NO172895B

NO172895B - Peptid-aminoalkylamider, deres anvendelse for fremstilling av peptider samt en fremgangsmaate for fremstilling av slike peptider

Info

Publication number: NO172895B
Application number: NO874374A
Authority: NO
Inventors: Gerhard Breipohl; Jochen Knolle
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1986-10-21
Filing date: 1987-10-20
Publication date: 1993-06-14
Also published as: HU197719B; FI88031B; ZA877862B; IE60864B1; DK175126B1; ES2052535T3; PT85952B; EP0264802B1; AU7993587A; IE872821L; JPS63104951A; NO172895C; DE3783009D1; FI88031C; IL84195A; AU595390B2; KR960013073B1; CA1340421C; ATE83244T1; EP0264802A3

Description

Foreliggende oppfinnelse angår peptid-aminoalkylamider, disses anvendelse for fremstilling av peptider samt en fremgangsmåte for fremstilling av disse peptider.

Innføringen av et aminoalkylamid i den C-terminale ende av et biologisk virksomt peptid har i noen tilfeller utvirket seg positivt på den metaboliske stabilitet og virkningen (EP-A-179 332). Ved fremstillingen av de således modifiserte peptider betjente man seg av den klassiske fragmentkobling i oppløsning.

Ved fastfasesyntesen av peptider (sammenlign Patchornik, Cohen, "Perspectives in Peptide Chemistry", side 118-128 (Karger, Basel 1981)) påpodes de reaktive kjeder ofte ikke direkte på kunstharpikslegemet, men forbindes med såkalte spacer eller links med bæreren. Fra litteraturen (for eksempel Atherton, Sheppard, "Perspectives in Peptide Chemistry", sidene 101-117 (Karger, Basel 1981)) er det for eksempel kjent reagenser til innføring av slike spacere (såkalte "linkage agents"), som har formlene VI, VII og VII.

Det er nu funnet nye "linkage agents" som gjør det mulig å bygge opp C-terminaler med aminoalkylamid- eller hydrazid-modifiserte peptider direkte ved hjelp av fastfasesyntesen.

I henhold til dette angår foreliggende oppfinnelse nye forbindelser i form av peptid-aminoalkylamider og disse karakteriseres ved formel I

der

A betyr hydrogen eller 9-fluorenylmetyloksykarbonyl

B betyr fenylamin eller alanin

X betyr (C1-<C>12)-<a>lkylen

V betyr hydrogen, fenylkarbonylmetyl eller (C^_6)alkyl W betyr -0-[CH2]n-,

n betyr et helt tall fra 1 til 6 og

p betyr et helt tall fra 0 til 5.

Funksjonelle grupper i sidekjedene av aminosyrerester kan foreligge beskyttet. Egnede beskyttelsesgrupper er beskrevet ved Hubbuch, Kontakte (Merck) 1979, nr. 3, side 14-23 og ved Bullesbach, Kontakte (Merck) 1980, nr. 1, side 23-35. Foretrukket er slike grupper som er stabile overfor baser og svake syrer og som kan avspaltes ved hjelp av sterke syrer.

Alkylen kan være rettlinjet eller forgrenet.

Forbindelsene med formel I kan fremstilles ved at

a) en forbindelse med formel II

der

R betyr en nukleofil utløsbar avspaltbar gruppe og

V og W har den ovenfor angitte betydning, omsettes med en forbindelse med formel III der A betyr 9-fluormetylmetyloksykarbonyl og B, X, p hal-den ovenfor nevnte betydning, og at i den dannede beskyttede forbindelse med formel I, en eller begge beskyttelsesgruppene A og/eller V eventuelt spaltes av under dannelse av den eller de frie NH2- og/eller C02H-grupper, eller

b) en forbindelse med formel I, der A betyr hydrogen og B, X, v, W, n og p har ovenfor angitte betydning, omsettes

med en forbindelse med formel IV

A-[B]5_p-OH (IV),

der A, B og p har den ovenfor angitte betydning men A Ikke betyr hydrogen, eller deres aktivester, halogenid eller azid, og, hvis V forskjellig fra hydrogen, eventuelt spalter av en karboksylbeskyttelsesgruppe V under dannelse av en karboksylgruppe.

