CN1218956C - 高通量多肽的合成方法与装置 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一套高通量多肽合成的方法和装置，这种高通量多肽合成装置主要由多肽反应器、多肽芯片以及多肽洗脱器构成。
Description
技术领域
本发明涉及一种多肽的合成方法及其装置，特别是一种“无限制”高通量合成的方法及其装置。
背景技术
自从生物化学家用人工方法合成多肽40多年以来，随着分子生物学、生物化学技术的飞速发展，多肽的研究取得了惊人的、划时代的发展。随着人体基因组的突飞猛进的发展，今后在相当的时间内，人类对于多肽的研究与应用将出现一个辉煌的时期，所以说21世纪是多肽的世界。多肽存在于所有生物领域，涉及激素、神经、血管等多门学科。
自从发明固相多肽及有机化合物的合成方法以来，新的固相合成方法就一直在发展。利用自动或手工合成方法，有时能合成上千、甚至在某些情况下合成数以百万计的多肽或小分子物质。这种能产生具有相同序列长短但不同种类或不同库的化合物的合成方法，就称之为“组合化学”或“组合合成”。
由于组合化学方法能够快速地大规模合成化合物，因而对于快速阐明新配体对接受器的结合过程就提供了一种强有力的工具。这些新方法在筛选新的治疗药物领域显示了特殊的前景。可参考下列文献：Gallop et al.，Applications of Combinatorial Technologies to DrugDiscovery：I.Background and Peptide Combinatorial Libraries，J.，Med.Chem.37：1233-51(1994)；Gorgon et al.，Applications of combinatorialTechnologies to Drug Discovery：II.Combinatorial organic Synthesis，Library Screening Strategies and Future Directions，J.，Med.Chem.37：1385-401(1994)；Posner et al.，Catalytic Antibodies：PerusingCombinatorial Libraries，Trends.Biochem.Sci.19：145-50(1994)
使用组合方法所产生的库的多重接收是令人印象深刻的。比如，这些方法已经被用来产生四万亿肽库：Pinilla et al.，Investigation ofAntigen-Antibody Interactions Using a Soluble，Non-Support-BoundSynthetic Decapeptide Library Composed of Four Trillion(4 times10@12)Sequences，Biochem.J.301：847-53(1994)；Wallace et al.，AMultimeric Synthetic Peptide Combinatorial Library，Pept.Res.7：27-31(1994)；Kerr et al.，Encoded Combinatorial Peptide LibrariesContaining Non-Natural Amino Acids，J.Am.Chem.Soc.115：2529-31(1993)；美国专利5288514以及美国专利5143854。
目前，产生组合库一般可分为三种主要方法：“立体指导”、“分离组合法”和“重组法”。这些方法的差异在于下面所描述的一个或多个方面：反应器的设计、聚合物类型和组成、一些物理因素(如时间、温度、空气)的控制、产品的分离、固相或液相的测定、简单或复杂的混合以及解释单个库成员的结构的过程的方法。
既然由分离组合法产生的聚合物库不是立体指导的，单个库成员的结构就不能通过分析反应矩形图来阐明。这样，结构就直接通过分析多聚物来阐明。因此，分离组合法过程的一个限制是需要一种可能的方法去分析多聚物的组成。虽然测序技术对于多肽和核酸是可能的，而对于有另外组成多聚物的序列化反应，比如碳水化合物、有机物、肽核酸或混合多聚物可能就不为人知了。
虽然组合合成方法提供了一个强有力的方式去迅速筛选目标分子，但是仍然还有大量问题有待解决。比如，既然立体指导库成员必须在立体分离分析中合成，那就仅有小部分库能被合成出来。在立体指导库中每一个反应器的位置要被一个XY轴坐标限定，目的是全部库都被两维坐标限定，随着库的尺寸增加，两维坐标方向也跟着延长。除此之外，随着不同反应数目应用于去建造随直线上升的库，库尺寸成指数增加。因此，要产生一套完整的线性四聚物(由四个不同输入组成的)，就要求16倍16矩阵(4的4次方＝256库成员)产生一套完整的线性八聚物(由四个不同输入组成的)需256倍，256矩阵(4的8次方＝65,536库成员)，产生一个完整由20个不同输入组成的四聚物需要400倍，400矩阵(4的20次方＝160,000库成员)。所以，不仅库矩阵的物理尺寸迅速膨胀(构建一个由20个不同输入组成的四聚物，使用立体指导需1667个小反应器)，传递每一个试剂或溶剂到矩阵的每一个反应器中去也是相当耗时的(用人工操作)，或需复杂的、昂贵的自动化设备。
