CN1366539A - 一种新的用于肽和小分子有机合成的基于连接剂的固体载体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新的基于连接剂的固体载体,在该固体载体上产生连接剂部分的方法和采用该载体合成肽与小分子组合库的方法,本发明的新固体载体还包括共价连接到该固体载体如聚苯乙烯上的官能化的连接剂。

Description

一种新的用于肽和小分子有机合成的 基于连接剂的固体载体

技术领域

本发明涉及一种新的用于肽合成和组合库合成的基于连接剂的固体载体，在该固体载体上产生连接剂部分的方法和采用该载体合成肽与小分子组合库的方法，本发明的新固体载体还包括共价连接到该固体载体如聚苯乙烯上的官能化连接剂。

背景技术

固相合成的快速发展要求研制符合更新合成挑战的新的和通用载体。已良好地建立用于合成肽固体载体，现在甚至能直接在载体上合成环肽、肽酰胺、肽醛等。[(a)Barany.G.Et al，Int.J.Peptide protein Res.30，705-739，1987；(b)Fields，G.B.et al.，Int.J.Peptide proteinRes 35，161-214，1990.(C)Lloyd-Williams.P.et al.，Tetrahedron，49，11065-11133，1993(d)Wang，S S.，J Amer.Chem.Soc.95.1328，1973(e)Barlos，K.，et al.，Tetrahedron Letters，30，3947，1989(1)Beebe，X，et al.，J.Org.Chem.，60，4204，1995(g)Rink，H.，Tetrahedron Letters，28，3787，1987(h)Rapp.W.，et al.，in″Peptides 1988″Proc.20th European Peptide Symposium Jung G.andBoyer.E.(Eds.)，Walker de Gruyter，Berlin，pp 199 1989]。而且，合成有机小分子要求更通用和广泛的固体载体。在文献中报道了大量的载体具有各种与合成子结合的官能度及它们的稳定性和对合成反应剂和所用的实验条件的敏感性[(a)esapay，G.，et al.In“Peptides Chemistry，Structure and Biology，Proc.13th American Peptide Symposium”，Hodges.R.S.and Smith J.A.(Eds.).ESCOM.Leiden pp 435，1994.(b)Hermkens.P.H.H et al.Tetrahedron，52，4527，1996(c)Hermkens，P.H.H.et al，Tetrahedron，53，5643，1997(d)Brown，R.C.，J.ChemSoc.Perkin-I 3293，1998]。大部分已有的载体要求涉及强酸的从固体载体上分解出分子的激烈条件，而这些条件对该分子是有害的。而且，氨解和还原分解方法导致副反应和外消旋化，尤其在肽的情况下。另一方面，要求较温和条件的载体不能经受有机合成中所用的各种反应剂和实验条件，尤其在有机小分子的情况下。因此，研制可交叉配伍的新的通用载体是极有益的。目前流行基于在固体基质和生长分子之间引入双官能连接剂的策略来研制各种载体。其第一步包括将连接剂分子连接到固体基质上，然后在含有连接剂的固体载体上建构期望的合成支架。这允许采用期望的官能度以连接合成支架并在该固体载上取得期望的化学性质。基于这个前提，大量的基于连接剂的固体载体已被研制并在商业上利用[Oesapay，G.，et a″，in″Peptides Chemistry，Structure and Biology，Proc.13thAmerican Peptide Symposium″，Hodges，R S.and Smith J.A.(Eds.)，ESCOM，Leiden，pp 435，1994，(b)Hermkens，P.H.H.et al，Tetrahedron，52，4527，1996(c)Hermkens，P.H.H.et al，Tetrahedron，53，5643，1997(d)Brown，R.C.，J，Chem.Soc.Perkin-I，3293，1998和a)Blackburn，C.Biopolymers，peptide sciences，47，311，1998(b)Patek，M.and Lebl，M ibid 353(c)Barany，G.，et al，美国专利：5,235,0281993.(d)Barany，G.，美国专利：5,306,562，1994(e)Jensen，K.J，et al，美国专利5,917,015，1999]。

在类似的思路上工作，申请人还更早地研制了一种用于肽的固相合成的连接剂[Katti，S.B.et al，J.Chem.Soc.Chem.Commun.，843-844，1992]。图2，式VII所示的碱不稳定的连接剂是采用容易得到的原料制备的，并用于C-末端的每个氨基酸合成。它是根据用于合成PAM树脂的方法制备的[Mitchell，A.R.et al.，J.Org.Chem.43，2845，1978]。这为固体载体上的连接剂提供了预先装载的氨基酸以进一步合成肽。该合成起始于用苯甲酰甲基溴(II)处理氯乙酸(I)得到对应的酯(III)。用巯基乙醇(IV)处理酯III得到受保护的连接剂(V)。用含有DCC和DMAP的受适宜保护的氨基酸(Boc或Fmoc)酰化该连接剂的羟基，然后用Zn/AcOH解封苯甲酰甲基酯以得到游离酸(VI)。然后用四原子氧将游离酸VI的硫基氧化以得到对应的砜(VII)。通过DIC/HOBT方法将携带有适宜受保护氨基酸的连接酸装载到氨甲基树脂上并获得定量的装载。在将携带连接剂的第一氨基酸装载到固体载体上以后，对基于连接剂的固体载体的应用表现为采用已知的方法利用Boc和Fmoc化学合成肽。在极温和的条件下，采用二噁烷甲醇4N NaOH(3091)处理30分钟而在该固体载体上进行肽的分解。这提供了获得受保护的肽片断的机会，而这些片断是合成大肽和蛋白质的非常有用的中间产物[Kaiser，E.T.Acc.Chem.Res.22.47.1989；Williams，P.et al.Tetrahedron，49，11065，1993]。因此该连接剂表现为与Boc和Fmoc化学方案相容并可在实验室中容易地合成。采用这种连接剂已合成了许多肽和受保护肽片断。

技术问题

尽管存在各种优点，上述的基于连接剂的固体载体仍存在某些局限。为了合成肽，在每一次合成时要合成C末端的具有氨基酸的连接剂[附图的图2所示]。因此，用于每一种序列的合成要求额外的步骤和更长的时间。而且，在将具有受保护的氨基酸的连接剂装载到固体载体之前要求采用过四原子氧将其氧化，四原子氧是一种强氧化剂，这样易于氧化的氨基酸不能用作第一氨基酸。因此，在C末端具有半胱氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和酪氨酸的肽序列存在的问题是这些氨基酸在四原子氧氧化期间被氧化。第二，如在附图的图2所示，已观察到式VII的连接剂在用于除去Fmoc基团的分解条件下并不稳定，尤其是合成更长的肽的时候。已观察到延长与20％的哌啶溶液的接触导致该固体载体上生长链的分解。由于固体载体产物的分解通过β-消除而发生，20％哌啶溶液的碱度足以造成该连接剂的β-消除，并导致在各个解封步骤肽的部分分解。

