FI88031C - 4-(substituerad aminokarbonyloximetyl)fenoxiaettiksyraderivat, foerfarande foer framstaellning av dessa och deras anvaendning i en fastfassyntes av peptid-aminoalkylamider - Google Patents

Description

α 83031 4-(substituoitu aminokarbonyylioksimetyyli)fenoksietikka-happojohdannaisia, menetelmä niiden valmistamiseksi ja niiden käyttö peptidi-aminoalkyyliamidien kiinteäfaasi-synteesissä 5

Aminoalkyyliamidin liittäminen biologisesti vaikuttavan peptidin C-terminaalipäähän on joissakin tapauksissa vaikuttanut edullisesti metaboliseen pysyvyyteen ja tehoon (EP-hakemusjulkaisu 179 332). Näin muunnettujen 10 peptidien valmistuksessa käytettiin klassista fragmentti-kytkemistä liuoksessa.

Peptidien kiinteäfaasisynteesissä [vrt. Patchor-nik, Cohen: Perspectives in Peptide Chemistry, s. 118 -128 (Karger, Basel 1981)] ei reaktiivisia ketjuja usein 15 oksasteta suoraan hartsiaineeseen, vaan liitetään ns.

speiserien tai linkkien välityksellä kantaja-aineeseen. Kirjallisuudesta [esim. Atherton, Sheppard: Perspectives in Peptide Chemistry, s. 101 - 117 (Karger, Basel 1981)] tunnetaan esimerkiksi reagensseja, joiden avulla liite-20 tään tällaisia speisereitä (ns. "linking agents"), joiden kaavat ovat VI, VII ja VIII: H0CH2 -^==^-CH2-CH2- co2h hoch^)- och2- co2h 25 (VI) (VII)

H0CH^O>“C02H

30 (VIII)

Nyt on keksitty uusia kytkentäaineita, joiden avulla on mahdollista rakentaa C-terminaalissa aminoal-kyyliamidilla modifioituja peptidejä suoraan kiinteäfaa-35 sisynteesillä.

2 83031

Esillä olevan keksinnön kohteena ovat siten yhdisteet, joiden kaava on I

γΐ Y2

5 (I) A-[B]p-NH-[X]m-NH-C0-0-CH2 -^~^-W-C02-V

Υ2 γ4 jossa A on vety tai 9-fluorenyylimetyylioksikarbonyyli, 10 B on Phe tai Ala, X on C1_12-alkyleeni, Y1, Y2, Y3 ja Y4 ovat vetyjä, V on vety, mahdollisesti bentsoyyliryhmällä substituoitu Cj.g-alkyyli tai bentsyyli, 15 W on -0-CH2-, m on 1 ja p on kokonaisluku 0 tai 1.

Edullisia ovat sellaiset kaavan I mukaiset yhdisteet, joissa p on 0.

20 X on edullisesti haarautumaton C1.8-alkyleeni.

Radikaalina A mahdollisesti oleva 9-fluorenyylime-tyylioksikarbonyyli (Fmoc) kuuluu emäslabiileihin tai heikkojen happojen suhteen labiileihin aminon suojaryh-. miin [ks. esim. Hubbuch, Kontakte (Merck) 1979, nro 3, s.

25 14 - 23].

B on aminohappotähde Phe tai Ala, joka voi olla D-• ' tai L-muodossa.

Alkyleeni voi olla haarautumaton tai haarautunut. Keksinnön kohteena on myös menetelmä kaavan I mu-30 kaisten yhdisteiden valmistamiseksi, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että

a) yhdiste, jolla on kaava II

35 R- CO- 0- CH2-^__y w- C02- v (I1) Y2 γ4

II

3 ο λ η 7 4

ο ο υ ό I

jossa R on halogeeni tai aktivoitu aryylioksi,

V on mahdollisesti bentsoyyliryhmällä substituoitu W, Y1, Y2, Y3 ja Y4 merkitsevät edellä määriteltyä, saate-5 taan reagoimaan yhdisteen kanssa, jolla on kaava III

