JP2007521316A - ペプチド合成方法 - Google Patents
ペプチド合成方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2007521316A JP2007521316A JP2006522395A JP2006522395A JP2007521316A JP 2007521316 A JP2007521316 A JP 2007521316A JP 2006522395 A JP2006522395 A JP 2006522395A JP 2006522395 A JP2006522395 A JP 2006522395A JP 2007521316 A JP2007521316 A JP 2007521316A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- resin
- peptide
- peptides
- proline
- derivative
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 title description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 77
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims abstract description 57
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims abstract description 57
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 38
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 38
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 25
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims abstract description 23
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 claims abstract description 16
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 15
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 12
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims abstract description 10
- 150000003147 proline derivatives Chemical class 0.000 claims abstract description 10
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims abstract description 9
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims abstract description 9
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims abstract 2
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000003875 Wang resin Substances 0.000 claims description 12
- JFLSOKIMYBSASW-UHFFFAOYSA-N 1-chloro-2-[chloro(diphenyl)methyl]benzene Chemical compound ClC1=CC=CC=C1C(Cl)(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 JFLSOKIMYBSASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- NERFNHBZJXXFGY-UHFFFAOYSA-N [4-[(4-methylphenyl)methoxy]phenyl]methanol Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1COC1=CC=C(CO)C=C1 NERFNHBZJXXFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- BXRNXXXXHLBUKK-UHFFFAOYSA-N piperazine-2,5-dione Chemical class O=C1CNC(=O)CN1 BXRNXXXXHLBUKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 claims description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 5
- RHQDFWAXVIIEBN-UHFFFAOYSA-N Trifluoroethanol Chemical compound OCC(F)(F)F RHQDFWAXVIIEBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 claims description 3
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 claims description 2
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 claims description 2
