HU208158B - Process for the synthesis of 1h-rh analogs by temporary protection - Google Patents

Description

A találmány tárgya LH-RH analógok szilárdfázisú szintézisére szolgáló új eljárás, amely során minimális védelmet alkalmazunk.

Az LH-RH analógok nona- vagy dekapeptidek, amelyek az LH-RH-val szerkezeti kapcsolatban vannak, és az LH-RH-hoz hasonló biológiai hatást fejtenek ki. Az analógokkal intenzív klinikai vizsgálatokat folytatnak, mivel kimutatták, hogy az endometriózis, prosztatarák, idő előtti pubertás és más, hormonok által közvetített rendellenességek szimptómáinak enyhítésére képesek. Noha bizonyos LH-RH analógok gyógyászati alkalmazásra jelenleg hozzáférhetőek, szintézisük bonyolult és következésképpen drága eljárással történik, ami szükségszerűen megnöveli a kezelésre szorulók költségeit. Az LH-RH analógokat általában vagy agonistákként vagy antagonistákként írják le, attól függően, hogy milyen módon hatnak.

A jelen találmány szempontjából érdekes LH-RH analógok nona- és dekapeptidek, és agonisták és antagonisták egyaránt vannak közöttük.

A jelen találmány vonatkozásában hasznos LH-RH agonisták például a nafarelin, leuprorelin, buserelin, goserelin, histerelin, triptorelin és deslorelin; ezek mindegyike abban különbözik a természetben előforduló LHRH-tól, hogy a 6-os helyzetben lévő glicint egy D-aminosav helyettesíti. A szintetikus agonisták abban megegyeznek a természetben előforduló hormonnal, hogy a 2-es helyzetben hisztidint, a 4-es helyzetben szerint és az 5-ös helyzetben tirozint tartalmaznak, amelyek mindegyike reakcióképes oldallánccal rendelkezik, és ez a szintézis során nehézségeket okozhat.

Az LH-RH antagonisták a természetben előforduló LH-RH-tól abban különböznek általában, hogy a 2-es helyzetű, hisztidil-csoport hiányzik vagy mással van helyettesítve. A szintézis szempontjából nézve a hisztidin elhagyása csökkenti a nemkívánt mellékreakciók lehetőségét, azonban a szerin és tirozin jelenléte még mindig speciális lépések megtételét teszi szükségessé az oldalláncon végbemenő reakciók elkerülésére.

Az LH-RH analógok különböző módszerekkel szintetizálhatok, mint ahogy azt J. M. Stewart és J. D. Young a „Solid Phase Peptide Synthesis” című művében (W. H. Freeman Co., San Francisco, 1969), J. Meinenhofer a „Hormonal Proteins and Peptides” [Vol. 2. 46. oldal, Academic Press (New York)] és E. Schröder és K. Lübke „The Peptides” [Vol. 1., Academic Press (New York), 1965] című munkákban leírták. Az eljárások lényegében vagy folyadék vagy szilárd fázisban valósíthatók meg. Mindkét módszer szerint a soron következő aminosavat kapcsolják a növekedő peptidlánchoz. Általában az első aminosav karboxicsoportját vagy aminocsoportját alkalmas védőcsoporttal védik. A védett aminosavat azután vagy egy közömbös szilárd hordozóhoz kötik vagy feloldják, és ezután adják hozzá a soron következő védett aminosavat olyan körülmények között, hogy az amid-kötés kialakuljon. Ezután a védőcsoportot eltávolítják erről az újonnan hozzákapcsolt aminosav-maradékról, és a következő aminosav hozzáadására kerül sor. Ez addig folytatódik, míg minden kívánt aminosav a megfelelő sorrendben összekapcsolásra kerül, és minden védőcsoport és a szilárd hordozó eltávolítása után megkapják a végső polipeptidet. Ezen általános eljárás egyszerű módosításával lehetővé válik, hogy a növekvő lánchoz egynél több aminosavat adjanak egy időben, például úgy, hogy egy védett tripeptidet egy védett dipeptiddel kapcsolnak össze pentapeptiddé.

A szilárd fázisú szintézis szigorúbb körülményei azonban általában szükségessé teszik, hogy az amidkötés kialakítása alatt az aminosavak minden reakcióképes oldallánca védve legyen. Az oldallánc védőcsoportjait rendszerint akkor távolítják el, amikor már a kész polipeptidet a közömbös hordozóról, amelyen előállították, már lehasították vagy ezzel egyidőben.

Egy különösen hasznos szilárd fázisú szintézist ismertetnek Nestor és munkatársai az LH-RH analógok előállítására a 4234571 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban. Eszerint az alfa-aminosavak (N^alfa) alfa-amino-csoportját egy sav- vagy bázisérzékeny csoporttal, például terc-butil-oxi-karbonil-csoporttal védik; minden reakcióképes oldalláncot, amely a szerinben, hisztidinben és tirozinban jelen van, erősen kötődő csoportokkal védenek, amelyek eltávolításához hidrogén-fluoridos kezelés vagy hasonlóan drasztikus eljárás szükséges. Az alfa-amino-csoportok védőcsoportjait és az oldallánc védőcsoportjait általában külön lépésben távolítják el.

Ez a megoldás a kutatómunkához szükséges mennyiségű peptidek előállítására alkalmas, azonban ha a peptidek nagy volumenű előállítását tervezik, ezek a módszerek nem kielégítőek. A teljesen védett oldalláncú aminosavak drágák, és ezek a költségek a peptidek nagyüzemi előállítása esetén szignifikánsak lehetnek. A hidrogén-fluorid alkalmazása a komoly környezetszennyezés mellett hozzájárul a kereskedelmileg elfogadhatatlan hozamveszteségekhez. Sőt, mivel az oldallánc védőcsoportjainak eltávolítása külön lépésben történik, a szintetikus eljárásban további időt és költséget jelent.

Más eljárások sem vonzóbbak. Tien és munkatársai [Pept. Chem. 375-379, T. Shiba and S. Sakakibara (Ed.). Protein Research Foundation, Osaka (1988)] LH-RH olyan szintézisről számolnak be, amelyben a hisztidin megvédésére tozilcsoportot és a tirozin és szerin megvédésére benzilcsoportot alkalmaznak. Ily módon ugyan elkerülik a hidrogén-fluorid alkalmazását, azonban a benzilcsoport eltávolítására egy külön hidrogénezési lépésre van szükség, amely a triptofán részleges redukcióját okozhatja.

D. H. Coy és munkatársai [Int. J. Peptide Protein Rés. 14, 339-343 (1979)] a (D-Phe², D-Trp³, D-Phe⁶)-LHRH antagonisták szintézisét ismertetik, amelyhez olyan különböző oldalláncvédő csoportokat alkalmaznak, amelyek mindegyike eltávolítható hidrogén-fluoriddal, benziloldalláncvédő csoportot csak a szerinen, tozil-oldalláncvédő csoportot csak az aigininen, 2-bróm-benzil-oxi-kaibonilcsoportot a szerinen és aigininen vagy a szerinen, argininen és tirozinon alkalmaznak. Az arginin só formájában való védését (ArgxHCl) a „csak a szerint” védő eljárásban is használták. A hidrogén-fluoridot a nyers pepiidnek

HU 208 158 Β a hordozóról való lehasítására és az oldalláncvédő csoportok eltávolítására alkalmazták. Csak abban az egy esetben kerülte el Coy a hidrogén-fluoriddal való kezelést, amikor a peptid „teljesen” védőcsoport mentes volt, csak az arginin volt védve só formájában. Minden védőcsoportot alkalmazó szintézis rosszabb hozamot eredményezett, mint a védtelen oldalláncokkal végzett eljárás.