En nukleofil utløsbar avspaltbar gruppe R er for eksempel halogen som klor, brom og jod eller aktivert aryloksy som p-nitrofenoksy.

Omsetningen av en forbindelse med formel II med en forbindelse III gjennomfører man fortrinnsvis i et aprotisk oppløs-ningsmiddel, som for eksempel THF, DMF, CHC13 eller CH2C12, fortrinnsvis i nærvær av en base som for eksempel et tertiært amin, for eksempel etyltriisopropylamin, trietylamin eller pyridin, i det tilsetningen av en acyleringskatalysator som DMAP, HOObt eller HOBt virker fordelaktig, ved en temperatur mellom 0°C og reaksjonsblandingens kokepunkt, fortrinnsvis mellom 0°C og 40°C.

Forbindelsene med formel I (A = hydrogen) omsetter man med forbindelse med formel IV, deres aktivester, halogenid eller azid, fortrinnsvis i et organisk oppløsningsmiddel som DMF, fordelaktig i nærvær av en base som for eksempel et tert.-amin, ved en temperatur mellom -10°C og reaksjonsblandingens kokepunkt, fortrinnsvis ved romtemperatur. Egnede aktivestere er for eksempel ONSu-, OBt-, OObt- og p-nitrofenoksyfor-bindelsene. Foretrukkede halogenderivater er kloridene. Til forbedring av oppløsligheten kan det tilsettes pyridiniumperklorat.

Forbindelsene med formel II fremstiller man for eksempel, ved at man omsetter estere med formel IX

der W og V har den ovenfor nevnte betydning, V imidlertid ikke betyr hydrogen, med fosgen eller fosgenderivater som for eksempel klormaursyrenitrofenylester, i et aprotisk, polart oppløsningsmiddel, for eksempel THF eller DMF, i blanding med en tert. base, for eksempel et tert.amin som pyridin, fortrinnsvis i forhold 1:1 ved en temperatur mellom -40" C og værelsestemperatur, fortrinnsvis mellom -20°C og 0°C. Oppfinnelsen angår videre anvendelsen av en forbindelse med formel I der V betyr hydrogen og A ikke betyr hydrogen, ved fastfasesyntese av en forbindelse med formel V

der P betyr en peptidrest av q < p+1 a-aminosyrer og X og p har den ovenfor angitte betydning.

Til slutt angår oppfinnelsen en fremgangmåte for fremstilling av et peptid med formel I der P, X og p har den ovenfor angitte betydning ved fastfasesyntese, og denne fremgangsmåte karakteriseres ved at man kobler en forbindelse med formel I der A ikke betyr hydrogen og V betyr hydrogen, til en harpiks, spalter av beskyttelsesgruppen A, trinnvis kobler til Q-p, med 9-fluorenylmetyloksykarbonyl temporært beskyttede a-aminosyrer, eventuelt i form av aktiverte derivater og, efter avsluttet oppbygning setter fri peptidet med formel V ved behandling med en middels sterk til sterk syre fra harpiksen, hvorved samtidig eller derefter ved egnede forholdsregler, temporært innførte sidekjedebeskyttelsesgrupper spaltes av.

Hvis det for å forhindre sidereaksjoner eller er nødvendig for syntesen av spesielle peptider, blir de funksjonelle gruppene i sidekjedene av aminosyrer også beskyttet (se for eksempel T.W. Green "Protective Groups in Organic Syntheses", New York, John Wiley & Sons, 1981), hvorved man i første rekke benytter Arg(Tos), Arg(Mts), Arg(Mtr), Asp(OBzl), Asp(OBut), Cys(4-MeBzl), Cys(Acm), Cys(SBut), Glu(OBzl), Glu(OBut), His(Tos), His(Fmoc), His(Dnp), His(Trt), Lys(Cl-2), Lys(Boc), Met(O), Ser(Bzl), Ser(But), Thr(Bzl), ThrfBu<*>).