发明目的

本发明的主要目的是提供一种可正交相容的基于连接剂的固体载体以用于有机合成。

本发明的另一目的是提供一种新的基于连接剂的固体载体以用于采用单独或组合的Boc和fmoc化学方案合成肽。

本发明的另一目的是提供一种新的包括共价连接到固体载体如聚苯乙烯上的官能化的连接剂的固体载体。

本发明的另一目的是提供一种合成羟乙基亚磺酰乙酰氨基树脂的方法。

本发明的另一目的是提供一种新的用于合成受保护的肽片断的固体载体，以用于更长肽的固相汇集合成。

本发明的另一目的是增加用于合成有机小分子以产生组合库的新的基于连接剂的固体载体的范围。

附图的简要说明

在附图中，

图1表示羟乙基亚磺酰乙酰氨基树脂的结构；

图2代表常规的肽合成；

图3代表羟乙基亚磺酰乙酰氨基树脂(HESA)的合成；

图4代表由Boc化学方案合成Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-OH；

图5代表由Fmoc化学方案合成Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-OH；

图6和7代表噻唑烷衍生物的合成。

发明简述

为了满足上述目的，如图1式I所示，本发明描述了一种新的可正交相容的固体载体，羟乙基亚磺酰乙酰氨基树脂(HESA树脂)的研制，如图1的分子式1所示。本文所描述的该新的固体载体可以用于分别或组合采用Boc和Fmoc化学方案合成生物活性肽。

发明详述

固相合成和组合化学领域已结合作为新的前导性发现的有用工具出现。在药物工业和合成更多化合物的需求的大力促进下，固相合成已被许多有机转化所接受。与这种新的利益一致的是技术发展的机会，即适于处理有机合成需求的新连接剂和/或固体载体。具有各种化学性质的已有固体载体虽然在概念上是优良的，它适于一种或其它类型的化学并涉及尖端化学。本发明的载体是易于从商业上获得的廉价的原材料。可以在非常温和的条件下分解最终产物。本发明描述了一种新的基于连接剂的固体载体以用于合成肽和产生组合库的小分子。

由于从该载体中分解产物需要非常温和的碱性条件，本发明使受保护的肽片断得以快速合成，而这些肽片断用于更大肽的汇集合成。合成的肽具有高产量和良好的纯度。而且该产物避免了外消旋化。这还可以合成C-末端的易于氧化的氨基酸的序列。本发明的另一特征是该新的固体载体可以用于固相合成有机小分子和产生肽与有机小分子以及杂环分子的组合库。在实验室中可以非常方便地大批合成该新固体载体，并且在储藏期间不需要任何特定的预防，以及可以在周围温度下储藏数月以用于随后的合成应用。而且，还为这种合成研制了一种新的方法。

这种化学上定义为活性脚手的新的固体载体的合成由两步实现。在第一步中，采用已知的如附图的图3所示的方法[STEP-1]将含有适宜的取代氢的离去基团的氯乙酸或其等同物与氨甲基树脂结合。该反应步骤是定量的，如阴性Kaiser测试所示。在下一步骤中，如附图的图3所示，巯基乙醇与从步骤1中得到的固体载体反应以得到期望的固体载体1[STEP-2]。在附图中所示的基于连接剂的固体载体1的特征是以在1666cm^-1处对应于该新引入的乙酰氨基的的强峰和在3219cm^-1处对应于基本羟基的峰为基础的。

采用文献中报道的标准方法，通过采用标准方案加入适宜的Boc或Fmoc保护的氨基酸来对羟基官能团进行定量。在Boc-化学的情况下，通过苦味酸法[方法A]测定该固体载体上的氨基官能团而进行这种定量[Gisin，B.F.，Anal.Chim.Acta.，58，248，1972]。而在Fmoc化学的情况下，通过哌啶处理除去Fmoc基团，然后通过测定在301nm处的吸光度来对9-芴基甲基哌啶进行定量[方法B][Meienhofer.J.et al.，Int.J.Peptide protein Res.13，35，1979]。发现新树脂1在环境温度下稳定数个月，并且它一旦被制成，可以长时间地用于随后的合成应用并无需任何特定的储藏条件。而且，在Boc和Fmoc化学方案中还测定了含有该树脂的氨基酸对反应剂和哌啶合成常用实验条件的稳定性。在50％的TFA∶DCM和20％的处于DMF中的哌啶的情况下，申请人并没有观察到任何结合到氨基酸上的树脂的分解。

外消旋化研究：

虽然用于从树脂中分解肽的碱性条件是相当温和的，但申请人认为适宜提供一些关于外消化危险的确切证据。为此目的合成了一对受保护的二肽，Boc-Gly-L-Phe-OH和Boc-Gly-D-Phe-OH。选择该二肽是因为羧肽酶-A这种酶在C-末端优先水解与芳族氨基酸相邻的肽键[Bradshaw，R.A.，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，63，1389，1969]。在该载体的肽分解过程中如果发生外消旋化，则在Boc-Gly-L-Phe-OH的情况下我们应该预期有一个对应于未水解的二肽的峰，而在Boc-Gly-D-Phe-OH的情况下则依外消旋化的程度而存在某种水解。用羧肽酶-A对从该固体载体中除去以后不经进一步纯化的受保护的二肽进行酶水解。30分钟以后，通过TLC监测等分试样。Boc-Gly-L-Phe-OH完全水解并在适当位置观察到对应于Boc-Gly和L-苯丙氨酸的两点。从缺少对应于水解产物的点和二肽完整性可以看出Boc-Gly-D-Phe-OH完全抗水解。还可以通过HPLC来进行这种监测并得到类似的结果。在Boc-Gly-L-Phe-OH的情况下观察到完全的水解，而在Boc-Gly-D-Phe-OH的情况下没有观察到水解分解，这可以由在HPLC曲线上缺少对应于Boc-Gly的峰来证明。这些结果明确表明在从该固体载体上除去肽的过程中不存在C-末端氨基酸的外消旋化。

基于连接剂的固体载体的合成应用

为表明该连接剂的用途，已采用Boc与Fmoc化学和一些噻唑烷衍生物进行某些肽的合成。已分别通过Boc-化学和Fmoc化学合成亮氨酸-脑啡肽。通过标准DIC/HOBt方案实现逐步地去保护/结合循环以引入随后的氨基酸残基。由50％的处于DCM中的FTA或5N的HCl/二噁烷解封Boc基团，而由20％的哌啶/DMF解封Fmoc基团。在每一步骤重复结合反应以得到较好的产量，如果根据Kaise测试判断要求这样的话。在碱性条件下从该固体载体上分离出最终的肽，并用5N HCl/二噁烷处理。在检查和结晶之后，获得大于60-70％总产量的全部的肽。它们已采用光谱方法表征。

发现所有的化合物在逆相HPLC中的纯度大于90％而在FAB-MS中给出适宜分子的离子峰。为了增加本发明连接剂的范围，认为可期望合成具有侧链官能度的肽。为此目的选择对应于I型前胶原的残基211-216的五肽Lys-Thr-Thr-Lys-Ser[Katayama K.et al，J，Biol.Chem.，268，9941，1993]。由Boc化学采用DIC/HOBT合成以进行结合反应。在图4所示的相同的方案之后将Boc-Ser(Bzl)连接到该连接剂上。然后依次加入适宜保护的氨基酸。在合成结束时，如前述从该固体载体中除去氨基和侧链受保护的肽。该受保护的肽片断的特征在于在FAB-MS光谱的适宜的[M+H]⁺上的分子离子峰。可以从该固体载体上选择性分解肽而保持氨基和侧链保护的基团完整的事实表明该连接剂可以用于采用片断缩合方法合成更大肽。最后，定量地除去该保护基团并获得78％产率的五肽。