Coy és munkatársai beszámoltak továbbá a (D-Leu⁶, des Gly-NH2¹⁰)-LH-RH-etil-amid LH-RH agonista szintéziséről is, amelynél a hisztidin esetében dinitro-fenil-csoportot alkalmaztak oldalláncvédőként, az arginint sóformában védték és nem végeztek hidrogén-fluoridos kezelést. A dinitrofenil oldalláncvédő csoportot a pepiidnek a hordozóról való lehasításával egy időben távolították el etil-amin dimetil-formamidos oldatával. A csak a hisztidint védő eljárás hozama csak 34% volt a teljes védést és hidrogén-fluoridos kezelést alkalmazó eljárás 24%-ával szemben. Nem hasonlították össze a fenti eljárást egy védőcsoportot egyáltalán nem alkalmazó szintézissel.

A fentiekből azt látjuk, hogy a különböző minimális védést alkalmazó stratégiák közül a csak hisztidint védő eljárás jelenthet némi javulást a hozam tekintetében bizonyos LH-RH antagonisták teljes védést alkalmazó szintézisével szemben; azonban az LH-RH agonisták esetében az említett oldalláncvédő kísérletek egyike sem jár különösebb előnnyel.

Noha a hidrogén-fluoriddal történő védőcsoport-eltávolítást nem alkalmazó ideális eljárás az lehet, amikor védőcsoportot egyáltalán nem használunk, így azonban a hisztidin védtelenül hagyása racemizálódást okozhat. Coy és munkatársai módszerét követve viszont azt tapasztaltuk, hogyha csak a hisztidint védjük, akkor szerin jelenlétében bisz-szerin szennyeződés is keletkezik, a szerin acileződése folytán. Az irodalom bán leírtakon túl jelentős javításra van szükség ahhoz, hogy az LH-RH analógok szintézisére egy olyan, gyakorlatban hasznosítható eljárást kapjunk, amely a védőcsoportok eltávolításához nem teszi szükségessé a hidrogén-fluoriddal való kezelést, és mégis védelmet biztosít azon csoportok számára, amelyek ha védtelenek maradnak, károsan hatnak a peptid tisztaságára és hozamára.

A találmány célkitűzéseit úgy érjük el az LH-RH analógok szintézisében, hogy átmeneti időleges minimális védelmet alkalmazunk, azaz csak a szerin aminosav hidroxi-oldalláncát védjük egy olyan csoporttal, amelyet a szerinnek a pepiidhez való kapcsolása után eltávolítunk. Az oldalláncvédő csoport ugyanolyan körülmények közötti labilis, mint amilyeneket az alfa-aminocsoport védőcsoportjának eltávolítására használunk. Az olyan LH-RH analógok esetében, amelyek hisztidint tartalmaznak, az imidazol-oldalláncot szintén védhetjük olyan csoporttal, amely a kapcsolási ciklus alatt, alkalmasan egy alfa-amino-csoport védőcsoporjainak eltávolítására használt reagenssel szemben labilis, de kívánt esetben olyan csoporttal is védhetjük, amely aminolízissel vagy ammonolízissel távolítható el.

A szerin oldallánc és, ha jelen van, a hisztidin oldalláncának időleges védelme minimálisra csökkenti a szennyeződések képződését és maximálisra növeli a hozamot anélkül, hogy egy hidrogén-fluoridos vagy más védőcsoport eltávolítást lépésre szükség lenne.

A jelen találmány tárgya LH-RH analógok olyan szintézise, amely során az aminosav-maradék oldalláncai csak elengedhetetlenül minimális számban védettek.

A találmány további tárgya egy olyan eljárás LHRH analógok szintézisére, amely elkerüli a hidrogénfluoridos védőcsoport eltávolítást, és ily módon a toxikus hidrogén-fluorid reagens alkalmazását, ezáltal csökkentve a toxikus hulladékot, amelynek képződésével a hagyományos eljárások együtt járnak.

A jelen találmány említett vonásai további előnyök forrásai, csökken az LH-RH vegyületek előállítási költsége, és egy további, az oldallánc védőcsoportjait eltávolító eljárási lépést nem kell elvégezni.

A találmány szerinti időleges minimális védést alkalmazó eljárás feltehetően használható bármely, néhánytól több tucatig változó számú aminosavból álló, szerint tartalmazó polipeptid szilárd fázisú szintézisére, tekintet nélkül a szekvencia fennmaradó részére. Az LH-RH analógok és más nona- és dekapeptidek szintézisét gyakran választják célul. Bár a találmány ismertetésekor az egyes aminosavak szekvenciális sorrendben való kapcsolására utalunk, a szakemberek számára nyilvánvaló, hogy az eljárás olyan szintézisek esetében is alkalmazható, amikor kisebb polipeptid blokkokat kapcsolnak nagyobb polipeptiddé, például egy tetrapeptidet egy pentapeptidhez, amennyiben bármely szerin oldallánca átmenetileg védve van a szerin kapcsolása alatt.

Az időleges védés azt jelenti, hogy a szerin oldallánca a szintézis egy aránylag rövid periódusa alatt védett. Az oldallánc-védőcsoportot és az alfa-aminovagy karboxilcsoportot védő csoportot egyszerre távolítjuk el a szerin kapcsolásának megtörténte után. Általában a szerin oldalláncának védésére alkalmazott csoport kiválasztásakor arra kell tekintettel lennünk, hogy a csoport a kapcsolás körülményei között stabil, az alfa-amino-csoport védőcsoportjainak eltávolítására alkalmas körülmények között pedig labilis legyen. A jelen találmány szerint, amennyiben alfaamino-csoportot védünk, a szerin oldallánc védésére előnyösen terc-butil-, terc-butil-dimetil-szilil-, trimetil-szilil-, tritil-, pivalil- és tetrahidropiran-2-il-csoportot használunk.

Azon LH-RH analógok esetében, amelyek hisztidinmaradékot tartalmaznak, kívánatos az imidazol-oldalláncot megvédeni. Ez is lehet egy időleges változat, azaz labilis a kapcsolás alatt vagy a helyén marad a peptidnek a hordozóról való eltávolításáig. Előnyösen aminolízist vagy ammonolízist alkalmazunk a gyanta és a peptid hasítására, és egyúttal eltávolítjuk a hisztidin védőcsoportját is.

A jelen találmány szerint a védőcsoport eltávolítására előnyösen hidrogén-klorid 3-6 szénatomos alkohollal készült oldatát és diklór-metánt használunk. Az alkohol és diklór-metán térfogataránya előnyösen 0,1 és 10,0 között van, a sav koncentrációja 2 n és 9 n között változik. Legelőnyösebben az alkohol izopropanol.