De som bærere anvendte harpikser er kommersielt tilgjenge-lige. Foretrukket er BHA- og MBHA-harpikser.

Avspaltningen av peptider med formel V foregår da ved behandling med i peptidsyntesene vanligvis anvendte middels sterke til sterke syrer (for eksempel trifluoreddiksyre, HF), i det de i spaceren inneholdte uretanbeskyttelsesgrupper spaltes.

Som koblingsreagens for forbindelsen med formel I (V = H) og de videre aminosyrederivater kan det anvendes alle mulige i peptidsyntesene anvendte aktiveringsreagenser, se for eksempel Houben-Weyl, "Methoden der organischen Chemie", bind 15/2, spesielt imidlertid karbodiimider som for eksempel N,N'-dicykloheksylkarbodi imid, N,N'-di isopropylkarbodi imid eller N-etyl-N'-(3-dimetylaminopropyl)karbadiimid. Koblingen kan derved gjennomføres direkte ved addisjon av aminosyrederivat med aktiveringsreagens og eventuelt en tilsetning som undertrykker racemiseringen, som for eksempel 1-hydroksy-benzotriazol (HOBt) (W. KSnig, R. Geiger, "Chem. Ber." 103, 708 (1970)) eller 3-hydroksy-4-okso-3,4-dihydrobenzotriazin (HOObt) (W. Konig, R. Geiger, "Chem. Ber." 103, 2054 (1970) til harpiksen eller også kan foraktiveringen av aminosyre-derivatetet foregå separat som symmetrisk anhydrid eller HOBt- henholdsvis HOObt-ester og oppløsningen av den akviterte spesie i et egnet oppløsningsmiddel has til den koblingsdyktige peptidharpiks.

Koblingen henholdsvis aktiveringen av forbindelsen med formel I (V = H) og aminosyrederivatene med en av de ovenfor nevnte aktiveringsreagenser kan gjennomføres i dimetylformamid eller metylenklorid eller en blanding av begge. Det aktiverte aminosyrederivat anvendes vanligvis i et 1,5- til 4-ganger overskudd. I tilfeller, der det inntrer en ufullstendig kobling, gjentas koblingsreaksjonen, uten på forhånd å gjennomføre den for koblingen av den nestfølgende aminosyre nødvendige avblokking av a-aminogruppen av peptidharpiksen.

Det følgeriktige forløp av koblingsreaksjonen kan undersøkes ved hjelp av ninhydrin-reaksjonen, som for eksempel omtalt av E. Kaiser et al. i "Anal. Biochem." 34'595 (1970). Syntesen kan også automatiseres, for eksempel med en peptidsynthesizer Modell 430 A fra fa. Applied Biosystems, i det det enten kan anvendes det av apparatfremstilleren foreskrevne syntese-program eller også oppstilt av brukeren selv. Sistnevnte anvendes spesielt ved anvendelse av med Fmoc-gruppen beskyttede aminosyrederivater.

Ved avspalting av peptidamidene fra harpiksen med fluorhy-drogen eller trifluoreddiksyre tilsettes som kationfanger vanligvis stoffer som fenol, kresol, tiokresol, tioanisol, anisol, etanditiol, dimetylsulfid, etylmetylsulfid eller en blanding av to eller flere av disse hjelpemidler. Trifluor-eddiksyren kan derved også anvendes fortynnet med egnede oppløsningsmidler, som for eksempel metylenklorid.

Anvendte forkortelser:

Oppfinnelsen skal forklares nærmere ved hjelp av noen eksempler.

Eksempel 1: 4-hydroksymetylfenoksyeddiksyremetylester

18,2 g 4-hydroksymetylfenoksyeddiksyre oppløses sammen med 17,1 ml N,N-dilsopropyletylamin 1 50 ml DMF og settes derefter til den opprørte oppløsning av 6,1 ml metyljodid. Derved oppvarmer blandingen seg svakt. Efter 3 timer er reaksjonen avsluttet. Oppløsningsmidlet fjernes. Resten opptas i eter og ekstraheres en gang med 0,5N saltsyre. Den vandige fase ekstraheres ytterligere 3 ganger med eter, de forenede eterfaser vaskes med vandig natriumhydrogenkarbonat-oppløsning og dampes inn. Resten oppløses i eddikester og filtreres over en kort søyle med kiselgel. Den efter inndampningen dannede svakt gulaktige olje krystalliserte ved henstand.

