FI102380B - Menetelmä peptidien valmistamiseksi kiinteäfaasisynteesin avulla - Google Patents

Description

102380

Menetelmä peptidien valmistamiseksi kiinteäfaasisynteesin avulla

Keksintö koskee menetelmää peptidien valmistamisek-5 si, joilla on yleinen kaava I

(X) n - A - NH2 (I) jossa 10 X tarkoittaa α-aminohapporyhmää joukosta Ac-Nal(2),

Ac-D-Nal(2), p-Cl-Phe, p-Cl-D-Phe, Trp, D-Trp, Ser, Tyr, D-Tyr, Ser(α-L-Rha), D-Ser(α-L-Rha), Leu, D-Leu, Arg, D-Arg, Pro, D-Pro, p-Glu, His, D-Ser(tBu), n tarkoittaa kokonaislukua 3 - 10, ja 15 A tarkoittaa atsaglysiiniä, sekä näiden fysiologisesti siedettävien suolojen valmistamiseki, kiinteäfaasisynteesin avulla.

Keksinnön lähtökohtana on tehtävä kehittää rasemoi-tumista niukasti aiheuttava menetelmä sellaisten peptidien 20 valmistamiseksi, joissa on C-terminaaliset atsa-aminohap- poamidit, kiinteäfaasisynteesin avulla.

Tämä tehtävä ratkaistaan keksinnön mukaisella mene-: telmällä, jolle on tunnusomaista, että yhdiste, jolla on

kaava II

:;ί 25 <_/ :T: (II> ::: 30 h2n ^ γ4 • ·♦ ·.· · jossa Y1, Y2, Y3, Y4 ja Y5 tarkoittavat vetyä, C1_4-alkoksia .··. tai - (CH2) n-COOH, jolloin ryhmät voivat olla samanlaisia

• I

”·[ tai erilaisia mutta ainakin yksi ryhmä on - (CH2) n-COOH, n ·..·' 35 tarkoittaa kokonaislukua 1-3, ja « « 102380 2 R1 tarkoittaa vetyä tai 4-metoksifenyyliä, saatetaan liuottimessa reagoimaan silyloimisrea-genssin kanssa, joka on tert.-butyylidimetyylisilyyliklo-ridi, tert.-butyylifenyylisilyylikloridi, trimetyylikloo-5 risilaani tai bistrimetyylisilyyliasetamidi, ja tämän jäl keen muutetaan silyloitu yhdiste kloorimuurahaishappojohdannaisen kanssa kaavan III mukaiseksi yhdisteeksi 10 ty 15 jossa R1, Y1, Y2, Y3, Y4 ja Y5 tarkoittavat samaa kuin edellä ja R2 on nitrolla ja/tai halogeenilla substituoitu fe- nyyli, 20 näin saadut kaavan III mukaiset yhdisteet saatetaan

reagoimaan aminohappohydratsidin kanssa, jolla on kaava IV

R3 - X - CO - NH - NH2 · HC1 (IV) a · 25 jossa X tarkoittaa edellä esitettyä o-aminohapporyhmää, ♦ ♦ ... ja • aa * R3 tarkoittaa Fmoc-, Bpoc- tai Boc-suojaryhmää, liuottimessa kaavan V mukaisiksi yhdisteiksi • a « 30 γΐ «2

··· /?' 1 A

35 °i_HN / 'y4 H τίΗ—co—«-R3 3 102380 jossa R1, R3 ja Y1, Y2, Y3, Y4 ja Y5 tarkoittavat samaa kuin edellä, ja siinä tapauksessa, että R3 tarkoittaa Boc, tämä suojaryhmä poistetaan hydrauksen avulla käyttämällä Pd-katalysaattoria ja muutetaan ennen seuraavaa reaktiota 5 Fmoc- tai Bpoc -uretaanisuojaryhmäksi, tämän jälkeen kaavan V mukainen yhdiste, jossa R1, Y1, Y2, Y3, Y4 ja Y5 tarkoittavat samaa kuin edellä ja R3 on Fmoc- tai Bpoc-uretaa-nisuojaryhmää, kytketään hartsiin peptidikemiassa tavallisten kytkentäreagenssien avulla - (CH2)n-COOH-ryhmän väli-10 tyksellä, suojaryhmä R3 lohkaistaan pois, rakenteeseen kytketään vaiheittain Fmoc- tai Bpoc-suojaryhmien avulla tilapäisesti suojattuja o-aminohappoja, mahdollisesti niiden aktiivisten johdannaisten muodossa, ja koostamisen päätyttyä vapautetaan kaavan I mukaiset peptidit hartsista kä-15 sittelemällä keskivahvalla hapolla, jolloin samanaikaisesti tai sopivien toimenpiteiden avulla jälkeenpäin niihin tilapäisesti tuodut sivuketjujen suojaryhmät lohkaistaan jälleen pois. Keksinnön mukaisesti siis välikeyhdiste (Spacer-yhdiste) muutetaan asyloitumiskykyiseen muotoon, 20 tämä saatetaan reagoimaan sopivan muurahaishappojohdannaisen kanssa ja tämän jälkeen vastaavan aminohappohydratsi- ·; din kanssa, suojaryh-mä muutetaan mahdollisesti emäslabii-