HU 208 158 B

A jelen találmány céljaira az „LH-RH” kifejezés a luteinizáló hormont felszabadító hormonra utal, és az „LH-RH analógok” magukba foglalják magát az LHRH-t is és azokat a polipeptideket, amelyek szerkezeti rokonságban vannak az LH-RH-val vagy abból levezethetők, és az LH-RH-hoz hasonló biológiai hatást fejtenek ki. A különböző közönséges aminosavak jelölésére azokat a rövidítéseket használjuk, amelyeket a IUPAC-IUB Comission on Biochemical Nomenclature ajánlott [Biochemistry, 11, 1726 (1972)]. Minden peptid-szekvenciát az általánosan elfogadott egyezmény szerint írunk, azaz az N-terminális aminosav bal oldalon, a C-terminális aminosav a jobb oldalon helyezkedik el.

A rövidítések L-aminosavakat jelentenek, az akirális glicin és további olyan nem természetes aminosavak kivételével, amelyek akirálisak, vagy ha másként (például D-, DL-) nem jelöljük. Az Et etilcsoport, a Bu butilcsoport és az iPr izopropilcsoport.

Más, a találmány leírásánál használt rövidítések a természetes LH-RH aminosavrészeinek helyettesítőit foglalják magukba, ezek a következők:

Rövidítés Nal (2) p-F-Phe p-Cl-Phe Pál (3) hArg(Et)₂ hArg(CH₂CF₃)₂ hArg(Bu)

Lys(iPr)

His(Bzl)

Aminosavmaradék 3-(2-naftil)-alanil-csoport 3-(p-fluor-fenil)-alanil-csoport 3-(p-klór-fenil)-alanil-csoport 3-(3-piridil)-alanil-csoport N^G,N^G’-bisz(etil)-homoarginil-cso port

N^G,N^G’-bisz(2,2,2-trifluor-etil)-homoaiginil-csoport

N^G-butil-homoarginil-csoport N^e-izopropil-lizil-csoport (benzil)-hisztidil-csoport

A gyógyászatilag elfogadható savaddíciós sók meghatározás azokra a sókra utal, amelyek az eredeti vegyület kívánt biológiai hatását megtartják toxikus mellékhatások nélkül. Ilyen sók példáiként a szervetlen savakkal, például hidrogén-kloriddal, hidrogén-bromiddal, kénsavval, foszforsavval, salétromsavval és hasonlókkal képzett savaddíciós sókat és a szerves savakkal, például ecetsavval, oxálsavval, borkősavval, borostyánkősavval, maleinsavval, fumársavval, glükonsavval, citromsavval, almasavval, aszkorbinsavval, benzoesavval, csersavval, embonsavval, alginsavval, poliglutaminsavval, naftalinszulfonsavval, naftalindiszulfonsavval, poligalakturonsavval és hasonlókkal képezett sókat említjük.

Az „N-Ac” rövidítés az N-acetil védőcsoportra utal, azaz egy olyan acetilcsoportra, amely a terminális aminosavmaradék amin-nitrogénjéhez kapcsolódik, az általánosan elfogadott nómenklatúra szerint. A találmány szerinti új eljárással elsősorban az

R¹-R²-R³-Ser-Tyr-R⁴-Leu-R⁵-Pro-R⁶ (I) általános képletnek megfelelő aminosav-szekvenciájú LH-RH analógok állíthatók elő; a képletben az R‘-R⁶ általános jelek az alábbi aminosavmaradékokat képviselik:

R¹ (piro)Glu vagy N-Ac-D-Nal(2);

R² His, D-p-Cl-Phe vagy D-p-F-Phe;

R³ Trp, D-Trp, D-Nal(2) vagy D-Pal(3);

R⁴ D-Nal(2), D-hArg(Et)₂, D-hArg(Bu), DhArg(CH₂CF₃)₂, D-His(Bzl), D-Leu, D-Pal(3), DSer(tBu) vagy D-Trp;

R⁵ Arg, L-hArg(Et)₂, L-hArg(Bu), L-hArg(CH₂CF₃)₂ vagy Lys(iPr); és

R Gly-NH₂ NH-NHCONH₂, D-Ala-NH₂ vagy NHEt; amelyekben az aminosavak N-alfa-védőcsoporttal vannak ellátva; az eljárásban a javítás abból áll, hogy (a) a

4-es helyzetben lévő szerin oldalláncát olyan alkalmas csoporttal védjük, amely az alfa-amino-csoport vagy karboxi-csoport védőcsoportjainak racemizáció mellékreakciók indukálása vagy a növekvő pepiidnek a gyantáról való lehasítása nélküli eltávolítására képes reagenssel szemben labilis és (b) amennyiben hisztidin van jelen, az oldalláncát kívánt esetben az alfa-aminocsoport védőcsoportjának eltávolítására alkalmas reagenssel szemben vagy aminolízissel vagy ammonolízissel labilis csoporttal védjük.

A találmány szerinti eljárás egyik előnyös kiviteli módja értelmében az (I) általános képletű LH-RH analógok szilárd fázisú szintézisét az alábbi lépésekben folytatjuk le:

(1) a polipeptid aminosavainak alfa-amino-csoport25 ját megvédjük, (2) a szerin oldalláncát az alfa-aminocsoport védőcsoportjának eltávolítására alkalmas szerekkel szemben labilis csoporttal megvédjük, (3) amennyiben jelen van, a hisztidin oldalláncát bázikus védőcsoport-eltávolító szerekkel szemben labilis vagy aminolízissel vagy ammonolízissel eltávolítható csoporttal megvédjük, (4) a C-terminális aminosavat közömbös szilárd hordozóhoz kapcsoljuk; (5) egy vagy több aminosavat a C-terminális végről kiindulva, egymás után, a szekvenciának megfelelő sorrendben, al35 kalmas kapcsolószer segítségével egymáshoz kapcsolunk, (6) minden ciklus végén a védőcsoportokat erre alkalmas szerekkel való kezeléssel eltávolítjuk; az eltávolításra használt szereket azok közül választjuk ki, amelyek az alfa-aminocsoportok és az oldalláncok vé40 dőcsoportjait egyaránt képesek eltávolítani anélkül, hogy racemizációt vagy mellékreakciókat indukálnának, vagy a növekvő pepiidet lehasítanák a gyantáról, a nona- vagy dekapeptid előállításához szükséges számú alkalommal ismételjük a kapcsolási és eliminációs lé45 pést, (7) a polipeptidet aminolízissel vagy ammonolízissel lehasítjuk a hordozóról, és (8) elkülönítjük és tisztítjuk a kapott polipeptidet. Egy másik előnyös kiviteli mód szerint a szilárd fázisú szintézist a következő lépésekben folytatjuk le:

(1) szilárd fázisú szintézissel kapcsoljuk a megfelelő Boc-csoporttal védett aminosavakat és tercbutilcsoporttal védett szerint egymást követően és az (I) általános képletű vegyület aminosav-szekvenciájának megfelelő sorrendben, jobbról balra haladva, egy kö55 zömbös szilárd hordozóhoz kovalensen kapcsolt BocR⁶-O-ból kiindulva, (2) minden ciklus végén eltávolítjuk a Boc-védőcsoportot és egyúttal a szerinről vagy D-szerinről a terc-butil-csoportot hidrogén-klorid/diklór-metán vagy hidrogén-klorid/kevés szénatomos al60 kohol/diklór-metán rendszert alkalmazva, így a szilárd

HU 208 158 Β hordozóhoz kötött polipeptidet kapjuk, (3) lehasítjuk ammonolízissel a polipeptidet a hordozóról, és (4) a kapott polipeptidet elkülönítjük.

