KR0152276B1 - Lh-rh 유사체의 일시적 최소 보호합성 방법 - Google Patents

Lh-rh 유사체의 일시적 최소 보호합성 방법

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Abstract

아미노산 세린 및 히스티딘(존재할 경우)이 선택된 α-아미노 탈보호제에 대해 불안정한 그룹으로 합성 도중 측쇄 보호되는 LH-RH 유사체의 고체상 합성법이 기술되어 있다.

Description

LH-RH 유사체의 일시적 최소 보호 합성 방법
본 발명은 최소 보호 방법에 의한 LH-RH 유사체의 고체상 합성에 관한 것이다.
LH-RH 유사체는 LH-RH와 구조적으로 관련된 노나-또는 데카펩타이드이며, LH-RH의 생물학적 활성과 유사한 생물학적 활성을 나타낸다. 이들 유사체는 자궁내막증식증, 전립선 암, 조발 청춘기 및 기타 호르몬 매개된 질병의 증상을 경감시키는 이의 능력이 입증됨으로 인해 집중적인 임상 연구 대상이다.
특정 LH-RH 유사체는 현재 치료학적 사용을 위해 유용하나, 이의 합성은 복잡하고 따라서 치료가 필요한 이들에게 비용 부담을 필수적으로 증가시키는 비경제적인 방법이다. LH-RH 유사체는 이의 작용방식에 따라 효능제 또는 길항제로서 통상 기술되어 있다.
본 발명에서 관심을 두는 LH-RH 유사체는 노나-및 데카펩타이드이며, 효능제 및 길항제 모두를 포함한다. 본 발명에서 유용한 LH-RH 효능제의 예는 나파렐린, 류프로렐린 이며;이들은 모두 6-위치에서 글리신 잔기가 D-아미노산으로 대체됨으로써 자연 발생 LH-RH와 구별된다. 합성 효능제는 자연 발생 호르몬과 공통적으로 -위치에 히스티딘, 4-위치에 세린 및 5-위치에 티로신을 가지며, 이들은 모두 합성시에 난점으로 나타날 수 있는 반응성 측쇄를 갖는다.
LH-RH 길항제는 2-위치에서 히스티딜 잔기의 결실 또는 치환에 의해 자연 발생 LH-RH와 통상 구별된다. 합성적인 견지에서 히스티딘의 결실은 바람직하지 않은 부반응에 대한 기회를 감소시키나, 세린 및 티로신 모두의 존재는 측쇄 반응을 방지하기 위해 특별 단계를 취할 것을 필요로 한다.
LH-RH 유사체는 문헌(참조:J.M. Stesart and J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969; J. Meinnhofer, Hormonal Proteins and Peptides, Vol. 2, page 46, Academic Press(new York), 1973; 및 E. Schroder and K. Lubke, The Peptides, Vol. 1, Academic Press(New York), 1965)에 교시된 바와 같은 여러 방법에 의해 합성될 수 있다. 이들 방법은 용액상 또는 고체상 기술로서 광범위하게 특징지워질 수 있다. 두 방법은 성장 펩타이드 쇄에 아미노산을 연속적으로 첨가함을 포함한다. 통상, 제1아미노산의 아미노 또는 카복실 그룹은 적합한 보호 그룹에 의해 보호 된다. 그후 보호된 아미노산을 아미드 결합을 형성시키기에 적합한 조건하에 서열대로 다음 보호된 아미노산을 가함으로써 불활서 고체 지지체에 결합시키거나 용액 중에서 이용할 수 있다. 그후, 보호 그룹을 새로 첨가된 아미노산 잔기로부터 제거하고 나서 다음 아미노산을 가하는 식으로 한다. 모든 목적하는 아미노산을 적합한 서열로 결합시킨 후, 잔류하는 보호 그룹 및 고체 지지체를 제거하여 최종 폴리펩타이드를 수득한다.
이 통상의 방법을 단순히 변형시킴으로써, 예를 들어 보호된 트리펩타이드를 보호된 디펩타이드와 커플링시켜서 펜타펩타이드를 형성시킴으로써 성장 쇄에 하나 이상의 아미노산을 일시에 가할 수 있다.
그러나, 고체상 합성의 더욱 엄격한 조건은 통상적으로 아미노산 상의 반응성 측쇄를 아미드 결합의 형성 도중 보호시킬 것을 필요로 한다. 측쇄 보호 그룹은 통상 폴리펩타이드가 형성되어 있는 불활성 지지체로부터 완성된 폴리펩타이드의 절단 후 또는 이와 동시에 별도의 단계에서 제거된다.
LH-RH 유사체의 제조를 위한 한가지 특히 유용한 고체상 합성 방법은 참조로 본원에 인용된 네스터(Nestor)등의 미합중국 특허 제4,234,571호에 기술되어 있다. 통상적으로 사용되는 이 접근법에서 각각의 아미노산 α-아미노(Nα)작용 그룹은 산 또는 염기 민감성 그룹, 예를 들어 3급-부틸옥시카보닐(BOC)에 의해 보호되며;세린, 히스티딘 및 티로신 상에 존재하는 것과 같은 반응성 측쇄는 또한 이의 제거를 위해 불화수소(HF)를 이용한 처리 또는 유사하게 강력한 공정을 필요로하는 강하게 결합된 그룹으로 보호된다. 또한, α-아미노 보호그룹 및 측쇄 보호 그룹의 제거는 통상 별도의 단계로 수행한다.
이 접근법은 연구목적 양의 펩타이드의 제조를 위해서는 적합하나, 대규모의 펩타이드의 제조를 고려하는 경우에 이들 방법은 만족스럽지 않다. 완전히 보호된 측쇄를 갖는 아미노산은 고가이고, 이들 비용은 상업적 규모의 펩타이드 제조시 중요할 수 있다. 또한, 불화수소의 사용은 심각한 환경 위험을 야기시키는 외에 상업적으로 허용될 수 없는 수율 손실을 일으킨다. 더우기, 측쇄 보호 그룹을 제거하기 위해 별도의 제조 단계가 요구되므로 이는 합성 방법에서 추가의 시간 및 비용을 필요로 한다.
또 다른 보고서는 더 이상 흥미를 끌지 않는다. 티엔(Tien)등은 문헌(참조:Pept. Chem:375-379, T. Shiba and S. Sakakibara(Ed.), Protein Research Foundaton, Osaka(1988))에서 히스티딘 상의 토실 보호, 및 티로신 및 세린 상의 벤질 보호를 이용하는 LH-RH의 합성법을 보고하였다. 이 접근법에서는 불화수소를 사용하지 않으나 여전히 벤질 보호 그룹을 제거하기 위한 별도의 탈수소화 단계를 필요로 하고, 이때 트립토판의 약간의 환원이 일어난다.