分离组合法也有很多局限性，尽管在理论上大库能使用分离组合法构建出来，库成员身份的标识也必须由分析化学决定。因此，分离组合法也只能应用来合成那些能通过小规模程序来阐明的化合物，如多肽和多肽核苷酸小规模的初步筛选。
既然这种典型程序化方法要求分子的某部分，这就有令人感兴趣的事，去发现产生未被程序化分子限制的标识的化合物库。去发现那些任何未知的化合物或将要被发现的化学库也是激动人心的。随着人体基因组的发展以及新药开发的特征，在修正一些特殊氨基酸、β氨基酸、荧光标记、大肽分子等方面，这些多阶段合成物就显得越来越重要。在这些方法里，试剂可能是有机或无机试剂，功能团或侧链功能团被引进、移去或增加，侧翼打开或关闭，立体化学变化等。在几乎所有情况下，多肽的立体化学、功能团或肽链都是不一样的。
所有这些方法都是指导固定序列长度库，或用另一个说法，所有产生的多肽或目标物都有同样长度的氨基酸残基。如果要在同一时间产生同样数量的成千上万个多肽，但却是不同序列长度的多肽的话，这将是不可能的，基因组的研究将会非常有限。
为了克服这些问题，新的多肽合成法开始发展，这些依赖于机器去对溶剂和原料进行分配。比如ACT396MPS能在同时合成96种多肽，MulitiSyn公司的最新合成仪能同时产生192种多肽。然而其缺陷是多肽的种类量增加了，但多肽数量与质量却下降了。因为多肽合成依赖于总体分配，同样的，如果所需用的氨基酸或构物模板(buildingblocks)的数目巨大，加不同的氨基酸到成百上千个多肽的反应里去是不可能的，控制反应将会需要高速大型的微机站。如果合成由5-20个氨基酸残基组成的多肽，它将需要数以千万计的成本去设计生产。
本发明所提供“无限制”高通量多肽的合成方法及装置，能辨别不同组成的多肽的结构、能辨别所有多肽中每个多肽的精确结构、能够不受特殊氨基酸种类、肽链长短以及多肽数量的限制，因而本发明能完全弥补目前高通量多肽合成方法的缺陷和不足。
发明内容
本发明设计与提供了一套种高通量多肽合成的方法及其装置。该装置主要由(1)能够携带多肽序列和指导、检测多肽合成进度的多肽芯片1；(2)耐酸、耐碱、耐有机试剂，携带单一多肽芯片1的特殊多肽反应器2；(3)快速洗脱多肽反应器2中试剂的洗脱装置3组成。此高通量多肽合成装置可以在同一时间内，化学合成任何肽链长度的多肽以及任何数目的多肽化合物，合成的单一多肽化合物可以独立、方便地经高压液相色谱、质谱等手段予以表征。
此方法并不只局限于Fmoc、t-Boc或NSC化学合成法。
此方法并不只局限于多肽的合成，也可以用于其它分子，如：碳水化合物、蛋白质化合物等的高通量合成。
除了本发明中所述的多肽芯片1、多肽反应器2与多肽洗脱器3外，本发明使用的专用术语名称以及多肽载体的制备，多肽的偶联合成反应以及多肽偶联反应的监测方法都是本领域中为人熟知和常用的。
除非有另外不同的定义，本文所使用的技术与科学术语与本发明所属领域一般技术人员通常所理解的一样。但是关于本发明的实施或实验，现对以下术语予以定义，并对本发明中的设计与材料加以描述。
多肽芯片1：应用植于高分子材料内的感应晶片，利用特殊的玻化技术，做成耐酸、耐碱、耐有机溶剂的高储量多肽芯片1，芯片的晶片具有超储存量，能自动鉴别与程控技术，根据输入指令，依照合成、识别、分离程序进行多肽的合成控制。每一芯片只储存一特殊多肽序列。通过计算机程序，此芯片是“可再生”的。
多肽反应器2：为高密度聚丙烯材料，其特点是耐所有的试剂、耐酸与耐碱。反应器的孔径为500～1000目，从而可以有效地保护100～200目的高分子载体不互相污染，并保证多肽的单一性；所设计的1000目孔径有效地保证了溶剂与其它液体原料的自由出入。t-Boc或Fmoc化学都可以利用，反应器的大小可根据最终多肽量的要求而定，并同时能容纳芯片与氨基酸高分子载体。
多肽洗脱器3：是专门设计的多肽反应器2的洗脱装置，具有一般甩干机的特点，可由高密度聚丙烯、聚四氟乙烯或316不锈钢材料制成。它可以通过控制特殊转速而让试剂快速从反应器中洗脱出来，从而达到彻底清理多肽载体的目的。
多肽反应载体7：反应载体是一种具有硬性或半硬性表面，但同时具有功能链团的高分子材料。一般以聚苯乙烯或聚乙烯为基本骨架，通过化学修饰，氨基酸可连接到反应载体上。反应载体的孔径一般为100～200目或70目，如此可以保持在过滤时反应载体与溶剂的彻底分离。
