KR102397271B1 - Amg 416의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

AMG 416, 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염의 제조 방법이 제공된다. AMG416은 칼슘 감지 수용체의 합성, 8개 아미노산 선택적 펩타이드 작동제이다. 이는 만성 신장 질환-미네랄 및 뼈 장애(CKD-MBD)를 갖는 투석 환자에서 이차적 부갑상샘항진증(SHPT)의 정맥내 치료로서 개발되고 있다.

Description

AMG 416의 제조 방법{METHOD FOR PREPARING AMG 416}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2014년 4월 3일 출원된 U.S. 가출원 번호 61/974,899의 이익을 청구하며, 그 내용은 이들의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
서열목록에 대한 참조
서열목록은 2015년 4월 3일에 생성되고 "0419250488seqlist.txt"로 명명된 텍스트 파일(2531 바이트) 형태로 EFS를 통해 전자 제출되며, 그 내용은 이들의 전체가 본원에 참조로 포함된다.
분야
본 개시는 폴리펩타이드 합성 분야, 보다 구체적으로 AMG 416, 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염의 합성에 관한 것이다.
AMG416은 칼슘 감지 수용체의 합성, 8개 아미노산 선택적 펩타이드 작동제이다. 이는 만성 신장 질환-미네랄 및 뼈 장애(CKD-MBD)를 갖는 투석 환자에서 이차적 부갑상샘항진증(SHPT)의 정맥내 치료로서 개발되고 있다.
AMG 416의 하이드로클로라이드 염은 하기 화학 구조를 갖는다:
Figure 112016106595085-pct00001
(서열번호 1)
주 사슬은 7개 아미노산을 가지며, 모두 D-배치이다. 측쇄 시스테인 잔기는 L-배치이다. AMG 416(자유 염기)의 분자식은 C38H73N21O10S2이며, 1048.3 Da의 산출 평균 분자량을 갖는다.
AMG 416 및 그 제조 방법은 국제 특허 공개 번호 WO 2011/014707에 기재되며, 이는 임의의 목적을 위해 참조로 본원에 포함된다. 국제 특허 공개 번호 WO 2011/014707에 기재된 바와 같이, AMG 416은 대응하는 Fmoc-보호된 D-아미노산으로부터 고상 합성에 의해 어셈블리될 수 있다. 수지로부터의 절단 후, 물질은 Boc-L-Cys(NPyS)-OH로 처리되어 디설파이드 결합을 형성할 수 있다. 이어서 Boc 기는 트리플루오로아세테이트(TFA)로 제거되고 생성 산물은 역상 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 정제되고, 동결건조에 의해 TFA 염 형태로서 단리될 수 있다. TFA 염은 후속 염 교환 절차를 수행함으로써 약학적으로 허용 가능한 염으로 전환될 수 있다. 이러한 절차는 당분야에 널리 공지되어 있으며, 예로 이온 교환 기법이 포함되며, 선택적으로 생성 산물의 정제(예를 들어 역상 액체 크로마토그래피 또는 역삼투)가 뒤따른다.
AMG 416, 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염(예로, AMG 416 HCl)의 효율적인 생산 방법, 특히 상업적 규모의 제조를 위해 적절한 방법이 필요하다.
상술된 문제의 측면에서, 다른 것들 중에서 AMG 416, 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염의 제조 방법을 제공하는 것이 본 개시의 목표이다.
제1 측면에서, AMG 416의 제조 방법으로서, Fmoc-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-[수지](서열번호 2) 및 Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-[수지](서열번호 3)로 이루어진 군으로부터 선택된 구조를 갖는 수지-결합된 펩타이드를 제공하는 단계; 고체 지지체로부터 펩타이드를 절단하는 단계; 및 절단된 펩타이드의 D-Cys 잔기의 측쇄를 활성화하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
제1 측면에 관련된 하나 이상의 구현예에서, 절단 및 활성화 단계는 동일한 용기에서 일어난다.
하나 이상의 추가 구현예에서, 수지-결합된 펩타이드는 물, 트리플루오로아세트산, 트리이소프로필실란 및 디피리딜디설파이드를 포함하는 용액과 접촉된다.
