JP2004513191A - ペプチドおよび小分子有機合成用の新しいリンカーに基づく固相支持体 - Google Patents
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Abstract
本発明は、新規なリンカーに基づく固相支持体、固相支持体上にリンカー部分を作り出す方法、ならびに支持体を用いてペプチドおよび小分子コンビナトリアル・ライブラリーを合成する方法に関し、本発明の新規な固相支持体はまた、ポリスチレンのような固相支持体に共有結合した官能化リンカーを含んでなる。
Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、ペプチド合成およびコンビナトリアル・ライブラリー合成に用いられる新規なリンカーに基づく固相支持体、固相支持体上にリンカー部分を作り出す方法、ならびに支持体を用いてペプチドおよび小分子コンビナトリアル・ライブラリーを合成する方法に関する。本発明の新規な固相支持体はまた、ポリスチレンのような固相支持体に共有結合した官能化リンカーを含む。
【０００２】
【従来の技術】
背景技術
固相合成の急速な発展は、より新しい合成課題を満たす新規かつ反応しやすい固相支持体の開発を要する。ペプチド合成用の固相支持体は非常によく確立されており、今般、環状ペプチド、ペプチドアミド、ペプチドアルデヒドなどの合成でさえ支持体上で直接可能となっている［（ａ） Ｂａｒａｎｙ， Ｇ． ｅｔ． ａｌ．， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔｉｄｅ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ． ３０， ７０５−７３９， １９８７．； （ｂ） Ｆｉｅｌｄｓ， Ｇ． Ｂ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔｉｄｅ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ． ３５， １６１−２１４， １９９０． （ｃ） Ｌｌｏｙｄ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ， Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ， ４９， １１０６５−１１１３３， １９９３ （ｄ） Ｗａｎｇ， Ｓ． Ｓ．， Ｊ． Ａｍｅｒ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ９５． １３２８， １９７３ （ｅ） Ｂａｒｌｏｓ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ３０， ３９４７， １９８９ （ｆ） Ｂｅｅｂｅ， Ｘ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．， ６０， ４２０４， １９９５ （ｇ） Ｒｉｎｋ， Ｈ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ２８， ３７８７， １９８７ （ｈ） Ｒａｐｐ． Ｗ．， ｅｔ ａｌ．， ”Ｐｅｐｔｉｄｅｓ １９８８”． Ｐｒｏｃ． ２０ｔｈ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ． Ｊｕｎｇ Ｇ． ａｎｄ Ｂｏｙｅｒ Ｅ． （ｅｄｓ．）， Ｗａｌｋｅｒ ｄｅ （Ｇｒｎｙｔｅｒ， Ｂｅｒｌｉｎ， ｐｐ １９９ １９８９］。さらに、有機小分子の合成はより反応しやすく広範囲の固相支持体を必要とする。シントンに結合する種々の官能基ならびに用いられる合成試薬および実験条件に対するそれらの安定性および感受性についての文献には、多数の支持体が報告されている［Ｏｅｓａｐａｙ， Ｇ．， ｅｔ ａｌ． ”Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｐｒｏｃ． １３ｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ”． Ｈｏｄｇｅｓ， Ｒ． Ｓ． ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ Ｊ． Ａ． （Ｅｄｓ．）， ＥＳＣＯＭ， Ｌｅｉｄｅｎ． ｐｐ ４３５． １９９４． （ｂ） Ｈｅｒｍｋｅｎｓ， Ｐ． Ｈ． Ｈ． ｅｔ ａｌ， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ， ５２， ４５２７． １９９６ （ｃ） Ｈｅｒｍｋｅｎｓ． Ｐ． Ｈ． Ｈ． ｅｔ ａｌ， Ｔｅｔｒａｈｅｒｏｎ， ５３． ５６４３． １９９７ （ｄ） Ｂｒｏｗｎ， Ｒ． Ｃ．， Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｐｅｒｋｉｎ−ｌ． ３２９３． １９９８］。ほとんどの場合、利用できる支持体は、分子に有害である強酸を含む固相支持体から分子を開裂させるために激しい条件を必要とする。さらに、アミノ分解および還元的開裂法は、特にペプチドの場合には、副反応およびラセミ化を引き起こす。他方、比較的温和な条件を必要とする支持体では、特に有機小分子の場合には、有機合成に用いられる種々の試薬および実験条件に耐えられない。従って、オルト適合性の新規かつ反応しやすい支持体の開発が極めて有益である。本質的に固体マトリックスと成長中の分子との間に二官能性リンカーを組み込む戦略に基づいた種々の支持体の開発が活発に行われている。第１の工程は固体マトリックスにリンカー分子を結合させることを含み、次ぎにそのリンカーを担持する固相支持体上で所望の合成足場を構成する。これによって合成足場の結合に所望の官能基を利用して固相支持体上に所望の化学特性を達成することができる。この前提に基づいて、リンカーに基づく固相支持体がいくつか開発され、市販されている［Ｏｅｓａｐａｙ， Ｇ．， ｅｔ ａｌ， ”Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｐｒｏｃ． １３ｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ”， Ｈｏｄｇｅｓ， Ｒ． Ｓ． ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ Ｊ， Ａ， （Ｅｄｓ．）， ＥＳＣＯＭ， Ｌｅｉｄｅｎ， ｐｐ ４３５， １９９４， （ｂ） Ｈｅｒｍｋｅｎｓ， Ｐ． Ｈ． Ｈ． ｅｔ ａｌ， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ， ５２， ４５２７， １９９６ （ｃ） Ｈｅｒｍｋｅｎｓ， Ｐ． Ｈ． Ｈ． ｅｔ ａｌ， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ， ５３， ５６４３， １９９７ （ｄ） Ｂｒｏｗｎ， Ｒ． Ｃ．， Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｐｅｒｋｉｎ−１， ３２９３， １９９８． およびａ） Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ， Ｃ． Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ， ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ４７， ３１１， １９９８ （ｂ） Ｐａｔｅｋ， Ｍ． ａｎｄ Ｌｅｂｌ， Ｍ． ｉｂｉｄ． ３５３ （ｃ） Ｂａｒａｎｙ， Ｇ．， ｅｔ ａｌ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐａｔｅｎｔ： ５，２３５，０２８ １９９３． （ｄ） Ｂａｒａｎｙ， Ｇ．， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐａｔｅｎｔ： ５，３０６，５６２， １９９４ （ｅ） Ｊｅｎｓｅｎ， Ｋ． Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐａｔｅｎｔ ５，９１７，０１５， １９９９］。同様の方針で研究を行い、出願人らもペプチド固相合成用のリンカーを以前に開発している［Ｋａｔｔｉ， Ｓ． Ｂ． ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍｍｕｎ．， ８４３−８４４， １９９２］。図２、式ＶＩＩに示したような基礎の不安定なリンカーを、容易に入手できる原料を用いて製造し、使用される各アミノ酸についてそれぞれＣ末端で合成した。それはＰＡＭ樹脂の合成に使用される方法に従って製造した［Ｍｉｔｃｈｅｌｌ， Ａ． Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ， Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ４３， ２８４５， １９７８］。これによって、ペプチドのさらなる合成のため、固相支持体上に予めリンカーが付加されたアミノ酸が得られる。この合成をクロロ酢酸（Ｉ）を臭化フェナシル（ＩＩ）で処理することで開始すると、対応するエステル（ＩＩＩ）が得られた。エステルＩＩＩメルカプトエタノール（ＩＶ）で処理すると、保護されたリンカー（Ｖ）が得られた。リンカーの水酸基をＤＣＣおよびＤＭＡＰで適切に保護されたアミノ酸（ＢｏｃまたはＦｍｏｃ）でアシル化し、次いでＺｎ／ＡｃＯＨによってフェナシルエステルを脱ブロックすると、遊離の酸（ＶＩ）が得られた。次ぎに遊離の酸ＶＩのスルフィド基を酸化してオキソンで処理することにより、対応するスルホン（ＶＩＩ）が得られた。適切に保護されたアミノ酸を有するリンカー酸をＤＩＣ／ＨＯＢＴ法によってアミノメチル樹脂上に付加すると、定量的な付加が得られた。固相支持体上に第１のアミノ酸を担持するリンカーを付加したところ、リンカーに基づく固相支持体ーの有用性は、公知の方法を使用するＢｏｃおよびＦｍｏｃ化学を利用するペプチド合成によって実証された。固相支持体からのペプチドの開裂は、極めて温和な条件下、ジオキサン：メタノール：４Ｎ ＮａＯＨ（３０：９：１）で３０分間処理することによって行われた。このこれによって保護されたペプチド断片を得る機会が与えられたが、これは大きいペプチドおよびタンパク質の合成のために極めて有用な中間体である［Ｋａｉｓｅｒ， Ｅ． Ｔ．， Ａｃｃ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ． ２２， ４７， １９８９： Ｗｉｌｌｉａｍｓ， Ｐ． ｅｔ ａｌ． Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ． ４９， １１０６５， １９９３］。このように、リンカーがＢｏｃおよびＦｍｏｃ双方の化学プロトコールに適合し、実験室で容易に合成できるということが実証された。このリンカーを用いて数種のペプチドおよび保護されたペプチド断片が合成された。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
技術上の課題
種々の利点にもかかわらず、上記のリンカーに基づく固相支持体にはある制限が存在する。ペプチドの合成でＣ末端にアミノ酸をもつリンカーは各合成で個々に合成すべきである［添付図面に示された図２］。従って、各配列の合成は付加的な工程を要し、時間がかかる。さらに、保護されたアミノ酸を有するリンカーは、固相支持体上に付加する前に強力な酸化剤であるオキソンを用いて酸化されることから、酸化しやすいアミノ酸を第１のアミノ酸として使用することができない。従ってＣ末端にシステイン、メチオニン、トリプトファンおよびチロシンを有するペプチド配列は、これらのアミノ酸がオキソン酸化の間に酸化されるという問題を持つ。次に、添付図面の図２に示されている式ＶＩＩのリンカーは、特により長いペプチドの合成に関してＦｍｏｃ基の除去に用いられる開裂条件下では全く安定でないことが認められている。２０％ピペリジン溶液に長時間曝される結果、固相支持体から成長鎖が開裂することが認められた。固相支持体からの生成物の開裂はβ脱離を経て起こるので、２０％ピペリジン溶液の塩基性はリンカーのβ脱離を引き起こすには十分であり、各脱ブロック工程でペプチドの部分開裂が起こる結果となった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
発明の目的
本発明の主要な目的は、有機合成用のオルトゴナル適合性のリンカーに基づく固相支持体を提供することである。
【０００５】
本発明のもう１つの目的は、ＢｏｃおよびＦｍｏｃ化学プロトコールを単独または組み合わせて使用してペプチド合成用の新規なリンカーに基づく固相支持体を提供することである。
【０００６】
本発明のさらにもう１つの目的は、ポリスチレンのような固相支持体に共有結合した官能化リンカーを含む新規な固相支持体を提供することである。
【０００７】
本発明のもう１つの目的は、ヒドロキシエチル−スルフェニル−アセトアミド樹脂の合成方法を提供することである。
【０００８】
本発明のさらにもう１つの目的は、より長いペプチドの固相収斂合成に使用される保護されたペプチド断片の合成用の新規な固相支持体を提供することである。
【０００９】
本発明のなおさらにもう１つの目的は、コンビナトリアル・ライブラリーを形成する有機小分子の合成用の新規なリンカーに基づく固相支持体の範囲を強化することである。
【００１０】
発明の概要
上記目的を満たすために、本発明は、図１の式Ｉに示された新規なオルトゴナル適合性の固相支持体、ヒドロキシエチル−スルフェニル−アセトアミド樹脂（ＨＥＳＡ樹脂）の開発を記載する。本明細書に記載される新規な固相支持体は、ＢｏｃおよびＦｍｏｃ双方の化学を単独または組み合わせて用いて生物学的に活性なペプチドを合成するのに使用できる。
【００１１】
発明の具体的な説明
固相合成の分野とコンビナトリアル化学とが一緒になって、新しいリード物質を発見するための有用な手段として現れてきた。製薬産業およびより多くの化合物へのその探求によって大いにあおられ、固相合成は多くの有機変換に採用されてきた。これに関しての新たな興味は技術開発の１つの機会であり、すなわち有機合成の要求に対応するようにした新規なリンカーおよび／または固相支持体である。概念としては科学的精密さと簡潔さを備えているが、多様な化学特性をもつ有用な固相支持体は一方または他方のタイプの化学に適したものであって、複雑な化学を含む。本発明の支持体は市販されている安価な原料から容易に得られる。最終生成物は極めて温和な条件下で開裂させることができる。本発明は、コンビナトリアル・ライブラリーを形成するペプチドおよび小分子の合成用の新規なリンカーに基づく固相支持体の合成および適用を記載する。
【００１２】
支持体からの生成物の開裂には極めて温和な塩基性条件しか必要とされないので、これにより大きいペプチドの収斂合成に有用である保護されたペプチド断片の迅速な合成もたらされる。合成されたペプチドは高収率で優れた純度である。さらにこれらの生成物はラセミ化していない。このことによって、酸化しやすいアミノ酸をＣ末端にもつ配列を合成が可能となる。本発明のもう１つの重要な特徴は、新規な固相支持体を、有機小分子の固相合成に、ならびにペプチドおよび有機小分子ならびに複素環式分子のコンビナトリアル・ライブラリーの形成に使用できることである。新規な固相支持体は実験室で大量に極めて便宜に合成することができ、保存中にも特別の注意を何ら必要とせず、次の合成に適用するまで周囲温度で数ヶ月間保存することができる。さらに、新規な方法もまた、その合成のために開発された。
【００１３】
化学的に決められた反応性操作による新規な固相支持体の合成は２段階で達成された。第１の工程では、クロロ酢酸またはハロゲンの代わりに好適な脱離基を含むその等価物を、添付図面の図３に示された公知の方法［工程１］によってアミノメチル樹脂とカップリングする。この反応工程は、ネガティブ・カイザーテストによって示されるように定量的である。次の工程では、メルカプトエタノールと工程１で得られた固相支持体とを反応させて、添付図面の図３に示された所望の固相支持体１［工程２］を得た。添付図面に示された新規なリンカーに基づく固相支持体１は、新たに導入されたアセトアミド部分のカルボニルに相当する１６６６ｃｍ−１の強いピークおよび第一級水酸基に相当する３２１９ｃｍ−１のピークを基に同定された。
【００１４】
水酸官能基の定量は、標準的なプロトコールを用いて適当なＢｏｃまたはＦｍｏｃで保護されたアミノ酸を付加することにより、文献で報告されている標準法によって行った。Ｂｏｃ化学の場合、ピクリン酸法により固相支持体上のアミノ官能基を評価することによって定量を行った［方法Ａ］［Ｇｉｓｉｎ， Ｂ． Ｆ．， Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． Ａｃｔａ．， ５８， ２４８， １９７２］。一方、Ｆｍｏｃ化学の場合には、ピペリジン処理によってＦｍｏｃ基を除去し、次いで３０１ｎｍの吸光度を測定することによって９−フルオロエニルメチルピペリジンを定量した［方法Ｂ］［Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔｉｄｅ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ． １３， ３５， １９７９］。新規な樹脂１は、数ヶ月間、周囲温度で安定であることが分かっており、一度製造すれば特別な保存条件を何ら設けることなく長期間次の合成の適用に用いることができる。さらに、アミノ酸を担持する樹脂についても、ＢｏｃまたはＦｍｏｃ化学プロトコールの際にペプチド合成に通常用いられる試薬および実験条件に対する安定性を試験した。本発明者らは５０％ＴＦＡ：ＤＣＭならびにＤＭＦ中２０％ピペリジン下でアミノ酸が結合した樹脂の開裂を全く認めなかった。
【００１５】
ラセミ化の検討：
樹脂からペプチドを開裂させるアルカリ条件は極めて温和であるが、出願人らはラセミ化の危険についてのある明確な証拠を提供することが適当であると考えた。保護された一対のジペプチド、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨおよびＢｏｃ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＯＨをこの目的のために合成した。酵素カルボキシペプチダーゼ−ＡはＣ末端の芳香族アミノ酸の隣りのペプチド結合を優先的に加水分解するので、このジペプチドを選択した［Ｂｒａｄｓｈａｗ， Ｒ． Ａ．， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ６３， １３８９， １９６９］。支持体からペプチドが開裂する際、ラセミ化が起こるとすれば、本発明者らはＢｏｃ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨの場合に加水分解されていないジペプチドに相当するピークを予想しなければならなかったが、ラセミ化の程度にもよるがＢｏｃ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＯＨの場合にもいくらかの加水分解は起こるはずである。固相支持体から除去された後、保護されたジペプチドをさらに精製することなく、カルボキシペプチダーゼ−Ａによる酵素加水分解を施した。３０分後、アリコットをＴＬＣによってモニタリングした。Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨは完全に加水分解され、その代わりにＢｏｃ−ＧｌｙおよびＬ−フェニルアラニンに相当する２つのスポットが見られた。一方、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＯＨは、加水分解生成物に相当するスポットが存在しないことから、加水分解に完全に耐性があり、ジペプチドはそのままであった。このモニタリングはＨＰＬＣによっても行い、同様の結果が得られた。Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨの場合には完全な加水分解が認められたが、一方、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＯＨの場合には、ＨＰＬＣプロフィールにおいてＢｏｃ−Ｇｌｙに相当するピークが存在しないことで明らかなように、加水分解的開裂は認められなかった。これらの結果は、固相支持体からペプチドを除去する際にＣ末端のアミノ酸のラセミ化は起こらないことを明白に実証するものである。