为了说明新固体载体在有机小分子合成中的应用，已合成了一些噻唑烷衍生物[Patek，M.，et al，Tetrahedron Letters 36，2227，1995]。适于该合成的方案以略图的形式表示(图6和7，其中R＝H、Cl、Br、F、NO₂、OH、OMe、烷基、芳烷基、芳香基和取代物；X＝C或N；R’＝酰基、烷基、Boc、Bz、Z或氨基酸；而R”＝氨基保护基团)。通过DIC/DMAP或任何其它催化剂，采用合成肽所述的方案将适宜保护的半胱氨酸衍生物即Fmoc-Cys(Trt)连接到该固体载体上。通过20％处在DMF中的哌啶的处理裂解Fmoc基团，然后通过10％处于DCM中的TFA处理除去三苯甲基。具有自由氨基的载体结合的半胱氨酸和巯基与所需的商业上可获得的醛(采用大于2摩尔)在室温下或在升高的温度下反应。在6-8小时后完成环化。还可选择采用Boc-Cys(trt)作为与该固体载体结合的起始物质而成功地合成噻唑烷。该衍生物的优点是可以在单一步骤即TFA处理中除去氨基和巯基上的保护基团。因此可以将如此得到的噻唑烷衍生物从该固体载体上裂解或从该固体载体上衍化/酰化。因此，携带噻唑烷的载体分成许多部分，并在平行的合成方案中用不同的芳香或脂肪酰化剂分别将自由氨基官能团酰化。采用各种醛和酰化剂产生大量的高产量和纯度的新衍生物。

为了增加附图中图1的式1所示的基于连接剂的固体载体的范围，在不同的氨基酸/肽或任何其它结合到该载体上的分子上合成该噻唑烷的骨架。因此，采用标准的方案将受适宜保护的Boc或Fmoc保护的氨基酸连接到该固体载体上。除去氨基保护的基团并由DIC/HOBt方法将游离氨与受适宜保护的半胱氨酸残基偶合。在由Kaiser测试监测完全偶合以后，如前述以相同的方式除去半胱氨酸。让携带具有自由氨基和半胱氨酸的巯基的二肽的树脂与期望的商购得到的醛(采用大于2摩尔)在该固体载体上于室温下反应。在6-8小时后完成环化。因此可以将如此得到的噻唑烷衍生物从该固体载体上裂解或从该固体载体上衍化/酰化。因此，携带噻唑烷的载体分成许多部分，并在平行的合成方案中用不同的芳香或脂肪酰化剂分别将自由氨基官能团酰化。采用各种C-末端氨基酸、不同的醛和酰化剂产生大量的高产量和纯度的不同新衍生物。

简言之，该连接剂可以在实验室中方便地合成并非常适于采用Boc和Fmoc化学方案合成肽。可以将合成的受保护的肽用于片断浓缩方法。在从固体载体上分离肽中所用的条件不会导致外消旋化。我们相信本文所报道的新连接剂对酸和温和的碱条件是稳定的，因此，它具有用于合成肽/低核苷酸和大量小分子库结构的巨大潜力。

因此，本发明涉及研制羟乙基亚磺酰乙酰氨基树脂，用于单独或组合采用Boc和Fmoc化学固相合成肽以及合成有机小分子组合库的可交叉配伍的固体载体。本发明还提供了一种新的合成具有图1中式1所示通式的羟乙基亚磺酰乙酰氨基树脂的方法，其中该固体载体选自氨基官能膜、多孔玻璃、聚苯乙烯、棉花和纸，而聚苯乙烯选自氨基聚苯乙烯和氨甲基聚苯乙烯，该方法包括：

a)在存在二异丙基碳二酰亚胺或任何其它常用的偶合反应剂下，用已知方法，将含有适宜的离去基团取代氢的氯乙酸或其等同物与氨甲基树脂反应[如附图的图3所示的顺序]，

b)如果需要，则在存在碘化钠下将以上含有离去基团的固体载体与巯基乙醇反应以得到期望的图3式I的固体载体，

c)如附图的图4-7所示，将如此得到的新固体载体用于合成肽、受保护的肽片断和有机小分子。

根据本发明的进一步特征，采用容易商购得到的廉价原料进行该基于连接剂的固体载体的合成。

本发明的进一步的实施方案描述了如此得到的可交叉配伍的固体载体具有最佳的官能度(0.3-0.5meq/g)，发现树脂1在外周温度下稳定数个月，并且一旦被合成可以长时间地用于随后的合成应用并无需任何特定的储藏条件。

在本发明的另一个实施方案中包括，测定携带氨基酸的树脂对反应剂和在Boc与Fmoc化学方案中合成肽所常用实验条件的稳定性，并发现在固相肽合成中过量使用50％TFA∶DCM和20％的处于DMF中的哌啶的情况下是稳定的。

在另一个实施方案中，该固体载体用于肽、受保护的肽片断和有机小分子的固相合成。

在又一个实施方案中，可交叉配伍的羟乙基亚磺酰乙酰氨基树脂用于通过Boc化学方案固相合成肽。

在再一个实施方案中，可交叉配伍的羟乙基亚磺酰乙酰氨基(HESA)树脂用于通过Fmoc化学方案固相合成肽。

在另一个实施方案中，该可交叉配伍相容性的羟乙基亚磺酰乙酰氨基(HESA)树脂用于采用单独或组合的Boc和Fmoc化学方案固相合成肽。

在另一个实施方案中，羟乙基亚磺酰乙酰氨基树脂用于固相合成杂环有机小分子如噻唑烷衍生物。

在另一个实施方案中，该羟乙基亚磺酰乙酰氨基树脂用于有机小分子组合库的固相合成。

在另一个实施方案中，可在温和的碱性条件下裂解最终产物。

在另一个实施方案中，采用0.1-0.5N碱水和选自二噁烷、四氢呋喃、甲醇、乙醇和二甲基甲酰胺的有机溶剂的混合物从该固体载体上裂解最终产物。

在另一个实施方案中，该固体载体在经适宜的修饰之后还用作净化树脂和固定化反应剂，其中该官能团选自醛基、羧基、硫羟基、氨基和聚氨基。

在另一个实施方案中，该反应是在选自二氯甲烷、四氢呋喃、二甲基甲酰胺、醚、石油醚、乙酸、甲醇等的有机溶剂和N，N’-二环己基碳酰二亚胺、1-羟基苯并三唑、N-羟基琥珀酰亚胺等存在下，于15℃和85℃之间的温度范围内进行的。

在另一个实施方案中，该反应是在采用选自二环己基碳酰二亚胺、混合酐、活性酯、苯并三唑-1-基-氧-三-(二甲基氨基)六氟磷酸鏻(BOP)、苯并三唑-1-基-六氟磷酸四甲基脲鎓(HBTU)或7-氮杂苯并三唑-1-基六氟磷酸四甲基脲鎓(HATU)下进行的。

在另一个实施方案中，用于酸裂解保护基团的酸选自HBr∶AcOH、HCl∶二噁烷、甲酸和三氟乙酸。

在另一个实施方案中，本发明的特征是得到了未消旋化的产物。而且，本发明还提供了分别或组合采用Boc和Fmoc化学方法合成肽和固相合成有机小分子如噻唑烷衍生物的方法[如附图中的图4-7所示]。在固相合成以后，可以在非常温和的条件下从该固体载体上裂解下最终产物。本发明还描述了合成肽和小分子以采用该新的载体产生高产量和纯度的组合库。

