FI102538B - LH-RH-analogien synteesi väliaikaisella, pienimmällä mahdollisella suo jauksella - Google Patents

Description

102538 LH-RH-analogien synteesi väliaikaisella, pienimmällä mahdollisella suojauksella Tämä keksintö koskee menetelmää LH-RH-analogin, 5 joka on nona- tai dekapeptidi ja joka sisältää vähintään yhden seriiniryhmän, kiinteäfaasisynteesiä varten. Menetelmä antaa pienimmän mahdollisen suojauksen.

LH-RH-analogit ovat nona- tai dekapeptidejä, jotka ovat rakenteeltaan läheisiä LH-RH:lie, ja jotka osoittavat 10 samanlaista biologista aktiivisuutta kuin LH-RH. Analogit ovat intensiivisen kliinisen tutkimuksen kohde niiden osoitetun kyvyn vuoksi vähentää endometrioosin, eturauhassyövän, ennenaikaisen puberteetin ja muiden hormonivälit-teisten sairauksien oireita. Vaikka tiettyjä LH-RH-analo-15 geja on tällä hetkellä saatavilla terapeuttiseen käyttöön, niiden synteesi on monimutkainen, ja niin muodoin kallis menetelmä, mikä väistämättä lisää hoidon tarpeessa olevien kustannuksia. LH-RH-analogien on tavanomaisesti kuvattu olevan joko agonisteja tai antagonisteja, riippuen niiden 20 vaikutustavasta.

Tässä keksinnössä kiinnostuksen kohteena olevat LH-RH-analogit ovat nona- ja dekapeptidejä, ja ne käsittävät sekä agonisteja että antagonisteja. Esimerkit LH-RH-ago-nisteista, jotka ovat hyödyllisiä aiheena olevassa keksin-. ' 25 nössä, ovat nafareliini, leuproreliini, busereliini, gose- reliini, histereliini, triptoreliini ja desloreliini; nämä kaikki eroavat luonnossa esiintyvästä LH-RH:sta siinä, että 6-asemassa oleva glysiinijäännös on korvattu D-amino-hapolla. Synteettisillä agonisteilla on siten yhteisenä 30 piirteenä luonnollisen hormonin kanssa histidiini asemassa '· 2, seriini asemassa 4 ja tyrosiini asemassa 5, joilla kai killa on reaktiiviset sivuketjut, jotka voivat aiheuttaa ongelmia synteesissä.

LH-RH-antagonistit eroavat luonnossa esiintyvästä 35 LH-RH:sta yleensä siinä, että asemassa 2 oleva histidyy- 2 102538 lijäännös on poistettu tai korvattu. Synteesin kannalta histidiinin poisto vähentää ei-toivottujen sivureaktioiden mahdollisuuksia; kuitenkin sekä seriinin että tyrosiinin läsnäolo vaatii silti erityisiä toimenpiteitä sivuketjujen 5 reaktioiden välttämiseksi.

LH-RH-analogeja voidaan syntetoida erilaisilla menetelmillä, kuten on esitetty julkaisuissa J. M. Stewart ja J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis. W. H. Freeman Co., San Francisco, 1969; J. Meinenhofer, Hormonal 10 Proteins and Peptides. Vol. 2, sivu 46, Academic Press (New York), 1973; ja E. Schroder ja K. Lubke, The Peptides. Voi. 1, Academic Press (New York), 1965. Menetelmiä voidaan laajalti luonnehtia joko liuosfaasi tai kiinteä-faasimenetelmiksi. Kumpikin menetelmä käsittää aminohappo-15 jen peräkkäisen lisäämisen kasvavaan peptidiketjuun. Ta vallisesti ensimmäisen aminohapon joko amino- tai karbok-syyliryhmä suojataan sopivalla suojaryhmällä. Suojattu aminohappo voidaan sitten joko kiinnittää reagoimattomaan kiinteään kantajaan tai käyttää hyödyksi liuoksessa lisää-20 mällä järjestyksessä seuraava suojattu aminohappo olosuh teissa, jotka ovat sopivat amidisidoksen muodostumiselle. Suojaava ryhmä poistetaan sitten tästä vasta lisätystä aminohappojäännöksestä, ja seuraava aminohappo lisätään, ja niin edelleen. Kun kaikki toivotut aminohapot on lii-25 tetty oikeassa järjestyksessä, mahdolliset jäljellä olevat suojaryhmät ja kiinteät kantajat poistetaan, jotta saadaan lopullinen polypeptidi. Tämän yleisen menetelmän yksinkertaisella muunnelmalla on mahdollista lisätä enemmän kuin yksi aminohappo kerralla kasvavaan ketjuun, esimerkiksi 30 kytkemällä suojattu tripeptidi suojattuun dipeptidiin, jotta muodostuu pentapeptidi.

Kiinteäfaasisynteesin täsmällisemmät olosuhteet kuitenkin edellyttävät yleensä, että mitkä tahansa reaktiiviset sivuketjut aminohapoissa suojataan amidisidoksen 35 muodostamisen aikana. Sivuketjuja suojaavat ryhmät poiste- 3 102538 taan yleensä erillisessä vaiheessa sen jälkeen, kun valmis polypeptidi on pilkottu inertistä kantajasta, jolla se on tehty, tai samanaikaisesti sen kanssa.

Eräs erityisen hyödyllinen kiinteäfaasisynteesime-5 netelmä LH-RH-analogien valmistamiseksi on tuotu esille US-patentissa nro 4 234 571, Nestor et ai, joka julkaisu on esitetty tässä viitteenä. Tässä yleisesti käytössä olevassa lähestymistavassa jokaisen aminohapon α-amino- (N*) funktio on suojattu happamalla tai emäksisellä herkällä 10 ryhmällä, kuten t-butyylioksikarbonyylillä (Boc); mitkä tahansa reaktiiviset sivuketjut, kuten seriinissä, histi-diinissä ja tyrosiinissä olevat, suojataan myös vahvasti sitoutuneilla ryhmillä, jotka edellyttävät käsittelyä ve-tyfluoridilla (HF), tai muita samalla tavalla voimakkaasti 15 vaikuttavia menetelmiä niiden poistamiseksi. Myöskin a-a- minoryhmää suojäävien ryhmien ja sivuketjuja suojaavien ryhmien poisto suoritetaan yleisesti erillisillä vaiheilla.

Tämä sovellutus on riittävä peptidien tutkimuksessa 20 tarvittavien määrien tuottamista varten, mutta kun suunni tellaan peptidien tuottoa suuressa mittakaavassa, nämä menetelmät eivät ole tyydyttäviä. Aminohapot, joiden sivu-ketjut on täysin suojattu, ovat kalliita, ja nämä kustannukset voivat olla merkittäviä peptidien kaupallisen mit-• ' 25 takaavan tuotannossa. Myöskin vetyfluoridin käyttö, sen lisäksi, että se aiheuttaa vakavia ympäristöriskejä, aiheuttaa osaltaan saannon menetyksiä, jotka ovat kaupallisesti mahdottomia hyväksyä. Sitä paitsi, koska tarvitaan erillinen tuotannon vaihe sivuketjuja suojaavien ryhmien 30 poistamiseksi, se merkitsee lisäaikaa ja -kuluja synteesi- prosessiin.

