KR100920297B1 - 고상 펩티드 합성 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 CTC 수지 상에서 고상 합성에 의해 화학식 I의 펩티드 유도체 또는 이의 염을 제조하는 방법을 포함한다:
화학식 I

Description

고상 펩티드 합성 방법{SOLID PHASE PEPTIDE SYNTHESIS}
본 발명은 하기 화학식 I의 펩티드 유도체의 제조 방법에 관한 것이다.
Figure 112007027760429-pct00001
상기 식에서,
Tos는 p-톨루엔설포닐을 의미한다.
본 발명의 방법은 고상 합성 방법을 기본으로 한다. 고상 합성에서, 출발물질이 불활성 고체 지지체에 결합되어 있는 동안, 아미노산이 임의 바라는 서열의 펩티드로 형성(결합)된다. 출발 생성물이 고체에 결합되고, 출발 물질로부터 임의 생성물이 잘 결합되어 유지되기 때문에, 반응물은 용액으로 첨가된다. 바라는 서열이 지지체에 함께 결합되면, 펩티드는 지지체로부터 이탈(즉, 분할)된다.
본 발명에 따라 제조된 펩티드 유도체는 EC3.4.4.류의 특정 단백질 가수 분해 효소 및 특히 트롬빈(EC는 생화학의 국제 협회 "효소 위원회(Enzyme Committee)"의 약어이다)의 정량 측정에 적합하다.
이러한 관련 펩티드의 합성 방법은 미국 특허 제 4,428,874 호(1984), 제 4,070,245 호(1978) 및 제 4,629,695 호(1986)에 기술되어 있다. 이러한 방법은 상이한 아미노산 유도체를 사용하는 용액상 합성을 기본으로 하였다.
그러나, 이러한 기술에 명시된 방법은 바라는 이성질체의 광학 순도 및 각각의 펩티드의 정제에 필요한 노력에 비추어 보아 만족스럽지 못했다.
따라서, 본 발명의 목적은 화학식 I의 펩티드 유도체를 우수한 수율 및 높은 광학 순도로 제조하는, 더욱 경제적인 방법의 제공에 관한 것이다.
본 발명의 목적은 청구범위 제 1 항에 따라 본 발명의 방법을 실시함으로써 달성된다.
상기 방법은 a) 커플링제/첨가제 시스템의 존재 하에 고상 지지체 상에서 아르기닌, 프롤린 및 글라이신 아미노산을 연속적으로 커플링하는 단계, b) 글라이신 잔기의 N-α-아미노기를 토실화하는 단계, c) 토실화된 펩티드 또는 이의 아미노 측쇄 보호된 유도체를 고상 지지체로부터 분할하는 단계, 및 d) 커플링제/첨가제 시스템의 존재하에서 하기 화학식 II의 펩티드 중간체 또는 이의 아미노 측쇄 보호된 유도체와 하기 화학식 III의 아닐린을 반응시키는 단계를 포함한다:
Figure 112007027760429-pct00002
R-NH2
상기 식에서,
R은 p-아미노페닐을 의미하며, 하나의 아미노기는 아미노 보호기로 보호된다.
본원의 상세한 설명 및 청구범위에 사용된 약어의 의미는 다음 표에 기술된 바와 같다:
Figure 112007027760429-pct00003
또한, 아르기닌 및 프롤린 아미노산은 이의 L- 또는 D-구조로, 라세미체로서, 또는 이들 이성질체의 다양한 혼합물로서 사용될 수 있다는 것을 이해할 수 있다. 바람직하게는, 아미노산은 이들의 L-구조로 사용된다.
본 발명의 단계 a)에서의 연속 커플링은, 제 1 단계로서 고체상 지지체에 바람직하게는 보호된 아르기닌을 부착하는 것을 포함한다.
아르기닌의 α-아미노 기는 당해 기술 분야의 숙련가들에게 공지된 통상의 아미노 보호기에 의해 보호될 수 있다. Fmoc가 아르기닌의 바람직한 α-아미노 보호기이다.
일반적으로 아르기닌 분자의 측쇄, 즉 구아니딘 부는 당해 기술 분야의 숙련가들에게 공지된 아르기닌 측쇄 보호기로 보호된다. 바람직한 아르기닌 측쇄 보호기는 Pmc 또는 Pbf, 더욱 바람직하게는 Pbf이다.