【００１６】
リンカーに基づく固相支持体の合成適用：
このリンカーの有用性を実証するために、ＢｏｃおよびＦｍｏｃ化学を用いるいくつかのペプチドならびにいくつかのチアゾリジン誘導体の合成を行った。ロイエンケフェリンは、Ｂｏｃ化学とＦｍｏｃ化学ぞれぞれによって合成された。次のアミノ酸残基を組み込むための段階的な脱保護／カップリングサイクルは、標準的なＤＩＣ／ＨＯＢｔプロトコールによって達成した。Ｂｏｃ基の脱ブロックは、ＤＣＭ中５０％のＴＦＡまたは５Ｎ ＨＣｌ／ジオキサンによって、Ｆｍｏｃ基の脱ブロックは２０％ピペリジン／ＤＭＦによって行った。よりよい収率を達成するために、各工程においてカップリング反応を繰り返し、必要であればカイザーテスト試験によって判断した。最終ペプチドはアルカリ条件下で固相支持体から分離し、５Ｎ ＨＣｌ／ジオキサンで処理した。後処理および結晶化の後、全ペプチドは全体で６０〜７０％を超える収率で得られた。それらを分光光度法によって同定した。
【００１７】
これらの化合物は総て、逆相ＨＰＬＣで純度が９０％より高いことが分かり、ＦＡＢ−ＭＳで正確な分子イオンピークを示した。本リンカーの範囲を拡大するには側鎖官能基を有するペプチドを合成することが望ましいと考えられた。Ｉ型プロコラーゲンの残基２１１〜２１６に相当するペンタペプチド、Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒをこの目的のために選択した［Ｋａｔａｙａｍａ Ｋ． ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６８， ９９４１， １９９３］。カップリング反応にＤＩＣ／ＨＯＢｔを用いるＢｏｃ化学によって合成を行った。図４に示されたものと同様のプロトコールに従い、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）をリンカーに結合させた。この後に適切に保護されたアミノ酸の一連の付加を行った。合成の終了時に、アミノおよび側鎖が保護されたペプチドを先に記載したように固相支持体から開裂させた。保護されたペプチド断片は、ＦＡＢ−ＭＳスペクトルにおける適当な［Ｍ＋Ｈ］＋の分子イオンピークによって同定した。ペプチドをアミノおよび側鎖保護ペプチドをそのままにして固相支持体から選択的に開裂させることができるという事実は、このリンカーが断片縮合法によるより大きいペプチドの合成において有用である可能性があることを示唆している。最後に、保護基を定量的に除去すると、ペンタペプチドが７８％の収率で得られた。
【００１８】
有機小分子の合成における新規な固相支持体の適用を実証するために、いくつかのチアゾリジン誘導体［Ｐａｔｅｋ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３６， ２２２７， １９９５］を合成した。この合成に適合させたプロトコールがスキームに示めされている（図６および７、ここでＲ＝Ｈ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｆ、ＮＯ２、ＯＨ、ＯＭｅ、アルキル、アラルキル、アリールおよび置換体、Ｘ＝ＣまたはＮ、Ｒ’＝アシル、アルキル、Ｂｏｃ、Ｂｚ、Ｚまたはアミノ酸、ならびにＲ’’＝アミノ保護基）。適切に保護されたシステイン誘導体すなわち、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）をＤＩＣ／ＤＭＡＰまたはペプチドの合成に関して記載されたプロトコールを用いるその他の触媒によって固相支持体に結合させた。Ｆｍｏｃ基はＤＭＦ中２０％ピペリジンで処理することによって開裂させ、次いでトリチル基はＤＣＭ中１０％ ＴＦＡで処理することによって除去した。室温または高温で、遊離アミノおよびスルフヒドリル基を有するシステインを結合した支持体を所望の市販のアルデヒド（２モル過剰を使用）と反応させた。環化は６〜８時間で完了した。あるいは、固相支持体に結合させる出発原料としてＢｏｃ−Ｃｙｓ（ｔｒｔ）を用いてチアゾリジンをも上手く合成された。この誘導体の利点は、アミノおよびスルフヒドリル基から保護基を一段階、すなわちＴＦＡ処理で除去することができるという点である。このようにして得られたチアゾリジン誘導体は、固相支持体それ自体から開裂させることもできるし、あるいは固相支持体上で誘導体化／アシル化することもができる。従って、チアゾリジンを担持する支持体をいくつかの部分に分割し、遊離アミノ基を並行合成プロトコールで種々の芳香族および脂肪族アシル化剤で個々にアシル化した。種々のアルデヒドおよびアシル化剤を用い、いくつかの新規な誘導体が高収率かつ高純度で生成された。
【００１９】
添付図面に示された図１の式１に示されたリンカーに基づく固相支持体の範囲を拡大するために、チアゾリジン骨格を支持体に結合させた種々のアミノ酸／ペプチドまたはその他の分子上で合成した。このように、適切に保護されたＢｏｃまたはＦｍｏｃ保護アミノ酸を標準的なプロトコールを用いて固相支持体に結合させた。アミノ保護基を除去し、遊離アミンをＤＩＣ／ＨＯＢｔ法によって適切に保護されたシステイン残基とカップリングさせた。カイザーテストによってモニタリングしたところ、カップリングが完了した後、システインの両保護基を先に記載したものと同様の方法で除去した。システインの遊離アミノおよびスルフヒドリル基をもつジペプチドを担持する樹脂を、室温において固相支持体上で所望の市販のアルデヒド（２モル過剰を使用）と反応させた。環化は６〜８時間で完了した。このようにして得られたチアゾリジニルジペプチド誘導体は固相支持体それ自体から開裂させることもできるし、あるいは固相支持体上で誘導／アシル化することもできる。チアゾリジニルジペプチド誘導体を担持する支持体をいくつかの部分に分割し、遊離アミノ基を並行合成プロトコールで種々の芳香族および脂肪族アシル化剤で個々にアシル化した。種々のＣ末端アミノ酸、種々のアルデヒドおよびアシル化剤を用いて、多様な新規な化合物が高収率かつ高純度で生成された。
【００２０】
要するに、新規なリンカーは実験室で便宜に合成することができ、それはＢｏｃおよびＦｍｏｃ化学プロトコールによるペプチド合成に理想的に適している。保護されたペプチドをセグメント縮合法に用いるために合成することができる。固相支持体からのペプチドの脱離に使用される条件ではラセミ化は生じない。本発明者らは、ここで報告された新規なリンカーが酸性および弱塩基性条件に対して安定であり、ゆえにそれはペプチド／オリゴヌクレオチド合成および多様な小分子ライブラリーの構築に用いられる著しい可能性を有していると考えている。
従って、本発明は、ＢｏｃおよびＦｍｏｃ化学を単独でまたは組み合わせて用いるペプチドおよび保護されたペプチド断片の固相合成のため、ならびに有機小分子コンビナトリアル・ライブラリーの合成のためのオルトゴナル適合性のヒドロキシエチル−スルフェニル−アセトアミド樹脂の開発に関する。本発明はまた、図１の式１に示された式を有するヒドロキシエチル−スルフェニル−アセトアミド樹脂の新規な合成方法を提供し、ここで固相支持体はアミノ官能膜、多孔質ガラス、ポリスチレン、綿および紙からなる群から選択され、ポリスチレンはアミノポリスチレンおよびアミノメチルポリスチレンからなる群から選択され、該方法は、
（ａ）既知の方法［添付図面の図３に示された一連の工程］を用い、ジイソプロピルカルボジイミドまたは通常用いられるその他のカップリング試薬の存在下、クロロ酢酸またはハロゲンの代わりに好適な脱離基を含むその等価物とアミノメチル樹脂とを反応させること、
（ｂ）ヨウ化ナトリウムの存在下、脱離基を有する上記支持体とメルカプトエタノールとを反応させて図３の式１の所望の固相支持体を得ること、さらに所望により、
（ｃ）このようにして得られた新規な固相支持体を、添付図面の図４〜７に示されたペプチド、保護ペプチド断片および有機小分子の合成に使用すること
を含んでなる。
【００２１】
本発明のさらなる特徴によれば、リンカーに基づく固相支持体の合成は、容易に入手できる市販の安価な原料を用いて行われた。
【００２２】
本発明のさらなる具体例は、このようにして得られたオルトゴナル適合性の固相支持体は最適の官能性（０．３〜０．５ｍｅｑ／ｇ）を有していることが分かり、新規な樹脂１は数ヶ月周囲温度で安定であることが分かり、一度製造すれば特別な貯蔵条件を何ら設けることなく長期間、後の合成の適用に用いることができることを記載するものである。
【００２３】
本発明のも１つの具体例は、アミノ酸を担持する樹脂について、ＢｏｃおよびＦｍｏｃ化学プロトコールによるペプチド合成に通常用いられる試薬および実験条件に対する安定性が試験され、固相ペプチド合成に過剰に用いられる５０％ＴＦＡ：ＤＣＭならびにＤＭＦ中２０％ピペリジン下で安定であることが分かったことが含まれる。
【００２４】
さらにもう１つの具体例では、固相支持体をペプチド、保護されたペプチド断片および有機小分子の固相合成に使用する。
【００２５】
さらにもう１つの具体例では、オルトゴナル適合性のヒドロキシエチル−スルフェニル−アセトアミド（ＨＥＳＡ）樹脂をＢｏｃ化学プロトコールによるペプチドの固相合成に使用する。
【００２６】
さらにもう１つの具体例では、オルトゴナル適合性のヒドロキシエチル−スルフェニル−アセトアミド（ＨＥＳＡ）樹脂をＦｍｏｃ化学プロトコールによるペプチドの固相合成に使用する。
【００２７】
さらにもう１つの具体例では、オルトゴナル適性のヒドロキシエチル−スルフェニル−アセトアミド（ＨＥＳＡ）樹脂をＢｏｃおよびＦｍｏｃ双方の化学プロトコール単独または組み合わせることによるペプチドの固相合成に使用する。
【００２８】
さらにもう１つの具体例では、ヒドロキシエチル−スルフェニル−アセトアミド樹脂をチアゾリジン誘導体のような複素環式有機小分子の固相合成に使用する。
【００２９】
さらにもう１つの具体例では、ヒドロキシエチル−スルフェニル−アセトアミド樹脂を有機小分子の組合せライブラリーの固相合成に使用する。
【００３０】
さらにもう１つの具体例では、最終生成物は弱アルカリ条件下で開裂可能である。
【００３１】
さらにもう１つの具体例では、０．１〜０．５Ｎアルカリ水溶液とジオキサン、テトラヒドロフラン、メタノール、エタノールおよびジメチルホルムアミドからなる群から選択される有機溶媒との混合物を用いて固相支持体から最終生成物を開裂させる。
【００３２】
さらにもう１つの具体例では、固相支持体をまた、適宜変性させた後にスカベンジャー樹脂および固定化剤として使用し、ここで官能基はアルデヒド、カルボキシル、チオール、アミノおよびポリアミノ基からなる群から選択される。
【００３３】
さらにもう１つの具体例では、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドなどの存在下、１５℃〜８５℃の範囲の温度で、塩化メチレン、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、エーテル、石油エーテル、酢酸、メタノールなどからなる群から選択される有機溶媒の存在下で反応を行う。
【００３４】
さらにもう１つの具体例では、ジシクロヘキシルカルボジイミド、混合無水物、活性エステル、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、ベンゾトリアゾール−１−イル テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）または７−アザベンゾトリアゾール−１−イル テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート酸（ＨＡＴＵ）からなる群から選択されるカップリング試薬を用いて反応を行う。
【００３５】
さらにもう１つの具体例では、保護基の酸分解開裂に使用される酸がＨＢｒ：ＡｃＯＨ、ＨＣｌ：ジオキサン、ギ酸およびトリフルオロ酢酸からなる群から選択される。
【００３６】
さらにもう１つの具体例では、本発明の特徴は、ラセミ化のない生成物が得られるという点にある。さらに、本発明はまた、ＢｏｃおよびＦｍｏｃ双方の化学プロトコールを単独でまたは組み合わせて用いるペプチドの合成法、ならびにチアゾリジン誘導体のような有機小分子の固相合成法を提供する［添付図面に示された図４〜７］。固相合成後の最終生成物は極めて温和な条件下で固相支持体から開裂させることができる。本発明はまた、新規な固相支持体を用いて高収率かつ高純度でコンビナトリアル・ライブラリーを生成するペプチドおよび小分子の合成を記載する。
【００３７】
以下、本発明を詳細な実施例によりさらに説明する。これらの実施例は種々の具体的かつ例示的な具体例をさらに例示するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【００３８】
一般法
本研究で用いた総てのアミノ酸は特に断りのない限り、Ｌ−配置であった。用いた支持体は置換０．５〜０．９ミリ当量／ｇの２％架橋型アミノメチル化スチレン／ジビニルベンゼン共重合体であった。カップリング反応は総て無水反応物および乾燥溶媒を用いて行った。総ての中間体および最終化合物の均質性は次の溶媒系を用いたシリカゲルプレートでのＴＬＣにより確認した。（ａ） ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ−ＡｃＯＨ （４９：１：１）， （ｂ） ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ （１９：１）， （ｃ） ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ−ＡｃＯＨ （４８：１：１）， （ｄ） ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ−ＡｃＯＨ （１８：１：１）， （ｅ） ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ−ＡｃＯＨ （１７：２：１）， （ｆ） ｎ−ＢｕＯＨ−ＡｃＯＨ−Ｈ２Ｏ （４：１：５， 上層）。また最終化合物の純度はμ−Ｂｏｎｄａｐａｋ Ｃ１８カラムおよび４０分の直線的グラジェント０〜４０％Ｂ（Ａ＝０．１％ＴＦＡ水溶液、Ｂ＝アセトニトリル）を用いたＲＰ−ＨＰＬＣにより調べ、２２５ｎｍ（ＵＶ）でモニタリングした。旋光性はＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ２４１偏光計で記録した。ＮＭＲスペクトルはＢｒｕｋｅｒ ＤＲＸ ３００ＭＨｚ分光光度計で記録した。ＩＲスペクトルはＳｈｉｍａｄｚｕ ８２０１ＰＣ ＦＴＩＲで記録した。
【００３９】
実施例１
ヒドロキシエチル−スルフェニル−アセトアミド樹脂（化合物１）の合成
市販のアミノメチルポリスチレン樹脂２．０ｇ（０．９ミリ当量／ｇ）を固相反応器に入れ、これに乾燥ジクロロメタン（ＤＣＭ）を加えた。この懸濁液を窒素下で攪拌しながら３０分間膨潤させた。これをＤＣＭで３回、ＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）混合物で１回洗浄した。それをＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）中、触媒量のジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）の存在下、クロロ酢酸（０．４５ｇ、５ｍｍｏｌ）およびＤＩＣ（０．８ｍｌ、５ｍｍｏｌ）で処理した。反応混合物を窒素下で８時間またはカイザーテストで陰性になるまで攪拌した。この樹脂を濾過してＤＭＦ、ＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）、ＤＭＦ、ＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）、最後にＤＣＭ各２５ｍｌで順次洗浄した。クロロアセチル手を有する樹脂を、触媒として第三級アミンおよびヨウ化ナトリウムの存在下、窒素下で攪拌しながら、ＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）２０ｍｌ中のメルカプトエタノール（０．４ｍｌ、５ｍｍｏｌ）の溶液と６〜８時間反応させた。樹脂を濾過し、ＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）で３回、最後にＤＣＭで洗浄し、乾燥させて所望の樹脂１（２．１ｇ）を得た。
【００４０】
固相支持体の特性決定
新規なリンカーに基づく固相支持体１を、新たに導入されたアセトアミド部分のカルボニルに相当する１６６６ｃｍ−１の強いピークおよび第一級ヒドロキシ基に相当する３２１９ｃｍ−１のピークに基づいて決定した。
【００４１】
置換度の決定
ヒドロキシ官能基の定量は、文献に報告された、標準的なプロトコールを使用する適当なＢｏｃおよびＦｍｏｃで保護したアミノ酸の添加による標準法により行った。Ｂｏｃ化学の場合には、ピクリン酸法を用いて定量を行った［方法Ａ］。一方、Ｆｍｏｃ化学の場合には、Ｆｍｏｃ基をピペリジン処理により除去し、次ぎに３０１ｎｍにおける吸光度を測定することにより、９−フルオレニルメチルピペリジンを定量した［方法Ｂ］。新規なリンカーの置換度は０．３５〜０．４５ｍミリ当量／ｇの間であった。詳細を以下に示す。
【００４２】
方法Ａ：（Ｂｏｃ化学）
ヒドロキシエチル−スルフェニル−アセトアミド樹脂（１）（０．５ｇ）を反応器に入れ、窒素下で攪拌しながらジクロロメタン（ＤＣＭ）中で膨潤させた。３０分後、樹脂を濾過してＤＣＭで洗浄した。この樹脂にＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）２０ｍｌ中のＢｏｃ−Ｌｅｕ（０．４２ｇ、２．４ｍｍｏｌ）、ＤＩＣ（０．２ｍｌ、２．５ｍｍｏｌ）およびジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）またはＮ−メチルイミダゾール（ＮＭＩ）（０．４ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。この混合物を８〜１０時間攪拌した。樹脂をＤＣＭで３回洗浄して乾燥させた。乾燥樹脂のアリコート（〜３０．０ｍｇ）を３０分間酸分解（５Ｎ ＨＣｌ／ジオキサン、５ｍｌ）してＢｏｃ基を除去した。この後、樹脂をＤＣＭおよびＤＭＦで洗浄した。ＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）（４０ｍｌ）中のＤＩＥＡ（２ｍｌ）を加えて振盪し、得られた塩酸塩を中和した。次いでこの樹脂をＤＭＦおよびＤＣＭで順次洗浄した。その後上記生成物をピクリン酸法により定量して固相支持体上にあるアミノ基量を導き出した。樹脂のアリコット（２．５ｍｇ）を取り、ＤＣＭ（２ｍｌ）およびエタノール（８ｍｌ）中のピクリン酸（５０ｍｇ）を加えて攪拌した。樹脂を十分洗浄した後、それをＤＩＥＡ（１ｍｌ）を加えて攪拌すると、樹脂と結合したピクリン酸はそのＤＩＥＡ塩として溶液中に解離した。この溶液を５０ｍｌとし、ＵＶ分光光度計を用いて３５０ｎｍにおける吸光度を記録した。
【００４３】
下式：
【数１】
を計算に用いた。
【００４４】
方法Ｂ：（Ｆｍｏｃ化学）