多肽合成反应：指按照多肽的自然序列，通过化学合成的方法将多种氨基酸连接起来。多肽合成需要多肽反应器2、反应载体、洗脱装置及其它管子等器具。
在过去所有报导的高通量合成中，只有组合化学能达到高通量的目的，但组合化学所针对的所有多肽化合物必须有同样长度的氨基酸序列。如有一种多肽链度不同，则不能实现高通量。而一般的多肽自动合成仪则从立体和数量上有巨大的限制。
常用氨基酸：虽然本发明可适用于任何氨基酸、小分子化合物及其它适用于固相合成用的构建模块(building block)，本发明仅采取L-型常用氨基酸作为实例。
使用该装置来高通量合成多肽的操作过程如下：
1)将所有要合成的多肽序列输入到计算机程序中，计算出所有连接到载体上氨基酸的种类。
2)分别取合适数量的多肽反应器2和多肽芯片1。在每个多肽反应器2中各放入一个多肽芯片1，并同时各称量100毫克左右的Fmoc-Gly-Wang树脂，使用计算机识别器，将每个多肽序列编码到每个多肽芯片1上形成数据库。
3)将所有的多肽反应器2放在一起，进行脱去Fmoc保护基的反应，30～50分钟后，滤掉脱保护基试剂，将所有多肽反应器2放入到多肽洗脱器3中甩干。拿出所有多肽反应器2，用试剂如DMF洗涤，再放入到多肽洗脱器3中甩干，如此重复4～6次。根据多肽芯片1的指令，所有含有C端第二个氨基酸为X的多肽反应器2则被放入到预先活化的Fmoc-X氨基酸/偶联剂溶液中，比如含有C端第二个氨基酸为L(Leu)的多肽反应器2则被放入到预先活化的Fmoc-Leu氨基酸/偶联剂溶液中。反应80～100分钟后，将所有多肽反应器2放入到多肽洗脱器3中除去残留的氨基酸与试剂液体，重复用试剂如DMF洗涤/甩脱2～4次。第一步多肽偶联反应结束，C-端的第二个氨基酸已被偶联到载体上。
4)重复进行第(3)步操作，将所有的多肽反应器2一起做去掉Fmoc-保护基的反应，依次将C端开始的各个氨基酸偶联到载体上。
5)根据多肽芯片1的指令，多肽已完成所有序列与反应，取出它们并用单一地用三氟乙酸混合溶液切割，最终得到单一的多肽粗品。
附图说明
图1是本发明的高通量多肽合成装置示意图，该高通量多肽合成装置主要由多肽芯片1、多肽反应器2以及反应洗脱装置3构成。
图2说明了多肽芯片的结构及其工作原理。
图3说明了本发明中的多肽反应器2的工作原理。
图4a说明了多肽洗脱器的结构及其工作原理。
图4b说明了多肽洗脱器离心片10的结构及其工作原理。
图5是本发明实施例1的第一步反应示意图。
图6是本发明实施例1的第二步反应示意图。
图7是本发明实施例1的第三步反应示意图。
图8是本发明实施例1的第四步反应示意图。
图9是本发明实施例1的多肽合成完成示意图。
具体实施方式
本发明提供了一种高通量多肽合成的装置与方法，与传统的N×N×N级数的组合化学不同。传统组合化学是在使用N个不同高分子载体的情况下，同时与同一种氨基酸或多种氨基酸反应，然后分成N份的情况下又与同样数量的氨基酸反应。这样所产生出来的所有多肽分子虽然多肽序列不同，但却具有相同的多肽链长。本发明所提供的装置与方法也可用于组合化学合成，但却不限于组合化学合成。本发明的特征在于此装置与方法可以高通量的合成具有不同肽链的多肽分子。肽链的长度可以同时是5肽、10肽、11肽或其它长度。
在同一反应试剂条件下，为了能够同时合成成千上万或更多个多肽分子，本发明设计了特殊的多肽反应器2。此种多肽反应器2不同于一般常用的玻璃反应器，其下部含有玻璃滤片；也不同于针筒型反应器更不同于柱型体。它是经过特殊高分子工艺选择高密度、高强度聚丙烯为原料，制成通壁均具有500～1000目匀径的全封闭网状反应器，一般来讲，好的多肽高分子载体的最小孔径选择在200目或200目以下，也可以使用400目的孔径。
多肽反应器2是经过特殊高分子工艺选择高密度、高强度聚丙烯为原料，制成通壁均具有500～1000目匀径的全封闭网。工作时，要将每一多肽芯片1放入到一个多肽反应器2中。氨基酸液9和试剂8可以通过网孔自由出入，多肽高分子载体7全溶胀在试剂如DMF的情况下，由于其孔径比多肽反应器2的壁径大，从而可以保证载体7被“约束”在多肽反应器2内，同时为了保障多肽键的快速偶联与试剂8洗脱的方便、高效，孔径大于1000目是不可取的，因而500～1000目是较佳选择。
通常，多肽高分子载体7在DMF等试剂中的溶胀度为5～7倍。为了保证试剂的有效流通，多肽高分子载体的总体积不应超过(或大于)十分之一多肽反应器2的体积。根据最终多肽量的要求，选择多肽反应器2的大小，将称量好的初始氨基酸高分子载体7(含C端第一个氨基酸)装入多肽反应器2中，放入多肽芯片1以指导与监测多肽的进展。然后将多肽反应器2的盖子封上。一般来讲，对于大体积的多肽反应器2，盖子也具有500～1000目的壁径。如果目的是经常地合成上千上万或更多的多肽化合物，预先库存含有氨基酸高分子载体的多肽反应器2则会提高工作效率。库存时要根据氨基酸种类加以分类。