원칙적으로, 문헌[Peptides: Chemistry and Biology, N. Sewald, H.-D. Jakubke, Wiley- VCH Verlag GmbH, Weinheim, 2002 and Fmoc-Solid Phase Peptide Synthesis-A practical approach, W.C. Chan, P.D. White, Oxford University Press Inc. New York, 2000]에 기술된 바와 같이, 고상 펩티드 합성에 유용한 것으로 공지된 모든 고상 지지체가 본 발명의 합성에 사용될 수 있다.
2-클로로트라이틸클로라이드-폴리스티렌 수지(CTC-수지)가 본 발명의 펩티드 합성을 위한 고상 지지체로서 가장 적합하다는 것을 알게 되었다. CTC 수지는 예를들면 머크 바이오사이언스(Merck Bioscience)로부터 상업적으로 입수할 수 있다.
보호된 아르기닌은 예를들면 다이클로로메테인과 같은 불활성 용매에서 용해 되는 것이 바람직하다.
Et3N, DIEA 또는 sym-콜리딘(sym-collidine), 바람직하게는 DIEA 또는 sym-콜리딘과 같은 3급 아민이 통상적으로 존재한다.
일반적으로, 고상 지지체에의 부착은 실온에서 발생한다.
충전된 수지의 후처리는 당해 기술 분야의 숙련가에게 공지된 기법에 따르며, 유기 용매로 수지를 세정하고, 여과시킨 후, 최종적으로 적절한 온도에서 건조시키는 것을 포함한다.
제 1 단계의 바람직한 실시양태에서, Fmoc-Arg(Pbf)-OH 충전된 CTC-수지가 제조된다.
계속적인 단계에서, 보호된 프롤린의 커플링 후 보호된 글라이신과의 커플링이 실시된다.
커플링이 실시되기 전에, 아르기닌의 α-아미노기는 DMF 또는 NMP(바람직하게는 NMP)와 같은 적합한 용매를 지닌 5 내지 20% 용액 중에서 몰폴린, DBU 또는 피페리딘(바람직하게는 피페리딘)과 같은 2급 아민에 의해 적절하게 탈보호되어야 한다.
프롤린 및 글라이신 둘 다의 α-아미노기는 당해 기술 분야의 숙련가에게 공지된 통상의 아미노 보호기에 의해 보호될 수 있다. Fmoc가 프롤린 및 글라이신 둘 다의 바람직한 α-아미노 보호기이다.
프롤린은 PG-Pro-OPfp, PG-Pro-OSu 및 PG-Pro-OBt로부터 선택된 활성화된 유 도체의 형태로서, 또는 PG-Pro-OH의 형태의 비활성화된 유도체로서 사용될 수 있으며, 이때 상기 PG는 아미노 보호기를 의미한다.
바람직하게, 프롤린은 Fmoc-(L)-Pro-OH 형태로 사용된다.
글라이신은 PG-Gly-OPfp, PG-Gly-OSu 및 PG-Gly-OBt로부터 선택된 형태의 활성화된 유도체로서, 또는 PG-Gly-OH 형태의 비활성화 유도체로서 사용될 수 있으며, 이때 PG는 아미노 보호기를 의미한다.
바람직하게는, 글라이신은 Fmoc-Gly-OH의 형태로 사용된다.
본 발명에 따라, 아미노산의 커플링은 DCC/HOBt, HBTU/HOBt, TBTU/HOBt, HATU/HOAt, DEPBT/HOOBt 및 PyBOP/Cl-HOBt로부터 선택된 커플링제/첨가제 시스템을 사용하여 실시된다.
바람직한 커플링제/첨가제 시스템은 DEPBT/HOOBt 또는 HBTU/HOBt이고, HBTU/HOBt가 가장 바람직하다.
각각의 커플링은 NMP와 같은 적합한 용매 중에서 Et3N, DIEA 또는 sym-콜리딘(바람직하게는 DIEA 또는 sym-콜리딘)과 같은 3급 아민의 존재하에서 통상적으로 실시된다.
이상적으로, 커플링 반응은 0 내지 40℃의 온도에서 교반 하에 실시된다.
글라이신과의 커플링 전의 프롤린의 탈보호 및 글라이신의 최종적인 탈보호는 DMF 또는 NMP(바람직하게는 NMP)와 같은 적합한 용매를 갖는 5 내지 20%의 용액 중에서 몰폴린, DBU 또는 피페리딘(바람직하게는 피페리딘)과 같은 2급 아민을 사 용하여 적절하게 실시될 수 있다.
이러한 커플링 반응의 바람직한 실시양태에서, H2N-Gly-(L)-Pro-(D/L)Arg- (Pbf)-OH 충전된 CTC-수지가 제조된다.