Vaihtoehtoiset menetelmät eivät ole sen enempää houkuttelevia. Tien et ai., Pept. Chem. 375 - 379, T.

Shiba ja S. Sakakibara (Ed.), Protein Research Foundation, 35 Osaka (1988), ovat raportoineet LH-RH:n synteesistä käyt- 4 102538 taen tosyylisuojausta histidiinille ja bentsyylisuojausta tyrosiinille ja seriinille. Tämä sovellutus, vaikka se välttää vetyfluoridin käytön, yhä edellyttää erillistä dehydrogenaatiovaihetta bentsyylisuojaryhmien poistamisek-5 si, minkä seurauksena tapahtuu, jonkin verran tryptofäänin pelkistymistä.

D. H. Coy et ai., Int. J. Peptide Protein Res.. 14, 339 - 343 (1979) raportoivat LH-RH-antagonistin synteesistä, [D-Phe2, D-Trp3, D-Phe6] -LH-RH käyttäen erilaisia sivu-10 ketjun suojausmenetelmiä, jotka kaikki edellyttävät HF- suojauksenpoiston: he tarjoavat ainoastaan seriinin sivu-ketjun suojauksen bentsyylillä, ainoastaan arginiinin sivuketjun suojauksen tosyylillä, sekä seriinin että arginiinin sivuketjujen suojauksen ja seriinin, arginiinin 15 sekä tyrosiinin sivuketjujen suojauksen (2-bromibentsyyli- oksikarbonyylillä). Arginiinin suolasuojausta (Arg HCl:na) käytettiin myöskin "ainoastaan seriini" -synteesissä. Ve-tyfluoridia käytettiin pilkkomaan raakapeptidi kantajastaan, ja poistamaan sivuketjuja suojaavat ryhmät. Ainoas-20 taan kun peptidi on "täysin" suojaamaton (ja vain suola- suojaus arginiinille) vältti Coy-vetyfluoridikäsittelyn. Kaikki suojatut synteesit tarjosivat huonommat saannot kuin synteesit suojaamattomilla sivuketjuilla.

Coy et ai. raportoivat edelleen LH-RH-agonistin - 25 synteesistä [D-Leu6, desGly-NH210]-LH-RH etyyliamidi, jossa on ainoastaan histidiinin sivuketjun dinitrofenyy-lisuojaus, arginiinin suolasuojaus, eikä HF-käsittelyä. Sivuketjua suojaava dinitrofenyyliryhmä poistettiin peptidin kantajastaan pilkkomisen aikana liuoksella, joka si-30 saisi etyyliamidia dimetyyliformamidissa. Saanto syntee- • sistä, jossa ainoastaan histidiini oli suojattu, oli vain 34 % versus 24 % täysin suojattuun, HF pilkkomista käyttävään synteesiin nähden. Vertailua suojaamattomaan synteesiin ei tehty.

35 Alalla ehdotetaan, että erilaisista pienimmän mah dollisen suojauksen menetelmistä se, jossa histidiini on 5 102538 ainoana suojattuna, voi tarjota jonkin verran lisäystä saantoon, verrattuna täysin suojattuihin synteeseihin tietyille LH-RH-antagonisteille; kuitenkaan mitään erityistä etua ei liity mihinkään raportoiduista sivuketjujen suo-5 jaussovellutuksista LH-RH-agonisteille.

Vaikka ihanteellinen sovellutus HF-suojauksenpois-tovaiheen eliminoimiseksi voi olla suojaamattoman synteesin toteutus, suojauksen puuttuminen histidiiniltä johtaa liialliseen rasemointiin. Seuraamalla Coy'ta et ai., on 10 kuitenkin havaittu, että menetelmän käyttö, jossa ainoas taan histidiini on suojattu, johtaa korkeisiin bis-serii-ni-epäpuhtaustasoihin, johtuen seriinijäännöksen asylaa-tiosta. Huomattavaa parannusta tarvitaan alalla vallitseviin oppeihin nähden, jotta saadaan LH-RH-analogeille 15 käyttökelpoinen pienimmän mahdollisen suojauksen synteesi, joka ei edellytä HF-suojauksenpoistovaihetta, ja joka silti tarjoaa suojan niille ryhmille, jotka, jos ne ovat suojaamattomia, voivat vaikuttaa haitallisesti peptidin puhtauteen ja saantoon.

20 Tämän keksinnön tarkoituksena on tarjota menetelmä LH-RH-analogien syntetoimiseksi, jossa menetelmässä vain olennaisesti pienin mahdollinen määrä aminohappo jäännösten sivuketjuja on suojattu.

Tämän keksinnön tavoite on lisäksi tarjota menetel-25 mä LH-RH-analogien syntetoimiseksi, jolla menetelmällä vältetään HF-suojauksenpoistovaiheen tarve, ja siten myös vältetään myrkyllisen HF-reagenssin käyttö ja vähennetään myrkyllisiä jäteliuoksia, jotka usein liittyvät tavanomaisiin prosesseihin.

30 Yllä mainitut seikat tästä keksinnöstä tarjoavat t; lisäetuja, kuten LH-RH-yhdisteiden valmistuksen kustannus ten väheneminen, sekä myöskin ylimääräisen menetelmävai-heen välttämisen sivuketjuja suojaavien ryhmien poistamiseksi .

6 102538 Tämän keksinnön päämäärät saavutetaan LH-RH-analogeille väliaikaisen, pienimmän mahdollisen suojauksen menetelmällä, jossa ainoastaan aminohappojäännös seriinin hydroksi-sivuketju suojataan ryhmällä, joka poistetaan 5 välittömästi sen jälkeen, kun seriini on liitetty peptidi- ketjuun. Sivuketjua suojaava ryhmä on sellainen, joka on labiili samoissa olosuhteissa, jotka ovat käyttökelpoiset α-aminoryhmää suojaavan ryhmän poistamiseen. Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista se, mitä patent-10 tivaatimuksessa 1 esitetään. Niille LH-RH-analogeille, jotka sisältävät histidiinijäännöksen, imidatsolisivuketju voidaan myös suojata ryhmällä, joka on labiili liittämis-syklin aikana, soveltuvasti labiili a-aminoryhmän suoja-ryhmän poistavalle aineelle, mutta ihanteellisesti se voi-15 daan myös suojata ryhmällä, joka voidaan poistaa aminolyy- sillä tai ammonolyysillä.

Seriinin väliaikainen sivuketjun suojaus, ja histi-diinin sivuketjun suojaus, jos histidiini on läsnä, minimoi epäpuhtauksien muodostumisen ja maksimoi saannot, 20 edellyttämättä HF- tai vaihtoehtoista erillistä suojauksen poistovaihetta.

Menetelmän ia LH-RH-analoaien kuvaus Tämän keksinnön mukaisen väliaikaisen, pienimmän mahdollisen suojauksen antavan menetelmän ajatellaan ole-*. 25 van sopiva seriiniä sisältävän polypeptidin kiin- teäfaasisynteesiin. Kun keksintöä kuvataan viitaten yksittäisten aminohappojen perättäiseen lisäämiseen, ne, joilla on alan tuntemusta huomaavat, että menetelmä on yhtälailla käytettävissä synteeseissä, joissa pienten polypeptidien 30 ryhmiä liitetään muodostamaan suurempi polypeptidi, esim.

lisäämällä tetrapeptidi pentapeptidiin, edellyttäen, että minkä tahansa seriinijäännöksen sivuketju on väliaikaisesti suojattu seriinin kytkemissyklin aikana.