ヒドロキシエチル−スルフェニル−アセトアミド樹脂（１）（０．５ｇ）を反応器に入れ、窒素下で攪拌しながらジクロロメタン（ＤＣＭ）中で膨潤させた。３０分後、樹脂を濾過してＤＣＭで洗浄した。この樹脂にＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）２０ｍｌ中のＦｍｏｃ−Ｌｅｕ（０．８２ｇ、２．４ｍｍｏｌ）、ＤＩＣ（０．２ｍｌ、２．５ｍｍｏｌ）およびジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）またはＮ−メチルイミダゾール（ＮＭＩ）（０．４ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。この混合物を８〜１０時間攪拌した。樹脂をＤＣＭで３回洗浄して乾燥させた。この乾燥Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ樹脂のアリコート（２．５ｍｇ）を試験管に取り、ＤＭＦ中の２０％ピペリジン０．５ｍｌで時折攪拌しながら１５〜２０分間処理した。対照として別の試験管にＤＭＦ中の２０％ピペリジン０．５ｍｌを取った。２０分後、両方の試験管にＤＭＦを加え、容量を５０ｍｌとした。ＵＶ−ＶＩＳ分光光度計により３０１ｎｍにおいて両方の溶液の吸光度を記録した。置換度（ｍＭｏｌ／ｇ）を下式：
【数２】
により計算する。
【００４５】
安定性の検討：
試薬への長期暴露下におけるＢｏｃおよび／またはＦｍｏｃ保護基の脱ブロックの際のリンカーの安定性を実証するために、以下の試験を行った。固相支持体と結合した小アリコートのＦｍｏｃ保護アミノ酸（０．４１ミリ当量／ｇ、１００ｍｇ）をＤＣＭ中の５０％ＴＦＡおよび５Ｎ ＨＣｌ／ジオキサン各１ｍｌで攪拌しながら８時間個々に処理し、次いで樹脂を濾過し、洗浄して乾燥させた。個々のフラスコにおいて固相支持体と結合した Ｂｏｃ保護アミノ酸（０．３８ミリ当量／ｇ、１２０ｍｇ）を２０％ピペリジン／ＤＭＦ１．２ｍｌで攪拌しながら１０時間処理し、次いで樹脂を濾過し、洗浄して乾燥させた。乾燥した樹脂を方法ＡおよびＢを用いて定量した結果、未処理の樹脂とほぼ同じであった。このことからリンカーがＦｍｏｃおよびＢｏｃ基の脱保護に使用する条件に対して安定であることが示唆される。
【００４６】
ラセミ化の検討：
実施例６および７に記載の新規な塩基に不安定な固相支持体上で合成したジペプチドを基質として用い、合成および固相支持体からの生成物の開裂の際に起こるラセミ化を検出した。
Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨ（６）およびＢｏｃ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＯＨ（７）各０．００６４ｇ（２０μＭ）を個々の反応バイアルに入った１Ｍ ＮａＣｌ（５０μｌ）に溶解し、それに１Ｍ ｔｒｉｓ ＨＣｌ（５０μｌ）を加えてｐＨ７．５に維持した。異なるセットの試験の各バイアルにカルボキシペプチダーゼ−Ａ １５〜５０μｌを加え、２５℃で５分間振盪した。次いで酵素添加前後５分の反応混合物のアリコートを０．１％ＴＦＡを含有する水に０〜９０％アセトニトリルの直線的グラジェントを用いた４０分間にわたるＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した。Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨならびにＢｏｃ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＯＨは各々１２．５および１３分の保持時間を示した。一方、酵素加水分解後のＢｏｃ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨにはジペプチドの保持時間においてピークは得られなかったが、その代わりに８分の保持時間においてＢｏｃ−Ｇｌｙに相当する別のピークが得られた。しかしながら、酵素処理後のＢｏｃ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＯＨのＨＰＬＣプロフィールには加水分解前のジペプチド、すなわち１３分のものとの保持時間における差はなかった。
【００４７】
実施例２
Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯＨ（化合物２）の合成
固相支持体、置換０．４ミリ当量／ｇのヒドロキシエチル−スルフェニル−アセトアミド樹脂（１）（１．２５ｇ、０．５ｍｍｏｌ）を反応器に入れ、窒素下で攪拌しながらジクロロメタン（ＤＣＭ）中で膨潤させた。３０分後、樹脂を濾過してＤＣＭで洗浄した。この樹脂にＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）２０ｍｌ中のＢｏｃ−Ｌｅｕ（０．２５ｇ、１．２ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）またはＮ−メチルイミダゾール（ＮＭＩ）（０．２ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。この混合物を８〜１０時間攪拌した。樹脂をＤＣＭで３回洗浄して乾燥させた。この乾燥樹脂のアリコート（２．５ｍｇ）への付加率について試験したところ、付加率は７８％であることが分かった［方法Ｂ］。樹脂をＤＣＭ中５０％ＴＦＡで３０分間処理してＢｏｃ基を除去した。３０分後、樹脂を濾過してＤＣＭ２０ｍｌ×３、ＤＣＭ中２０％ＤＩＥＡ２０ｍｌ×３、ＤＣＭ２０ｍｌ×３で洗浄した。ＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）２０ｍｌ中のＢｏｃ−Ｐｈｅ（０．２６ｇ、１ｍｍｏｌ）およびＨＯＢｔ（０．１５３ｇ、１ｍｍｏｌ）の溶液を窒素下で攪拌しながら上記樹脂に加えた。この懸濁液にＤＩＣ（０．１８ｍｌ、１．２ｍｍｏｌ）を加え、混合物を３時間またはカイザーテストで陰性になるまで攪拌した。
【００４８】
この樹脂をＤＣＭ中５０％ＴＦＡで３０分間処理してＢｏｃ基を除去した。樹脂を濾過してＤＣＭ２０ｍｌ×３、ＤＣＭ中２０％ＤＩＥＡ２０ｍｌ×３、ＤＣＭ２０ｍｌ×３で洗浄し、遊離アミノ基を有する樹脂とＢｏｃ−ＧｌｙとをＤＩＣ／ＨＯＢｔ法により結合した。完全なカップリング反応後、樹脂を濾過し、常法においてＤＣＭ中５０％ＴＦＡで処理してＢｏｃ基を除去し、Ｂｏｃ−Ｇｌｙを結合した。カイザーテストによってモニタリングして完全なカップリング反応後に常法においてＢｏｃ基を除去し、次いでＤＩＣ／ＨＯＢｔ法を用いてＢｏｃ−Ｔｙｒを結合した。ペンタペプチドを有する樹脂を窒素下で攪拌しながらジオキサン−ＭｅＯＨ−４Ｎ ＮａＯＨの混合物（３０：９：１、２０ｍｌ）で３０分間処理し、樹脂を濾過して水２ｍｌで洗浄した。合した濾液を真空蒸発させた。残渣を水に取り、エーテルで抽出した。水相を１Ｎ塩酸で酸性化してＥｔＯＡｃ（３×７５ｍｌ）で抽出した。合したＥｔＯＡｃ相を水およびブラインで洗浄し、次いでＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空蒸発させて非晶質固体を得た。このようにして得られた粗ペンタペプチド酸をＭｅＯＨ−エーテルから再結晶化させて標題の化合物０．２１ｇを得た。収率８３％、Ｒｆ：０．８（ｄ）；融点１３４−１３６℃； ［α］Ｄ２５＝ −９．８° （ｃ＝４．１， ＭｅＯＨ）； １Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６） δ： ０．９７ （ｄ， ６Ｈ）， １．１６ （ｓ， ９Ｈ）， ３．６−３．８（ｍ， ４Ｈ）， ４．１０， ４．２４および４．５８ （Ｃα プロトン）， ６．６３−７．００ （ＡＢｑ， ４Ｈ）， ７．４０（ｍ， ５Ｈ）， ７．８−８．１ （ＮＨｓ）。上記のようにして得たペプチド酸（０．２１ｇ、０．３ｍｍｏｌ）をチオアニソール（０．２ｍｌ）の存在下、５Ｎ ＨＣｌ／ジオキサン（２ｍｌ）中で１時間撹拌した。ＴＬＣにより反応をモニタリングした後、溶媒を真空蒸発させた。乾燥エーテルを加え、粉砕して白色の吸湿性固体としてペンタペプチド塩酸塩ＨＣｌ・Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯＨ（２）を得た。これを濾過して真空デシケーターで乾燥させた。収率：０．１５ ｇ （８５％）； Ｒｆ：０．６７（Ｆ）； 融点１４１○Ｃ （ｄｅｃ）； ［α］Ｄ２５＝−５．６° （ｃ＝０．５４， ＭｅＯＨ）；ＦＡＢ−ＭＳ ［Ｍ＋Ｈ］＋ ５５６； １Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６） δ： ０．９（ｄ， ６Ｈ）． ３．８−３．９（ｍ， ４Ｈ）， ４．２， ４．３および４．６８（Ｃα プロトン）， ６．８−７．１（ＡＢｑ， ４Ｈ）， ７．３（ｍ， ５Ｈ）， ７．５−８．５（ＮＨｓ）， ９．０ （ｓ， １Ｈ， フェノール性ＯＨ）。
【００４９】
実施例３
Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯＨ（化合物３）の合成
固相支持体、置換０．４ミリ当量／ｇのヒドロキシエチル−スルフェニル−アセトアミド樹脂（１）（０．７５ｇ、０．３ｍｍｏｌ）を反応器に入れ、窒素下で攪拌しながらジクロロメタン（ＤＣＭ）中で膨潤させた。３０分後、樹脂を濾過してＤＣＭで洗浄した。この樹脂にＢｏｃ−Ｌｅｕの溶液を３モル過剰にすることで常法において結合させた。この樹脂のアリコート（３．４ｍｇ）への付加率について試験したところ、付加率は８１％であることが分かった［方法Ｂ］。次ぎにＢｏｃ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯＨの合成を、２位のＢｏｃ−ＧｌｙをＢｏｃ−Ｄ−Ａｌａに置換し、Ｂｏｃ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯＨを得るために使用した方法と同様にして行った。固相支持体から開裂した後、白色の粉末としてＢｏｃ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯＨ（０．１３ｇ、７９％）を単離した。次いでこれをチオアニソール（０．１ｍｌ）の存在下、５Ｎ ＨＣｌ−ジオキサン（２ｍｌ）で１時間処理した。ＴＬＣにより反応をモニタリングした後、溶媒を蒸発させ、残渣を乾燥エーテルでトリチュレートした。次いでこれを濾過し、真空デシケーターで乾燥させて白色の固体として最終ペプチドＨＣｌ・Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯＨの０．１６ｇ（８２．８％）を得た。Ｒｆ：０．４８ （Ｆ）； 融点１８３℃ （ｄｅｃ）； ［α］Ｄ２５＝＋１４．３° （ｃ＝０．５６， ＭｅＯＨ）； 収率０．１５ｇ （８５％）； Ｒｆ：０．６７（Ｆ）； 融点１４１℃ （ｄｅｃ）； ［α］Ｄ２５＝−５．６° （ｃ＝０．５４）． １Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６） δ： ０．８５（ｄ， ６Ｈ）， １．０２（ｄ， ３Ｈ）， ３．６（ｄ， ２Ｈ）， ４．２６， ４．３８， ４．４４および４．６８（Ｃα プロトン）， ６．８−７．０（ＡＢｑ， ４Ｈ）， ７．２４（ｍ， ５Ｈ）， ７．５−８．５（ＮＨｓ）， ９．０５（ｓ， １Ｈ， フェノールＯＨ）。
【００５０】
実施例４
Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯＨ（Ｆｍｏｃ化学による化合物２）の合成
置換０．４ミリ当量／ｇのヒドロキシエチル−スルフェニル−アセトアミド樹脂（１）（０．１ｇ、０．４ｍｍｏｌ）を反応器に入れ、窒素下で攪拌しながらジクロロメタン（ＤＣＭ）中で膨潤させた。３０分後、樹脂を濾過してＤＣＭで洗浄した。この樹脂にＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）２０ｍｌ中のＦｍｏｃ−Ｌｅｕ（０．４１ｇ、１．２ｍｍｏｌ）、ＤＩＣ（０．２ｍｌ、１．５ｍｍｏｌ）およびジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）またはＮ−メチルイミダゾール（ＮＭＩ）（０．２ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。この混合物を８〜１０時間攪拌した。樹脂をＤＣＭで３回洗浄して乾燥させた。この乾燥樹脂のアリコート（２．５ｍｇ）への付加率について試験したところ、付加率は７８％であることが分かった［方法Ａ］。樹脂をＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）１２ｍｌ中の２０％ピペリジンで２０分間処理してＦｍｏｃ基を除去した。樹脂をＤＣＭで３回洗浄した。樹脂をＤＣＭで３回洗浄した後、ＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）１０ｍｌ中のＦｍｏｃ−Ｐｈｅ（０．３８ｇ、１．０ｍｍｏｌ）およびＨＯＢｔ（０．１５ｇ、１．０ｍｍｏｌ）の溶液を攪拌しながら加えた。この混合物にＤＩＣ（０．１８ｍｌ、１．２ｍｍｏｌ）を加え、３時間またはこれがカイザーテストで陰性になるまで攪拌を続けた。樹脂を濾過し、ＤＣＭ２０ｍｌで３回洗浄した。常法においてＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）１２ｍｌ中の２０％ピペリジンで２０分間処理してＦｍｏｃ基を脱ブロックした。次ぎに、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（図５の工程３）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（図５の工程４）を上記のＤＩＣ／ＨＯＢｔ法により結合した。最後のカップリングにはＦｍｏｃ−Ｔｙｒの代わりにＢｏｃ−Ｔｙｒを使用した。ペンタペプチドを有する樹脂を窒素下で攪拌しながらジオキサン−ＭｅＯＨ−４Ｎ ＮａＯＨの混合物（３０：９：１、２０ｍｌ）で３０分間処理し、樹脂を濾過して水２ｍｌで洗浄した。合した濾液を真空蒸発させた。残渣を水に取り、エーテルで抽出した。水性相を１Ｎ塩酸で酸性化してＥｔＯＡｃ（３×７５ｍｌ）で抽出した。合したＥｔＯＡｃ相を水およびブラインで洗浄し、次いでＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空蒸発させて非晶質固体を得た。このようにして得られた粗ペンタペプチド酸をＭｅＯＨ−エーテルから再結晶化させて標題の化合物を得た。収率：０．１６ｇ， （７７％） Ｒｆ：０．８（ｄ）； 融点１４０−１４１℃ （ｄｅｃ）； ［α］Ｄ２５＝−５．６° （ｃ＝０．５４， ＭｅＯＨ）； ＦＡＢ−ＭＳ ［Ｍ＋Ｈ］＋ ５７０； １Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６） δ： ０．９１（ｄ， ６Ｈ）． ３．８−３．９（ｍ， ４Ｈ）， ４．２６， ４．３７および４．６０（Ｃα プロトン）， ６．８−７．１（ＡＢｑ， ４Ｈ）， ７．３０（ｍ， ５Ｈ）， ７．５−８．５（ＮＨｓ）， ９．０５（ｓ， １Ｈ， フェノールＯＨ）。
【００５１】
実施例５
Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−ＯＨ（化合物５）の合成
標準的な方法に従い、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）とヒドロキシエチル−スルフェニル−アセトアミド樹脂とを結合した。置換０．３４ミリ当量／ｇの固相支持体（０．７３ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を反応器に入れ、窒素下で攪拌しながらジクロロメタン（ＤＣＭ）中で膨潤させた。３０分後、樹脂を濾過してＤＣＭで洗浄した。この樹脂にＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）１５ｍｌ中のＢｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）（０．３０ｇ、１．０ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）またはＮ−メチルイミダゾール（ＮＭＩ）（０．２ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。次ぎにＤＩＣ（０．１６ｍｌ、１ｍｍｏｌ）を反応混合物に加えた。この混合物を８〜１０時間攪拌した。樹脂をＤＣＭで３回洗浄して乾燥させた。この乾燥樹脂のアリコート（２．０ｍｇ）への付加率について試験したところ、付加率は８１％であることが分かった［方法Ｂ］。樹脂をＤＣＭ中５０％ＴＦＡで３０分間処理してＢｏｃ基を除去した。３０分後、樹脂を濾過してＤＣＭ２０ｍｌ×３、ＤＣＭ中２０％ＤＩＥＡ２０ｍｌ×３、ＤＣＭ２０ｍｌ×３で洗浄した。Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）の遊離アミノ基を有する樹脂と次のアミノ酸にある相手、すなわちＢｏｃ−Ｌｙｓ（２−Ｃｌ−Ｚ）とを結合した。次いでＢｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｂｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、最後にＢｏｃ−Ｌｙｓ（２−Ｃｌ−Ｚ）を成長しているペプチド鎖に順次結合した。各工程におけるＢｏｃ基の脱ブロックはＣＨ２Ｃｌ２中５０％ＴＦＡを用いて行った。次いで樹脂を０．１Ｎ ＮａＯＨで処理して最終保護ペプチドＢｏｃ−Ｌｙｓ（２−Ｃｌ−Ｚ）−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）−Ｌｙｓ（２−Ｃｌ−Ｚ）−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−ＯＨを得た。次いで保護ペプチドにＰｄ／Ｃを用いる触媒的還元を施して、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−ＯＨを得た。最終工程のＢｏｃ基をジオキサン中５Ｎ ＨＣｌを用いて除去して最終ペプチドＬｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−ＯＨを得た。収率：０．０９ｇ， （７８．５％）， Ｒｆ：０．３３ （Ｆ）； 融点１５８℃， ＦＡＢ−ＭＳ ［Ｍ＋Ｈ］＋５６４； ［α］Ｄ２５＝−２０° （ｃ＝０．１， ＤＭＦ）， １Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６） δ： １．０６（ｄ， ３Ｈ）， １．１０（ｄ， ３Ｈ）， １．３６（ｍ， ２Ｈ）， １．５３（ｍ， ２Ｈ）， ２．７３（ｔ， ４Ｈ）， ４．１５（ｍ， ２Ｈ）， ４．１６−４．４（Ｃα Ｈｓ）， ７．４９（ｔ， ３Ｈ）， ７．５９（ｔ， ３Ｈ）， ７．８−８．７０（ＮＨｓ）。
【００５２】
実施例６
Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨ（化合物６）の合成
標題化合物を、２を得るために使用した方法と同様に固相支持体と結合した上記塩基不安定性リンカー上で合成した（０．５ｍｍｏｌ規模）。収率０．１０ｇ， （７６％）， Ｒｆ ０．３４ （ａ）； 融点１１８℃： ［α］Ｄ２５＝＋４０° （ｃ＝０．１１， ＤＭＦ）； ＦＡＢ−ＭＳ ［Ｍ＋Ｈ］＋ ３２３； １Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６） δ： １．１６（ｓ， ９Ｈ）， ２．３（ｍ， ２Ｈ）， ３．６（ｍ， ２Ｈ）， ４．５８（ｂｓ， １Ｈ）， ７．４（ｍ， ５Ｈ）， ７．９−８．２（ＮＨｓ）。
【００５３】
実施例７
Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＯＨ（化合物７）
同様に、化合物７もまた０．５ｍｍｏｌ規模で合成した。収率：０．１２ｇ（８０％）；Ｒｆ ０．３４ （ａ）； 融点１０９℃； ［α］Ｄ２５＝＋５０°（ｃ＝０．１１）． ＦＡＢ−ＭＳ ［Ｍ＋Ｈ］＋ ３２３；． １Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６） δ： １．１６（ｓ， ９Ｈ）， ２．３（ｍ， ２Ｈ）， ３．６（ｍ， ２Ｈ）， ４．５８（ｂｓ， １Ｈ）， ７．４（ｍ， ５Ｈ）， ７．９−８．２（ＮＨｓ）。