디. 에이치. 코이(D.H.Coy)등은 문헌(참조:Int.J. Peptie Protein Res., 14, 339-343(1979))에서 세린만의 벤질측쇄 보호, 아르기닌만의 토실 측쇄 보호, 세린 및 아르기닌 측쇄 보호, 및 세린, 아르기닌 및 티로신(2-브로모벤질-옥시 카보닐과 함께)측쇄 보호를 제공하는 다양한 측쇄 보호 공정(이들 모두는 HF 탈보호를 필요로 한다)를 이용한 LH-RH 길항제, (D-Phe2, D-Trp3, D-Phe6)-LH-RH의 합성법을 보고한다.
아르기닌의 염 보호(Arg HCL로서)는 세린 단독합성에서 또한 사용된다. 조 펩타이드를 이의 지지체로부터 절단하고 측쇄 보호 그룹을 제거하기 위해 불화수소를 사용한다. 펩타이드가 완전히 비보호될 경우(및 아르기닌을 위한 염 보호 경우)에만 코이(Coy)는 불화수소 처리를 하지 않았다. 모든 보호된 합성법은 비보호된 측쇄 합성법의 수율보다 더 불량한 수율을 제공한다.
또한, 코이 등은 히스티딘 만의 디니트로페닐 측쇄 보호, 아르기닌의 염 보호 및 HF 무처리를 이용한 LH-RH 효능제(D-Leu6, 데스Gly-NH2 10)-LH-RH 에틸아미드의 합성법을 보고한다. 디니트로페닐 측쇄 보호 그룹은 디메틸포름아미드 중 에틸아민의 용액을 이용하여 펩타이드가 이의 지지체로부터 절단되는 도중 제거된다. 히스티딘-단독 보호된 합성법으로 부터의 수율은 완전히 보호된 HF 절단 합성법에 대해 단지 34%대 24%이다. 비보호된 합성과의 비교는 행하지 않았다.
당해 기술은 다양한 최소 보호 방법중에서 히스티딘-단독 보호가 특정 LH-RH 길항제에 대해 완전히 보호된 합성법을 능가하는 수율에 있어서의 개선점을 제공할 수 있음을 제안한다; 그러나, 어떠한 특정 잇점도 LH-RH 효능제에 대한 보고된 측쇄 보호 접근법과 관련되지 않는다.
HF 탈보호 단계를 배제하기 위한 이상적인 접근법이 비보호된 합성을 수행하는데 있어서 있을 수 있으나, 히스티딘에 대해 보호의 결핍으로 인해 과도한 라세미화가 유도된다. 그러나, 코이 등에 따라, 본 발명자들은 히스티딘-단독 보호법의 사용으로 세린 잔기의 아실화에서 기인하여 비스-세린 불순도의 수준이 높아짐을 밝혀내었다. 당해 기술의 교시를 능가하는 현저한 개선이, HF 탈보호 단계를 요하지 않으나, 비보호될 경우 펩타이드의 순도 및 수율에 악영향을 끼치는 그룹을 보호하는 LH-RH 유사체를 위한 실용적인 최소 보호 합성법을 수득하기 위해 요구된다.
본 발명의 목적은 단지 필수적인 최소수의 아미노산 잔기의 측쇄가 보호되는 LH-RH 유사체의 합성 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 HF 탈보호 단계를 필요로 하지 않으므로 독성 HF 시약의 사용을 방지하고 통상의 방법에서 종종 직면하는 독성 폐기 스트림을 감소시킨, LH-RH 유사체의 합성 방법을 제공하는 것이다.
상기 주목한 본 발명의 측면은 LH-RH 화합물의 제조비용을 감소시킬 뿐 아니라 측쇄 보호 그룹을 제거하기 위한 추가의 공정 단계를 배제시키는 추가의 잇점을 제공한다.
본 발명의 목적은 아미노산 잔기 세린의 하이드록시 측쇄만이, 펩타이드 쇄에 대한 세린의 커플링 후 즉시 제거되는 그룹으로 보호되는, LH-RH 유사체에 대한 일시적인 최소 보호 방법에 의해 달성된다. 측쇄 보호 그룹은 α-아미노 보호 그룹을 제거하기에 유용한 동일 조건하에 불안정한 그룹이다. 히스티딘 잔기를 함유하는 LH-RH 유사체를 위해, 이미다졸 측쇄는 커플링 사이클 도중 불안정한 그룹, 적합하게는 α-아미노 그룹 탈보호제에 대해 불안정한 그룹으로 또한 보호될 수 있으나, 임의로 이는 또한 가아미노분해 또는 가암모니아 분해에 의해 제거될 수 있는 그룹으로 보호될 수 있다.
세린의 일시적인 측쇄 보호 및 히스티딘(존재할 경우)의 측쇄 보호는 불순물의 형성을 최소화시키고 HF 또는 다른 별도의 탈보호 단계를 요구하지 않으면서 수율을 최대화시킨다.
[방법 및 LHRH 유사체의 기술]
본 발명의 일시적 최소 보호 방법은 서열의 나머지와는 무관하게 수개 내지 수십개의 잔기를 갖는 세린-함유 폴리펩타이드의 고체상 합성에 적용가능한 것으로 예측된다. LH-RH 유사체 및 기타 노나-및 데카펩타이드는 바람직한 합성 표적이다. 각각의 아미노산의 연속 첨가에 관하여 본 발명을 기술하였으나, 당해 기술분야의 숙련가는 이 방법을 세린 잔기의 측쇄가 세린 커플링 사이클 도중 일시적으로 보호되는 한, 예를 들어 테트라펩타이드를 펜타펩타이드에 첨가하는 것과 같이 더 작은 폴리펩타이드의 블록을 커플링시켜 더 큰 폴리펩타이드를 형성시키는 합성법에 동등하게 적용가능함을 인지할 것이다.
일시적 보호란 세린 측쇄가 합성 사이클중 비교적 단기간 동안 보호됨을 의미한다. 측쇄 보호 그룹 및 α-아미노 보호 그룹은 세린 커플링이 수행된 후 동시에 제거된다. 통상적으로, 세린 측쇄 보호 그룹을 선택하기 위한 중요한 기준은 그룹이 커플링 조건에 안정한 α-아미노 탈보호 조건에는 불안정해야 하는 것이다. 본 발명의 한 측면에서, α-아미노 보호를 사용할 경우, 세린 측쇄는 바람직하게는 3급-부틸, 3급-부틸디메틸실릴, 트리메틸실릴, 트리틸, 피발릴 및 테트라하이드로피란-2-일 중에서 선택된 그룹에 의해 보호한다.