多肽反应器2保证了单一多肽分子的可行性，本发明的多肽芯片1则可将每一个多肽分子、多肽反应器2进行分类别目的标记。从而成千上万个多肽反应器2(多肽化合物)可以非常容易地加以识别。
将具有记忆与识别能力的晶片4，利用特殊的玻璃化技术，做成具有耐酸、耐碱与耐有机溶剂的高储存量多肽芯片1。多肽芯片的核心是具有记忆与识别能力的晶片4，外围是具有耐酸、耐碱与耐有机溶剂性能的玻璃外壳5，并且在外壳上有天线6。多肽芯片具有超储存量，能自动鉴别60步以上反应。借助计算机辅助识别与程控技术，根据输入的指令，依照合成、识别、洗脱等多肽合成步骤，进行多肽的合成。
每一多肽芯片1可以容许储存一定长度的多肽序列，如15个氨基酸长。每个氨基酸的代号既可以用三位英文或单一英文符号来输入。其次，在高通量合成之前，如果所有的多肽、所有步骤的氨基酸脱保护、浓度与时间都一致的话，则计算机可一次性地将所有多肽芯片1输入相同的反应条件。如果每一步的反应条件是不一样的，则可分批，分个地将每一多肽芯片1按照具体的要求加以指令的输入。
本发明的多肽芯片1只能储存一个多肽序列，这是非常重要的。它可以在一个多肽合成完成经“处理后”再生，从而用于新的多肽化合物的合成。
每一个多肽芯片1都有自己的标识号码，即使1千万个多肽芯片1被同时制备出来，它们的标识号码也不会重复或相同。
在给定的多肽化合物情况下，比如15000个不同肽链的多肽，将每一多肽芯片1放入到一个多肽反应器2中，将氨基酸9的高分子载体7加入后，封盖子，根据每一多肽的特殊序列与所要反应的具体条件，存储与编写单一的指令到多肽芯片1上，这样，即使15000个多肽反应器2在任何情况下相混或在任何情况下来检查反应的状态，通过多肽芯片1，所有的多肽序列会被识别出来。
虽然多肽反应器2的巧妙设计可以使不同的液体试剂8自由地出入于器内与器外，为了达到洗脱的目地，并不需要使用传统多肽人工合成的压力过滤洗涤多肽载体7。但是为了加速洗涤和提高效率、保障洗涤的彻底，本发明特别设计了适用于高通量合成的洗脱装置3，它是一种特殊的离心器。
洗脱装置3用耐有机溶剂且不与氨基酸9或多肽试剂8发生反应的材料制成，如316不锈钢或高密度聚丙烯或聚四氟乙烯材料。在内壁中，离心片10的下部呈蜂状结构，离心器的液体通过排液管12流入废液瓶，离心片10的较佳转速为1000～1500rpm，转速太高不但有可能损伤多肽反应器2的器壁，还有可能迫使多肽载体7通过器壁流出；转速太低则清洗效果不好。
多肽离心器的外壳设计为夹心状。使用时将要清洗或刚反应完的所有多肽反应器2放入到离心器的多肽离心片10夹壁中。可根据多肽反应器2的大小与离心器的大小，放入不同数量的多肽反应器2。为了保障好的洗涤效果，多肽反应器2最多只能占用离心片10夹壁的一半，如果有更多的多肽反应器2需要在一次离心中完成洗涤，则应增加离心的时间，比如从3分钟增加到6分钟。多肽离心器的外壳设计为夹心状。
多肽洗脱器主壳的内壁上有一层耐溶剂的聚四氟乙烯O-环11，不锈钢壳盖依自身重力而自然地密封整个离心容器。当离心工作完成时，打开壳盖，通过钩环14取出整个离心片10与多肽反应器2。将离心片10倒下来，取出所有的多肽反应器2，然后将离心片10放回到多肽洗脱器3中，为下次洗涤作准备。排液阀13在整个洗涤过程中必须处于“打开”状态，而在置换废液瓶与洗涤等待过程中，排液阀13则处于关闭状态。
本发明同样适用于小量多肽的合成，如5个、10个或20个。本发明的最大特征在于它适用于高通量的合成，合成多肽数量越多，越能发挥本发明的优势；同样地，虽然本发明适用于不同保护化学如Fmoc，t-Boc或NSC，但是化学本身的日益发展，Fmoc占有越来越大的比重。
下面的实施例将结合附图对本发明作进一步的解释，这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。本领域技术人员在权利要求的范围内所进行的某些改变和调整也应认为属于本发明的范畴。
实施例1 利用第1种工艺条件合成17个肽链长度、C端首氨基酸相同且序列不同的多肽
一般的Fmoc固相合成的技术与步骤均适用于这里。虽然所有的氨基酸(包括D-型)在这里都适用，此实施例只选用了L-型的氨基酸。所有的氨基酸载体7取代度控制在0.4mmol/g左右。所用溶剂8如DMF、偶联剂如HBTU等为常规用法。
17种多肽分别含有相同的C-端氨基酸和不同的肽链长度，它们的多肽序列如下(单字母氨基酸缩写)：
第一肽 A-L-A-A-G
第二肽 A-R-A-G
第三肽 L-A-L-A-G
第四肽 R-L-A-G
第五肽 R-A-R-A-G
第六肽 L-A-R-G
第七肽 R-L-A-R-G
第八肽 A-L-R-G
第九肽 R-R-R-R-G
第十肽 L-L-R-G
第十一肽 R-A-R-R-G
第十二肽 L-A-L-G