Összefoglalólag tehát a találmány olyan új eljárás legalább egy szerinmaradékot és adott esetben hisztidinmaradékot is tartalmazó LH-RH analógok, különösen az (I) általános képletnek megfelelő peptidek szilárd fázisú szintézisére, amelynek során az egyes aminosavak alfa-aminocsoportján időleges megvédése mellett

a) hisztidinmaradékot nem tartalmazó LH-RH analógok szintézise esetén csak a szerinmaradék, illetőleg szerinmaradékok hidroxil-oldalláncát védjük időlegesen olyan védőcsoporttal, amely az alfa-aminocsoportok védőcsoportjainak eltávolítására alkalmas reagensekkel szemben labilis, vagy

b) szerinmaradék(ok) mellett hisztidinmaradékot is tartalmazó LH-RH analógok előállítása esetén a szerinmaradék hidroxilcsoportjának az a) eljárás szerinti megvédése mellett kívánt esetben a hisztidinmaradék imidazol-oldalláncát is megvédjük olyan védőcsoporttal, amely az alfa-aminocsoportok védőcsoportjainak eltávolítására alkalmas reagensekkel vagy pedig az aminolízissel vagy ammonolízissel szemben labilis.

A találmány legelőnyösebben olyan (I) általános képletű LH-RH antagonista előállítására szolgáló eljárást bocsát rendelkezésre, amelynek képletében R¹ (piro)Glu,

R² His,

R³ Trp,

R⁴ D-Nal(2),

R⁵ Arg és

R⁶ Gly-NH₂(nafarelin), vagy amelynek képletében

R¹ Ac-D-Nal(2),

R² D-p-Cl-Phe,

R³ D-Pal(3),

R⁴ D-hArg(Et)₂,

R⁵ L-hArg(Et)₂ és

R⁶ D-Ala-NH₂.

A találmány előnyös foganatosítási módja szerint az aminosavak alfa-amino-csoportját (N^alfa) savra vagy bázisra érzékeny csoporttal védjük. Ez a csoport a peptidkötés képzésének körülményei között stabil, de ugyanakkor könnyen eltávolítható anélkül, hogy a növekedő peptidlánc megbomlana vagy a benne lévő királis centrumokon racemizáció következne be. Alkalmas védőcsoportok a terc-butoxi-karbonil-(Boc), difenil-izopropil-oxi-karbonil-, terc-amil-oxi-karbonil-, izobomil-oxi-karbonil-, alfa,alfa-dimetil-3,5-dimetoxibenzil-oxi-karbonil-, ο-nitrofenil-szulfenil-, 2-cianoterc-butil-oxi-karbonil-, 9-fluorenil-metil-oxi-karbonil(Fmoc) csoport és hasonlók. Az alfa-amino-csoportot védő csoport előnyösen terc-butil-oxi-karbonil-csoport (Boc). Ha olyan (I) általános képletű pepiidet kívánunk előállítani, mint a buserelin vagy goserelin, amelyek képletében R⁴ D-Ser(t-Bu), a kapcsolási ciklusban, beleértve a D-Ser(t-Bu) hozzáadását, és azt követően az alfa-aminocsoport védésére előnyösen Fmoc csoportot használunk. Az Fmoc olyan bázikus reagensekkel szemben labilis (pH> 8,5), mint amilyen például a piperidin, amely nem távolítja el a D-Ser(t Bu) aminosavról a terc-butil-csoportot. A későbbi ciklusokban, a D-Ser(t Bu) kapcsolását követően az N^alfa védésére bázisra érzékeny csoportokat szükséges használni. A 4-es helyzetű szerin oldalláncát olyan csoporttal védjük, amely például egy enyhe fluoridos kezeléssel eltávolítható. A szerin oldalláncának védésére előnyös a terc-butil-dimetil-szilil-csoport.

A szerin-csoport hidrox i-oldalláncát a szerinnek a növekedő pepiidhez való kapcsolásakor a találmány általános leírásánál említett módon védjük. Az oldalláncot védő csoportot a kapcsolás után és a következő aminosav hozzáadása előtt távolitjuk el. A szerin oldallánc védőcsoport eltávolítását ugyanazzal a reagenssel végezzük, amellyel az N^alfa védőcsoportot eltávolítjuk. A szerin esetében előnyös oldallánc védőcsoport a tercbutil-, terc-butíl-dimetil-szilil-, trimetil-szilil, tritil-, pivalil- és a tetrahidropiran-2-il-csoport.

Az LH-RH agonistákban általában jelen lévő hisztidin imidazol oldalláncát szintén védjük. A hisztidin oldalláncának védelmére használt csoport labilis lehet a kapcsolási ciklus alatt is, például egy N^alfa-védőcsoportot eltávolító reagenssel szemben, de kívánt esetben az eltávolítására akkor is sor kerülhet, amikor a pepiidet a hordozóról lehasítjuk. A hisztidin esetében előnyös oldalláncvédő csoport a p-toluolszulfonil- és a 2,4-dinitro-fenil-csoport.

A szintézist úgy kezdjük, hogy az első aminosavat, amely általában a C-terminális aminosav a végtermékben, egy alkalmas szilárd hordozóhoz kapcsoljuk. A fenti szintézishez használható megfelelő szilárd hordozók azok az anyagok, amelyek a lépésenként végrehajtott kondenzációs és védőcsoport eltávolítást reakciók körülményei között közömbösek és az alkalmazott közegben nem oldódnak. A kereskedelemben kapható gyanták közül a sztirol/divinil-benzol gyantákat említhetjük, amelyek reakcióképes csoportokkal módosítottak, ilyenek például a klór-metilezett sztirol/divinilbenzol kopolimer, a hidroxi-metilezett sztirol/divinilbenzol kopolimer és hasonlók. Előnyös a Merrifield gyanta, amely 1%-ban térhálósított klór-metilezett sztirol/divinil-benzol kopolimer.

A gyantához, például egy klór-metilezett sztirol/divinil-benzol gyantához való kapcsolást úgy végezzük, hogy az N^alfa-védett C-terminális aminosavat, különösen az N^alfa-Boc-aminosavat cézium-, tetrametil-ammónium-, trietil-ammóniurn-, 1,5-diazabiciklo[5.4.0]undec-5-én vagy hasonló sója formájában, etanolban, acetonitrilben, N,N-dimetil-formamidban vagy hasonló oldószerben oldva, különösen dimetil-formamidban oldott céziumsója formájában, emelt hőmérsékleten, például kb. 40 és 60 °C közötti hőmérsékleten, előnyösen kb. 50 °C-on, 12-72 órán át, előnyösen 48 órán át reagáltatjuk a klór-metilezett gyantával.