히스티딘 잔기를 갖는 LH-RH 유사체에 대해, 이미다졸측쇄를 보호하는 것이 통상 바람직하다. 이 보호그룹은 또한 일시적으로 변화(즉 커플링 사이클 도중 불안정)될 수 있거나, 펩타이드가 이의 지지체로부터 제거될 때까지 제위치에 잔류할 수 있다. 바람직하게는, 가아미노분해 또는 가암모니아분해를 이용하여 수지를 이의 지지체로부터 절단하고 동시에 히스티딘 보호 그룹을 제거한다.
본 발명의 다른 한 측면에서 탈보호제는 C3-C6알콜 및 디클로로메탄 중의 염화수소의 용액 중에서 선택된다. 바람직하게는, 디클로로메탄에 대한 알콜의 비는, 0.1 내지 10.0(v/v)이고, 산 농도는 2 내지 9N이다. 가장 바람직하게는, 알콜은 이소프로판올이다.
[약어 및 정의]
본 발명의 목적을 위해, 포현 LH-RH는 화체 형성 호르몬 방출 호르몬을 지칭하며, LH-RH 유사체는 LH-RH 자체, 및 LH-RH와 구조적으로 연관되거나 이로부터 유도되고 LH-RH의 생물학적 활성과 유사한 생물학적 활성을 나타내는 기타 폴리펩타이드를 포함하는 의미이다.
각종 통상의 아미노산에 대한 약어는 생화학적 명명법에 관해 IUPAC-IUB 위원회에 의해 추천된 것들이다(참조:Biochemistry, 11, 1726(1972)). 본원에서 언급된 모든 펩타이드 서열은 통상 채택되는 관례에 따라 기입되며, 즉, N-말단 아미노산은 좌측에, C-말단 아미노산은 우측에 위치한다.
비키랄성 아미노산 글리신을 제외하고, 또한 비키랄성인 비천연 아미노산은 어느 것이나 제외하고는 본원에서 약어는 L-아미노산을 나타내며, 그렇지 않을 경우 D-또는 D, L-로서 표시한다. Et는 에틸이고, Bu는 부틸이며, iPr는 이소프로필이다.
본 발명을 기술하는데 유용한 기타 약어는 천연 LH-RH펩타이드 중 아미노산을 하기와 같이 대체시킴과 관련된다.
Figure kpo00001
Figure kpo00002
본원에서의 사용시, 용어 약제학적으로 허용되는 염은 독성학적 부작용없이 모 화합물의 목적하는 생물학적 활성을 보유하는 염을 지칭한다. 이러한 염의 예는 무기한(예:염화 수소산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 질산등)으로 형성된 산부가 염;및 유기산(예:아세트산, 옥살산, 타르타르산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 글루콘산, 시트르산, 말산, 아스코르브산, 벤조산, 탄닌산, 파모산, 알긴산, 폴리글루탐산, 나프탈렌 설폰산, 나프탈렌디설폰산, 폴리갈락투론산 등)으로 형성된 염이다.
약어 N-Ac는, 통상 채택되는 명명법과 일치하게 특별히 N-아세틸 보호그룹, 즉 말단 아미노산 잔기의 아민 질소상에 결합된 아세틸 그룹을 지칭한다.
[바람직한 양태]
본 발명의 한 양태에서, (a) 4-위치의 세린의 측쇄를 적합하게는, 라세미화, 부반응 또는 성장 펩타이드의 이의 수지 지지체로부터의 절단을 유발하지 않으면서 α-아미노 보호 그룹을 제거하는데에 유용한 시약에 대해 불안정한 그룹으로 일시적으로 보호하고 (b) 히스티딘(존재할 경우)의 측쇄를, α-아미노 그룹 탈보호제, 또는 가아미노분해 또는 가암모니아분해에 불안정한 그룹으로 보호함을 특징으로 하여, 일반식(Ⅰ)의 아미노산 서열을 갖는 화합물의 고체상 합성을 위한 개선된 최소보호 방법이 제공된다.
Figure kpo00003
상기식에서,
R1은(피로)Glu 및 N-Ac-D-Nal(2) 중에서 선택되고;
R2는 His, D-p-Cl-Phe 및 D-p-F-Phe 중에서 선택되며;
R3는 Trp, D-Trp, D-Nal(2) 및 D-Pal(3) 중에서 선택되고;
R4는 D-Nal(2), D-hArg(Et)2, D-hArg(Bu), D-hArg(CH2CF3)2, D-His(Bzl), D-Leu, D-Pal(3), D-Ser(tBu) 및 D-Trp 중에서 선택되며;
R5는 Arg, L-hArg(Et)2, L-hArg(Bu), L-hArg(CH2CF3)2, 및 Lys(iPr)중에서 선택되고;
R6는 Gly-NH2, NH-NHCONH2, D-Ala-NH2및 NHEt 중에서 선택되며;
이때, 아미노산에는 Nα보호가 제공된다.
다른 한 양태에서, 하기 단계를 포함하는 일반식(Ⅰ)의 화합물의 고체상 합성을 위한 일시적 최소 보호 방법이 제공된다:(a) 폴리펩타이드 중 아미노산의 α-아미노 그룹을 보호하고, (b) 세린의 측쇄를 α-아미노 보호그룹을 제거하는데 유용한 시약에 불안정한 그룹으로 보호하고, (c) 히스티딘 (존재할 경우)의 측쇄를 염기성 탈보호제에 불안정한 그룹 또는 가아미노분해 또는 가암모니아분해에 의해 제거할 수 있는 그룹으로 보호하고, (d) c-말단 아미노산을 불활성 고체 지지체에 결합시키고, (e) 적합한 커플링제를 사용하여 c-말단 에서부터 출발하여 하나 이상의 선택된 아미노산을 서로에 연속 사이클로 서열대로 커플링시키고, (f) 각각의 사이클의 종결시에 탈보호제(라세미화, 부반응 또는 수지로 부터 성장 펩타이드의 절단을 유발시키지 않으면서 α-아미노 보호 그룹 및 측쇄 보호그룹 둘다를 제거할 수 있는 시약 중에서 선택)로 처리함으로써 보호 그룹을 제거하고, (f) 필요에 따라 커플링 및 제거 단계를 반복하여 노나-또는 데카펩타이드를 형성시키며, (g) 가아미노 분해 또는 가암모니아분해에 의해 폴리펩타이드를 지지체로부터 절단하고, (h) 생성된 폴리펩타이드를 분리 및 정제한다.