«III

; liksi tai heikkojen happojen suhteen labiiliksi suojaryh- mäksi, näin saatu välikeyhdiste kytketään hartsiin, toi-25 vottu peptidi koostetaan vaiheittain C-terminaalisesta i päästä, tämän jäl-keen peptidi lohkaistaan erilleen hart- • · ... sista ja muutetaan mahdollisesti fysiologisesti siedettä- • · · väksi suolakseen.

Mikäli luonnon tai keinotekoiset a-aminohapot ovat \V 30 kiraalisia, ne voivat esiintyvä D- tai L-muodossa. Esi- • · e · merkkeinä mainittakoon:

Arg, Glu, Gly, His, Leu, Phe, Pro, Ser, Trp, Tyr, Nai, .*·. Tbg, Npg, Thia (katso esim. Houben-Weyl, Methoden der oor- ganischen Chemie, osat XV/1 ja 2, Stuttgart, 1974).

« *··' 35 Atsa-aminohappo on johdettu aminohaposta, jolloin ' * keskeinen rakenneosa -CH2- on korvattu ryhmällä -NH-.

102380 4

Jos aminoryhmä on monosubstituoitu, kyseessä on ns. iminohappo. Tässä yhteydessä mainittakoon erityisesti ne yhdisteet, jotka on substituoitu C^a-alkyylillä tai halogeenilla .

5 Kaavan I mukaisten yhdisteiden suoloilla ymmärre tään erityisesti farmaseuttisesti käyttökelpoisia tai ei-myrkyllisiä suoloja. Erityisesti tulevat kysymykseen alkali- tai maa-alkalisuolat, suolat fysiologisesti siedettävien amiinien kanssa ja suolat epäorgaanisten tai orgaa-10 nisten happojen kanssa, joita ovat esim. HC1, HBr, H2S04, H3P04, maleiinihappo, fumaarihappo, sitruunahappo, viini-happo ja etikkahappo.

Menetelmä suoritetaan edullisesti siten, että yhdiste, jolla on kaava II

15 V/ —CH-(/ \_γ3 (II) / >=< 20 H,N L \ .

2 y5 Y4 . jossa Y1, Y2, Y3, Y4 ja Y5 tarkoittavat vetyä, C^-alkoksia tai -(CH2)n-COOH, jolloin ryhmät voivat olla samanlaisia . 25 tai erilaisia, mutta ainakin yksi ryhmä on - (CH2)n-COOH, n tarkoittaa kokonaislukua 1-3, ja • · · -* ti· *·* * R1 tarkoittaa vetyä tai 4-metoksifenyyliä, saatetaan reagoimaan silyloimisreagenssin, joka on • · esimerkiksi tert. butyylidimetyylisilyylikloridi, tert.

:V: 30 butyylifenyylisilyylikloridi, tai trimetyylikloorisilaani, .♦··. erityisesti trimetyylikloorisilaanin kanssa, tarkoitukseen • · · l.. sopivassa liuottimessa, kuten esim. THFrssa, asetonitrii- ”* Iissä, metyleenikloridissa, dimetyyliformamidissa tai näi- • tl den seoksissa, ja tämän jälkeen muutetaan silyloitu yhdis-·:··: 35 te kloorimuurahaishappojohdannaisen, erityisesti substitu- 102380 5 oitujen esterijohdannaisten kanssa, kaavan III mukaisiksi yhdisteiksi.