Az egymást követő védett aminosavak kapcsolását a szakterületen jól ismert módszerekkel, általában automata polipeptid-szintetizátorban végezzük. Minden védett aminosavat kb. 1,5-2,5 moláris fe5

HU 208 158 Β leslegben adjuk a rendszerhez, és a kapcsolást közömbös, nemvizes poláris oldószerben, így például diklór-metánban, dimetil-formamidban vagy ezek elegyeiben, előnyösen diklór-metánban és kb. környezeti hőmérsékleten végezzük. Kapcsolószerként Ν,Ν’-diciklohexil-karbodiimidet (DCC), N,N’-diizopropil-karbodiimidet (DIC) vagy más karbodiimidet vagy magában vagy 1-hidroxi-benzotriazol (HBt), 0acil-karbamidok, benzotriazol-A-il-oxi-trisz(pirrolidino-foszfónium)-hexafluor-foszfát(PyBop),N-hidroxiszukcinimid vagy más N-hidroxi-imid vagy oxim jelenlétében alkalmazunk. Más esetben védett aminosav-észtereket, például p-nitro-fenil-észtert vagy pentafluor-fenil-észtert vagy szimmetrikus anhidrideket is használhatunk.

A gyantához kötött pepiidhez való kapcsolódás teljességének vizsgálatára a Kaiser-tesztet [Anal. Biochem., 34, 595 (1970)], a prolin esetében a kloraniltesztet [Anal. Biochem., 777, 145 (1981)] vagy az itazin-tesztet (Anal. Chim. Acta, 118, 149 (1980)] alkalmazzuk.

Ha a fenti tesztek szerint a kapcsolás nem teljes, a reakciót további aminosav hozzáadásával megismételjük, de elhagyjuk a védőcsoportok további savas eltávolítását. Amikor az utolsó kapcsolás is megtörtént, a gyantát metanollal vagy metanol tartalmú diklór-metánnal lemossuk és maximum 60 °C-on szárítjuk.

Minden ciklus végén, azaz miután a következő N^alfa-védett aminosavat a növekvő polipeptid-lánchoz kapcsoltuk, a védőcsoportot az erre alkalmas szerrel való kezeléssel eltávolítjuk. Amikor szerint kapcsolunk, az alkalmazott szer eltávolítja mind az N^alfa-Boc védőcsoportot, mind a szerint védő csoportot. A védőcsoportot eltávolító szerek közül előnyösként a diklórmetánban oldott hidrogén-kloridot, a diklór-metánban oldott trifluor-ecetsavat és a 3-6 szénatomos alkoholban oldott hidrogén-kloridot említjük, amelyek közül a diklór-metánnal elegyített izopropanolban oldott hidrogén-klorid az előnyös. A hidrogén-klorid koncentrációja általában 2 és 9 n között változik, előnyösen 4-5 n. A metilén-klorid és a 3-6 szénatomos alkohol térfogataránya 0,1 és 10 közötti, előnyösen 1:1. Különösen előnyös védőcsoport eltávolító szer az izopropanol és diklór-metán 1:1 térfogatarányú elegyével készült 4,5 n hidrogén-klorid oldat. A védőcsoportokat eltávolító lépést általában 0 és 45 °C, előnyösen környezeti, 20 és 27 °C közötti hőmérsékleten végezzük.

A szakember számára nyilvánvaló, hogy a kapcsoláshoz és a védőcsoportok eltávolításához használt reagensek a fentiektől eltérő módon is megválaszthatók, amennyiben a szerin védőcsoportját olyan reagenssel távolítjuk el, amely kielégíti a találmány szerinti feltételeket. Alkalmazhatunk például minden egyes védőcsoport eltávolítást ciklusban hidrogén-klorid/izopropanol/diklór-metán rendszert. Más esetben bizonyos ciklusokban trifluor-ecetsav/diklór-metán elegy, a többiben hidrogén-klorid/izopropanol/diklór-metán rendszer alkalmazása is megfelel.

A szilárd fázisú szintézis végén a polipeptidet lehasítjuk a gyantáról. A hasítást ammonolízissel, azaz telített ammóniaoldattal végezzük megfelelő oldószerben, ha a peptid C-terminálisa alanin vagy glicin, a C-terminálisként prolint tartalmazó peptideket aminolízissel, alkíl-aminnal vagy fluor-alkil-aminnal hasítjuk le. A reakció 10 és 50 °C közötti hőmérsékleten, előnyösen kb. 25 °C-on, 12 és 24 óra közötti idő, előnyösen 18 óra alatt játszódik le. Alkalmas oldószerek a metanol, etanol, izopropanol, dimetil-formamid, tetrahidrofurán, Ν,Ν-dimetil-etanol-amin, hexán és ezek elegyei. Előnyösen ammóniával telített metanolt használunk. Más esetben a pepiidet egy bázissal való átészterezéssel és azt követő aminolízissel is eltávolíthatjuk a gyantáról.

A polipeptidet azután egy sor kromatográfiás lépéssel tisztítjuk, amelyhez a következőkből egy vagy több típust használhatunk: ioncsere acetát-formában lévő gyengén bázikus gyantán, hidrofób adszorpciós kromatográfia funkciós csoportot nem tartalmazó polisztirol-divinil-benzolon, például Amberlite®XAD gyantán, adszorpciós kromatográfia kovasavgélen, ioncserélő kromatográfia karboxi-metil-cellulózon, megoszlási kromatográfia például Sephadex® G-25 adszorbensen, vagy ellenáramú megoszlás, nagy teljesítményű folyadékkromatográfia (HPLC), különösen fordított fázisú HPLC-t alkalmazva oktil- vagy oktadecil-szilil-kovasav töltetű oszlopon.

Ha az 1-es, 2-es, 3-as vagy 6-os helyzetek közül egyben vagy többen racém aminosavat használunk, és az egyes izomereket tartalmazó termékeket kívánunk előállítani, a diasztereomer nonapeptid vagy dekapeptid végtermékeket elválasztjuk, és a megfelelő helyzetben D-aminosavat tartalmazó kívánt peptidet elkülönítjük és tisztítjuk, előnyösen az előzőekben említett kromatográfiás eljárásokkal.

Kívánt esetben az elkülönített és tisztított polipeptidet gyógyászatilag elfogadható sóvá alakítjuk.

A következő példákban összehasonlítjuk a találmány szerinti időleges védést alkalmazó eljárást a védést nem alkalmazó eljárással mind LH-RH agonisták, mind LH-RH antagonisták esetében. Ezek a példák csupán a találmány bemutatására szolgálnak, és semmiképpen nem tekinthetők korlátozó jellegűeknek az igényelt oltami kör szempontjából.

Az 1. és 4. példa termékeiben, amelyek a találmány szerinti · időleges minimális védelem alkalmazásával készültek, jelentősen kevesebb a szennyezés, mint a 3. és 5. példa szerint, a védelmet nem alkalmazó eljárással előállított termékekben.