제2 측면에서, AMG416의 제조 방법으로서, Ac-D-Cys(SPy)-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2(서열번호 4)의 구조를 갖는 펩타이드를 제공하는 단계; 및 펩타이드를 L-Cys과 접촉시켜 콘주게이션된 산물을 생산하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
제2 측면과 관련된 일부 구현예에서, 펩타이드는 L-Cys 및 트리플루오로아세트산을 포함하는 수성 용액과 접촉된다.
제2 측면과 관련된 일부 추가 구현예에서, 방법은 추가로 콘주게이션된 산물을 동결건조하는 단계를 포함한다.
일부 추가 구현예에서, 제2 측면의 방법은 추가로 콘주게이션된 산물과 이소프로필 알코올(IPA) 및 염화수소산(HCl)을 포함하는 수성 용액을 접촉시켜서 AMG 416 HCl을 포함하는 침전물을 생산하는 단계를 포함한다.
제2 측면과 관련된 하나 이상의 추가 구현예에서, 방법은 추가로 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 침전물을 정제하는 단계를 추가로 포함한다.
제3 측면에서, AMG 416의 제조 방법으로서, Fmoc-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-[수지](서열번호 2) 및 Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-[수지](서열번호 3)로 이루어진 군으로부터 선택된 구조를 갖는 수지-결합된 펩타이드를 제공하는 단계; 고체 지지체로부터 펩타이드를 절단하고, 즉 지지되지 않은 펩타이드를 제공하고, 지지되지 않은 펩타이드의 D-Cys 잔기의 측쇄를 활성화하여 AMG 416 SPy 중간체를 생성하는 단계(여기서 SPy는 2-피리딘설페닐 또는 S-Pyr임), 수성 0.1% TFA(트리플루오로아세트산 용액) 중에 AMG 416 SPy 중간체를 용해하는 단계, 및 HPLC에 의해 AMG 416 SPy 유도체를 정제하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
제3 측면과 관련된 일부 구현예에서, 방법은 추가로 AMG 416 SPy 중간체를 공비 증류하여 용매 교환을 실시함으로써 신규 용매, 예로 물 및 이소프로필 알코올 중에 AMG 416 SPy 용액을 생산하는 단계를 포함한다.
제3 측면과 관련된 일부 추가적인 구현예에서, 방법은 추가로 이소프로필 알코올 - AMG 416 SPy의 물 용액을 접촉시키는 단계를 포함하며, 일부 구현예에서 그 트리플루오로아세테이트 염 형태로, L-Cys를 포함하는 수성 용액과 접촉시키는 단계를 포함한다.
제4 측면에서, H-D-Arg(Pbf)-OH, 즉 본원에 제공된 일정한 합성 방법을 위해 적합한 원료의 제조 방법이 제공된다.
제4 측면과 관련된 일부 구현예에서, 방법은 NaI(나트륨 요오다이드)의 존재 하에 Boc-D-Arg-OH를 Boc-D-Arg(Pbf)-OH로 전환시키는 단계를 포함한다. 일부 추가 구현예에서, 나트륨 요오다이드는 약 5% 몰 농도로 존재한다.
제4 측면과 관련된 일부 추가적인 구현예에서, 방법은 추가로 Boc-D-Arg(Pbf)-OH를 D-Arg(Pbf)-OH로 전환시키고, D-Arg(Pbf)-OH를 IPA/물 용매 시스템 중에 결정화하는 단계를 포함한다.
본원에 기재된 방법의 추가적인 구현예는 하기 기재, 실시예 및 청구범위로부터 자명할 것이다. 상기 및 하기 기재로부터 이해될 수 있는 바와 같이, 본원에 기재된 각각의 모든 특징 및 둘 이상의 이러한 특징의 각각의 모든 조합은 이러한 조합에 포함된 특징이 상호 일관되는 한, 본 개시의 범위 내에 포함된다. 또한, 임의의 특징 또는 특징의 조합은 본 발명의 임의의 구현예로부터 구체적으로 배제될 수 있다.
도 1은 AMG 416(Ac-D-Cys(L-Cys-OH)-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2)(서열번호 1)의 화학 구조를 나타낸다.
도 2는 Rink 아미드 AM 수지 및 Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-수지(서열번호 3)의 화학 구조를 나타낸다.
도 3은 SPy 중간체 산물(Ac-D-Cys(SPy)-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2)(서열번호 4)이 펩티딜-수지(Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH-수지)(서열번호 3)로부터 형성되는 반응식을 나타낸다.