- 238000010306 acid treatment Methods 0.000 claims description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 11
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 7
- 102100023688 Eotaxin Human genes 0.000 description 7
- 101710139422 Eotaxin Proteins 0.000 description 7
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-dimethylformamide Substances CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 1,3-diisopropylcarbodiimide Chemical compound CC(C)N=C=NC(C)C BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- -1 chlorotrityl Chemical group 0.000 description 5
- BGRWYRAHAFMIBJ-UHFFFAOYSA-N diisopropylcarbodiimide Natural products CC(C)NC(=O)NC(C)C BGRWYRAHAFMIBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 4
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- FIRHQRGFVOSDDY-UHFFFAOYSA-N ethyl 1-hydroxytriazole-4-carboxylate Chemical compound CCOC(=O)C1=CN(O)N=N1 FIRHQRGFVOSDDY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000006340 racemization Effects 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000918983 Homo sapiens Neutrophil defensin 1 Proteins 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical class N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 2
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- XXMYDXUIZKNHDT-QNGWXLTQSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-(1-tritylimidazol-4-yl)propanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21)C(N=C1)=CN1C(C=1C=CC=CC=1)(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 XXMYDXUIZKNHDT-QNGWXLTQSA-N 0.000 description 1
- LZOLWEQBVPVDPR-VLIAUNLRSA-N (2s,3r)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-[(2-methylpropan-2-yl)oxy]butanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H]([C@H](OC(C)(C)C)C)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 LZOLWEQBVPVDPR-VLIAUNLRSA-N 0.000 description 1
- JARBLLDDSTVWSM-IJAHGLKVSA-N (2s,3r)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-trityloxybutanoic acid Chemical compound O([C@H](C)[C@H](NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21)C(O)=O)C(C=1C=CC=CC=1)(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 JARBLLDDSTVWSM-IJAHGLKVSA-N 0.000 description 1
- 102100034871 C-C motif chemokine 8 Human genes 0.000 description 1
- 101710155833 C-C motif chemokine 8 Proteins 0.000 description 1