NMR og massespektrum stemmer overens med den angitte struktur .

Eksempel 2:

9,8 g 4-hydroksymetylfenoksyeddiksyremetylester oppløses i 200 ml tørr CH2CI2, derefter tilsettes 10,1 g klormaursyre p-nitrofenylester og 7 ml trietylamin. Blandingen kokes ca. 6 timer under tilbakeløp inntil produktet er helt omsatt. Derefter tilsettes en suspensjon av 15,5 g Fmoc-NH-(CH2)4-NH2 (fremstilt ved omsetning av Boc-NH-(CH2)4~NH2 med Fmoc-ONSu • og efterfølgende Boc-avspaltning) i 100 ml tørr CH2C12 samt ytterligere 7 ml trietylamin og blandingen kokes under tilbakeløp. Efter avsluttet reaksjon fjernes oppløsningsmid-let, resten digereres med eter og suges fra. Filterresten vaskes med vandig IN Na2C03-oppløsning og derefter med varmt vann og tørkes i eksikkator under høyvakuum.

Smeltepunkt 122-124°C, NMR og massespektrum stemmer overens med den angitte struktur.

Eksempel 3:

5,2 g av den ifølge eksempel 2 dannede ester suspenderes i 100 ml metanol og tilsettes 6 ekvivalenter av en vandig IN NaOH. Efter avsluttet reaksjon innstilles pH til 3 med vandig IN HC1 og metanol fjernes. Utfellingen suges fra, vaskes med litt H2O og digereres derefter i eter og suges fra Igjen.

Smeltepunkt fra 196°C (spalting), NMR og massespektrum er i overensstemmelse med den angitte struktur.

Eksempel 4:

1.5 g av det ifølge eksempel 3 dannede produkt suspenderes i 50 ml tørr DMF. Derefter tilsettes i rekkefølge 0,9 g pyridiniumperklorat (til forbedring av oppløsligheten), samt 2.6 g Fmoc-Phe-00bt og 0,5 ml trietylamin. Blandingen omrøres ved værelsestemperatur. Efter avsluttet reaksjon

fjernes oppløsningsmidlet og resten fordeles mellom eddikester H2O. Vannfasen ekstraheres Igjen med eddikester og de forenede organiske faser tørkes og inndampes. Resten digereres med litt CHCI3 og suges fra. Filterresten eftervaskes med litt eter og tørkes.

Smeltepunkt fra 140"C (spalting), NMR og massespektrum er i overensstemmelse med den angitte struktur.

1,4 g av den ifølge eksempel 4 dannede Fmoc-fenylalaninspa-cersyre oppløses sammen med 350 mg HOBt i 40 ml tørr DMF og has til 3,66 g 4-metylbenzhydrylaminharpiks (Nova Biochem, ladning 0,4 mMol/g). Derefter blander man med 0,6 ml diisopropylkarbodiimid og lar det avreagere under stadig gjennomblanding. Efter avsluttet reaksjon suges fra, eftervaskes med DMF, isopropanol, CH2CI2 og tert.-butylmetyleter og tørkes i høyvakuum. Oppladning ifølge elementæranalyse (N-bestemmelse ): 0,3 mMol/g.

Eksempel 6: Syntese av [des-Tyr<24>, des-Arg<23>]-r-atriopeptin III-(4-amino)butylamid

Peptidsyntesen foregår på 1 g av den ovenfor nevnte harpiks under anvendelse av Fmoc-aminsyre-OOBt-estere med en automatisk peptidsyntesiserer Modell 430A fra fa. Applied Biosystems og selvmodifisert synteseprogrammer.