Väliaikainen suojaus merkitsee, että seriinin sivu-35 ketju suojataan synteettisen vaiheen suhteellisen lyhyen 7 102538 ajan. Sivuketjun suojaryhmä ja a-amino- tai karboksyyli-ryhmän suojaryhmä poistetaan samanaikaisesti, sen jälkeen, kun seriinin liittäminen on tapahtunut. Yleisesti ottaen määräävä kriteeri seriinin sivuketjun suojaryhmää valit-5 taessa on, että ryhmän tulee olla stabiili liittämisolo- suhteissa, mutta labiili a-amino-suojauksen poistavissa oloissa. Tämän keksinnön mukaisesti, joka käsittää a-aminoryhmän suojauksen, seriinin sivuketju suojataan t-butyylillä tai t-butyylidimetyylisilyylillä.

10 Niille LH-RH-analogeille, jotka sisältävät histi- diinijäännöksiä, on yleisesti ottaen suotavaa suojata imi-datsolisivuketju. Tämä suojaus voi myöskin olla väliaikainen, se on, labiili liittämissyklin aikana, tai se voi pysyä, kunnes peptidi irrotetaan kantajastaan. Mieluiten 15 käytetään aminolyysiä tai ammonolyysiä pilkkomaan hartsi kantajastaan, ja samanaikaisesti poistamaan histidiiniä suojaava ryhmä.

Tämän keksinnön toisessa aspektissa suojauksen poistava aine valitaan liuoksista, jotka sisältävät vety-20 kloridia C3-C6-alkoholeissa ja dikloorimetaanissa. Alkoho lin suhde dikloorimetääniin on mieluiten 0,1 - 10,0 (v/v), ja happokonsentraatio on 2N - 9N. Kaikkein mieluimmin alkoholi on i-propanolia.

Lyhenteet ia täsmennykset : 25 Tämän keksinnön tarkoituksia varten ilmaisu "LH-RH" •. - viittaa luteinisoivaa hormonia vapauttavaan hormoniin, ja "LH-RH-analogien" tarkoitetaan käsittävän LH-RH:n itsensä, yhtä hyvin kuin muut polypeptidit, jotka ovat rakenteeltaan läheisiä LH-RH:lie, tai johdettu siitä, ja jotka 30 osoittavat samanlaista biologista aktiivisuutta kuin LH- RH.

Lyhenteet erilaisille tavallisille aminohapoille ovat niitä, joita IUPAC-IUB-Commission on Biochemical Nomenclature, Biochemistry. 11, 1726 (1972) suosittelee.

35 Kaikki peptidisekvenssit, jotka on mainittu tässä, on kir- 3 102538 joitettu yleisesti hyväksytyllä tavalla, jonka mukaisesti N-terminaalinen aminohappo on vasemmalla ja C-terminaalinen aminohappo on oikealla.

Lyhenteet tässä edustavat L-aminohappoja, ei-kiraa-5 lisen aminohapon glysiinin muodostaessa poikkeuksen, ja poikkeuksen edelleen muodostaessa mitkä tahansa ei-luonnolliset aminohapot, jotka ovat ei-kiraalisia, tai jotka on muuten merkitty D- tai D,L-. Et on etyyli, Bu on butyy-li ja iPr on isopropyyli.

10 Muut lyhenteet, jotka ovat käyttökelpoisia keksin töä kuvattaessa käsittävät aminohappojen korvaamisen luonnollisessa LH-RH-peptidissä seuraavasti:

Aminohappoi äännös Lyhenne 3-(2-naftyyli)-alanyyli Nai(2) 15 3-(p-fluorifenyyli)-alanyyli p-F-Phe 3-(p-kloorifenyyli)-alanyyli p-Cl-Phe 3-(3-pyridyyli)-alanyyli Pal(3) N^N^-bis (etyyli) - hArg(Et)2 homoarginyyli 20 NG,NG'-bis(2,2,2-trifluori- hArg (CH2CF3) 2 etyyli)homoarginyyli l^-butyyli-homoarginyyli hArg(Bu) N*-Isopropyyli-D-lysyyli Lys(iPr) (bentsyyli)-histidyyli His(Bzl) 25 * ·

Kuten tässä on käytetty, termi "farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat" viittaa suoloihin, jotka säilyttävät emoyhdisteen toivotun biologisen aktiivisuuden ilman myrkyllisiä sivuvaikutuksia. Esimerkkejä tällaisista suolois-30 ta ovat happamat additiosuolat, jotka muodostetaan epäor- . gaanisten happojen kanssa, esimerkiksi suolahapon, bromi- • · * vetyhapon, rikkihapon, fosforihapon, typpihapon ja muiden samankaltaisten happojen kanssa; ja suolat, jotka muodostetaan orgaanisten happojen kanssa, kuten esimerkiksi 35 etikkahapon, oksaalihapon, tartaarihapon, meripihkahapon, 9 102538 maleiinihapon, fumaarihapon, glukonihapon, sitruunahapon, omenahapon, askorbiinihapon, bentsoehapon, parkkihapon, pamiinihapon, alginiinihapon, polyglutamiinihapon, nafta-leenisulfonihappojen, naftaleenidisulfonihappojen, polyga-5 lakturonihapon, ja muiden samankaltaisten happojen kanssa.

Lyhenne "N-Ac" viittaa spesifisesti N-asetyylisuo-jaryhmään, se on, asetyyliryhmään kiinnitettynä terminali-seen aminohappojäännökseen amiinitypessä, yhdenmukaisesti yleisesti hyväksytyn terminologian kanssa.

10 Eräässä keksinnön sovellutusmuodossa annetaan käyt töön parannettu pienimmän mahdollisen suojauksen menetelmä yhdisteen kiinteäfaasisynteesiä varten, jolla yhdisteellä on kaava 15 R^R^R^Ser-Tyr-R^Leu-R^Pro-R6 (I) jossa R1 valitaan joukosta (pyro)Glu ja N-Ac-D-Nal (2) ; R2 valitaan joukosta His, D-p-Cl-Phe ja D-p-F-Phe; 20 R3 valitaan joukosta Trp, D-Trp, D-Nal(2) ja D-Pal(3); R4 valitaan joukosta D-Nal(2), D-hArg(Et)2, D-hArg(Bu), D-hArg (CH2CF3)2, D-His(Bzl), D-Leu, D-Pal(3), D-Ser(tBu) ja D-Trp; R5 valitaan joukosta Arg, L-hArg(Et)2, L-hArg(Bu), L-hArg-25 (CH2CF3) 2 ja Lys(iPr); ja R6 valitaan joukosta Gly-NH2, NH-NHC0NH2, D-Ala-NH2 ja NHEt ; jolloin aminohapot on varustettu N*-suojauksella; jossa parannus käsittää (a) seriinin sivuketjun väliaikaisen suojauksen 4-asemassa, sopivasti ryhmällä, joka on 30 labiili niille aineille, jotka ovat hyödyllisiä a-amino- „ · ryhmää suojäävien ryhmien poistossa indusoimatta rasemoin- • · <, tia, sivureaktioita tai kasvavan peptidin pilkkoutumista hartsikantajastaan, ja (b) histidiinin, jos se on läsnä, sivuketjun suojauksen ryhmällä, joka on labiili o-amino-35 ryhmän suojauksen poistoaineelle, tai aminolyysille tai ammonolyysille.