- GSNUFIFRDBKVIE-UHFFFAOYSA-N DMF Natural products CC1=CC=C(C)O1 GSNUFIFRDBKVIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 150000003862 amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000004744 butyloxycarbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- PBAYDYUZOSNJGU-UHFFFAOYSA-N chelidonic acid Natural products OC(=O)C1=CC(=O)C=C(C(O)=O)O1 PBAYDYUZOSNJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N divinylbenzene Substances C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000018474 human neutrophil peptide 1 Human genes 0.000 description 1
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 238000003402 intramolecular cyclocondensation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- AEUKDPKXTPNBNY-XEYRWQBLSA-N mcp 2 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 AEUKDPKXTPNBNY-XEYRWQBLSA-N 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylpyridin-2-amine Chemical compound CN(C)C1=CC=CC=N1 PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N thioanisole Chemical compound CSC1=CC=CC=C1 HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KRJOFJHOZZPBKI-KSWODRSDSA-N α-defensin-1 Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)NC(=O)[C@H](CSSC[C@H](NC2=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N3)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=CC=C1 KRJOFJHOZZPBKI-KSWODRSDSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/04—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length on carriers
- C07K1/042—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length on carriers characterised by the nature of the carrier
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/521—Chemokines
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
当該ペプチドのC末端にまたはそれに近接してプロリン残基またはプロリン誘導体を含む所与のペプチドまたはその誘導体を合成する方法を提供する。この方法は、(a)第一の樹脂上で、少なくとも3つの順次のアミノ酸残基またはそれらの誘導体からなる該ペプチドのC末端部分またはその誘導体を、選択したアミノ酸類、小型ペプチド類またはそれらの誘導体を順次にカップリングさせて合成する;(b)このC末端部分を該第一の樹脂から切断する;(c)該C末端部分を、ペプチド類の合成には概して好適ではあるが、当該ペプチドのC末端に位置するプロリン残基を有するペプチド類の形成には不適当な第二の樹脂に再結合させる;そして(d)前記C末端部に選択されたアミノ酸類、小型ペプチド類または誘導体類をカップリングさせることを包含する。
Description
本発明は、ペプチド合成方法に関する。
40残基までのペプチド類の化学合成は、現在では日常的作業として効率的であり、過去10年間にわたる最近の進歩は、40〜150残基の範囲内のペプチド類および小型タンパク質の合成に至っている。効率的な新規合成方法および合成に使用できるずらりと並んだ樹脂がこれに寄与してきた。
Wang,S.S.:J.Am.Chem.Soc.95(1973),1328によって開発された特殊な一樹脂(図1参照)は、産業上の標準となっており、長いペプチド類の効率的合成に有効であることが証明されている。しかし、この樹脂には、C末端アミノ酸に関していくつかの問題がある。まず、この樹脂をシステインおよびヒスチジンの保護された誘導体でエステル化すると、かなりの程度のラセミ化が起るが、これは極めて望ましくないことである。さらに、プロリンの保護された誘導体によるエステル化はうまくいくが、さらなるアミノ酸残基を付加してジペプチドを形成させたのちに、問題に遭遇する。第三のアミノ酸のカップリングに備えてそのジペプチドを脱保護すると、遊離アミノ基をもつジペプチドエステルが生じるが、これがしばしば分子内環化して、図2に示した遊離の環状ジペプチド(ジケトピペラジン)を生じる。それによるジペプチドの損失は、多くの場合に定量的であり、C末端プロリンペプチド類の合成へのWang樹脂の使用を不適当なものとする。さらに、C末端から2番目の残基がプロリン残基またはその誘導体類のいずれかである場合にも、環化が起ることも示唆されている。
C末端プロリン含有ペプチド類の合成には、極めて酸に不安定な立体障害塩化2−クロロトリチル樹脂(図3参照)の使用が推奨されている(立体的嵩高さがジケトピペラジン形成を阻害するため)。
