JP2022516350A

JP2022516350A - 新規キャッピングおよび捕捉試薬の使用によるｈｐｌｃ不要のペプチド精製

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Publication number: JP2022516350A
Application number: JP2021539416A
Authority: JP
Inventors: ベルクマン，フランク; ポンプルン，ゼーバスティアン・ヨハネス
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2019-01-07
Filing date: 2020-01-03
Publication date: 2022-02-25
Also published as: US20220064212A1; EP3908590A1; CN113272316A; WO2020144111A1

Abstract

本開示は、固相ペプチド合成におけるキャッピングおよび捕捉試薬の使用に関する。本開示は、固相ペプチド合成の方法であって、本開示によるキャッピングおよび捕捉試薬が使用される方法にさらに関する。本開示は、本開示によるキャッピングおよび捕捉試薬の使用を介した（完全長）合成ペプチドの精製のための方法にさらに関する。本開示はまた、本開示によるキャッピングおよび捕捉試薬ならびにアミノオキシ樹脂またはヒドラジン樹脂を含むキット、ならびにキットの使用にも関する。【選択図】なし

Description

本発明は、固相ペプチド合成におけるキャッピングおよび捕捉試薬の使用に関する。本発明は、固相ペプチド合成の方法であって、本発明によるキャッピングおよび捕捉試薬が使用される方法にさらに関する。本発明は、ペプチド合成中に本発明によるキャッピングおよび捕捉試薬が（完全長）合成ペプチドのその後の精製を促進するために使用される固相ペプチド合成のための方法にさらに関する。本発明はまた、本発明によるキャッピングおよび捕捉試薬ならびにアミノオキシ樹脂またはヒドラジン樹脂を含むキット、ならびに前記キットの使用にも関する。

固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）は、短い長さから中間の長さのペプチド合成のための主力な方法である（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．、ＳｏｌｉｄＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｉ．ＴｈｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆａＴｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＣｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙ、１９６３年、８５巻（１４号）、２１４９～２１５４頁）。特にＦｍｏｃベースの戦略は、主に使用されている方法論として普及している（Ｗ．Ｃ．ＣｈａｎＰ．Ｄ．ＷｈｉｔｅＥｄｓ．、ＦｍｏｃＳｏｌｉｄＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ、ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ．ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ：２０００年）。普通カップリング効率が高くても、段階的合成の間に少量の未反応アミノ基が蓄積する。異なる位置に１つまたは複数の残基が欠損した欠失配列の無制御な蓄積を回避するため、各カップリング工程後、大量の過剰なキャッピング試薬を樹脂に加えて、すべての残留する遊離アミンが完全に失活することを確実にする。普通無水酢酸はこの目的のために使用される。ＳＰＰＳの最も単調で、時間を消費する態様は、依然として分取ＨＰＬＣによる粗ペプチドの精製である。キャッピング戦略にもかかわらず、一部の短縮型配列は完全長産物と共に共溶出し、分離することが困難となり得る。精製問題の決着を促進するため、不完全な配列をタグ化して、これらのＨＰＬＣ溶出プロファイルまたはこれらの溶解度を改変するための様々な試薬が開発されてきた（Ｓｈｏｇｒｅｎ－Ｋｎａａｋ，Ｍ．Ａ．；ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ、Ｋ．Ａ．；Ｉｍｐｅｒｉａｌｉ，Ｂ．、α－Ｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｙｌｃａｐｐｉｎｇｏｆｐｅｐｔｉｄｅｓ：ａｎＮ－ｔｅｒｍｉｎａｌｃａｐｐｉｎｇｓｔｒａｔｅｇｙｓｕｉｔａｂｌｅｆｏｒＥｄｍａｎｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ、２０００年、４１巻（６号）、８２７～８２９頁；Ｃａｎｎｅ，Ｌ．Ｅ．；Ｗｉｎｓｔｏｎ，Ｒ．Ｌ．；Ｋｅｎ，Ｓ．Ｂ．Ｈ．、ＳｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆａｖｅｒｓａｔｉｌｅｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｈａｎｄｌｅｆｏｒｕｓｅｗｉｔｈＢｏｃｃｈｅｍｉｓｔｒｙｓｏｌｉｄｐｈａｓｅｐｅｐｔｉｄｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ、１９９７年、３８巻（１９号）、３３６１～３３６４頁；Ｍｏｎｔａｎａｒｉ，Ｖ．；Ｋｕｍａｒ、Ｋ．、ＪｕｓｔＡｄｄＷａｔｅｒ：ＡＮｅｗＦｌｕｏｒｏｕｓＣａｐｐｉｎｇＲｅａｇｅｎｔｆｏｒＦａｃｉｌｅＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＰｅｐｔｉｄｅｓＳｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄｏｎｔｈｅＳｏｌｉｄＰｈａｓｅ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＣｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙ、２００４年、１２６巻（３１号）、９５２８～９５２９頁；Ｍｏｎｔａｎａｒｉ，Ｖ．；Ｋｕｍａｒ，Ｋ．、ＡＦｌｕｏｒｏｕｓＣａｐｐｉｎｇＳｔｒａｔｅｇｙｆｏｒＦｍｏｃ‐ＢａｓｅｄＡｕｔｏｍａｔｅｄａｎｄＭａｎｕａｌＳｏｌｉｄ‐ＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ。ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＯｒｇａｎｉｃＣｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００６年、２００６巻（４号）、８７４～８７７頁）。代わりに、最後の工程において、完全長ペプチドを、この所望の生成物の選択的単離を可能にする部分で修飾する（Ｖｉｌｌａｉｎ，Ｍ．；Ｖｉｚｚａｖｏｎａ，Ｊ．；Ｒｏｓｅ，Ｋ．、Ｃｏｖａｌｅｎｔｃａｐｔｕｒｅ：ａｎｅｗｔｏｏｌｆｏｒｔｈｅｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｓｙｎｔｈｅｔｉｃａｎｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００１年、８巻（７号）、６７３～６７９頁；Ｔｏｓｈｉａｋｉ，Ｈ．；Ａｋｉｒａ，Ｔ．；Ｋｅｎ’ｉｃｈｉｒｏｈ，Ｎ．；Ｔａｋｅｓｈｉ，Ｓ．；Ｔｏｒｕ、Ｋ．；Ｓａｂｕｒｏ，Ａ．、Ｐｅｐｔｉｄｅｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｂｙａｆｆｉｎｉｔｙｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｂａｓｅｄｏｎ α‐ｋｅｔｏａｃｙｌｇｒｏｕｐｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｅｐｔｉｄｅＳｃｉｅｎｃｅ、２００９年、１５巻（５号）、３６９～３７６頁；Ｔｏｓｈｉａｋｉ，Ｈ．；Ａｋｉｒａ，Ｔ．；Ｔｏｒｕ，Ｋ．；Ｓａｂｕｒｏ，Ａ．；Ｍｉｃｈｉｏ，Ｍ．、ＰｅｐｔｉｄｅｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｕｓｉｎｇｔｈｅｃｈｅｍｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅｒｅａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎＮ‐（ｍｅｔｈｏｘｙ）ｇｌｙｃｉｎｅａｎｄｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｏ‐ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄｒｅｓｉｎ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｅｐｔｉｄｅＳｃｉｅｎｃｅ、２０１６年、２２巻（６号）、３７９～３８２頁；Ｌｏｉｂｌ，Ｓ．Ｆ．；Ｈａｒｐａｚ，Ｚ．；Ｚｉｔｔｅｒｂａｒｔ，Ｒ．；Ｓｅｉｔｚ，Ｏ．、ＴｏｔａｌｃｈｅｍｉｃａｌｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓｗｉｔｈｏｕｔＨＰＬＣｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．ＣｈｅｍｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ、２０１６年、７巻（１１号）、６７５３～６７５９頁）。