도 4는 AMG 416의 TFA 염이 SPy 중간체(AA1-7( SPy ))로부터 형성되는 반응식을 나타낸다.
도 5는 AMG 416의 HCl 염이 AMG 416의 TFA 염으로부터 형성되는 반응식을 나타낸다.
도 6은 Boc-D-Arg(Pbf)-OH가 Boc-D-Arg-OH로부터 형성되는 반응식을 나타낸다.
도 7은 D-Arg(Pbf)-OH가 Boc-D-Arg(Pbf)-OH로부터 형성되는 반응식을 나타낸다.
이제 본 개시를 보다 상세히 이후에서 설명할 것이다. 그러나 상기 개시는 여러 상이한 형태로 구현될 수 있고, 본원에 나타낸 구현예에 제한되는 것으로 간주되어서는 안 된다; 오히려 이들 구현예는 본 개시가 철저하고 전체적이며 당분야 숙련가에게 그 범위를 충분히 전달하도록 제공된다.
상기 또는 하기에 있는지와 무관하게, 본원에 인용된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 달리 나타내지 않는 한, 본원에 이들의 전문이 참조로 포함된다. 동일한 용어가 본원에 참조로 포함된 공보, 특허 또는 특허 출원에서 그리고 본 개시에서 모두 정의되는 경우, 본 개시에서의 정의가 우선하는 정의를 나타낸다. 특정 유형의 화합물, 펩타이드, 화학 등의 설명을 위해 참조되는 공보, 특허 및 특허 출원에 있어서, 이러한 화합물, 화학 등에 관한 부분은 본원에 참조로 포함되는 문서의 부분이다.
본원에서 이용되는 섹션 제목은 단지 구성상의 목적을 위한 것이며, 기재된 대상물을 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다.
본원에서 다르게 정의되지 않는 한, 본 출원에 관해 이용되는 과학적 및 기술적 용어는 당업자에게 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥 상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어에는 복수가 포함되며, 복수 용어에는 단수가 포함되어야 한다.
일반적으로, 본원에 기재된 분자 생물학 및 단백질 화학에 관해 이용되는 명명법 및 기법은 당분야에 널리 공지되고 일반적으로 이용되는 것들이다. 본 출원의 방법 및 기법은 달리 나타내지 않는 한, 일반적으로 당분야에 널리 공지된 통상적 방법에 따라 그리고 본 출원을 통해 인용되고 논의되는 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참고문헌에 기재된 바와 같이 수행된다. 예로, 임의의 목적을 위해 참고문헌으로 본원에 포함되는 [Laszlo, Peptide-Based Drug Design: Methods and Protocols, Humana Press(2008); Benoiton, Chemistry of Peptide Synthesis, CRC Press(2005); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates(1992)]를 참고하라. 정제 기법은 당분야에서 일반적으로 수행되는 바와 같이 또는 본원에 기재된 바와 같이, 제조업체의 사양에 따라 수행된다. 본원에 기재된 분석 화학, 합성 유기 화학 및 의학 및 약학 화학에 관해 이용되는 용어 그리고 실험실 절차 및 기법은 당분야에 널리 공지되고 일반적으로 이용되는 것들이다. 표준 기법이 화학적 합성, 화학적 분석, 약학적 제조, 제형화 및 전달 그리고 환자의 치료를 위해 이용될 수 있다.
상기 개시는 본원에 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약 등에 제한되지 않으며 그와 같이 변할 수 있음이 이해되어야 한다. 본원에서 이용되는 용어는 단지 특정 구현예를 설명하는 목적을 위한 것이며, 개시된 범위를 제한하려는 것이 아니고, 이는 청구범위에 의해서만 정의된다.
특히 주어진 양에 대한 용어 "약"은 + 또는 - 5%의 일탈을 포괄하는 것을 의미한다.
I. 일반 정의
본원에서 이용되는 단수 표현은 구체적으로 달리 나타내지 않는 한, 하나 또는 하나를 초과하는(즉, 하나 이상의) 문법적 대상체를 나타낸다. 예로서, "하나의 요소"는 하나의 요소 또는 하나를 초과하는 요소를 의미한다.