C末端残基の上記性質の故に2−クロロトリチル樹脂を用いて、中程度の長さのおよび長いペプチドを合成するための実験が行われた。中程度の長さのペプチド(約30残基)は、C末端残基がシステインであるHNP−1であった。長いペプチドは、C末端残基がプロリンである74アミノ酸ペプチドのモルモットエオタキシンであった。
両実験は不成功であった。両ペプチドとも低収率で得られ、鎖の組立てをモニターして、両場合ともカップリング効率が低いことが示された。C末端システインのラセミ化の問題を多少とも解決すると報告されている樹脂ローディング手順を用いてWang樹脂上でHNP−1ペプチドを合成したときの状況との比較により、鎖の組立ては優れており、クロロトリチル樹脂で得られる低い収率は、この樹脂のある性質のためであると判断された。
一つの仮説は、この樹脂が酸に対して極めて不安定であるために、鎖組立ての間に樹脂からペプチドが早々と開裂してしまうというものであった。本発明者らは、モルモットエオタキシンの鎖組立ての間の当該樹脂と酸種との接触を排除することを試みて、合成条件を種々変更したが、収率の向上は達成されなかった。別の仮説は、2−クロロトリチル樹脂の何らかの性質、たとえば膨潤性がそれを長いペプチド類の組立てに不適当かつ非効率的とするというものである。
このように、2−クロロトリチル樹脂は、比較的短い(たとえば<20残基)ペプチド類の合成にのみ適合しているように思われる。今回、2−クロロトリチル樹脂でのC末端プロリン含有ペプチドに関連する諸問題が、Wang樹脂上で合成を実施するならば、多少とも解決されることが見出された。
本発明は、対象ペプチドのC末端またはそれに近接してプロリンまたはその誘導体のいずれかを含む所与のペプチドの合成方法に関するものである。この方法は、長いペプチド、たとえば少なくとも20のアミノ酸残基をもつペプチド類あるいは塩化2−クロロトリチル樹脂上では合成に問題のあるペプチド類の合成に特に適している。
「近接して」なる表現は、プロリン残基がC末端から2番目の位置にあることを意味する。
「誘導体」なる表現は、種々の置換基の置換/付加によって対応するペプチド、アミノ酸またはアミノ酸残基と相違していてよいペプチド、アミノ酸またはアミノ酸残基を指す。タンパク質合成においては、保護基をもつあるいは標識またはタグとしてまたは他の所望の目的のために機能できるように修飾された修飾アミノ酸類を使用するのが普通である。たとえば、本発明の方法において、ヒドロキシプロリンまたは他のプロリン誘導体などのアミノ酸誘導体類を使用できた。
好ましい一実施態様では、本方法は下記の工程を包含する。
(a)第一の樹脂上で、少なくとも3つの順次のアミノ酸残基またはそれらの誘導体からなる該ペプチドのC末端部分またはその誘導体を、選択したアミノ酸類、小型ペプチド類またはそれらの誘導体を順次にカップリングさせて合成する;該第一の樹脂は、該ペプチドのC末端にまたはそれに近接して位置するプロリン残基またはプロリン誘導体をもつペプチドの形成に適したものとする;
(b)かくして得られたC末端部分を該第一の樹脂から切断する;
(c)該C末端部分を、ペプチド類の合成には概して好適ではあるが、当該ペプチドのC末端にまたはそれに近接して位置するプロリン残基またはプロリン誘導体をもつペプチド類の形成には不適当な第二の樹脂に再結合させる;
(d)前記C末端部に選択されたアミノ酸類、小型ペプチド類または誘導体類をカップリングさせて、該所与のペプチドを得る。
(a)第一の樹脂上で、少なくとも3つの順次のアミノ酸残基またはそれらの誘導体からなる該ペプチドのC末端部分またはその誘導体を、選択したアミノ酸類、小型ペプチド類またはそれらの誘導体を順次にカップリングさせて合成する;該第一の樹脂は、該ペプチドのC末端にまたはそれに近接して位置するプロリン残基またはプロリン誘導体をもつペプチドの形成に適したものとする;
(b)かくして得られたC末端部分を該第一の樹脂から切断する;
(c)該C末端部分を、ペプチド類の合成には概して好適ではあるが、当該ペプチドのC末端にまたはそれに近接して位置するプロリン残基またはプロリン誘導体をもつペプチド類の形成には不適当な第二の樹脂に再結合させる;
(d)前記C末端部に選択されたアミノ酸類、小型ペプチド類または誘導体類をカップリングさせて、該所与のペプチドを得る。
本発明の方法を用いて任意の長さのペプチドを合成できるが、該方法は、少なくとも20のアミノ酸残基を有するペプチド類、すなわち「長いペプチド類」の合成に特に適している。本方法は、約150までのアミノ酸残基を有するペプチド類に特に好適である。
本発明の方法は、他の方法では定量的に得ることが困難であったペプチド類の合成を可能にする。C末端プロリン残基をもち、本発明の方法を用いて得ることのできるかかるペプチド類のうちでも、ケモカイン類、とりわけヒトケモカインIP−10、BLCおよびMCP−2が特に重要である。
上記第一の樹脂は、環状ジペプチド類の生成、とりわけジケトピペラジン化合物の生成を惹起しないように選ぶのが有利である。
本発明方法の工程(a)および/または(b)は、所定のアミノ酸残基、小型ペプチドまたはそれらの誘導体の逐次カップリングによって成し遂げればよい。これは、周知の標準的固相手順を用いて実施できる。これらの手順において、次に選択されたアミノ酸または小型ペプチドのα−アミノ基を保護基によって保護して、当該ペプチドのC末端部を支えている樹脂に、ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)などのカップリング剤とともに加える。次に、α−アミノ保護基を、ペプチド結合はそのままにしておく適当な塩基に暴露させることによって除去すれば、つぎに上記工程を反復することによって次のアミノ残基を付加させることができる。かかる手順は、たとえばW.C.ChanとP.D.White:Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis A Practical Approach(Fmoc固相ペプチド合成、実用的アプローチ)、OUP(オックスフォード大学出版局)、2000年に詳述されている。