102538

Toisessa suoritusmuodossa annetaan käyttöön väliaikaisen, pienimmän mahdollisen suojauksen menetelmä kaavan (I) mukaisen yhdisteen kiinteäfaasisynteesille, joka menetelmä käsittää seuraavat vaiheet: (a) polypeptidin amino-5 happojen α-aminoryhmien suojauksen, (b) seriinin sivuket jun suojauksen ryhmällä, joka on labiili niille aineille, jotka ovat käyttökelpoisia α-aminoryhmää suojaavan ryhmän poistamisessa, (c) histidiinin, jos se on läsnä, sivuketjun suojaaminen ryhmällä, joka on labiili emäksisille suo-10 jauksen poistaville aineille, tai ryhmällä, joka voidaan poistaa aminolyysillä tai ammonolyysillä, (d) C-terminaa-lisen aminohapon sitominen kiinteään kantajaan, (e) yhden tai useamman valitun aminohapon peräkkäinen liittäminen toisiinsa sopivalla liittämisaineella, toisiaan seuraavis-15 sa sykleissä, alkaen C-termainaalisesta päästä, (f) suoja- ryhmien poisto jokaisen syklin jälkeen käsittelemällä suojauksen poistavalla aineella, joka valitaan niistä aineista, jotka pystyvät poistamaan sekä α-aminoryhmää suojaavan ryhmän että sivuketjua suojaavan ryhmän indusoimatta rase-20 mointia, sivureaktioita, tai pilkkomatta kasvavaa peptidiä hartsista, (f) liittämis- ja poistamisvaiheiden toisto, kuten tarvitaan nona- tai dekapeptidin muodostamiseksi, (g) polypeptidin pilkkominen kantajasta aminolyysillä tai ammonolyysillä ja (h) saadun polypeptidin eristäminen ja 25 puhdistaminen.

Vielä eräässä suoritusmuodossa keksintö koskee kaavan (I) mukaisen yhdisteen kiintofaasisynteesiä, joka menetelmä käsittää seuraavat vaiheet: (a) kytketään kiintofaasisynteesillä sopiva Boc-30 suojattu ja t-butyylisuojattu seriini peräkkäisissä syk- leissä ja järjestyksessä kaavan (I) mukaisen yhdisteen aminohapposekvenssissä oikealta vasemmalle, alkaen ryhmästä B0C-R6-O-, joka on kovalenttisesti kiinnitetty inert-tiin kiinteään kantajaan, (b) eliminoidaan kunkin syklin 35 lopussa Boc-suojaryhmä ja samanaikaisesti t-butyyliryhmä 102538 seriinistä tai D-seriinistä käsittelemällä suojauksen poistavalla aineella, joka on HC1/CH2C12 tai HCl/alempial-kanoli/CH2Cl2, polypeptidin muodostamiseksi, joka on sidottu kiinteään kantajaan, (c) irrotetaan polypeptidi kanta-5 jasta ammonolyysillä, ja (d) eristetään muodostunut poly peptidi .

Edullisessa suoritusmuodossa annetaan käyttöön edellä kuvattu menetelmä edellä mainitun kaavan mukaisen polypeptidin valmistamiseksi, jossa polypeptidissä 10 R1 on (pyro)Glu tai N-Ac-D-Nal(2); R2 on His tai D-p-Cl-Phe; R3 on Trp ja D-Pal(3); R4 on D-Nal (2), D-Leu, D-Trp, D-Ser(tBu), D-His(Bzl) tai D-hArg(Et)2; 15 Rs on Arg tai hArg(Et)2; ja R6 on Gly-NH2, NHEt tai D-Ala-NH2.

Kaikkein mieluiten keksintö antaa käyttöön menetelmän kaavan (I) mukaisen LH-RH-antagonistin, se on nafare-liinin, valmistamiseksi, jossa 20 R1 on (pyro)Glu, R2 on His, R3 on Trp, R4 on D-Nal (2) , R5 on Arg, ja 25 R6 on Gly-NH2, tai Kaavan (I) mukaisen LH-RH -antagonistin valmistamiseksi, jossa R1 on AC-D-Nal(2) ; R2 on D-p-Cl-Phe; 30 R3 on D-Pal (3) ; R4 on D-hArg(Et)2; • « .

Rs on L-hArg(Et)2; ja R6 on D-Ala-NH2.

Edullisessa suoritusmuodossa aminohappojen a-amino 35 (N“) funktio suojataan happamalle tai emäksiselle herkällä 12 102538 ryhmällä. Suojaryhmä on stabiili olosuhteissa, joissa pep-tidisidos muodostetaan, vaikka se on helposti poistettavissa tuhoamatta kasvavaa peptidiketjua tai aiheuttamatta minkään peptidin sisältämän kiraalisen keskuksen rasemoin-5 tia. Soveltuvia suojarymiä ovat t-butoksikarbonyyli (Boc), bifenyyli-isopropyylioksikarbonyyli, t-amyylioksikarbonyy-li, isobornylioksikarbonyli, a,a-dimetyyli-3,5-dimetoksi-bentsyylioksikarbonyyli, o-nitrofenyylisulfenyyli, 2-syaani - t -butyylioksikarbonyyli, 9-fluorenyylimetyylioksikarbo-10 nyyli (Fmoc) ynnä muut samankaltaiset. Edullisimmin o-ami- noryhmää suojaava ryhmä on t-butoksikarbonyyli (Boc). Kun on toivottua valmistaa peptidi, kuten busereliini tai go-sereliini, jossa R4 kaavan (I) mukaisessa yhdisteessä on D-Ser(t-Bu), Fmoc on edullinen N“:n suojaamiseksi liittä-15 missykleissä, D-Ser(t-Bu):n lisäämisen aikana ja sen jäl keen .

Fmoc on labiili emäksisille aineille (pH >8,5), kuten piperidiinille, joka ei poista tBU:ta D-SER(tBu):sta. Myöhemmissä sykleissä, D-Ser(tBu):n lisäyksen jälkeen, on 20 käytettävä emäkselle herkkää N*-suojausta. Seriinin 4-ase massa oleva sivuketju suojataan ryhmällä, joka voidaan poistaa esim. miedolla fluoridikäsittelyllä. Edullinen seriinin sivuketjun suojaryhmä on t-butyylidimetyylisilyy- li.

25 Seriinijäännöksen hydroksisivuketju suojataan se riinin kasvavaan peptidiin liitämisen aikana, kuten on kuvattu tämän keksinnön yleisessä selvityksessä. Sivuketjun suojaryhmä poistetaan sen jälkeen, kiin kytkeminen on suoritettu, ennen seuraavan aminohapon kytkemistä. Serii-30 nin sivuketjun suojaryhmä poistetaan samalla aineella, jota käytetään poistamaan N*-suojaryhmä. Edullisimpia sivu-ketjujen suojaryhmiä seriinille ovat t-butyyli, t-butyyli-dimetyylisilyyli, trimetyylisilyyli, trityyli, pivalyyli j a tetrahydropyran-2-yyli.