第十三肽 A-L-R-L-G
第十四肽 L-L-L-G
第十五肽 A-R-R-L-G
第十六肽 R-A-L-G
第十七肽 A-R-L-G
1)将所有多肽序列输入到计算机程序中，计算出所有氨基酸的种类(指连接到载体上的氨基酸，如这里Gly则不计算入内)，这里共有三种氨基酸A(Ala)；R(Arg)和L(Leu)。由于C端的第一个氨基酸已经连接到载体上，因而所偶连的第一个氨基酸则为C端倒数第二个。
2)分别取合适数量的多肽反应器2和多肽芯片1。在每个多肽反应器2(共17个)中各放入一个多肽芯片1，并同时各称量100毫克Fmoc-Gly-Wang树脂，使用计算机识别器，将每个多肽序列编码到每个多肽芯片1上，这样17个多肽就有了如图5(左)所示的数据库。
3)将所有的多肽反应器2放在一起，然后进行脱去Fmoc保护基的反应，45分钟后，滤掉脱保护基试剂，将所有多肽反应器2放入到多肽洗脱器3中甩干(图4a、图4b)。拿出所有多肽反应器2，用DMF洗涤，再放入到多肽洗脱器3中甩干，如此重复5次，根据多肽芯片1的指令，所有含有C端第二个氨基酸为A(Ala)的多肽反应器2则被放入到预先活化的Fmoc-Ala氨基酸/偶联剂溶液中；含有C端第二个氨基酸为R(Arg)的多肽反应器2则被放入到预先活化的Fmoc-Arg(pbf)氨基酸/偶联剂溶液中；含有C端第二个氨基酸为L(Leu)的多肽反应器2则被放入到预先活化的Fmoc-Leu氨基酸/偶联剂溶液中。反应90分钟后，将所有多肽反应器2放入到多肽洗脱器3中除去残留的氨基酸与试剂液体，重复用DMF洗涤/甩脱3次。第一步多肽偶联反应结束。C-端的第二个氨基酸已被偶联到载体上。
4)将17个多肽反应器2一起做去掉Fmoc-保护基的反应(图6)。45分钟后，滤掉脱保护基试剂，再将所有多肽反应器2放入到多肽洗脱器3中甩干，取出所有多肽反应器2，用DMF洗涤，再放入到多肽洗脱器3中甩干，如此重复5次，根据多肽芯片1的指令，所有含有C端第三个氨基酸A(Ala)的多肽反应器2则被放入到预先活化的Fmoc-Ala氨基酸/偶联剂溶液中；含有C端第三个氨基酸R(Arg)的多肽反应器2则被放入到预先活化的Fmoc-Arg(pbf)氨基酸/偶联剂溶液中；含有C端第三个氨基酸L(Leu)的多肽反应器2则被放入到预先活化的Fmoc-Leu氨基酸/偶联剂溶液中。反应90分钟后，将所有多肽反应器2放入到多肽洗脱器3中除去残留的氨基酸与试剂液体，重复用DMF洗涤，甩脱3次(图5)。第二步多肽偶联反应结束。C-端的第三个氨基酸已被偶联到载体上。
5)将17个多肽反应器2一起做去掉Fmoc-保护基的反应(图7)。45分钟后，滤掉脱保护基试剂，将所有多肽反应器2放入到多肽洗脱器3中甩干，取出所有多肽反应器2，用DMF洗涤，再放入到多肽洗脱器3中甩干，如此重复5次。根据多肽芯片1的指令，所有含有C端第四个氨基酸A(Ala)的多肽反应器2被放入到预先活化的Fmoc-Ala氨基酸/偶联剂溶液中；含有C端第四个氨基酸R(Arg)的多肽反应器2则被放入到预先活化的Fmoc-Arg(pbf)氨基酸/偶联剂溶液中；含有C端第四个氨基酸L(Leu)的多肽反应器2则被放入到预先活化的Fmoc-Leu氨基酸/偶联剂溶液中。反应90分钟后，将所有多肽反应器2放入到多肽洗脱器3中除去残留的氨基酸与试剂液体，重复用DMF洗涤，甩脱3次(图7)。第三步多肽偶联反应结束。C-端的第四个氨基酸以被偶联到载体上。
6)将17个多肽反应器2一起做去掉Fmoc保护基的反应。45分钟后，滤掉脱保护洗基试剂，将所有多肽反应器2放入到多肽洗脱器3中甩干，取出所有多肽反应器2，用DMF洗涤，再放入到多肽洗脱器3中甩干，如此重复5次，根据多肽芯片1的指令，多肽②④⑥⑧⑩(12)(14)(16)(17)号已完成所有序列与反应，它们被取出，并被单一地用三氟乙酸混合溶液切割，最终得到单一的多肽粗品(图8)。而①③⑤⑦⑨(11)(13)(15)号多肽则仍有未完成的序列与程序。
7)根据多肽芯片1的指令，所有含有C端第五个氨基酸A(Ala)的多肽反应器2则被放入到预先活化的Fmoc-Ala氨基酸/偶联剂溶液中；含有C端第五个氨基酸R(Arg)的多肽反应器2则被放入到预先活化的Fmoc-Arg(pbf)氨基酸/偶联剂溶液中；含有C端第五个氨基酸L(Leu)的多肽反应器2则被放入到预先活化的Fmoc-Leu氨基酸/偶联剂溶液中。反应90分钟后，将所有多肽反应器2放入到多肽洗脱器3中除去残留的氨基酸与试剂液体，重复用DMF洗涤，甩脱3次(图9)。第四步多肽偶联反应结束。C-端的第五个氨基酸已被偶联到载体上。将所有多肽反应器2一起做去掉Fmoc保护基的反应45分钟后，滤掉脱保护洗基试剂。将所有多肽反应器2放入到多肽洗脱器3中甩干，取出所有多肽反应器2，用DMF洗涤，再放入到多肽洗脱器3中甩干，如此重复5次，根据多肽芯片1的指令，使用的多肽偶联反应全部完成。而①③⑤⑦⑨(11)(13)(15)号多肽被取出，并被单一地用三氟乙酸混合溶液液切割，最终得到单一的多肽粗品。