본 발명의 방법에서 단계 b)의 글라이신 잔기의 N-α-아미노기의 토실화는 Et3N, DIEA 또는 sym-콜리딘(바람직하게는 DIEA)와 같은 3급 아민의 존재하에서 4-톨루엔설포닐클로라이드를 사용하여 통상적으로 실시된다.
일반적으로, 토실화는 0 내지 40℃의 온도에서 다이클로로메테인과 같은 불활성 용매의 존재하에서 실시된다.
고상 지지체로부터의 분할은 당해 기술 분야의 숙련가에게 공지된 방법에 의해 실시될 수 있다.
바람직하게는, 바람직한 펩티드 Tos-Gly-(L)-Pro-(L)-Arg(Pbf)-OH는, 다이클로로메테인 중에서 묽은 산성 용액(바람직하게는 0.1 내지 5%의 트라이플루오로아세트산 용액)으로 처리함으로써 CTC-수지로부터 분할된다.
수득된 펩티드는 당해 기술 분야에 공지된 방법, 바람직하게는 액상 크로마토그래피 정제 기술에 의해 추가로 정제될 수 있다.
단계 d)에 따라, 토실화된 펩티드 유도체는 커플링제/첨가제 시스템의 존재 하에서 하기 화학식 III의 아닐린과 커플링된다:
화학식 III
R-NH2
상기 식에서, R은 p-아미노페닐을 의미하며, 하나의 아미노기는 아미노 보호기로 보호된다.
커플링은 Et3N, DIEA 또는 sym-콜리딘(바람직하게는 DIEA)과 같은 3급 아민의 존재하에서 DCC/HOBt, HBTU/HOBt, TBTU/HOBt, HATU/HOAt, PyBOP/Cl-HOBt 및 DEPBT/HOOBt(바람직하게는, DEPBT/HOOBt)로부터 선택된 커플링제/첨가제 시스템의 존재하에서 실시된다.
반응은 교반 하에 0 내지 40℃의 온도 범위에서 DMF와 같은 적당한 용매 중에서 실시되는 것이 바람직하다.
반응 혼합물의 후처리는 당해 기술 분야의 숙련가의 일반적인 지식에 따르며, 묽은 HCl과 같은 묽은 산으로의 추출을 포함할 수 있다.
수득된 펩티드는 당해 기술 분야에 공지된 방법, 바람직하게는 액상 크로마토그래피 정제 기술에 의해 추가로 정제될 수 있다.
본 발명의 공정에 있어서, 바라는 펩티드 이성질체는 85%까지의 우수한 수율 및 96%까지의 광학 순도로 수득될 수 있다.
실시예 1
Fmoc-(L)-Arg(Pbf)-OH의 CTC-수지에의 부착
500g(0.77mol)의 Fmoc-(L)-Arg(Pbf)(머크 바이오사이언스 노보바이오 켐(Merck Biosciences Novobiochem))을 5.5ℓ다이클로로메테인 및 812㎖(4.77mol) DIEA의 교반된 용액에 용해시켰다. 1kg CTC-수지(머크 바이오사이언스 게엠베하(Merck Biosciences GmbH), 100-200 메시, 1%DVB, 충전량: 0.8 내지 1.6mmol/g 수지)를 첨가하고, 용액을 약 2분 동안 교반시켰다. 혼합물을 3시간 동안 실온에서 방치시키고, 각각 1시간 후 및 2시간 후에 혼합물을 2분 동안 교반시켰다. 3시간 후, 혼합물을 5 내지 10℃로 냉각시키고, 300㎖ 메탄올을 첨가하였다. 현탁액을 상기 온도에서 1시간 동안 방치시켰다. 이어서, 혼합물을 흡입 필터에서 여과시켰다.
이어서, 다이클로로메테인/메탄올/DIEA(80:15:5)의 용액에 수지를 현탁시키고, 5분 동안 교반시킨 후, 30분 동안 방치시켰다. 여과 후, 수지를 5ℓ DMF로 4번, 2.5ℓ 아이소프로판올로 4번, 2.5ℓ 아이소헥세인으로 3번 세정하였다. 수지를 여과시킨 후, 수지를 젖은 상태로 유지하였다. 이어서, 수지를 30℃의 진공 건조 캐비넷에서 40시간 동안 건조시켰다.