A-[B]p-NH-[X]„-NH2 (III), 10 jossa A on 9-fluorenyylimetyylioksikarbonyyli ja B, X, p ja m merkitsevät edellä määriteltyä, ja näin saadusta suojatusta kaavan I mukaisesta yhdisteestä mahdollisesti lohkaistaan toinen tai molemmat suojaryhmistä A ja/tai V, 15 jolloin muodostuu vapaa NH2- ja/tai C02H-ryhmä, jolloin edullisia ovat menetelmät, joissa lohkaistaan selektiivisesti V esim. pelkistävästi Zn/jääetikka-seoksen avulla, tai b) kaavan I mukainen yhdiste, jossa A on vety ja 20 p = 0 ja B, X, Y1, Y2, Y3, Y4, V, H ja m merkitsevät

edellä määriteltyä, saatetaan reagoimaan yhdisteen kanssa, jolla on kaava IV

25 A- [B]p-0H (IV) jossa B merkitsee edellä määriteltyä ja A on 9-fluorenyy-limetyylioksikarbonyyli ja p=l, tai tämän yhdisteen ak-30 tiiviesterin, halogenidin tai atsidin kanssa ja kun V ei ole vety, mahdollisesti lohkaistaan karboksyylisuojaryhmä V, jolloin muodostuu karboksyyliryhmä.

Edellä määritelty ryhmä R on nukleofiilisesti irrotettava poistuva ryhmä.

4 88031

Kaavan II mukaisen yhdisteen reaktio kaavan III mukaisen yhdisteen kanssa suoritetaan edullisesti ap-roottisessa liuottimessa, joista esimerkkejä ovat THF, DMF, CHCl^ ja CI^Cl2, edullisesti emäksen läsnä ollessa, kuten 5 esim. tertiaarisen amiinin, esimerkiksi etyylitri-isopro-pyyliamiinin, trietyyliamiinin tai pyridiinin läsnä ollessa, jolloin asylointikatalysaattorin (esim. DMPA, HOObt tai HOBt) lisäys vaikuttaa edullisesti, lämpötilassa 0°C:n ja reaktioseoksen kiehumispisteen välillä, edul- 10 lisesti 0 - 40°C:ssa.

Kaavan I mukainen yhdiste (A = vety) saatetaan edullisesti reagoimaan kaavan IV mukaisen yhdisteen, sen aktiiviesterin, halogenidin tai atsidin kanssa orgaanisessa liuottimessa, kuten DMF:ssä, edullisesti emäksen, 15 kuten esim. tert.amiinin, läsnä ollessa lämpötilassa -10°C:n ja reaktioseoksen kiehumispisteen välillä, edullisesti huoneen lämpötilassa. Sopivia aktiiviestereitä ovat esimerkiksi ONSu-, OBt-, OObt- ja -p-nitrofenoksiyh-disteet. Edullisia halogeenijohdannaisia ovat kloridit.

20 Liukoisuuden parantamiseksi voidaan lisätä pyridiniumper-kloraattia.

Kaavan II mukaisia yhdisteitä valmistetaan esimerkiksi saattamalla esteri, jonka kaava on IX

25 v>—<γ2 .·. HO- CH2_^ C02- V (IX) : : : Y3 y4 30 jossa Y3, Y2, Y3, Y4, W ja V merkitsevät edellä määri-' teltyä, jolloin V ei kuitenkaan ole vety, reagoimaan fos- geenin tai fosgeenijohdannaisen, kuten esim. kloorimuu-: rahaishapponitrofenyyliesterin kanssa, aproottisen polaa- ' risen liuottimen, esim. THF:n tai DMF:n ja tert.emäksen, .· · 35 esim. tert.amiinin, kuten pyridiinin seoksessa edullisesti 5 8 G Ο 31 seossuhteessa 1:1, lämpötilassa -40 °C:n ja huoneen lämpötilan välillä, edullisesti -20 - 0 °C:ssa.

Keksintö koskee edelleen sellaisen kaavan I mukaisen yhdisteen käyttöä, jossa V on vety ja A ei ole vety, 5 kiinteäfaasisynteesissä, jolla valmistetaan yhdisteitä, joilla on kaava (V) P-NH- [X] b-NH2 (V) 10 jossa kaavassa P on a-aminohapoista muodostunut peptidi-tähde ja X ja m merkitsevät edellä määriteltyä, sekä menetelmää kaavan P-NH-[X]„-NH2 mukaisen peptidin valmistamiseksi, jossa kaavassa P, X ja m merkitsevät edellä määriteltyä, kiinteäfaasisynteesillä, jolle menetelmälle on 15 tunnusomaista, että kaavan I mukainen yhdiste, jossa A ei ole vety ja V on vety, kytketään hartsiin, suojaryhmä A lohkaistaan, asteittain kytketään emäslabiileilla tai heikkojen happojen suhteen labiileilla aminosuojaryhmillä väliaikaisesti suojattuja a-aminohappoja mahdollisesti 20 aktivoidun johdannaisensa muodossa ja kaavan P-NH-tX],,-NH2 mukaisen peptidin rakentamisen päätyttyä peptidi vapautetaan hartsista käsittelemällä keskivahvalla tai vahvalla hapolla, jolloin samanaikaisesti tai jälkeenpäin sopivilla toimenpiteillä peptidiin väliaikaisesti liite-25 tyt sivuketjusuojaryhmät jälleen lohkaistaan.