또다른 한 양태에서, (a) 적합한 Boc-보호되고 3급-부틸 보호된 세린을 불활성 고체 지지체에 공유 결합된 Boc-R6-O-로 부터 출발하여 일반식(Ⅰ)의 화합물의 아미노산 서열의 우측으로 부터 좌측으로의 순서로 및 연속 사이클로 고체상 합성에 의해 커플링시키고, (b) 각각의 사이클의 종결시에 HCL/CH2CL2및 HCL/저급 알칸올/CH2CL2중에서 선택된 탈보호제로 처리함으로써 세린 또는 D-세린으로부터 Boc-보호 그룹 및 동시에 3급-부틸 그룹을 제거하여 고체 지지체에 결합된 폴리펩타이드를 형성시키고, (c) 가암모니아분해에 의해 지지체로부터 폴리펩타이드를 절단하고, (d) 생성된 폴리펩타이드를 분리하는 단계를 포함하는, 일반식(Ⅰ)의 화합물의 고체상 합성 방법이 제공된다.
바람직한 양태에서,
R1이 (피로)Glu 또는 N-Ac-D-Nal(2)이고;
R2가 His 또는 D-p-Cl-Phe이며;
R3가 Trp 또는 D-Pal(3)이고;
R4가 D-Nal(2), D-Leu, D-Trp, D-Ser(tBu) D-His(Bzl) 또는 D-hArg(Et)2이며;
R5가 Arg 또는 hArg(Et)2이고;
R6가 Gly-NH2, NHEt 또는 D-Ala-NH2인 상기 일반식 (Ⅰ)을 갖는 폴리펩타이드의 제조를 위한 상기 기술한 바와 같은 방법이 제공된다.
가장 바람직하게는, 본 발명은 R1이 (피로)Glu이고, R2가 His이며, R3가 Trp이고, R4가 D-Nal(2)이며, R5가 Arg이고, R6가 Gly-NH2인 일반식(Ⅰ)의 LH-RH 길항제, 즉 나파렐린, 또는 R1이 Ac-D-Nal(2)이고, R2가 D-p-Cl-Phe이며, R3가 D-Pal(3)이고, R4가 D-hArg(Et)2이며, R5가 L-hArg(Et)2이고, R6가 D-Ala-NH2인 일반식(Ⅰ)의 LH-RH 길항제의 제조방법을 제공한다.
바람직한 양태에서, 아미노산의 α-아미노(Nα)작용그룹을 산 도는 염기 민감성 그룹으로 보호한다. 보호그룹은 펩타이드 결합 형성의 조건에 대해 안정하며, 성장 펩타이드 쇄의 분해 또는 그안에 함유된 키랄 중심의 라세미화 없이 쉽게 제거 가능하다. 적합한 보호그룹은 3급-부톡시카보닐(Boc), 비페닐이소프로필옥시카보닐, 3급-아밀옥시카보닐, 이소보르닐 옥시카보닐, α, α-디메틸-3,5-디메톡시벤질옥시카보닐, o-니트로페닐설페닐, 2-시아노-3급-부틸옥시카보닐, 9-플루오레닐메틸옥시카보닐(Fmoc)등이다. 바람직한 α-아미노 보호그룹은 3급-부톡시카보닐(Boc)이다. 상기 일반식(Ⅰ)중의 R4가 D-Ser(t-Bu)인 부세렐린 또는 고세렐린과 같은 펩타이드를 제조하고자 할 경우, D-Ser(tBu)의 첨가를 포함하고 이에 이어지는 커플링 사이클 중 Nα보호를 위해 Fmoc가 바람직하다. Fmoc는 D-Ser(tBu)로부터 tBu를 제거하지 않는 피페리딘과 같은 염기성 시약(pH8.5)에 대해 불안정하다. 후 사이클에서 D-Ser(tBu)의 첨가에 이어 염기 민감성 Nα보호를 이용할 것이 요구된다., 4-위치의 세린의 측쇄를 예를 들어 온화한 불화물 처리로 제거될 수 있는 그룹으로 보호한다. 바람직한 세린 측쇄보호 그룹은 3급-부틸디메틸실릴이다.
세린 잔기의 하이드록시 측쇄는 본 발명의 일반적인 양태에 대해 기술한 바와 같이 성장 펩타이드에 세린을 커플링시키는 중에 보호한다. 측쇄 보호 그룹은 커플링을 수행한 후에, 그리고 다음 아미노산을 첨가하기 전에 제거한다. 세린 측쇄 보호 그룹은 Nα보호 그룹을 제거하기 위해 사용된 동일한 시약으로 제거한다. 세린에 대해 바람직한 측쇄 보호 그룹은 3급-부틸, 3급-부틸디메틸실릴, 트리메틸실릴, 트리틸, 피발릴및 테트라하이드로피리란-2-일이다.
또한, 통상적으로 LH-RH 효능제 내에 존재하는 히스티딘의 이미다졸 측쇄도 보호한다. 히스티딘 측쇄 보호 그룹은 또한 커플링 사이클 도중 불안정할 수 있으며, 예를 들어 Nα그룹 탈보호제에 대해 불안정할 수 있으나, 임의로는 펩타이드가 이의 지지체로부터 절단될 경우 이의 제거가 완결될 수 있다.
히스티딘에 대해 바람직한 측쇄 보호 그룹은 p-톨루엔설포닐 및 2,4-디니트로페닐이다.
합성을 개시시키기 위해, 통상 최종 생성물 중 C-말단 아미노산인 제1아미노산을 적합한 고체 지지체에 결합시킨다. 상기 합성을 위해 유용한 적합한 고체 지지체는 시약 및 단계적 축합-탈보호 반응의 반응조건에 불활성이며 사용된 매질에 불용성인 물질이다. 시판중인 수지의 예로는 반응성 그룹으로 개질된 스티렌/디비닐벤젠 수지, 예를 들면 클로로메틸화 스티렌.디비닐벤젠 공중합체, 하이드록시메틸화 스티렌/디비닐벤젠 공중합체 등이 있다. 메리필드 수지(1% 가교결합된 클로로메틸화 스티렌/디비닐벤젠 공중합체)가 바람직하다.
예를 들어, 클로로메틸화 스티렌 디비닐벤젠 수지와 같은 수지에 대한 결합은 에탄올, 아세토니트릴, N,N-디메틸포름 아미드(DMF)등 중 Nα보호된 C-말단 아미노산, 특히 Nα-Boc 아미노산을 이의 세슘, 테트라메틸암모늄, 트리에틸암모늄, 1,5-디아자비사이클로(5.4.0)운데크-5-엔 또는 유사한 염, 특히 DMF중 세슘염으로서 승온, 예를 들어 약 40 내지 60℃, 바람직하게는 약 50℃에서 약 12 내지 72시간, 바람직하게는 약 48시간 동안 클로로메틸화 수지와 반응시킴으로서 수행한다.
