DK172398B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af beskyttede argininholdige peptider - Google Patents

Description

o DK 172398 B1 i

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af beskyttede argininholdige peptider ved fragmentkobling, ved hvilken i det mindste ét ar-gininholdigt fragment ved den pågældende fragmentkobling 5 omsættes som perchlorat.

I forbindelse med den foreliggende opfindelse kan argininholdige fragmenter være: 1. Arginin, hvis COOH eller hvis ct-NI^-gruppe eventuelt er beskyttet med en inden for peptidkemi- 10 en gængs beskyttelsesgruppe, eller 2. segmenter, der indeholder arginin og yderligere aminosyrer, og hvis funktionelle gruppe(r) e-ventuelt er beskyttet med beskyttelsesgruppe(r) . der er gængs inden for peptidkemien. Egnede 15 beskyttelsesgrupper er f.eks. beskrevet i

Schroder, Liibke, The Peptides, bd. 1, Academic Press, New York, 1965, 3-75 og 137-270. Fragmentkoblingen sker ved hjælp af standardmetoder, såsom f.eks. anført i Perspectives in Peptide 20 Chemistry, udg. Eberle m.fl., Karger, Basel, 15-155 (1981). Foretrukken er koblingen i nærvær af carbodiimider, såsom N,N1-dicyclohexylcarbodiimid, N,N'-di-tert.butylcarbodi-imid, N,N'-diisopropylcarbodiimid, N-ethyl-N'-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid eller N,Ν'-bis-(4-nitrophenyl)-25 carbodiimid, eventuelt ved tilsætning af N-hydroxysuccin-imid, 1-hydroxybenzotriazol, 3-hydroxy-4-oxo-3,4-dihydro--1,2,3-benzotriazin eller andre racemiseringssænkende forbindelser. Koblingen kan foregå både "klassisk" i opløsning og ved faststofmetoden (Merrifield) med et under 30 synteseforløbet til en harpiks covalent bundet fragment.

Anvendelsen af højere, ved sidekæderne beskyttede peptider som mellemprodukter ved peptidsyntesen vanskeliggøres ofte på grund af disses tunge opløselighed.

Ofte er disse peptider så uopløselige, at en videre syn-35 tese må lades ude af betragtning. Den dårlige opløselighed forøger reaktionsvarigheden og forringer udbyttet.

O

DK 172398 B1 2

Disse vanskeligheder optræder f.eks. ved syntese af sekre- tin.

Sekretin, der er et hormon fra duodenum, er et heptacosapeptid med formlen 5 H-His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Glu-Leu-Ser-Arg-Leu-Arg-Asp—Ser—Ala—Arg—leu—Gln-Arg-leu—leu-Gln—Gly—Leu-Val-NHg [Eur. J. Biochem. 15, 513-519 (1970)]. Sekretin stimule-10 rer bugspytkirtlens bicarbonatproduktion og hæmmer den gastrinstimulerende mavesyresekretion.

Sekretin er tidligere blevet trinvis syntetiseret under anvendelse af p-nitrophenylester-metoden [J.

Am. Chem. Soc. 89, 6753-6757 (1967)] og af "Repetitive 15 Excess Mixed Anhydride"-(REMA)-metoden [Helv. Chim. Acta 59, 1112-1126 (1976)]. Anvendelsen af segmenter til syntese af sekretin kræver så vidt muligt racemiserings-frie koblingsmetoder. Således kan man allerede ved hjælp af acid-metoden [J. Am. Chem. Soc. 90, 4711-4715, 20 (1968)] og af dicyclohexylcarbodiimid/N-hydroxysuccini- mid-(DCC/HONSu)-metoden [Chem. Ber. 105, 2508-2514 (1972)] opbygge sekretin. Andre varianter af DCC-koblingen består i anvendelsen af racemiseringssænkende og opløselig-hedsformidlende tilsætningsstoffer, såsom 1-hydroxybenzo-25 triazol (HOBt) og 3-hydroxy-4-oxo-3,4-dihydro-l,2,3-benz-triazin (HOObt) [Chem. Ber. 107, 215-231 (1974); Gut Hormones, udg. S.R. Bloom, 165-168 (1978)]. Sekretinsynte-se på fast fase er beskrevet i Int. J. Peptide Protein Res. 9, 63-70 (1977) .

30 Den største vanskelighed ved de ovennævnte seg mentkoblinger udgør fragmenternes tunge opløselighed, som på grund af reaktanternes store fortynding nødvendiggør lange reaktionstider og overskud af det N-endestillede fragment. Ved hjælp af foraktivering af de N-endestil-

OC

lede fragmenter med DCC/HOObt kan reaktionstiden og for det meste også reaktionsvolumen formindskes noget [Gut

O

3 DK 172398 B1

Hormones, udg. S.R. Bloom, 165-168 (1978)].TDer opstår desuden store vanskeligheder ved fraspaltning af den benzyloxycarbonylgruppe (Z), der anvendes til den midlertidige aminobeskyttelse, ved hjælp af katalytisk hy-5 drogenering. Også her er tungtopløselighed hovedårsagen. Da eddikesyre, når det er muligt, bør undgås som opløsningsmiddel (eddikesyre er vanskelig at fjerne fra basiske peptider og foranlediger ved fragmentkobling acetylering af aminogrupperne), må man tage kostbare 10 opløsningsmidler, såsom f.eks. trifluorethanol, i brug [Gut Hormones, udg. S.R. Bloom, 167 (1978)].