C末端部の形成のための好ましい第一の樹脂は、塩化2−クロロトリチル樹脂またはジケトピペラジンの形成を阻害または極小化する任意の類似の樹脂である。
本発明の方法で使用でき、長いペプチドの合成のための第二の樹脂として使用すべき好ましい樹脂は、SASRINTMなる商標のもとに市販されているポリスチレン−コ−ジビニルベンゼンの4−(3−メトキシ−4−(ヒドロキシメチル)フェノキシメチル)誘導体などのベンジルエステルリンカーを有する樹脂である。特に好ましい樹脂は、Wang樹脂として知られている4−ヒドロキシメチルフェノキシメチル樹脂である。Wang樹脂類は周知であり、広く入手可能である。
第一の樹脂からの切断工程は、緩和な酸処理を用いて、たとえばジクロロメタン中20%トリフルオロエタノールを用いて、達成するのが有利である。これにより、完全に保護された(トリ)ペプチド部分を得ることができる。かくして、C末端部分が完全に保護された状態で提供され得るので、長いペプチドの合成に適した樹脂に直接にカップルさせることができる。それらの保護基は、Fmoc(9−フルオレニルメトキシカルボニル)、Nsc(2−(4−ニトロフェニルスルホニル)エトキシカルボニル)またはt−Boc(第三級ブチルオキシカルボニル)ペプチド合成に通常使用される標準的保護基であってよい。
本発明は、対象ペプチドのC末端またはそれに近接してプロリンまたはその誘導体のいずれかを含む所与のペプチドを合成することができる。
以下、本発明を、図面に関連して、ただし単なる例として、記述する。
C末端プロリン残基を含有するモルモット(gp)エオタキシンの合成が、この樹脂交換手法を用いて、精製およびジスルフィド結合形成の後に、全収率5mgで達成された。2−クロロトリチル樹脂で実施した同規模の合成では、典型的には<1mgの全収率であることを考えれば、本発明の方法の利点はまったく明らかである。
ジケトピペラジン形成を起こし易いいかなるタンパク質/ペプチドも、ここに記載した戦略を用いて組立てることができる。C末端にまたはそれに隣接してプロリンまたはプロリン誘導体を含有するポリペプチド類またはタンパク質類は、組立ての間にジケトピペラジン形成を起こし易い。ここに記述したアプローチは、かかるペプチド類の合成のために極めて効果的であろう。
[2−クロロトリチル樹脂上でのgpエオタキシンの保護されたC末端トリペプチド(Fmoc−Thr(But)−Lys(Boc)−Pro−ClTrtR)(1)の合成]
ABI 430Aペプチド合成装置を用いてペプチド合成を行なった。反応器中で、H−Pro−2−クロロトリチル樹脂(1g、0.49mmol/g、ロット番号PrT−2、Nankai Hecheng株式会社、中国)を用いた。Nsc−Lys(Boc)−OH(503mg、1mmol)を、HOCt(4ml、1mmol、GL Biochem(上海)社、中国)およびDIC(4ml、1mmol、Acros社)で15分間活性化した後、反応器に移し、30分間カップリングさせた。第二のカートリッジのNsc−Lys(Boc)−OHを同様にして活性化し、最初の溶液を排出した後の樹脂に再度カップリングさせた。
ABI 430Aペプチド合成装置を用いてペプチド合成を行なった。反応器中で、H−Pro−2−クロロトリチル樹脂(1g、0.49mmol/g、ロット番号PrT−2、Nankai Hecheng株式会社、中国)を用いた。Nsc−Lys(Boc)−OH(503mg、1mmol)を、HOCt(4ml、1mmol、GL Biochem(上海)社、中国)およびDIC(4ml、1mmol、Acros社)で15分間活性化した後、反応器に移し、30分間カップリングさせた。第二のカートリッジのNsc−Lys(Boc)−OHを同様にして活性化し、最初の溶液を排出した後の樹脂に再度カップリングさせた。
樹脂上の未反応アミノ基を無水酢酸(DMF中0.5M、10ml)でキャッピングした後、デブロック溶液(DMF中、1%DBU、20%ピペリジン)によりNsc基を除去した。
Fmoc−Thr(But)−OH(397mg、1mmol、Applied Biosystems社)を同様にして活性化し、30分間樹脂にカップリングさせ、続いて、先と同じアミノ酸を再カップリングさせた。カップリング後、樹脂をDMFで、次にDCMで洗い、真空下で乾燥して、1.21gの(1)を得た。
さらに1gの樹脂を用いて上記合成を反復して、首記の樹脂1.18gを得た。両バッチの樹脂を合わせて、その後の作業に用いた。
[Fmoc−Thr(But)−Lys(Boc)−Pro−OH(2)の切断および単離]
ペプチド樹脂(1)を、トリフルオロエタノール(20%)のDCM溶液(50ml)中で60分間撹拌した。樹脂が暗緑色になった。この溶液をろ過し、減圧下に蒸発させて、油状物を得て、これを冷ジエチルエーテル/ヘキサンを用いて粉末化した。溶媒を蒸発させ、新鮮なヘキサンを加えて、固体を生じさせ、これより溶媒を再度蒸発により除去した。白色固体(400mg、0.55mmol)を得た。マススペクトロメトリーエレクトロスプレー正イオンが、723.4に見出された。C39H54N4O9に対する予測は722.4kD。
ペプチド樹脂(1)を、トリフルオロエタノール(20%)のDCM溶液(50ml)中で60分間撹拌した。樹脂が暗緑色になった。この溶液をろ過し、減圧下に蒸発させて、油状物を得て、これを冷ジエチルエーテル/ヘキサンを用いて粉末化した。溶媒を蒸発させ、新鮮なヘキサンを加えて、固体を生じさせ、これより溶媒を再度蒸発により除去した。白色固体(400mg、0.55mmol)を得た。マススペクトロメトリーエレクトロスプレー正イオンが、723.4に見出された。C39H54N4O9に対する予測は722.4kD。
[(2)をWang樹脂にカップリングさせてのFmoc−Thr(But)−Lys(Boc)−Pro−O−Wang樹脂(3)の生成]
保護されたトリペプチド(2)(400mg、0.55mmol)を極小量(<2ml)のDMFに溶解させ、DIC(86μl、0.55mmol)を加えて活性化させ、15分間超音波処理した。