各カップリング工程に対して、効率的なキャッピングが確実に行われるよう大量の過剰なカップリング試薬を樹脂に加えなければいけないので、高価な、または複雑な合成が要求される試薬は常套的用途に対して有用ではない。高いコストを回避しながらの、完全長ペプチドの末端修飾は別の問題を提起する：精製後の最終生成物は精製ハンドルもしくはその部分を依然として含有する、または、例えばペプチドの生体活性が問題にされている場合、トレースレスで切断可能なリンカーの使用が必要となる。文献にはいくつかのトレースレスリンカーが記載されている、しかし最終生成物溶液を汚染しないよう、およびペプチドに無害なように、切断条件を慎重に制御しなければならない。

固体支持体上で合成した化合物の精製を促進する試薬が、例えばＷＯ０３／０１７９３０Ａ２において開示されている。

固相上で合成したペプチドの容易な精製のためのフルオラスキャッピング試薬が、例えば、Ｍｏｎｔａｎａｒｉ，Ｖ．；Ｋｕｍａｒ、Ｋ．、Ｊｕｓｔａｄｄｗａｔｅｒ：ａｎｅｗｆｌｕｏｒｏｕｓｃａｐｐｉｎｇｒｅａｇｅｎｔｆｏｒｆａｃｉｌｅｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐｅｐｔｉｄｅｓｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄｏｎｔｈｅｓｏｌｉｄｐｈａｓｅ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｍｅｒｉｃａｎＣｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙ、２００４年、１２６巻、９５２８～９５２９頁において開示されている。

活性化されたカルボン酸および保護されたカルボニル基を含む窒素含有複素環式化合物が、例えば、ＷＯ２０１０／０３２４３７Ａ１において開示されている。

発明者らは、比較的安価な出発物質から開始して、キャッピングおよび捕捉試薬を調製することができることを示すことができた。固相ペプチド合成における効率的なキャッピングのため、多くの場合大量の過剰なキャッピング試薬をすべての合成サイクルで加えなければならない。安価で、簡単に入手可能な試薬のみが常套的使用に対して実用的である。

固相ペプチド合成に本発明のキャッピングおよび捕捉試薬を使用すれば、精製の並列化の可能性により、分取ＨＰＬＣ精製と比較して著しく時間が節約される。さらに、従来の分取ＨＰＬＣと比較して、溶媒が最大約２００倍節約される。ＨＰＬＣ上で所望の生成物と共に共溶出する終端配列を、容易に分離することができる。本発明によるキャッピングおよび捕捉試薬を使用すれば、全長ペプチドの捕捉を用いたリンカー戦略と比較して、所望の生成物上に残留部分が存在しない。よって、最終生成物を得るための最終切断工程が必要とされない（すなわち、切断による、または厳しい切断条件により引き起こされる副生物による汚染がない）。

したがって、第１の態様では、本発明は、固相ペプチド合成における、キャッピング部分および捕捉部分を含むキャッピングおよび捕捉（ｃａｐ－ｃａｐｔ）試薬の使用であって、前記キャッピング部分がカルボン酸または活性化されたカルボン酸であり、前記捕捉部分が保護されたカルボニル基である、キャッピングおよび捕捉試薬の使用に関する。

本発明によると、ｃａｐ－ｃａｐｔ試薬は固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）において使用される。固相ペプチド合成は、固体支持体上でのアミノ酸誘導体の連続的反応によりペプチド鎖の高速合成による合成を可能にする。固体支持体は、出現するペプチド鎖に連結する、反応性基で官能化した小さなポリマー樹脂ビーズからなってよい（例えば、アミンまたはヒドロキシル基）。ペプチド鎖Ｎ末端にカップリングすることになる各アミノ酸は、それがカルボキシ、ヒドロキシルまたはアミノ基などの反応性官能基を含有する場合、そのＮ末端および側鎖上で保護されなければならない。このような保護は、使用されている側鎖および保護戦略に応じて、Ｎ末端アミノ基に対しては適当な保護基、例えば、Ｂｏｃ（酸に不安定）またはＦｍｏｃ（フルオレニルメチルオキシカルボニル）（塩基に不安定）を使用し、側鎖に対しては直交保護基、例えば、ｔｅｒｔ－ブチル、ベンジル、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、２，２，４，６，７－ペンタメチルジヒドロベンゾフラン－５－スルホニル（Ｐｂｆ）、トリチル、モノメトキシトリチル（Ｍｔｒ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、１－（４，４－ジメチル－２，６－ジオキソシクロヘキサ－１－イリデン）－３－メチルブチル（ｉｖＤｄｅ）などを使用して達成することができる。一般的なＳＰＰＳの手順は、Ｎ末端脱保護とカップリング反応とが交互するサイクルの繰返しである方法である。樹脂は各工程と工程との間に洗浄することができる。最初に、保護されたアミノ酸をＤＩＣ／ＯｘｙｍａまたはＨＢＴＵなどのカップリングまたは活性化試薬、およびＤＩＰＥＡなどの塩基を使用して樹脂にカップリングする。キャッピング工程は、無水酢酸などのキャッピング試薬を使用して、次のカップリング工程におけるさらなる反応から未反応のアミノ基をブロックするためにその後適用されてもよい。続いて、アミンを脱保護し、次いで次のアミノ酸の遊離酸とカップリングする。所望の配列が合成されるまでこのサイクルを繰り返す。合成の終わりに、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）などの試薬強酸または求核種を使用してすべての保護基を同時に除去しながら、粗ペプチドを固体支持体から切断する。水、チオール、硫化物またはシランなどの捕捉剤をＴＦＡに加えてもよい。粗ペプチドをジエチルエーテルなどの非極性溶媒から沈殿させて、可溶型有機副産物を除去することができる。