Milloin sivureaktioiden välttämiseksi tai erityisten peptidien synteesi vaatii, aminohappojen sivuketjuissa olevat funktionaaliset ryhmät on lisäksi suojattava sopivilla suojaryhmillä (ks. esim. T.W. Greene: 30 "Protective Groups in Organic Syntheses", New York, John Wiley & Sons, 1981), jolloin lähinnä käytetään seuraavia: Arg(Tos), Arg(Mts), Arg(Mtr), Asp(OBzl), Asp(OBut), Cys(4-MeBzl), Cys(Acm), Cys(SBut), Glu(OBzl), Glu(OBut), His(Tos), His(Fmoc), His(Dnp), His(Trt), Lys(Cl-2), 35 Lys(Boc), Met(O), Ser(Bzl), Ser(But), Thr(Bzl), ThriBu*).

6 80031

Kantaja-aineina käytetyt hartsit ovat kaupallisesti saatavia tuotteita. Edullisia ovat BHA- ja MBHA-hart-sit.

Kaavan V mukaisen peptidin lohkaiseminen suorite-5 taan peptidisynteesissä tavallisella käsittelyllä käyttäen keskivahvaa ja vahvaa happoa (esim. trifluorietikka-happo, HF), jolloin speiseriin sisältyvä uretaanisuojaryh-mä lohkeaa.

Kaavan I mukaisen yhdisteen (V = H) ja muiden ami-10 nohappojohdannaisten kytkentäreagensseina voidaan käyttää kaikkia mahdollisia peptidisynteesissä käytettyjä akti-vointireagensseja, ks. esim. Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, osa 15/2; erityisesti käytetään kuitenkin karbodi-imidejä, kuten esim. N,N1-disykloheksyyli-15 karbodi-imidiä, N,N'-di-isopropyylikarbodi-imidiä tai N-etyyli-N'-(3-dimetyyliaminopropyyli)karbodi-imidiä. Kytkentäreaktio hartsiin liittämiseksi voidaan tällöin suorittaa suoraan lisäämällä aminohappojohdannaista akti vointireagenssin ja mahdollisen rasemoitumista estävän 20 lisäaineen kanssa, joista esimerkkejä ovat 1-hydroksibent-sotriatsoli (HOBt) /W. König, R. Geiger, Chem. Ber. 103, 708 (1970)7 tai 3-hydroksi-4-okso-3,4-dihydrobentsotriat-siini (HOObt) /W. König, R. Geiger, Chem. Ber. 103, 2054 (1970)7 tai aminohappojohdannaisen esiaktivointi symmet-25 riseksi anhydridiksi tai HOBt- tai HOObt-esteriksi voidaan suorittaa erikseen ja aktivoidun yhdisteen liuos sopivas-• sa liuottimessa lisätä kytkentäkykyiseen peptidihartsiin.

Kaavan I mukaisen yhdisteen (V = H) ja aminohappo-johdannaisten kytkentä tai aktivointi jollakin edellä " 30 mainituista aktivointireagensseista voidaan suorittaa di- metyyliformamidissa tai metyleenikloridissa tai näiden seoksessa. Aktivoitua aminohappojohdannaista käytetään . ' yleensä 1,5 - 4-kertaisena ylimääränä. Niissä tapauksis- • sa, joissa kytkentä ei tapahdu täydellisesti, kytkentä- 35 reaktio toistetaan ennen seuraavan aminohapon kytkemisen l· 7 y 0031 kannalta välttämätöntä peptidihartsin oc-aminoryhmän suo-jaryhmän poistamista.

Onnistunut kytkentäreaktio voidaan todeta ninhyd-riinireaktiolla, jonka ovat kuvanneet esim. E. Kaiser et 5 ai., Anal. Biochem. 34, 595 (1970). Synteesi voidaan myös automatisoida esim. käyttämällä firman Applied Biosystems laitetta Peptid-Synthesizer malli 430A, jolloin voidaan käyttää joko laitteen valmistajan suunnittelemaa syntee-siohjelmaa tai laitteen käyttäjän itse laatimaa ohjelmaa. 10 Viimeksi mainittuja käytetään varsinkin silloin, kun kyseessä ovat Fmoc-ryhmällä suojatut aminohappojohdannaiset.

