物產生一保護形式之式I化合物（亦即，其中該分子所存在之一或多個或所有胺基被一胺基保護基團所保護之式I化合物）。此等化合物之實例為（例如）環[(2S，4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-〇)-Pr〇-Phg-D-Trp (Boc)-Lys(Boc)-Try(Bzl)-Phe-]、環[(2S，4R)-4-(Boc-NH_ CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-Phg-D-Trp-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-]和環[(2S，4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)- ΡΓ0_ DPhg-D-Trp-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe·]。根據此項技術中熟知之方法可去除該胺基保護基，例如以三氟乙酸；3M HC1、EtOAc ; Me3CCl、苯酴、CH2C12 ; 10% Ηβ〇4、呤烷；溴化兒茶酚硼烷進行（例如）裂解β 式II、III和IV化合物或其鹽類是新賴的，且為本發明之一部分’將兩個肽單位（每個肽單位包含至少一個保護或非保護形式的胺基酸）以醯胺鍵連接在一起可製備該等化合物，其中此種方式之醯胺鍵能夠獲得在式Π、：^或IV中所定義之所需胺基酸序列。可根據此項技術中所熟知之方法從第一個胺基酸開始進行合成作用’例如，在溶液中進行，或以固相合成。在固相合成中，將第一個胺基酸視情況以一適當連接物粘附到 Μ月曰（例如，以聚本乙烯為基礎之市售樹脂）上，該連接物爲（例如）一在溫和條件下可被裂解以保持側鏈完整保護之連接物，例如，一選擇性取代以三苯甲基為基礎之連接物，例如4-(羥基-二苯基_ ▼基）_苯甲酸，其中一個苯基可視情 94514-940114.doc 1345570 ^ f . —… > 第093123701號專利申請案年/乃/(更J t替货虿| 中文說明書替換頁(94年1月）---—~— 況經（例如）C1取代。無論是在溶液中或以固相合成，可以傳統方法完成所需肽鏈之構建，例如，使用其中末端胺基為經Fmoc-保護之胺基酸，存在側鏈胺基的地方則以一不同的胺基保護基團（例如B〇c或CBO)進行保護。 • 當以固相合成完成該合成作用時，可根據此項技術中所熟知之方法，（例如）用乙酸；三氟乙酸；乙酸-三氟乙醇-二氣甲烷；溶於二氣甲烷中之六氟異丙醇將該構建肽從樹脂上移除。一自固相上移除構建肽之較佳方法為，（例如）當使用一非氯化之以三苯甲基為基礎之連接物時，用（例如）甲烷/二氯甲烷處理，較佳在室溫下，或用酮（例如，乙基甲基酮）處理，較佳在約50°C之溫度下。舉例而言，式Π ' III和IV化合物之實例為： H-Lys(Boc)-D-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2

-NH-CO-0)-Pro-Phg-D-Trp(Boc)-OH H-Lys(Boc)-D-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2

-NH-CO-0)-Pro-Phg-D-Trp-OH H-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-Phg-D-Trp

(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-OH H-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)

-Pro-DPhg-DTrp(Boc)-Lys(Boc)-OH H-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)

-Pro-Phg-DTrp-Lys(Boc)-OH H-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0) 94514-940114.doc 1345570 第093123701號專利申請案夺年/刀夕^修(更j t#換頁中文說明書替換頁(94年1月） --~----— -Pro-Phg-D-Trp(Boc)Lys(Boc)-OH。式II、III或IV化合物可以如上文式I化合物所揭示之鹽形式存在。該式I化合物為重要的生長抑素激動劑，且具有如WO 97/0 1579或WO 02/10192中所揭示令人感到有興趣之藥理學特性，其所揭示之該藥理學特性之内容以引用方式併入本說明書參考。一較佳之化合物為環[{(4-NH2-C2H4-NH-CO-0)-Pro}-Phg-DTrp-Lys-Tyr(4-苄基）-Phe]或其鹽類。較佳之鹽類為天冬胺酸鹽（單價-或雙價-天冬胺酸鹽）或帕莫酸鹽。當應用本發明之方法時，對應式II、III或IV直鏈肽之環化產量高於70%。【實施方式】下文將以實例闡述本發明。所有溫度係以為°c表示。使用下列縮寫詞：