如此，经过四步反应，17个肽链长度，序列不同的多肽则单一地被合成出来。
实施例2 利用第2种工艺条件合成17个肽链长度、C端首氨基酸相同且序列不同的多肽
本实施例要合成的多肽和操作过程都与实施例1完全相同，只是所采用的工艺条件有所不同。
1)、2)步操作与实施例1完全相同。
3)将所有的多肽反应器2放在一起，然后进行脱去Fmoc保护基的反应，30分钟后，滤掉脱保护基试剂，将所有多肽反应器2放入到多肽洗脱器3中甩干。拿出所有多肽反应器2，用DMF洗涤，再放入到多肽洗脱器3中甩干，如此重复4次，根据多肽芯片1的指令，所有含有C端第二个氨基酸为A(Ala)的多肽反应器2则被放入到预先活化的Fmoc-Ala氨基酸/偶联剂溶液中；含有C端第二个氨基酸为R(Arg)的多肽反应器2则被放入到预先活化的Fmoc-Arg(pbf)氨基酸/偶联剂溶液中；含有C端第二个氨基酸为L(Leu)的多肽反应器2则被放入到预先活化的Fmoc-Leu氨基酸/偶联剂溶液中。反应80分钟后，将所有多肽反应器2放入到多肽洗脱器3中除去残留的氨基酸与试剂液体，重复用DMF洗涤/甩脱2次。第一步多肽偶联反应结束。C-端的第二个氨基酸已被偶联到载体上。
4)将17个多肽反应器2一起做去掉Fmoc-保护基的反应。30分钟后，滤掉脱保护基试剂，再将所有多肽反应器2放入到多肽洗脱器3中甩干，取出所有多肽反应器2，用DMF洗涤，再放入到多肽洗脱器3中甩干，如此重复4次，根据多肽芯片1的指令，所有含有C端第三个氨基酸A(Ala)的多肽反应器2则被放入到预先活化的Fmoc-Ala氨基酸/偶联剂溶液中；含有C端第三个氨基酸R(Arg)的多肽反应器2则被放入到预先活化的Fmoc-Arg(pbf)氨基酸/偶联剂溶液中；含有C端第三个氨基酸L(Leu)的多肽反应器2则被放入到预先活化的Fmoc-Leu氨基酸/偶联剂溶液中。反应80分钟后，将所有多肽反应器2放入到多肽洗脱器3中除去残留的氨基酸与试剂液体，重复用DMF洗涤，甩脱2次。第二步多肽偶联反应结束。C-端的第三个氨基酸已被偶联到载体上。
5)将17个多肽反应器2一起做去掉Fmoc-保护基的反应。30分钟后，滤掉脱保护基试剂，将所有多肽反应器2放入到多肽洗脱器3中甩干，取出所有多肽反应器2，用DMF洗涤，再放入到多肽洗脱器3中甩干，如此重复4次。根据多肽芯片1的指令，所有含有C端第四个氨基酸A(Ala)的多肽反应器2被放入到预先活化的Fmoc-Ala氨基酸/偶联剂溶液中；含有C端第四个氨基酸R(Arg)的多肽反应器2则被放入到预先活化的Fmoc-Arg(pbf)氨基酸/偶联剂溶液中；含有C端第四个氨基酸L(Leu)的多肽反应器2则被放入到预先活化的Fmoc-Leu氨基酸/偶联剂溶液中。反应80分钟后，将所有多肽反应器2放入到多肽洗脱器3中除去残留的氨基酸与试剂液体，重复用DMF洗涤，甩脱2次。第三步多肽偶联反应结束。C-端的第四个氨基酸以被偶联到载体上。
6)将17个多肽反应器2一起做去掉Fmoc保护基的反应。30分钟后，滤掉脱保护洗基试剂，将所有多肽反应器2放入到多肽洗脱器3中甩干，取出所有多肽反应器2，用DMF洗涤，再放入到多肽洗脱器3中甩干，如此重复4次。根据多肽芯片1的指令，多肽②④⑥⑧⑩(12)(14)(16)(17)号已完成所有序列与反应，它们被取出，并被单一地用三氟乙酸混合溶液切割，最终得到单一的多肽粗品。而①③⑤⑦⑨(11)(13)(15)号多肽则仍有未完成的序列与程序。
7)根据多肽芯片1的指令，所有含有C端第五个氨基酸A(Ala)的多肽反应器2则被放入到预先活化的Fmoc-Ala氨基酸/偶联剂溶液中；含有C端第五个氨基酸R(Arg)的多肽反应器2则被放入到预先活化的Fmoc-Arg(pbf)氨基酸/偶联剂溶液中；含有C端第五个氨基酸L(Leu)的多肽反应器2则被放入到预先活化的Fmoc-Leu氨基酸/偶联剂溶液中。反应80分钟后，将所有多肽反应器2放入到多肽洗脱器3中除去残留的氨基酸与试剂液体，重复用DMF洗涤，甩脱2次。第四步多肽偶联反应结束。C-断的第五个氨基酸已被偶联到载体上。将所有多肽反应器2一起做去掉Fmoc保护基的反应30分钟后，滤掉脱保护洗基试剂。将所有多肽反应器2放入到多肽洗脱器3中甩干，取出所有多肽反应器2，用DMF洗涤，再放入到多肽洗脱器3中甩干，如此重复5次。根据多肽芯片1的指令，使用的多肽偶联反应全部完成。而①③⑤⑦⑨(11)(13)(15)号多肽被取出，并被单一地用三氟乙酸混合溶液液切割，最终得到单一的多肽粗品。
如此，经过四步反应，17个肽链长度，序列不同的多肽则单一地被合成出来。
实施例3 利用第3种工艺条件合成17个肽链长度、C端首氨基酸相同且序列不同的多肽