根据以下详细的实施例将对本发明进一步描述。提供这些实施例是进一步说明各种特定和例举性的实施方案与技术，不应将其解释为对本发明范围的限定。

实验部分：

一般方法

所有用于本发明研究的氨基酸为L-结构，除非另外指出。所用的载体为2％交联的，具有0.5-0.9meq/g取代的氨甲基化的苯乙烯/二乙烯基苯共聚物。采用无水反应剂和干燥溶剂进行所有的偶合反应。通过在硅胶板采用以下的溶剂系统进行TLC得到均匀的中间产物和最终化合物：(a)CHCl₃-MeOH-AcOH(49∶1∶1)，(b)CHCl₃-MeOH(19∶1)，(c)CHCl₃-MeOH-AcOH(48∶1∶1)，(d)CHCl₃-MeOH-AcOH(18∶1∶1)，(e)CHCl₃-MeOH-AcOH(17∶2∶1)，(f)n-BuOH-AcOH-H₂O(4∶1∶5，上层)。还通过RP-HPLC采用μ-Bondapak C₁₈柱和线性梯度0-40％B在40分钟内(A＝0.1％含水TFA，B＝乙腈)和在225nm(UV)下监测来检查最终化合物的纯度。在Perkin Elmer 241偏振计上记录旋光度。在Bruker DRX 300MHz分光计上记载NMR光谱。在Shimadzu 8201 PC FTIR上记载IP光谱。

实施例1

合成羟乙基亚磺酰乙酰氨基树脂(化合物1)

将2.0g(0.9meq/g)商购的氨甲基聚苯乙烯树脂置于固体反应容器中，向其加入干燥的二氯甲烷(DCM)。让该悬浮液在氮搅拌30分钟下膨胀。用DCM清洗三次并用DCM∶DMF(1∶1)的混合物清洗一次。在存在催化量的处于DCM∶DMF(1∶1)中的二甲基氨基吡啶(DMAP)下用氯乙酸(0.45g，5mmol)和DIC(0.8ml，5mmol)处理。在氮下搅拌该反应混合物8小时或直至Kaiser测试阴性。将该树脂过滤，分别用25ml的DMF、DCM∶DMF(1∶1)、DMF、DCM∶DMF(1∶1)以及最终用DCM连续洗涤。在存在叔胺和碘化钠作为催化剂的情况下，在氮下用20ml处于DCM∶DMF(1∶1)中的巯基乙醇溶液(0.4ml，5mmol)搅拌该具有氯乙基脚手支架的树脂6-8小时。用DCM∶DMF(1∶1)和最后用DCM对该树脂过滤洗涤三次，并干燥得到期望的树脂(2.1g)。

固体载体的表征

该基于连接剂的固体载体1的特征是以在1666cm^-1处对应于该新引入的乙酰氨基基团的强峰和在3219cm^-1处对应于基本羟基的峰为基础的。

测定取代程度

采用文献中报道的标准方法，通过采用标准方案加入适宜的Boc或Fmoc保护的氨基酸来对羟基官能团进行定量。在Boc-化学的情况下，通过苦味酸法[方法A]进行这种定量。而在Fmoc化学的情况下，通过哌啶处理除去Fmoc基团，然后通过测定在301nm处的吸光度来对9-芴基甲基哌啶进行定量[方法B]。观测到该新的连接剂的取代程度范围为0.35-0.45meq/g。详述如下：

方法A(Boc化学)

将羟乙基亚磺酰乙酰氨基树脂(1)(0.5g)置于反应容器中，并在氮搅拌下让其在二氯甲烷(DCM)中膨胀。30分钟以后，过滤并用DCM洗涤该树脂。往该树脂中加入20ml处于DCM∶DMF(1∶1)中的Boc-Leu(0.42g，2.4mmol)、DIC(0.2ml，2.5mmol)和二甲基氨基吡啶(DMAP)或N-甲基咪唑(NMI)(0.4mmol)的溶液。搅拌该混合物8-10小时。用DCM洗涤该树脂三次并干燥。酸解(5N HCl/二噁烷，5ml)一个等分试样的该干燥树脂(~30.0mg)30分钟以除去Boc基团。然后，用DCM和DMF洗涤该树脂。用处在DCM-DMF(1∶1)(40ml)中的DIEA(2ml)摇动中和如此得到的盐酸盐。然后连续用DMF和DCM洗涤该树脂。接着由苦味酸法定量上述的产物以找出该固体载体上氨基的数量。取该树脂的一个等分试样(2.5mg)并用处于DCM(2ml)和乙醇(8ml)中的苦味酸(50mg)搅拌。在完全洗涤该树脂之后，用DIEA(1ml)搅拌，结果连接到该树脂上的苦味酸以它的DIEA盐的形式释放在该溶液中。补充该溶液到50ml，并用UV分光光度计测得在350nm处的吸光度。用下式计算。

       这里E＝14500

方法B：(Fmoc化学)

将羟乙基亚磺酰乙酰氨基树脂(1)(0.5g)置于反应容器中，并在氮搅拌下让其在二氯甲烷(DCM)中膨胀。30分钟以后，过滤并用DCM洗涤该树脂。往该树脂中加入20ml处于DCM∶DMF(1∶1)中的Fmoc-Leu(0.42g，2.4mmol)、DIC(0.2ml，2.5mmol)和二甲基氨基吡啶(DMAP)或N-甲基咪唑(NMI)(0.4ml)的溶液。搅拌该混合物8-10小时。用DCM洗涤该树脂三次并干燥。取一个等分试样的该干燥Fmoc-Leu-树脂(2.5mg)于试管中，并在偶而旋涡摇晃下用0.5ml的20％的处于DMF中的哌啶处理15-20分钟。在各个单独的试管中取0.5ml的20％的处于DMF中的哌啶作为对照。20分钟后，往这两个试管中加入DMF以使体积达50ml。由UV-VIS分光光度计在301nm处记载两种溶液的吸光度。以下式计算取代程度(mMol/g)。 $\mathrm{mMol}/g=\frac{A_{301}\×\mathrm{Vol}\left(\mathrm{ml}\right)}{7800\×\mathrm{Wt}\left(g\right)}$

其中，A₃₀₁＝含有树脂的溶液的吸光度

      Vol＝溶液的最后体积

      Wt＝所取树脂的提取物重量

稳定性研究：

为了说明该连接剂在与反应剂延长接触下解封Boc和/或Fmoc保护基团期间的稳定性，进行以下实验。在搅拌下对小等分试样的受Fmoc保护的结合到该固体载体上的氨基酸(0.41meq/g，100mg)分别用1ml50％的处于DCM中的TFA和5N的HCl/二噁烷处理8小时，然后将该树脂过滤、洗涤并干燥。在单独的烧瓶中，在用2ml的20％的哌啶/DMF搅拌10小时下对结合到该固体载体上的受Boc保护的氨基酸(0.38meq/g，120mg)进行处理，然后将该树脂过滤、洗涤和干燥。用方法A和B定量干燥树脂，结果与未处理的树脂几乎相同，从而表明该连接剂对去保护Fmoc和Boc基团所采用的条件是稳定。