Det har nu overraskende vist sig, at syntesen af beskyttede argininholdige peptider ved kobling af det ofte tungtopløselige fragment lettes væsentligt, når man 15 ved koblingen ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvender mindst én peptidkomponent som perchlorat. Per-chlorater af basiske peptider har en udmærket opløselighed i polære opløsningsmidler, såsom f.eks. dimethyl-formamid eller dimethylacetamid, hvilket er yderst for-20 delagtigt for yderligere reaktioner og forbedrer volumenudbyttet. Et egnet reagens til indførelse af perchlo-ratet er foruden perchlorsyren perchlorater af egnede aminer, fortrinsvis pyridiniumperchlorat, som i modsætning til den vandholdige perchlorsyre kan afvejes vand-25 frit [Ber. dtsch. chem. Ges. 59, 448-455 (1926)]. Perchlorat ionen bindes til den stærkt basiske guanidino-gruppe, og det frigjorte pyridin indgår i opløsningsmidlet. Således kan argininholdige peptiders opløselighéd forøges stærkt ved tilsætning af pyridiniumperchlorat og 30 derved bringes til reaktion. Således kan det yderst tunrigt-opløselige Z-Thr(But)-Ser(But)-Glu-(0Bufc)-Leu-Ser(Bufc)--Arg-Leu-OH foraktiveres ved tilsætning af pyridiniumperchlorat med DCC og HOObt i dimethylacetamid. Også det i organiske opløsningsmidler praktisk talt uopløse-35 lige arginin kan acyleres ved tilsætning af pyridiniumper-chlor. Med arginin-hydrochlorid er dette ikke muligt.

O

DK 172398 B1 4

Perchlorat-ionerne egner ikke kun til forøgelse af opløseligheden, men de beskytter også guanidino-gruppen mod acylering. Det ljar således vist sig, at pyridi-niumperchlorat er et udmærket additiv·.;, til protonering 5 af guanidinogruppen ved fastfasesyntese under anvendelse af Fmoc-aminosyrer, medens saltsyre som bekendt ikke egner sig til dette formål ,[jfr. E. Atherton, R.C. Sheppard og D. Wade, J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1060-1062 (1983)].

10 Fortrinsvis anvendes en fremgangsmåde til frem

stilling af et beskyttet sekretinderivat med formlen I

R-His(R1)-Ser(But)-Asp(OBut)-Qly-Thr(But)-Phe-Thr(But)-Ser(But)-Glu(OBut)-Leu-Ser(But)-Arg(HC10il)-Leu-Arg(HC10ll)-15 Asp(0But)-Ser(But)-Ala-Arg(HC10|})-Leu-Gln-Arg(HC10ij)-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-NH2 (I)» hvor (a) R og R*- er Boc-resten, eller (b) R er Boc-resten, og R^ er hydrogen, eller 20 (c) R og R^ er adamantyloxycarbonyl-resten, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at et peptid med formlen H-X-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-NH2 Ila 25 hvor X er -Arg(HC104)-, -Arg (HC104) -Leu-Gln-Arg (HC1C>4) --Arg (HC104) -Asp (OBu1) -Ser (Bu1) -Ala-Arg (HC1C>4) -30 -Leu-Gln-Arg(HC104) eller -Thr(Bu1)-Ser(Bu1)-Glu(OBu1)-Leu-Ser(Bu1)-Arg (HC104)-Leu-Arg(HC104)-Asp(OBu1)-Ser(Bu1)--Ala-Arg(HC104)-Leu-Gln-Arg(HC104)-, under tilsætning af 3-hydroxy-4-oxo-3,4-dihydro-l,2,3-35 -benzotriazin (HOObt) ved "én-beholdermetoden" omsættes med de tilsvarende peptider med fri carboxylgruppe i po-

O

DK 172398 B1 5 lære opløsningsmidler, såsom f.eks.. dimethylacetamid med dicyclohexylcarbodiimid og de nødvendige mængder af en tertiær base, som f.eks. N-ethylmorpholin, og at de således syntetiserede peptider udfældes fra vand som per-5 chlorater under tilsætning af tilsvarende mængder per-chlorsyre og eventuelt af et perchlorat som NaClO*.

Den hydrogenolytiske fraspaltning af Nn-ni-trobeskyttelsesgruppen for arginin i perchlorsyre er kendt fra J. Amer. Chem. Soc. 101, 1569-1576 (1979).

10 Særlig foretrukken er en fremgangsmåde, der er ejendommelig ved, at det ovennævnte peptid med formlen Ila fås ved hydrogenering af benzyloxycarbonyl-hol-dige fragmenter med formlen

15 Z-X-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-NH2 II

hvor X er -Arg(Z2)-, -Arg(Z2)-Leu-Gln-Arg(HC10^)-,

Arg(Z2)-Asp(0But)-Ser(But)-Ala-Arg(HClO^J-Leu-Gln-Arg (HCIO^) - eller -Thr (Bu*") -Ser (But) -Glu 20 (OBut)-Leu-Ser(But)-Arg(HC104)-Leu-Arg(HCl04)-

Asp (OBut) -Ser (But) -Ala-Arg (HC1C>4) -Leu-Gln-Arg(HC104)-, i dimethylacetamid under tilsætning af en palladiumkatalysator, idet pH-værdien ved tilsætning af en perchlor-25 syre-holdig opløsning holdes mellem 4 og 6, og dette omsættes yderligere på den ovenfor beskrevne måde. Det er også muligt at tilsætte ækvivalente mængder pyridi-niumperchlorat, når der ikke kan anvendes en autotitra-tor.

30 Ved hydrogeneringen af

Z-Arg(Z2)-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-NH2 III

er der hidtil anvendt iseddike som opløsningsmiddel [Chem.

35 Ber. 104, 2441 (1971)]. Der blev anvendt ca. 350 ml iseddike til 10 mmol af stoffet. For helt at fjerne eddi-

O

DK 172398 B1 6 kesyren, hvad der er nødvendigt for at forhindre en ace-tylering i det næste peptiddannelsestrin, skal der tilsættes mindst 2 ækvivalenter HBr eller HC1, og derefter skal der flere gange under tilsætning af pyridin fældes 5 ud fra methanol og eddikesyreester eller diisopropylether.