Bzl =苄基 DAEM =二乙基胺 DIC1 =二異丙基碳二亞胺 DMF =N，N-二曱基甲醯胺 DPPA =二苯基磷醯基疊氮化合物 EDIPA =N-乙基二異丙基胺 HBTU =0-(苯并三氮唑-卜基）-Ν，Ν，Ν·，Ν'-四曱基脲- 六氟填酸 94514-940H4.doc -12- 1345570 — ________ 第093123701號專利申請案1个/，^日'(史)止另中文說明書替換頁(舛年1月）----1 HOBT =1-羥基-苯并-三氮唑 IPA =異丙醇 Phg =笨基甘胺酸 RT =室溫 TBME =第三-丁基甲基醚實例1:旧-丁)^(821)-?1|6-(28,411)-4-(8〇(：-]\11-0：112-€112- NH-CO-〇)-Pro-Phg-D-Trp，Lys(Boc)-OH】

將 10.4 克（FMOC-Tyr(Bzl)-Phe-[(2S，4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)]-Pro-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-OH)溶於 1〇〇毫升 DMF中。RT下，加入2.0毫升二乙基胺，然後於RT下連續攪拌4小時。在40°C下蒸發該澄清黃色溶液。在該殘餘物中加入150毫升乙酸異丙酯。播晶並在RT下攪拌1 8小時，過濾並用20毫升乙酸異丙酯洗滌。於40°C下乾燥。HPLC 87.5% b.a.(17.6 分鐘）。ESI-MS : 1287.5(M+Na)+; 'H-NMR (DMSO)(a，DMSO): 1.14(2H，m)，1.33(2H，m)，1.37(18H， 945l4-940U4.doc -13· 1345570

第093123701號專利申請案 f …_.· ) 中文說明書替換頁(94年1月） m), 1.53(1H, m), 1.64(1H, m), 2.06(1H, m), 2.22(1H, m), 2.78-3.15(12H, m), 3.38(1H, m), 3.79(2H, br)5 4.12(1H, m), 4.55-4.75(3H, m), 5.06(2H, s), 5.15(1H, d), 5.54(1H, d), 6.75(1H, br), 6.83(1H, br), 6.89(2H, d), 6.94(1H, t), 6.99(111，8)，7.43(211，（1)，7.10-7.50(芳族，11)，7.59(111，（1)， 8.14(1H，d)，8·45-8.55(2Η，m)，8.60(1H，d)，10.71(1H，br)。按以下方法製備用作原料之化合物： a)Z-D-Trp-Lys(BOC)-OMe

10'下’將9.5克1108|加至溶於230毫升1'肝之23.7克 Z-D-Trp-OH之溶液中’形成澄清無色溶液。在RT下，加入 20.8克H-Lys(BOC)-〇Me.HCl ’接著加入7.7毫升N-曱基嗎啉。將該精製懸浮液冷卻至〇它，然後加入丨丨4毫升二異丙基碳亞胺。〇°C下攪拌1小時，然後在RT下攪拌3小時。將溶於120毫升水之7.0克濃硫酸之溶液加至該懸浮液中。用毫升乙酸乙酯萃取、分離各相、然後用1〇〇毫升飽和鹽水、 100毫升25%鹽水、5%碳酸氫鈉疼用MgS〇4乾燥該有機相，並蒸發異丙酯中’並於RT下攪拌2小時。 5°/〇碳酸氫鈉溶液連續洗滌有機相。然後殘餘物溶於250毫升乙酸過濾且於40°C下乾燥，可 94514-940114.doc •14- 1345570

中文說明書替換頁(94年1月-------1 得到 40.9 克白色物質之 Z-D-Trp-Lys(BOC)-〇Me。HPLC-條件：MN Nucleosil 100A/C 18; 5微米；250x4毫米；A相： 0.24%磷酸’ B相：乙腈；梯度：30分鐘内20%至80% B ;波長220奈米；流速1.3毫升/分鐘；溫度35°C ;純度97.8% 1).&.(24.2分鐘）。 b) H-D-Trp-Lys(BOC)-OMe

將19.8克（34.1毫莫耳）2-〇-1[卬-1^8(8〇(：)-〇]\^溶於220毫升甲醇中，RT下，加入2.2克10%的催化劑鈀炭（PdC)，及進行氫化作用。氫化作用在RT下1小時後完成，濾去催化劑，在30°C蒸發濾液：白色固體。HPLC : 98.1% b.a.(16.2分鐘）。 c)Z-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OMe