外消旋化研究

将在该新的碱不稳定性固体载体上合成的实施例6&7所述的二肽用作底物，以检测在合成期间和从该固体载体上分解产物过程中发生的任何外消旋化。在单独的反应小瓶中，将分别为0.0064g(20μM)的Boc-Gly-L-Phe-OH(6)和Boc-Gly-D-Phe-OH(7)溶于1M的NaCl(50μl)。加入1M的tris HCl(50μl)以保持PH为7.5。在不同组的实验中在各个小瓶中加入15-50μl的羟基肽酶-A，并在25℃下摇晃5分钟。然后在加入酶的5分钟之前和之后，由RP-HPLC采用处于含0.1％TFA的水溶液中的乙腈0-90％的线性梯度，对等分试样的混合物分析40分钟以上。Boc-Gly-L-Phe-OH和Boc-Gly-D-Phe-OH的保留时间分别表现为12.5和13分钟，而Boc-Gly-L-Phe-OH在酶解之后在二肽的保留时间处没有峰，却在8分钟的保留时间处给出对应于Boc-Gly的峰。而Boc-Gly-D-Phe-OH在用酶处理以后的HPLC曲线表明其保留时间与二肽水解前的保留时间没有变化，即13分钟。

实施例2

合成Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-OH(化合物2)

将具有0.4meq/g取代度的羟乙基亚磺酰乙酰氨基树脂(1)置于反应容器中，并在氮搅拌下使其在二氯甲烷(DCM)中膨胀。30分钟后过滤，并用DCM洗涤该树脂。往该树脂中加入20ml处于DCM∶DMF(1∶1)中的Boc-Leu(0.25g，1.2mmol)二甲基氨基吡啶(DMAP)或N-甲基咪唑(NMI)(0.2mmol)的溶液。搅拌该混合物8-10小时。用DCM洗涤该树脂三次并干燥。测试一个等分试样的该干燥树脂(2.5mg)的装载量，且发现其装载量为78％[方法B]。用50％处于DCM中的TFA处理30分钟以除去Boc基团。30分钟后过滤，并用20ml×3的DCM、20ml×3的20％处于DCM中的DIEA、20ml×3的DCM洗涤该树脂。在氮搅拌下往上述树脂加入20ml处于DCM∶DMF(1∶1)中的Boc-Phe(0.26g，1mmol)和HOBt(0.153g，1mmol)溶液。往该悬浮液中加入DIC(0.18ml，1.2mmol)并将该混合物搅拌3小时或直至该树脂的Kaiser测试为阴性。

用50％处于DCM中的TFA处理30分钟以除去Boc基团。过滤并用20ml×3的DCM、20ml×3的20％的处在DCM中的DIEA、20ml×3的DCM洗涤该树脂，而具有自由氨基的树脂通过DIC/HOBt方法与Boc-Gly偶合。在完全偶合反应之后，过滤并用50％处于DCM中的TFA处理该树脂，以常规的方式除去Boc基团，并与Boc-Gly偶合。在由Kaiser测试监测到完全偶合反应之后，以常规的方式除去Boc基团，然后采用DIC/HOBt法与Boc-Tyr偶合。在氮搅拌下用二噁烷-MeOH-4N、NaOH(30∶9∶1，20ml)的混合物处理30分钟，过滤并用2ml的水洗涤该树脂。真空蒸发该混合的滤液。残留物置于水中，并用醚提取。用1N的盐酸酸化含水层，并用EtOAc(3×75ml)提取。用水和盐水洗涤混合的EtOAc层，然后在Na₂SO₄上干燥，并真空蒸发得到无定形固体。从MeOH-醚中重结晶如此得到的原始五肽酸以提供0.21g该标题化合物。产量：83％，R_f：0.8(d)；m.p.134-136℃；[α]_D ²⁵＝-9.8°(c＝4.1，MeOH)；¹H NMR(DMSO-d₆)δ：0.97(d，6H)，1.16(s，9H)，3.6-3.8(m，4H)，4.10，4.24和4.58(C^α质子)，6.63-7.00(ABq，4H)，7.40(m，5H)，7.8-8.1(NHs)。将以上得到的肽酸(0.21g，0.3mmol)在存在苯硫基甲烷(0.2ml)下于5N的Hcl/二噁烷(2ml)中搅拌1小时。在通过TLC监测该反应之后真空蒸发该溶剂。在加入干燥醚和研磨时，得到白色吸湿性固体盐酸五肽HCl.Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-OH(2)。过滤并在真空干燥器干燥：产量：0.15g(85％)；R_f：0.67(F)；m.p.141℃(dec)；[α]_D ²⁵＝-5.6°(c＝0.54，MeOH)；FAB-MS[M+H]556；¹H NMIR(DMSO-d₆)δ0.9(d，6H)，3.8-3.9(m，4H)，4.2，4.3和4.68(C^α质子)，6.8-7.1(ABq，4H)，7.3(m.5H)，7.5-8.5(NHs)，9.0(s，1H，酚OH)。

实施例3

合成Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-OH(化合物3)

将具有0.4meq/g取代度的羟乙基亚磺酰乙酰氨基树脂(1)置于反应容器中，并在氮搅拌下使其在二氯甲烷(DCM)中膨胀。30分钟后过滤，并用DCM洗涤该树脂。向该树脂中以常规的方式加入大于3摩尔的Boc-Leu溶液。测试一个等分试样的该干燥树脂(3.4mg)的装载量，且发现其装载量为81％[方法B]。然后以类似于在2位处用Boc-D-Ala取代Boc-Gly而得到Boc-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu所使用的方法合成Boc-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-OH。从该固体载体上裂解以后，分离出白色粉末Boc-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-OH(0.13g，79％)。然后在存在苯硫基甲烷(0.1ml)下于5N的Hcl/二噁烷(2ml)中处理1小时。在通过TLC监测该反应之后真空蒸发该溶剂，并用干乙醚研磨残留物。然后过滤并在真空干燥器中干燥，以给出0.16g(82.8％)的白色固体状的最终的肽HCl.Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-OH。R_f：0.48(F)；m.p.183℃(dec.)；[α]_D ²⁵＝+14.3°(c＝0.56，MeOH)；产量：0.15g(85％)；R_f：0.67(F)；m.p.141℃(dec)；[α]_D ²⁵＝-5.6°(c＝0.54)。¹H NMR(DMSO-d₆)δ：0.85(d，6H)，1.02(d，3H)，3.6(d，2H，)，4.26，4.38，4.44和4.68(C^α质子)，6.8-7.0(ABq，4H)，7.24(m，5H)，7.5-8.5(NHs)，9.05(s，1H，酚OH)。

实施例4

合成Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-OH(通过Fmoc化学合成化合物2)