保護されたトリペプチド(2)(400mg、0.55mmol)を極小量(<2ml)のDMFに溶解させ、DIC(86μl、0.55mmol)を加えて活性化させ、15分間超音波処理した。
Wang樹脂(800mg、0.56mmol、ロット番号W−34、Nankai Hecheng株式会社、中国)を極小量のDMF中で、ちょうど自由流動性となるまで膨潤させ、ジメチルアミノピリジン(結晶数個)を加えた。活性化ペプチド溶液(2)を加え、カップリング反応を4時間超音波処理下に実施した。この混合物を次にろ過し、樹脂をDMF、DCMおよびジエチルエーテルで順次洗浄した。樹脂を真空下で乾燥して、最終収量1.0gを得た。この樹脂についてFmocローディング試験を行なったところ、最終ローディングは0.162mmol/gであった。イズミヤ試験を利用して、Wang樹脂へのトリペプチドのローディングがラセミ化を伴っていないことが確認された。
[Wang樹脂上でのgpエオタキシンの合成]
500mg、0.081mmolの樹脂(3)を用いて、gpエオタキシンの合成を行なった。1mmolのアミノ酸、HOCt(2ml、1mmol)およびDIC(2ml、1mmol)を用いて、ABI合成装置で、標準的カップリングサイクルを順次実施した。ただし、
(a)つぎのアミノ酸Fmoc−Thr(Trt)−OHは、樹脂での先行キャッピング工程なしに、カップリングさせ、
(b)N末端アミノ酸Fmoc−His(Trt)−OHは、HOCtの代わりに2mmolのHOBtを用いてカップリングさせた。
最終のFmoc基は、精製用タグとして樹脂上に維持した。
500mg、0.081mmolの樹脂(3)を用いて、gpエオタキシンの合成を行なった。1mmolのアミノ酸、HOCt(2ml、1mmol)およびDIC(2ml、1mmol)を用いて、ABI合成装置で、標準的カップリングサイクルを順次実施した。ただし、
(a)つぎのアミノ酸Fmoc−Thr(Trt)−OHは、樹脂での先行キャッピング工程なしに、カップリングさせ、
(b)N末端アミノ酸Fmoc−His(Trt)−OHは、HOCtの代わりに2mmolのHOBtを用いてカップリングさせた。
最終のFmoc基は、精製用タグとして樹脂上に維持した。
[gpエオタキシンの切断、精製および単離]
鎖組立ての後、Fmoc−ペプチドを、EDT/H2O/TIS/チオアニソール/TFA(0.5/1.0/0.2/0.2/10ml)により、0℃で、窒素下で4時間かけて切断した。ろ過して、樹脂を除去し、ペプチドを冷エーテル中へ沈殿させ、遠心分離した。これを、G50セファデックスゲルろ過およびHPLCによって精製し、アミノ末端のFmoc基を、CH3CN/H2O(1:1)中20%のピペリジンを用いてタンパク質から切断した。DTTを加えて、各Cys残基の側鎖を還元し、切断されたFmocをゲルろ過により除去して、純粋な還元型ペプチドを得た。これを、50mMトリス、pH8.0、0.5mM GSH/0.5mM GSSG中でフォールディングさせ、HPLCでモニターした。フォールディング(折りたたみ)の完了には、約1週間を要した。
鎖組立ての後、Fmoc−ペプチドを、EDT/H2O/TIS/チオアニソール/TFA(0.5/1.0/0.2/0.2/10ml)により、0℃で、窒素下で4時間かけて切断した。ろ過して、樹脂を除去し、ペプチドを冷エーテル中へ沈殿させ、遠心分離した。これを、G50セファデックスゲルろ過およびHPLCによって精製し、アミノ末端のFmoc基を、CH3CN/H2O(1:1)中20%のピペリジンを用いてタンパク質から切断した。DTTを加えて、各Cys残基の側鎖を還元し、切断されたFmocをゲルろ過により除去して、純粋な還元型ペプチドを得た。これを、50mMトリス、pH8.0、0.5mM GSH/0.5mM GSSG中でフォールディングさせ、HPLCでモニターした。フォールディング(折りたたみ)の完了には、約1週間を要した。
折りたたまれたペプチドをHPLCによって精製して、純粋で、折りたたまれたペプチドを得た。(エレクトロスプレーマススペクトロメトリー;予測質量8356.9Da、実測値8353.9Da)。
Claims (11)
- 当該ペプチドのC末端にまたはそれに近接してプロリン残基またはプロリン誘導体を含む所与のペプチドまたはその誘導体を合成する方法であって、下記の諸工程を包含する該方法。
(a)第一の樹脂上で、少なくとも3つの順次のアミノ酸残基またはそれらの誘導体からなる該ペプチドのC末端部分またはその誘導体を、選択したアミノ酸類、小型ペプチド類またはそれらの誘導体を順次にカップリングさせて合成する;該第一の樹脂は、該ペプチドのC末端にまたはそれに近接して位置するプロリン残基またはプロリン誘導体をもつペプチドの形成に適したものとする;
(b)かくして得られたC末端部分を該第一の樹脂から切断する;
(c)該C末端部分を、ペプチド類の合成には概して好適ではあるが、当該ペプチドのC末端にまたはそれに近接してプロリン残基またはプロリン誘導体をもつペプチド類の形成には不適当な第二の樹脂に再結合させる;
(d)前記C末端部に選択されたアミノ酸類、小型ペプチド類または誘導体類をカップリングさせて、該所与のペプチドを得る。 - 該ペプチドが長いペプチドである請求項1に記載の方法。
- 該所与のペプチドが、そのC末端にまたはそれに近接してプロリン残基またはプロリン誘導体をもつケモカインである請求項1または2に記載の方法。