將 17.0 克 H-D-Trp-Lys(BOC)-OMe 與 80 毫升 THF 混合。RT 下，將9.2克Z-Phg-OH加至該灰白懸浮物中。加入4·4克 HOBt，用20毫升THF潤洗。將該黃色混濁溶液冷卻至〇°C， 94514-940114.doc 1345570 第093123701號專利申請案年/刀修，史)五替換寊中文說明書替換頁(94年1月） ---,一然後在10分鐘内，加入5·3毫升DIC1溶於15毫升THF之溶液。〇°C下攪拌2小時，然後rT下攪拌2小時。然後加入3 6 毫升硫酸溶在57毫升水之溶液，用70毫升乙酸乙酯萃取，用水、飽和鹽水' 5%碳酸氫鈉、25%鹽水洗滌，經MgS04 乾燥’然後蒸發。將該白色殘餘物在125毫升乙酸異丙酯中於40°C下攪拌2小時，然後過濾懸浮物。4(TC下乾燥該殘餘物：淺黃色物質。HPLC : 96.3% b.a.(25.3分鐘）。 d) H-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OMe

將23.4克（23.8毫莫耳）(乙-?1^-0-1^-1^8(丑0(：)-〇]\^)溶於 260毫升甲醇中’RT及常壓下加入2.6克10%的鈀炭及進行氫化作用。3小時後濾去催化劑，在30°C蒸發濾液：白色固體》 HPLC : 95.9% b.a.(17.6分鐘）。 e)Z-[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)]-Pro-Phg -D-Trp-Lys(Boc)-OMe 94514-940114.doc -16- 1345570 細顆細嫩中文說明書替換頁(94年1月） --------

RT下，將11.1克（2S，4R)-4-(2-第三-丁氧羰基胺基乙基胺曱醯氧）-吡咯啶-1-羧酸苄酯-2-羧酸和19.0克 11邛1^-〇-1'^-1^3(8〇(：)-〇]^6溶於290毫升1'1^中。加入3.32 克11031，然後將該混濁液體冷卻至0°(：〇然後加入4.50毫升溶於90毫升THF之DIC1溶液。0°C下攪拌24小時。然後在RT 下，加入2.2克硫酸溶於22毫升水之溶液，將攪拌該淺乳白色溶液15分鐘，然後滴入到500毫升水中。50°C下，蒸發該白色懸浮液直至不再蒸餾出THF。過濾該懸浮液，並每次用80毫升水洗滌該殘餘物4次，再用250毫升甲醇洗滌，然後用總量為80毫升的曱醇洗滌2次。50°C隔夜乾燥。HPLC 91.0% b.a.(19.5分鐘）。 f) H -[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)] -Pro-Phg-D-Trp-Lys(Boc)-OMe 94514-940114.doc -17- 1345570 第093123701號專利申請案中文說明書替換頁(94年1月）

Γ--ΤΓ

將 22.0 克（12.7 毫莫耳）Z-[(2S，4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)]-Pro-Plig-D-Trp-Lys(BOC)-OMe 溶於 220 毫升 DMF中，然後加入4.4克10%的Pd/C，RT下進行氫化作用4 小時。然後濾去該催化劑，將該濾液加入到600克冰和400 毫升水之混合物中。濾去沉澱物，用水洗滌。30°C乾燥可得到灰白色固體。HPLC : 97.0% b.a.(12.3分鐘）。 g) Z-Phe-[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO O)] -Pro-Phg-D-Trp-Lys(Boc)-OMe

將 5.1 克 Z-Phe-OH 和 16.5 克 H-tpS^RO-^CBoc-NH-CI^- CHrNH-CO-OW-Pro-Phg-D-Trp-LysCBocO-OMe 溶於 250 毫升THF中，加入2.29克HOBt，並將該黑色溶液冷卻至〇。〇。 945l4-940I14.doc -18- 1345570

第09M23701號專利申請案中文說明書替換頁(94年1月）將3.1毫升DIC1溶於80毫升THF中，然後〇°C下，加至該反應混合物中。〇eC下攪拌24小時。然後將該反應混合物加入到 200毫升10%的硫酸中，濾去沉澱固體，用水洗滌。過濾後，該殘餘物與200毫升曱醇混合，然後濾去懸浮物。40°C隔夜乾燥。HPLC : 97.2% b.a.(21.1 分鐘）。 h)(H-Phe-[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)] -Pro-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OMe)