将具有0.4meq/g取代度的羟乙基亚磺酰乙酰氨基树脂(1)(0.1g，0.4mmol)置于反应容器中，并在氮搅拌下让其在二氯甲烷(DCM)中膨胀。30分钟以后，过滤并用DCM洗涤该树脂。往该树脂中加入20ml处于DCM∶DMF(1∶1)中的Fmoc-Leu(0.41g，1.2mmol)、DIC(0.2ml，2.5mmol)和二甲基氨基吡啶(DMAP)或N-甲基咪唑(NMI)(0.4mmol)的溶液。搅拌该混合物8-10小时。用DCM洗涤该树脂三次并干燥。测试一个等分试样的该干燥树脂(2.5mg)的装载量，且发现其装载量为78％[方法A]。用12ml的20％的处于DCM∶DMF(1∶1)中的哌啶处理该树脂20分钟以除去Fmoc基团。用DCM洗涤该树脂三次。在用DCM洗涤该树脂三次以后，在氮搅拌下往上述树脂加入10ml处于DCM∶DMF(1∶1)中的Fmoc-Phe(0.38g，1.0mmol)和HOBt(0.15g，1.0mmol)溶液。往该混合物中加入DIC(0.18ml，1.2mmol)，并将该混合物继续搅拌3小时或直至该树脂的Kaiser测试为阴性。过滤并用20ml×3的DCM洗涤该树脂三次。通过用12ml 20％的处在DCM∶DMF(1∶1)中的哌啶常规的处理20分钟而将该Fmoc基团解封。然后由上述的DIC/HOBt法偶合Fmoc-Gly(图5的步骤3)、Fmoc-Gly(图5的步骤4)。以Boc-Tyr代替Fmoc-Tyr用于最后的偶合。在氮搅拌下用二噁烷-MeOH-4.NaOH(30∶9∶1，20ml)的混合物将具有戊胎的树脂处理30分钟，过滤并用2ml的水洗涤该树脂。真空蒸发该混合的滤液。残留物置于水中并用醚提取。用1N的盐酸酸化含水层并用EtOAc(3×75ml)提取。用水和盐水洗涤混合的EtOAc层，然后在Na₂SO₄上干燥，并真空蒸发得到无定形固体。从MeOH-醚中重结晶如此得到的粗制五肽酸以提供该标题化合物。产量：0.16g，(77％)R_f：0.8(d)：m.p.140-141℃(dec)；[α]_D ²⁵＝-5.6°(c＝0.54，MeOH)；FAB-MS[M+H]⁺570；¹HNMR(DMSO-d₆)δ：0.91(d，6H)，3.8-3.9(m，4H)，4.26，4.37和4.60(C^α质子)，6.8-7.1(ABq，4H)，7.30(m，5H)，7.5-8.5(NHs)，9.05(s，IH，酚OH)。

实施例5

合成Lys-Thr-Thr-Lys-Ser-OH(化合物5)

根据标准方法将Boc-Ser(Bzl)结合到羟乙基亚磺酰乙酰氨基树脂上。将具有0.34meq/g取代度的固体载体(0.73g，0.25mmol)置于反应容器中，并在氮搅拌下让其在二氯甲烷(DCM)中膨胀。30分钟以后，过滤并用DCM洗涤该树脂。往该树脂中加入20ml处于DCM∶DMF(1∶1)中的Boc-Ser(Bzl)(0.3g，1.0mmol)二甲基氨基吡啶(DMAP)或N-甲基咪唑(NMI)(0.2mmol)的溶液。搅拌该混合物8-10小时。用DCM洗涤该树脂三次并干燥。测试一个等分试样的该干燥树脂(2.0mg)的装载量，且发现其装载量为81％[方法B]。用50％处于DCM中的TFA处理30分钟以除去Boc基团。30分钟后过滤，并用20ml×3的DCM、20ml×3的20％处于DCM中的DIEA、20ml×3的DCM洗涤该树脂。具有自由氨基Boc-Lys(Cl-Z)的树脂与其它随后的氨基结合，即Boc-Lys(2-Cl-Z)，Boc-Thr(Bzl)，Boc-Thr(Bzl)和最后的Boc-Lys(2-Cl-Z)依次结合到该生长肽链上。在各个步骤采用50％处于CH₂Cl₂中的TFA进行Boc基团的解封。然后通过用0.1N的NaOH处理该树脂得到最终的受保护的肽Boc-Lys(2-Cl-Z)-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(2-Cl-Z)-Ser(Bzl)-OH。然后用Pd/C将受保护的肽催化转化氢化，得到Boc-Lys-thr-Thr-Lys-Ser-OH。在最后步骤用5N处在二噁烷的HCl除去Boc基团以提供最终的肽Lys-thr-Thr-Lys-Ser-OH。产量：0.09g(78.5％)，R_f：0.33(F)；m.p.158℃；FAB-MS，[M+H]⁺564，[α]_D ²⁵＝+20°(c＝0.1，DMF)；¹H NMR(DMSO-d₆)δ：1.06(d，3H)，1.10(d，3H)，1.36(m，2H)，1.53(m，2H)，2.73(t，4H)，4.15(m，2H)，4.16-4.4(C^αHs)，7.49(t，3H)，7.59(t，3H)，7.8-8.70(NHs)。

实施例6

合成Boc-Gly-L-Phe-OH(化合物6)

在上述连接到该固体载体上的碱不稳定性连接剂上以与得到2的类似方式合成该标题化合物(0.5mmol规模)。产量：0.10g(76％)；R_f：0.34(a)；m.p.118℃；[α]_D ²⁵＝+40°(c＝0.11，DMF)；FAB-MS[M+H]⁺323；¹HNMR(DMSO-d₆)δ：1.16(s，9H)，2.3(m，2H)，3.6(m，2H)，4.58(bs，1H)，7.4(m，5H)，7.9-8.2(NHs)。

实施例7

Boc-Gly-D-Phe-OH(化合物7)

类似地，还在0.5mmol的规模上合成化合物7，产量：0.12g(80％)；R_f：0.34(a)；m.p.109℃；[α]_D ²⁵＝+50°(c＝0.11).FAB-MS[M+H]⁺323；¹HNMR(DMSO-d₆)δ：1.16(s，9H)，2.3(m，2H)，3.6(m，2H)，4.58(bs，1H)，7.4(m，5H)，7.9-8.2(NHs)。

实施例8

合成2-(4-甲氧基苯基)噻唑烷-4-羧酸(化合物8)

通过DIC/DMAP方法将商购得到的Fmoc-Cys(Trt)连接到该基于连接剂的固体载体1上。将具有0.4meq/g取代度的固体载体(1.0g)置于反应容器中，并在氮搅拌下使其在二氯甲烷(DCM)中膨胀。30分钟后过滤，并用DCM洗涤该树脂。往该树脂中加入20ml处于DCM∶DMF(1∶1)中的Fmoc-Cys(Trt)(0.70g，1.2mmol)二甲基氨基吡啶(DMAP)或N-甲基咪唑(NMI)(0.4mmol)的溶液。搅拌该混合物8-10小时。用DCM洗涤该树脂三次并干燥。通过采用20％的哌啶处理，然后记录在UV上的吸光度[方法A]来测试一个等分试样的该干燥树脂的装载量，发现其装载量为90％。将带有Fmoc-Cys(Trt)的树脂用20ml 20％的处于DCM∶DMF(1∶1)中的哌啶处理20分钟以除去Fmoc基团。用DCM洗涤该树脂3次，然后用10％的处在DCM中的三氟乙酸(TFA)/Bu₃SiH处理30分钟(三次)以除去Cys的三苯甲基。在用DCM洗涤该树脂三次以后，在搅拌下加入15ml处于DCM∶DMF(1∶1)中的对茴香醛(0.5ml)。搅拌8-10小时。用DCM洗涤该树脂三次并干燥。在搅拌下用二噁烷-MeOH-4N NaOH的混合物(30∶9∶1，20ml)处理30分钟，过滤并用2ml的水洗涤该树脂。真空蒸发该混合的上清液。将残留物置于水中并用醚提取。用1N的盐酸酸化含水层并用EtOAc(3×70ml)提取。用水和盐水洗涤混合的EtOAc层，然后在Na₂SO₄上干燥，并真空蒸发得到白色结晶物质2-(4-甲氧苯基)噻唑烷-4-羧酸。产量：0.061g，72％；m.p.150-51℃；FAB-MS[M+H]⁺239；¹H NMR(DMSO-d₆)δ：3.5(m，2H)，3.7(s，3H)，4.8(bs，1H)，5.9(bs，1H)，6.8-7.1(Abq，4H)。