En katalytisk hydrogenering ville derfor være mere formålstjenlig i opløsningsmidler såsom methanol eller dime-thylacetamid under tilsætning af HC1 eller HBr. Sådanne forsøg mislykkedes på grund af den tungtopløselige for-10 bindelse med formlen III i de ovennævnte opløsningsmid-, ler. Heller ikke suspensioner gik under hydrogeneringen i opløsning. Det er derfor overraskende, at forbindelsen med formlen III, der praktisk taget er uopløselig i dime-thylacetamid, under tilsætning af perchlorsyre under hy-15 drogenerinqen hurtigt opløses under dannelse af

H-Arg(HC104)-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-NH2 HC1C>4 IV

Til 10 mmol af forbindelsen med formlen II kræves kun 120 20 ml dimethylacetamid, altså ca. en tredjedel af den ovenfor beskrevne mængde eddikesyre. Foruden den enklere oparbejdning har det således udvundne peptid-diperchlorat med formlen IV den fordel, at det er lettere opløseligt i polære opløsningsmidler, såsom dimethylacetamid og di-25 methylformamid. Således anvendes ved reaktion af

Z-Arg(Z2)-Leu-Gln-OH

med det tilsvarende peptid-dihydrobromid [Chem. Ber. 104, 30 2443-2444 (1971)] til 10 mmol ca. 650 ml dimethylforma- mid som opløsningmiddel, medens en tilsætning på 10 mmol med peptid-diperchlorat med formlen IV kun kræver 70 ml dimethylacetamid, altså ca. en tiendedel opløsningsmiddel. Herved forkortes reaktionstiden fra 7 dage til få timer, 35 og volumenudbyttet forøges væsentligt.

Noget lignende gør sig også gældende med de an-

O

DK 172398 B1 7 dre fragmenter. Ved katalytisk hydrogenering af Z-Arg(Z2)-Leu-Qln-Arg(HC10]j)-I*eu-Leu-Gln-Qly-Leu-Val-NH2 v 5 til H- Arg (HClOjj) -Leu-Gln-A rg (HCIO^) -Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-NH2 HCIO^j

10 VI

går man frem som med III. Til 10 mmol behøver man ca.

220 ml dimethylacetamid, medens det tilsvarende hydro-bromid [Chem. Ber. 104, 2444 (1971)] til 10 mmol kræver 15 1540 ml iseddike.

Ved kondensation af 10 mmol af forbindelsen med formlen VI med Z-Arg(Z2) -Asp (OBu*·) -Ser (But) -Ala-OH anvendes kun 45 ml dimethylacetamid som opløsningsmiddel, medens omtrent samme portion af det tilsvarende 20 decapeptid-trihydrochlorid kræver 70 ml opløsningsmiddel [Gut Hormones, udg. S.R. Bloom, 166 (1978)]. Den katalytiske hydrogenering af det således opnåede tetra-decapeptid Z-A rg (Z 2) -Asp (OBu*) - Se r (Bu15) -Ala- A rg (HClOj,) -Leu-Gln-A rg 25 (HC10j|)-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-NH2

VII

til 30 f * H-Arg(HC102j)-Asp(0Bux')-Ser(Bu/-Ala-.Arg(HC10jj)-Leu-Gln-Arg(HC10Jl)-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-NH2 HCIO^

VIII

35 foregår igen uden problemer i dimethylacetamid (10 mmol i 250 ml), medens 10 mmol af det tilsvarende dihydrobro-

O

DK 172398 B1 8 mid hydrogeneres i 2000 ml 80%'s eddikesyre (Chem. Ber.

104, 2450 (1971)] og dihydrochloridet i det kostbare trifluorethanol (Gut Hormones, udg. S.R. Bloom, 167 (1978)] .

5 Det tungtopløselige

Z-Thr (Bu*") -Ser (But) -Glu (OBu**) -Leu-Ser (But) -Arg-Leu-OH

opløses let i nærvær af forbindelsen med formlen VIII, 10 således at også her kondensationen til Z-Thr(Bi2t)-Ser(But)-Glu(0But)-Leu-Ser(But)-Arg(HC10ii)-

Leu-ArgiHClOj^-AspCOBu^-Ala-ArgCHClOiP-Leu-Gln-

ArgiHClO^-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-NHg

15 IX

ved "énbeholder-metoden" er mulig i et lille volumen opløsningsmiddel . En anvendt mængde på 10 mmol kan let gennemføres i 200 ml af en dimethylformamid/dimethylacet-20 amid-blanding, medens en analog mængde med det tilsvarende tetrahydrobromid kræver mere end 500 ml opløsningsmiddel [Chem. Ber. 107, 230 (1974)].

Den katalytiske hydrogenering af forbindelsen med foifmlen IX til 25 H-Thr (But) -Ser (Bufc) -Glu (OBut) -Leu-Ser (Bu*1) -Arg (HC104) -Leu -ArgiHClO^) -Asp(OBut) -Ser (Bu*") -Ala-Arg (HCIO^,) -Leu-Gln-Arg (HC104) -Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-NH2 HC1C>4

X

30 er mulig i dimethylacetamid som ved de ovenfor beskrevne benzyloxycarbonyl-segmenter. 1 g af forbindelsen med formlen IX opløses let i 10 ml dimethylacetamid. Til 1 g af det tilsvarende tetrahydrobromid kræves til opløsning 35 ca. 140 ml af en blanding af methanol/dimethylacetamid = 4:1 [Chem. Ber. 107, 231 (1974)] eller ca. 270 ml 80%'s eddikesyre [Chem. Ber. 105, 2512 (1972)].

O

DK 172398 B1 9

Omsætningen af forbindelsen med formlen X med

Boc-His-Ser (But) -Asp (OBu1) -Gly-Thr (Bu1) -Phe-OH

5 til forbindelsen med formlen Ib kræver pr. mmol ca. 40 ml af en blanding af dimethylformamid og dimethylacetamid = 1:1. Med det tilsvarende pentahydrobromid kræves mere end den dobbelte mængde opløsningsmiddel [Chem. Ber. 107, 231 (1974)], og ved anvendelse af DCC/N-hydroxysuccinimid 10 som kondensationsreagens forbruges ca. den femdobbelte mængde opløsningsmiddel [Chem. Ber. 105, 2513 (1972)].