ＳＰＰＳの間に、所望の配列／組成物の完全長合成ペプチドを得ることができる。しかし、各カップリング工程の高い効率にもかかわらず、成長するペプチド鎖上の少量のアミノ酸は連続的なアミノ酸に反応しないことがあり、短縮したまたは不良のペプチド配列をもたらす。不良ペプチド配列はＳＰＰＳにおいて形成される主要副産物を表す。主要（完全長）合成ペプチドと比較して、不良ペプチド配列の画分は、選択したペプチドの長さおよび複雑性が増加するにつれて増加する。不良ペプチドは、所望の完全長合成ペプチドから分離することが困難または不可能なこともある。本明細書に記載されているキャッピング工程、すなわち本開示に記載されているキャッピングおよび捕捉試薬に基づくキャッピング工程は、不良ペプチド配列の末端アミノ基をブロックし、よって、それがさらなるカップリング工程で反応することおよびアミノ酸欠失を有するペプチド配列を形成することを阻止する。したがって、このｃａｐ－ｃａｐｔ試薬は完全長合成ペプチドの精製のための手段も提供する。

「不良のペプチド」または「不良ペプチド配列」とは本開示によると、ＳＰＰＳサイクル完了後、最後から２番目のアミノ酸上に非保護のアミノ基を有するペプチドである。当業者であれば、このような短縮したペプチドは、不完全なカップリング反応の結果であることを理解している。その後のカップリング工程において不良のペプチドがさらにカップリングされることを阻止するため、この不良ペプチドをキャッピングすることができ、これは常套的に無水酢酸で行われる。また他には、この不良ペプチドを活性化させることもでき、これを次の合成サイクルで反応させ、よって「ｎ－１」－ペプチド、すなわち完全長合成ペプチドに非常に似ているが、１個のアミノ酸だけ短いペプチドをもたらすこともできる。

本明細書で開示されているキャッピングおよび捕捉（ｃａｐ－ｃａｐｔ）試薬は、ペプチド合成中に不良のペプチド配列をキャッピングし、固相ペプチド合成後に不良のペプチド配列を除去することを可能にする。キャッピング部分は、ＳＰＰＳの副産物上に位置する第１の反応性基、例えば、不良のペプチドと反応して、不良のペプチド配列がさらに反応するのを阻止する。キャッピングおよび捕捉試薬の一部である捕捉部分は、捕捉部分をさらなる反応性基と化学選択的に反応させることによって、それら不良のペプチド配列の除去を可能にする。捕捉部分は、完全長合成ペプチド上には存在せず、キャッピングした不良ペプチド配列上のみに存在するので、あらゆる不良ペプチドは、所望の完全長合成ペプチドから簡単に分離することができる。

反応性基とは、結合を形成することが可能な、好ましくは別の反応性基と共有結合を形成することが可能な化学基である。

本発明の場合、第１の反応性基はアミノ基、特に不良ペプチド上の末端アミノ基である。この末端アミノ基は、本明細書で開示されているｃａｐ－ｃａｐｔ試薬のキャッピング部分と反応する。

さらなるまたは第２の反応性基は、ｃａｐ－ｃａｐｔ試薬の捕捉部分と反応する反応性基である。第２の反応性基は固体支持体上に位置する。

適切な第２の反応性基はアミノオキシ基またはヒドラジン基である。

本発明に開示された使用、方法およびキットによると、ｃａｐ－ｃａｐｔ試薬はキャッピング部分および捕捉部分を含み、キャッピング部分はカルボン酸または活性化したカルボン酸である。

本発明によると捕捉部分は保護されたカルボニル基である。一実施形態では保護されたカルボニル基はアセタールまたはケタールである。

カルボン酸はカルボキシル基－Ｃ（Ｏ）ＯＨを含む有機化合物である。

本発明の一実施形態では、ｃａｐ－ｃａｐｔ試薬のキャッピング部分はカルボン酸基である。

そのカルボン酸形態でのｃａｐ－ｃａｐｔ試薬の活性化はカップリング試薬を用いた処理により行うことができる。活性化は、ｃａｐ－ｃａｐｔ試薬を不良ペプチド配列に添加する前に実施することができる。代わりに、ｃａｐ－ｃａｐｔ試薬の活性化は、不良ペプチド配列とすでに接触させながら行ってもよい。後者の場合、活性化は、固相ペプチド合成に対しても使用している少なくとも１種の試薬を用いて行うことができる。例えばカップリング試薬がｃａｐ－ｃａｐｔ試薬の活性化のために使用される場合、カップリング試薬は、保護されたアミノ酸をカップリングして、ペプチド配列を作り上げるために使用されるカップリング試薬と同じものであってもよい。

一実施形態ではキャッピング部分は活性化したカルボン酸である。当業者は活性化したカルボン酸という用語に精通している。活性化したカルボン酸は、求核攻撃を極めて受けやすいカルボン酸誘導体である。一実施形態では活性化したカルボン酸は、アミノ基と反応性のあるカルボン酸の誘導体である。１つの例では、不良ペプチド上のアミノ基は活性化したカルボン酸と反応して、アミド結合（またはペプチド結合）を形成する。

活性化したカルボン酸の例は、ハロゲン化アシル、無水物、ペンタフルオロフェニルエステル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルまたはＮ－ヒドロキシベンゾトリアゾールエステルなどである。

本発明の一実施形態では、キャップ－捕捉試薬は、１つのキャッピング部分と１つの捕捉部分とを含む。

さらなる実施形態では、ｃａｐ－ｃａｐｔ試薬は、式（Ｉ）：

［式中、
Ｒ１は、水素または置換されていてもよいアルキルであり、
Ｒ２は、ＯＲ５またはハロゲンであり、
各Ｒ３およびＲ４は、独立して、置換されていてもよいアルキルであるか、またはこれらが結合している酸素原子と一緒になって、置換されていてもよい５員もしくは６員環を形成し、
Ｒ５は、Ｈ、スクシンイミド、ペンタフルオロフェニル、ベンゾトリアゾール、無水物および

から選択され、
ｎは、独立して、０、１、２、３または４である］を有する。

「アルキル」は本明細書で使用される場合、好ましくは１～５個の炭素原子を有する、一般式Ｃ_ｎＨ_２ｎ＋１の飽和した分枝または直鎖の化学基である。「置換されていてもよいアルキル」とは、一般式Ｃ_ｎＨ_２ｎ＋１の飽和した分枝または直鎖の化学基であり、水素原子の少なくとも１個が異なる基または原子、すなわち置換基により置き換えられている。置換基の例は、ハロゲン、－ＣＮ、－ＮＯ_２、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１１）_２、－ＣＯＯ（Ｒ１１）、－Ｏ（Ｒ１１）、－Ｎ（Ｒ１１）_２であり、Ｒ１１は、独立して、ＨまたはＣ_１～Ｃ_３アルキルである。

これらが結合している酸素原子と共に各Ｒ３およびＲ４により形成されてもよい５員または６員環における任意選択の置換基は、例えば、メチルまたはエチルなどのアルキルである。