13 102538

Edelleen, histidiinin, joka yleensä esiintyy LH-RH-agonisteissa, imidatsolisivuketju suojataan myöskin. Histidiinin sivuketjun suojaryhmä voi myös olla labiili kyt-kemissyklin aikana, esimerkiksi labiili Ne-ryhmän suojauk-5 sen poistavalle aineelle, mutta ihanteellisesti sen poisto suoritetaan, kun peptidi pilkotaan kantajastaan. Edullisia sivuketjun suojaryhmiä histidiinille ovat p-tolueenisul-fonyyli ja 2,4-dinitrofenyyli.

Synteesin aloittamiseksi ensimmäinen aminohappo, 10 joka on yleensä C-terminaalinen aminohappo lopputuottees sa, kiinnitetään sopivaan kiinteään kantajaan. Sopivia kiinteitä kantajia, jotka ovat käyttökelpoisia edellä mainitussa synteesissä, ovat sellaiset materiaalit, jotka ovat inerttejä reagensseille ja vaiheittaisen kondensaa-15 tio-suojauksenpoisto-reaktion reaktio-olosuhteille, sekä liukenemattomia käytettyihin aineisiin. Esimerkkejä kaupallisessa käytössä olevista hartseista ovat styreeni/di-vinyylibentseenihartsit, joita on modifioitu reaktiivisella ryhmällä, esimerkiksi kloorimetyloitu styreeni/divinyy-20 libentseeni kopolymeeri, hydroksimetyloitu styreeni/di- vinyylibentseeni kopolymeeri, ynnä muut samankaltaiset. Merrifieldin hartsi (1 % ristisidottu kloorimetyloitu styreeni /di vinyylibentseeni kopolymeeri) on edullisin.

Kiinnittäminen hartsiin, esimerkiksi kloorimetyloi-25 tuun styreeni/divinyylibentseenihartsiin, suoritetaan N“- suojatun, C-terminaalisen aminohapon, erityisesti N*-Boc-aminohapon, reaktiolla - kuten sen cesium-, tetrametyyli-ammonium-, trietyyliammonium-, 1,5-diatsabisyklo[5.4.0]- undeka-5-eeni-, tai muun samankaltaisen suolan etanolissa, 30 asetonitriilin, Ν,Ν-dimetyyliformamidin (DMF), tai sen kaltaisten aineiden, erityisesti cesiumsuolan DMF:ssa -kloorimetyloidun hartsin kanssa, nostetussa lämpötilassa, esimerkiksi noin 40 °C ja 60 °C välillä, mieluiten noin 50 °C:ssa, noin 12 - 72 tuntia, mieluiten noin 48 tuntia.

14 102538

Peräkkäisten suojattujen aminohappojen liittäminen suoritetaan alalla hyvin tunnetuilla menetelmillä, tyypillisesti automaattisella polypeptidisyntetoijalla, kuten alalla hyvin tunnetaan. Jokainen suojattu aminohappo tuo-5 daan noin 1,5 - 2,5-kertaisena molaarisena ylimääränä, ja liittäminen suoritetaan inertissä, ei vettä sisältävässä, polaarisessa liuottimessa, kuten dikloorimetaanissa, DMF:ssa tai niiden seoksissa, mieluiten dikloorimetaanissa suunnilleen ympäröivässä lämpötilassa. Liittämisaine vali-10 taan joukosta N,N'-disykloheksyylikarbodi-imidi (DCC), N,N'-di-isopropyylikarbodi-imidi (DIC), tai muu karbodi-imidi, joko yksin tai 1-hydroksibentsotriatsolin (HBt), O-asyyliureoiden, bentsotriatsoli-A-yyli-oksi-tris(pyrro-lidiinifosfonium)heksafluorifosfaatin (PyBop), N-hydroksi-15 sukkiini-imidin, muiden N-hydroksi-imidien tai oksimien läsnä ollessa. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää suojattujen aminohappojen aktiivisia estereitä (esim. p-nitrofe-nyyli, pentafluorifenyyli ja sen kaltaiset) tai symmetrisiä anhydridejä.

20 Peptidihartsi testataan täydellisen kytkemisen suhteen käyttäen Kaiser Testiä fAnal. Biochem.. 34. 595 (1970)], paitsi proliinin kytkemisen suhteen, missä tapauksessa käytetään Kloraniili Testiä (Anal. Biochem.. 117. 145 (1981)) tai Isatiini Testiä fAnal. Chim. Acta.

·' 25 118, 149 (1980)].

Jos testi (t) viittaavat siihen, että reaktio ei ole täydellinen, kytkeminen toistetaan käyttäen lisättyjä aminohappoja, mutta jättäen pois lisätty hapan suojauksen poisto. Kun viimeinen kytkentä on täydellinen, hartsi pes-30 tään metanolilla tai metanolilla, joka sisältää dikloori- metaania, ja kuivataan korkeintaan 60 °C lämpötilassa.

Jokaisen syklin jälkeen, se on, sen jälkeen kun jokainen seuraava N“-suojattu aminohappo on lisätty kasvavaan polypeptidiketjuun, suojaryhmä poistetaan käsittele-35 mällä suojauksen poistavalla aineella. Kun lisätään serii- 15 102538 ni, suojauksen poistava aine poistaa sekä Ne-Boc-suojaryh-män että seriinin suojaryhmän. Edullisimpien suojauksen poistavien aineiden joukossa ovat suolahappo dikloorime-taanissa (HC1/CH2C12), trifluorietikkahappo dikloorimetaa-5 nissa (TFA/CH2CL2) ja suolahappo liuotettuna C3-C6-alkoho- liin, mieluiten isopropanoliin, joka on sekoitettu dikloo-rimetaanin kanssa. Yleisesti ottaen HCl:n konsentraatio on 2N - 9N, mieluiten 4N - 5N. CH2C12/C3-C6-alkoholin suhde on 0,1 - 10 (v/v), mieluiten noin 1:1. Erityisen edullinen 10 suojauksen poistava aine on 4,5N HCl i-PrOH:CH2Cl2:ssa (1:1). Suojauksen poistovaihe toteutetaan yleensä lämpötilassa 0 - 45 °C, mieluiten ympäröivässä lämpötilassa (20 - 27 °C) .

Alaan perehtyneet voivat hyväksyä sen, että kytken-15 tä/suojauksen poisto -käytännön valinta niin, että käyte tään aineita, jotka ovat muita kuin edellä kuvatut, on täysin soveliasta edellyttäen, että seriinijäännöksen suojaus poistetaan aineella, joka täyttää tämän keksinnön tavoitteet. Käytäntö, jossa käytetään HCl/iPrÖH/CH2Cl2 jo-20 kaiseen suojauksen poistosykliin, voidaan ottaa käyttön.

Vaihtoehtoisesti, sekoitettu käytäntö, jossa TFA/CH2C12 käytetään tietyissä sykleissä, ja HCl/iPrOH/CH2Cl2 toisissa, on myöskin käyttökelpoinen. Muunlaiset syklit ovat ilmeisiä alaan perehtyneelle.