Som opløsningsmiddel til den katalytiske hydrogenering af benzyloxycarbonyl-segmenterne, der foregår under anvendelse af en autotitrator ved pH 4-6, anvendes 15 fortrinsvis dimethylacetamid, eftersom perchlorsyreopløs-ninger i dimethylacetamid er mere stabile end i dimethyl-formamid. Formylresten fraspaltes let ved hjælp af per-chlorsyre under dannelse af dimethylamin. Også dimethylacetamid angribes langsomt af perchlorsyre. Anvendte 20 perchlorsyre/dimethylacetamid-opløsninger skal altså være frisk fremstillede. Man kan dog også, når vand ikke nedsætter opløseligheden for meget, overveje anvendelse af vandig perchlorsyre (1-2 N) til titrering af de frigjorte aminogrupper. Efter afsluttet hydrogenering fra-25 suges katalysatoren (Pd-katalysator på kul eller barium-sulfat)^ og filtratet inddampes. Remanensen kan udrives med egnede opløsningsmidler, såsom f.eks. eddikesyreester eller diisopropylester, hvorved der dannes for det meste amorfe bundfald, som kan frasuges. På trinnet 30 med peptiderne med formlen VI og VIII lønner en rensning af produkterne sig. Decapeptid-triperchloratet med formlen VI kan renses udmærket ved modstrømsfordeling mellem n-butanol og vand, medens tetradecapeptidtetraper-chloratet med formlen VIII renses ved hjælp af en gel-35 filtrering på en isopropyleret tværbundet dekstrangel i vand som elueringsmiddel. For at forhindre bakterievækst på 10 DK 172398 B1 o søjlen og i eluatet tilsættes "Chloreton" (1,1,1-tri-chlor-2.-methyl-2-propanol) indtil mætning. "Chloreton" kan efter rensning fjernes ved hjælp af ekstraktion med eddikesyreester.

5 Oparbejdningen efter er. segmentkobling med DCC

og HOObt er enkel. Når det er muligt, suges det udfældede dicyclohexylurinstof fra efter afsluttet reaktion, og Z-peptid-perchloratet fældes under tilsætning af den beregnede mængde perchlorsyre med vand. Dersom stoffet 10 udfældes, så at det er vanskeligt at filtrere, forvandler tilsætning af NaClO^ den mælkeagtige emulsion til en let filtrerbar suspension.

Opfindelsen angår desuden et peptid med formlen I, hvor R og har de ovenfor definerede betydnnin-15 ger.

Opfindelsen vil i det følgende blive nærmere forklaret ved hjælp af eksempler.

Eksempel 1 20 Η-Arg (HCIO^) -Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-NH^ HCIO^ 22 g (18,2 mmol) Z-Arg(Z^)-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-N^ suspenderes i 220 ml dimethylacetamid. Efter tilsætning af P.d/kul-katalysator hydrogeneres katalytisk på autotritator under tilsætninq af IN HC10. i di-25 methylacetamid ved pH 4,5. (IN HCIO^ i dimethylacetamid skal hver gang fremstilles frisk, da perchlorsyren langsomt hydrolyserer dimethylacetamid til dimethylamin og eddikesyre).

Fremstilling af ca. IN HC104 i dimethylacetamid: Til 800 ml godt afkølet dimethylacetamid tildryp-30 pes langsomt under omrøring 110 ml 60%'s HCIO^ (stærk varmetoning) og fyldes derpå op til 1000 ml med dimethylacetamid.

Efter afsluttet hydrogenering frasuges katalysatoren, og filtratet inddampes til ca. 100 ml. Pepti-35 det fældes med 600 ml eddikesyreester og frasuges. Derpå omrøres peptidet, som er meget hygroskopisk, endnu o 11 DK 172398 B1 engang med 600 ml eddikesyreester, suges fra og tørres i højvakuum over P2°5* Udbytte 18,2 g (92%), smeltepunkt: bliver skumagtigt ved 112-124°C, [a]^ = -30,7° (c = 1, 80%'s eddikesyre).

5 ^H-NMR-spektrum: ved S = 2,7-2,9 ses de to di methyl amidbånd. Mellem S - 1,9 og 2,0 ses dimethylami-dets og eddikesyreesterens acetylgrupper.

Analyse: Beregnet for C36H6gN1208*2 HC1°4· 0,8 dimethyl-acetamid.l H20 (molekylvægt 1085,68): 10 C 43,37, H 7,35, Cl 6,53, N 16,51, H?0 1,66

Fundet: C 43,3 , H 7,1 , Cl 6,5 , N 16,1 , H20 1,7 .

Eksempel 2 Z-Arg (ZQ -Leu-Gln-Arg(HCIO^) -Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-NH^ 15 Til en opløsning af 2,445 g (15 mmol) 3-hy- droxy-4-oxo-3,4-dihydro-l,2,3-benzotriazin (= HOObt) i 105 ml dimethylacetamid tilsættes ved 40°C under omrøring 12,24 g (15 mmol) Z-Arg(Z2)-Leu-Gln-OH (fintrevet). Efter at alt er opløst, får blandingen lov at nå stuetempe-20 ratur, og der tilsættes langsomt 16,93 g (15 mmol) H-Arg-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-NH2.2 HC104.1 H20.1,3 DMA. Der omrøres ved stuetemperatur, indtil alt er opløst. Herefter afkøles til 10°C (opløsningen begynder at blive tyk), og der tilsættes efter hinanden under omrøring 25 1,95 ml (15 mmol) N-ethylmorpholin og 3,9 g (18,9 mmol) dicyclohexylcarbodiimid. Blandingen får under omrøring lov at nå stuetemperatur. I reglen bliver blandingen fast efter ca. 4 timer. I enkelte tilfælde kan blandingen dog røres indtil næste dag. Blandingen henstår ved 30 stuetemperatur natten over, hvorefter der under omrøring tilsættes en blanding af 600 ml isvand og 15 ml 2N vandig perchlorsyre. Der omrøres i kulden i 15 minutter, hvorefter der frasuges og eftervaskes med vand. Bundfaldet omrøres derpå endnu engang med 300 ml vand i 1-2 35 timer ved stuetemperatur. Bundfaldet suges fra og vaskes med vand. Over P2°5 tørres, til vægten er konstant.