一実施形態では活性化したカルボン酸は、当技術分野で公知の適切なカップリング試薬の誘導体と共に形成されるエステル結合を含む。残基Ｒ２またはＯＲ５のある特定の実施形態はそれぞれ、カルボン酸と、カルボジイミド、例えば、ＤＣＣ（Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド）、ＤＩＣ（ジイソプロピルカルボジイミド）、ＥＤＣ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）、ＥＤＡＣ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）またはＷＳＣ（水溶性カルボジイミド）とを、任意選択で添加剤、例えば、ＨＯＢｔ（ヒドロキシベンゾトリアゾール）、ＨＯＡｔ（１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール）、ＨＯＯＢｔ、（３－ヒドロキシ－１，２，３－ベンゾトリアジン－４－オン）、ＨＯＳｕ、（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド）、ＯｘｙｍａＰｕｒｅ（２－シアノ－２－（ヒドロキシイミノ）アセテート）もしくはＤＭＡＰ（４－ジメチルアミノピリジン）と組み合わせて、ホスホニウム試薬、例えば、ＢＯＰ（ベンゾトリアゾール－１－イル－オキシ－トリス－（ジメチルアミノ）－ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＰｙＢＯＰ（ベンゾトリアゾール－１－イル－オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＰｙＢｒＯＰ、（３－ヒドロキシ－１，２，３－ベンゾトリアジン－４－オン）、ＰｙＡＯＰ（（７－アザベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＰｙＯｘｉｍ（［エチルシアノ（ヒドロキシイミノ）アセタト－Ｏ^２］トリ－１－ピロリジニルホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）もしくはＤＥＰＢＴ（３－（ジエトキシホスホリルオキシ）－１，２，３－ベンゾトリアジン－４（３Ｈ）－オン）と組み合わせて、アミニウム／ウラン－イモニウム試薬、例えば、ＴＢＴＵ、ＨＢＴＵ（（２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＨＣＴＵ（Ｏ－（１Ｈ－６－クロロベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＨＤＭＣ（Ｎ－［（５－クロロ－３－オキシド－１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－４－モルホリニルメチレン］－Ｎ－メチルメタンアミニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＴＡＴＵ（Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート）、ＨＡＴＵ（１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスフェート）、ＣＯＭＵ（（１－シアノ－２－エトキシ－２－オキソエチルイデンアミノオキシ）ジメチルアミノ－モルホリノ－カルベニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＴＯＴＴ（２－（１－オキシ－ピリジン－２－イル）－１，１，３，３－テトラメチルイソチオウロニウムテトラフルオロボレート）もしくはＴＦＦＨ（テトラメチルフルオロホルムアミジニウムヘキサフルオロホスフェート）と組み合わせて、または他のカップリング試薬、例えば、ＥＥＤＱ（Ｎ－エトキシカルボニル－２－エトキシ－１，２－ジヒドロキノリン）、Ｔ３Ｐ（ホスホン酸プロピル無水物）、ＤＭＴＭＭ（４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチル－モルホリニウムクロリド）、ＢＴＣ（ベンゼン－１，３，５－トリカルボン酸）もしくはＣＤＩ（１，１’－カルボニルジイミダゾール）（例えば、Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣｈｅｍＦｉｌｅｓ、２００７年、７巻、Ｎｏ．２、ＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓを参照されたい）と組み合わせて反応させることにより形成されるものである。

さらなる実施形態では、キャッピングおよび捕捉試薬は、

［式中、
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は、それぞれ独立して、水素およびアルキルから選択され、
Ｒ１０は置換されていてもよいアルキルである］からなる群から選択される。

一実施形態では、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９のそれぞれは、独立して、水素およびＣ_１～Ｃ_３アルキルから選択される。

Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９のそれぞれは水素であってよい。

Ｒ１０は、メチルまたはエチルであってよい。

Ｒ１は、独立して、水素、メチルまたはエチルであってよい。

キャッピング部分の一部である残基Ｒ２は、独立して、Ｆ、ＣｌおよびＢｒ、Ｏ－スクシンイミド、Ｏ－ペンタフルオロフェニル、Ｏ－ベンゾトリアゾール、無水物および

からなる群から選択されてもよい。

ｃａｐ－ｃａｐｔ試薬は、

から選択されてもよい。

好ましい実施形態では、ｃａｐ－ｃａｐｔ試薬は、

である。

本発明のさらなる態様は、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）のための方法であって、個々のアミノ酸が、Ｆｍｏｃ－化学反応を介して互いにカップリングしており、少なくとも１つのカップリング工程後、本発明によるキャッピングおよび捕捉試薬が不良ペプチド配列のキャッピングのために使用される方法に関する。

Ｆｍｏｃは、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル、すなわち有機化学合成における保護基を表す。

固相ペプチド合成を表すＦｍｏｃ化学反応において、ペプチド鎖は、不溶性（樹脂）支持体に結合しながら、１回に１個のアミノ酸ずつ段階的に組み立てられる。アミノ酸はＦｍｏｃ基によりこれらのアミノ末端において保護され、これらのカルボン酸末端の活性化後、成長鎖にカップリングする。このアミノ酸の活性化したカルボン酸は、成長するペプチド鎖の末端アミノ基と反応する。次いで、Ｆｍｏｃ基は塩基による処理により除去され、このプロセスは繰り返される。ペプチドが組み立てられた後、これは、例えば、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）による処理で不溶性樹脂支持体から除去される。同時に、アミノ酸側鎖上の保護基もまた除去されて、粗直鎖ペプチドを生成する。

さらに詳細には、段階的固相Ｆｍｏｃ－化学反応を使用したペプチド合成のための常套的プロセスは以下を含む：（ａ）双極性非プロトン溶媒中でペプチド合成に適合した樹脂を膨潤させる工程；（ｂ）存在する場合、双極性非プロトン溶媒中のピペリジン溶液を使用して、樹脂上のＦｍｏｃ基を脱保護する工程；（ｃ）Ｆｍｏｃ脱保護後、双極性非プロトン溶媒で樹脂を洗浄する工程；（ｄ）脱保護した樹脂にカップリングさせるために、双極性非プロトン溶媒中にＦｍｏｃ－アミノ酸、カップリング試薬（複数可）（例えば（２－（６－クロロ－１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルアミニウムヘキサフルオロホスフェート）（ＨＣＴＵ）または２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）／１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）とＤＩＰＥＡ）を溶解することによって、Ｆｍｏｃ－アミノ酸を活性化する工程；（ｅ）活性化したＦｍｏｃ－アミノ酸溶液を反応器内の樹脂に充填する工程；（ｆ）活性化したＦｍｏｃ－アミノ酸を樹脂上のＮ末端アミノ基にカップリングさせる工程；（ｇ）各Ｆｍｏｃ－アミノ酸のカップリング後、樹脂を洗浄する工程；（ｈ）任意選択で未反応アミノ基をキャッピングする、例えば、樹脂上の不良ペプチド配列をキャッピング試薬（例えば、無水酢酸）でキャッピングする工程；（ｉ）完全長合成ペプチドが形成されるまで工程（ｂ）～（ｈ）を繰り返す工程；（ｊ）アミノ酸側鎖を同時に脱保護しながら、切断カクテルを使用して所望のペプチドを樹脂から切断する工程；（ｊ）切断混合物を樹脂から濾過する工程；ならびに（ｋ）濾液を蒸発および／または沈殿させ、有機溶媒を用いて粗生成物を濃縮溶液から部分的に精製して、部分的に精製されたペプチドを生成する工程。