연속적인 보호된 아미노산의 커플링을 당해 기술분야에 익히 공지된 방법으로, 통상적으로 자동화 폴리펩타이드 합성기내에서 수행한다. 각각의 보호된 아미노산을 약 1.5내지 약 2.5배 몰 과량으로 도입시키고, 불활성의 비수성 극성 용매, 예를 들어 디클로로메탄, DMF또는 이의 혼합물, 바람직하게는 디클로로메탄 중에서 대략 주위 온도에서 커플링을 수행한다. 플링제는 N,N'-디사이클로헥실카보디이미드(DCC), N,N'-디-이소-프로필카보디이미드(DIC) 또는 기타 카보디이미드 중에서 단독으로 또는 1-하이드록시벤조트리아졸(HBt), O-아실 우레아, 벤조트리아졸-Δ-일-옥시-트리스(피롤리디노 포스포늄)헥사플루오로포스페이트(PyBop), N-하이드록시숙신이미드, 기타 N-하이드록시이미드 또는 옥심의 존재하에 선택한다. 대안으로, 보호된 아미노산 활성 에스테르(예:p-니트로페닐, 펜타플루오로페닐 등) 또는 대칭 무수물을 사용할 수 있다.
클로라닐 시험(참조:Anal. Biochem., 117, 145(1981))또는 이사틴 시험(참조:Anal. Chim. Acta, 118, 49(1980))을 이용하는 프롤린에 대한 커플링을 제외하고는, 카이저 시험 (참조:Anal. Biochem., 34, 595(1970))을 이용하여 펩타이드 수지를 커플링 반응 완료 여부에 대해 검사한다.
완료 시험(들)이 반응이 완료되지 않음을 나타낼 경우, 추가의 아미노산을 사용하나 추가의 아미노산 탈보호를 생략하여 커플링을 반복한다. 최후 커플링이 완료되면, 수지를 메탄올 또는 디클로로메탄-함유 메탄올로 세척하여 최대 60℃에서 건조시킨다.
각각의 사이클의 종결시에, 즉 각각의 연속적인 Nα보호된 아미노산을 성장 폴리펩타이드 쇄에 가한 후, 탈보호제로 처리함으로써 보호 그룹을 제거한다. 세린을 가할 경우, 탈보호제는 Nα-Boc 보호 그룹 및 세린 보호 그룹 모두를 제거한다. 바람직한 탈보호제는 디클로로메탄 중 염화수소(HCl/CH2Cl2), 디클로로메탄중 트리플루오로아세트산(TFA/ CH2Cl2)및 C3-C6알콜, 바람직하게는 디클로로메탄과 혼합된 이소프로판올에 용해된 염화수소이다. 통상적으로, HCl의 농도는 2 내지 9N, 바람직하게는 4내지 5N이다. C3-C6알콜에 대한 CH2Cl2의 비는 0.1내지 10(v/v), 바람직하게는 약 1:1이다. 특히 바람직한 탈보호제는 i-PrOH:CH2Cl2(1:1) 중 4.5N HCl이다. 탈보호 단계는 통상적으로 0 내지 45℃, 바람직하게는 주위 온도(20 내지 27℃)에서 수행한다.
당해 기술분야의 숙련가는 상기 기술한 것들이외의 시약을 이용하는 커플링/탈보호 공정의 선택이 세린 잔기가 본 발명의 목적을 달성하는 시약으로 보호되는 한 전적으로 적합함을 인지할 것이다. 각각의 탈보호 사이클에 대해 HCl/iPrOH/CH2Cl2를 사용하는 공정을 이용할 수 있다. 또한, 특정 사이클에 대해 TFA/ CH2Cl2를 사용하고 다른 사이클에 대해 HCl/iPrOH/CH2Cl2를 사용하는 혼합 공정이 또한 유용하다.
기타 사이클은 당해 기술 분야의 숙련가에게 쉽게 명백해질 것이다.
고체상 합성의 종결시에 폴리펩타이드를 수지로부터 절단한다. 절단은 알라닌 또는 글리신 C-말단을 갖는 펩타이드에 대해서는 적합한 용매중 암모니아의 포화용액을 이용한 가암모늄 분해에 의해 수행하고;프롤린C-말단을 갖는 펩타이드에 대해서는 알킬아민 또는 플루오로알킬아민을 이용한 가아미노 분해에 의해 수행한다. 절단은 약 10 내지 50℃, 바람직하게는 약 25℃에서 약 2 내지 24시간, 바람직하게는 약 18시간 동안 수행한다. 적합한 용매에는 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 디메틸포름아미드, 테트라하이드로푸란, N,N-디메틸에탄올아민, 핵산 및 이의 혼합물이 포함된다. 바람직하게는, 메탄올 중 암모니아의 포화 용액을 사용한다. 대안으로, 염기를 이용한 에스테르교환 반응에 이은 가아미노분해에 의해 펩타이드를 수지로부터 제거할 수 있다.
그 후, 폴리타이드를 하기 종류중 어느 것 또는 모두를 이용하는 일련의 크로마토그래피 단계에 의해 정제한다:아세테이트 형의 약 염기성 수지 상 이온 교환;수소성 흡수 크로마토그래피 또는 비유도된 폴리스티렌-디비닐벤젠(예:Amberlite
Figure kpo00004
XAD);실리카 겔 흡수 크로마토그래피;카복시 메틸셀룰로스 사 이온 교환 크로마토그래피;분배 크로마토그래피(예:Sephadex
Figure kpo00005
G-25 상), 도는 향류(countercurrent)분배;고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 특히 옥틸-또는 옥타데실실릴-실리카 결합된 상 컬럼 패킹 상의 역상 HPLC.
1, 2, 3 또는 6위치 중 하나 이상에서 라세믹 아미노산이 사용되고 각각의 이성체성 생성물 분리를 목적으로 하는 경우, 부분입체 이성체성 노나펩타이드 또는 데카펩타이드 최종 생성물을 분리하고, 적합한 위치에 D-아미노산을 함유하는 목적하는 펩타이드를 바람직하게는 상기 기술한 크로마토그래피 공정도중에 분리하고 정제한다.
임의로, 분리하고 정제된 폴리펩타이드를 약제학적으로 허용되는 염으로 전환시킨다.