이전에 벨칼세티드 또는 KAI-4169로 알려져 있는 에텔칼세티드로도 알려져 있는 용어 "AMG 416"은 하기 구조식을 갖는, L-시스테임을 포함하는 화학명: N-아세틸-D-시스테이닐-D-알라닐-D-아르기닐-D-아르기닐-D-아르기닐-D-알라닐-D-아르긴아미드 디설파이드를 갖는 화합물을 나타낸다:
Figure 112016106595085-pct00002
본원에 기재된 AMG 416, 또는 임의의 화합물 또는 AMG 416 단편, 중간체, 또는 전구체에 대한 언급은 이들의 중성, 비하전 형태뿐만 아니라 이들의 약학적으로 허용 가능한 염, 수화물 및 용매화물을 포괄하려는 것이다.
용어 "AMG 416 하이드로클로라이드" 및 "AMG 416 HCl"은 상호 교환적이며, 하기 구조식을 갖는 AMG 416의 하이드로클로라이드 염 형태를 나타낸다:
Figure 112016106595085-pct00003
일반적으로, x는 3-5(예로, 3, 4 또는 5)의 값을 갖는다.
"약학적으로 허용 가능한 염"은 환자에게 유의미한 유해 독성 효과를 유도하지 않는 염 형성을 위해 적합한 적어도 하나의 기를 갖는 화합물의 염 형태를 나타낸다. 하나의 측면에서, 용어 "약학적으로-허용 가능한 염"은 본원에 제공된 바와 같은 화합물의 상대적으로 비독성인, 무기 또는 유기 산 부가 염, 예로 하나 이상의 이온화 가능한 아민기를 보유하는 AMG 416뿐만 아니라 AMG 416 단편, 중간체, 전구체 등을 나타낼 수 있다. 대표적인 염에는 하이드로브로마이드, 하이드로클로라이드, 설페이트, 비설페이트, 포스페이트, 니트레이트, 아세테이트, 발레레이트, 올레에이트, 팔미테이트, 스테아레이트, 라우레이트, 벤조에이트, 락테이트, 포스페이트, 토실레이트, 시트레이트, 말레에이트, 푸마레이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 나프틸레이트, 메실레이트, 글루코헵토네이트, 락토바이오네이트 및 라우릴설포네이트 염 등이 포함된다(예를 들어, [Berge et al. (1977) "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci. 66:1-19] 참고). 추가적으로 적합한 약학적으로 허용 가능한 염 형태는, 예로 [Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use, Weinheim/Zuerich:Wiley-VCH/VHCA, 2002; P. H. Stahl and C. G. Wermuth, Eds.]에서 확인될 수 있다.
본원에서 이용되는 용어 "아미노산" 및 "잔기"는 상호 교환적이며, 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 맥락에서 이용되는 경우, 천연 생성 및 합성 아미노산 둘 모두뿐만 아니라 아미노산 유사체, 아미노산 모사체 및 천연 생성 아미노산과 화학적으로 유사한 비-천연 생성 아미노산을 모두 나타낸다. "자유 아미노산" 또는 "자유 아미노기"는 -NH2의 형태인, 즉 보호되지 않은 아미노기를 갖는 아미노산, 펩타이드 단편, 또는 펩타이드를 나타낸다.
본원에서 이용되는 어구 "보호기" 또는 "PG"는 원하지 않는 화학적 변환으로부터 잠재적으로 반응성인 작용기를 보호하는 일시적 치환체 또는 치환체들을 나타낸다. 이러한 보호기의 예에는 각각 카복실산의 에스테르, 알코올의 실릴 에테르 및 알데하이드 및 케톤의 아세탈 및 케탈이 포함된다. 예로, [Greene, T.W.; Wuts, P.G.M. Protective Groups in Organic Synthesis, 4th ed.; Wiley: New York, 2007; Isidro-Llobet, A., et al., Amino Acid-Protecting Groups, Chem. Rev 2009, 109, 2455-2504]를 참고하라. 본원에 기재된 바와 같은 반응성 아미노산 또는 펩타이드 단편은 종종 적합하게는 대상 화학적 변환의 표적이 아닌 하나 이상의 보호기 또는 관능부를 함유한다. 예시적인 보호기에는, 예로 벤질옥시카보닐("Cbz" 또는 "Z")로도 불리는 카복시벤질, 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc), 2,2,4,6,7-펜타메틸디하이드로벤조푸란-5-설포닐(Pbf), tert-부틸옥시카보닐(Boc), 트리틸(Trt), 메틸 에스테르(OMe), 2-피리딘설페닐(SPy 또는 S-Pyr), 아미드 등이 포함된다. 본원에 제공되는 단축 구조에서, C-말단에서의 -NH2는 아미드 보호기(~C(O)NH2)를 표시하며, N-말단에서의 "H"는 자유 아미노기를 나타내고, 괄호 안의 보호기의 명명은 보호기가 오르니틴의 δ 질소 상에 있음을 표시한다.