Peptidiamidien lohkaisussa hartsilta fluorivedyn tai trifluorietikkahapon avulla käytetään kationien sitomiseen tavallisesti sellaisia aineita kuin fenoli, kreso-15 li, tiokresoli, tioanisoli, anisoli, etaaniditioli, di- metyylisulfidi, etyylimetyylisulfidi tai kahden tai useamman tällaisen apuaineen seosta. Trifluorietikkahappo voidaan tällöin myös laimentaa sopivalla liuottimena, kuten esim. metyleenikloridilla.

20 Käytettyjä lyhenteitä:

Fmoc 9-fluorenyylimetyylioksikarbonyyli

Ddz iV,a:-dimetyyli-3,5-dimetoksibentsyylioksikarbonyyli Bpoc 2-/bifenylyyli- (4).7propyyli- (2) -oksikarbonyyli Msc metyylisulfonyylietyylioksikarbonyyli . .·. 25 Peoc pyridyylietyylioksikarbonyyli • . Pse fenyylisulfonyylietyylioksikarbonyyli . - Tse tolyylisulfonyylietyylioksikarbonyyli HONSu N-hydroksisukkinimidi HOBt 1-hydroksibentsotriatsoli 30 HOObt 3-hydroksi-4-okso-3,4-dihydrobentsotriatsiini THF tetrahydrofuraani DMF dimetyyliformamidi DMAP dimetyyliaminopyridiini

Seuraavat esimerkit on tarkoitettu keksinnön valai-35 semiseksi, jolloin ne eivät kuitenkaan rajoita keksintöä.

8 o ·*> n 2 1 j u U Ο !

Esimerkki 1 4-hydroksimetyylifenoksietikkahappometyyliesteri 18,2 g 4-hydroksimetyylifenoksietikkahappoa ja 17.1 ml N,N-di-isopropyylietyyliamiinia liuotetaan yhdes-5 sä 50 mitään DMF ja liuokseen lisätään sitten sekoittaen 6.1 ml metyylijodidia. Tällöin seos jonkin verran lämpe-nee. Kolmen tunnin kuluttua reaktio on päättynyt. Liuotin haihdutetaan. Jäännös liuotetaan eetteriin ja liuos uutetaan kerran 0,5-n kloorivetyhapolla. Vesifaasi uute- 10 taan vielä kolme kertaa eetterillä, yhdistetyt eetteri-faasit pestään NaHCO^-vesiliuoksella ja haihdutetaan. Jäännös liuotetaan etyyliasetaattiin ja liuos suodatetaan lyhyen silikageelipylvään lävitse. Liuos haihdutetaan, jäännöksenä saatu heikosti kellertävä öljy kiteytyy 15 seisotettaessa.

NMR- ja massaspektri vastaavat odotettua rakenne t ta .

Esimerkki 2 2 0 Fmoc-NH- ( CH2 ) 4“ N11- co“ °~ CH2 O- CH2-COOCH3 9,8 g 4-hydroksimetyylifenoksietikkahappometyyli-esteriä liuotetaan 200 ml:aan vedetöntä CH2C12, sitten lisätään 10,1 g kloorimuurahaishappo-p-nitrofenyylieste-25 riä ja 7 ml trietyyliamiinia. Seosta keitetään palautus-‘ jäähdyttäen noin kuusi tuntia, jolloin lähtöaine on täy- sin reagoinut. Sitten lisätään Fmoc-NH-(CH2)^-NH^:n (15,5 g) (valmistettu saattamalla Boc-NH-(CH2)^-NH2 rea-·: goimaan Fmoc-ONSu:n kanssa ja sitten lohkaisemalla Boc) 30 suspensio 100 ml:ssa vedetöntä CH2C12 ja vielä 7 ml tri-etyyliamiinia ja seosta keitetään palautusjäähdyttäen. Reaktion päätyttyä liuotin haihdutetaan, jäännöstä hierretään eetterissä, se imusuodatetaan. Suodattimelle jäänyt aine pestään 1-n Na^O^-vesiliuoksella ja sitten läm-35 pimällä vedellä ja kuivataan suurvakuumissa eksikkaatto-rissa.

9 33031

Sp. 122 - 124°C, NMR- ja massaspektri vastaavat ilmoitettua rakennetta.