U

R*-CH-(' X)-Y3 (III) . / /"Λ ITOOC- HN φ 'γ4 10 jossa R1, Y1, Y2, Y3, Y4 ja Y5 tarkoittavat samaa kuin edellä ja R2 on nitrolla ja/tai halogeenilla, esimerkiksi fluorilla tai kloorilla, substituoitu fenyyli, 15 näin saadut kaavan III mukaiset yhdisteet saatetaan

reagoimaan aminohappohydratsidin kanssa, jolla on kaava IV

R3 - X - CO - NH - NH2 · HC1 (IV) 20 jossa ·.· X tarkoittaa edellä esitettyä o-aminohapporyhmää ja : R3 tarkoittaa emäslabiileja tai heikkojen happojen .···. vastaavasti hydrauksen suhteen labiileja suojaryhmiä, ku- !·. ten esim. uretaanisuojaryhmää (katso esim. Hubbuch, Kon- 25 takte (Merck) 1979, nro 3, sivut 14 - 23) ja • · ... liuottimessa, johon kaavojen III ja IV mukaiset yh- *** ’ disteet ovat liukoisia, kuten esim. DMFrssa, kaavan V mu kaisiksi yhdisteiksi, • · • I · * * * 4 _ «if: 30 tf r!—ch—P \—Y3 6 / W (V>

oc—HN & \A

4 i + ·:··: 35 R ’H—co—X—B3 102380 6 jossa R1, R3 ja Y1, Y2, Y3, Y4 ja Y5 tarkoittavat samaa kuin edellä esitetyt merkitykset, ja siinä tapauksessa, että R3 tarkoittaa hydrauksen suhteen labiilia suojaryhmää Boc eli bentsyylioksikarbonyyliä, tämä suojaryhmä poistetaan hyd-5 rauksen avulla käyttämällä Pd-katalysaattoria ja muutetaan ennen seuraavaa reaktiota emäslabiiliksi uretaanisuo-jaryhmäksi Fmoc tai heikon hapon suhteen labiiliksi ure-taanisuojaryhmäksi Bpoc, tämän jälkeen kaavan V mukainen yhdiste, jossa R1, Y1, Y2, 10 Y3, Y4 ja Y5, tarkoittavat samaa kuin edellä ja R3 on Fmoc tai Bpoc, kytketään hartsiin peptidikemiassa tavallisten kytkentäreagenssien avulla -(CH2) n-COOH-ryhmän välityksellä, suojaryhmä R3 lohkaistaan pois, rakenteeseen kytketään vaiheittain Fmoc- tai Bpoc-suojaryhmien avulla tilapäises-15 ti suojattuja o-aminohappoja, mahdollisesti niiden aktiivisten johdannaisten muodossa, ja koostamisen päätyttyä vapautetaan kaavan I mukaiset peptidit hartsista käsittelemällä keskivahvalla hapolla, jolloin samanaikaisesti tai sopivien toimenpiteiden avulla niihin jälkeenpäin tilapäi-20 sesti tuodut sivuketjujen suojaryhmät lohkaistaan jälleen ··· pois.

. .'. Kaavan IV mukaisia yhdisteitä valmistetaan saatta- « < « .···. maila aminohappoja tai vastaavasti iminohappoja reagoimaan vastaavien hydratsidien kanssa peptidikemiassa tavallisten 25 kytkentämenetelmien mukaan.

mmm* Alkoksi voi olla suoraketjuinen tai haarautunut.

• · · *·* * Halogeeni tarkoittaa fluoria, klooria, bromia tai jodia, erityisesti fluoria tai klooria.

Siinä tapauksessa, että sivureaktioiden estämiseksi

»M

' 30 tai erityisten peptidien synteesiä varten on tarpeellista, ,···. amino-, atsa-amino- tai vastaavasti iminohappojen sivuket- • · · I.. jussa olevat funktionaaliset ryhmät ovat lisäksi suojatut *” sopivilla suojaryhmillä (katso esim. T.W. Greene, "Pro- tective Groups in Organic Synthesis", New York, John Wiley *;··: 35 & Sons, 1981; Hubbuch, Kontakte (Merck) 1979, nro 3, sivut 102380 7 14-23; Biillesbach, Kontakte (Merck) 1980, nro 1, sivut 23-35), jolloin ensisijassa käytetään seuraavia; Arg(Tos), Arg(Mts), Arg(Mtr), Arg(Pmc), Glu(OBzl), Glu(OtBu), His(Tos), His(Fmoc), His(Dnp), His(Trt), Ser(Bzl), 5 Ser(tBu). Lisäksi voivat sivuketjussa olevat funktionaaliset ryhmät olla myös glykosyloituja, kuten esim. julkaisussa EP-A 263 521 (HOE 86/F 253) on esitetty.