2 5 Kiinteäfaasisynteesin lopuksi polypeptidi pilkotaan hartsista. Pilkkominen suoritetaan ammonolyysillä; kyllästetyllä ammoniakkiliuoksella soveltuvassa liuottimessa peptideille, joissa on alaniini- tai glysiini-C-terminus; niille peptideille, joissa on proliini-C-terminus, pilkko-30 minen tapahtuu aminolyysillä; alkyyliamiinilla tai fluo- rialkyyliamiinilla. Pilkkominen toteutetaan lämpötilassa, joka on 10 °C ja 50 °C välillä, mieluiten noin 25 °C:ssa, noin 12 - 24 tuntia, mieluiten noin 18 tuntia. Sopivia liuottimia ovat esimerkiksi metanoli, etanoli, isopropano-35 li, dimetyyliformamidi, tetrahydrofuraani, N,N-dimetyyli- I* 102538 etanoliamiini, heksaanit ja niiden seokset. Mieluiten käytetään kyllästettyä ammoniakkiliuosta metanolissa. Vaihtoehtoisesti peptidi voidaan poistaa hartsista transesteri-fikaatiolla emäksen kanssa, mitä seuraa aminolyysi.

5 Polypeptidi puhdistetaan sitten sarjalla kromato grafisia vaiheita, jotka käsittävät minkä tahansa tai kaikki seuraavista tavoista: Ioninvaihto heikosti emäksisellä hartsilla asetaattimuodossa; hydrofobinen adsorp-tiokromatografia tai ei-derivatisoitu polystyreeni-divi-10 nyylibentseeni (esim. AmberliteR XAD); silikageeliadsorp- tiokromatografia; ioninvaihtokromatografia karboksimetyy-liselluloosalla; partitiokromatografia (esim. SephadexR G-25) tai vastavirtaerottelu; korkean erotuskyvyn neste-kromatografia (HPLC), erityisesti käänteisfaasi-HPLC-ok-15 tyyli- tai -oktadekyylisilyyli-silika pakatulla sidotun faasin pylväällä.

Jos käytetään raseemista aminohappoa yhdessä tai useammassa 1, 2, 3 tai 6 asemista ja on toivottavaa saada yksittäisiä isomeerituotteita, diastereomeeriset nonapep-20 tidi- tai dekapeptidilopputuotteet erotetaan, ja toivottu peptidi, jossa on D-aminohappo sopivassa asemassa, eristetään ja puhdistetaan, mieluiten edellä mainitun kromatograf iavaiheen aikana.

Valinnaisesti, eristetty ja puhdistettu polypeptidi ·. 25 muunnetaan farmaseuttisesti hyväksyttäväksi suolaksi.

Seuraavat esimerkit vertaavat tämän keksinnön mukaista väliaikaista suojausprosessia suojaamattomaan prosessiin sekä LH-RH-agonisteille että LH-RH-antagonisteil-le. Nämä esimerkit esitetään vain spesifisiä tarkoituksia 30 varten, eikä niitä pidä tulkita siten, että ne asettaisi- vat mitään epäoikeudenmukaisia rajoituksia patenttivaati-mukeissa esitetyn keksinnön puitteille.

Sekä esimerkin 1 että 3 tuotteissa, käyttäen tämän keksinnön mukaista väliaikaisen, pienimmän mahdollisen 35 suojan menetelmää, on merkittävästi vähemmän epäpuhtauksia 17 102538 verrattuna tuotteisiin, joita saadaan esimerkeissä 2 ja 4 käyttäen ei-suojattuja synteesejä.

Pienemmän määrän epäpuhtauksia lisäksi tämän keksinnön mukainen menetelmä tarjoaa lisäetuja tuottamalla 5 suurempia saantoja, ja käyttämällä vähemmän vaarallisia reagensseja, lyhyemmässä ajassa ja alhaisemmalla energiankulutuksella LH-RH-analogien eristyksessä ja puhdistuksessa. Lisäetuna on pienenpien määrien tuottaminen huomattavasti vähemmän myrkyllisiä jäteliuoksia.

10 Valmistusohje λ

Boc-Gly-O-Hartsin valmistus 4,9 g N*-Boc-glysiiniä liuotettiin seokseen, joka sisälsi 50 ml metanolia ja 50 ml tislattua vettä. Liuoksen pH saatettiin 7,5:een vesipitoisella cesiumbikarbonaatil-15 la. Liuotin poistettiin sitten alipaineessa.

18 tunnin kuivaamisen jälkeen korkeassa alipainessa jäännös liuotettiin 150 ml kuivaa DMF:a. Lisättiin 25 g l-%:ista kloorimetyloitua polystyreeni/divinyylibentseeni (Merrifield) -hartsia (vastaavuus 25 mmol kloridia). Seos-20 ta ravisteltiin 50 °C:ssa 24 tuntia, suodatettiin, ja hartsi pestiin sitten vuoronperään DMFrlla, vedellä ja etanolilla. Hartsia kuivattiin alipaineessa 3 vuorokautta, jotta saatiin 28,34 g Boc-Gly-O-hartsia.

Valmistusohje B

25 Boc-Ala-O-Hartsin valmistus

Seuraten valmistusohjeen A menettelytapoja, Ne-Boc-D-alaniini lisättiin 1 % Merrifield hartsiin, jotta saatiin Ne-Boc-D-Ala-0-hartsi.

Esimerkki 1 3 0 Nafareliinin synteesi väliaikaisella seriinin suo-* jauksella Tässä esimerkissä nafareliini valmistettiin käyttäen seuraavia sivuketjunsuojausvaiheita: suolasuojaus arginiinille (kloridina), tosyylisuojaus histidiinille ja 35 t-butyylisuojaus seriinille.

1β 102538 N“-Boc-aminohapot saatiin Bachemilta [Torrance, CA) (Leu, Tyr, His(Tos), Arg, Trp ja Gly), Star Biochemi-calsilta (Torrance, CA) (Pro ja Ser(tBu)) ja Synthe Techilta (Albany, OR) (D-Nal(2)].

5 Liuokset, jotka sisälsivät 4 - 4,5 N HC1 i-PrOH/ CH2Cl2:ssa (1/1) valmistettiin kuplittamalla HCl:a jäähdytettyyn i-PrOH:iin. Heti kun liuos tuli kylläiseksi (määritetty titraamalla, noin 9N) , liuos pidettiin huoneenlämmössä, ei pidempään kuin 3 päivää, ja laimennettiin 10 samalla määrällä CH2C12 ennen käyttöä.

1,0 mmol N“-Boc-Gly-0-hartsia, valmistettu valmistusohjeen A mukaisesti, laitettiin reaktioastiaan 5,0 1 Vega 296 automaattiseen kiinteäfaasi-peptidisyntetoijaan, joka oli varustettu lisäpulloilla reagenssien lisäämistä 15 varten, paineistusta, paineistuksen poistoa, ja inertin typpiatmosfäärin ylläpitoa varten.

Seuraavat aminohapot lisättiin Ne-Boc-Gly-0-hartsiin DIC- tai HBt-avustetulla DIC-kytkennällä 3 tunnin ajan: N“-Boc-Pro 2,0 ekviv.