하기 실시예에서 LH-RH 효능제 및 LH-RH 길항제 모두에 대하여 본 발명의 일시적 보호 방법을 비보호된 방법과 비교 한다. 이들 실시예는 상술 만의 목적을 위해 제시되며, 청구한 본 발명의 범위에 대해 어떠한 부당한 제한이라도 가하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 발명의 일시적 최소 보호 방법을 이용한 실시예 1 및 3의 생성물 모두에서 비보호된 합성법을 이용한 실시에 2 및 4에서 수득된 생성물에 비교해 현저하게 더 적은 불순물이 존재하였다.
더 적은 불순물 외에, 본 발명의 방법은 더 높은 수율을 제공하여 LH-RH 유사체의 분리 및 정제시 더 짧은 기간에 걸쳐 더 적은 에너지 소비로 덜 해로운 시약을 사용하는 추가의 잇점을 부여한다. 또 다른 잇점은 상당히 덜 유독한 폐기스트림의 더 적은 양의 발생이다.
[제조실시예 A]
Boc-Gly-O-수지의 제조
Nα-Boc-글리신 4.9g을 메탄올 50㎖ 및 증류수 50㎖의 혼합물에 용해시킨다. 수성 중탄산세슘을 사용하여 용액의 pH를 7.5로 만든다. 그리고 나서 용매를 진공하에 제거한다.
고진공하에서 18시간 동안 건조시킨 후, 잔사를 뭇 DMF 150㎖에 용해시킨다. 1% 클로로메틸화 폴리스티렌/디비닐벤젠(메리필드) 수지(25 밀리몰 클로라이드에 상당)25g을 가한다.
혼합물을 50℃에서 24시간 동안 진탕시키고, 여과하고나서 수지를 DMF, 물 및 에탄올로 차례로 세척한다. 수지를 진공하에 3일 동안 건조시켜서 Boc-Gly-O-수지 28.34g을 수득한다.
[제조실시예 B]
Boc-Ala-O-수지의 제조
제조실시예 A의 방법에 따라 Nα-Boc-D-알라닌을 1% 메리필드 수지에 가하여 Nα-Boc-D-Ala-O-수지를 수득한다.
[실시에 1]
일시적 세린 보호를 이용한 나파렐린의 합성
이 실시예에서, 하기 측쇄 보호 공정을 사용하여 나파렐린을 제조한다. 아르기닌에 대한 염 보호(클로라이드로서), 히스티딘에 대한 토실 보호, 및 세린에 대한 3급-부틸 보호.
바켐(Bachem)사 (Torrance, CA) (Leu, Tyr, His(Tos), Arg, Trp 및 Gly), 스타 바이오케이칼즈(Star Biochemicals)사 (Torrance, CA) (Pro 및 Ser(tBu)), 신테 테크(Synthe Tech)사 (Albany, OR) (D-Nal(2))로부터 Nα-Boc 아미노산을 수득한다.
i-PrOH/CH2Cl2(1/1) 중 4내지 4.5N HCl 용액을 HCl을 냉각된 /iPrOH중으로 버블링시킴으로써 제조한다. 용액이 포화되면(적정에 의해 측정, 약 9N), 용액을 실온에 3일 이하 동안 유지시키고, 사용하기 전에 동일 용적의 CH2Cl2로 희석시킨다.
제조실시예 A로부터의 Nα-Boc-Gly-O-수지 1.0밀리몰을 시약의 첨가 및, 가압, 탈압 및 질소 불활성 대기의 유지를 위한 부대 병 및 플라스크가 장착된 5.0ℓ용량의 베가(Vega)296 자동화 고체상 펩타이드 합성기의 반응 용기에 위치시킨다.
하기 아미노산을 DIC 또는 HBt-보조 DIC커플링에 의해 3시간 동안 Nα-Boc-Gly-O-수지에 가한다:
Figure kpo00006
하기 공정을 이용하여 각각의 첨가에 이어 Nα보호 그룹을 제거한다.
프로그램 A: 수지를 우선 CH2Cl2로 1회 1분, TFA-CH2Cl2(40/60)으로 1회 1분, TFA-CH2Cl2(40/60)으로 1회 30분, CH2Cl2로 5회 1분, Et3N-CH2Cl2(5/95)로 3회 1분,
CH2Cl2로 4회 1분 세척한다.
프로그램 B:수지를 우선 CH2Cl2로 1회 1분, CH2Cl2/i-PrOH(1/1) 중 4 내지 4.5N HCl로 1회 1분, CH2Cl2/i-PrOH(1/1)중 4내지 4.5N HCl로 1회 30분, CH2Cl2로 3회 1분, DMF로 1회 1분, Et3N-CH2Cl2(5/95)로 3회 1분, DMF로 1회 1분, CH2Cl2로 4회 1분 세척한다.
프로그램 A를 이용하여 Gly, Pro, Arg, Leu, D-Nal(2) 및 Try 상 Nα보호 그룹을 제거한다. Ser, Trp 및 His 상 Nα보호 그룹의 제거 및 세린 측쇄 보호 그룹의 제거를 위해 프로그램 B:를 이용한다.
공정 A 또는 B에 따른 각각의 탈보호 및 세척 단게 후, 서열상 다음 아미노산을 가하고 수지를 CH2Cl2로 3회 1분, MeOH로 4회 1분, DMF로 2회 1분 및 CH2Cl2로 4회 1분 세척한다. 서열이 완결되면, 메탄올 중 암모니아의 포화 용액으로 약 18시간 동안 약 25℃에서 처리하여 펩타이드를 수지로부터 절단한다.
조 펩타이드를 2M 아세트산에 용해시키고, AG3-X4A 수지(Bio-Rad)의 컬럼을 통과시킴으로써 아세테이트 염으로 전환 시킨다. 아세테이트를 최소량의 메탄올에 용해시키고 아세톤을 가하여 펩타이드를 재침전시킨다. 역상 HPLC(Partisil ODS-3, 40μ, 0.5% 아세트산을 갖는 아세토니트릴)을 이용하여 극성 및 비극성 불순물을 제거한다. 97%이상의 나파렐린 아세테이트를 함유하는 분획을 합하여 물로 희석시키고, 역상 HPLC 컬럼에 재충전하고, 물중 1% 아세트산으로 세척한다. 잔사를 침전, 여과 및 세척한 후 진공하에 건조시킨다.
벡크만(Bechman) 119CL 아미노산 분석기 상에서 아미노산 분석을 수행한다. 아미노산 분석용 샘플을 4N CH3SO3H(0.2% 3-(2-아미노메틸 인돌(HCl)로 20시간 동안 110℃에서 가수분해한다.