Esimerkki 3

5 H2N- (CH2)4-NH-C0-0-CH2 0-CH2-COOH

5,2 g esimerkin 2 mukaisesti valmistettua esteriä suspendoidaan 100 mlsaan metanolia ja suspensioon lisätään kuusi ekvivalenttia 1-n NaOH-vesiliuosta. Reaktion 10 päätyttyä seoksen pH-arvo säädetään 1-n HCl-vesiliuoksel-la kolmeksi ja metanoli haihdutetaan. Sakka imusuodate-taan, pestään vähäisellä vesimäärällä, sitä hierretään eetterissä ja se suodatetaan jälleen.

Sp. 196°C:sta alkaen (hajoaa), NMR- ja massaspektri 15 vastaavat ilmoitettua rakennetta.

Esimerkki 4

Fmoc-Phe-NH-(CH2)4-NH-CO-O-CH2 O-CH2-COOH

20 1/5 g esimerkissä 3 saatua tuotetta suspendoidaan 50 ml:aan DMF. Sitten lisätään peräkkäin 0,9 g pyridinium-perkloraattia (liukoisuuden parantamiseksi) sekä 2,6 g Fmoc-Phe-OObt ja 0,5 ml trietyyliamiinia. Seosta sekoitetaan huoneen lämpötilassa. Reaktion päätyttyä liuotin 25 haihdutetaan ja jäännös jaetaan etyyliasetaattiin ja veteen liukeneviin osiin. Vesifaasi uutetaan vielä kerran : etyyliasetaatilla ja yhdistetyt orgaaniset faasit kuiva- I : taan ja haihdutetaan. Jäännöstä hierretään pienessä mää- :· rässä kloroformia, sitten suodatetaan. Suodattimelle jää- — 30 nyt tuote pestään vähäisellä määrällä eetteriä ja kuiva- . ·. taan.

Sp. 140°C:sta alkaen (hajoaa), NMR- ja massaspektri vastaavat ilmoitettua rakennetta.

10

Esimerkki 5 8 G 0 31

Fmoc- Phe- NH- (CH2) 4- NH- CO- O- CH2 O- CH2- CO- (4- metyylibentshydryyliamiinihartsi) 5 1,4 g esimerkissä 4 saatua Fmoc-fenyylialaniini-speiserhappoa liuotetaan yhdessä HOBtsn (350 mg) kanssa 40 ml:aan vedetöntä DMF ja liuos lisätään 3,66 g:aan 4-me-tyylibentshydryyliamiinihartsia (nova Biochem, lataus 10 0,4 mmol/g). Tämän jälkeen lisätään 0,6 ml di-isopropyy- likarbodi-imidiä ja seoksen annetaan reagoida samalla koko ajan sekoittaen. Reaktion päätyttyä tuote imusuodate-taan, pestään DMF:11a, isopropanolilla, CH2Cl2:lla ja tert.butyylimetyylieetterillä ja kuivataan suurvakuumis-15 sa. Lataus alkuaineanalyysin (N-määritys) mukaan on: 0,3 mmol/g.

Esimerkki 6 2 4 23 /cles-Tyr , des-Arg y-r-atriopeptiini-III-(4- amino)butyyliamidin synteesi 20 Peptidisynteesi tapahtuu 1 g:lie edellä saatua hartsia käyttäen Fmoc-aminohappo-OOBt-estereitä automaattisen peptidisyntetisoijän malli 430A (firma Applied Biosystems) ja itse modifioitujen synteesiohjelmien avulla .

25 Tällöin valmistajan tuottamiin patruunoihin punni- taan kulloinkin 1 mmol vastaavaa aminohappo johdannaista, Fmoc-Arg (Mtr)-OH: ta, Fmoc-Asn-OH:ta ja Fmoc-Gln-OH: ta : yhdessä HOBt:n (1,5 mmol) kanssa. Näiden aminohappojen esiaktivointi suoritetaan suoraan patruunoissa ja liuotta-30 maila 4 ml:aan DMF ja lisäämällä 2 ml 0,55-m di-isopropyy-likarbodi-imidin DMF-liuosta. HOObt-esterit liuotetaan 6 ml:aan DNF ja pumpataan sitten samoin kuin in situ esi-: aktivoidut aminohapot, arginiini, asparagiini ja gluta- ·:·. miini etukäteen 20-%:isella piperidiinin DNF-liuoksella 35 suojaryhmistä vapautetulle hartsille. In situ aktivoidut -...· aminohapot kytkeytyvät kaksinkertaisesti.