20 N“-Boc-Arg.HCl 2,0 ekviv.

Ne-Boc-Leu.H20 2,0 ekviv.

N“-Boc-D-Nal(2) 1,5 ekviv./HBt Ne-Boc-Tyr 1,5 ekviv./HBt N“-Boc-Ser(tBu) 2,0 ekviv./HBt 25 N“-Boc-Trp 1,75 ekviv./HBt N“-Boc-His(Tos) 1,75 ekviv./HBt (pyro)Glu 2,5 ekviv./HBt

Seuraavia menettelytapoja käytettiin poistamaan Ne-suojaryhmä jokaisen lisäyksen jälkeen.

3 0 Menettelytapa A: Hartsi pestiin ensin CH2Cl2:lla 1 x f.! 1 min, TFA-CH2C12:11a (40/60) lxl min, TFA-CH2C12:11a (40/ 60) 1 x 30 min, CH2Cl2:lla 5x1 min, Et3N-CH2Cl2:11a (5/95) 3x1 min, CH2Cl2:lla 4x1 min.

Menettelytapa B: Hartsi pestiin ensin CH2Cl2:lla 1 x 35 1 min, 4 - 4,5 N HCl :11a CH2Cl2/i-PrOH:ssa (l/l) lxl min, is 102538 4 - 4,5 N HC1:11a CH2Cl2:SSa (l/l) 1 X 30 min, CH2Cl2:lla 3x1 min, DMF: 11a lxl min, Et3N-CH2Cl2:11a (5/95) 3x1 min, DMF:11a lxl min, CH2Cl2:lla 4x1 min.

Menettelytapaa A käytettiin poistamaan N“-suojaryhmä 5 aminohapoista Gly, Pro, Arg, Leu, D-Nal(2) ja Tyr. Menet telytapaa B käytettiin N*-suojaryhmän poistamiseen aminohapoista Ser, Trp ja His, ja seriinin sivuketjun suojaryhmän poistamiseen.

Jokaisen suojauksen poistamis- ja pesuvaiheen jäl-10 keen, jotka seurasivat menettelytapoja A ja B, seuraava aminohappo sekvenssissä lisättiin ja hartsi pestiin CH2-Cl2:11a 3x1 min, MeOHrlla 4x1 min, DMF:11a 2x1 min ja CH2Cl2:11a 4x1 min. Kun sekvenssi oli täydellinen, peptidi pilkottiin hartsista käsittelemällä kyllästetyllä 15 ammoniakkiliuoksella metanolissa noin 18 tuntia noin 25 °C:ssa.

Raakapeptidi liuotettiin 2 M etikkahappoon ja muunnettiin asetaatin suolaksi ajamalla AG3-X4A-pylvään (Bio-rad) läpi. Asetaatti liuotettiin mahdollisimman pieneen 20 määrään metanolia ja lisättiin asetonia saostamaan peptidi uudelleen. Käänteisfaasi-HPLC:a (Partisil ODS-3, 40 μ, asetonitriili, jossa oli 0,5 % etikkahappoa) käytettiin poistamaan polaariset ja ei-polaariset epäpuhtaudet. Fraktiot, jotka sisälsivät vähintään 97 % nafareliiniase-25 taattia, yhdistettiin ja laimennettiin vedellä, johdet tiin uudelleen käänteisfaasi-HPLC-pylvääseen ja pestiin l-%:isella etikkahapon vesiliuoksella. Jäännös saostet-tiin, suodatettiin, pestiin ja kuivattiin sitten vakuumis-sa.

30 Aminohappoanalyysit toteutettiin Beckman 119CL

« !. -aminohappoanalysaattori 11a. Näytteet aminohappoanalyysej ä varten hydrolysoitiin 4N CH3S03H:lla (0,2 % 3-(2-aminome-tyyli-indoli) HC1) 20 tuntia 110 °C:ssa.

Analyyttinen HPLC toteutettiin Spectra Physics 8800 35 -kromatografilla, käyttäen Alltechin ODS-II pylvästä, 5 μ, 2„ 102538 4,6 x 250 mm, 10 μΐ inj., virtaus - 1,5 ml/min, 2 7,5 % CHjCN, 72,5 % 0,16 M KH2P04 pH=5,l, lämpötila = 40 °C.

Raakapeptidin HPLC-analyysi osoitti pääpiikin 18 minuutin retentioajalla, vastaten nafareliinia, eikä yli 5 1 % epäpuhtauksia 14 minuutin retentioajalla.

Esimerkki 2

Nafareliinin synteesi ilman seriinin suojausta

Seurattiin esimerkin 1 mukaista menetelmää, paitsi että Ne-Boc-Ser korvattiin N“-Boc-Ser(tBu):11a.

10 HPLC-analyysi osoitti pääpiikin 18 minuutissa, vas taten nafareliinia, ja 8,1 - 11,5 % epäpuhtauden 14 minuutin retentioajalla (rt).

Myöskin saanto tästä "suojaamattomasta" synteesistä oli suunnilleen sama kuin se, joka saatiin täysin suoja-15 tusta synteesistä HF-käsittelyllä; jälkimmäisessä tapauk sessa saanto oli huomattavasti pienempi kuin se, joka saatiin esimerkin 1 mukaisesta väliaikaisen suojauksen synteesistä.

Esimerkki 3 20 LH-RH-antagonistin synteesi käyttäen väliaikaista seriinin suojausta Tässä Esimerkissä LH-RH -antagonisti, N-Ac-D-Nal-(2) -D-pCl-Phe-D-Pal- (3) -Ser-Tyr-D-hArg (Et) 2-Leu-hArg (Et) 2-Pro-D-AlaNH2, valmistettiin käyttäen seuraavaa sivuketjun 25 suojausmenettelyä: suolasuojaus L- ja D-hArg (Et) 2: lie (klo ridina) ja t-butyylisuojaus seriinille.

N“-Boc aminohapot saatiin Bachemilta (Torrance, CA) (D-Ala, Arg ja Leu); Star Biochemicalsilta (Torrance CA) (Pro); Synthe Techilta (Albany, OR) [D-Nal(2)], Incellilta 30 (Milwaukee, WI) [D-Pal(3)] ja UCB Bioprocuctsilta (Belgia) λ (p-Cl-Phe) .

Aminohapot lisättiin valmistusmenetelmän B mukaiseen N“-Boc-D-Ala-0-Hartsiin, seuraavassa järjestyksessä: 21 102538

Ne-Boc-Pro 2,3 ekviv.

N*-Boc-hArg (Et) 2 .HC1 1 ekviv./HBt Ne-Boc-Leu.H20 2,3 ekviv.

5 N*-Boc-D-hArg (Et) 2-HCl 1,6 ekviv./HBt

Ne-Boc-Tyr 2,1 ekviv./HBt N*-Boc-Ser(tBu) 2,0 ekviv.

Ne-Boc-D-Pal(3) 1,8·ekviv./HBt N*-Boc-D-p-Cl-Phe 2,0 ekviv.

10 N*-Boc-D-Nal(2) 2,1 ekviv./HBt etikkahappoanhydridi

Asetylaatio (päällystys, capping) tehtiin Ala, Pro ja Leu:n jälkeen. Ylimäärä HBt:ta (2 ekviv.) käytettiin 15 emäksisten aminohappojen, hArg(Et)2 ja Pal (3) liittämiseen.