【００５４】
実施例８
２−（４−メトキシフェニル）チアゾリジン−４−カルボン酸（化合物８）の合成
市販のＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）とリンカーに基づく固相支持体１とをＤＩＣ／ＤＭＡＰ法により結合した。置換０．４ミリ当量／ｇの固相支持体（１．０ｇ）を反応器に入れ、窒素下で攪拌しながらジクロロメタン（ＤＣＭ）中で膨潤させた。３０分後、樹脂を濾過してＤＣＭで洗浄した。この樹脂にＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）２０ｍｌ中のＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）（０．７０ｇ、１．２ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）またはＮ−メチルイミダゾール（ＮＭＩ）（０．４ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。この混合物を８〜１０時間攪拌した。樹脂をＤＣＭで３回洗浄して乾燥させた。この樹脂のアリコートを試験し、２０％ピペリジン処理により付加率を調べ、次ぎにＵＶ吸光度を記録した［方法Ａ］。これは付加率９０％であることが分かった。Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）を有する樹脂をＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）２０ｍｌ中２０％ピペリジンで２０分間処理してＦｍｏｃ基を除去した。樹脂をＤＣＭで３回洗浄し、次いでＤＣＭ中１０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／Ｂｕ３ＳｉＨで３０分間（３回）処理してＣｙｓのトリチル基を除去した。樹脂をＤＣＭで３回洗浄した後、ＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）１５ｍｌ中のｐ−アニスアルデヒド（０．５ｍｌ）の溶液を攪拌しながら加え、攪拌を８〜１０時間続けた。樹脂をＤＣＭで３回洗浄して乾燥させた。これをジオキサン−ＭｅＯＨ−４Ｎ ＮａＯＨの混合物（３０：９：１、２０ｍｌ）で攪拌しながら３０分間処理し、樹脂を濾過して水２ｍｌで洗浄した。合した濾液を真空蒸発させた。残渣を水に取り、エーテルで抽出した。水性相を１Ｎ塩酸で酸性化してＥｔＯＡｃ（３×７０ｍｌ）で抽出した。合したＥｔＯＡｃ相を水およびブラインで洗浄し、次いでＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空蒸発させて白色の結晶質として２−（４−メトキシフェニル）チアゾリジン−４−カルボン酸を得た。収率：０．０６１ｇ， ７２％； 融点１５０−５１℃； ＦＡＢ−ＭＳ ［Ｍ＋Ｈ］＋２３９； １Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６） δ：３．５（ｍ， ２Ｈ）， ３．７（ｓ， ３Ｈ）， ４．８（ｂｓ， １Ｈ）， ５．９（ｂｓ， １Ｈ）， ６．８−７．１（Ａｂｑ， ４Ｈ）。
【００５５】
実施例９
Ｎ−Ｂｏｃ−２−（４−メトキシフェニル）チアゾリジン−４−カルボン酸（化合物９）の合成
市販のＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）とリンカーに基づく固相支持体＃とをＤＩＣ／ＤＭＡＰ法により結合した。置換０．３４ミリ当量／ｇの固相支持体（０．５０ｇ）を反応器に入れ、窒素下で攪拌しながらジクロロメタン（ＤＣＭ）中で膨潤させた。３０分後、樹脂を濾過してＤＣＭで洗浄した。この樹脂にＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）２０ｍｌ中のＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）（０．５６ｇ、１．０ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）またはＮ−メチルイミダゾール（ＮＭＩ）（０．２５ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。この混合物を８〜１０時間攪拌した。樹脂をＤＣＭで３回洗浄して乾燥させた。この樹脂のアリコートを試験し、２０％ピペリジン処理により付加率を調べ、次ぎに吸光度を記録したところ、付加率約８８％であることが分かった［方法Ａ］。Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）を有する樹脂をＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）１２ｍｌ中２０％ピペリジンで２０分間処理してＦｍｏｃ基を除去した。樹脂をＤＣＭで３回洗浄し、次いでＤＣＭ中１０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／Ｂｕ３ＳｉＨで３０分間（３回）処理してＣｙｓのトリチル基を除去した。樹脂をＤＣＭで３回洗浄した後、ＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）１０ｍｌ中のｐ−アニスアルデヒド（０．５ｍｌ）の溶液を攪拌しながら加えた。攪拌を８〜１０時間続けた。樹脂をＤＣＭで３回洗浄した。この樹脂にＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）１０ｍｌ中のジ−ｔ−ブチルジカルボネート（０．２２ｇ、１ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（０．２ｍｌ、１．０ｍｍｏｌ）の溶液を加え、攪拌を３時間続けた。３時間後、樹脂はカイザーテストで陰性であった。樹脂をＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）１０ｍｌ×３、ＤＭＦ１０ｍｌ×３、ＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）１０ｍｌ×２、最後にＤＣＭで３回洗浄して乾燥させた。これをジオキサン−ＭｅＯＨ−４Ｎ ＮａＯＨの混合物（３０：９：１、２０ｍｌ）で攪拌しながら３０分間処理し、樹脂を濾過して水２ｍｌで洗浄した。合した濾液を真空蒸発させた。残渣を水に取り、エーテルで抽出した。水性相を１Ｎ塩酸で酸性化してＥｔＯＡｃ（３×７０ｍｌ）で抽出した。合したＥｔＯＡｃ相を水およびブラインで洗浄し、次いでＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空蒸発させて白色の結晶質としてＮ−Ｂｏｃ−２−（４−メトキシフェニル）チアゾリジン−４−カルボン酸を得た。収率：０．０４８ ｇ， ８２％； 融点１６０−１６２℃； ＦＡＢ−ＭＳ ［Ｍ＋Ｈ］＋ ３４０． １Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６） δ：１．２（ｓ， ９Ｈ）， ３．４（ｍ， ２Ｈ）， ３．９（ｓ， ３Ｈ）， ４．７（ｂｓ， １Ｈ）， ５．９（ｂｓ， １Ｈ）， ６．８−７．１（Ａｂｑ， ４Ｈ）。
【００５６】
実施例１０
Ｎ−ベンゾイル−２−（４−メトキシフェニル）チアゾリジン−４−カルボン酸（化合物１０）の合成
市販のＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）とリンカーに基づく固相支持体＃とをＤＩＣ／ＤＭＡＰ法により結合した。置換０．３４ミリ当量／ｇの固相支持体（０．５０ｇ）を反応器に入れ、窒素下で攪拌しながらジクロロメタン（ＤＣＭ）中で膨潤させた。３０分後、樹脂を濾過してＤＣＭで洗浄した。この樹脂にＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）２０ｍｌ中のＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）（０．５６ｇ、１．０ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）またはＮ−メチルイミダゾール（ＮＭＩ）（０．２５ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。この混合物を８〜１０時間攪拌した。樹脂のアリコートをＤＣＭで３回洗浄して乾燥させた。この樹脂のアリコートを試験し、２０％ピペリジン処理により付加率を調べ、次ぎに吸光度を記録したところ、付加率約８８％であることが分かった［方法Ａ］。Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）を有する樹脂をＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）１２ｍｌ中２０％ピペリジンで２０分間処理してＦｍｏｃ基を除去した。樹脂をＤＣＭで３回洗浄し、次いでＤＣＭ中１０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／Ｂｕ３ＳｉＨで３０分間（３回）処理してＣｙｓのトリチル基を除去した。樹脂をＤＣＭで３回洗浄した後、ＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）１０ｍｌ中のｐ−アニスアルデヒド（０．５ｍｌ）の溶液を攪拌しながら加えた。攪拌を８〜１０時間続けた。樹脂をＤＣＭで３回洗浄した。この樹脂にＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）１０ｍｌ中の塩化ベンゾイル（０．２ｍｌ、２ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（０．４ｍｌ、２．０ｍｍｏｌ）の溶液を加え、樹脂がカイザーテストで陰性になるまで３時間攪拌した。樹脂をＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）１０ｍｌ×３、ＤＭＦ１０ｍｌ×３、ＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）１０ｍｌ×２、最後にＤＣＭで３回洗浄して乾燥させた。これをジオキサン−ＭｅＯＨ−４Ｎ ＮａＯＨの混合物（３０：９：１、２０ｍｌ）で攪拌しながら３０分間処理し、樹脂を濾過して水２ｍｌで洗浄した。合した濾液を真空蒸発させた。残渣を水に取り、エーテルで抽出した。水性相を１Ｎ塩酸で酸性化してＥｔＯＡｃ（３×７０ｍｌ）で抽出した。合したＥｔＯＡｃ相を水およびブラインで洗浄し、次いでＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空蒸発させて白色の結晶質としてＮ−ベンゾイル−２−（４−メトキシフェニル）チアゾリジン−４−カルボン酸を得た。収率：０．０４３ ｇ， ７２％； 融点１０８−１１０℃； ＦＡＢ−ＭＳ ［Ｍ＋Ｈ］＋ ３４４． １Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６） δ：３．３（ｍ， ２Ｈ）， ３．９（ｓ， ３Ｈ）， ４．７（ｂｓ， １Ｈ）， ５．７（ｂｓ， １Ｈ）， ６．６（ｍ， ５Ｈ）， ６．９−７．２（Ａｂｑ， ４Ｈ）。
【００５７】
実施例１１
Ｎ−Ｂｏｃ−２−（４−メトキシフェニル）チアゾリジニル−ロイシン（化合物１１）の合成
置換０．４ミリ当量／ｇの新規なリンカーに基づく固相支持体１（１．０ｇ）を反応器に入れ、窒素下で攪拌しながらジクロロメタン（ＤＣＭ）中で膨潤させた。３０分後、樹脂を濾過してＤＣＭで洗浄した。この樹脂にＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）２０ｍｌ中のＢｏｃ−Ｌｅｕ（０．４５ｇ、２ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）またはＮ−メチルイミダゾール（ＮＭＩ）（０．４ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。この反応混合物を８〜１０時間攪拌した。樹脂をＤＣＭで３回洗浄して乾燥させた。この乾燥樹脂のアリコート（２．５ｍｇ）への付加率について試験したことろ、付加率は８２％であることが分かった［方法Ｂ］。樹脂をＤＣＭ中５０％ＴＦＡで３０分間処理してＢｏｃ基を除去した。３０分後、樹脂を濾過してＤＣＭ２０ｍｌ×３、ＤＣＭ中２０％ＤＩＥＡ２０ｍｌ×３、ＤＣＭ２０ｍｌ×３で洗浄し、最後にＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）２０ｍｌ中の２０％ピペリジン溶液に懸濁してＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）２０ｍｌで処理した。Ｌｅｕの遊離アミノ基を有する樹脂とＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）２０ｍｌ中のＢｏｃ−Ｃｙｓ−（Ｔｒｔ）（０．５６ｇ、１ｍｍｏｌ）およびＨＯＢｔ（０．１５３ｇ、１ｍｍｏｌ）の溶液とを窒素下で攪拌しながら反応させた。この懸濁液にＤＩＣ（０．１８ｍｌ、１．２ｍｍｏｌ）を加え、樹脂がカイザーテストで陰性になるまで３時間攪拌した。これを濾過してＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）１５ｍｌ×３、最後にＤＣＭで洗浄した。樹脂をＤＣＭ中５０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／Ｂｕ３ＳｉＨで３０分間処理し、次いでＤＣＭ中１０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／Ｂｕ３ＳｉＨで１０分間（３回）洗浄してＣｙｓのＢｏｃおよびトリチル基をともに除去した。樹脂をＤＣＭで３回洗浄した後、ＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）１０ｍｌ中のｐ−アニスアルデヒド（０．５ｍｌ）の溶液を攪拌しながら加えた。攪拌を８〜１０時間続けた。樹脂をＤＣＭで３回洗浄した。この樹脂にＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）１０ｍｌ中の塩化ベンゾイル（０．２ｍｌ、２ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（０．４ｍｌ、２．０ｍｍｏｌ）の溶液を加え、攪拌を３時間続けた。３時間後、樹脂はカイザーテストで陰性であった。樹脂をＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）１０ｍｌ×３、ＤＭＦ１０ｍｌ×３、ＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）１０ｍｌ×２、最後にＤＣＭで３回洗浄して乾燥させた。これをジオキサン−ＭｅＯＨ−４Ｎ ＮａＯＨの混合物（３０：９：１、２０ｍｌ）で攪拌しながら３０分間処理し、樹脂を濾過して水２ｍｌで洗浄した。合した濾液を真空蒸発させた。残渣を水に取り、エーテルで抽出した。水性相を１Ｎ塩酸でｐＨ２．０まで酸性化してＥｔＯＡｃ（３×７０ｍｌ）で抽出した。合したＥｔＯＡｃ相を水およびブラインで洗浄し、次いでＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空蒸発させてガラス質としてＮ−Ｂｏｃ−２−（４−メトキシフェニル）チアゾリジニル−ロイシンを得た。収率：０．１１ｇ， ７８％； ＦＡＢ−ＭＳ ［Ｍ＋Ｈ］＋ ４５３； １Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６） δ：０．９（ｍ， ６Ｈ）， １．２（ｂｓ， ９Ｈ）， １．７（ｍ， ２Ｈ）， ４．３（ｍ， １Ｈ）， ３．５（ｍ， ２Ｈ）， ３．７（ｓ， ３Ｈ）， ４．８６（ｂｓ， １Ｈ）， ５．９（ｂｓ， １Ｈ）， ６．８−７．１（Ａｂｑ， ４Ｈ）。
【００５８】
【発明の効果】
本発明の利点
図１の式１に示した新規なリンカーに基づく固相支持体、ヒドロキシエチル−スルフェニル−アセトアミド樹脂（ＨＥＳＡ樹脂）はペプチド合成用のオルトゴナル適合性固相支持体である、すなわちこれはＢｏｃおよびＦｍｏｃ化学双方を単独または組み合わせて使用することにより生物学的に有効なペプチドの合成に用いることができる。支持体からの生成物の開裂には極めて弱い塩基条件しか必要でないため、大ペプチドの収斂合成に有用な保護されたペプチド断片の迅速な合成が行われる。合成されたペプチドは高収率かつ高純度である。さらに生成物ではラセミ化は起こらない。またこれによりＣ末端に酸化しやすいアミノ酸を有する配列が合成できる。新規なリンカーに基づく固相支持体を有機小分子の固相合成およびペプチドおよび有機小分子ならびに複素環式分子のコンビナトリアル・ライブラリーの生成に用いることができる。新規な固相支持体は実験室で極めて便宜に大量合成することができ、保存時に特別な注意を何ら払う必要はなく、後の合成用に周囲温度で何ヶ月もの間保存できる。さらに、それを合成するための新規な方法も開発した。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ヒドロキシエチル−スルフェニル−アセトアミド樹脂の構造を示す。
【図２】
従来のペプチド合成を示す。
【図３】
ヒドロキシエチル−スルフェニル−アセトアミド樹脂（ＨＥＳＡ）の合成を示す。
【図４】
Ｂｏｃ化学プロトコールによるＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯＨの合成を示す。
【図５】
Ｆｍｏｃ化学プロトコールによるＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯＨの合成を示す。
【図６】
チアゾリジン誘導体の合成を示す。
【図７】
チアゾリジン誘導体の合成を示す。
【発明が属する技術分野】
本発明は、ペプチド合成およびコンビナトリアル・ライブラリー合成に用いられる新規なリンカーに基づく固相支持体、固相支持体上にリンカー部分を作り出す方法、ならびに支持体を用いてペプチドおよび小分子コンビナトリアル・ライブラリーを合成する方法に関する。本発明の新規な固相支持体はまた、ポリスチレンのような固相支持体に共有結合した官能化リンカーを含む。
【０００２】
【従来の技術】
背景技術