A szennyezések csökkentése mellett a találmány szerinti eljárás további előnyökkel rendelkezik, magasabb hozamot eredményez, kevesebb veszélyes reagenst alkalmaz, rövidebb ideig tart és az LH-RH analógok elkülönítéséhez és tisztításához kevesebb energia szükséges. További előnye, hogy megvalósításakor a lényegesen kevésbé toxikus hulladék is kisebb mennyiségben termelődik.

HU 208 158 Β

A) példa

Boc-Gly-O-gyanta előállítása

4,9 g N^alfa-Boc-glicint 50 ml víz és 50 ml metanol elegyében oldunk. Az oldat pH-ját vizes cézium-hidrogén-karbonáttal 7,5-re állítjuk. Az oldószert ezután vákuumban eltávolítjuk.

A maradékot 18 órán át nagy vákuumban szárítjuk, majd 150 ml száraz dimetil-formamidban oldjuk. 25 g 1%-ban klór-metilezett polisztirol/divinil-benzol (Merrifield) gyantát adunk hozzá, ami 25 mmól kloridnak felel meg. Az elegyet 24 órán át 50 °C-on rázzuk, majd szűrjük, és a gyantát egymást követően dimetil-formamiddal, vízzel és etanollal mossuk. A gyantát 3 napig vákuumban szárítjuk, így 28,34 g Boc-Gly-O-gyantát kapunk.

B) példa

Boc-Ala-O-gyanta előállítása

Az A) példa szerinti eljárást alkalmazzuk, N^alfaBoc-D-alanint 1% Merrifield gyantához kapcsolunk, és N^alfa-D-ala-O-gyantát kapunk.

1. példa

Nafarelin előállítása időleges szerinvédés alkalmazásával

Ebben a példában a nafarelint - (piro)Glu-His-TrpSec-Tyr-D-Nal(2)-Leu-Arg-Pro-Gly(NH₂) - úgy állítjuk elő, hogy a következő oldallánc-védéseket alkalmazzuk: az argininsó (hidroklorid) formájában, a hisztidint tozilcsoporttal, a szerint terc-butil-csoporttal védjük.

Az N^alfa-Boc aminosavak a következő helyekről származtak: Bachem (Torrance, CA) (Leu, Tyr, His(Tos), Arg, Trp és Gly), Star Biochemicals (Torrance, CA) (Pro és Ser/tBu/), Synthe Tech (Albany, OR) (D Nal/2/).

Az izopropanol-diklór-metán 1:1 térfogatarányú elegyével készült 4-4,5 n hidrogén-klorid-oldatot úgy állítjuk elő, hogy hűtés közben izopropanolon hidrogén-kloridot buborékoltatunk át. Amikor az oldat telítetté válik, titrálással meghatározva kb. 9 n a koncentrációja. Ezt az oldatot szobahőmérsékleten tároljuk 3 napnál nem hosszabb ideig, és használat előtt azonos térfogatú diklór-metánnal hígítjuk.

1,0 mmól A) példa szerint készült N^alfa-Boc-Gly-Ogyantát egy 5,0 L Vega 296 automata szilárd fázisú peptidszintetizátor reakcióedényébe mérünk, amely további üvegekkel és lombikokkal van ellátva a reagensek adagolására, a nyomás alá helyezéshez vagy a nyomás megszüntetéséhez és a közömbös nitrogén atmoszféra fenntartásához.

A következő aminosavakat adjuk az N^alfa-Boc-GlyO-gyantához, és a kapcsolást diizopropil-karbodiimiddel magában vagy 1-hidroxi-benzotriazol (HBt) jelenlétében végezzük 3 órán át:

N^alfa-Boc-Pro

N^alfa-Boc-ArgxHCl

N^alfa-Boc-LeuxH₂O

N^alfa-Boc-D-Nal(2)

N^alfa-Boc-Tyr

2,0 mólekvivalens 2,0 mólekvivalens 2,0 mólekvivalens

1,5 mólekvivalens/HBt

1,5 mólekvivalens/HBt

N^alfa-Boc-Ser(tBu) 2,0 mólekvivalens/HBt

N^alfa-Boc-Trp 1,75 mólekvivalens/HBt

N^alfa-Boc-His(Tos) 1,75 mólekvivalens/HBt (pyro)Glu 2,5 mólekvivalens/HBt)

Az egyes kapcsolásokat követően az alábbi körülményeket alkalmazzuk az N^alfa-védőcsoport eltávolítására.

Program A: A gyantát először lxl percig diklórmetánnal, lxl percig trifluor-ecetsav/diklór-metán

40/60 térfogatarányú eleggyel, 1x30 percig trifluorecetsav/diklór-metán 40/60 térfogatarányú eleggyel, 5x1 percig diklór-metánnal, 3x1 percig trietil-amin/diklór-metán 5/95 térfogatarányú eleggyel és 4x1 percig diklór-metánnal mossuk.

Program B: A gyantát először lxl percig diklórmetánnal, lxl percig 4-4,5 n, diklór-metán/izopropanol 1:1 térfogatarányú eleggyel készült hidrogén-klorid-oldattal, 1x30 percig 4-4,5 n, diklór-metán/izopropanol 1: 1 térfogatarányú eleggyel készült hidrogén-klorid oldattal, 3x1 percig diklór-metánnal, lxl percig dimetil-formamiddal, 3x1 percig trietilamin/diklór-metán 5/95 térfogatarányú eleggyel, lxl percig dimetil-formamiddal és 4x1 percig diklórmetánnal mossuk.

Az A programot a Gly, Pro, Arg, Leu, D-Nal(2) és Tyr N^alfa védőcsoportjainak eltávolítására, a B programot a Ser, Trp és His N^alfa-védőcsoportjainak és a szerin oldalláncát védőcsoportnak az eltávolítására használjuk.

Az egyes védőcsoport eltávolítási és A vagy B program szerinti mosási lépés után a soron következő aminosavat kapcsoljuk, a gyantát 3x1 percig diklór-metánnal, 4x1 percig metanollal, 2x1 percig dimetil-formamiddal és 4x1 percig diklór-metánnal mossuk. Amikor a sorozat teljes, a pepiidet ammóniával telített metanollal 25 °C-on 18 óra hosszat tartó kezeléssel lehasítjuk.

A nyers pepiidet 2 mólos ecetsavban oldjuk és AG3X4A (Bio-Rad) gyantából készült oszlopon átengedve acetátsóvá alakítjuk. Az acetátot minimális mennyiségű metanolban oldjuk és aceton hozzáadásával ismét kicsapjuk a pepiidet. A poláris és nempoláris szennyezéseket Partisii ODS-3 (40 μ) adszorbensen 0,5% ecetsavat tartalmazó acetonitrillel végzett fordított fázisú HPLC alkalmazásával távolítjuk el. A legalább 97% nafarelin45 acetátot tartalmazó frakciókat egyesítjük, vízzel hígítjuk és ismét fordított fázisú HPLC oszlopra visszük, amelyet 1 % ecetsavat tartalmazó vízzel mosunk. A maradékot kicsapjuk, szűrjük, mossuk, és azután vákuumban szárítjuk, 37,25 g tisztított pepiidet kapunk, ami 47,2%-os ho50 zamnak felel meg.