將 8.5 克 Z-Phe-[(2S，4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)] -Pro-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OMe 溶於 180 毫升 DMF 中，然後加入4.25克10%的Pd/C，於RT下，氫化該混合物6小時。然後濾去該催化劑，並於4〇°C下蒸發濾液。RT下，將600毫升第三-丁基甲基醚滴入至該殘餘物（30克）中，過濾懸浮液，殘餘物用300毫升TBME洗滌。40°C下乾燥。HPLC : 93.1% b.a.(16.6分鐘）。

i)FMOC-Tyr(Bzl)-Phe-[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH -CO-0)]-Pro-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OMe 94514-940114.doc -19- 第093123701號專利申請案料修(更)止替投Μ 中文說明書替換頁(94年1月） ------}

將 6.5 克 H-Phe-[(2S，4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)] -Pro-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OMe和 3.1 克 FMOC-Tyr(Bzl)-OH 及0.86克HOBT懸浮於180毫升THF中，並冷卻至0°C。加入 5.5克LiBr，然後力σ入20毫升THF 〇然後力口入1.18毫升溶於 50毫升THF中之DIC1， 0°C下攪拌該黑色懸浮物2小時。移去冷浴槽，再持續攪拌24小時。然後加入0.65克硫酸和6.5 毫升水之溶液，再加入160毫升水。於40°C下進行蒸發，過濾該殘餘物，用水洗滌，直到最終洗滌液PH值達到4.0。在 30毫升曱醇中攪拌濾餅，過濾該懸浮液，用毫升曱醇洗滌該殘餘物》35°C乾燥後可得到灰白色物質。HPLC 95.4% b.a.(26.0分鐘）。 10)FMOC-Tyr(Bzl)-Phe-[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-

NH-CO-O)]-Pr0-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OH 94514-940114.doc -20- _·/月^)修(更)正替換頁

第093123701號專利申請案中文說明書替換將 U.0 克 FMOC-Tyr(Bzl)-Phe-[(2S，4R)-4- (B〇c-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)]-Pro-Phg-D-Trp-Lys(Boc)-OMe 懸浮於 250毫升THFt。加入7.3克LiBr和75毫升THF。然後RT下，在20分鐘内緩慢加入8.7毫升1莫耳濃度之NaOH。RT下持續攪拌3小時，然後在另計之15小時内加入5毫升1莫耳濃度之 NaOH。將最終反應溶液加入到1.7克硫酸溶於34毫升水之溶液中。所得到之2-相-混合物加入到50毫升乙酸乙酯中。分離各相後，用鹽水洗滌有機相3次，然後蒸發。將25毫升 DIF加入到該殘餘物中。所得澄清DIF-溶液加入到260毫升水中。過濾所得懸浮液，該濾餅用水洗滌3次，40°C隔夜乾燥。HPLC 71.9% b.a.(28.6分鐘）。實例2 : 4-(環（二苯基）甲基）苯甲醯基胺基甲基聚苯乙烯樹脂之製備

0 94514-940114.doc -21- 1345570 第〇93丨237〇1號專利申請案^千/刀修中文說明書替換頁(94年1月/---- 該合成作用係在氮氣下，於一手動操作之1公升攪拌批量反應器（其配有經燒結之玻璃物）中進行。RT下，用DMF預處理的市售胺基曱基聚苯乙烯樹脂（30.4克，41.07毫莫耳）與溶於DMF(140毫升）之4-(羥基-二苯基-甲基）笨曱胺酸 (15.0克，49.28毫莫耳，1.2當量）、羥基苯并三氮唑（HOBT) (7.54克，49.28毫莫耳，1.2當量）和01(：1(12.43克，98.57毫莫耳，2.4當量）之溶液隔夜反應。減壓下通過玻璃物過濾去除溶劑，該樹脂用DMF和甲醇反覆各洗滌5次。40°C下真空乾燥可得到44.69克樹脂。該樹脂作為下列合成六肽之原料。合成經保護直鏈肽之過程與樹脂連結之直鏈六肽係於氮氣下，於一配有經燒結玻璃物之攪拌批量反應器中，以C至N端方向反覆進行偶聯反應後手動組合而成。4-(環（二苯基）甲基）苯甲醯基胺基甲基聚苯乙烯樹脂係作原料，且係以一標準步驟進行之，該步驟係由重複循環Να-去保護作用（20%溶於DMF之二乙基胺 (DAEM)，體積比）、依次用DMF和ΙΡΚ反覆洗滌及在RT下之偶聯反應（DIPC1/HOBT，DIEPA和DMF)所組成。稍微改變此偶聯過程時，應特別注意的是，藉由在0°C下進行苯基甘胺酸之偶聯反應，以便將苯基甘胺酸之外消旋化減至最小。在將該完全組合之經保護直鏈肽從其樹脂支持物上裂解前，應去除Να-Fmoc保護作用。