il 3G331

Synteesin päätyttyä peptidi-butyyliamidi lohkaistaan hartsista ja samanaikaisesti poistetaan sivuketjujen suojaryhmät trifluorietikkahapolla, joka sisältää kationin-sitojana tioanisolia ja m-kresolia. Trifluorietikkahapon 5 haihduttamisen jälkeen saatua jäännöstä hierretään useita kertoja etyyliasetaatissa ja sitten seos lingotaan. Saatua raakapeptidiä käsitellään kysteiinisuojaryhmän poistamiseksi tributyylifosfiinilla trifluorietanolissa. Liuottimen poistamisen jälkeen hierretään jälleen etyyliasetaa-10 tissa ja lingotaan. Pelkistynyt raakapeptidi hapetetaan heti jodilla 80-%:isessa vesipitoisessa etikkahapossa, ylimääräinen poistetaan askorbiinihapolla, reaktioseos haihdutetaan pieneen tilavuuteen ja siitä poistetaan suo- £ lat 1-n etikkahapon vesiliuoksella Sephadex G25 :11a. Puh-15 dasta peptidiä sisältävät fraktiot yhdistetään ja kylmä-kuivataan .

Aminohappoanalyysin mukaan peptidin aminohappokoostumus vastaa ilmoitettua kaavaa.

Esimerkki 7 20 4-hydroksimetyylifenoksietikkahappofenasyyliesteri 182 g 4-hydroksimetyylifenoksietikkahappoa ja 199 g (X-bromiasetofenonia liuotetaan 600 ml:aan vedetöntä DMF ja liuokseen tiputetaan sitten 0°C:ssa nopeasti 138 ml trietyyliamiinia. Seosta sekoitetaan ja sen annetaan 25 lämmetä yön yli huoneen lämpötilaan. DMF-liuos kaadetaan 3,5 litraan vettä ja vesifaasi uutetaan etyyliasetaatil-la. Orgaaninen faasi pestään vedellä, kuivataan natrium-sulfaatilla ja haihdutetaan. Haihdutettaessa liuoksesta saostuu tuote. Se imusuodatetaan, pestään etyyliasetaat-30 ti/n-heksaaniseoksella 1:1 ja kuivataan suurvakuumissa.

Sp. 94 - 95°C, NMR vastaa ilmoitettua rakennetta.

12 ΰϋ031

Esimerkki 8 ο2ν O O-CO-O-CH2 o- ch2- co2- ch2- co^> 5 30 g 4-hydroksimetyylifenoksietikkahappofenasyyli- «* r ·. I.«· t i il liuoiltaan mu.) jdktMMiiMiia '>00 miinan TllF/py r id i i n i -seosta 1:1 ja liuos jäähdytetään -20°C:seen. Sitten siihen tiputetaan kloorimuurahaishappo-p-nitrofenyyliesterin (21 g) liuos 100 ml:ssa THF. 30 minuutin sekoittamisen 10 jälkeen samassa lämpötilassa seoksen annetaan lämmetä 0°C:seen ja se sekoitetaan 1 litraan kyllästetyn NaCl-vesiliuoksen ja veden 1:1 seosta 0°C:ssa ja sekoittamista jatketaan lisäyksen päätyttyä vielä 30 minuuttia. Sakka imusuodatetaan, pestään jäävedellä, kuivataan ja hier-15 retään n-heksaanissa.

Sp. 142 - 145°C, NMR vastaa ilmoitettua rakennetta.

Esimerkki 9

Fmoc-Phe-NH- (CH2)q-NH-CO-0-CH2 0-CH2-C02- 20 ch2-co^J^ 9,3 g esimerkissä 8 valmistettua yhdistettä, 12,25 g Fmoc-Phe-NH-(CH2)g-NH2~trifluoriasetaattia ja 25 3,26 g HOObt:tä lisätään kiinteinä kolviin, sitten kol- viin kaadetaan 2,58 g etyylidi-isopropyyliamiinia 100 ml:ssa vedetöntä DMA. Seosta sekoitetaan 3,5 tuntia 40°C:ssa, sitten seos sekoitetaan 500 ml:aan kyllästetty NaCl-vesiliuos/vesiseosta 1:1. Saostunut sakka imusuo-: .. 30 datetaan, pestään jäävedellä, kuivataan ja hierretään ee tte r i / e t yy 1 ia se t aa tt i seokses sa.

Sp. 147 - 150°C, NMR- ja massaspektri vastaavat : ilmoitettua kaavaa.