본원에서 이용되는 용어 "보호 제거제" 또는 "탈보호제"는 상호 교환적으로 이용될 수 있으며, 아미노산 상에 연결된 아미노-보호제를 제거하기 위한 화학적 시약이며, 아미노-보호제는 당분야에 널리 공지된 것들, 예컨대 비제한적으로 Fmoc 및 Boc일 수 있다.
본원에서 상호 교환적으로 이용되는 용어 "커플링제", "축합제", "활성화제", "축합 활성화제"는 하나의 아미노산으로부터 아미노기의 또 다른 아미노산으로부터의 카복실기와의 반응을 촉진하여 펩타이드 결합을 형성하는 화학적 시약을 나타낸다. 예시적인 커플링제는 당분야에 널리 공지되어 있고, 비제한적으로 카보디이미드, 예컨대 N,N'-디이소프로필카보디이미드(DIC), 디사이클로헥실카보디이미드(DCC), 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥사이드 헥사플루오로포스페이트(HATU), [벤조트리아졸-1-일옥시(디메틸아미노)메틸리덴]-디메틸아자늄;테트라플루오로보레이트(TBTU), N,N,N',N'-테트라메틸-O-(1H-벤조트리아졸-1-일)우로늄 헥사플루오로포스페이트, O-(벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HBTU), 및 N,N-디이소프로필에틸 아민(DIPEA)이 포함된다. 예로, [El-Faham, A. and Albericio, F., "Peptide Coupling Reagents, More than a Letter Soup", Chem . Rev. 2011, 111, 6557-6602]를 참고하라. 이러한 화합물은 상업적 공급업체로부터 쉽게 이용 가능하다.
본원에서 이용되는 용어 "절단제"는 수지에 결합된 펩타이드를 수지로부터 분리시킬 수 있는 화학적 제제를 나타낸다. 절단제는 당업자에게 널리 공지되어 있으며, TFA 및 HCl 용액을 포함하는 산 용액이 포함된다.
용어 "처리"는 임의의 객관적 또는 주관적 파라미터, 예컨대 폐지, 경감; 징후 또는 증상의 감소 또는 손상, 병리 또는 상태를 환자가 더 관용 가능하게 만듦; 퇴행 또는 감소 속도의 지연; 최종 퇴행 지점을 덜 쇠약하게 만듦; 환자의 신체적 또는 정신적 웰빙을 개선함을 포함하는 손상, 병리 또는 상태의 치료 또는 완화에서의 임의의 성공 표시를 나타낸다. 징후 또는 증상의 치료 또는 완화는 신체 검사 결과를 포함하는 객관적 또는 주관적 파라미터에 기반할 수 있다. 예를 들어, 본원에 나타낸 일정한 방법은 혈청 무손상 부갑상샘 호르몬(iPTH)의 감소에 의해 CKD-MBD 투석 환자에서 SHPT를 성공적으로 치료한다.
"유효량"은 일반적으로 증상의 중증도 및/또는 빈도를 감소시키고/시키거나, 증상 및/또는 내재 원인을 제거하고/하거나, 증상 및/또는 이들의 내재 원인의 발생을 예방하고/하거나 질환 상태(예로, 상승된 PTH 수준)로부터 일어나거나 이와 연관되는 손상을 개선 또는 교정하기 충분한 양이다. "치료적 유효량"은 질환 상태 또는 증상, 특히 질환 상태와 연관된 상태 또는 증상을 구제하거나 다르게는 어떻게든 임의의 방식으로 질환 상태 또는 질환과 연관된 임의의 다른 바람직하지 않은 증상의 진행을 예방, 방해, 저지 또는 역전시키기 충분한 양이다. 전체 치료 효과는 반드시 하나의 용량 투여에 의해 일어나지는 않으며, 일련의 용량들 투여 후에만 일어날 수도 있다. 따라서, 치료적 유효량은 하나 이상의 투여로 투여될 수 있다.