上記の標準的Ｆｍｏｃ合成の一般的概要に示されている通り（工程（ｈを参照）、無水酢酸を用いたキャッピング工程は、未反応のアミノ基、特に所望のペプチド配列の最後から２番目の未反応アミノ酸上のアミノ基をキャッピングするために使用することができる。しかし、無水酢酸が使用される場合、短縮したペプチドから完全長ペプチドを分離するのは困難となり得、普通高度なＨＰＬＣ方法が必要とされる。

本明細書で開示されている使用および手順に従い、不良ペプチドは、工程（ｈ）において、上記に概説されているように、本開示によるキャッピングおよび捕捉試薬でキャッピングする。前記キャッピング中に、キャッピング部分と非保護のアミノ基（不良ペプチド配列の上）との間にアミド結合が形成される。こうして、ｃａｐ－ｃａｐｔ試薬のキャッピング部分と反応し、それぞれ固相に結合した、保護された捕捉部分および完全長合成ペプチドを含む少なくとも１つの「不良ペプチド配列」が得られる。本発明によるＳＰＰＳ方法では、不良ペプチド配列は、キャッピング工程を介して結合したｃａｐ－ｃａｐｔ試薬を含む。

さらなる態様では、本発明は、（完全長）合成ペプチドの精製のための方法であって、
－本発明による固相ペプチド合成を実施する工程、
－こうして合成した化合物を固相から切断する工程、
－捕捉部分を脱保護する工程、および
－脱保護した捕捉部分を固体樹脂支持体に結合し、これにより少なくとも１つの不良ペプチド配列を固体樹脂支持体に結合する工程、および
－不良ペプチドを含む固体樹脂支持体から完全長合成ペプチドを分離する工程
を含む、方法に関する。

好ましい実施形態では、固体樹脂支持体はアミノオキシ樹脂、またはヒドラジン樹脂である。

（完全長）合成ペプチドの精製のための方法の個々の工程は以下に例示されている。

ペプチド合成の完了後、合成されたペプチド鎖は固相から切断する。この切断工程は適当な試薬の添加により実施される。普通、ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）などの強酸、捕捉剤（求核剤）と組み合わせたＴＦＡ、例えば、添加剤、例えば、水、シラン、例えば、ＴＥＳ（トリエチルシラン）またはＴＩＳ（トリイソプロピルシラン）、チオール、例えば、メルカプトエタノール、ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）、エタンジチオール（ＥＤＴ）またはジオキサ－１，８－オクタン－ジチオール（ＤＯＤＴ）、硫化物、例えば、チオアニソールまたはエチルメチルスルフィドまたはエーテル、例えば、アニソールなどとのＴＦＡ混合物が使用される。

不良ペプチドにおける保護された捕捉部分を脱保護することなく、合成した完全長合成ペプチドを固相から切断することは可能であり得るが、固体支持体からの合成ペプチドの切断と、捕捉部分の脱保護との両方を遂行する条件が普通選択される。よって、不良ペプチドに結合しているｃａｐ－ｃａｐｔ試薬の捕捉部分（および依然として存在するあらゆるｃａｐ－ｃａｐｔ試薬の捕捉部分）を脱保護する。好ましい実施形態では、捕捉部分の脱保護工程は、樹脂からペプチドを切断する切断工程と同時に実施して、側鎖アミノ酸保護基を脱保護し、よって同じ試薬を使用する。

一実施形態では、固相は混合物から濾過する。本実施形態では、濾液は好ましくは、全長合成ペプチドと、不良ペプチドに結合しているｃａｐ－ｃａｐｔ試薬を含む不良ペプチドとの混合物を含む。

一実施形態では、不良ペプチドに結合したｃａｐ－ｃａｐｔ試薬の脱保護した捕捉部分はアミノ基を含む樹脂に結合する。好ましい実施形態では、脱保護した捕捉部分はアミノオキシ樹脂、またはヒドラジン樹脂に結合する。結合は、それぞれのアミノオキシ樹脂、またはヒドラジン樹脂を脱保護した捕捉部分に添加することにより達成される。結合工程を用いて、不良ペプチド配列（ｃａｐ－ｃａｐｔ試薬を介してキャッピング）はアミノオキシ樹脂またはヒドラジン樹脂に結合する。脱保護した捕捉基とアミノオキシ樹脂またはヒドラジン樹脂との間の結合は、オキシムまたはヒドラゾン結合を介して一般的に達成される。

アミノオキシ樹脂ならびにヒドラジン樹脂は固体支持体を含む。固体支持体は一般的に当技術分野で周知であり、ビーズ、カラム、アレイ、マルチウェルプレート、フィルターまたは他の表面基質を含む。一実施形態ではアミノオキシ樹脂またはヒドラジン樹脂はそれぞれビーズ、カラムまたはフィルターの形態である。一実施形態ではアミノオキシ樹脂またはヒドラジン樹脂はそれぞれビーズまたはフィルターの形態である。

その後の工程において、完全長合成ペプチドは、これに結合している（ｃａｐ－ｃａｐｔ試薬を介して）不良ペプチド配列を有する固体樹脂支持体、例えば、アミノオキシ樹脂またはヒドラジン樹脂から分離される。分離は、例えば、濾過、沈降、または遠心分離により達成することができる。

記述されている分離を用いれば、合成した合成ペプチドの効率的なおよび対費用効果の高い精製が可能である。このような精製は、労働集約的な、値段の高いおよび時間を消費するＨＰＬＣ工程を必要としない。むしろ本明細書で開示されている手順に従い合成した数個から多くのペプチドが、経済的におよび並行して精製され得る。

さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載されているｃａｐ－ｃａｐｔ試薬および少なくとも１種のアミノオキシ樹脂またはヒドラジン樹脂を含むキットを対象とする。

さらなる態様では、本発明は、不良ペプチド配列からの完全長ペプチドの分離のための、本明細書に記載されているｃａｐ－ｃａｐｔ試薬と、少なくとも１種のアミノオキシ樹脂またはヒドラジン樹脂とを含むキットの使用を対象とする。

好ましい実施形態では、キットは、固相ペプチド合成で得たペプチドの精製に使用される。

本発明による使用は、本発明の方法に対して特定されたようにさらに定義することができる。特に、本開示のさらなる態様に使用されている用語に関しては、本開示の第１の態様において使用されている用語、実施例および特定の実施形態を指すが、これらは、本開示のさらなる態様にもまた適用可能である。

一般的に、本開示は、本明細書に記載されている特定の方法論、プロトコル、および試薬に限定されない。理由はこれらが変動し得るからである。さらに、本明細書で使用されている用語は、特定の実施形態のみについて記載する目的のためのものであり、本開示の範囲を限定することを意図しない。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が他を明確に指さない限り、複数についての言及を含む。同様に、単語「含む」、「含有する」および「包含する」は、端を含めないというよりもむしろ、端を含めると解釈される。