Kantaja-aineina käytettyjä hartseja on kaupallisesti saatavana tai niitä voidaan myös valmistaa, kuten esim. 10 alkoksibentsyylialkoholihartseja, aminometyylihartseja tai bentshydryyliaminohartseja. Edullisia ovat aminometyy-li-, bentshydryyliamino- (BHA) ja metyylibentshydryyli-amiinihartsi (MBHA). Kuormitus määritetään aminohappoana-lyysin ja/tai alkuaineanalyysin avulla.

15 Sopivilla välikeyhdisteillä ymmärretään esimerkiksi julkaisuissa Atherton, Sheppard in Perspectives in Peptide Chemistry, sivut 101-117 (Karger, Basel 1981); EP-A 264 802 (HOE 86/F 259), EP-A 287 882 (HOE 87/F 101) ja EP-A 322 348 (HOE 87/F 386K) esitettyjä välikeyhdisteitä sa-20 moin kuin niistä johdettuja johdannaisia, kuten esimerkik-si sellaisia, joista suojaryhmä on lohkaistu pois. Edul-: lisiä ovat 4-karboksylatopropoksi-4 '-metoksi-bentshydryy- .*". liamiini ja 5-karboksylatoetyyli-2,4-dimetoksi-4'-metoksi- bentshydryyliamiini.

25 Kytkentäreagensseina kaavan V mukaiselle välikeyh- • · ... disteille ja muille aminohappo johdannaisille voidaan käyt- t · · * tää kaikkia mahdollisia peptidisynteesissä käytettyjä ak- tivointireagensseja, katso esim. Houben-Weyl, Methoden der ·.*.* Organischen Chemie, osa XV/2, Stuttgart 1974, erityisesti « I · ·.· * 30 kuitenkin karbodi-imidejä, kuten esim. N, N'-disyklohek- syylikarbodi-imidiä, N, N'-di-isopropyylikarbodi-imidiä tai .···. N-etyyli-N' - (3-dimetyyliaminopropyyli) karbodi-imidiä. Kyt- • · '·' kentä voidaan suorittaa tällöin suoraan lisäämällä hart- ...* siin aminohappo johdannaista aktivointireagenssin kanssa ja 35 mahdollisesti rasemoitumista ehkäisevän lisäaineen, kuten 102380 8 esim. 4-metyyliaminopyridiinin, 1-hydroksibentsotriatsolin (HOBt) (W. König, R. Geiger, Chem. Ber. 103 (1970) 788- 798) tai 3-hydroksi-4-okso-3,4-dihydrobentsohydratsiinin (HOObt) kanssa (W. König, R. Geiger, Chem. Ber. 103 (1970) 5 2034-2040), tai aminohappojohdannaisen esiaktivointi sym metriseksi anhydridiksi tai HOBt- tai vastaavasti HOObt-esteriksi voidaan suorittaa erikseen ja aktivoidun lajin liuos sopivassa liuottimessa lisätään kytkentäkykyiseen peptidihartsiin.

10 Kaavan V mukaisen välikeyhdisteen ja aminohappo joh dannaisten kytkentä tai vastaavasti aktivointi edellä mainitun aktivointireagenssin avulla voidaan suorittaa dime-tyyliformamidissa tai metyleenikloridissa tai näiden molempien seoksessa. Aktivoitua aminohappojohdannaista käy-15 tetään yleensä 1,5 - 4 -kertaisin ylimäärin. Niissä tapauksissa, joissa tapahtuu epätäydellinen kytkeytyminen, toistetaan kytkentäreaktio, ilman että sitä ennen suoritetaan järjestyksessä seuraavan aminohapon kytkentään tarvittava peptidihartsin α-aminoryhmän "avaaminen" (suoja-20 ryhmän poisto).

;· Kytkentäreaktion menestyksellistä kulkua voidaan : tutkia ninhydriinireaktion avulla, jollaisen esittävät . esim. E. Kaiser et ai. (Anal. Biochem. 34 (1970) 595).