-· Seuraavat yhdisteet (esimerkit 10 - 14) valmiste- 35 taan analogisesti esimerkin 9 kanssa: 13 83031

Esimerkki 10

Fmoc-Phe-NH-(CH2)4-NH-C0-0-CH2 O-CH2-CO2-CH2- CO^> 5

Sp. 144 - 147°C, NMR- ja massaspektri vastaavat ilmoitettua kaavaa.

Esimerkki 11

Fmoc-Ala-NH- (CH2)8-NH-C0-0-CH2 \V O-CH2-CO2-CH2 10 -CO^p)

Sp. 179 - 181°C, NMR- ja massaspektri vastaavat ilmoitettua kaavaa.

15 Esimerkki 12

Fmoc-NH-(CH2)8-NH-c0-0-CH2 ^ 0-CH2-C02-CH2-

CO-Q

20 Sp. 144 - 145°C, NMR- ja massaspektri vastaavat ilmoitettua kaavaa.

Esimerkki 13

Fmoc- NH- (CH2)6-NH-C0-0-CH2 O-CH2-CO2-CH2- .·. 25 00-^3

Sp. 172 - 175°C, NMR-spektri vasta ilmoitettua : l I kaavaa.

· Esimerkki 14 30 Fmoc-NH-(CH2)4-NH-CO-0-CH2O-CH2-CO2-CH2- co-f?)

Sp. 165 - 166°C, NMR-spektri vastaa ilmoitettua ra-35 kennetta.

Esimerkki 15 14 33031

Fmoc-Phe-NH-<CH2)8-NH-C0-0-CH2 0-CH2-C02H

5 8,4 g yhdistettä Fmoc-Phe-NH-(CH2)8"N^“C0"^'CH2 -T \Vo-CH2-CO2-CH2-CO suspendoidaan jääetikkahapon ö 10 (150 ml) ja dikloorimetaanin (50 ml) seokseen ja suspen sioon lisätään annoksittain 12 g sinkkijauhetta, joka sitä ennen on aktivoitu pesemällä 1-n kloorivetyhapolla ja vedettömällä etanolilla. Joidenkin minuuttien kuluttua suspensio hieman lämpenee ja muuttuu paksummaksi ja vai- 15 keasti sekoitettavaksi. Sen vuoksi lisätään vielä 80 ml jääetikkahappoa ja 50 ml dikloorimetaania ja sekoittamista jatketaan yön yli. Sitten seos suodatetaan kirkastus-suodattimella, pestään jääetikkahapolla ja dikloorimetaa-nilla. Suodos haihdutetaan, jäännöksenä saatu öljy liuo- 20 tetaan pieneen määrään dikloorimetaania ja liuosta sekoitetaan etyyliasetaatin ja eetterin kanssa. Saostunut tuote imusuodatetaan ja kuivataan suurvakuumissa.

Sp. 160°C:sta alkaen (hajoaa), NMR- ja massaspek-trit vastaavat ilmoitettua rakennetta.

25 Esimerkissä 15 kuvatulla menetelmällä valmistetaan myös esimerkkien 16 - 18 yhdisteet: '.;. ‘ Esimerkki 16

Fmoc-Phe-NH-(CH2)4-NH-CO-O-CH2-^ ^-O-CH2-C02H

·*· . 30 Sp. 150°C:sta alkaen (hajoaa), NMR- ja massaspek- tr it vastaavat ilmoitettua rakennetta.

Esimerkki 17

: Fmoc-Phe-NH- (CH2)q-NH-CO-O-CH2-^r~^-Q-CH2-CQ2H

35 Sp. 160°C:sta alkaen (hajoaa), NMR- ja massaspek- - - trit vastaavat ilmoitettua rakennetta.

n

Esimerkki 18 30031

Fmoc-NII- (CH2)8-NII-C0-0-Cll2"<^^> O-CH2-CO2II

5 Sp. 1r>4°(’:sta alkaen (hajoaa), NMK- ja inassaspek t r i 1 vastaavat ilmoitettua rakennetta.

Esimerkki 19

Fmoc-NH- ( CH2 ) 6- NH- CO- O- CH2 O- CH2- C02CH3 10 Synteesi suoritetaan analogisesti esimerkin 2 kans sa. Sp. 115 - 118°C, NMR- ja massaspektrit vastaavat ilmoitettua rakennetta.