固相合成の急速な発展は、より新しい合成課題を満たす新規かつ反応しやすい固相支持体の開発を要する。ペプチド合成用の固相支持体は非常によく確立されており、今般、環状ペプチド、ペプチドアミド、ペプチドアルデヒドなどの合成でさえ支持体上で直接可能となっている［（ａ） Ｂａｒａｎｙ， Ｇ． ｅｔ． ａｌ．， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔｉｄｅ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ． ３０， ７０５−７３９， １９８７．； （ｂ） Ｆｉｅｌｄｓ， Ｇ． Ｂ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔｉｄｅ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ． ３５， １６１−２１４， １９９０． （ｃ） Ｌｌｏｙｄ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ， Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ， ４９， １１０６５−１１１３３， １９９３ （ｄ） Ｗａｎｇ， Ｓ． Ｓ．， Ｊ． Ａｍｅｒ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ９５． １３２８， １９７３ （ｅ） Ｂａｒｌｏｓ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ３０， ３９４７， １９８９ （ｆ） Ｂｅｅｂｅ， Ｘ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．， ６０， ４２０４， １９９５ （ｇ） Ｒｉｎｋ， Ｈ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ２８， ３７８７， １９８７ （ｈ） Ｒａｐｐ． Ｗ．， ｅｔ ａｌ．， ”Ｐｅｐｔｉｄｅｓ １９８８”． Ｐｒｏｃ． ２０ｔｈ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ． Ｊｕｎｇ Ｇ． ａｎｄ Ｂｏｙｅｒ Ｅ． （ｅｄｓ．）， Ｗａｌｋｅｒ ｄｅ （Ｇｒｎｙｔｅｒ， Ｂｅｒｌｉｎ， ｐｐ １９９ １９８９］。さらに、有機小分子の合成はより反応しやすく広範囲の固相支持体を必要とする。シントンに結合する種々の官能基ならびに用いられる合成試薬および実験条件に対するそれらの安定性および感受性についての文献には、多数の支持体が報告されている［Ｏｅｓａｐａｙ， Ｇ．， ｅｔ ａｌ． ”Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｐｒｏｃ． １３ｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ”． Ｈｏｄｇｅｓ， Ｒ． Ｓ． ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ Ｊ． Ａ． （Ｅｄｓ．）， ＥＳＣＯＭ， Ｌｅｉｄｅｎ． ｐｐ ４３５． １９９４． （ｂ） Ｈｅｒｍｋｅｎｓ， Ｐ． Ｈ． Ｈ． ｅｔ ａｌ， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ， ５２， ４５２７． １９９６ （ｃ） Ｈｅｒｍｋｅｎｓ． Ｐ． Ｈ． Ｈ． ｅｔ ａｌ， Ｔｅｔｒａｈｅｒｏｎ， ５３． ５６４３． １９９７ （ｄ） Ｂｒｏｗｎ， Ｒ． Ｃ．， Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｐｅｒｋｉｎ−ｌ． ３２９３． １９９８］。ほとんどの場合、利用できる支持体は、分子に有害である強酸を含む固相支持体から分子を開裂させるために激しい条件を必要とする。さらに、アミノ分解および還元的開裂法は、特にペプチドの場合には、副反応およびラセミ化を引き起こす。他方、比較的温和な条件を必要とする支持体では、特に有機小分子の場合には、有機合成に用いられる種々の試薬および実験条件に耐えられない。従って、オルト適合性の新規かつ反応しやすい支持体の開発が極めて有益である。本質的に固体マトリックスと成長中の分子との間に二官能性リンカーを組み込む戦略に基づいた種々の支持体の開発が活発に行われている。第１の工程は固体マトリックスにリンカー分子を結合させることを含み、次ぎにそのリンカーを担持する固相支持体上で所望の合成足場を構成する。これによって合成足場の結合に所望の官能基を利用して固相支持体上に所望の化学特性を達成することができる。この前提に基づいて、リンカーに基づく固相支持体がいくつか開発され、市販されている［Ｏｅｓａｐａｙ， Ｇ．， ｅｔ ａｌ， ”Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｐｒｏｃ． １３ｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ”， Ｈｏｄｇｅｓ， Ｒ． Ｓ． ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ Ｊ， Ａ， （Ｅｄｓ．）， ＥＳＣＯＭ， Ｌｅｉｄｅｎ， ｐｐ ４３５， １９９４， （ｂ） Ｈｅｒｍｋｅｎｓ， Ｐ． Ｈ． Ｈ． ｅｔ ａｌ， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ， ５２， ４５２７， １９９６ （ｃ） Ｈｅｒｍｋｅｎｓ， Ｐ． Ｈ． Ｈ． ｅｔ ａｌ， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ， ５３， ５６４３， １９９７ （ｄ） Ｂｒｏｗｎ， Ｒ． Ｃ．， Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｐｅｒｋｉｎ−１， ３２９３， １９９８． およびａ） Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ， Ｃ． Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ， ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ４７， ３１１， １９９８ （ｂ） Ｐａｔｅｋ， Ｍ． ａｎｄ Ｌｅｂｌ， Ｍ． ｉｂｉｄ． ３５３ （ｃ） Ｂａｒａｎｙ， Ｇ．， ｅｔ ａｌ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐａｔｅｎｔ： ５，２３５，０２８ １９９３． （ｄ） Ｂａｒａｎｙ， Ｇ．， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐａｔｅｎｔ： ５，３０６，５６２， １９９４ （ｅ） Ｊｅｎｓｅｎ， Ｋ． Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐａｔｅｎｔ ５，９１７，０１５， １９９９］。同様の方針で研究を行い、出願人らもペプチド固相合成用のリンカーを以前に開発している［Ｋａｔｔｉ， Ｓ． Ｂ． ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍｍｕｎ．， ８４３−８４４， １９９２］。図２、式ＶＩＩに示したような基礎の不安定なリンカーを、容易に入手できる原料を用いて製造し、使用される各アミノ酸についてそれぞれＣ末端で合成した。それはＰＡＭ樹脂の合成に使用される方法に従って製造した［Ｍｉｔｃｈｅｌｌ， Ａ． Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ， Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ４３， ２８４５， １９７８］。これによって、ペプチドのさらなる合成のため、固相支持体上に予めリンカーが付加されたアミノ酸が得られる。この合成をクロロ酢酸（Ｉ）を臭化フェナシル（ＩＩ）で処理することで開始すると、対応するエステル（ＩＩＩ）が得られた。エステルＩＩＩメルカプトエタノール（ＩＶ）で処理すると、保護されたリンカー（Ｖ）が得られた。リンカーの水酸基をＤＣＣおよびＤＭＡＰで適切に保護されたアミノ酸（ＢｏｃまたはＦｍｏｃ）でアシル化し、次いでＺｎ／ＡｃＯＨによってフェナシルエステルを脱ブロックすると、遊離の酸（ＶＩ）が得られた。次ぎに遊離の酸ＶＩのスルフィド基を酸化してオキソンで処理することにより、対応するスルホン（ＶＩＩ）が得られた。適切に保護されたアミノ酸を有するリンカー酸をＤＩＣ／ＨＯＢＴ法によってアミノメチル樹脂上に付加すると、定量的な付加が得られた。固相支持体上に第１のアミノ酸を担持するリンカーを付加したところ、リンカーに基づく固相支持体ーの有用性は、公知の方法を使用するＢｏｃおよびＦｍｏｃ化学を利用するペプチド合成によって実証された。固相支持体からのペプチドの開裂は、極めて温和な条件下、ジオキサン：メタノール：４Ｎ ＮａＯＨ（３０：９：１）で３０分間処理することによって行われた。このこれによって保護されたペプチド断片を得る機会が与えられたが、これは大きいペプチドおよびタンパク質の合成のために極めて有用な中間体である［Ｋａｉｓｅｒ， Ｅ． Ｔ．， Ａｃｃ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ． ２２， ４７， １９８９： Ｗｉｌｌｉａｍｓ， Ｐ． ｅｔ ａｌ． Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ． ４９， １１０６５， １９９３］。このように、リンカーがＢｏｃおよびＦｍｏｃ双方の化学プロトコールに適合し、実験室で容易に合成できるということが実証された。このリンカーを用いて数種のペプチドおよび保護されたペプチド断片が合成された。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
技術上の課題
種々の利点にもかかわらず、上記のリンカーに基づく固相支持体にはある制限が存在する。ペプチドの合成でＣ末端にアミノ酸をもつリンカーは各合成で個々に合成すべきである［添付図面に示された図２］。従って、各配列の合成は付加的な工程を要し、時間がかかる。さらに、保護されたアミノ酸を有するリンカーは、固相支持体上に付加する前に強力な酸化剤であるオキソンを用いて酸化されることから、酸化しやすいアミノ酸を第１のアミノ酸として使用することができない。従ってＣ末端にシステイン、メチオニン、トリプトファンおよびチロシンを有するペプチド配列は、これらのアミノ酸がオキソン酸化の間に酸化されるという問題を持つ。次に、添付図面の図２に示されている式ＶＩＩのリンカーは、特により長いペプチドの合成に関してＦｍｏｃ基の除去に用いられる開裂条件下では全く安定でないことが認められている。２０％ピペリジン溶液に長時間曝される結果、固相支持体から成長鎖が開裂することが認められた。固相支持体からの生成物の開裂はβ脱離を経て起こるので、２０％ピペリジン溶液の塩基性はリンカーのβ脱離を引き起こすには十分であり、各脱ブロック工程でペプチドの部分開裂が起こる結果となった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
発明の目的
本発明の主要な目的は、有機合成用のオルトゴナル適合性のリンカーに基づく固相支持体を提供することである。
【０００５】
本発明のもう１つの目的は、ＢｏｃおよびＦｍｏｃ化学プロトコールを単独または組み合わせて使用してペプチド合成用の新規なリンカーに基づく固相支持体を提供することである。
【０００６】
本発明のさらにもう１つの目的は、ポリスチレンのような固相支持体に共有結合した官能化リンカーを含む新規な固相支持体を提供することである。
【０００７】
本発明のもう１つの目的は、ヒドロキシエチル−スルフェニル−アセトアミド樹脂の合成方法を提供することである。
【０００８】
本発明のさらにもう１つの目的は、より長いペプチドの固相収斂合成に使用される保護されたペプチド断片の合成用の新規な固相支持体を提供することである。
【０００９】
本発明のなおさらにもう１つの目的は、コンビナトリアル・ライブラリーを形成する有機小分子の合成用の新規なリンカーに基づく固相支持体の範囲を強化することである。
【００１０】
発明の概要
上記目的を満たすために、本発明は、図１の式Ｉに示された新規なオルトゴナル適合性の固相支持体、ヒドロキシエチル−スルフェニル−アセトアミド樹脂（ＨＥＳＡ樹脂）の開発を記載する。本明細書に記載される新規な固相支持体は、ＢｏｃおよびＦｍｏｃ双方の化学を単独または組み合わせて用いて生物学的に活性なペプチドを合成するのに使用できる。
【００１１】
発明の具体的な説明
固相合成の分野とコンビナトリアル化学とが一緒になって、新しいリード物質を発見するための有用な手段として現れてきた。製薬産業およびより多くの化合物へのその探求によって大いにあおられ、固相合成は多くの有機変換に採用されてきた。これに関しての新たな興味は技術開発の１つの機会であり、すなわち有機合成の要求に対応するようにした新規なリンカーおよび／または固相支持体である。概念としては科学的精密さと簡潔さを備えているが、多様な化学特性をもつ有用な固相支持体は一方または他方のタイプの化学に適したものであって、複雑な化学を含む。本発明の支持体は市販されている安価な原料から容易に得られる。最終生成物は極めて温和な条件下で開裂させることができる。本発明は、コンビナトリアル・ライブラリーを形成するペプチドおよび小分子の合成用の新規なリンカーに基づく固相支持体の合成および適用を記載する。
【００１２】
支持体からの生成物の開裂には極めて温和な塩基性条件しか必要とされないので、これにより大きいペプチドの収斂合成に有用である保護されたペプチド断片の迅速な合成もたらされる。合成されたペプチドは高収率で優れた純度である。さらにこれらの生成物はラセミ化していない。このことによって、酸化しやすいアミノ酸をＣ末端にもつ配列を合成が可能となる。本発明のもう１つの重要な特徴は、新規な固相支持体を、有機小分子の固相合成に、ならびにペプチドおよび有機小分子ならびに複素環式分子のコンビナトリアル・ライブラリーの形成に使用できることである。新規な固相支持体は実験室で大量に極めて便宜に合成することができ、保存中にも特別の注意を何ら必要とせず、次の合成に適用するまで周囲温度で数ヶ月間保存することができる。さらに、新規な方法もまた、その合成のために開発された。
【００１３】
化学的に決められた反応性操作による新規な固相支持体の合成は２段階で達成された。第１の工程では、クロロ酢酸またはハロゲンの代わりに好適な脱離基を含むその等価物を、添付図面の図３に示された公知の方法［工程１］によってアミノメチル樹脂とカップリングする。この反応工程は、ネガティブ・カイザーテストによって示されるように定量的である。次の工程では、メルカプトエタノールと工程１で得られた固相支持体とを反応させて、添付図面の図３に示された所望の固相支持体１［工程２］を得た。添付図面に示された新規なリンカーに基づく固相支持体１は、新たに導入されたアセトアミド部分のカルボニルに相当する１６６６ｃｍ−１の強いピークおよび第一級水酸基に相当する３２１９ｃｍ−１のピークを基に同定された。
【００１４】
水酸官能基の定量は、標準的なプロトコールを用いて適当なＢｏｃまたはＦｍｏｃで保護されたアミノ酸を付加することにより、文献で報告されている標準法によって行った。Ｂｏｃ化学の場合、ピクリン酸法により固相支持体上のアミノ官能基を評価することによって定量を行った［方法Ａ］［Ｇｉｓｉｎ， Ｂ． Ｆ．， Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． Ａｃｔａ．， ５８， ２４８， １９７２］。一方、Ｆｍｏｃ化学の場合には、ピペリジン処理によってＦｍｏｃ基を除去し、次いで３０１ｎｍの吸光度を測定することによって９−フルオロエニルメチルピペリジンを定量した［方法Ｂ］［Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔｉｄｅ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ． １３， ３５， １９７９］。新規な樹脂１は、数ヶ月間、周囲温度で安定であることが分かっており、一度製造すれば特別な保存条件を何ら設けることなく長期間次の合成の適用に用いることができる。さらに、アミノ酸を担持する樹脂についても、ＢｏｃまたはＦｍｏｃ化学プロトコールの際にペプチド合成に通常用いられる試薬および実験条件に対する安定性を試験した。本発明者らは５０％ＴＦＡ：ＤＣＭならびにＤＭＦ中２０％ピペリジン下でアミノ酸が結合した樹脂の開裂を全く認めなかった。
【００１５】
ラセミ化の検討：
樹脂からペプチドを開裂させるアルカリ条件は極めて温和であるが、出願人らはラセミ化の危険についてのある明確な証拠を提供することが適当であると考えた。保護された一対のジペプチド、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨおよびＢｏｃ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＯＨをこの目的のために合成した。酵素カルボキシペプチダーゼ−ＡはＣ末端の芳香族アミノ酸の隣りのペプチド結合を優先的に加水分解するので、このジペプチドを選択した［Ｂｒａｄｓｈａｗ， Ｒ． Ａ．， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ６３， １３８９， １９６９］。支持体からペプチドが開裂する際、ラセミ化が起こるとすれば、本発明者らはＢｏｃ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨの場合に加水分解されていないジペプチドに相当するピークを予想しなければならなかったが、ラセミ化の程度にもよるがＢｏｃ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＯＨの場合にもいくらかの加水分解は起こるはずである。固相支持体から除去された後、保護されたジペプチドをさらに精製することなく、カルボキシペプチダーゼ−Ａによる酵素加水分解を施した。３０分後、アリコットをＴＬＣによってモニタリングした。Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨは完全に加水分解され、その代わりにＢｏｃ−ＧｌｙおよびＬ−フェニルアラニンに相当する２つのスポットが見られた。一方、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＯＨは、加水分解生成物に相当するスポットが存在しないことから、加水分解に完全に耐性があり、ジペプチドはそのままであった。このモニタリングはＨＰＬＣによっても行い、同様の結果が得られた。Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨの場合には完全な加水分解が認められたが、一方、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＯＨの場合には、ＨＰＬＣプロフィールにおいてＢｏｃ−Ｇｌｙに相当するピークが存在しないことで明らかなように、加水分解的開裂は認められなかった。これらの結果は、固相支持体からペプチドを除去する際にＣ末端のアミノ酸のラセミ化は起こらないことを明白に実証するものである。
【００１６】
リンカーに基づく固相支持体の合成適用：
このリンカーの有用性を実証するために、ＢｏｃおよびＦｍｏｃ化学を用いるいくつかのペプチドならびにいくつかのチアゾリジン誘導体の合成を行った。ロイエンケフェリンは、Ｂｏｃ化学とＦｍｏｃ化学ぞれぞれによって合成された。次のアミノ酸残基を組み込むための段階的な脱保護／カップリングサイクルは、標準的なＤＩＣ／ＨＯＢｔプロトコールによって達成した。Ｂｏｃ基の脱ブロックは、ＤＣＭ中５０％のＴＦＡまたは５Ｎ ＨＣｌ／ジオキサンによって、Ｆｍｏｃ基の脱ブロックは２０％ピペリジン／ＤＭＦによって行った。よりよい収率を達成するために、各工程においてカップリング反応を繰り返し、必要であればカイザーテスト試験によって判断した。最終ペプチドはアルカリ条件下で固相支持体から分離し、５Ｎ ＨＣｌ／ジオキサンで処理した。後処理および結晶化の後、全ペプチドは全体で６０〜７０％を超える収率で得られた。それらを分光光度法によって同定した。
【００１７】
これらの化合物は総て、逆相ＨＰＬＣで純度が９０％より高いことが分かり、ＦＡＢ−ＭＳで正確な分子イオンピークを示した。本リンカーの範囲を拡大するには側鎖官能基を有するペプチドを合成することが望ましいと考えられた。Ｉ型プロコラーゲンの残基２１１〜２１６に相当するペンタペプチド、Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒをこの目的のために選択した［Ｋａｔａｙａｍａ Ｋ． ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６８， ９９４１， １９９３］。カップリング反応にＤＩＣ／ＨＯＢｔを用いるＢｏｃ化学によって合成を行った。図４に示されたものと同様のプロトコールに従い、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）をリンカーに結合させた。この後に適切に保護されたアミノ酸の一連の付加を行った。合成の終了時に、アミノおよび側鎖が保護されたペプチドを先に記載したように固相支持体から開裂させた。保護されたペプチド断片は、ＦＡＢ−ＭＳスペクトルにおける適当な［Ｍ＋Ｈ］＋の分子イオンピークによって同定した。ペプチドをアミノおよび側鎖保護ペプチドをそのままにして固相支持体から選択的に開裂させることができるという事実は、このリンカーが断片縮合法によるより大きいペプチドの合成において有用である可能性があることを示唆している。最後に、保護基を定量的に除去すると、ペンタペプチドが７８％の収率で得られた。