Synteesi voidaan suorittaa myös automatisoituna esim. toi-25 minimen Applied Biosystems peptidisyntetisaattorin malli • · ... 43 0A avulla, jolloin voidaan käyttää joko laitteiston vai- • · · • mistäjän laatima synteesiohjelmaa tai myöskin sen käyttäjän itse laatimaa ohjelmaa. Jälkimmäistä käytetään erityi- ·.*.* sesti käytettäessä Fmoc-ryhmällä suojattuja aminohappojoh- • · · V : 30 dannaisia.

Peptidiamidien lohkaiseminen erilleen hartsista • · · .···. suoritetaan käsittelemällä peptidisynteesissä tavallisesti < · käytetyillä keskivahvoilla hapolla (esim. trifluorietik-:...: kahapolla) , jolloin kationien sitojiksi lisätään sellaisia 35 aineita kuten fenolia, kresolia, tiokresolia, anisolia, 102380 9 tioanisolia, etaaniditiolia, dimetyylisulfidia, etyylime-tyylisulfidia tai näiden kaltaisia kiinteäfaasisynteesissä tavallisia, kationeja sitovia aineita erikseen tai kahden tai useamman näiden apuaineiden seosta. Trifluorietikka-5 happoa voidaan tällöin käyttää myös laimennettuna sopivalla liuottimena, kuten esim. metyleenikloridilla.

Välikeyhdisteen hartsista erilleen lohkaisun yhteydessä tapahtuu samanaikaisesti sivuketjusuojaryhmien lohkeaminen pois.

10 Näin saatujen raakapeptidien puhdistus tapahtuu kromatografiän avulla käyttämällä ©Sephadex'iä, ioninvaih-tohartseja tai HPLC:tä.

Kiinteäfaasisynteesin menetelmä on edullinen seu-raavien yhdisteiden valmistamiseksi: Ac-D-Nal(2)-p-Cl-D-15 Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(α-L-Rha)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2 ja pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2 (Zoladex).

Käytettyjen lyhenteiden luettelo: BSA bistrimetyylisilyyliasetamidi 20 DCC disykloheksykarbodi-imidi ·;· DIC di-isopropyylikarbodi-imidi « i t ; ;'j DMAP dimetyyliaminopyridiini

Fmoc 9-f luorenyylimetoksikarbonyyli HOBt 1-hydroksibentsotriatsoli « 25 HOObt 3-hydroksi-4-oksi-3,4-dihydro-l, 2,3-bentsotriat- • · ... siini • · »

Nai naftyylialaniini

Npg neopentyyliglysiini :.V Pmc 2,2,5,7,8-pentametyylikromaani-6-sulfonyyli • · · : 30 Tbg tert.-butyyliglysiini THF tetrahydrofuraani .···. Thia 2-tienyylialaniini • · *** Seuraavien esimerkkien tarkoituksena on valaista *...* esillä olevaa keksintöä rajoittamatta sitä kuitenkaan nii- 35 hin.

102380 10

Esimerkki 1 a) 5-karboksylatoetyyli-2,4-dimetoksi-4'-metoksi-bentshydryyliamiini 17,5 g 5-karboksylatoetyyli-2,4-dimetoksi-4'-metok-5 si-bentsofenonioksiimia liuotettiin 450 mitan etanolin ja DMFtn l:l-seosta ja liuokseen lisättiin 2 ml väkevää NH3. Sen jälkeen kun joukkoon oli lisätty Pt/C-katalysaattoria, hydrattiin normaalipaineessa 5 päivää. Reaktion päätyttyä erotettiin katalysaattori imusuodattimella, suodos haih-10 dutettiin ja tuote saostettiin eetterillä. Sitä käytettiin sellaisenaan ilman enempää puhdistamista.

Ib) N-(p-nitrofenyylioksikarbonyyli)-5-karboksyla-toetyyli-2,4-dimetoksi-4'-metoksi-bentshydryyliamiini 10 g esimerkissä la) saatua otsikkoyhdistettä pan-15 tiin reaktioastiaan 100 ml:ssa THF/DMF(4:1)-seosta ja joukkoon lisättiin huoneen lämpötilassa 2,1 ekvivalenttia bistrimetyylisilyyliasetamidia (BSA). Suspensio kirkastui lyhyessä ajassa täydellisesti ja kirkasta liuosta hämmennettiin sen jälkeen 2 tuntia. Tämän jälkeen lisättiin 3 g 20 kloorimuurahaishapponitrofenyyliesteriä ja seosta sekoi- tettiin sen jälkeen vielä tunnin ajan. Reaktion päätyttyä : poistettiin liuotin korkeassa tyhjössä. Jäännökseen lisät- .···. tiin 300 ml vettä ja syntyvä öljy uutettiin etikkaesteril- lä. Etikkaesteri-faasi pestiin 1 N KHS04-liuoksella ja ve-25 dellä. Orgaaninen faasi kuivattiin MgS04:n avulla ja haih- • · ... dutettiin kuiviin. Jäännös (12 g) karakterisoitiin NMR:n, • » i *·* IR:n ja MS:n avulla.