O

DK 172398 B1 12

Udbytte: 28 g (92%), smeltepunkt 222°C (i andre portioner findes også smeltepunkter på 240 eller 253-255°C).

[a] ^ = -27,1° (c = 1, 80%'s eddikesyre). Rotationsværdier for andre portioner: -27,8°,-28,9°, -27,4°).

5 Efter oparbejdning indeholder stoffet 1 molækv.

dicyclohexylurinstof.

Efter NMR indeholder stoffet 0,5 molækv. dime-thylacetamid og efter vandbestemmelse ifølge Fischer 3 molækv. vand.

10 Beregnet molekylvægt:

Peptidperchlorat 1697,40 Dicyclohexylurinstof 224,34 3 vand 54,048 0,5 dimethylacetamid 43,562 15 Molekylvægt ialt 2019,35

Eksempel 3 H-Arg(HClQ1)-Leu-Gln-Arg(HClOl)-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val- nh2.hcio1 20 27g(13,37 mmol) Z-Arg(Z2)-Leu-Gln-Arg-Leu-

Leu-Gln-Gly-Leu-Val-NH2.HCIO^.DC-urinstof.3 H20. 0,5 dimethylacetamid suspenderes i 300 ml dimethylacetamid.

Efter tilsætning af Pd/kul-katalysator hydrogéneres på autotitratoren under tilsætning af frisk fremstillet IN 25 HCIO^ i dimethylacetamid katalytisk ved pH 4,5. Efter afsluttet hydrogenering frasuges katalysatoren, og filtratet inddampes fuldstændig i højvakuum. Remanensen opløses i 150 ml vandig 0,02N HC1 mættet med n-butanol.

Der frafiltreres fra uopløselige bestanddele (hovedsage-30 lig DC-urinstof) og derpå i 7 trin modstrømsfordelt mellem 0,02N HCl og n-butanol. n-Butanolfasen skal være mættet med 0,02N HCl og 0,02N HCl skal være mættet med n-butanol. De enkelte trin kontrolleres i DC (DC: n-bu-tanol/pyridin/vand/iseddike = 60:20:24:6). De gode frak-35 tioner (vand 5-7 og n-butanol 4-7) kombineres og inddampes i højvakuum. Remanensen udrives med diisopropyl-

O

DK 172398 B1 13 ether og frasuges. Stoffet er først meget hygroskopisk.

Efter tørring over P2®5 ^ vakuum mister det denne egenskab. Udbytte 15,15 g (hovedfraktion). Bifraktionerne (vand 3-4 og n-butanol 2-3), som foruden forureninger 5 dog indeholder anseelige mængder af det ønskede peptid, inddampes adskilt og modstrømsfordeles som ovenfor i 100 ml-faseportioner. De anvendelige fraktioner (vand 3-7 og n-butanol 7) inddampes, udrives med diisopropyl'-* ether, frasuges og tørres i højvakuum over p2°5· For 10 at fjerne det forstyrrende vand anbefales en efterde- stillation med toluen før udrivning med diisopropylether. Udbytte 5,45 g (2. fraktion). Samlet udbytte 20,6 g (72%) .

[a]^ = -27,6° (c = 1, 80%'s eddikesyre).

15 Stoffet indeholder ifølge NMR 6 molækviva lenter dimethylacetamid, 0,75 molækvivalenter diisopropylether og ifølge vandbestemmelse ifølge Fischer 1,5 molækvivalenter I^O.

Beregnet molekylvægt: 20 Decapeptid.3 HCIO^ 1495,9 6 Dimethylacetamid 522,7 0,75 Diisopropylether 76,6 1,5 Vand 27,6

Samlet molekylvægt 2122,8 25

Eksempel 4 Z-Arg(Z^)-Aps(OBu^)-Ser(Bu^)-Ala-Arg(HClO^)-Leu-Gln-ArgtHClO^)-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-NH^ 8,73 g (9 mmol) Z-Arg(Z2)-Asp(OBu^j -Ser(But)-30 Ala-OH.O,5 1^0 og 1,47 g (9 mmol) 3-hydroxy-4-oxo-3,4--dihydro-1,2,3-benzotriazin (= HOObt)opløses i 45 ml dimethylacetamid. Under omrøring tilsættes 19,1 g (9 mmol) H-Arg-Leu-Gln-Arg-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-NH2 · 3 HC1C>4 (indeholder ifølge NMR 0,75 molækvivalent diisopropyl-35 ether og 6 molækvivalenter dimethylacetamid samt 1,5 molækvivalent t^O), hvorefter der opvarmes til 40°C,

O

DK 172398 B1 14 hvorved alt opløses. Derpå afkøles til 0°C, og der tilsættes 2,34 ml (18 mmol) N-ethylmorpholin. Reaktionsopløsningen skulle herved antage en gul farve (HOObt virker som indikator!). Dersom der ikke indtræffer noget 5 farveskift, indeholder decapeptidet fra modstrømsfordeling stadig for meget saltsyre, og der tilsættes forsigtigt yderligere N-Ethylmorpholin, indtil der sker et farveskift til gult. (Man bør undgå overskud af N-ethylmorpholin på grund af faren for racemisering). Derpå til-10 sættes 2,34 g (11,26 mmol) DCC, der omrøres i en time ved 0°C og tre timer ved stuetemperatur. Blandingen henstår natten over ved stuetemperatur. DC-kontrol med hensyn til fuldstændig omsætning i iseddike/n-butan-ol/vand = 1:3:1.