本实施例要合成的多肽和操作过程都与实施例1完全相同，只是所采用的工艺条件有所不同。
1)、2)步操作与实施例1完全相同。
3)将所有的多肽反应器2放在一起，然后进行脱去Fmoc保护基的反应，50分钟后，滤掉脱保护基试剂，将所有多肽反应器2放入到多肽洗脱器3中甩干。拿出所有多肽反应器2，用DMF洗涤，再放入到多肽洗脱器3中甩干，如此重复6次，根据多肽芯片1的指令，所有含有C端第二个氨基酸为A(Ala)的多肽反应器2则被放入到预先活化的Fmoc-Ala氨基酸/偶联剂溶液中；含有C端第二个氨基酸为R(Arg)的多肽反应器2则被放入到预先活化的Fmoc-Arg(pbf)氨基酸/偶联剂溶液中；含有C端第二个氨基酸为L(Leu)的多肽反应器2则被放入到预先活化的Fmoc-Leu氨基酸/偶联剂溶液中。反应100分钟后，将所有多肽反应器2放入到多肽洗脱器3中除去残留的氨基酸与试剂液体，重复用DMF洗涤/甩脱4次。第一步多肽偶联反应结束。C-端的第二个氨基酸已被偶联到载体上。
4)将17个多肽反应器2一起做去掉Fmoc-保护基的反应。50分钟后，滤掉脱保护基试剂，再将所有多肽反应器2放入到多肽洗脱器3中甩干，取出所有多肽反应器2，用DMF洗涤，再放入到多肽洗脱器3中甩干，如此重复6次，根据多肽芯片1的指令，所有含有C端第三个氨基酸A(Ala)的多肽反应器2则被放入到预先活化的Fmoc-Ala氨基酸/偶联剂溶液中；含有C端第三个氨基酸R(Arg)的多肽反应器2则被放入到预先活化的Fmoc-Arg(pbf)氨基酸/偶联剂溶液中；含有C端第三个氨基酸L(Leu)的多肽反应器2则被放入到预先活化的Fmoc-Leu氨基酸/偶联剂溶液中。反应100分钟后，将所有多肽反应器2放入到多肽洗脱器3中除去残留的氨基酸与试剂液体，重复用DMF洗涤，甩脱4次。第二步多肽偶联反应结束。C-端的第三个氨基酸已被偶联到载体上。
5)将17个多肽反应器2一起做去掉Fmoc-保护基的反应。50分钟后，滤掉脱保护基试剂，将所有多肽反应器2放入到多肽洗脱器3中甩干，取出所有多肽反应器2，用DMF洗涤，再放入到多肽洗脱器3中甩干，如此重复6次。根据多肽芯片1的指令，所有含有C端第四个氨基酸A(Ala)的多肽反应器2被放入到预先活化的Fmoc-Ala氨基酸/偶联剂溶液中；含有C端第四个氨基酸R(Arg)的多肽反应器2则被放入到预先活化的Fmoc-Arg(pbf)氨基酸/偶联剂溶液中；含有C端第四个氨基酸L(Leu)的多肽反应器2则被放入到预先活化的Fmoc-Leu氨基酸/偶联剂溶液中。反应100分钟后，将所有多肽反应器2放入到多肽洗脱器3中除去残留的氨基酸与试剂液体，重复用DMF洗涤，甩脱4次。第三步多肽偶联反应结束。C-端的第四个氨基酸以被偶联到载体上。
6)将17个多肽反应器2一起做去掉Fmoc保护基的反应。50分钟后，滤掉脱保护洗基试剂，将所有多肽反应器2放入到多肽洗脱器3中甩干，取出所有多肽反应器2，用DMF洗涤，再放入到多肽洗脱器3中甩干，如此重复6次。根据多肽芯片1的指令，多肽②④⑥⑧⑩(12)(14)(16)(17)号已完成所有序列与反应，它们被取出，并被单一地用三氟乙酸混合溶液切割，最终得到单一的多肽粗品。而①③⑤⑦⑨(11)(13)(15)号多肽则仍有未完成的序列与程序。
7)根据多肽芯片1的指令，所有含有C端第五个氨基酸A(Ala)的多肽反应器2则被放入到预先活化的Fmoc-Ala氨基酸/偶联剂溶液中；含有C端第五个氨基酸R(Arg)的多肽反应器2则被放入到预先活化的Fmoc-Arg(pbf)氨基酸/偶联剂溶液中；含有C端第五个氨基酸L(Leu)的多肽反应器2则被放入到预先活化的Fmoc-Leu氨基酸/偶联剂溶液中。反应100分钟后，将所有多肽反应器2放入到多肽洗脱器3中除去残留的氨基酸与试剂液体，重复用DMF洗涤，甩脱4次。第四步多肽偶联反应结束。C-端的第五个氨基酸已被偶联到载体上。将所有多肽反应器2一起做去掉Fmoc保护基的反应50分钟后，滤掉脱保护洗基试剂。将所有多肽反应器2放入到多肽洗脱器3中甩干，取出所有多肽反应器2，用DMF洗涤，再放入到多肽洗脱器3中甩干，如此重复6次。根据多肽芯片1的指令，使用的多肽偶联反应全部完成。而①③⑤⑦⑨(11)(13)(15)号多肽被取出，并被单一地用三氟乙酸混合溶液液切割，最终得到单一的多肽粗品。
如此，经过四步反应，17个肽链长度，序列不同的多肽则单一地被合成出来。
实施例4 合成17个肽链长度、C端首氨基酸不同且序列不同的多肽
17种多肽分别含有不同的C端氨基酸与不同的肽链长度及多肽序列。它们的多肽序列分别为(单字母氨基酸缩写)：
第一肽 A-L-A-A-A
第二肽 A-R-A-A
第三肽 L-A-L-A-F
第四肽 R-L-A-F
第五肽 R-A-R-A-F
第六肽 L-A-R-H
第七肽 R-L-A-R-H