N- (p-nitrofenyylioksikarbonyyli)-5-karboksylato- • · :.V etyyli-2,4-dimetoksi-4'metoksi-bentshydryyliamiini saa- • · · : 30 tettiin sen jälkeen reagoimaan aminohappohydratsidien .·;·. kanssa sopivasti substituoiduiksi ankkureiksi.

.···, le) Bentsyylioksikarbonyyli-4-prolyyli-atsaglysyy- li-(5-karboksylatoetyyli-2,4-dimetoksi-4'-metoksibentsyy-lihydryyli) amidi.

35 3,27 g bentsyylioksikarbonyyli-prolyylihydratsidi- 102380 11 hydrokloridia ja 6,94 g esimerkissä Ib) saatua otsikkoyh-distettä liuotettiin 40 ml:an dimetyyliformamidia (DMF) ja joukkoon lisättiin 3 ekvivalenttia N-etyylimorfoliinia ja katalyyttinen määrä dimetyyliaminopyridiiniä (DMAP). Ai-5 neiden annettiin reagoida 16 tuntia. Reaktion päätyttyä seos haihdutettiin kuiviin. Jäännös otettiin etikkaeste-ri/butanoli-seokseen ja orgaaninen faasi pestiin kyllästetyllä NaHC03-liuoksella, 1 N KHS04-liuoksella ja vedellä. Orgaaninen faasi kuivattiin MgS04:n avulla ja suodatuksen 10 jälkeen haihdutettiin kuiviin. Jäännös oli kiteytettävissä uudelleen puhtaasta etikkaesteristä. Tällöin saatiin 6, 6 g otsikkoyhdistettä.

FAB-MS: 641 (M+LI + ) IR: CO 1695 cm'1 15 ^-NMR (DMSO) : δ = 3,7 s (6H, OCH3) miljoonasosia

Id) 9-fluorenyylimetoksikarbonyyli-L-prolyyli-at-saglysyyli(5-karboksylatoetyyli-2,4-dimetoksi-4'-metoksi-bentshydryyli)amidi 26,5 g esimerkissä le) saatua otsikkoyhdistettä 20 liuotettiin 300 ml:an metanolia ja liuokseen lisättiin 2 g Pd/C-katalysaattoria. Tunnin kuluttua oli hydraus päätty-: nyt. Katalysaattori erotettiin suodattamalla ja suodos : haihdutettiin kuiviin. Ilman enempää puhdistamista otet- tiin jäännös (17,5 g) seokseen, jossa oli 80 ml vettä ja 25 80 ml dioksaania, ja seokseen lisättiin 8 g natriumvety- • · ..... karbonaattia ja 17 g 9-f luorenyylimetoksi-karbonyyli-N- • · · hydroksisukkinimidiä (Fmoc-ONSu). Aineiden annettiin rea- . . goida päivän ajan. Reaktion päätyttyä suodatettiin sei- • · · *·|·* keyttävän kerrossuodattimen läpi. Suodoksen pH säädettiin « · · V * 30 2 N H2S04:lla arvoon 6 ja suodos haihdutettiin tyhjössä 80 • ml:n tilavuuteen. Tämä laimennettiin 100 ml:11a vettä ja .**·. uutettiin etikkaesteri/n-butanoli-(8,5:1,5)-seoksella.

• · ·

Orgaaninen faasi pestiin puoliksi kyllästetyllä NaCl-li-'···' uoksella ja haihdutettiin sen jälkeen kuiviin. Jäännös ‘ 35 suodatettiin etikkaesterin kanssa 500 g:n suuruisen pii- 102380 12 happogeelimäärän läpi. Tällöin saatiin 20 g otsikkoyhdis-tettä.