- 該第一の樹脂を、環状ジペプチド、とりわけジケトピペラジン化合物の生成をもたらさないように選択する請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 該工程(a)および/または(b)を、所定のアミノ酸残基類または誘導体類の逐次カップリングによって達成する請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- C末端部分生成用の該第一の樹脂が塩化2−クロロトリチル樹脂である請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 該第二の樹脂が、ベンジルエステルリンカーをもつタイプの樹脂である請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 該第二の樹脂がWang樹脂である請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- 該所与のペプチドが150アミノ酸残基に至るまでのものである請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- 当該切断工程を、緩和な酸処理、たとえばジクロロメタン中の20%トリフルオロエタノールを用いて達成する請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
- 該C末端部分が完全に保護されていて、第二の樹脂に直接結合させることができる請求項1〜10のいずれかに記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GBGB0318205.2A GB0318205D0 (en) | 2003-08-02 | 2003-08-02 | Synthetic method |
PCT/GB2004/003312 WO2005014640A1 (en) | 2003-08-02 | 2004-07-30 | Method of peptide synthesis |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2007521316A true JP2007521316A (ja) | 2007-08-02 |
Family
ID=27799747
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2006522395A Withdrawn JP2007521316A (ja) | 2003-08-02 | 2004-07-30 | ペプチド合成方法 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7645858B2 (ja) |
EP (1) | EP1648930B1 (ja) |
JP (1) | JP2007521316A (ja) |
AT (1) | ATE435236T1 (ja) |
AU (1) | AU2004263355A1 (ja) |
CA (1) | CA2534143A1 (ja) |
DE (1) | DE602004021814D1 (ja) |
GB (1) | GB0318205D0 (ja) |
WO (1) | WO2005014640A1 (ja) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
USRE46830E1 (en) | 2004-10-19 | 2018-05-08 | Polypeptide Laboratories Holding (Ppl) Ab | Method for solid phase peptide synthesis |
EP2971166B1 (en) | 2013-03-14 | 2021-05-19 | Children's Medical Center Corporation | Psap peptide for treating cd36 expressing cancers |
EP3122369B1 (en) | 2014-03-26 | 2022-08-31 | Children's Medical Center Corporation | Cyclic prosaposin peptides and uses thereof |
EP3272331B1 (de) | 2016-07-22 | 2018-07-04 | Evonik Degussa GmbH | Verfahren zur herstellung von siloxanen enthaltend glycerinsubstituenten |
CN115038711B (zh) * | 2021-01-04 | 2023-05-02 | 湖北健翔生物制药有限公司 | 一种阿托西班的合成方法 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS61233699A (ja) | 1985-04-10 | 1986-10-17 | Mitsubishi Petrochem Co Ltd | 新規カルシトニン |
US7265201B1 (en) * | 1995-06-23 | 2007-09-04 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Human chemotactic cytokine |
US7279304B2 (en) * | 2000-12-18 | 2007-10-09 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for preparation of macrocyclic molecules and macrocyclic molecules prepared thereby |
-
2003
- 2003-08-02 GB GBGB0318205.2A patent/GB0318205D0/en not_active Ceased
-
2004
- 2004-07-30 DE DE602004021814T patent/DE602004021814D1/de not_active Expired - Fee Related
- 2004-07-30 WO PCT/GB2004/003312 patent/WO2005014640A1/en active Application Filing
- 2004-07-30 JP JP2006522395A patent/JP2007521316A/ja not_active Withdrawn