HPLC로의 충전 분석: 0.405mmol/g Fmoc-Arg(Pbf)-CTC
HPLC 방법: 칼럼: 키스톤 베타 베이직(Keystone Beta Basic) C18; 이동 상 A: H2O + 0.1% TFA, 이동 상 B: 아세토나이트릴 + 0.075% TFA, T = 30℃, t = 22분, Rt = 12.2분.
실시예 2
Tos-Gly-(L)-Pro-(L)-Arg(Pbf)-OH
Figure 112007027760429-pct00004
펩티드 반응 용기를 5g Fmoc-(L)-Arg(Pbf)-CTC-수지(충전량: 0.405 mmol/g; 2.075 mmol)로 충전시켰다. 87.5㎖ 다이클로로메테인을 첨가하였다. 수지가 적어도 30분 동안 다이클로로메테인 중에서 팽창하였을 때, 용매를 NMP로 변경시켰다. 이어서, 수지를 87.5㎖ NMP(3번)로 세정하였다. NMP 중의 5% 피페리딘 용액에서 탈블로킹을 30분 이내 동안 실시하였다. 이어서, 수지를 62.5㎖ NMP로 6번 세정하였다.
8.75㎖ NMP 중의 1.05g(3.11mmol) Fmoc-(L)-Pro-OH, 0.477g(3.11mmol) HOBt 및 1.09㎖(6.22mmol) DIEA의 용액을 제조하고, 5분 후에 7.5㎖ NMP 중의 1.18g(3.11 mmol) HBTU를 첨가하여 커플링 절차를 실시하였다. 10분 동안의 예비 활성화 후, 상술된 용액을 수지에 첨가하고, 현탁액을 30℃에서 2시간 동안 주의하여 교반시켰다. 커플링 후에 NMP로 철저하게 세정하였다.
NMP 중의 5% 피페리딘 용액에서 30분 이내 동안 아미노기를 탈블로킹하였다. 이어서, 수지를 NMP로 철저하게 세정하였다. 8.75㎖ NMP 중의 0.925g(3.11 mmol) Fmoc-Gly-OH, 0.477g(3.11mmol) HOBt 및 1.09㎖(6.22 mmol) DIEA의 용액을 제조하고, 5분 후에 7.5㎖ NMP 중의 1.18g(3.11 mmol) HBTU를 첨가하여 커플링 절차를 실시하였다. 10분 동안의 예비 활성화 후, 상술된 용액을 수지에 첨가하고, 현탁액을 30℃에서 2시간 동안 주의하여 교반시켰다. 커플링 후에 NMP로 철저하게 세정하였다.
NMP 중의 5% 피페리딘 용액에서 30분 이내 동안 아미노기의 마지막 탈블로킹을 다시 실시한 후, NMP 및 다이클로로메테인(3번)으로 철저하게 세정하였다. 이어서, 수지를 75㎖의 다이클로로메테인에 현탁시키고, 0.475g(2.49mmol) 4-톨루엔설포닐클로라이드(Tos-Cl) 및 0.43㎖(2.49 mmol)DIEA를 첨가하였다. DCM 중의 1% TFA 용액을 사용하여 펩티드를 최종적으로 분할하였다. 여액을 톨루엔으로 희석시키고 진공에서 증발시켰다.
1.7g의 조질 펩티드(Tos-Gly-(L)-Pro-(L)-Arg(Pbf)-OH)가 수득되었다.
HPLC: 칼럼: 키스톤 베타 베이직 C18; 이동 상 A: H2O + 0.1% TFA, 이동 상 B: 아세토나이트릴 + 0.1% TFA, T = 30℃, t = 34분, Rt = 13.9분, A%: 89.6%,
NMR: 1H, 13C
ESI-MS: MH+ 735.3, MNa+ 757.3; [M-H]- 733.3
실시예 3
Tos-Gly-(L)-Pro-(L)-Arg(Pbf)-p-Boc-아미노아닐리드
Figure 112007027760429-pct00005
반응 용기를 9㎖ DMF 중의 0.61g(0.83mmol) Tos-Gly-(L)-Pro-(L)-Arg(Pbf)-OH로 충전시키고 0.135g(0.83 mmol) HOOBt 및 0.29㎖(1.66 mmol) DIEA를 첨가하였다. 예비활성화 혼합물을 5분 동안 교반시킨 후, 0.248g(0.83mmol) DEPBT 및 0.156g(0.75mmol) N-Boc-p-페닐렌다이아민을 첨가하였다. 실온에서 5시간 동안 교반시킨 후, 용매를 진공에서 증류시켰다. 잔유물을 수성 HCl-용액으로 추출하였다. 실리카를 사용하여 크로마토그래피 정제하여 0.39g(85%)의 생성물을 수득하였다.