FAB-MS: 729 (M+LI+) IR: CO 1695 cm'1 5 le) Esimerkissä Ib) saadun otsikkoyhdisteen kytken tä polystyreenihartsiin 1,0 g aminometyylipolystyreenihartsia (kuormitus 1,07 mmol) ja 1,2 g esimerkissä Id) saatua otsikkoyhdis-tettä suspendoitiin 10 ml:an dimetyyliformamidia ja jouk-10 koon lisättiin 216 mg 1-hydroksibentsotriatsolia (HOBt) ja 0,75 ml di-isopropyylikarbodi-imidiä (DIC). Aineiden annettiin reagoida yön yli, kunnes ninhydriinikoe osoitti täydellistä reaktiota. Hartsi erotettiin suodattamalla ja pestiin dimetyyliformamidilla ja metyleenikloridilla ja 15 kuivattiin perusteellisesti tyhjössä. Hartsin kuormitus proliinilla oli 0,51 mmol/g.

lf) Ac-D-Nal(2)-p-Cl-D-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(o-L-Rha)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2

Esimerkissä le) saadun yhdisteen 9-fluorenyylime-20 toksikarbonyyli-Na-aminosuojaryhmä lohkaistiin pois 20-%:isella piperidiini/dimetyyliformamidi-liuoksella : (2x3 min, 2x8 ml) . Tämän jälkeen hartsi pestiin N-metyyli- pyrrolidinonilla (5x10 ml) ja peptidi koostettiin hartsiin (785 mg esimerkistä le saatua hartsia)), jolloin suoritet- • · I · 25 tiin seuraavat vaiheet syklisesti: • « - Fmoc-suojaryhmän lohkaisu pois 20-%:isella pipe- • · · * ridiinin DMF-liuoksella - Hartsin pesu DMF/N-metyylipyrrolidinoni-seoksella * · » *·’·* - Fmoc-aminohapon kytkeminen paikalleen aktivoimal- V ’ 30 la in situ HOBt-esteriksi käyttämällä di-isopropyylikar- bodi-imidiä aktivointireaktanttina (1,5 mmol aminohappoa, « .···. 2,25 mmol HOBt ja 1,6 mmol di-isopropyylikarbodi-imidiä) ;t Siinä tapauksessa, että kytkentä oli epätäydellinen « * '··' (Kaiser-koe) , toistettiin kytkentävaihe. Viimeisenä amino- t •’ 35 happona liitettiin Fmoc-D-Nal(2)-OH. N-terminaalinen ase- 102380 13 tyyliryhmä tuotiin reaktiona asetanhydridin kanssa.

Kiinteäfaasisynteesin päätyttyä hartsi pestiin (DMF, CH2C12) ja kuivattiin perusteellisesti. Tällöin saatiin 1,35 g substituoitua hartsia.

5 Kuivattu hartsi suspendoitiin huoneen lämpötilassa 0,75 ml:n kanssa etaaniditiolia. 15 minuutin kuluttua lisättiin 7,5 ml trifluorietikkahappoa ja suspensiota hämmennettiin 1,5 tuntia. Tämän ajan kuluttua erotettiin hartsi suodattamalla ja pestiin perusteellisesti 80-10 %:isella trifluorietikkahapolla. Suodos haihdutettiin tyhjössä ja jäännös otettiin 30 mitan vettä. Lisäämällä NaHC03 säädettiin pH välille 6-7 ja peptidiä ravisteltiin n-pen-tanolin kanssa (4x30 ml) . n-pentanolifaasi haihdutettiin ja jäännös otettiin 10 mitan metanoli/H20(9:1)-seosta ja 15 joukkoon lisättiin 0,5 g K2C03. Seosta sekoitettiin 30 minuuttia, suodatettiin ja suodos haihdutettiin. Jäännös otettiin 100 mitan n-pentanolia ja orgaaninen faasi pestiin vedellä. MgS04:n avulla suoritetun kuivauksen ja suodatuksen jälkeen orgaaninen faasi haihdutettiin. Tällöin 20 saatiin 740 mg raakatuotetta. Kromatografiän jälkeen, jos- * sa käytettiin OSephadex G 25 -hartsia (1 M etikkahappo) ja piihappogeeliä, saatiin 185 mg puhdasta otsikkoyhdistettä. FÄB-MS: 1531 (M+H+)

I < I

* I

··· * 1 · • · · • « • · l • · · • · • · < • · « • · 1 • · · • · « • · · ·· • · • · 4 4 » I « I 4 4 4 4 • I · 4 I « i < 4 • 1

Claims (3)