实施例9

合成N-Boc-2-(4-甲氧基)噻唑烷-4-羧酸(化合物9)

通过DIC/DMAP方法将商购得到的Fmoc-Cys(Trt)连接到该基于连接剂的固体载体#上。将具有0.34meq/g取代度的固体载体(0.50g)置于反应容器中，并在氮搅拌下使其在二氯甲烷(DCM)中膨胀。30分钟后过滤，并用DCM洗涤该树脂。往该树脂中加入20ml处于DCM∶DMF(1∶1)中的Fmoc-Cys(Trt)(0.56g，1.0mmol)二甲基氨基吡啶(DMAP)或N-甲基咪唑(NMI)(0.25mmol)的溶液。搅拌该混合物8-10小时。用DCM洗涤该树脂三次并干燥。通过采用20％的哌啶处理，然后记录在UV上的吸光度来测试一个等分试样的该干燥树脂的装载量，表明其装载量为88％[方法A]。用12ml20％的处于DCM∶DMF(1∶1)中的哌啶处理该含有Fmoc-Cys(Trt)的树脂20分钟以除去Fmoc基团。用DCM洗涤该树脂3次，然后用10％的处在DCM中的三氟乙酸(TFA)/Bu₃SiH处理30分钟(三次)以除去Cys的三苯甲基。在用DCM洗涤该树脂三次以后，在搅拌下加入10ml处于DCM∶DMF(1∶1)中的对茴香醛(0.5ml)。搅拌8-10小时。用DCM洗涤该树脂三次并干燥。向该树脂加入10ml处在DCM∶DMF(1∶1)中的二叔丁基碳酸氢钠(0.22g，1mmol)和DIEA(0.2ml，1.0mmol)溶液并搅拌3小时。三小时后该树脂的Kaiser测试为阴性。用DCM∶DMF(1∶1)10ml×3、DMF10ml×3、DCM∶DMF(1∶1)10ml×2和最终三次用DCM洗涤该树脂并干燥。在搅拌下用二噁烷-MeOH-4N NaOH的混合物(30∶9∶1，20ml)处理30分钟，过滤并用2ml的水洗涤该树脂。真空蒸发该混合的上清液。将残留物置于水中并用醚提取。用1N的盐酸酸化含水层，并用EtOAc(3×70ml)提取。用水和盐水洗涤混合的EtOAc层，然后在Na₂SO₄上干燥，并真空蒸发得到白色结晶物质N-Boc-2-(4-甲氧基)噻唑烷-4-羧酸。产量：0.048g，82％；m.p.160-162℃；FAB-MS[M+H]^-340，¹H NMR(DMSO-d₆)δ：1.2(s，9H)，3.4(m，2H)，3.9(s，3H)，4.7(bs，IH)，5.9(bs，IH)，6.8-7.1(Abq，4H)。

实施例10

合成N-苄基2-(4-甲氧基苯基)噻唑烷-4-羧酸(化合物10)

通过DIC/DMAP方法将商购得到的Fmoc-Cys(Trt)连接到该基于连接剂的固体载体#上。将具有0.34meq/g取代度的固体载体(0.50g)置于反应容器中，并在氮搅拌下使其在二氯甲烷(DCM)中膨胀。30分钟后过滤并用DCM洗涤该树脂。往该树脂中加入20ml处于DCM∶DMF(1∶1)中的Fmoc-Cys(Trt)(0.56g，1.0mmol)二甲基氨基吡啶(DMAP)或N-甲基咪唑(NMI)(0.25mmol)的溶液。搅拌该混合物8-10小时。用DCM洗涤该树脂三次并干燥。通过采用20％的哌啶处理，然后记录在UV上的吸光度来测试一个等分试样的该干燥树脂的装载量，表明其装载量为88％[方法A]。用12ml20％的处于DCM∶DMF(1∶1)中的哌啶处理该带有Fmoc-Cys(Trt)的树脂20分钟以除去Fmoc基团。用DCM洗涤该树脂3次，然后用10％的处在DCM中的三氟乙酸(TFA)/Bu₃SiH处理30分钟(三次)以除去Cys的三苯甲基。在用DCM洗涤该树脂三次以后，在搅拌下加入10ml处于DCM∶DMF(1∶1)中的对茴香醛(0.5ml)。搅拌8-10小时。用DCM洗涤该树脂三次并干燥。向该树脂加入10ml处在DCM∶DMF(1∶1)中的苯甲酰氯(0.2ml，2mmol)和DIEA(0.4ml，2.0mmol)溶液，并搅拌3小时。三小时后该树脂的Kaiser测试为阴性。用DCM∶DMF(1∶1)10ml×3、DMF10ml×3、DCM∶DMF(1∶1)10ml×2洗涤该树脂和最终用DCM洗涤该树脂三次，并干燥。在搅拌下用二噁烷-MeOH-4N NaOH的混合物(30∶9∶1，20ml)处理30分钟，过滤，并用2ml的水洗涤该树脂。真空蒸发该混合的上清液。将残留物置于水中，并用醚提取。用1N的盐酸酸化含水层，并用EtOAc(3×70ml)提取。用水和盐水洗涤混合的EtOAc层，然后在Na₂SO₄上干燥，并真空蒸发得到白色结晶物质N-苄基2-(4-甲氧基苯基)噻唑烷-4-羧酸。产量：0 043g，72％，m.p.108-110℃；FAB MS[M+H]⁺344，¹H NMR(DMSO-d₆)δ：3.3(m，2H)，3.9(s，3H).4.7(bs，1H)，5.7(bs，1H)，6.6(m，5H)，6.9-7.2(Abq，4H)。

实施例11

合成N-Boc-2-(4-甲氧基苯基)噻唑烷基-亮氨酸(化合物11)