올테크(Alltech)사의 OSD-Ⅱ 칼럼, 5μ, 4.6×250㎜, 10μ주입, 유속 1.5㎖/분, 27.5% CH3CN, 72.5% 0.16M KH2PO4, Ph 5.1, 온도 40℃를 이용하여 스펙트라 피직스(Spectra Physics)8800 크로마토그래프 상에서 분석 HPLC를 수행한다.
조 펩타아드의 HPLC분석은 나파렐린에 해당하는 18분의 체류시간에 주 피크를 나타내며 체류시간 14분에서 1% 이상의 불순도는 관찰되지 않는다.
[실시예 2]
세린 보호가 없는 나파렐린의 합성
실시예1의 방법을 따르되, 단 Nα-Boc-Ser(tBu)를 Nα-Boc-Ser-로 대체한다.
HPLC 분석하면 나파렐린에 해당하는 18분에서 주 피크를 나타내고, 14분의 체류시간에 불순물 8.1내지 11.5%를 나타낸다.
또한, 이 비보호된 합성법으로부터의 수율은 HF 처리를 수반하는 완전히 보호된 합성법으로부터 수득된 수율과 거의 동일하며, 후자의 겨우 수율은 실시예1의 일시적 보호 합성법으로 수득된 수율보다는 현저히 더 낮다.
[실시예 3]
일시적 세린 보호법을 이용한 LH-RH 길항제의 합성
이 실시예에서는 하기 측쇄 보호 공정을 이용한 LH-RH 길항제, N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pla(3)-Ser-Tyr-D-hArg(Et)2-leu-harg(Et)2-Pro-d-AlaNH2를 제조한다:L-및 D-hArg(Et)2에 대한 염보호(클로라이드로서)및 세린에 대한 3급-부틸 부호.
바켐(Bachem) 사(Torrance, CA) (D-Ala, Arg 및 Leu); 스타 바이오케미칼즈(Star Biochemicals)사 (Torrance, CA) (Pro);신테 테크(Synthe Tech)사 (Albany, OR) (D-Nal(2)), 인셀(Incell)사(Milwaukee, WI) (D-Pal(3)) 및 유씨비 바이오프로덕츠(UCB Bioproducts)사 (Belgium) (p-Cl-Phe)로부터 Nα-Boc-아미노산을 수득한다.
하기 서열로 아미노산을 제조실시예 B의 Nα-Boc-D-Ala-O-수지에 가한다.
Figure kpo00007
Ala, Pro 및 Leu 후에 아세틸화(캡핑)을 수행한다.
염기성 아미노산, hArg(Et) 및 Pal(3)의 커플링을 위해 과량의 HBt(2당량)를 사용한다.
DIC 또는 HBt-보조 DIC 커플링에 의해 아미노산을 3시간동안 결합시키고, 수지를 CH2Cl2로 3회 1분, MeOH로 4회 1분, DMF로 2회 1분 및 CH2Cl2로 4회 1분 잇따라 세척한다.
하기 공정을 이용하여 각각의 첨가후 Nα보호 그룹을 제거한다:
프로그램 A:수지를 우선 CH2Cl2로 1회 1분, TFA-CH2Cl2(40/60)로 1회 1분, TFA-CH2Cl2(40/60)로 1회 1분, TFA-CH2Cl2(40/60)로 1회 30분, CH2Cl2로 5회 1분, Et3N-CH2Cl2(5/95)로 3회 1분, CH2Cl2로 4회 1분 세척한다.
프로그램 B:수지를 우선 CH2Cl2로 1회 1분, CH2Cl2/i-PrOH(1/1)중 4 내지 4.5N HCl로 1회 1분, CH2Cl2/i-PrOH(1/1)중 4 내지 4.5N HCl로 1회 30분, CH2Cl2로 3회 1분, DMF로 1회 1분, Et3N-CH2Cl2(5/95)로 3회 1분, DMF로 1회 1분, CH2Cl2로 4회 1분 세척한다.
Ala, Pro, L-hArg(Et)2, Leu 및 D-Nal(2) 상의 보호 그룹의 제거를 위해 프로그램 A를 이용하고;D-hArg(Et)2, Tyr, Ser, D-Pal(3) 및 p-Cl-Phe 상의 보호 그룹의 제거를 위해 프로그램 B를 이용한다.
공정 A 또는 B에 따른 각각의 탈보호 및 세척 단계 후, 서열상 다음 아미노산을 가하고, 수지를 CH2Cl2로 3회 1분, MeOH로 4회 1분, DMF로 2회 1분 및 CH2Cl2로 4회 1분 세척 한다. 서열이 완료되면, 메탄올 중 암모니아의 포화용액으로 약 18시간 동안 약 25℃에서 처리하여 펩타이드를 수지로부터 절단한다.
조 펩타이드를 우선 2M 아세트산에 용해시키고, AG3-X4A 수지(Bio-Rad)의 컬럼을 통과시켜 이의 아세테이트 염으로 전환 시킨다. 아세테이트를 실리카 겔 컬럼 상 크로마토그래피 (CH2Cl2/i-PrOH/MeOH/H2O/HOAc 용매)에 적용시키고; 아세테이트 분획을 물에 용해시키고; 역상 컬럼(Vydec C-8, 15 내지 20μ)상에 충전한 다음 아세토니트릴/TEAP(pP 3)을 이용하여 정제한다. 목적하는 순도의 분획을 합하여 물로 희석시키고, 역상 HPLC 컬럼 상에 재충전한 다음 물 중 1% 아세트산으로 세척한다. 펩타이드를 MeOH/CH3CN/HOAc/H2O(44/50/1/5)의 혼합물로 스트리핑시킨다. 잔사를 메탄올 또는 아세트산에 용해시키고 에테르 상에 침전시키고, 여과하여 에테르로 세척하고 진공하에 건조시킨다.
벡크만(Bechman) 119CL 아미노산 분석기 상에서 아미노산 분석을 수행한다. 아미노산 분석용 샘플을 6N HCl로 110℃에서 20시간 동안 가수분해시킨다.
spherisorb C-8(alltech), 5μ, 4.6×250㎜, 10μ1 주입, 유량 1.5㎖/분, 30% CH3CN, 70% NH4H2PO40.04M, 디메틸 옥틸아민 4.3×10-3, 온도 40℃를 이용하여 스펙트라 피직스(Spectra Physics) 8800크로마토그래프 상에서 분석 HPLC를 수행한다.
길항제의 합성은 체류 시간 18분에서 주 피크의 존재에 의해 확인되며;체류시간 16분에서 1% 이상의 다른 피크는 관찰되지 않는다.