15 Blandingen stivner til en geléagtig masse, som udrives med 1000 ml vand under tilsætning af 4,5 ml 2N vandig perchlorsyre. Bundfaldet suges fra, vaskes godt med vand og tørres i vakuum over ^2*^5 ·

Udbytte 22,9 g (99%) . Stoffet indeholder 1 20 molækvivalent DC-urinstof. Smeltepunkt 194-200°C.

[a]^1 = 22,6° (c = 1, i 80%'s eddikesyre).

Eksempel 5 Η-Arg(HC104)-Asp(0But)-Ser(Bufc)-Ala-Arg(HCIO^)-Leu-Gln-25 Arg(HCIO^)-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-NH^.HCIO^ 37 g (14,4 mmol) Z-Arg (Z^) -Arg (0But) -Ser (Bu*") -Ala-Arg-Leu-Gln-Arg-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-NH2.2 HCIO^ (+ DC urinstof) opløses i 370 ml dimethylacetamid. Opløsningen forbliver uklar. Uden at filtrere tilsættes 30 Pd-katalysator, og der hydrogeneres under tilsætning af frisk fremstillet IN HCIO^ i dimethylacetamid eller vand på autotitratoren ved pH 4,5. Efter afslutning af hydro-generingen frasuges katalysatoren, og filtratet inddampes. Remanensen opløses i 60 ml vand, og det uopløse-35 lige filtreres fra (hovedsagelig DC-urinstof). Filtratet chromatograferes på "Sephadex LH 20". Som eluerings-

O

DK 172398 B1 15 middel anvendes vand, som er mættet med chloreton (chlor-eton fungerer som desinfektion og kan senere let fjernes). Søjledimension: ca. 4 m lang, diameter 8 cm. Fraskillelsen af de ninhydrin-positive forure-5 ninger er vigtig (som hovedforurening kan konstateres H-Arg-Asp(OBut)-Ser(But)-Ala-OH). DC-kontrol af eluatet i n-butanol/pyridin/vand/iseddike = 60:20:24:6. Det peptidholdige eluat ekstraheres til fjernelse af chloreton tre gange med eddikesyreester og frysetørres efter 10 afdestillation af den i vand opløste eddikesyreester.

Udbytte 17,73 g (55%).

[a]^ = -26,8° (c = 1, i 80%'s eddikesyre).

Ifølge analyse er stoffet et hexahydrat.

Analyse: Beregnet for C-^H^gCl^N^O^.6 H^O (2246,2): 15 C 41,17, H 7,09, Cl 6,31, N 16,21, H?0 4,82.

Fundet: C 41,3, H 7,1, Cl 6,4, N 16,0, H20 5,1.

Eksempel 6 Z-Thr(Bufc)-Ser(Bu*)-Glu(OBut)-Leu-Ser(But)-Arg(HC101)-20 Leu-Arg (HC104) -Asp (OBu11) -Ser (Bu*1) -Ala-Arg (HC104) -Leu-Gln-Arg(HCIO^)-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-NH^ (a) 1,2 g (1 mmol) Z-Thr(But)-Ser(But)-Glu(OBut)-

Leu-Ser(But)-Arg-Leu-OH.2 H20 og 163 mg (1 mmol) 3-hy-droxy-4-oxo-3,4-dihydro-l,2,3-benzotriazin (= HOObt) 25 suspenderes i en blanding af 10 ml dimethylacetamid og 10 ml dimethylformamid.· Dertil sættes ved stuetemperatur 2,24 g (1 mmol) H-Arg-Asp(OBu^)-Ser(Bu^)-Ala-Arg-Leu-Gln-Arg-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-NH2.4 HCIO^.6 H20.

Herved indtræder opløsning. Nu tilsættes 0,26 ml (2 30 mmol) N-ethylmorpholin og en opløsning af 440 mg (2,13 mmol) dicyclohexylcarbodiimid (= DCC) i 5 ml dimethyla-acetamid ved stuetemperatur. Der omrøres i ca. 4 timer ved stuetemperatur, og blandingen henstår natten over ved stuetemperatur. Om muligt (hvis opløsningen ikke 35 er blevet geléagtig) frasuges næste dag fra DC-urinstof-fet, og filtratet omrøres med 200 ml vand, hvortil der o 16 DK 172398 B1 i forvejen er tilsat 1 ml 2N HCIO^ (2 mmol). Peptidet udfældes emulsionsagtigt. Ved tilsætning af 4 ml af en 50%'s vandig NaClO^-opløsning fnugger peptidet godt ud.

Det frasuges og vaskes med lidt vand.

5 Udbytte efter tørring over P2°5: 3'17 9 (96/5%).

[a]^ = -17,8° (c = 1, i 80%'s eddikesyre).

(b) Til en suspension af 600 ml (0,5 mmol) Z-Thr-(But)-Ser(But)-Glu(OBut)-Leu-Ser(But)-Arg-Leu-OH.2 H20 i 0,5 ml dimethylacetamid sættes 90 mg (0,5 mmol) pyri-10 diniumperchlorat og 81,5 mg (0,4 mmol) HOObt . Når alt er opløst, tilsættes 412 mg (2 mmol) DCC, hvorefter der omrøres i 2 timer ved stuetemperatur. I mellemtiden opløses 1,07 g (0,5 mmol) H-Arg-Asp(OBufc)-Ser(Bufc)-Ala-Arg-Leu-Gln-Arg-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-NH2.4 HCIO^.

15 6 H20 i 5 ml dimethylacetamid. I denne opløsning suges ovennævnte blanding over et lille filter, vaskes med lidt dimethylacetamid, hvorefter der tilsættes 0,13 ml (1 mmol) N-ethylmorpholin og omrøres i 2 timer ved stuetemperatur. Derefter udfældes peptidet ved tilsætning 20 af 100 ml vand. Peptidet fracentrifugeres og tørres.

Udbytte: 1,21 g.