Fmoc-(2S，4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-OH 按 94514-940114.doc -22- 第093123701號專利申請案

中文說明書替換頁(94年1月） --J 照WO 02/101 192所揭示之方法進行合成。所有其他胺基酸可商業購得。 H-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0) -Pro-Phg-D-Trp(Boc)Lys(Boc)-OH之合成

?^Fmoc-Lys(Boc)-0-樹脂之合成 RT下，經甲苯預處理之4-(環（二苯基）曱基）苯甲醯基胺基甲基聚苯乙烯樹脂（20克，19.4毫莫耳）用溶於甲苯中之乙醯氣（7.6克，97毫莫耳）處理4小時。過濾後，隔夜重複該過程，然後過濾該樹脂，用甲苯和二氣甲烷洗滌。RT下，與 Fmoc-Lys(Boc)-OH(18.2 克，38_8 毫莫耳；2當量）和 N-甲基嗎啉（3.94克，38.8毫莫耳，2當量）之混合物進行偶聯反應4 小時。過濾後，該樹脂用DMF和IPA輪流洗滌3次，真空乾燥得到26.5克具有容量度為0.566毫莫耳/克（用Fmoc-方法測定）之微黃色Fmoc-Lys(Boc)-0-樹脂。 (文獻 Fmoc-方法：Meienhofer，J·; Waki，M; Heimer，E.P.;

Lambros, T.J.; Makofske, R.C.; Chang, C.D. Int. J. Pep. Prot. Res· 1979, 13, 35)。 b)^M-〇-Lys(Boc)-D-Trp(Boc)-Phg- (2S,4R)-4- (Boc-NH- 94514-940114.doc -23- 1345570 厂------- 、第觀襲m專利申請案1,哼修(更)正替換頁中文說明書替換頁(94年1月）

CH2-CH2-NH-CO-〇)-Pr〇-Phe-Tyr(Bzl)-H

Fmoc-Lys(Boc)-0-樹脂（28.0克，19.96毫莫耳）懸浮於DMF 中，並用溶於DMF之DAEM溶液（20%體積比）於RT下處理10 分鐘。過濾後’重複該過程，然後用DMF和1PA輪流洗蘇3 次，接著用DMF洗滌3次。在每次偶聯後重複該Na-Fmoc- 去保護作用和洗滌過程。用一胺基酸、HOBT和DIC1之混合物進行偶聯作用’在RT 下攪拌該混合物30分鐘，然後立即加入到樹脂中。持續進行偶聯直至完成，亦即直至"Kaiser”茚三酮試驗為陰性反應監測出殘留胺基完全消失為止。偶聯後，該樹脂用DMF洗滌5次，然後準備用於Fmoc-保護作用。依次偶聯下列胺基酸衍生物：卩111〇(：_0_1^(；8〇〇-〇11(16.81克，31.92毫莫耳，2當量）、 01?(100毫升）、只08丁(4.93克，32_24毫莫耳，2.02當量）、〇101(5.35克，42.45毫莫耳，2_66當量）。卩111〇〇1»118-〇11(11.92克，31.92毫莫耳，2當量）'11^(70 毫升）、11〇81'(4.93克，32.24毫莫耳，2.02當量）、〇10：1(5.35 克，42.45毫莫耳，2.66當量）。需特別注意，藉由在0°C下進行苯基甘胺酸之偶聯作用，以將該胺基酸之外消旋化減至最小。

Fmoc-(2S,4R)4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-OH (17.26克，31,92毫莫耳，2當量）、〇抒（100毫升）、11〇31'(4.93 克，32_24毫莫耳，2.02當量）、DIC1(5,35克，42.45毫莫耳， 94514-940Ii4.doc • 24- 第093123701號專利申請案中文說明書替換頁(94年1月）

1345570 2.66當量）

Fmoc-Plle-OH(12.36克，31.92毫莫耳，2當量）、DIF(100 毫升）、11〇31'(4.93克，32.24毫莫耳，2.02當量）、〇1(：1(5.35 克，42.45毫莫耳，2.66當量）。 ?111〇(：-1>1'(821)-0玨（15.75克，31.92毫莫耳，2當量）、 01?(100毫升）、11081'(4.93克，32.24毫莫耳，2.02當量）、 DIC1(5.35 克，42_45 毫莫耳，2.66當量）》