Dertil anvendes henholdsvis 1 mMol av det tilsvarende aminosyrederivat i den fra fremstilleren leverte patroner, Fmoc-Arg(Mtr )-0H, Fmoc-Asn-OH og Fmoc-Glri-OH innveies sammen med 1,5 mMol HOBt i patronen. Foraktiveringen av disse aminosyrer foregår direkte i patronen ved oppløsning i 4 ml DMF og tilsetning av 2 ml av en 0,55 M oppløsning av diisopropylkarbodiimid i DMF. HOObt-esteren oppløses i 6 ml DMF og pumpes derefter likeledes som de in situ foraktiverte aminosyrer arginin, asparagin og glutamin på den på forhånd med 20$ piperidin i DMF avblokkerte harpiks. Det in situ aktiverte aminosyrer kobles dobbelt.

Efter avsluttet syntese avspaltes peptid-butylamidet fra harpiksen under samtidig fjerning av sidekjedebeskyttelses-gruppene med trifluoreddiksyre, som inneholder tioanisol og m-kresol som kationfangere. Det til fjerningen av trifluoreddiksyre dannede rest digereres flere ganger med eddikester og sentrifugeres. Det gjenblivende råpeptid behandles for fjerning av cysteinbeskyttelsesgruppene med tributylfosfin og trifluoretanol. Efter fjerning av oppløsningsmidlet, digereres igjen med eddikester og sentrifugeres. Det reduserte råpeptid oksyderes med en gang med jod i 8056-ig vandig eddiksyre, ^-overskuddet fjernes med ascorbinsyre og reaksjonsblandingen avsaltes efter inndamping til et lite volum på "Sephadex" G25 med vandig IN eddiksyre. Fraksjonene som inneholder det rene peptid forenes og frysetørkes.

Peptidet tilsvarer ifølge aminosyreanalyse i aminosyresammen-setningen den angitte formel.

Eksempel 7: 4-hydroksymetylfenoksyeddiksyrefenacylester.

182 g 4-hydroksymetylfenoksyeddiksyre og 199 g oc-bromacetofe-nol oppløses i 600 ml tørr DMF og derefter tildryppes hurtig ved 0"C 138 ml trietylamind. Man lar det komme til værelsestemperatur og omrører natten over. DMF-oppløsningen helles på 3,5 1 vann og den vandige fase ekstraheres med etylacetat. Den organiske fase vaskes med vann, tørkes over natriumsulfat og dampes inn. Ved inndampningen faller produktet ut. Det suges fra, vaskes med etylacetat:n-heksan 1:1 og tørkes under høyvakuum.

Smeltepunkt: 94-95"C, NMR stemmer overens med den angitte struktur.

Eksempel 8: 30 g 4-hydroksymetylfenoksyeddiksyrefenacylester oppløses under beskyttelsesgass i 500 ml av en blanding av THF:pyridin 1:1 og avkjøles til -20°C. Derefter tildryppes 21 g klormaursyre-p-nitrofenylester oppløst I 100 ml THF. Efter 30 minutters omrøring ved denne temperatur lar man det hele oppvarmes til 0°C og innrører blandingen i 1 1 av en halvmettet vandig NaCl-oppløsning på 0°C og efteromrører i 30 minutter. Utfellingen suges fra, vaskes med isvann og drives ut efter tørkning med n-heksan.

Smeltepunkt: 142-145°C, NMR er i overensstemmelse med den angitte struktur.

Eksempel 9:

9,3 g av den i eksempel 8 fremstilte forbindelse, 12,25 g Fmoc-Phe-NH-(CH2)g-NH2-trifluoracetat og 3,26 g HOObt has som faststoff i en kolbe, overhelles derefter med en blanding av 2,58 g metyldiisopropylamin i 100 ml tørr DMF. Blandingen omrøres derefter i ytterligere 3,5 timer ved 40°C og røres inn derefter i 500 ml halvmettet vandig NaCl-oppløsning. Den dannede utfelling suges fra, vaskes med isvann og drives ut efter tørking med eter/etylacetat.

Smeltepunkt: 147-150°C, NMR og MS stemmer overens med den angitte formel.