第八肽 A-L-R-H
第九肽 R-R-R-R-L
第十肽 L-L-R-L
第十一肽 R-A-R-R-L
第十二肽 L-A-L-L
第十三肽 A-L-R-L-Y
第十四肽 L-L-L-Y
第十五肽 A-R-R-L-Y
第十六肽 R-A-L-Y
第十七肽 A-R-L-Y
将所有多肽序列输入到计算机程序中，计算出所用氨基酸的种类(指连接到载体上的氨基酸，如这里Ala、Phe、His、Leu、Tyr则不计算入内)。由于C端氨基酸不同，首先要列出所有C端氨基酸相同的序列，单一地向多肽反应器2中加入氨基酸载体与多肽芯片1编码，输入单一指令。等所有的树脂加入与多肽芯片1编码，指令完毕后，则可按照多肽芯片1的指令逐步将每一多肽合成出来。
除C端氨基酸外，本实施例中的其他氨基酸都与实施例1相同，剩余的反应与步骤将不因C-端第一个氨基酸的不同而与实施例1有所不同。故可重复实施例1完成17个具有不同肽链长度与不同C端氨基酸的多肽。
实施例5 合成N个(几千、几万…)具有不同肽链长度与C端氨基酸的高通量多肽
参考实施例4，首先逐一地按照含有共同C端氨基酸肽链的多肽归类，依次加入氨基酸树脂、多肽芯片1到多肽反应器2中，逐一地编码与输入特殊指令于每一多肽芯片1，如此，完成所有N个多肽序列。
参考实施例1，一步一步地按照每个多肽芯片1的指令将所有反应做完，直到最后一步反应、最后一个多肽的完成。
由于多肽芯片1的完整性，在N个多肽序列中，如果第M个多肽反应器2在第X步反应中被遗忘或漏掉了，在任何时候多肽芯片1会重新指导此M多肽的继续反应。整个N个多肽的反应次序并不受此影响。唯一的影响是第M个多肽要晚几个小时或几天(根据遗忘的时间)去完成，而其他所有的多肽则不受影响。
Claims (11)
1.一套多肽合成装置，其特征在于它由能够携带多肽序列和指导、检测多肽合成进度的多肽芯片(1)、耐酸、耐碱、耐有机溶剂，携带单一多肽芯片(1)的多肽反应器(2)与快速洗脱多肽反应器(2)中试剂的多肽洗脱器(3)组成，所述多肽反应器(2)器壁有500-1000目的均匀孔径。
2.如权利要求1所述的多肽合成装置，其特征在于所述的多肽芯片(1)由感应晶片(4)、天线(6)和外壳(5)三部分构成，所述感应晶片(4)具有记忆与识别能力。
3.如权利要求2所述的多肽合成装置，其特征在于所述的多肽芯片(1)外壳由耐酸、耐碱和耐有机溶剂的材料制成。
4.如权利要求2或3所述的多肽合成装置，其特征在于所述的多肽芯片(1)外壳(5)是由高强度玻璃材料制成。
5.如权利要求1所述的多肽合成装置，其特征在于所述的多肽反应器(2)由耐酸、耐碱和耐有机溶剂的材料制成。
6.如权利要求1或5所述的多肽合成装置，其特征在于所述的多肽反应器(2)是由高密度聚丙烯材料制成。
7.如权利要求1所述的多肽合成装置，其特征在于所述的多肽洗脱器(3)由耐酸、耐碱和耐有机溶剂的材料制成。
8.如权利要求1或7所述的多肽合成装置，其特征在于所述的多肽洗脱器(3)由316不锈钢、高密度聚丙乙烯或聚四氟乙烯材料制成。
9.如权利要求1或7所述的多肽合成装置，其特征在于所述多肽洗脱器(3)的转速为1000-1500转/分。
10.一种利用权利要求1所述的多肽合成装置来高通量合成多肽的方法，其操作过程如下：
1)将所有要合成的多肽序列输入到计算机程序中，计算出所有连接到载体上氨基酸的种类；
2)分别取合适数量的多肽反应器(2)和多肽芯片(1)，使用计算机识别器，将每个多肽序列编码到每个多肽芯片(1)上形成数据库；
3)将所有的多肽反应器(2)放在一起，进行脱去Fmoc保护基的反应；30-50分钟后，滤掉脱保护基试剂，将所有多肽反应器(2)放入到多肽洗脱器(3)中甩干；拿出所有多肽反应器(2)，用试剂DMF洗涤，再放入到多肽洗脱器(3)中甩干，如此重复4-6次；根据多肽芯片(1)的指令，所有含有C端第二个氨基酸为X的多肽反应器(2)则被放入到预先活化的Fmoc-X氨基酸/偶联剂溶液中；反应80-100分钟后，将所有多肽反应器(2)放入到多肽洗脱器(3)中除去残留的氨基酸与试剂液体，重复用试剂DMF洗涤/甩脱2-4次；第一步多肽偶联反应结束，C-端的第二个氨基酸已被偶联到载体上；
4)重复进行第3)步操作，依次将C端开始的各个氨基酸偶联到载体上；
5)根据多肽芯片(1)的指令，多肽已完成所有序列与反应后，取出它们并单一地用三氟乙酸混合溶液切割，最终得到单一的多肽粗品。
11.如权利要求10所述的高通量合成多肽的方法，其特征在于其中所述的脱去Fmoc保护基的反应时间为45分钟，洗涤、甩干操作重复次数是5次；多肽反应器(2)在预先活化的Fmoc-X氨基酸/偶联剂溶液中的反应时间为90分钟，用试剂洗涤/甩脱的重复次数是3次。
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