在將該完全組合之經保護直鏈肽從其樹脂支持物上裂解前’用溶於DMF之DAEM溶液（20%體積比）於RT下處理該樹脂10分鐘以去除Να-Fmoc保護。過濾後，重複該過程，並用DMF和IPA輪流洗滌3次，接著用DMF洗滌3次。（40°C真空乾燥該樹脂可得到一微黃色樹脂）。 c)從樹脂支持物上裂解該直鏈狀： H-Tyr(Bzl)-Phe-(2S54R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)

-Pro-Phg-D-Trp(Boc)Lys(Boc)-OH

Ca)用 Ac0H/CH2C12/H20(45/45/5體積比）之方法籲將完全組合之經保護直鏈肽樹脂-〇 - L y s ( B 〇 c )-D-Trp(Boc)-Phg-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-Phe-Tyr(Bzl)-H(24.5 克）懸浮於一 Ac0H/CH2C12/H20 (45/45/5體積比，150毫升）之混合物中，然後於RT下攪拌1 小時、過濾、用CH2C12洗滌。將濾液蒸發至乾燥’將該殘餘物與一 TBME和庚烷（7/3體積比）之混合物攪拌1小時、過濾、真空乾燥，可得到一微黃色固體：成分含量：93.5% 94514-940114.doc -25- 年//] #曰修(更)正替換頁I '

第093123701號專利申請奏---I 中文說明書替換頁(94年1月） HPLC 克/克；純度 91.6% (F)-HPLC 及 2.5%(F)-HPLC D-Phg- 表異構體。該樹脂（4-(環（二苯基）曱基）苯曱醯基胺基甲基聚苯乙烯樹脂）用曱醇洗滌3次並乾燥，即可重複使用。

Cb)使用CH2C12和甲醇之方法將該完全組合之經保護直鏈肽樹脂-0-Lys(Boc)-D-Trp(Boc)-Phg-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-Phe-Tyr(Bzl)-H(6.2 克）懸浮於一 CH2C12/ MeOH(l/l 體積比，115毫升）之混合物中，並於RT下攪拌3天、過濾、用 CH2C12洗滌。蒸發該濾液至乾燥，將該殘餘物與一 TBME 和庚烷（7/3體積比，60毫升）之混合物攪拌1小時、過濾、真空乾燥。成分含量：93.5% HPLC克/克；純度92.6% (F)-HPLC 及 1.1%(F)-HPLC D_Phg-表異構體。該樹脂（4-(環（二苯基）甲基）苯甲醯基胺基甲基聚苯乙烯樹脂）用曱醇洗滌3次並乾燥，即可重複使用。

Cc)使用甲基乙基酮/MeOH之方法將該完全組合之經保護直鏈肽樹脂-0-Lys(Boc)-D-Trp(Boc)-Phg-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-Phe-Tyr(Bzl)-H(4.0克）懸浮於一二甲基乙基酮1/1體積比（24 毫升）之混合物中，並在50°C下攪拌15小時、過濾、用MeOH 洗滌。蒸發該濾液至乾燥，將該殘餘物與一 TBME和庚烷 (7/3體積比，60毫升）之混合物攪拌1小時、過濾、真空乾燥。成分含量：88.1% HPLC克/克；純度95.2% (F)-HPLC及 94514-940114.doc •26· 1345570

修(更)正替換頁I 第093123701號專利申請案L 中文說明書替換頁(94年1月） 1.8%(F)-HPLC D-Phg-表異構體。該樹脂（4-(環（二苯基）甲基）苯甲醯基胺基曱基聚笨乙烯樹脂）用曱醇洗滌3次並乾燥’即可重複使用° 純化為了分析目的，以RP層析法純化該直鏈肽。特徵描述以 FAB-MS、LC-MS及 NMR_數據（百萬分之 DMSO，1.16, 1.34, 1.55, 1.61(3H), 1.66, 2.05, 2.20, 2.51, 2.83(2H), 2.91, φ 2.96, 2.98, 3.02, 3.41, 3.78, 4.13, 4.61, 5.13, 5.51, 6.74, 6.83, 6.88(2Η), 7.01(2Η), 7.11(2Η), 7.38, 7.42(2Η), 7.49, 7.72, 8.01，8.29，8.48，8.62, 8.75)確認經RP-層析法純化之分析樣本之結構。以胺基酸分析榷定該胺基酸之構型：在酸性條件下水解該化合物、轉化成衍生物，及以對映立體具選擇性之氣相層析/化學電離子質譜歸類出每一個別胺基酸之構型。另外之結構證據係將不同的直鏈肽轉換成確定特徵之環春狀肽。根據所描述之過程合成下列化合物。 H-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-(2S，4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-Phg-D-Trp(Boc)-OH ； H-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-Phg-D-Trp-OH ； H-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-Phg-D-Trp 94514-940I14.doc -27- 1345570 第093123701號專利申請案