Følgende forbindelser (eksempel 10 til 14) fremstilles analogt eksempel 9:

Eksempel 10:

Smeltepunkt 144-147°C, NMR og MS tilsvarer den angitte formel.

Eksempel 11:

Smeltepunkt: 179-181°C, NMR og MS tilsvarer den angitte formel.

Smeltepunkt 144-145°C, NMR og MS tilsvarer den angitte formel.

Eksempel 13:

Smeltepunkt 172-175°C, NMR tilsvarer den angitte formel.

Eksempel 14:

Smeltepunkt 165-166°C, NMR tilsvarer den angitte formel.

suspenderes i en blanding av 150 ml iseddik og 50 ml diklormetan og blandes porsjonsvis med 12 g sinkpulver som på forhånd var blitt aktivert ved vasking med IN HC1 og tørr etanol. Efter få minutter blir suspensjonen tykkere og

vanskelig omrørbar under svak varmetoning. Derfor tilsettes ytterligere 80 ml iseddik og 50 ml diklormetan og det hele omrøres videre natten over. Derefter suges fra over et klarsjiktfilter og eftervaskes med iseddik og diklormetan. Filtratet inndampes, den som rest gjenblivende olje opptas i litt diklormetan og røres ut med etylacetat og eter. Det utfelte produkt suges fra og tørkes under høyvakuum.

Smeltepunkt: fra 160°C under spaltning, NMR og MS er i overensstemmelse med den angitte formel.

Efter den i eksempel 15 omtalte metode fremstilles også forbindelsene i eksempel 16 til 18:

Eksempel 16:

Smeltepunkt: fra 150°C under spaltning, NMR og MS i overensstemmelse med den angitte formel.

Eksempel 17:

Smeltepunkt: fra 160°C under spaltning, NMR og MS i overensstemmelse med den angitte formel.

Eksempel 18:

Smeltepunkt: fra 154°C under spaltning, NMR og MS i overensstemmelse med den angitte formel.

Eksempel 19:

Fremstillingen forgikk analogt eksempel 2.

Smeltepunkt: 115-118°C, NMR og MS stemmer overens med den angitte formel.

Eksempel 20:

ble fremstilt efter den i eksempel 3 omtalte metode. Smeltepunkt 184-187°C under spaltning, NMR og MS stemmer overrens med den angitte formel.

Eksempel 21:

Fremstillingen foregikk analogt eksempel 4.

Smeltepunkt: fra 120°C under spaltning, NMR og MS stemmer overens med den angitte formel.

Claims

1. Forbindelse, karakterisert ved at den har formel I der A betyr hydrogen eller 9-fluorenylmetyloksykarbonyl B betyr fenylamin eller alanin X betyr (C^-C-Lg )-alkylen V betyr hydrogen, fenylkarbonylmetyl eller (C1_^,)alkyl W betyr -0-[CH2]n-, n betyr et helt tall fra 1 til 6 og p betyr et helt tall fra 0 til 5.

2. Anvendelse av en forbindelse med formel I ifølge krav 1, der V betyr hydrogen og A ikke betyr hydrogen, ved fastfasesyntesen av forbindelser med formel V der P betyr en peptidrest av q < p+1 a-aminosyrer og X, og p har den i krav 1 angitte betydning.

3. Fremgangsmåte til fremstilling av et peptid med formel V, hvori P, X, m og p har den i krav 2 angitte betydning, ved fastfasesyntese, karakterisert ved at man kobler en forbindelse med formel I der A ikke betyr hydrogen og V betyr hydrogen, til en harpiks, spalter av beskyttelsesgruppen A, trinnvis kobler til q-p, med 9-fluorenylmetyloksykarbonyl temporært beskyttede a-aminosyrer, eventuelt i form av aktiverte derivater og, efter avsluttet oppbygning setter fri peptidet med formel V ved behandling med en middels sterk til sterk syre fra harpiksen, hvorved samtidig eller derefter ved egnede forholdsregler, temporært innførte sidekjedebeskyttelsesgrupper spaltes av.