[실시예 4]
일시적 세린 보호가 없는 LH-RH 길항제의 합성
Nα-Boc-Ser-(tBu) 대신 Nα-Boc-Ser 를 사용하여 실시예 3을 반복한다.
HPLC 분석은 길항제에 해당하는 18분에서의 주 피크의 존재 및 체류시간 16분에서 6.5%의 불순도의 존재를 나타낸다.
하기 특허청구의 범위는 특히 본 발명자가 그의 발명으로 간주하는 요지를 지적하고 이를 명확하게 청구한다. 이들 특허 청구의 범위는 고체상 펩타이드 합성의 기술분야의 숙련가에 의해 인지될 수 있는 등가물의 완전한 범위를 포함한다.

Claims (14)

  1. 세린 잔기의 측쇄 만을 α-아미노보호 그룹의 제거에 유용한 시약에 대해 불안정한 보호 그룹으로 일시적으로 보호함을 특징으로 하는, 하나 이상의 세린 잔기를 함유하는 LH-RH 유사체의 고체상 합성 방법.
  2. 제1항에 있어서, 세린 측쇄를 3급-부틸, 트리틸, 피발릴, 3급-부틸디메틸실릴, 트리메틸실릴 및 테트라하이드로피란-2-일 중에서 선택된 그룹으로 보호하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 세린 측쇄 보호그룹을 C3-C6알콜/디클로로메탄 용액 중에서 염화수소로 처리함으로써 제거하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, C3-C6알콜이 이소프로판올인 방법.
  5. (a) 4-위치의 세린의 측쇄만을 일시적으로 보호하고, (b) 존재할 수 있는 히스티딘의 측쇄를, α-아미노 그룹 탈보호제, 또는 가아미노분해 또는 가암모니아분해에 불안정한 그룹으로 보호함을 특징으로 하는, 일반식(Ⅰ)의 아미노산 서열을 갖는 화합물의 고체상 합성 방법.
    Figure kpo00008
    상기식에서,
    R1은(피로)Glu 및 N-Ac-D-Nal(2) 중에서 선택되고;
    R2는 His, D-p-Cl-Phe 및 D-p-F-Phe 중에서 선택되며;
    R3는 Trp, D-Trp, D-Nal(2) 및 D-Pal(3) 중에서 선택되고;
    R4는 D-Nal(2), D-hArg(Et)2, D-hArg(Bu), D-hArg(CH2CF3)2, D-His(Bzl), D-Leu, D-Pal(3), D-Ser(tBu) 및 D-Trp 중에서 선택되며;
    R5는 Arg, L-hArg(Et)2, L-hArg(Bu), L-hArg(CH2CF3)2및 Lys(iPr)중에서 선택되고;
    R6는 Gly-NH2, NH-NHCONH2, D-Ala-NH2및 NHEt 중에서 선택되며;
    아미노산에는 Nα보호가 제공된다.
  6. 제5항에 있어서, 세린의 측쇄를 α-아미노 보호 그룹의 제거에 유용한 시약에 대해 불안정한 그룹으로 보호하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 세린 측쇄 보호 그룹이 3급-부틸, 트리틸, 피발릴, 테트라하이드로피란-2-일, 트리메틸실릴 및 3급-부틸디메틸실릴, 바람직하게는 3급-부틸 중에서 선택되는 방법.
  8. 제5항에 있어서, α-아미노 보호 그룹이 3급-부틸옥시카보닐, 3급-아밀옥시카보닐, 이소보르닐옥시카보닐, α,α-디메틸-3,5-디메톡시벤질옥시카보닐, o-니트로페닐설페닐, 2-시아노-3급-부틸옥시카보닐 및 9-플루오로레닐메틸옥시카보닐 중에서 선택되는 방법.
  9. 제5항에 있어서, α-아미노 보호 그룹이 3급-부틸옥시카보닐이고, 세린 측쇄 보호 그룹이 3급-부틸이며, 히스티딘 측쇄 보호 그룹이 p-톨루엔설포닐인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 탈보호제가 HCl/CH2Cl2, TFA/CH2Cl2및 HCL/(C3-C6)알콜/CH2Cl2중에서 선택되는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 탈보호제가 HCl/iPrOH/CH2Cl2인 방법.
  12. 제5항에 있어서,R1이 Ac-D-Nal(2)이고; R2가 D-p-Cl-Phe이며; R3가 D-Pal(3)이고; R4가 D-hArg(Et)2이며; R5가 L-hArg(Et)2이고; R6가 D-Ala-NH2인 방법.
  13. 제5항에 있어서, R1이 (피로)Glu이고, R2가 His이며,R3가 Trp이고, R4가 D-Nal(2)이며, R5가 Arg이고, R6가 Gly-NH2인 방법.
  14. (a)적합한 Boc-보호되고 3급-부틸 보호된 세린을, 불활성 고체 지지체에 공유 결합된 Boc-R6-O-로 출발하여 일반식(Ⅰ)의 화합물의 아미노산 서열의 우측으로부터 좌측으로의 순서로 및 연속 사이클로 고체상 합성법에 의해 커플링시키고, (b) 각각의 사이클의 종결시에 HCl/CH2Cl2및 HCl/저급 알칸올/CH2Cl2중에서 선택된 탈보호제로 처리함으로써 세린 또는 D-세린으로부터 Boc-보호 그룹 및 동시에 3급-부틸그룹을 제거하여 고체 지지체에 결합된 폴리펩타이드를 형성시키고, (c) 가암모니아분해에 의해 지지체로부터 폴리펩타이드를 절단하고, (d) 생선된 폴리펩타이드를 분리하는 단계를 특징으로 하는, 일반식(Ⅰ)의 아미노산 서열을 갖는 화합물의 고체상 합성 방법.
    Figure kpo00009
    상기식에서, R1은(피로)Glu 및 N-Ac-D-Nal(2) 중에서 선택되고; R2는 His, D-p-Cl-Phe 및 D-p-F-Phe 중에서 선택되며; R3는 Trp, D-Trp, D-Nal(2) 및 D-Pal(3) 중에서 선택되고; R4는 D-Nal(2), D-hArg(Et)2, D-hArg(Bu), D-hArg(CH2CF3)2, D-His(Bzl), D-Leu, D-Pal(3), D-Ser(tBu) 및 D-Trp 중에서 선택되며; R5는 Arg, L-hArg(Et)2, L-hArg(Bu), L-hArg(CH2CF3)2, 및 Lys(iPr)중에서 선택되고; R6는 Gly-NH2, NH-NHCONH2, D-Ala-NH2및 NHEt 중에서 선택된다.
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