Az aminosavak analízisét Beckman 119CL típusú aminosav-analizátor segítségével végezzük. Az aminosav-analízishez a mintákat 0,2% 3-(2-amino-etil)-indol-hidrokloridot tartalmazó 4 n metánszulfonsavval

20 órán át, 110 °C-on hidrolizáljuk.

Az analitikai HPCL-hez Spectra Physics 8800 típusú kromatográfot használtunk (ODS-II oszlop (Alltech) 5 μ, 4,6x250 mm,10 μΐ inj., átfolyási sebesség

1,5 ml/perc, 27,5% acetonitril, 72,5% 0,16 mólos káli60 um-dihidrogén-foszfát, pH: 5,1, hőmérséklet: 40 °C).

HU 208 158 Β

A nyers peptid HPLC analízise egy fő csúcsot mutatott, amelynek retenciós ideje 10 perc, ez megfelel a nafarelinnek és nincs 1%-nál nagyobb szennyezés 14 perces retenciós idővel.

2. példa

Az 1. példában leírt eljárást követjük, azzal az eltéréssel, hogy a szerinmaradék hidroxil-oldalláncának védelmére terc-butil-csoport helyett terc-butil-dimetilszilil csoportot alkalmazunk 2,0 mólekvivalens menynyiségben. Ily módon 30,1 g tisztított nafarelint kapunk, ami 38%-os hozamnak felel meg:

3. példa

Nafarelin szintézise a szerin védése nélkül

Az 1. példa szerinti eljárást követjük, azzal az eltéréssel, hogy az N^alfa-Boc-Ser(tBu) helyett N^a,fa-BocSer-t használunk.

A HPLC analízis szerint egy fő csúcs található 18 perces retenciós idővel, amely a nafarelinnek felel meg, és 8,1 és 11,5%-nyi szennyezés mutatható ki, amelynek retenciós ideje 14 perc.

Az 1. példában leírt módon történő tisztítás után 42 g nafarelint kapunk, ami 10,8 %-os hozamnak felel meg, így a hozam megközelítőleg azonos a teljes védelmet és hidrogén-fluoridos kezelést alkalmazó szintézis hozamával, azaz jelentősen alacsonyabb, mint az

1. példában leírt, időleges védelmet alkalmazó szintézisé.

4. példa

LH-RH antagonista szintézise időleges szerinvédés alkalmazásával

Ebben a példában az N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-PheD-Pal(3)-Ser-Tyr-D-h Arg(Et)₂-Leu-hArg(Et)₂-Pro-DAlaNH₂ képletű LH-RH antagonistát állítjuk elő, az Lés D-hArg(Et)₂ oldalláncát só (klorid) formájában, a szerin oldalláncát terc-butilcsoporttal védjük.

Az N^alfa-védett aminosavak a következő helyekről származnak:

Bachem (Torrance, CA) (D-Ala, Arg és Leu); Star Biochemicals (Torrance, CA) (Pro); Synthe Tech (Albany, OR) (D-Nal(2)); Incell (Milwaukee, WI) (DPal(3)) és UCB Bioproducts (Belgium) (p-Cl-Phe).

Az aminosavakat a B) példa szerint előállított N^alfaBoc-D-Ala-O-gyantához a következő sorrendben adjuk:

N^alfa-Boc-Pro

N^alfa-Boc-hArg(Et)₂xHCl

N^alfa-Boc-LeuxH₂O

N^alfa-Boc-D-hAig(Et)₂xHCl

N^alfa-Boc-Tyr

N^alfa-Boc-Ser(tBu)

N^-Boc-D-PalC)

N“-Boc-p-Cl-Phe

N^alfa-Boc-D-Nal(2)

2,3 mólekvivalens 1 mólekvivalens/HBt 2,3 mólekvivalens 1,6 mólekvivalens/HBt 2,1 mólekvivalens/HBt 2,0 mólekvivalens 1,8 mólekvivalens 2,0 mólekvivalens 2,1 mólekvivalens

Ecetsavanhidrid

Az alanin, prolin és leucin kapcsolása után végzünk acetilezést. A bázikus aminosavak, a hArg(Et)₂ és Pal(3) kapcsolásakor 2 ekvivalens HBt-t használunk.

Az aminosavakat diizopropil-karbodiimiddel magában vagy 1-hidroxi-benzotriazol jelenlétében kapcsoljuk 3 órán át, és utána a gyantát 3x1 percig diklórmetánnal, 4x1 percig metanollal, 2x1 percig dimetil5 formamiddal és 4x1 percig diklór-metánnal mossuk.

Az N^alfa-védőcsoportokat az egyes kapcsolások után a következőképpen távolítjuk el:

A program: a gyantát először lxl percig diklór-metánnal, lxl percig trifluor-ecetsav/diklór-metán 40/60 térfogatarányú eleggyel, 1x30 percig trifluor-ecetsav/diklór-metán 40/60 térfogatarányú eleggyel, 5x1 percig diklór-metánnal, 3x1 percig trietil-amin/diklór-metán 5/95 térfogatarányú eleggyel és 4x1 percig diklór-metánnal mossuk.

B program: a gyantát először lxl percig diklór-metánnal, lxl percig 4-4,5 n, diklór-metán/izopropanol 1:1 térfogatarányú eleggyel készült hidrogén-kloridoldattal, 1x30 percig 4-4,5n, diklór-metán/izopropanol 1: 1 térfogatarányú eleggyel készült hidrogén-klorid20 oldattal, 3x1 percig diklór-metánnal, lxl percig dimetil-formamiddal, 3x1 percig trietil-amin/diklór-metán 5/95 térfogatarányú eleggyel, lxl percig dimetilformamiddal és 4x1 percig diklór-metánnal mossuk.

Az Alá, Pro, L-hArg(Et)₂, Leu és D-Nal(2) védő25 csoportjainak eltávolításakor az A programot, a Dh Arg(Et)₂, Tyr, Ser, D-Pal(3) és p-Cl-Phe védőcsoportjainak eltávolításakor a B programot használjuk. Minden védőcsoport eltávolítást és A vagy B program szerinti mosási lépés után a soron következő aminosavat kapcsol30 juk, és a gyantát 3x1 percig diklór-metánnal, 4x1 percig metanollal, 2x1 percig dimetil-formamiddal és 4x1 percig diklór-metánnal mossuk. Amikor a szekvencia teljes, a pepiidet ammóniával telített metanollal 25 °C-on 18 óra hosszat tartó kezeléssel lehasítjuk.