他に定義されていない限り、本明細書で使用されているすべての技術的および科学的用語および任意の頭字語は、本開示の分野の当業者により共通して理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似のまたは同等の任意の方法および材料を本明細書で提示された実施において使用することができるが、特定の方法、および材料が本明細書に記載されている。

本開示は以下の図および実施例によりさらに例示されるが、ただし、他に具体的に示されていない限り、図および実施例は、例示目的のためのみに含まれ、本開示の範囲を限定することを意図しないと理解される。

それぞれキャッピングおよび捕捉試薬１、または（１’）、および２ならびにアミノ－オキシＰＥＧＡ樹脂３の合成に対する一般的な反応スキームを図示している。エチル２，２－ジエトキシアセテートおよびエチル－２－メチル－１，３－ジオキソラン－２－アセテート（フラクトン）が、キャッピング部分を含有する、アルデヒドおよびケトンの合成に対して出発点として選択された。エステルをＮａＯＨで加水分解し（工程ａ）、続いてジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）で処理して対応する対称的な無水物へと変換した（工程ｂ）。試薬１および２を用いたキャッピングおよび脱保護を図示している。短いペプチド（ＷＥＧＳＫＹＡ）を標準的なＦｍｏｃベースのＳＰＰＳで合成した。５のカップリング後、一部の樹脂を容器から取り出し、試薬１または試薬２で処理した（化学量論的量のルチジンを有するＤＭＦ中）。脱保護し、これらのペプチドを樹脂から切断するため、ＴＦＡ、５％アニソール、５％チオアニソールおよび５％水を含有する切断カクテルを使用した。これは、トリイソプロピルシランの使用は、アルデヒドのアルコールへの還元を引き起こすと記載されているからである。切断カクテルで２時間処理した後、ペプチドを冷たいジイソプロピルエーテルで沈殿させ、ＬＣＭＳで分析した。これにより、両方の試薬によるキャッピングは定量的に生じたが、試薬２が順調に脱保護されてケト－キャッピングしたペプチド５を生成したのに対し、試薬１はアセタールとして依然として定量的に保護されていたことが明らかとなった。粗混合物を再度ＴＦＡ中に再び溶解し、２４時間後、室温での脱保護を最終的に観察した。本発明によるｃａｐ－ｃａｐｔ試薬を用いたペプチド配列のキャッピングを図示している。２つのＨＰＬＣクロマトグラムを図示している。図４ａは、ＷＥＧＳＫＹＡ（配列番号１）６とケト－キャッピングしたＧＳＫＹＡ（配列番号２）５の混合物のＨＰＬＣクロマトグラムを図示している。図４ｂは、アミノ－オキシ樹脂３との２時間のインキュベーション後のＨＰＬＣクロマトグラムを図示している。２つのＨＰＬＣクロマトグラムを図示している。図５ａは、アンジオテンシンＩの粗混合物の２１４ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラムおよびＳＰＰＳ後の終止配列を図示している。図５ｂは、アミノ－オキシ樹脂３とのインキュベーション後のアンジオテンシンＩの２１４ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムを図示している。モデルシステムとして、生物学的１０ｍｅｒアンジオテンシンＩ（ＤＲＶＹＩＨＰＦＨＬ）（配列番号３）を合成した。条件にストレスをかけるため、１工程当たり１当量のみのアミノ酸との単一カップリングを行った。粗物質のＬＣＭＳ分析は、プロリン後の主要な終止およびバリンおよびチロシン後のさらなる終止を明らかにした。これらのすべてを、試薬２で定量的にキャッピングした（Ｍ＋８４）（図５ａ）。混合物をｐＨ＝４．５でアセテートバッファーに溶解し、アミノオキシ樹脂３上で２時間インキュベートして、良好な純度で完全長アンジオテンシンＩ（図５ｂ）を得た。注目すべきはケト－キャッピングした短縮型Ｃａｐ－ＰＦＨＬ（配列番号４）の完全な除去であり、これは主要産物と共溶出している。４つのＨＰＬＣクロマトグラムを図示している。モデルペプチドとして、２８ｍｅｒｄｅｓ－オクタノイルグレリン（ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ）（配列番号５）を２０μｍｏｌスケールで合成した。ＳＰＰＳ後、粗製のｄｅｓ－オクタノイルグレリンを純度７２％で得た。粗生成物をアセテートバッファー（ｐＨ＝４．５、０．１Ｍ）に溶解し、ＨＰＬＣ－ＭＳで分析した（図６ａ）。粗生成物を２つの等しいアリコートに分割した。第１のアリコートは分取ＨＰＬＣで精製し（図６ｂ）、第２のアリコートはアミノ－オキシ樹脂３上で２時間インキュベートした（図６ｃ）。ＨＰＬＣ精製により、純度９９％および収率（最初の樹脂充填量それぞれに対して）２５％を得た。ｃａｐ－ｃａｐｔ試薬を用いた戦略により純度９２％および収率４８％を得た（図６ｃ）。図６ｄは、生成物が分取ＨＰＬＣの対象下におかれた場合のＨＰＬＣクロマトグラムを図示している。ＨＰＬＣ不要のペプチド精製に対するキャッピングおよび捕捉試薬の使用の略図である。酸の切断およびペプチドの脱保護の間、アセタールを含有するキャッピング部分はケトンに変換し、このケトンは、アミノ－オキシ樹脂により化学選択的に捕捉することができる。全長ペプチドは溶液中に純粋な生成物として残留する。

実施例１
エステル加水分解に対する一般的手順（図１も参照されたい）（Ｔａｒｔａｇｇｉａ，Ｓ．；Ｆｏｇａｌ，Ｓ．；Ｍｏｔｔｅｒｌｅ，Ｒ．；Ｆｅｒｒａｒｉ，Ｃ．；Ｐｏｎｔｉｎｉ，Ｍ．；Ａｕｒｅｌｉ，Ｒ．；ＤｅＬｕｃｃｈｉ，Ｏ．、ＣｈｅｍｏｅｎｚｙｍａｔｉｃＳｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆ δ－Ｋｅｔｏ β－ＨｙｄｒｏｘｙＥｓｔｅｒｓａｓＵｓｅｆｕｌＩｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓｆｏｒＰｒｅｐａｒｉｎｇＳｔａｔｉｎｓ．ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＯｒｇａｎｉｃＣｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０１６年、２０１６巻（１９号）、３１６２～３１６５頁を参照）：メチル２，２－ジメトキシアセテート、エチル２，２－ジエトキシアセテート、またはフラクトン（７５ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ（１００ｍＬ）中溶液のそれぞれに、ＮａＯＨ（２Ｍ水溶液、５０ｍＬ）を加えた。反応物を室温で４時間撹拌後、ＥｔＯＨを減圧下で除去した。次いで、水相をジイソプロピルエーテル（２×２０ｍＬ）で洗浄し、２ＭＨＣｌで酸性化し、ＥｔＯＡｃ（３×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機画分をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去して、わずかに黄色の油状物質として所望の生成物を生成した（２，２－ジメトキシ酢酸（１ａ’）；２，２－ジエトキシ酢酸（１ａ）：８５％；２ａ：７９％それぞれ）。すなわち、化合物１を収率８５％で得て、化合物２を収率７９％で得た。これは、キャッピング試薬を好収率および好純度で得るためには、クロマトグラフィー精製は必要なく、第１工程における抽出および第２の工程における濾過のみが必要であることを意味する。単一の合成作動において無水物１００ｇまでのスケールは簡単に可能であった。捕捉樹脂のベースとして、有機溶媒と水性溶媒の両方と作用するのに適しているＰＥＧベースのポリマー（ＡｍｉｎｏＰＥＧＡ（登録商標）樹脂）を使用した。Ｂｏｃ－アミノ－オキシ－酢酸を樹脂（工程ｃ）上に組み込み、ＴＦＡ（工程ｄ）で脱保護した（図１も参照されたい）。