【００１８】
有機小分子の合成における新規な固相支持体の適用を実証するために、いくつかのチアゾリジン誘導体［Ｐａｔｅｋ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３６， ２２２７， １９９５］を合成した。この合成に適合させたプロトコールがスキームに示めされている（図６および７、ここでＲ＝Ｈ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｆ、ＮＯ２、ＯＨ、ＯＭｅ、アルキル、アラルキル、アリールおよび置換体、Ｘ＝ＣまたはＮ、Ｒ’＝アシル、アルキル、Ｂｏｃ、Ｂｚ、Ｚまたはアミノ酸、ならびにＲ’’＝アミノ保護基）。適切に保護されたシステイン誘導体すなわち、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）をＤＩＣ／ＤＭＡＰまたはペプチドの合成に関して記載されたプロトコールを用いるその他の触媒によって固相支持体に結合させた。Ｆｍｏｃ基はＤＭＦ中２０％ピペリジンで処理することによって開裂させ、次いでトリチル基はＤＣＭ中１０％ ＴＦＡで処理することによって除去した。室温または高温で、遊離アミノおよびスルフヒドリル基を有するシステインを結合した支持体を所望の市販のアルデヒド（２モル過剰を使用）と反応させた。環化は６〜８時間で完了した。あるいは、固相支持体に結合させる出発原料としてＢｏｃ−Ｃｙｓ（ｔｒｔ）を用いてチアゾリジンをも上手く合成された。この誘導体の利点は、アミノおよびスルフヒドリル基から保護基を一段階、すなわちＴＦＡ処理で除去することができるという点である。このようにして得られたチアゾリジン誘導体は、固相支持体それ自体から開裂させることもできるし、あるいは固相支持体上で誘導体化／アシル化することもができる。従って、チアゾリジンを担持する支持体をいくつかの部分に分割し、遊離アミノ基を並行合成プロトコールで種々の芳香族および脂肪族アシル化剤で個々にアシル化した。種々のアルデヒドおよびアシル化剤を用い、いくつかの新規な誘導体が高収率かつ高純度で生成された。
【００１９】
添付図面に示された図１の式１に示されたリンカーに基づく固相支持体の範囲を拡大するために、チアゾリジン骨格を支持体に結合させた種々のアミノ酸／ペプチドまたはその他の分子上で合成した。このように、適切に保護されたＢｏｃまたはＦｍｏｃ保護アミノ酸を標準的なプロトコールを用いて固相支持体に結合させた。アミノ保護基を除去し、遊離アミンをＤＩＣ／ＨＯＢｔ法によって適切に保護されたシステイン残基とカップリングさせた。カイザーテストによってモニタリングしたところ、カップリングが完了した後、システインの両保護基を先に記載したものと同様の方法で除去した。システインの遊離アミノおよびスルフヒドリル基をもつジペプチドを担持する樹脂を、室温において固相支持体上で所望の市販のアルデヒド（２モル過剰を使用）と反応させた。環化は６〜８時間で完了した。このようにして得られたチアゾリジニルジペプチド誘導体は固相支持体それ自体から開裂させることもできるし、あるいは固相支持体上で誘導／アシル化することもできる。チアゾリジニルジペプチド誘導体を担持する支持体をいくつかの部分に分割し、遊離アミノ基を並行合成プロトコールで種々の芳香族および脂肪族アシル化剤で個々にアシル化した。種々のＣ末端アミノ酸、種々のアルデヒドおよびアシル化剤を用いて、多様な新規な化合物が高収率かつ高純度で生成された。
【００２０】
要するに、新規なリンカーは実験室で便宜に合成することができ、それはＢｏｃおよびＦｍｏｃ化学プロトコールによるペプチド合成に理想的に適している。保護されたペプチドをセグメント縮合法に用いるために合成することができる。固相支持体からのペプチドの脱離に使用される条件ではラセミ化は生じない。本発明者らは、ここで報告された新規なリンカーが酸性および弱塩基性条件に対して安定であり、ゆえにそれはペプチド／オリゴヌクレオチド合成および多様な小分子ライブラリーの構築に用いられる著しい可能性を有していると考えている。
従って、本発明は、ＢｏｃおよびＦｍｏｃ化学を単独でまたは組み合わせて用いるペプチドおよび保護されたペプチド断片の固相合成のため、ならびに有機小分子コンビナトリアル・ライブラリーの合成のためのオルトゴナル適合性のヒドロキシエチル−スルフェニル−アセトアミド樹脂の開発に関する。本発明はまた、図１の式１に示された式を有するヒドロキシエチル−スルフェニル−アセトアミド樹脂の新規な合成方法を提供し、ここで固相支持体はアミノ官能膜、多孔質ガラス、ポリスチレン、綿および紙からなる群から選択され、ポリスチレンはアミノポリスチレンおよびアミノメチルポリスチレンからなる群から選択され、該方法は、
（ａ）既知の方法［添付図面の図３に示された一連の工程］を用い、ジイソプロピルカルボジイミドまたは通常用いられるその他のカップリング試薬の存在下、クロロ酢酸またはハロゲンの代わりに好適な脱離基を含むその等価物とアミノメチル樹脂とを反応させること、
（ｂ）ヨウ化ナトリウムの存在下、脱離基を有する上記支持体とメルカプトエタノールとを反応させて図３の式１の所望の固相支持体を得ること、さらに所望により、
（ｃ）このようにして得られた新規な固相支持体を、添付図面の図４〜７に示されたペプチド、保護ペプチド断片および有機小分子の合成に使用すること
を含んでなる。
【００２１】
本発明のさらなる特徴によれば、リンカーに基づく固相支持体の合成は、容易に入手できる市販の安価な原料を用いて行われた。
【００２２】
本発明のさらなる具体例は、このようにして得られたオルトゴナル適合性の固相支持体は最適の官能性（０．３〜０．５ｍｅｑ／ｇ）を有していることが分かり、新規な樹脂１は数ヶ月周囲温度で安定であることが分かり、一度製造すれば特別な貯蔵条件を何ら設けることなく長期間、後の合成の適用に用いることができることを記載するものである。
【００２３】
本発明のも１つの具体例は、アミノ酸を担持する樹脂について、ＢｏｃおよびＦｍｏｃ化学プロトコールによるペプチド合成に通常用いられる試薬および実験条件に対する安定性が試験され、固相ペプチド合成に過剰に用いられる５０％ＴＦＡ：ＤＣＭならびにＤＭＦ中２０％ピペリジン下で安定であることが分かったことが含まれる。
【００２４】
さらにもう１つの具体例では、固相支持体をペプチド、保護されたペプチド断片および有機小分子の固相合成に使用する。
【００２５】
さらにもう１つの具体例では、オルトゴナル適合性のヒドロキシエチル−スルフェニル−アセトアミド（ＨＥＳＡ）樹脂をＢｏｃ化学プロトコールによるペプチドの固相合成に使用する。
【００２６】
さらにもう１つの具体例では、オルトゴナル適合性のヒドロキシエチル−スルフェニル−アセトアミド（ＨＥＳＡ）樹脂をＦｍｏｃ化学プロトコールによるペプチドの固相合成に使用する。
【００２７】
さらにもう１つの具体例では、オルトゴナル適性のヒドロキシエチル−スルフェニル−アセトアミド（ＨＥＳＡ）樹脂をＢｏｃおよびＦｍｏｃ双方の化学プロトコール単独または組み合わせることによるペプチドの固相合成に使用する。
【００２８】
さらにもう１つの具体例では、ヒドロキシエチル−スルフェニル−アセトアミド樹脂をチアゾリジン誘導体のような複素環式有機小分子の固相合成に使用する。
【００２９】
さらにもう１つの具体例では、ヒドロキシエチル−スルフェニル−アセトアミド樹脂を有機小分子の組合せライブラリーの固相合成に使用する。
【００３０】
さらにもう１つの具体例では、最終生成物は弱アルカリ条件下で開裂可能である。
【００３１】
さらにもう１つの具体例では、０．１〜０．５Ｎアルカリ水溶液とジオキサン、テトラヒドロフラン、メタノール、エタノールおよびジメチルホルムアミドからなる群から選択される有機溶媒との混合物を用いて固相支持体から最終生成物を開裂させる。
【００３２】
さらにもう１つの具体例では、固相支持体をまた、適宜変性させた後にスカベンジャー樹脂および固定化剤として使用し、ここで官能基はアルデヒド、カルボキシル、チオール、アミノおよびポリアミノ基からなる群から選択される。
【００３３】
さらにもう１つの具体例では、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドなどの存在下、１５℃〜８５℃の範囲の温度で、塩化メチレン、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、エーテル、石油エーテル、酢酸、メタノールなどからなる群から選択される有機溶媒の存在下で反応を行う。
【００３４】
さらにもう１つの具体例では、ジシクロヘキシルカルボジイミド、混合無水物、活性エステル、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、ベンゾトリアゾール−１−イル テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）または７−アザベンゾトリアゾール−１−イル テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート酸（ＨＡＴＵ）からなる群から選択されるカップリング試薬を用いて反応を行う。
【００３５】
さらにもう１つの具体例では、保護基の酸分解開裂に使用される酸がＨＢｒ：ＡｃＯＨ、ＨＣｌ：ジオキサン、ギ酸およびトリフルオロ酢酸からなる群から選択される。
【００３６】
さらにもう１つの具体例では、本発明の特徴は、ラセミ化のない生成物が得られるという点にある。さらに、本発明はまた、ＢｏｃおよびＦｍｏｃ双方の化学プロトコールを単独でまたは組み合わせて用いるペプチドの合成法、ならびにチアゾリジン誘導体のような有機小分子の固相合成法を提供する［添付図面に示された図４〜７］。固相合成後の最終生成物は極めて温和な条件下で固相支持体から開裂させることができる。本発明はまた、新規な固相支持体を用いて高収率かつ高純度でコンビナトリアル・ライブラリーを生成するペプチドおよび小分子の合成を記載する。
【００３７】
以下、本発明を詳細な実施例によりさらに説明する。これらの実施例は種々の具体的かつ例示的な具体例をさらに例示するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【００３８】
一般法
本研究で用いた総てのアミノ酸は特に断りのない限り、Ｌ−配置であった。用いた支持体は置換０．５〜０．９ミリ当量／ｇの２％架橋型アミノメチル化スチレン／ジビニルベンゼン共重合体であった。カップリング反応は総て無水反応物および乾燥溶媒を用いて行った。総ての中間体および最終化合物の均質性は次の溶媒系を用いたシリカゲルプレートでのＴＬＣにより確認した。（ａ） ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ−ＡｃＯＨ （４９：１：１）， （ｂ） ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ （１９：１）， （ｃ） ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ−ＡｃＯＨ （４８：１：１）， （ｄ） ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ−ＡｃＯＨ （１８：１：１）， （ｅ） ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ−ＡｃＯＨ （１７：２：１）， （ｆ） ｎ−ＢｕＯＨ−ＡｃＯＨ−Ｈ２Ｏ （４：１：５， 上層）。また最終化合物の純度はμ−Ｂｏｎｄａｐａｋ Ｃ１８カラムおよび４０分の直線的グラジェント０〜４０％Ｂ（Ａ＝０．１％ＴＦＡ水溶液、Ｂ＝アセトニトリル）を用いたＲＰ−ＨＰＬＣにより調べ、２２５ｎｍ（ＵＶ）でモニタリングした。旋光性はＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ２４１偏光計で記録した。ＮＭＲスペクトルはＢｒｕｋｅｒ ＤＲＸ ３００ＭＨｚ分光光度計で記録した。ＩＲスペクトルはＳｈｉｍａｄｚｕ ８２０１ＰＣ ＦＴＩＲで記録した。
【００３９】
実施例１
ヒドロキシエチル−スルフェニル−アセトアミド樹脂（化合物１）の合成
市販のアミノメチルポリスチレン樹脂２．０ｇ（０．９ミリ当量／ｇ）を固相反応器に入れ、これに乾燥ジクロロメタン（ＤＣＭ）を加えた。この懸濁液を窒素下で攪拌しながら３０分間膨潤させた。これをＤＣＭで３回、ＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）混合物で１回洗浄した。それをＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）中、触媒量のジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）の存在下、クロロ酢酸（０．４５ｇ、５ｍｍｏｌ）およびＤＩＣ（０．８ｍｌ、５ｍｍｏｌ）で処理した。反応混合物を窒素下で８時間またはカイザーテストで陰性になるまで攪拌した。この樹脂を濾過してＤＭＦ、ＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）、ＤＭＦ、ＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）、最後にＤＣＭ各２５ｍｌで順次洗浄した。クロロアセチル手を有する樹脂を、触媒として第三級アミンおよびヨウ化ナトリウムの存在下、窒素下で攪拌しながら、ＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）２０ｍｌ中のメルカプトエタノール（０．４ｍｌ、５ｍｍｏｌ）の溶液と６〜８時間反応させた。樹脂を濾過し、ＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）で３回、最後にＤＣＭで洗浄し、乾燥させて所望の樹脂１（２．１ｇ）を得た。
【００４０】
固相支持体の特性決定
新規なリンカーに基づく固相支持体１を、新たに導入されたアセトアミド部分のカルボニルに相当する１６６６ｃｍ−１の強いピークおよび第一級ヒドロキシ基に相当する３２１９ｃｍ−１のピークに基づいて決定した。
【００４１】
置換度の決定
ヒドロキシ官能基の定量は、文献に報告された、標準的なプロトコールを使用する適当なＢｏｃおよびＦｍｏｃで保護したアミノ酸の添加による標準法により行った。Ｂｏｃ化学の場合には、ピクリン酸法を用いて定量を行った［方法Ａ］。一方、Ｆｍｏｃ化学の場合には、Ｆｍｏｃ基をピペリジン処理により除去し、次ぎに３０１ｎｍにおける吸光度を測定することにより、９−フルオレニルメチルピペリジンを定量した［方法Ｂ］。新規なリンカーの置換度は０．３５〜０．４５ｍミリ当量／ｇの間であった。詳細を以下に示す。
【００４２】
方法Ａ：（Ｂｏｃ化学）
ヒドロキシエチル−スルフェニル−アセトアミド樹脂（１）（０．５ｇ）を反応器に入れ、窒素下で攪拌しながらジクロロメタン（ＤＣＭ）中で膨潤させた。３０分後、樹脂を濾過してＤＣＭで洗浄した。この樹脂にＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）２０ｍｌ中のＢｏｃ−Ｌｅｕ（０．４２ｇ、２．４ｍｍｏｌ）、ＤＩＣ（０．２ｍｌ、２．５ｍｍｏｌ）およびジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）またはＮ−メチルイミダゾール（ＮＭＩ）（０．４ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。この混合物を８〜１０時間攪拌した。樹脂をＤＣＭで３回洗浄して乾燥させた。乾燥樹脂のアリコート（〜３０．０ｍｇ）を３０分間酸分解（５Ｎ ＨＣｌ／ジオキサン、５ｍｌ）してＢｏｃ基を除去した。この後、樹脂をＤＣＭおよびＤＭＦで洗浄した。ＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）（４０ｍｌ）中のＤＩＥＡ（２ｍｌ）を加えて振盪し、得られた塩酸塩を中和した。次いでこの樹脂をＤＭＦおよびＤＣＭで順次洗浄した。その後上記生成物をピクリン酸法により定量して固相支持体上にあるアミノ基量を導き出した。樹脂のアリコット（２．５ｍｇ）を取り、ＤＣＭ（２ｍｌ）およびエタノール（８ｍｌ）中のピクリン酸（５０ｍｇ）を加えて攪拌した。樹脂を十分洗浄した後、それをＤＩＥＡ（１ｍｌ）を加えて攪拌すると、樹脂と結合したピクリン酸はそのＤＩＥＡ塩として溶液中に解離した。この溶液を５０ｍｌとし、ＵＶ分光光度計を用いて３５０ｎｍにおける吸光度を記録した。
【００４３】
下式：
【数１】
【００４４】
方法Ｂ：（Ｆｍｏｃ化学）
ヒドロキシエチル−スルフェニル−アセトアミド樹脂（１）（０．５ｇ）を反応器に入れ、窒素下で攪拌しながらジクロロメタン（ＤＣＭ）中で膨潤させた。３０分後、樹脂を濾過してＤＣＭで洗浄した。この樹脂にＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）２０ｍｌ中のＦｍｏｃ−Ｌｅｕ（０．８２ｇ、２．４ｍｍｏｌ）、ＤＩＣ（０．２ｍｌ、２．５ｍｍｏｌ）およびジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）またはＮ−メチルイミダゾール（ＮＭＩ）（０．４ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。この混合物を８〜１０時間攪拌した。樹脂をＤＣＭで３回洗浄して乾燥させた。この乾燥Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ樹脂のアリコート（２．５ｍｇ）を試験管に取り、ＤＭＦ中の２０％ピペリジン０．５ｍｌで時折攪拌しながら１５〜２０分間処理した。対照として別の試験管にＤＭＦ中の２０％ピペリジン０．５ｍｌを取った。２０分後、両方の試験管にＤＭＦを加え、容量を５０ｍｌとした。ＵＶ−ＶＩＳ分光光度計により３０１ｎｍにおいて両方の溶液の吸光度を記録した。置換度（ｍＭｏｌ／ｇ）を下式：
【数２】
【００４５】
安定性の検討：
試薬への長期暴露下におけるＢｏｃおよび／またはＦｍｏｃ保護基の脱ブロックの際のリンカーの安定性を実証するために、以下の試験を行った。固相支持体と結合した小アリコートのＦｍｏｃ保護アミノ酸（０．４１ミリ当量／ｇ、１００ｍｇ）をＤＣＭ中の５０％ＴＦＡおよび５Ｎ ＨＣｌ／ジオキサン各１ｍｌで攪拌しながら８時間個々に処理し、次いで樹脂を濾過し、洗浄して乾燥させた。個々のフラスコにおいて固相支持体と結合した Ｂｏｃ保護アミノ酸（０．３８ミリ当量／ｇ、１２０ｍｇ）を２０％ピペリジン／ＤＭＦ１．２ｍｌで攪拌しながら１０時間処理し、次いで樹脂を濾過し、洗浄して乾燥させた。乾燥した樹脂を方法ＡおよびＢを用いて定量した結果、未処理の樹脂とほぼ同じであった。このことからリンカーがＦｍｏｃおよびＢｏｃ基の脱保護に使用する条件に対して安定であることが示唆される。
【００４６】
ラセミ化の検討：
実施例６および７に記載の新規な塩基に不安定な固相支持体上で合成したジペプチドを基質として用い、合成および固相支持体からの生成物の開裂の際に起こるラセミ化を検出した。
Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨ（６）およびＢｏｃ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＯＨ（７）各０．００６４ｇ（２０μＭ）を個々の反応バイアルに入った１Ｍ ＮａＣｌ（５０μｌ）に溶解し、それに１Ｍ ｔｒｉｓ ＨＣｌ（５０μｌ）を加えてｐＨ７．５に維持した。異なるセットの試験の各バイアルにカルボキシペプチダーゼ−Ａ １５〜５０μｌを加え、２５℃で５分間振盪した。次いで酵素添加前後５分の反応混合物のアリコートを０．１％ＴＦＡを含有する水に０〜９０％アセトニトリルの直線的グラジェントを用いた４０分間にわたるＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した。Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨならびにＢｏｃ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＯＨは各々１２．５および１３分の保持時間を示した。一方、酵素加水分解後のＢｏｃ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨにはジペプチドの保持時間においてピークは得られなかったが、その代わりに８分の保持時間においてＢｏｃ−Ｇｌｙに相当する別のピークが得られた。しかしながら、酵素処理後のＢｏｃ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＯＨのＨＰＬＣプロフィールには加水分解前のジペプチド、すなわち１３分のものとの保持時間における差はなかった。
【００４７】
実施例２
Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯＨ（化合物２）の合成
固相支持体、置換０．４ミリ当量／ｇのヒドロキシエチル−スルフェニル−アセトアミド樹脂（１）（１．２５ｇ、０．５ｍｍｏｌ）を反応器に入れ、窒素下で攪拌しながらジクロロメタン（ＤＣＭ）中で膨潤させた。３０分後、樹脂を濾過してＤＣＭで洗浄した。この樹脂にＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）２０ｍｌ中のＢｏｃ−Ｌｅｕ（０．２５ｇ、１．２ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）またはＮ−メチルイミダゾール（ＮＭＩ）（０．２ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。この混合物を８〜１０時間攪拌した。樹脂をＤＣＭで３回洗浄して乾燥させた。この乾燥樹脂のアリコート（２．５ｍｇ）への付加率について試験したところ、付加率は７８％であることが分かった［方法Ｂ］。樹脂をＤＣＭ中５０％ＴＦＡで３０分間処理してＢｏｃ基を除去した。３０分後、樹脂を濾過してＤＣＭ２０ｍｌ×３、ＤＣＭ中２０％ＤＩＥＡ２０ｍｌ×３、ＤＣＭ２０ｍｌ×３で洗浄した。ＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）２０ｍｌ中のＢｏｃ−Ｐｈｅ（０．２６ｇ、１ｍｍｏｌ）およびＨＯＢｔ（０．１５３ｇ、１ｍｍｏｌ）の溶液を窒素下で攪拌しながら上記樹脂に加えた。この懸濁液にＤＩＣ（０．１８ｍｌ、１．２ｍｍｏｌ）を加え、混合物を３時間またはカイザーテストで陰性になるまで攪拌した。
【００４８】
この樹脂をＤＣＭ中５０％ＴＦＡで３０分間処理してＢｏｃ基を除去した。樹脂を濾過してＤＣＭ２０ｍｌ×３、ＤＣＭ中２０％ＤＩＥＡ２０ｍｌ×３、ＤＣＭ２０ｍｌ×３で洗浄し、遊離アミノ基を有する樹脂とＢｏｃ−ＧｌｙとをＤＩＣ／ＨＯＢｔ法により結合した。完全なカップリング反応後、樹脂を濾過し、常法においてＤＣＭ中５０％ＴＦＡで処理してＢｏｃ基を除去し、Ｂｏｃ−Ｇｌｙを結合した。カイザーテストによってモニタリングして完全なカップリング反応後に常法においてＢｏｃ基を除去し、次いでＤＩＣ／ＨＯＢｔ法を用いてＢｏｃ−Ｔｙｒを結合した。ペンタペプチドを有する樹脂を窒素下で攪拌しながらジオキサン−ＭｅＯＨ−４Ｎ ＮａＯＨの混合物（３０：９：１、２０ｍｌ）で３０分間処理し、樹脂を濾過して水２ｍｌで洗浄した。合した濾液を真空蒸発させた。残渣を水に取り、エーテルで抽出した。水相を１Ｎ塩酸で酸性化してＥｔＯＡｃ（３×７５ｍｌ）で抽出した。合したＥｔＯＡｃ相を水およびブラインで洗浄し、次いでＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空蒸発させて非晶質固体を得た。このようにして得られた粗ペンタペプチド酸をＭｅＯＨ−エーテルから再結晶化させて標題の化合物０．２１ｇを得た。収率８３％、Ｒｆ：０．８（ｄ）；融点１３４−１３６℃； ［α］Ｄ２５＝ −９．８° （ｃ＝４．１， ＭｅＯＨ）； １Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６） δ： ０．９７ （ｄ， ６Ｈ）， １．１６ （ｓ， ９Ｈ）， ３．６−３．８（ｍ， ４Ｈ）， ４．１０， ４．２４および４．５８ （Ｃα プロトン）， ６．６３−７．００ （ＡＢｑ， ４Ｈ）， ７．４０（ｍ， ５Ｈ）， ７．８−８．１ （ＮＨｓ）。上記のようにして得たペプチド酸（０．２１ｇ、０．３ｍｍｏｌ）をチオアニソール（０．２ｍｌ）の存在下、５Ｎ ＨＣｌ／ジオキサン（２ｍｌ）中で１時間撹拌した。ＴＬＣにより反応をモニタリングした後、溶媒を真空蒸発させた。乾燥エーテルを加え、粉砕して白色の吸湿性固体としてペンタペプチド塩酸塩ＨＣｌ・Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯＨ（２）を得た。これを濾過して真空デシケーターで乾燥させた。収率：０．１５ ｇ （８５％）； Ｒｆ：０．６７（Ｆ）； 融点１４１○Ｃ （ｄｅｃ）； ［α］Ｄ２５＝−５．６° （ｃ＝０．５４， ＭｅＯＨ）；ＦＡＢ−ＭＳ ［Ｍ＋Ｈ］＋ ５５６； １Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６） δ： ０．９（ｄ， ６Ｈ）． ３．８−３．９（ｍ， ４Ｈ）， ４．２， ４．３および４．６８（Ｃα プロトン）， ６．８−７．１（ＡＢｑ， ４Ｈ）， ７．３（ｍ， ５Ｈ）， ７．５−８．５（ＮＨｓ）， ９．０ （ｓ， １Ｈ， フェノール性ＯＨ）。
【００４９】
実施例３
Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯＨ（化合物３）の合成
固相支持体、置換０．４ミリ当量／ｇのヒドロキシエチル−スルフェニル−アセトアミド樹脂（１）（０．７５ｇ、０．３ｍｍｏｌ）を反応器に入れ、窒素下で攪拌しながらジクロロメタン（ＤＣＭ）中で膨潤させた。３０分後、樹脂を濾過してＤＣＭで洗浄した。この樹脂にＢｏｃ−Ｌｅｕの溶液を３モル過剰にすることで常法において結合させた。この樹脂のアリコート（３．４ｍｇ）への付加率について試験したところ、付加率は８１％であることが分かった［方法Ｂ］。次ぎにＢｏｃ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯＨの合成を、２位のＢｏｃ−ＧｌｙをＢｏｃ−Ｄ−Ａｌａに置換し、Ｂｏｃ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯＨを得るために使用した方法と同様にして行った。固相支持体から開裂した後、白色の粉末としてＢｏｃ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯＨ（０．１３ｇ、７９％）を単離した。次いでこれをチオアニソール（０．１ｍｌ）の存在下、５Ｎ ＨＣｌ−ジオキサン（２ｍｌ）で１時間処理した。ＴＬＣにより反応をモニタリングした後、溶媒を蒸発させ、残渣を乾燥エーテルでトリチュレートした。次いでこれを濾過し、真空デシケーターで乾燥させて白色の固体として最終ペプチドＨＣｌ・Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯＨの０．１６ｇ（８２．８％）を得た。Ｒｆ：０．４８ （Ｆ）； 融点１８３℃ （ｄｅｃ）； ［α］Ｄ２５＝＋１４．３° （ｃ＝０．５６， ＭｅＯＨ）； 収率０．１５ｇ （８５％）； Ｒｆ：０．６７（Ｆ）； 融点１４１℃ （ｄｅｃ）； ［α］Ｄ２５＝−５．６° （ｃ＝０．５４）． １Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６） δ： ０．８５（ｄ， ６Ｈ）， １．０２（ｄ， ３Ｈ）， ３．６（ｄ， ２Ｈ）， ４．２６， ４．３８， ４．４４および４．６８（Ｃα プロトン）， ６．８−７．０（ＡＢｑ， ４Ｈ）， ７．２４（ｍ， ５Ｈ）， ７．５−８．５（ＮＨｓ）， ９．０５（ｓ， １Ｈ， フェノールＯＨ）。
【００５０】
実施例４
Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯＨ（Ｆｍｏｃ化学による化合物２）の合成
置換０．４ミリ当量／ｇのヒドロキシエチル−スルフェニル−アセトアミド樹脂（１）（０．１ｇ、０．４ｍｍｏｌ）を反応器に入れ、窒素下で攪拌しながらジクロロメタン（ＤＣＭ）中で膨潤させた。３０分後、樹脂を濾過してＤＣＭで洗浄した。この樹脂にＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）２０ｍｌ中のＦｍｏｃ−Ｌｅｕ（０．４１ｇ、１．２ｍｍｏｌ）、ＤＩＣ（０．２ｍｌ、１．５ｍｍｏｌ）およびジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）またはＮ−メチルイミダゾール（ＮＭＩ）（０．２ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。この混合物を８〜１０時間攪拌した。樹脂をＤＣＭで３回洗浄して乾燥させた。この乾燥樹脂のアリコート（２．５ｍｇ）への付加率について試験したところ、付加率は７８％であることが分かった［方法Ａ］。樹脂をＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）１２ｍｌ中の２０％ピペリジンで２０分間処理してＦｍｏｃ基を除去した。樹脂をＤＣＭで３回洗浄した。樹脂をＤＣＭで３回洗浄した後、ＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）１０ｍｌ中のＦｍｏｃ−Ｐｈｅ（０．３８ｇ、１．０ｍｍｏｌ）およびＨＯＢｔ（０．１５ｇ、１．０ｍｍｏｌ）の溶液を攪拌しながら加えた。この混合物にＤＩＣ（０．１８ｍｌ、１．２ｍｍｏｌ）を加え、３時間またはこれがカイザーテストで陰性になるまで攪拌を続けた。樹脂を濾過し、ＤＣＭ２０ｍｌで３回洗浄した。常法においてＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）１２ｍｌ中の２０％ピペリジンで２０分間処理してＦｍｏｃ基を脱ブロックした。次ぎに、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（図５の工程３）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（図５の工程４）を上記のＤＩＣ／ＨＯＢｔ法により結合した。最後のカップリングにはＦｍｏｃ−Ｔｙｒの代わりにＢｏｃ−Ｔｙｒを使用した。ペンタペプチドを有する樹脂を窒素下で攪拌しながらジオキサン−ＭｅＯＨ−４Ｎ ＮａＯＨの混合物（３０：９：１、２０ｍｌ）で３０分間処理し、樹脂を濾過して水２ｍｌで洗浄した。合した濾液を真空蒸発させた。残渣を水に取り、エーテルで抽出した。水性相を１Ｎ塩酸で酸性化してＥｔＯＡｃ（３×７５ｍｌ）で抽出した。合したＥｔＯＡｃ相を水およびブラインで洗浄し、次いでＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空蒸発させて非晶質固体を得た。このようにして得られた粗ペンタペプチド酸をＭｅＯＨ−エーテルから再結晶化させて標題の化合物を得た。収率：０．１６ｇ， （７７％） Ｒｆ：０．８（ｄ）； 融点１４０−１４１℃ （ｄｅｃ）； ［α］Ｄ２５＝−５．６° （ｃ＝０．５４， ＭｅＯＨ）； ＦＡＢ−ＭＳ ［Ｍ＋Ｈ］＋ ５７０； １Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６） δ： ０．９１（ｄ， ６Ｈ）． ３．８−３．９（ｍ， ４Ｈ）， ４．２６， ４．３７および４．６０（Ｃα プロトン）， ６．８−７．１（ＡＢｑ， ４Ｈ）， ７．３０（ｍ， ５Ｈ）， ７．５−８．５（ＮＨｓ）， ９．０５（ｓ， １Ｈ， フェノールＯＨ）。
【００５１】
実施例５
Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−ＯＨ（化合物５）の合成
標準的な方法に従い、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）とヒドロキシエチル−スルフェニル−アセトアミド樹脂とを結合した。置換０．３４ミリ当量／ｇの固相支持体（０．７３ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を反応器に入れ、窒素下で攪拌しながらジクロロメタン（ＤＣＭ）中で膨潤させた。３０分後、樹脂を濾過してＤＣＭで洗浄した。この樹脂にＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）１５ｍｌ中のＢｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）（０．３０ｇ、１．０ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）またはＮ−メチルイミダゾール（ＮＭＩ）（０．２ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。次ぎにＤＩＣ（０．１６ｍｌ、１ｍｍｏｌ）を反応混合物に加えた。この混合物を８〜１０時間攪拌した。樹脂をＤＣＭで３回洗浄して乾燥させた。この乾燥樹脂のアリコート（２．０ｍｇ）への付加率について試験したところ、付加率は８１％であることが分かった［方法Ｂ］。樹脂をＤＣＭ中５０％ＴＦＡで３０分間処理してＢｏｃ基を除去した。３０分後、樹脂を濾過してＤＣＭ２０ｍｌ×３、ＤＣＭ中２０％ＤＩＥＡ２０ｍｌ×３、ＤＣＭ２０ｍｌ×３で洗浄した。Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）の遊離アミノ基を有する樹脂と次のアミノ酸にある相手、すなわちＢｏｃ−Ｌｙｓ（２−Ｃｌ−Ｚ）とを結合した。次いでＢｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｂｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、最後にＢｏｃ−Ｌｙｓ（２−Ｃｌ−Ｚ）を成長しているペプチド鎖に順次結合した。各工程におけるＢｏｃ基の脱ブロックはＣＨ２Ｃｌ２中５０％ＴＦＡを用いて行った。次いで樹脂を０．１Ｎ ＮａＯＨで処理して最終保護ペプチドＢｏｃ−Ｌｙｓ（２−Ｃｌ−Ｚ）−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）−Ｌｙｓ（２−Ｃｌ−Ｚ）−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−ＯＨを得た。次いで保護ペプチドにＰｄ／Ｃを用いる触媒的還元を施して、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−ＯＨを得た。最終工程のＢｏｃ基をジオキサン中５Ｎ ＨＣｌを用いて除去して最終ペプチドＬｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−ＯＨを得た。収率：０．０９ｇ， （７８．５％）， Ｒｆ：０．３３ （Ｆ）； 融点１５８℃， ＦＡＢ−ＭＳ ［Ｍ＋Ｈ］＋５６４； ［α］Ｄ２５＝−２０° （ｃ＝０．１， ＤＭＦ）， １Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６） δ： １．０６（ｄ， ３Ｈ）， １．１０（ｄ， ３Ｈ）， １．３６（ｍ， ２Ｈ）， １．５３（ｍ， ２Ｈ）， ２．７３（ｔ， ４Ｈ）， ４．１５（ｍ， ２Ｈ）， ４．１６−４．４（Ｃα Ｈｓ）， ７．４９（ｔ， ３Ｈ）， ７．５９（ｔ， ３Ｈ）， ７．８−８．７０（ＮＨｓ）。
【００５２】
実施例６
Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨ（化合物６）の合成
標題化合物を、２を得るために使用した方法と同様に固相支持体と結合した上記塩基不安定性リンカー上で合成した（０．５ｍｍｏｌ規模）。収率０．１０ｇ， （７６％）， Ｒｆ ０．３４ （ａ）； 融点１１８℃： ［α］Ｄ２５＝＋４０° （ｃ＝０．１１， ＤＭＦ）； ＦＡＢ−ＭＳ ［Ｍ＋Ｈ］＋ ３２３； １Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６） δ： １．１６（ｓ， ９Ｈ）， ２．３（ｍ， ２Ｈ）， ３．６（ｍ， ２Ｈ）， ４．５８（ｂｓ， １Ｈ）， ７．４（ｍ， ５Ｈ）， ７．９−８．２（ＮＨｓ）。
【００５３】
実施例７
Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＯＨ（化合物７）
同様に、化合物７もまた０．５ｍｍｏｌ規模で合成した。収率：０．１２ｇ（８０％）；Ｒｆ ０．３４ （ａ）； 融点１０９℃； ［α］Ｄ２５＝＋５０°（ｃ＝０．１１）． ＦＡＢ−ＭＳ ［Ｍ＋Ｈ］＋ ３２３；． １Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６） δ： １．１６（ｓ， ９Ｈ）， ２．３（ｍ， ２Ｈ）， ３．６（ｍ， ２Ｈ）， ４．５８（ｂｓ， １Ｈ）， ７．４（ｍ， ５Ｈ）， ７．９−８．２（ＮＨｓ）。
【００５４】
実施例８
２−（４−メトキシフェニル）チアゾリジン−４−カルボン酸（化合物８）の合成
市販のＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）とリンカーに基づく固相支持体１とをＤＩＣ／ＤＭＡＰ法により結合した。置換０．４ミリ当量／ｇの固相支持体（１．０ｇ）を反応器に入れ、窒素下で攪拌しながらジクロロメタン（ＤＣＭ）中で膨潤させた。３０分後、樹脂を濾過してＤＣＭで洗浄した。この樹脂にＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）２０ｍｌ中のＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）（０．７０ｇ、１．２ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）またはＮ−メチルイミダゾール（ＮＭＩ）（０．４ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。この混合物を８〜１０時間攪拌した。樹脂をＤＣＭで３回洗浄して乾燥させた。この樹脂のアリコートを試験し、２０％ピペリジン処理により付加率を調べ、次ぎにＵＶ吸光度を記録した［方法Ａ］。これは付加率９０％であることが分かった。Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）を有する樹脂をＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）２０ｍｌ中２０％ピペリジンで２０分間処理してＦｍｏｃ基を除去した。樹脂をＤＣＭで３回洗浄し、次いでＤＣＭ中１０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／Ｂｕ３ＳｉＨで３０分間（３回）処理してＣｙｓのトリチル基を除去した。樹脂をＤＣＭで３回洗浄した後、ＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）１５ｍｌ中のｐ−アニスアルデヒド（０．５ｍｌ）の溶液を攪拌しながら加え、攪拌を８〜１０時間続けた。樹脂をＤＣＭで３回洗浄して乾燥させた。これをジオキサン−ＭｅＯＨ−４Ｎ ＮａＯＨの混合物（３０：９：１、２０ｍｌ）で攪拌しながら３０分間処理し、樹脂を濾過して水２ｍｌで洗浄した。合した濾液を真空蒸発させた。残渣を水に取り、エーテルで抽出した。水性相を１Ｎ塩酸で酸性化してＥｔＯＡｃ（３×７０ｍｌ）で抽出した。合したＥｔＯＡｃ相を水およびブラインで洗浄し、次いでＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空蒸発させて白色の結晶質として２−（４−メトキシフェニル）チアゾリジン−４−カルボン酸を得た。収率：０．０６１ｇ， ７２％； 融点１５０−５１℃； ＦＡＢ−ＭＳ ［Ｍ＋Ｈ］＋２３９； １Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６） δ：３．５（ｍ， ２Ｈ）， ３．７（ｓ， ３Ｈ）， ４．８（ｂｓ， １Ｈ）， ５．９（ｂｓ， １Ｈ）， ６．８−７．１（Ａｂｑ， ４Ｈ）。