A nyers pepiidet 2 mólos ecetsavban oldjuk és AG3-X4A (Bio-Rad) gyantából készült oszlopon átengedve acetátsóvá alakítjuk. Az acetátot kovasavgél oszlopon kromatografáljuk, eluálószerként diklór-metán, izopropanol, metanol, víz és ecetsav elegyét használ40 juk, az acetátot tartalmazó frakciókat vízben oldjuk, egy Vydec C-18 (15-20 μ) fordított fázisú oszlopra visszük és acetonitril-TEAP elegy (pH 3) alkalmazásával tisztítjuk. A kívánt tisztaságú frakciókat egyesítjük, vízzel hígítjuk és ismét egy fordított-fázisú HPLC osz45 lopra visszük, majd 1%-os ecetsavval vizesen mossuk. A pepiidet metanol/acetonitril/ecetsav/víz 44/50/1/5 térfogatarányú eleggyel eluáljuk. A frakciókat egyesítjük és bepároljuk. A maradékot metanolban vagy ecetsavban oldjuk és éténél kicsapjuk, szűrjük, éterrel mossuk és vákuumban szárítjuk.

Az aminosavak analízisét Beckman 119CL típusú aminosavanalizátor segítségével végezzük. Az aminosav-analízishez a mintákat 6 n sósavval 20 órán át, 110 °C-on hidrolizáljuk.

Az analitikai HPLC-hez Spectra Physics 8800 típusú kromatográfot használtunk (Spherisorb C-8 adszorbens (Alltech), 5 μ, 4,6x250 mm, 10 μΐ inj., átfolyási sebesség 1,5 ml/perc, 30% acetonitril, 70% 0,04 mólos ammónium-dihidrogén-foszfát, dimetil-oktil-amin

4,3xl0^-3, hőmérséklet: 40 °C).

HU 208 158 B

Az antagonista szintézisét a 18 perces retenciós idővel jellemezhető főcsúcs igazolja, nincs 1 %-nál nagyobb más csúcs jelen 14 perces retenciós idővel.

5. példa

LH-RH antagonista szintézise időleges szerinvédés alkalmazása nélkül

A 4. példában leírtak szerint járunk el, de N^alfa-BocSer(tBu) helyett N^alfa-Boc-Ser-t használunk.

A HPLC analízis egy 18 perces retenciós idejű fő csúcsot mutat, amely megfelel az antagonistának, és egy 6,5%-ban jelenlévő szennyezést 16 perces retenciós idővel.

Claims (11)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás legalább egy szerinmaradékot és adott esetben hisztidinmaradékot is tartalmazó LH-RH analógok szilárd fázisú szintézisére, azzal jellemezve, hogy az egyes aminosavak alfa-aminocsoportjának időleges megvédésén kívül

   a) legalább egy szerinmaradékot tartalmazó LH-RH analógok szintézise esetén az előállítandó peptid reakcióképes oldallánccsoportot tartalmazó aminosavmaradékai közül csak a szerinmaradék(ok) hidroxil-oldalláncát védjük időlegesen olyan védőcsoporttal, amely az alfa-aminocsoportok védőcsoportjainak eltávolítására alkalmas reagensekkel szemben labilis, vagy

   b) szerinmaradék(ok) mellett hisztidinmaradékot is tartalmazó LH-RH analógok előállítása esetén a szerinmaradék hidroxilcsoportjának az a) eljárás szerinti megvédése mellett kívánt esetben a hisztidinmaradék imidazol-oldalláncát is megvédjük olyan védőcsoporttal, amely az alfa-aminocsoportok védőcsoportjainak eltávolítására alkalmas reagensekkel vagy pedig az aminolízissel vagy ammonolízissel szemben labilis. (Elsőbbség: 1991. 02.

   19.)
2. 2. Eljárás legalább egy szerinmaradékot tartalmazó

   LH-RH analógok szilárd fázisú szintézisére, azzal jellemezve, hogy az elóállítandó peptid reakcióképes oldallánc-csoportot tartalmazó aminosavmaradékai közül a szintézis során csak a szerinmaradék(ok) hidroxiloldalláncát védjük időlegesen olyan védő csoporttal, amely az alfa-aminocsoportok védőcsoportjainak eltávolítására alkalmas reagensekkel szemben labilis. (Elsőbbség: 1990. 02. 20.)
3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szerin hidroxil-oldalláncát terc-butil-csoporttal vagy terc-butil-dimetil-szilil-csoporttal védjük. (Elsőbbség: 1990.02. 20.)
4. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szerin oldalláncát védő csoport eltávolítására 3-6 szénatomos alkohollal és diklór-metánnal készült hidrogén-klorid-oldatot alkalmazunk. (Elsőbbség: 1990. 02. 20.)
5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, 3-6 szénatomos alkoholként izopropanolt alkalmazunk. (Elsőbbség: 1990.02.20.)
6. 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás (piro)Glu-HisTrp-Ser-Tyr-D-Nal(2)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ előállítására, azzal jellemezve, hogy a szerinmaradék hidroxiloldalláncát a szintézis művelete során időlegesen tercbutil- vagy terc-butil-dimetil-szilil-csoporttal, és kívánt esetben a hisztidinmaradék imidazolcsoportjának nitrogénatomját pedig tozilcsoporttal védjük. (Elsőbbség: 1991.02. 19.)
7. 7. A 2. igénypont szerinti eljárás (piro)Glu-His-TrpSer-Tyr-D-Nal(2)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ előállítására, azzal jellemezve, hogy a reakcióképes oldalláncot tartalmazó aminosavmaradékok közül csak a szerinmaradék hidroxilcsoportjának időleges megvédésére alkalmazunk védőcsoportot és védőcsoportként terc-butilvagy terc-butil-dimetil-szilil-csoportot használunk. (Elsőbbség: 1990.02.20.)
8. 8. A 2. igénypont szerinti eljárás N-acetil-D-Nal(2)D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-hArg(Et)₂-Leu-hArg(Et)₂-Pro-D-Ala-NH₂ előállítására, azzal jellemezve, hogy az alfa-amino-csoportok védelmére terc-butiloxi-karbonil-csoportot és a szerinmaradék hidroxilcsoportjának időleges védelmére védőcsoportként terc-butil-csoportot használunk. (Elsőbbség: 1990. 02.

   20.)
9. 9. Az 1. vagy 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a védőcsoportok eltávolítására 3-6 szénatomos alkohollal és diklór-metánnal készült hidrogén-klorid-oldatot alkalmazunk, (Elsőbbség: 1991. 02. 19.)
10. 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 3-6 szénatomos alkoholként izopropanolt alkalmazunk. (Elsőbbség: 1991. 02.19.)
11. 11. A 7. vagy 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy

    1. szilárd fázisú szintézissel az alfa-aminocsoporton

    Boc-csoporttal védett megfelelő aminosavakat és a terc-butil-dimetil-szilil-csoporttal védett szerint egymást követő ciklusokban, az előállítandó peptid aminosav-szekvenciájának megfelelő sorrendben egymáshoz kapcsoljuk, egy közömbös szilárd hordozóhoz kovalensen kötött Boc-R⁶-O-ból - ahol R⁶ az előállítandó peptid C-terminális aminosav maradékát képviseli - kiindulva,

    2. minden egyes ciklus végén a Boc-védőcsoportot

    3-6 szénatomos alkohollal és diklór-metánnal készült hidrogén-kloriddal eltávolítjuk,

    3. az így kapott, szilárd hordozóhoz kötött polipeptidet ammonolízissel lehasítjuk a hordozóról, és

    4. a kapott pepiidet elkülönítjük. (Elsőbbség: 1990.