生成物は、さらに精製せずに次の工程で使用した。

無水物合成に対する一般的手順（図１も参照されたい）：２，２－ジメトキシ酢酸（１ａ’）、２，２－ジエトキシ酢酸（１ａ）または２－（２－メチル－１，３－ジオキソラン－２－イル）酢酸（２ａ）（２０ｍｍｏｌ）のＣＨ_２Ｃｌ_２中溶液に、０℃でＮ、Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（１０ｍｍｏｌ）をゆっくりと加えた。激しい撹拌下で、反応物を室温まで温めた。３時間後、反応物を濾過し、固体を除去し、濾液の溶媒を減圧下で除去して、２種の無水物をそれぞれ定量的収率で、わずかに黄色の樹脂として生成し、これらをさらに精製せずに使用した。

２，２－ジメトキシ無水酢酸（１’）：
¹H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 3.45 (s, 12 H) 4.93 (s, 2 H)
２，２－ジエトキシ無水酢酸（１）：
¹H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 1.10 (t, 12 H) 3.50 (q, 8 H) 4.93 (s, 2 H)
２－（２－メチル－１，３－ジオキソラン－２－イル）無水酢酸（２）：
¹H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 1.50 (s, 6 H) 2.82 (s, 4 H) 3.98 (s, 8 H)

アミノ－オキシＰＥＧＡ樹脂（３）の合成（図１も参照されたい）：アミノ－ＰＥＧＡ－樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、１．００ｇ、充填量０．３７ｍｍｏｌ／ｇ）をＤＭＦ（５×１０ｍＬ）で洗浄した。Ｂｏｃ－アミノ－オキシ－酢酸（２１２ｍｇ、１．１１ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（３８０ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（３８３μＬ、２．２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１０ｍＬ）中で混合し、樹脂に加えた。室温で３０分の振盪後、樹脂をＤＭＦで洗浄し、Ｋａｉｓｅｒ試験で残留するアミノ基がないことを確認した。ＴＦＡ＋２％Ｈ_２Ｏで樹脂を１時間処理し、その後、アセテートバッファー（０．１Ｍ、ｐＨ＝４．５）で洗浄して、所望のアミノオキシ樹脂を生成した。

実施例２
ペプチド合成：ＳｙｒｏＩシンセサイザーおよびＲｉｎｋ－ＡｍｉｄｅＴｅｎｔａｇｅｌ樹脂（充填量０．１９ｍｍｏｌ／ｇ）を使用して、自動化されたＦｍｏｃベースの固相ペプチド合成を実施した。樹脂をＤＭＦ中２０％ピペリジンで、２ｘ５分間処理することにより、Ｆｍｏｃ脱保護を実施した。連続的なＦｍｏｃ－保護されたアミノ酸（ＮＭＰ中０．２５Ｍ＋ＨＯＡｔ０．２５Ｍ）を、ＨＣＴＵ（０．８Ｍ）およびＮ－メチルモルホリン（ＮＭＭ、ＤＭＦ中３Ｍ）を使用して、樹脂上で、室温で１５分間カップリングした。他に述べられていない場合、各カップリングに対して、５当量のアミノ酸（それぞれ樹脂充填量に対して）を使用し、カップリングを２回繰り返した。樹脂を２－（２－メチル－１，３－ジオキソラン－２－イル）無水酢酸（２）およびルチジン（両方ともＤＭＦ中０．５Ｍ；２０当量、それぞれ樹脂充填量に対する）で処理することにより、遊離残留アミノ官能基のキャッピングを実施した。ＴＦＡ／チオアニソール／アニソール／Ｈ_２Ｏ（８５：５：５：５）を使用して、樹脂からの切断を実施した。このカクテルを用いて樹脂を３０分間インキュベートし、次いで切断溶液を室温で１～２時間保持した。窒素流下で溶液の容量を減少させた後、ジイソプロピルエーテルを用いた沈殿および遠心分離により粗ペプチドを得た。

実施例３
上記に記載されている標準的な方法に従い（ただし、キャッピングに対して、２の代わりに無水酢酸を使用）、ペプチド配列Ｈ－ＳＫＳＹＳ－樹脂（配列番号６）（１０μｍｏｌ）を合成した。樹脂を２等分（各５μｍｏｌ）に分割した。第１のアリコートを２（ＤＭＦ中０．５Ｍ、０．５ｍＬ）およびＮＭＭ（Ｎ－メチルモルホリン）（ＤＭＦ中３Ｍ、１００μＬ）の溶液で１５分間処理した。第２のアリコート（アリコート２）を２ａ（ＤＭＦ中０．５Ｍ、０．５ｍＬ）、ＮＭＭ（ＤＭＦ中３Ｍ、１００μＬ）およびＨＣＴＵ（２－（６－クロル－１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルアミニウム－ヘキサフルオロホスフェート（ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔ））（ＤＭＦ中０．８Ｍ、２５０μＬ）の溶液で１５分間処理した。ＴＦＡ／チオアニソール／アニソール／Ｈ_２Ｏ（８５：５：５：５）を使用して、樹脂からの切断を実施した。両方のキャッピング方法は、末端アミノ基の完全なキャッピングを示した（図３）。
ＭＳ（ＥＳＩ）：６５４．２８［Ｍ＋Ｈ］^＋

実施例４
上記に記載されている標準的方法（ただし、キャッピングに対して、２の代わりに無水酢酸を使用する）に従い、ペプチド配列Ｈ－ＧＳＫＹＡ－樹脂（配列番号７）（１５μｍｏｌ）を合成した。図２に例示されているように、樹脂を３等分（各５μｍｏｌ）に分割した。第１のアリコート（アリコート１）を１（５０μｍｏｌ）および２，６－ルチジン（５０μｍｏｌ）のＤＭＦ（１ｍＬ）中溶液で１５分間処理した。第２のアリコート（アリコート２）を２（５０μｍｏｌ）および２，６－ルチジン（５０μｍｏｌ）のＤＭＦ（１ｍＬ）中溶液で１５分間処理した。ＴＦＡ／チオアニソール／アニソール／Ｈ_２Ｏ（８５：５：５：５）を使用して、樹脂からの切断を実施した。アリコート１もアリコート２も末端アミノ基の完全なキャッピングを示した。アリコート２のアセタールを完全に脱保護して、対応するケトンを生成した一方で、アリコート１のアセタール保護は切断手順後も依然として無傷のままであった。残留するアリコート（アリコート３）を２つのさらなる固相合成工程の対象下におき、樹脂からの切断後、ペプチドＨ－ＷＥＧＳＫＹＡを生成した。