将该新的具有0.4meq/g取代的基于连接剂的固体载体1(1.0g)置于反应容器中，并在氮搅拌下使其在二氯甲烷(DCM)中膨胀。30分钟后过滤，并用DCM洗涤该树脂。往该树脂中加入20ml处于DCM∶DMF(1∶1)中的Boc-Leu(0.45g，2mmol)二甲基氨基吡啶(DMAP)或N-甲基咪唑(NMI)(0.4mmol)的溶液。搅拌该混合物8-10小时。用DCM洗涤该树脂三次并干燥。测试一个等分试样的该干燥树脂(2.5mg)的装载量，发现其装载量为82％[方法B]。用50％的处于DCM中的TFA处理该树脂30分钟以除去Boc基团。30分钟后过滤，并用DCM 20ml×3、20％处于DCM中的DIEA20ml×3、DCM 20ml×3洗涤该树脂，并最终悬浮在20ml 20％的处在DMF∶DCM(1∶1)中的哌啶溶液，并用20ml的DMF∶DCM(1∶1)处理。在氮搅拌下使具有亮氨酸游离氨基的树脂与处在20ml DMF∶DCM(1∶1)中的Boc-Cys-(Trt)(0.56g，1mmol)和HOBt(0.153g，1mmol)反应。往该悬浮液中加入DIC(0.18ml，1.2mmol)并搅拌该混合物3小时直到该树脂的Kaiser测试为阴性。过滤并用15ml×3的DMF∶DCM(1∶1)以及最终用DCM洗涤该混合物。用50％的处在DCM中的三氟乙酸(TFA)/Bu₃SiH处理该树脂30分钟，然后用10％的处在DCM中的三氟乙酸(TFA)/Bu₃SiH洗涤10分钟(三次)以除去Cys上的Boc和三苯甲基。在用DCM洗涤该树脂三次以后，在搅拌下加入10ml处于DCM∶DMF(1∶1)中的对茴香醛(0.5ml)。搅拌8-10小时。用DCM洗涤该树脂三次。向该树脂加入10ml处在DCM∶DMF(1∶1)中的苯甲酰氯(0.2ml，2mmol)和DIEA(0.4ml，2.0mmol)溶液并搅拌3小时。三小时后该树脂的Kaiser测试为阴性。用DCM∶DMF(1∶1)10ml×3、DMF10ml×3、DCM∶DMF(1∶1)10ml×2洗涤该树脂和最终用DCM洗涤该树脂三次，并干燥。在搅拌下用二噁烷-MeOH-4N NaOH的混合物(30∶9∶1，20ml)处理30分钟，过滤并用2ml的水洗涤该树脂。真空蒸发该混合的上清液。将残留物置于水中并用醚提取。用1N的盐酸酸化含水层至PH为2并用EtOAc(3×70ml)提取。用水和盐水洗涤混合的EtOAc层，然后在Na₂SO₄上干燥，并真空蒸发得到玻璃状物质N-Boc-2-(4-甲氧基苯基)噻唑烷基-亮氨酸。产量：0.11g，78％，FAB-MS[M+H]⁺453；¹H NMR(DMSO-d₆)δ0.9(m，6H)，1.2(bs，9H)，1.7(m，2H)，4.3(m 1H)，3.5(m，2H)，3.7(s，3H)，4.86(bs，IH)，5.9(bs，1H)，6.8-7.1(Abq，4H)。

本发明的优点

如图1的式I所示的该新的基于连接剂的固体载体，羟乙基亚磺酰乙酰氨基树脂(HESA树脂)是用于肽合成的可交叉配伍相容性的固体载体，即它可以用于单独或组合采用Boc和Fmoc化学合成生物活性肽。由于它从该载体上裂解产物时要求非常温和的碱性条件，因而它提供了受保护的肽片断的快速合成，这可用于大肽的汇集合成。合成的肽具有高产量和良好的纯度。而且该产物没有外消旋化。它还允许在C-末端采用具有氧化趋势的氨基酸合成序列。该基于连接剂的载体可用于固相合成有机小分子和产生肽、有机小分子以及杂环分子的组合库。在实验室中可以方便地大批合成该新的固体载体，在储藏期间不需要特定的防护，且可以在外周温度下储藏数个月以用于随后的合成应用。而且，已研制出用于这种合成的新方法。

Claims (20)

1.一种用于肽合成和组合库合成的可交叉配伍相容性的羟乙基亚磺酰乙酰氨基(HESA)树脂，具有图1所示的通式，其中P代表氨甲基树脂。

2.权利要求1所要求的树脂，其中该固体载体树脂的形式选自氨基官能膜、多孔玻璃、二氧化硅、聚苯乙烯、聚二甲基丙烯酰胺、棉花和纸。

3.权利要求2所要求的树脂，其中聚苯乙烯选自氨基聚苯乙烯和氨甲基聚苯乙烯。

4.权利要求1所要求的树脂，其中该树脂用于固相肽/低核苷酸合成。

5.权利要求1所要求的树脂，其中该最终产物在温和的碱性条件下可裂解。

6.权利要求1所要求的树脂，其中该最终产物是采用0.1-0.5N碱水和选自二噁烷、四氢呋喃、甲醇、乙醇与二甲基甲酰胺的有机溶剂的混合物从该固体载体中裂解下来。

7.权利要求1所要求的树脂，其中该固体载体在经适宜的修饰之后还用作净化树脂和固定化反应剂，其中这些官能团选自醛基、羧基、硫羟基、氨基和聚氨基。

8.权利要求1所述的用于肽合成和组合库合成的羟乙基亚磺酰乙酰氨基树脂的合成方法，其中该方法包括：

i)在存在二异丙基碳二酰亚胺或任何其它常用的偶合反应剂下，将含有适宜的取代氢的离去基团的氯乙酸或其等同物与氨甲基树脂反应，和

ii)在存在碘化钠下将以上含有离去基团的固体载体与巯基乙醇反应以得到期望的式I的固体载体。

9.权利要求8所要求的方法，其中该固体载体用于肽、受保护的肽片断和有机小分子的的固相合成。

10.权利要求9所要求的方法，其中可交叉配伍的羟乙基亚磺酰乙酰氨基(HESA)树脂用于通过BOC化学方案固相合成肽。

11.权利要求9所要求的方法，其中可交叉配伍的羟乙基亚磺酰乙酰氨基(HESA)树脂用于通过Fmoc化学方案固相合成肽。

12.权利要求9所要求的方法，其中该可交叉配伍的羟乙基亚磺酰乙酰氨基(HESA)树脂用于通过单独或组合的Boc和Fmoc化学方案固相合成肽。

13.权利要求9所要求的方法，其中该可交叉配伍的羟乙基亚磺酰乙酰氨基树脂用于杂环有机小分子如噻唑烷衍生物的固相合成。

14.权利要求9所要求的方法，其中该可交叉配伍的羟乙基亚磺酰乙酰氨基树脂用于有机小分子组合库的固相合成。

15.权利要求9所要求的方法，其中该最终产物在温和的碱性条件下可裂解下来。

16.权利要求9所要求的方法，其中该最终产物是采用0.1-0.5N碱水和选自二噁烷、四氢呋喃、甲醇、乙醇与二甲基甲酰胺的有机溶剂的混合物从该固体载体中裂解下来。

17.权利要求9所要求的树脂，其中该固体载体在经适宜的修饰之后还用作净化树脂和固定化反应剂，其中这些官能团选自醛基、羧基、硫羟基、氨基和聚氨基。

18.权利要求8或9的方法，其中该反应是在存在选自二氯甲烷、四氢呋喃、二甲基甲酰胺、醚、石油醚、乙酸、甲醇等的有机溶剂和在存在N，N’-二环己基碳二酰亚胺、1-羟基苯并三唑、N-羟基琥珀酰亚胺等下，在15℃和85℃之间的温度范围内进行的。

19.权利要求8或9的方法，其中该反应是在采用选自混有二环己基碳二酰亚胺的酐、活性酯、苯并三唑-1-基-氧-三-(二甲基氨基)六氟磷酸鏻(BOP)、苯并三唑-1-基-六氟磷酸四甲基脲鎓(HBTU)或7-氮杂苯并三唑-1-基六氟磷酸四甲基脲鎓(HATU)一组偶合剂下进行的。

20.权利要求9所要求的方法，其中用于保护基团的酸裂解的酸选自HBr∶AcOH、HCl∶二噁烷、甲酸和三氟乙酸。

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