102380

1. Menetelmä peptidien valmistamiseksi, joilla on yleinen kaava I 5 (X) n - A - NH2 (I) jossa X tarkoittaa o-aminohapporyhmää joukosta Ac-Nal(2), 10 Ac-D-Nal(2), p-Cl-Phe, p-Cl-D-Phe, Trp, D-Trp, Ser, Tyr, D-Tyr, Ser(α-L-Rha), D-Ser(o-L-Rha), Leu, D-Leu, Arg, D-Arg, Pro, D-Pro, p-Glu, His, D-Ser(tBu), n tarkoittaa kokonaislukua 3 - 10, ja A tarkoittaa atsaglysiiniä, 15 sekä näiden fysiologisesti siedettävien suolojen valmistamiseki, tunnettu siitä, että yhdiste, jolla on kaava II H2N / V jossa

25 Y1, Y2, Y3, Y4 ja Y5 tarkoittavat vetyä, C1.4-alkoksia »»· ··.: tai - (CH2) n-COOH, jolloin ryhmät voivat olla samanlaisia tai erilaisia mutta ainakin yksi ryhmä on - (CH2) n-COOH, n • · · · tarkoittaa kokonaislukua 1-3, ja R1 tarkoittaa vetyä tai 4-metoksifenyyliä, 30 saatetaan liuottimessa reagoimaan silyloimisrea- • · ;*j*; genssin kanssa, joka on tert.-butyylidimetyylisilyyliklo- ridi, tert.-butyylifenyylisilyylikloridi, trimetyylikloo- # · « ' risilaani tai bistrimetyylisilyyliasetamidi, ja tämän jäl- '·<" keen muutetaan silyloitu yhdiste kloorimuurahaishappojoh- 35 dannaisen kanssa kaavan III mukaiseksi yhdisteeksi • · V-/ 102380 1,1,1 R^CC- HN l \ A Y5 Y4 jossa R1, Y1, Y2, Y3, Y4 ja Y5 tarkoittavat samaa kuin edellä ja

10 R2 on nitrolla ja/tai halogeenilla substituoitu fe- nyyli, näin saadut kaavan III mukaiset yhdisteet saatetaan reagoimaan aminohappohydratsidin kanssa, jolla on kaava IV

15 R3 - X - CO - NH - NH2 · HC1 (IV) jossa X tarkoittaa edellä esitettyä a-aminohapporyhmää, ja

20 R3 tarkoittaa Fmoc-, Bpoc- tai Boc-suojaryhmää, liuottimessa kaavan V mukaisiksi yhdisteiksi V/

25 Bä_CH—^V-ϊ3 (V) ·:··: oc—HN φ y H1^SnH_co—X-R3 :V; 30 jossa R1, R3 ja Y1, Y2, Y3, Y4 ja Y5 tarkoittavat samaa kuin • · edellä, ja siinä tapauksessa, että R3 tarkoittaa Boc, tämä suojaryhmä poistetaan hydrauksen avulla käyttämällä Pd- tr» katalysaattoria ja muutetaan ennen seuraavaa reaktiota Fmoc- tai Bpoc -uretaanisuojaryhmäksi, tämän jälkeen kaa-35 van V mukainen yhdiste, jossa R1, Y1, Y2, Y3, Y4 ja Y5 tar- 102380 koittavat samaa kuin edellä ja R3 on Fmoc- tai Bpoc-uretaa-nisuojaryhmää, kytketään hartsiin peptidikemiassa tavallisten kytkentäreagenssien avulla -(CH2)n-COOH-ryhmän välityksellä, suojaryhmä R3 lohkaistaan pois, rakenteeseen kyt-5 ketään vaiheittain Fmoc- tai Bpoc-suojaryhmien avulla tilapäisesti suojattuja o-aminohappoja, mahdollisesti niiden aktiivisten johdannaisten muodossa, ja koostamisen päätyttyä vapautetaan kaavan I mukaiset peptidit hartsista käsittelemällä keskivahvalla hapolla, jolloin samanaikaises-10 ti tai sopivien toimenpiteiden avulla jälkeenpäin niihin tilapäisesti tuodut sivuketjujen suojaryhmät lohkaistaan jälleen pois.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan yhdiste (Ac-D-

15 Nai(2)-p-Cl-D-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(α-L-Rha)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan yhdiste pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2. ( < I i 1 i « « * • · · M·· • · * ·· • · · « · · « · « · » « · · • · • · · • · · • · · • • M f * f I i « 1 · • « 102380