実施例５
ケトキャッピングしたＧＳＫＹＡ（配列番号２）（５）（１μｍｏｌ）およびＨ－ＷＥＧＳＫＹＡ（配列番号１）（６）（１μｍｏｌ）をアセテートバッファー（０．１Ｍ、ｐＨ＝４．５）に溶解し、ＨＰＬＣ－ＭＳで分析した（図４ａ）。アミノ－オキシＰＥＧＡ樹脂（３）を混合物に加え、２時間後、上澄み液をＨＰＬＣ－ＭＳで分析すると、６のみが溶液中に残されていることを示した（図４ｂ）。

実施例６
カップリングに対して使用されるアミノ酸の量を変えて、上記に記載されている手順に従い、アンジオテンシンＩを合成した：２×５当量Ｆｍｏｃ－アミノ酸の代わりに、１当量のアミノ酸との単一カップリングを実施した。粗生成物をアセテートバッファー（０．１Ｍ、ｐＨ＝４．５）に溶解し、ＨＰＬＣ－ＭＳで分析した（図５ａ）。アミノ－オキシＰＥＧＡ樹脂（３）を混合物に加え、２時間後、上澄み液をＨＰＬＣ－ＭＳで分析すると、大部分の不純物がうまく除去されたことを示した（図５ｂ）。

実施例７
上記に記載されている一般的なペプチド合成手順に従い、Ｄｅｓ－オクタノイルグレリン（ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ）（配列番号５）（２０μｍｏｌ）を合成した。粗生成物をアセテートバッファー（０．１Ｍ、ｐＨ＝４．５）に溶解し、ＨＰＬＣ－ＭＳで分析し（図６ａ）、７２％の所望の生成物を含有するという結果となった。混合物を２つのアリコートに分割した。第１のアリコートは分取ＨＰＬＣで精製し、純度９９％および収率２５％で所望の生成物を生成した（図６ｂ）。第２のアリコートはアミノ－オキシＰＥＧＡ樹脂（３）と共に２時間インキュベートした。所望の生成物を純度９２％および収率４８％で単離した（図６ｃ）。この生成物を分取ＨＰＬＣクロマトグラフィーの対象とすることで、生成物は、最終純度９９％および全収率３０％で単離することができた（図６ｄ）。

Claims

固相ペプチド合成における、キャッピング部分および捕捉部分を含むキャッピングおよび捕捉（ｃａｐ－ｃａｐｔ）試薬の使用であって、
前記キャッピング部分がカルボン酸または活性化したカルボン酸であり、前記捕捉部分が保護されたカルボニル基である、キャッピングおよび捕捉試薬の使用。
キャッピングおよび捕捉（ｃａｐ－ｃａｐｔ）試薬が、１つのキャッピング部分および１つの捕捉部分を含む、請求項１に記載のキャッピングおよび捕捉試薬の使用。
キャッピングおよび捕捉試薬が、式（Ｉ）：

［式中、
Ｒ１は、水素または置換されていてもよいアルキルであり、
Ｒ２は、ＯＲ５またはハロゲンであり、
各Ｒ３およびＲ４は、独立して、置換されていてもよいアルキルであるか、またはこれらが結合している酸素原子と一緒になって、置換されていてもよい５員もしくは６員環を形成し、
Ｒ５は、Ｈ、無水物、スクシンイミド、ベンゾトリアゾール、ペンタフルオロフェニル（ｐｅｎｔａｆｌｕｏｒｐｈｅｎｙｌ）、および

から選択され、
ｎは、独立して、０、１、２、３または４である］を有する、請求項１または請求項２に記載のキャッピングおよび捕捉試薬の使用。
キャッピングおよび捕捉試薬が、

［式中、
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は、それぞれ独立して、水素およびアルキルから選択され、
Ｒ１０は置換されていてもよいアルキルである］からなる群から選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載のキャッピングおよび捕捉試薬の使用。
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９が、それぞれ独立して、水素およびＣ_１～Ｃ_３アルキルから選択され、Ｒ１０がメチルまたはエチルである、請求項４に記載のキャッピングおよび捕捉試薬の使用。
Ｒ１が、独立して、水素、メチルまたはエチルである、請求項１から５のいずれか一項に記載のキャッピングおよび捕捉試薬の使用。
Ｒ２が、独立して、
Ｏ－スクシンイミド、Ｏ－ペンタフルオロフェニル、Ｏ－ベンゾトリアゾール、無水物および

からなる群から選択される、請求項１から６のいずれか一項に記載のキャッピングおよび捕捉試薬の使用。
キャッピングおよび捕捉試薬が、

から選択される、請求項１から６のいずれか一項に記載のキャッピングおよび捕捉試薬の使用。
個々のアミノ酸がＦｍｏｃ－化学反応を介して互いにカップリングし、少なくとも１つのカップリング工程の後、請求項１から８のいずれ一項に記載のキャッピングおよび捕捉試薬が不良ペプチド配列をキャッピングするために使用される、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）のための方法。
キャッピングおよび捕捉試薬のキャッピング部分がカルボン酸であり、キャッピング部分を、活性化剤を用いて活性化し、よって活性化したカルボン酸を調製する工程をさらに含み、活性化剤がＦｍｏｃ－化学反応の活性化剤に相当する、請求項９に記載の方法。
（完全長）合成ペプチドの精製のための方法であって、
－請求項９または１０に記載の固相ペプチド合成を実施する工程、
－こうして合成した化合物を固相から切断する工程、
－捕捉部分を脱保護する工程、および
－脱保護した捕捉部分を固体樹脂支持体に結合し、これにより少なくとも１つの不良ペプチド配列を固体樹脂支持体に結合する工程、および
－不良ペプチドを含む固体樹脂支持体から完全長合成ペプチドを分離する工程
を含む、方法。
固体樹脂支持体がアミノオキシ樹脂、またはヒドラジン樹脂である、請求項１１に記載の方法。
不良ペプチドを含む固体樹脂支持体からの完全長ペプチドの分離が、遠心分離または濾過により行われる、請求項１１または１２に記載の方法。
請求項１から８のいずれ一項に記載の少なくとも１種のキャッピングおよび捕捉試薬ならびに少なくとも１種のアミノオキシ樹脂、またはヒドラジン樹脂を含むキット。
固体支持体上に合成した化合物の精製のための、好ましくはペプチドの精製のための、請求項１４に記載のキットの使用。