HPLC, 방법 1: 칼럼: 키스톤 베타 베이직 C18; 150 x 4.6mm; 구배 방법
이동 상 A: H2O + 0.1% TFA, 이동 상 B: 아세토나이트릴 + 0.1% TFA, T = 30℃, t = 34분, Rt = 16.11분, A%: 91.13%,
HPLC, 방법 2: 칼럼: 카이로바이오틱(Chirobiotic) T; 10m, 250 x 4.6mm; 등용매용리 방법
이동상: ((아세토나이트릴: MeOH; 1:4) + 0.2% Et3N + 0.2 % AcOH) , T = 30℃, t = 30분, Rt = 4.53분, A%: 95.4%,
NMR: 1H 및 13C:
ESI-MS: MH+ 925.2, MNa+ 947.2, [M-H]-923.2

Claims (19)

  1. a) 커플링제/첨가제 시스템의 존재하에 고상 지지체 상에서 아르기닌, 프롤린 및 글라이신 아미노산을 연속적으로 커플링하는 단계;
    b) 글라이신 잔기의 N-α-아미노기를 토실화하는 단계;
    c) 토실화된 펩티드 또는 이의 아미노 측쇄 보호된 유도체를 고상 지지체로부터 분할하는 단계; 및
    d) 커플링제/첨가제 시스템의 존재하에 하기 화학식 II의 펩티드 중간체 또는 이의 아미노 측쇄 보호된 유도체와 하기 화학식 III의 아닐린을 반응시키는 단계
    를 포함하는, 하기 화학식 I의 펩티드 유도체 또는 이의 염의 제조 방법:
    화학식 I
    Figure 112007063388593-pct00006
    화학식 II
    Figure 112007063388593-pct00007
    화학식 III
    R-NH2
    상기 식에서,
    Tos는 p-톨루엔설포닐을 의미하고;
    R은 p-아미노페닐을 의미하며, 하나의 아미노기는 아미노 보호기로 보호된다.
  2. 제 1 항에 있어서,
    고상 지지체가 2-클로로트라이틸클로라이드-폴리스티렌 수지인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    아르기닌이 Pbf 또는 Pmc 보호기로 보호된 측쇄인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    프롤린이 PG-Pro-OPfp, PG-Pro-OSu 및 PG-Pro-OBt로부터 선택된 활성화된 유도체의 형태로 사용되거나, 또는 PG-Pro-OH의 형태로 비활성화되며, 이때 PG는 아미노 보호기를 의미하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    프롤린이 Fmoc-(L)-Pro-OH의 형태로 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    글라이신이 PG-Gly-OPfp, PG-Gly-OSu 및 PG-Gly-OBt로부터 선택된 활성화된 유도체의 형태로 사용되거나, PG-Gly-OH의 형태로 비활성화되며, 이때 PG는 아미노 보호기를 의미하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    글라이신이 Fmoc-Gly-OH의 형태로 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 5 항에 있어서,
    피페리딘의 처리에 의해 Fmoc 보호기가 제거되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서,
    단계 a)에서 아미노산의 연속적 커플링을 위한 커플링제/첨가제 시스템이 DCC/HOBt, HBTU/HOBt, TBTU/HOBt, HATU/HOAt, DEPBT/HOOBt 및 PyBOP/Cl-HOBt로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    커플링제/첨가제 시스템이 TBTU/HOBt인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서,
    화학식 II의 펩티드 중간체와 화학식 III의 아닐린의 반응을 위한 커플링제/첨가제 시스템이 DCC/HOBt, HATU/HOAt, HBTU/HOBt, TBTU/HOBt, PyBOP/Cl-HOBt 및 DEPBT/HOOBt로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    커플링제/첨가제 시스템이 DEPBT/HOOBt인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1 항에 있어서,
    토실화가 4-톨루엔설포닐클로라이드를 사용하여 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1 항에 있어서,
    고상 지지체로부터의 분할이 트라이플루오로아세트산을 사용하여 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1 항에 있어서,
    단계 d)에서 화학식 III의 아닐린과의 반응이 화학식 II의 펩티드 중간체의 아미노 측쇄 보호 유도체로서 Tos-Gly-Pro-Arg(Pbf)-OH를 사용하여 실시되는 것을 특징으 로 하는 방법.
  16. 삭제
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  18. 삭제
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KR1020077008228A 2004-10-12 2005-10-04 고상 펩티드 합성 방법 KR100920297B1 (ko)

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