中文說明書替換頁(94年1月） ----~一J (Boc)-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-OH ； H-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Phg-D-Trp (Boc)-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-OH ； H-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-

Pro-DPhg-DTrp(Boc)-Lys(Boc)-OH

實例3 :環化之經保護直鏈肽以合成環[(2S，4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-Phg-D-Trp(Boc)-Lys (Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-J

'^0 H-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-OH之環化作用疊氮化合物-方法為了環化作用，將該直鏈片段（2.5克，1.83毫莫耳）溶於 DMF(391 毫升）中，冷卻至 _5°C，用 EDIPA(0.47克，3.66毫莫耳’ 2當量）和DPPA(0.75克，2.75毫莫耳，1.5當量）處理，並在該溫度下攪拌直到完成環化（約20小時）。在反應混合物中逐滴加入水（39 1毫升），過濾沉澱物，用水洗滌直至檢測不到疊氮化合物，可得到4.9克水潤濕之白色固體（HPLC之 Rf與文獻相同），無需進一步純化即可用於去保護反應中。 945 丨 4-940114.doc -28· 1345570 si---------〜一，s—

第093123701號專利申請糾幻，ili勢结wj 中文說明書替換頁(94年1月）一 —--J 利用HPLC與一參考化合物直接比較定出該化合物特徵。 H-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0) -Pro-Phg-D-Trp(Boc)Lys(Boc}-OH之環化作用 a) HBTU方法 a 為了環化作用，將該直鏈片段（6.0克，3.5毫莫耳）溶於 DMF(780 毫升）中，冷卻至-5°C，用 EDIPA(1.13 克，8.75毫莫耳，2.5當量）、1103丁（1.18克，8.75毫莫耳，2.5當量）、 1181'11(3.3克，8.78毫莫耳，2.5當量）處理，並在該溫度下攪拌直至完成環化（約2小時）。RT下，在反應混合物中逐滴加入水（3 91毫升），過遽沉殿物，用水和庚烧洗蘇，隔夜真空乾燥。得到5.4克白、黃色固體。利用HPLC與一參考化合物直接比較定出該化合物特徵。成分含量55%重量比HPLC，純度 78(A%)-HPLC。 b) HBTU 方法 b 為了環化作用，將該直鏈片段（6.0克，4.16毫莫耳）溶於 DMF(60毫升）中，-5°C下，逐滴加入到一溶於DMF(135毫升）之 HOBT(4.15 克，10.4 毫莫耳，2.5 當量）、HBTU(4.15 克， 10.4毫莫耳，2.5當量）和丑〇1?八（1.41克，10.4毫莫耳，2.5 當量）溶液中，並在該溫度下攪拌直至完成環化（約2小時）。 RT下，在反應混合物中逐滴加入水（559毫升），過濾沉澱物，用水和庚烷洗滌，隔夜真空乾燥。得到一白、黃色固體。利用HPLC與一參考化合物直接比較定出該化合物特徵。成分含量77%重量比HPLC，純度84(A%)-HPLC。 94514-940114.doc -29- 1345570

第093123701號專利申請案'---- 中文說明書替換頁(94年1月）按照上述過程環化下列直鏈肽： H-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-

CO-0)-Pro-Phg-D-Trp(Boc)-OH H-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-(2S，4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-

CO-0)-Pro-Phg-D-Trp-OH H-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-Phg-D-Trp

(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-OH H-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Phg-D-Trp

(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-OH H-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0) -Pro-DPhg-DTrp(Boc)_Lys(Boc)-OH。實例 4 :環[(2S，4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0) -Pro-Phg_D-Trp-Lys_Tyr(Bzl)-Phe-】三氟乙酸鹽之合成 Η〆