【００５５】
実施例９
Ｎ−Ｂｏｃ−２−（４−メトキシフェニル）チアゾリジン−４−カルボン酸（化合物９）の合成
市販のＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）とリンカーに基づく固相支持体＃とをＤＩＣ／ＤＭＡＰ法により結合した。置換０．３４ミリ当量／ｇの固相支持体（０．５０ｇ）を反応器に入れ、窒素下で攪拌しながらジクロロメタン（ＤＣＭ）中で膨潤させた。３０分後、樹脂を濾過してＤＣＭで洗浄した。この樹脂にＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）２０ｍｌ中のＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）（０．５６ｇ、１．０ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）またはＮ−メチルイミダゾール（ＮＭＩ）（０．２５ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。この混合物を８〜１０時間攪拌した。樹脂をＤＣＭで３回洗浄して乾燥させた。この樹脂のアリコートを試験し、２０％ピペリジン処理により付加率を調べ、次ぎに吸光度を記録したところ、付加率約８８％であることが分かった［方法Ａ］。Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）を有する樹脂をＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）１２ｍｌ中２０％ピペリジンで２０分間処理してＦｍｏｃ基を除去した。樹脂をＤＣＭで３回洗浄し、次いでＤＣＭ中１０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／Ｂｕ３ＳｉＨで３０分間（３回）処理してＣｙｓのトリチル基を除去した。樹脂をＤＣＭで３回洗浄した後、ＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）１０ｍｌ中のｐ−アニスアルデヒド（０．５ｍｌ）の溶液を攪拌しながら加えた。攪拌を８〜１０時間続けた。樹脂をＤＣＭで３回洗浄した。この樹脂にＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）１０ｍｌ中のジ−ｔ−ブチルジカルボネート（０．２２ｇ、１ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（０．２ｍｌ、１．０ｍｍｏｌ）の溶液を加え、攪拌を３時間続けた。３時間後、樹脂はカイザーテストで陰性であった。樹脂をＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）１０ｍｌ×３、ＤＭＦ１０ｍｌ×３、ＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）１０ｍｌ×２、最後にＤＣＭで３回洗浄して乾燥させた。これをジオキサン−ＭｅＯＨ−４Ｎ ＮａＯＨの混合物（３０：９：１、２０ｍｌ）で攪拌しながら３０分間処理し、樹脂を濾過して水２ｍｌで洗浄した。合した濾液を真空蒸発させた。残渣を水に取り、エーテルで抽出した。水性相を１Ｎ塩酸で酸性化してＥｔＯＡｃ（３×７０ｍｌ）で抽出した。合したＥｔＯＡｃ相を水およびブラインで洗浄し、次いでＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空蒸発させて白色の結晶質としてＮ−Ｂｏｃ−２−（４−メトキシフェニル）チアゾリジン−４−カルボン酸を得た。収率：０．０４８ ｇ， ８２％； 融点１６０−１６２℃； ＦＡＢ−ＭＳ ［Ｍ＋Ｈ］＋ ３４０． １Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６） δ：１．２（ｓ， ９Ｈ）， ３．４（ｍ， ２Ｈ）， ３．９（ｓ， ３Ｈ）， ４．７（ｂｓ， １Ｈ）， ５．９（ｂｓ， １Ｈ）， ６．８−７．１（Ａｂｑ， ４Ｈ）。
【００５６】
実施例１０
Ｎ−ベンゾイル−２−（４−メトキシフェニル）チアゾリジン−４−カルボン酸（化合物１０）の合成
市販のＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）とリンカーに基づく固相支持体＃とをＤＩＣ／ＤＭＡＰ法により結合した。置換０．３４ミリ当量／ｇの固相支持体（０．５０ｇ）を反応器に入れ、窒素下で攪拌しながらジクロロメタン（ＤＣＭ）中で膨潤させた。３０分後、樹脂を濾過してＤＣＭで洗浄した。この樹脂にＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）２０ｍｌ中のＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）（０．５６ｇ、１．０ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）またはＮ−メチルイミダゾール（ＮＭＩ）（０．２５ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。この混合物を８〜１０時間攪拌した。樹脂のアリコートをＤＣＭで３回洗浄して乾燥させた。この樹脂のアリコートを試験し、２０％ピペリジン処理により付加率を調べ、次ぎに吸光度を記録したところ、付加率約８８％であることが分かった［方法Ａ］。Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）を有する樹脂をＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）１２ｍｌ中２０％ピペリジンで２０分間処理してＦｍｏｃ基を除去した。樹脂をＤＣＭで３回洗浄し、次いでＤＣＭ中１０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／Ｂｕ３ＳｉＨで３０分間（３回）処理してＣｙｓのトリチル基を除去した。樹脂をＤＣＭで３回洗浄した後、ＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）１０ｍｌ中のｐ−アニスアルデヒド（０．５ｍｌ）の溶液を攪拌しながら加えた。攪拌を８〜１０時間続けた。樹脂をＤＣＭで３回洗浄した。この樹脂にＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）１０ｍｌ中の塩化ベンゾイル（０．２ｍｌ、２ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（０．４ｍｌ、２．０ｍｍｏｌ）の溶液を加え、樹脂がカイザーテストで陰性になるまで３時間攪拌した。樹脂をＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）１０ｍｌ×３、ＤＭＦ１０ｍｌ×３、ＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）１０ｍｌ×２、最後にＤＣＭで３回洗浄して乾燥させた。これをジオキサン−ＭｅＯＨ−４Ｎ ＮａＯＨの混合物（３０：９：１、２０ｍｌ）で攪拌しながら３０分間処理し、樹脂を濾過して水２ｍｌで洗浄した。合した濾液を真空蒸発させた。残渣を水に取り、エーテルで抽出した。水性相を１Ｎ塩酸で酸性化してＥｔＯＡｃ（３×７０ｍｌ）で抽出した。合したＥｔＯＡｃ相を水およびブラインで洗浄し、次いでＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空蒸発させて白色の結晶質としてＮ−ベンゾイル−２−（４−メトキシフェニル）チアゾリジン−４−カルボン酸を得た。収率：０．０４３ ｇ， ７２％； 融点１０８−１１０℃； ＦＡＢ−ＭＳ ［Ｍ＋Ｈ］＋ ３４４． １Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６） δ：３．３（ｍ， ２Ｈ）， ３．９（ｓ， ３Ｈ）， ４．７（ｂｓ， １Ｈ）， ５．７（ｂｓ， １Ｈ）， ６．６（ｍ， ５Ｈ）， ６．９−７．２（Ａｂｑ， ４Ｈ）。
【００５７】
実施例１１
Ｎ−Ｂｏｃ−２−（４−メトキシフェニル）チアゾリジニル−ロイシン（化合物１１）の合成
置換０．４ミリ当量／ｇの新規なリンカーに基づく固相支持体１（１．０ｇ）を反応器に入れ、窒素下で攪拌しながらジクロロメタン（ＤＣＭ）中で膨潤させた。３０分後、樹脂を濾過してＤＣＭで洗浄した。この樹脂にＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）２０ｍｌ中のＢｏｃ−Ｌｅｕ（０．４５ｇ、２ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）またはＮ−メチルイミダゾール（ＮＭＩ）（０．４ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。この反応混合物を８〜１０時間攪拌した。樹脂をＤＣＭで３回洗浄して乾燥させた。この乾燥樹脂のアリコート（２．５ｍｇ）への付加率について試験したことろ、付加率は８２％であることが分かった［方法Ｂ］。樹脂をＤＣＭ中５０％ＴＦＡで３０分間処理してＢｏｃ基を除去した。３０分後、樹脂を濾過してＤＣＭ２０ｍｌ×３、ＤＣＭ中２０％ＤＩＥＡ２０ｍｌ×３、ＤＣＭ２０ｍｌ×３で洗浄し、最後にＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）２０ｍｌ中の２０％ピペリジン溶液に懸濁してＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）２０ｍｌで処理した。Ｌｅｕの遊離アミノ基を有する樹脂とＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）２０ｍｌ中のＢｏｃ−Ｃｙｓ−（Ｔｒｔ）（０．５６ｇ、１ｍｍｏｌ）およびＨＯＢｔ（０．１５３ｇ、１ｍｍｏｌ）の溶液とを窒素下で攪拌しながら反応させた。この懸濁液にＤＩＣ（０．１８ｍｌ、１．２ｍｍｏｌ）を加え、樹脂がカイザーテストで陰性になるまで３時間攪拌した。これを濾過してＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）１５ｍｌ×３、最後にＤＣＭで洗浄した。樹脂をＤＣＭ中５０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／Ｂｕ３ＳｉＨで３０分間処理し、次いでＤＣＭ中１０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／Ｂｕ３ＳｉＨで１０分間（３回）洗浄してＣｙｓのＢｏｃおよびトリチル基をともに除去した。樹脂をＤＣＭで３回洗浄した後、ＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）１０ｍｌ中のｐ−アニスアルデヒド（０．５ｍｌ）の溶液を攪拌しながら加えた。攪拌を８〜１０時間続けた。樹脂をＤＣＭで３回洗浄した。この樹脂にＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）１０ｍｌ中の塩化ベンゾイル（０．２ｍｌ、２ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（０．４ｍｌ、２．０ｍｍｏｌ）の溶液を加え、攪拌を３時間続けた。３時間後、樹脂はカイザーテストで陰性であった。樹脂をＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）１０ｍｌ×３、ＤＭＦ１０ｍｌ×３、ＤＣＭ：ＤＭＦ（１：１）１０ｍｌ×２、最後にＤＣＭで３回洗浄して乾燥させた。これをジオキサン−ＭｅＯＨ−４Ｎ ＮａＯＨの混合物（３０：９：１、２０ｍｌ）で攪拌しながら３０分間処理し、樹脂を濾過して水２ｍｌで洗浄した。合した濾液を真空蒸発させた。残渣を水に取り、エーテルで抽出した。水性相を１Ｎ塩酸でｐＨ２．０まで酸性化してＥｔＯＡｃ（３×７０ｍｌ）で抽出した。合したＥｔＯＡｃ相を水およびブラインで洗浄し、次いでＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空蒸発させてガラス質としてＮ−Ｂｏｃ−２−（４−メトキシフェニル）チアゾリジニル−ロイシンを得た。収率：０．１１ｇ， ７８％； ＦＡＢ−ＭＳ ［Ｍ＋Ｈ］＋ ４５３； １Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６） δ：０．９（ｍ， ６Ｈ）， １．２（ｂｓ， ９Ｈ）， １．７（ｍ， ２Ｈ）， ４．３（ｍ， １Ｈ）， ３．５（ｍ， ２Ｈ）， ３．７（ｓ， ３Ｈ）， ４．８６（ｂｓ， １Ｈ）， ５．９（ｂｓ， １Ｈ）， ６．８−７．１（Ａｂｑ， ４Ｈ）。
【００５８】
【発明の効果】
本発明の利点
図１の式１に示した新規なリンカーに基づく固相支持体、ヒドロキシエチル−スルフェニル−アセトアミド樹脂（ＨＥＳＡ樹脂）はペプチド合成用のオルトゴナル適合性固相支持体である、すなわちこれはＢｏｃおよびＦｍｏｃ化学双方を単独または組み合わせて使用することにより生物学的に有効なペプチドの合成に用いることができる。支持体からの生成物の開裂には極めて弱い塩基条件しか必要でないため、大ペプチドの収斂合成に有用な保護されたペプチド断片の迅速な合成が行われる。合成されたペプチドは高収率かつ高純度である。さらに生成物ではラセミ化は起こらない。またこれによりＣ末端に酸化しやすいアミノ酸を有する配列が合成できる。新規なリンカーに基づく固相支持体を有機小分子の固相合成およびペプチドおよび有機小分子ならびに複素環式分子のコンビナトリアル・ライブラリーの生成に用いることができる。新規な固相支持体は実験室で極めて便宜に大量合成することができ、保存時に特別な注意を何ら払う必要はなく、後の合成用に周囲温度で何ヶ月もの間保存できる。さらに、それを合成するための新規な方法も開発した。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ヒドロキシエチル−スルフェニル−アセトアミド樹脂の構造を示す。
【図２】
従来のペプチド合成を示す。
【図３】
ヒドロキシエチル−スルフェニル−アセトアミド樹脂（ＨＥＳＡ）の合成を示す。
【図４】
Ｂｏｃ化学プロトコールによるＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯＨの合成を示す。
【図５】
Ｆｍｏｃ化学プロトコールによるＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯＨの合成を示す。
【図６】
チアゾリジン誘導体の合成を示す。
【図７】
チアゾリジン誘導体の合成を示す。
Claims (20)
- 図１に示された式（式中、Ｐはアミノメチル樹脂を表す）を有し、ペプチド合成およびコンビナトリアル・ライブラリー合成に使用される、オルトゴナル適合性のヒドロキシエチル−スルフェニル−アセトアミド（ＨＥＳＡ）樹脂。
- 樹脂がアミノ官能膜、多孔質ガラス、シリカ、ポリスチレン、ポリジメチルアクリルアミド、綿および紙からなる群から選択される固相支持体の形態である、請求項１に記載の樹脂。
- ポリスチレンがアミノポリスチレンおよびアミノメチルポリスチレンからなる群から選択される、請求項２に記載の樹脂。
- 樹脂が固相ペプチド／オリゴヌクレオチド合成に使用される、請求項１に記載の樹脂。
- 最終生成物が弱アルカリ条件下で開裂可能である、請求項１に記載の樹脂。
- 最終生成物が、０．１〜０．５Ｎアルカリ水溶液とジオキサン、テトラヒドロフラン、メタノール、エタノールおよびジメチルホルムアミドからなる群から選択される有機溶媒との混合物を用いて固相支持体から開裂される、請求項１に記載の樹脂。
- 固相支持体がまた、好適な修飾後にスカベンジャー樹脂および固定化試薬として使用され、官能基がアルデヒド、カルボキシル、チオール、アミノおよびポリアミノ基からなる群から選択される、請求項１に記載の樹脂。
- ペプチド合成およびコンビナトリアル・ライブラリー合成に使用される請求項１のヒドロキシエチル−スルフェニル−アセトアミド樹脂の合成方法であって、
ｉ）ジイソプロピルカルボジイミドまたは通常用いられるその他のカップリング試薬の存在下で、クロロ酢酸またはハロゲンの代わりに好適な脱離基を含むその等価物とアミノメチル樹脂とを反応させること、および
ｉｉ）ヨウ化ナトリウムの存在下で、脱離基を有する上記支持体とメルカプトエタノールとを反応させて式１の所望の固相支持体を得ること、
を含んでなる方法。 - 固相支持体が、ペプチド、保護されたペプチド断片および有機小分子の固相合成に使用される、請求項８に記載の方法。
- オルトゴナル適合性のヒドロキシエチル−スルフェニル−アセトアミド（ＨＥＳＡ）樹脂が、Ｂｏｃ化学プロトコールによるペプチドの固相合成に使用される、請求項９に記載の方法。
- オルトゴナル適合性のヒドロキシエチル−スルフェニル−アセトアミド（ＨＥＳＡ）樹脂が、Ｆｍｏｃ化学プロトコールによるペプチドの固相合成に使用される、請求項９に記載の方法。
- オルトゴナル適合性のヒドロキシエチル−スルフェニル−アセトアミド（ＨＥＳＡ）樹脂が、ＢｏｃおよびＦｍｏｃ化学プロトコール双方の単独または組合せによるペプチドの固相合成に使用される、請求項９に記載の方法。
- ヒドロキシエチル−スルフェニル−アセトアミド樹脂が、チアゾリジン誘導体のような複素環式有機小分子の固相合成に使用される、請求項９に記載の方法。
- ヒドロキシエチル−スルフェニル−アセトアミド樹脂が、有機小分子コンビナトリアル・ライブラリーの固相合成に使用される、請求項９に記載の方法。
- 最終生成物が弱アルカリ条件下で開裂可能である、請求項９に記載の方法。
- 最終生成物が、０．１〜０．５Ｎアルカリ水溶液とジオキサン、テトラヒドロフラン、メタノール、エタノールおよびジメチルホルムアミドからなる群から選択される有機溶媒との混合物を用いて固相支持体から開裂される、請求項９に記載の方法。
- 固相支持体がまた、好適な修飾後にスカベンジャー樹脂および固定化試薬として使用され、官能基がアルデヒド、カルボキシル、チオール、アミノおよびポリアミノ基からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
- Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドなどの存在下、１５℃〜８５℃の範囲の温度で、塩化メチレン、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、エーテル、石油エーテル、酢酸、メタノールなどからなる群から選択される有機溶媒の存在下で反応が行われる、請求項８または９に記載の方法。
- ジシクロヘキシルカルボジイミド、混合無水物、活性エステル、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、ベンゾトリアゾール−１−イル テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）または７−アザベンゾトリアゾール−１−イル テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）からなる群から選択されるカップリング試薬を用いて反応が行われる、請求項８または９に記載の方法。
- 保護基の酸分解開裂に使用される酸がＨＢｒ：ＡｃＯＨ、ＨＣｌ：ジオキサン、ギ酸およびトリフルオロ酢酸からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
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