Aminohapot kiinnitettiin DIC- tai HBt-avustetulla DIC-kytkennällä 3 tuntia ja hartsi pestiin sen jälkeen CH2Cl2:11a 3x1 min, MeOH:lla 4x1 min, DMF: 11a 2x1 min ja CHjC^rlla 4x1 min.

20 Seuraavia menettelytapoja käytettiin poistamaan Naa- suojaryhmä jokaisen lisäyksen jälkeen:

Menettelytapa A: Hartsi pestiin ensin CHjCljHla 1 x 1 min, TFA-CHjClj: 11a (40/60) lxl min, TFA-CH2C12: Ha (40/60) 1 x 30 min, CH2Cl2:lla 5x1 min, Et3N-CH2Cl2:11a • 25 (5/95) 3x1 min, CH2Cl2:lla 4x1 min.

Menettelytapa B: Hartsi pestiin ensin CH2Cl2:lla 1 x 1 min, 4 - 4,5 N HCl :11a CH2Cl2/i-PrOH: ssa (l/l) lxl min, 4 - 4,5 N HCl:11a CHjClj/i-PrOH: ssa (l/l) 1 x 30 min, CH2-Cl2 :11a 3x1 min, DMF :11a lxl min, EtjN-CHjClj : 11a (5/95) 30 3 x 1 min, DMF :11a lxl min, CH2Cl2:lla 4x1 min.

;* Menettelytapaa A käytettiin suojaryhmien poistami seen aminohapoilta Ala, Pro, L-hArg(Et)2, Leu ja D-Nal(2); menettelytapaa B käytettiin suojaryhmien poistamiseen aminohapoilta D-hArg(Et)2, Tyr, Ser, D-Pal(3) ja p-Cl-Phe.

22 102538

Jokaisen suojauksenpoisto- ja pesuvaiheen jälkeen, jotka seurasivat menettelytapoja A tai B, lisättiin sekvenssin seuraava aminohappo ja hartsi pestiin CH2Cl2:lla 3x1 min, MeOH:lla 4x1 min, DMFrlla 2x1 min ja CH2-5 Cl2:11a 4x1 min. Kun sekvenssi oli täydellinen, peptidi pilkottiin hartsista käsittelemällä kyllästetyllä liuoksella, joka sisälsi ammoniakkia metanolissa, noin 18 tuntia noin 25 °C:ssa.

Raakapeptidi liuotettiin ensin 2 M etikkahappoon ja 10 muunnettiin sen asetaattisuolaksi ajamalla AG3-X4A-hart- sipylvään (Bio-Rad) läpi. Asetaatti ajettiin kromatogra-fisesti silikageelipylväässä (CH2Cl2/i-Pr0H/Me0H/H20/H0Ac liuotin); asetaattifraktiot liuotettiin veteen ja ladattiin käänteisfaasipylvääseen (Vydec C-18, 15-204) ja puh-15 distettiin asetonitriili/TEAPrlla (pH 3) . Fraktiot, joilla oli haluttu puhtaus, yhdistettiin ja laimennettiin vedellä ja ladattiin uudestaan käänteisfaasi-HPLC-pylvääseen ja pestiin sitten l-%:isen etikkahapon vesiliuoksella. Peptidi poistettiin seoksella Me0H/CH3CN/H0Ac/H20 (44/50/1/5) . 20 Jäännös liuotettiin metanoliin tai etikkahappoon ja seos tettiin eetterillä, suodatettiin, pestiin eetterillä ja kuivattiin alipaineessa.

Aminohappoanalyysit toteutettiin Beckman 119C1 -aminohappoanalysaattorilla. Näytteet aminohappoanalyysejä *. 25 varten hydrolysoitiin 6 N HCl:lla 110 °C:ssa 20 tuntia.

Analyyttinen HPLC toteutettiin Spectra Physics 8800 -kromatografilla käyttäen Spherisorb C-8:a (Alltech), 5 μ, 4,6 x 250 mm, 10 μΐ inj., virtaus = 1,5 ml/min., 30 % CH3CN, 70 % NH4H2P040,04 M, dimetyylioktyyliamiini 4,3 x 30 10-3, lämpötila 40 °C.

Antagonistin synteesi varmistettiin pääpiikin rt 18 min läsnäololla; toista piikkiä yli 1 % ei havaittu 16 minuutin retentioajalla.

23 102538

Esimerkki 4 LH-RH-antagonistin synteesi ilman väliaikaista se-riinin suojausta

Esimerkki 3 toistettiin käyttäen Ne-Boc-Ser:ia, Ne-5 Boc-Ser(tBu):n asemasta.

HPLC-analyysi osoitti pääpiikin 18 minuutissa, vastaten antagonistia, ja epäpuhtauden esiintymisen 6,5 % rt 16 minuutissa.

* .· • «

Claims (7)

1. 24 102538
2. 1. Menetelmä LH-RH-analogin, joka on nona- tai de-kapeptidi ja joka sisältää vähintään yhden seriiniryhmän, 5 kiinteäfaasisynteesiä varten, tunnettu siitä, että a) ainoastaan seriiniryhmän sivuketju suojataan väli-aikasesti t-butyyli- tai t-butyylidimetyylisilyylisuoja-ryhmällä, joka on labiili aineelle, joka poistaa a-aminoryhmän suojaryhmän, jolloin seriinin sivuketjun suo-10 jaryhmä ja α-aminoryhmän suojaryhmä poistetaan välittömästi sen jälkeen kun seriini on liitetty peptidiketjuun, ennenkuin seuraava aminohappo liitetään sekvenssiin; ja b) jos histidiini on läsnä, sen sivuketju suojataan tolueeni-sulfonyylillä.
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että seriinin sivuketjun suojaryhmä poistetaan käsittelemällä suolahappo/C3-C6 alkoholi/di-kloorimetaanilla, suolahappo/dikloorimetaanilla tai tri-fluorietikkahappo/dikloorimetaanilla.
4. 3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että seriinin sivuketjun suojaryhmä poistetaan käsittelemällä suolahappo/isopropanoli/di-kloorimetaanilla.
5. 4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 25 tunnettu siitä, että α-aminoryhmän suojaryhmä on t-butyylioksikarbonyyli, t-amyloksikarbonyyli, isobornyy-lioksikarbonyyli, a,e-dimetyyli-3,5-dimetoksibentsyyliok-sikarbonyyli, o-nitrofenyylisulfenyyli, 2-syaani-t-butyy-lioksikarbonyyli tai 9-fluorenyylimetyylioksikarbonyyli. *. 30 5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, *' tunnettu siitä, että β-aminoryhmän suojaryhmä on t-butyylioksikarbonyyli, seriinin sivuketjun suojaryhmä on t-butyyli ja histidiinin sivuketjun suojaryhmä on p-tolu-eenisulfonyyli. 35 25 102538
6. 6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että LH-RH-anlaogi on Ac-D-Nal(2)-D-p-Cl-Phe-D-Pal (3) -Ser-Tyr-D-hArg (Et) 2-Leu-L-hArg (Et) 2-Pro-D-Ala-NH2.
7. 7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että LH-RH-analogi on (pyro)-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Nal(2)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2. 1 · • « 102538