2 CF,COOH 為了完全去保護，該殘餘物（1·5克，0.79毫莫耳）在0°C下溶解於丁？八/1120(95:5,8.3毫升）中，在冰冷條件下攪拌該混合物30分鐘^ RT下，將該冰冷反應混合物逐滴加入到一 TBME(29毫升）和庚烷（13毫升）之混合物中，並攪拌2小時》過濾沉澱物，用TBME/庚烷1:1(體積比）洗滌，真空乾燥。 94514-940114.doc -30- 1345570 第〇93123701號專辦—’说证替每頁1 中文說明書替換頁(94年1月） ^~~~一'1 得到一淺褐色固體，成分含量53%重量比HPLC，純度： 79(A%)-HPLC。

94514-940114.doc -31 -

Claims

1345570 第093123701號專利申請案中文申凊專利範圍替換本(100年2月）十、申請專利範圍：

一種方法，其係用以製備式I化合物

或其鹽類其中 R1為-C2.6伸烷基-NR3R4、- c2 6伸烷基_胍或_ c2 6伸烷基 -COOH，其中每一 R3和R_4獨立為Η、C丨-4烷基、基-C2.4伸烷基或醯基，或R3和R4與其所連接之氮原子一起形成可包括另一雜環原子之雜環基團，及 R2 、-CH2-CO-O-CH2-R5、

其中Z〗為氧或硫，且尺5為視情況經取代苯基，其包括：環化一式II HjN-CH-CO-Phe-i^tR^NHCO-OJ-ProJ-iD or LJPhg-DTrpiR,, )-Lys(4-NHR12)-〇H II ch2-r2 之直鏈生長抑素類似物，其中1^和112如前定義，每一Rn和R12獨立為一胺基保護基團，據此’當Ri包括一末端NH2時，該末端NH2亦經一胺基保 94514-1000225.doc 本i 護基團保護且去除需要處之保護基團，及回收因此所獲之一以游離或鹽形式之式以匕合物。 2·如請求項1之方法，其包括環化式Π之直鏈生長抑素類似物 HjN-CH-CO-Phe-iA-iR^NHCO-OJ-ProJ-iD or LJPhg-DTrpiR^ )-Lys(4-NHR12)-〇H II ch2-r2 其中R|為-CH2_CH2-NR3R4 ’ R2為4-f氧基-苯基，且R3， R·4 ’尺"和R1Z如請求項1中所定義，據此’當1^包括一末端NH2時，該末端NH2亦經一胺基保護基團保護，及去除需要處之保護基團，及回收因此所獲之一以游離或鹽形式之式J化合物，其中 RA-CH2-CH2-NR3R4，尺2為4·苄氧基 _苯基。一種化合物，其為式丨丨化合物 l^N-jH-CO-Phe-W-d-NHCO-C^-ProHD or L)Phg-DTrp(R”）-Lys(4-NHR12)-OH II ch2-r2 或其鹽類，其中R!和R_2為請求項1中所定義，每一 R"和R丨2獨立為一胺基保護基團，據此’當11〗包括一末端Nh2時，該末端nH2亦經一胺基保護基團保護。如請求項3之式π化合物或其鹽類，其中R]為 -CH2-CH2-NR3R4，尺2為4_苄氧基_苯基，且每一Rn和& 獨立為一胺基保護基團，據此當心包括一末端NH2時，該 94514-1000225.doc • 2- 1345570 末端nh2亦經一胺基保護基團保護。 - 5. 如請求項3之式II化合物，其選自H-Tyr(Bzl)-Phe- (2S，4R)· · 4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-DPhg-DTrp(Boc)-Lys (Boc)-OH ' H-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH- CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-Phg-DTrp-Lys(Boc)-OH、及 H-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-〇)-Pro-Phg-D-Trp(Boc)Lys(Boc)-OH或其鹽類。 6. —種製備如請求項3中所定義之式Π化合物之方法，其包括：藉由一醯胺鍵將兩個肽單位連接在一起，每個肽單位鲁包含至少一個保護或非保護形式之胺基酸，其中此種方式之醢胺鍵能夠獲得在式II中所定義之所需胺基酸序列，及去除需要處至少一個保護基團，及回收因此所獲之一以游離或鹽形式之式π化合物。 7. 如請求項1或2之方法，其式I化合物為環[{(4 NH2_c2H4_ NH-CO-0)-Pro}-Phg-DTrp-Lys-Tyr(4·节基）_phe]。

94514-1000225.doc