- 2004-07-30 CA CA002534143A patent/CA2534143A1/en not_active Abandoned
- 2004-07-30 US US10/566,601 patent/US7645858B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-07-30 EP EP04767950A patent/EP1648930B1/en not_active Not-in-force
- 2004-07-30 AT AT04767950T patent/ATE435236T1/de not_active IP Right Cessation
- 2004-07-30 AU AU2004263355A patent/AU2004263355A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2534143A1 (en) | 2005-02-17 |
WO2005014640A1 (en) | 2005-02-17 |
US20060241282A1 (en) | 2006-10-26 |
EP1648930A1 (en) | 2006-04-26 |
EP1648930B1 (en) | 2009-07-01 |
DE602004021814D1 (de) | 2009-08-13 |
US7645858B2 (en) | 2010-01-12 |
ATE435236T1 (de) | 2009-07-15 |
GB0318205D0 (en) | 2003-09-03 |
AU2004263355A1 (en) | 2005-02-17 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4405594B2 (ja) | 改良型固相ペプチド合成及びかかる合成において利用するための試薬 | |
RU2515555C2 (ru) | Способ получения дегареликса | |
KR102397271B1 (ko) | Amg 416의 제조 방법 | |
AU2011201848B2 (en) | Peptide production and purification process | |
CN101899092B (zh) | 一种新型肽-链接基-缀合物及其固相合成方法 | |
KR20100036326A (ko) | 프람린타이드의 생산 방법 | |
EP3765488A1 (en) | Process for the manufacture of pthrp analogue | |
TW200806686A (en) | Producing method of thioester compound of peptide | |
Nakamura et al. | Synthesis of peptide thioesters via an N–S acyl shift reaction under mild acidic conditions on an N‐4, 5‐dimethoxy‐2‐mercaptobenzyl auxiliary group | |
JP2022527041A (ja) | プレカナチドを製造する改善された方法 | |
JP2007521316A (ja) | ペプチド合成方法 | |
JP2004513191A (ja) | ペプチドおよび小分子有機合成用の新しいリンカーに基づく固相支持体 | |
US20080194872A1 (en) | Purification of polypeptides | |
EP1511760B1 (en) | Carboxy protection strategies for acidic c-terminal amino acids in chemical ligation of oligopeptides | |
JP4878031B2 (ja) | 固相ペプチド合成法 | |
CZ289747B6 (cs) | Nalfa-2-(4-Nitrofenylsulfonyl)ethoxykarbonyl-aminokyseliny, způsob jejich přípravy a jejich pouľití | |
JPH1067796A (ja) | 環状ペプチドの合成法 | |
Fulcher | From Therapeutic Discovery to Structural Biology: Applications of Chemical Protein and Peptide Synthesis | |
KR100385096B1 (ko) | 고체상반응을통한아자펩티드유도체의제조방법 | |
JP2022516350A (ja) | 新規キャッピングおよび捕捉試薬の使用によるhplc不要のペプチド精製 | |
WO2023234860A1 (en) | Process for preparing glucagon-like peptide-1 | |
US20110046348A1 (en) | Methods of preparing peptide derivatives | |
Camarero et al. | A Fmoc-compatible Method for the Solid-Phase Synthesis of Peptide C-Terminal (alpha)-Thioesters based on the Safety-Catch Hydrazine Linker |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070725 |
|
A761 | Written withdrawal of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 Effective date: 20090217 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20090217 |