Eksempel 7 H-Thr(BuL)-Ser(Bu )-Glu(OBu )-Leu-Ser(Bu^)-Arg(HC104)-25 Leu-Arg (HCIO^) -Asp (OBu*') -Ser (Bu*~) -Ala-Arg (HCIO^) -Leu-

Gln-Arg(HCIO^)-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-NH^.HCIO^ 3,3 g (ca. 1 mmol) beskyttet Z-sekretin-(7-27)-heneikosapeptidtetraperchlorat (formel se ovenfor) opløses i 33 ml dimethylacetamid, tilsættes Pd/kul-ka-talysator og hydrogeneres katalytisk ved tilsætning af frisk fremstillet IN HCIO^ i dimethylacetamid eller vand på autotitratoren ved pH 4,5. Efter afsluttet reaktion frasuges katalysatoren, og filtratet inddampes i højvakuum. Remanensen udrives med eddikesyreester og 35 frasuges. Udbytte 3,17 g (97%).

[a]^5 = -22,0° (c = 1, i 80%’s eddikesyre).

O

DK 172398 B1 17

Eksempel 8

Boc-His-Ser(But)-Asp(OBut)-Gly-Thr(But)-Phe-Thr(But)-Ser (But) -Glu (OBut) -Leu-Ser (Bufc) -Leu-Ser (Bu*1) -Arg (HCIO^) -Leu-ArqCHClO^)-Asp(OBu^)-Ser(Bu*~)-Ala-Arq(HCIO^) -Leu-5 Gin-Arg(HC10^)-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-NH^

Til en opløsning af 9,51 g Boc-His-Ser(But)-Asp (OBu11)-Gly-Thr (But)-Phe-OH og 1,36 g HOObt i 166 ml dimethylacetamid og 166 ml dimethylformamid sættes under omrøring 27,2 g (8,3 mmoD H-Thr(But)-Ser (Bu*")-GlufOBu*") -10 Leu-Ser(But)-Arg(HC104)-Leu-Arg(HC104)-Asp(OBufc)-Ser(Bu^)-Ala-ArgiHClO^)-Leu-Gln-ArgiHClO^)-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-NH2.HC104. Når alt er opløst, tilsættes ved 0°C 2,2 ml N-e-thylmorpholin og 3,7 g dicyclohexylcarbodiimid, hvorefter der omrøres en time ved 0°C natten over ved stuetemperatur.

15 Næste dag suges opløsningen over i en blanding af 1,3 liter vand, 8,3 ml 2N HC1C>4 og 42,5 ml af en 50%'s NaClC>4-opløs-ning. Bundfaldet suges fra, vaskes med vand og tørres i vakuum over Ρ20^.

Udbytte 32,9 g.

Ifølge aminosyreanalyse er indholdet af peptid ca. 80% (= 83% udbytte).

[a]^ = -11,8° (c = 1, i 80%'s eddikesyre).

Eksempel 9 25 (a) Fmoe-Leu-OObt

Til en opløsning af 3,53 g Fmoc-Leu-OH og 1,63 g HOObt i 40 ml methylenchlorid tilsættes ved 0°C 2,06 g DCC. Der omrøres en time ved 0°C, og blandingen henstår natten over ved stuetemperatur. Bundfaldet suges fra, 30 og filtratet inddampes. Remanensen udrives to gange med petroleumsether, suges fra og tørres i vakuum.

Udbytte 5,2 g, amorft.

(b) Fmoc-Leu-Arg-OH

Til en suspension af 1,74 g L-arginin, 1,63 g 35 HOObt og 1,8 g pyridiniumperchlorat i 20 ml dimethylacet-amid tilsættes 5 g Fmoc-Leu OObt, hvorefter der omrøres 18 DK 172398 B1 ved stuetemperatur. Efter en times forløb er alt opløst. Blandingen henstår natten over ved stuetemperatur, og næste dag inddampes den. Remanensen deles mellem 180 ml pentanol og 160 ml vand (+ 20 ml mættet vandig 5 NaHCO^-opløsning). Til denne fordeling tilsluttes en 5-trins modstrømsfordelL.j mellem 180 ml pentanol og 180 ml vand. Fraktionerne med rent Fmoc-Leu-Arg-OH inddampes, og remanensen udrives med ether.

Udbytte: 4,1 g. Smeltepunkt 145-155°C under 10 sønderdeling.

[a]^® = -18,5° (c = 1, i methanol).

Eksempel 10

H-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr-OH

15 Syntesen sker med en "Applied Biosystems 430 A

Peptide Synthesizer".

Peptidets opbygning sker på en p-benzyloxybenz-ylalkoholharpiks ["Wang-harpiks": S. Wang, J. Am. Chem.

Soc. 9J>., 1328 (1973)], som ifølge den kendte metode [E.

20 Atherton m.fl., J. Chem. Soc. Chem. Comm., 336 (1981)] forestres med Fmoc-Tyr (Bu*-)-OH (substitueringsgrad: 0,4 mækv. pr. g). Der anvendes 1 g harpiks til syntesen. I de af apparatfabrikanten leverede patroner indvejes der hver gang 1 mmol Fmoc-Asn-OH, Fmoc-Ser(But)-OH, Fmoc-Phe-OH, 25 Fmoc-Arg-OH sammen med 1,5-2,5 ækvivalenter HOBt. I tilfælde af argininderivatet tilsættes der 1 ækvivalent pyridinium-perchlorat. Aktiveringen af aminosyrederivaterne som HOBt--estere sker i patronerne ved opløsning i 4 ml dimethylformamid og efterfølgende tilsætning af 2 ml af en 0,55 M opløs-30 ning af diisopropylcarbodiimid i dimethylformamid.

En typisk syntesecyklus er angivet i det følgende: 1. Fraspaltning af beskyttelsesgruppen med 2 x 8 ml af en 20%'s opløsning af piperidin i dimethylformamid i hver gang 10 minutter.

35 2. Vaskning med dimethylformamid (6x8 ml).