Esimerkki 20 nh2- (ch2)6-nh-co-o-ch2^7-o-ch2-co2h 15

Yhdiste valmistetaan esimerkissä 3 kuvatulla menetelmällä. Sp. 184 - 187°C (hajoaa), NMR- ja massaspektrit vastaavat ilmoitettua rakennetta.

Esimerkki 21

20 Fmoc-Phe-NH- (CH2) 6-NH-C0-0-CH2-^^-0-CH2-C02H

Synteesi suoritetaan analogisesti esimerkin 4 kanssa. Sp. 120°C:sta alkaen (hajoaa), NMR- ja massaspektrit vastaavat ilmoitettua rakennetta.

Claims (4)

16 83031

1. Yhdiste, jolla on kaava (I)

5 Y>-^2 A-[B]p-NH-[X]m-NH-C0-0-CH2 W-C02-V (I) γ3 γ4 jossa 10. on vety tai 9-fluorenyylimetyylioksikarbonyyli, B on Phe tai Ala, X on C1.12-alkyleeni, Y1, Y2, Y3 ja Y4 ovat vetyjä, V on vety, mahdollisesti bentsoyyliryhmällä substituoitu

15 C^-alkyyli tai bentsyyli, W on -0-CH2-, m on 1 ja p on kokonaisluku 0 tai 1.

2. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 mukaisen yhdis- 20 teen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että a) yhdiste, jolla on kaava γΐ γ2 R-CO-0-CH2~^ ^-W-C02-v 25 γ3 Y4 jossa R on halogeeni tai aktivoitu aryylioksi, V on mahdollisesti bentsoyyliryhmällä substituoitu C^.j- 30 alkyyli tai bentsyyli ja W, Y1, Y2, Y3 ja Y4 merkitsevät edellä määriteltyä, saatetaan reagoimaan yhdisteen kanssa, jolla on kaava Α-[Β]μ-ΝΗ-[Χ]„-ΝΗ2 jossa 35. on 9-fluorenyylimetyy1ioksikarbonyy1i ja B, X, p ja m merkitsevät patenttivaatimuksessa 1 määri- 17. si teltyä, ja näin saadusta suojatusta kaavan I mukaisesta yhdisteestä mahdollisesti lohkaistaan toinen tai molemmat suojaryhmistä A ja/tai V, jolloin muodostuu vapaa NH2- ja/tai C02H-ryhmä, tai 5 b) kaavan I mukainen yhdiste, jossa A on vety, p = 0 ja B, X, Y1, Y2, Y3, Y4, V, W ja m merkitsevät patenttivaatimuksessa 1 määriteltyä, saatetaan reagoimaan yhdisteen kanssa, jolla on kaava A-[B]p-0H 10 jossa B merkitsee edellä määriteltyä ja A on 9-fluorenyy-limetyylioksikarbonyli ja p = 1, tai tämän yhdisteen ak-tiiviesterin, halogenidin tai atsidin kanssa ja kun V ei ole vety, V mahdollisesti lohkaistaan, jolloin muodostuu karboksyyliryhmä.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukaisen sellaisen kaavan 1 mukaisen yhdisteen käyttö, jossa V on vety ja A ei ole vety, kiinteäfaasisynteesissä, jolla valmistetaan yhdisteitä, joilla on kaava P-NH-[X]„-NH2 20 jossa P on peptiditähde, joka on muodostunut a-amino-hapoista ja X ja m merkitsevät patenttivaatimuksessa 1 määriteltyä.

4. Menetelmä kaavan P-NH-[Χ]_-ΝΗ2 mukaisen peptidin valmistamiseksi kiinteäfaasisynteesillä, jossa kaa-25 vassa P, X ja m merkitsevät patenttivaatimuksessa 3 määriteltyä, tunnettu siitä, että patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdiste, jolla on kaava I, jossa A ei ole vety ja V on vety, kytketään hartsiin, suojaryhmä A lohkaistaan, asteittain kytketään emäslabiileilla tai heik-30 kojen happojen suhteen labiileilla aminosuojaryhmillä väliaikaisesti suojattuja a-aminohappoja mahdollisesti aktivoidun johdannaisensa muodossa ja kaavan P-NH-[X].-NH2 mukaisen peptidin kokoamisen päätyttyä peptidi vapautetaan hartsista käsittelemällä keskivahvalla tai vahvalla 35 hapolla, jolloin samanaikaisesti tai jälkeenpäin sopivin toimenpitein peptidiin väliaikaisesti liitetyt sivuketjujen suojaryhmät jälleen lohkaistaan. 18 *S«1