DK 172398 B1 19 3. Forchargering af harpiksen med HOBt ved 10 minutters behandling med en 0,5 M opløsning af HOBt i dimethyl-formamid og efterfølgende afpumpning af opløsningen.

4. Kobling af den i patronen i 30-45 min. foraktiverede 5 Fmoc-aminosyre-OBt-ester i 25-45 min.

5. Vaskning med dimethylformamid.

Efter endt syntese fraspaltes først Fmoc-gruppen fra peptid-harpiksen, ved hjælp af 20%'s piperidin i dimethyl-formamid, og derpå fraspaltes peptidet fra en prøve (100 10 mg) ved to timers behandling med trifluoreddikesyre/methy-lenchlorid/phenol i forholdet 70:30:5. Harpiksen skilles fra ved filtrering, eftervaskes med fraspaltningsopløsning, og filtratet inddampes i vakuum. Ved flere ganges sammenrøring med eddikeester fjernes phenolen. Det tilbageblevne 15 råpeptid opløses i 10%'s eddikesyre, der filtreres, og opløsningen frysetørres.

Udbytte: 23,8 mg råpeptid.

Aminosyreanalyse efter hydrolyse i 6 N HC1 ved 120°C i 24 timer: Asp (1,03), Ser (0,81), Tyr (0,89), Phe (1,00), 20 Arg (0,88), intet ornithin (ornithin dannes ud fra ved guani-dinogruppen acyleret arginin ved sur hydrolyse).

FAB-massespektrum: 686 (= molmasse + H+).

25

Claims (10)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af beskyttede argininholdige peptider ved hjælp af fragmentkobling, 5 kendetegnet ved, at der ved hver fragmentkobling mindst omsættes ét argininholdigt fragment som per-chlorat.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at et eventuelt beskyttet arginin om- 10 sættes som perchlorat.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at et argininholdigt segment omsættes som perchlorat.

4. Fremgangsmåde ifølge et af kravene 1-3, 15 kendetegnet ved, at et fragment under synteseforløbet er bundet covalent til et fast legeme.

5. Fremgangsmåde ifølge et af kravene 1-4, kendetegnet ved, at koblingen udføres i nærvær af et carbodiimid.

6. Fremgangsmåde ifølge et af kravene 1-5, kendetegnet ved, at koblingen udføres i nærvær af N,N'-diisopropylcarbodiimid eller Ν,Ν'-dicyclo-hexylcarbodiimid, eventuelt ved tilsætning af N-hydroxy-succinimid, 1-hydroxybenzotriazol, 3-hydroxy-4-oxo-3,4- 25 -dihydro-1,2,3-benzotriazin eller andre racemiserings-sænkende forbindelser.

7. Fremgangsmåde ifølge et af kravene 1-3 til fremstilling af et beskyttet sekretinderivat med formlen 30. t t t t R-His(Ra)-Ser(Bu^)-Asp(OBu*)-Gly-Thr(Bur)-Phe-Thr(Bu*)- Ser(But)-Glu( OBu1*) -Leu- S e r (But )-Arg(HC10jj) -Leu- A rg (HC10 ^) - Asp(0But)-Ser(But)-Ala-Arg(HC10|j)-Leu-Gln-Arg(HC10|j )- Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-Nl^

35 I O DK 172398 B1 hvor (a) R og er Boc-resten, eller (b) R er Boc-resten, og R^ er hydrogen, eller (c) R og R1 er adamantyloxycarbonyl-resten, kendeteqnet ved, at et peptid med formlen 5 « H-X-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-NH2 IIa hvor X er

10 -Arg(HCl04)-, -Arg(HC104)-Leu-Gln-Arg(HCIOJ- -Arg(HC104)-Asp(OBut)-Ser(Bu*)-Ala-Arg(HC104)- -Leu-Gln-Arg(HC104) eller -Thr (Bu*) -Ser (Bufc) -Glu(OBufc) -Leu-Ser (Bu11) -Arg 15 (HC104)-Leu-Arg(HC104)-Asp(OBu^-Ser(Bu11)- -Ala-Arg(HC104)-Leu-Gln-Arg(HC104)-, under tilsætning af 3-hydroxy-4-oxo-3,4-dihydro-l,2,3--benzotriazin (HOObt) ved "én-beholdermetoden" omsættes med de tilsvarende peptider med fri carboxylgruppe i po-20 lære opløsningsmidler med dicyclohexylcarbodiimid og nødvendige mængder af en tertiær base, og at de således syntetiserede peptider udfældes fra vand under tilsætning af tilsvarende mængder perchlorsyre og eventuelt et perchlo-rat som perchlorater.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kende tegnet ved, at peptidet med formlen Ila fås ved hydrogenering af benzyloxycarbonyl-holdige fragmenter med formlen Z-X-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-NH2 II 30 hvor X er -Arg(Z2)-, -Arg (Z2> -Leu-Gln-Arg (HC1C>4) -, Arg (Z2) -Asp (OBu11) -Ser (Bu11) -Ala-Arg (HC104) -Leu- Gln-Arg (HC10*) - eller -Thr (BuS-Ser (Bu11) -Glu t ’ f- (OBu )-Leu-Ser (Bu ) -Arg (HC104) -Leu-Arg (HC1C>4) -35 Asp (OBu11)-Ser (Bufc)-Ala-Arg (HC104)-Leu-Gln- Arg(HCl04)-, DK 172398 B1 O i dimethylacetamid under tilsætning af en palladiumkatalysator, idet pH-værdien ved tilsætning af en per-chlorsyreholdig opløsning holdes mellem 4 og 6, og yderligere omsættes ifølge krav 7.

9. Fremgangsmåde ifølge et af kravene 1-8, kendetegnet ved, at der anvendes pyridinium-perchlorat til fremstilling af perchloratet af det ar-gininholdige fragment.

10. Peptid , kendetegnet ved, at 10 det har formlen I, hvor R og har de i krav 7 definerede betydninger. 15 20 25 30 35