본원에서 이용되는 용어 "치료적 유효 용량" 및 "치료적 유효량"은 연구자, 의사 또는 다른 임상 담당자가 추구하는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 야기하는 양, 즉 관찰 가능한 수준의 하나 이상의 원하는 생물학적 또는 의학적 반응, 예를 들어 iPTH의 저하를 뒷받침하는 벨칼세타이드의 양을 의미하며, 여기에는 치료받는 질환 또는 장애의 징후 또는 증상의 경감 또는 완화가 포함된다.
용어 "펩타이드", "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 상호 교환적이며 아미노산 잔기의 중합체를 나타낸다. 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 대응하는 천연 생성 아미노산의 유사체 또는 모사체인 아미노산 중합체뿐만 아니라 천연 생성 아미노산 중합체에도 적용된다. 용어는 또한, 예로 탄수화물 잔기의 첨가에 의해 개질되어 당단백질을 형성하거나 인산화된 아미노산 중합체를 포괄할 수 있다. 펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질은 액상 합성 또는 고상 합성에 의해 또는 유전 조작된 또는 재조합 세포에 의해 생산되고, 아미노산 서열을 갖는 분자를 포함할 수 있다.
펩타이드 또는 폴리펩타이드의 "변이체"는 하나 이상의 아미노산 잔기가 또 다른 폴리펩타이드 서열에 대해 아미노산 서열 내로 삽입되고/되거나 결실되고/되거나 치환되는 아미노산 서열을 포함한다. 변이체에는 융합 단백질이 포함된다.
펩타이드 또는 폴리펩타이드의 "유도체"는 삽입, 결실 또는 치환 변이체와 다른 일부 방식으로, 예로 또 다른 화학적 모이어티에 대한 콘주게이션을 통해 화학적으로 개질된 펩타이드 또는 폴리펩타이드이다. 이러한 개질에는 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 아미노 및/또는 카복시 말단에 대한 기의 공유 부가, 예로 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 아미노 말단의 아세틸화 및/또는 카복시 말단의 아미드화가 포함될 수 있다.
용어 "아미노산"에는 당분야에서의 그 정상적 의미가 포함된다. 20개의 천연 생성 아미노산 및 이들의 약어는 통상적 활용을 따른다. 임의의 목적을 위해 본원에 참조로 포함되는 [Immunology-A Synthesis, 2nd Edition, (E. S. Golub and D. R. Green, eds.), Sinauer Associates: Sunderland, Mass. (1991)]을 참고하라. 19개의 통상적 아미노산(글리신 제외)의 입체이성질체(예로, D-아미노산), 비천연 아미노산, 예컨대 [알파]-,[알파]-이치환 아미노산, N-알킬 아미노산, 및 다른 통상적 아미노산도 폴리펩타이드를 위해 적합한 성분일 수 있고, 어구 "아미노산"에 포함된다. 비통상적 아미노산의 예에는 하기가 포함된다: 호모시스테인, 오르니틴, 4-하이드록시프롤린, [감마]-카복시글루타메이트, [엡실론]-N,N,N-트리메틸라이신, [엡실론]-N-아세틸라이신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포르밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-하이드록시라이신, [시그마]-N-메틸아르기닌 및 다른 유사 아미노산 및 이미노산(예로, 4-하이드록시프롤린). 본원에서 이용되는 폴리펩타이드 표기법에서, 표준 활용 및 관례에 따라 왼쪽 방향이 아미노 말단 방향이며, 오른쪽 방향이 카복실-말단 방향이다.
본원에서 이용되는 "대상체" 또는 "환자"는 임의의 포유류일 수 있다. 전형적인 구현예에서, 대상체 또는 환자는 인간이다.
용어 "q.s."는 원하는 기능을 달성하기 위해, 예로 용액을 원하는 부피(즉 100%)로 만들기 충분한 양의 첨가를 의미한다.
II. 구현예
하나 이상의 구현예에서, AMG 416 하이드로클로라이드는 하기와 같은 일련의 공정 단계를 통해 제조된다: 예시적인 단계에는 AMG 416의 7-막 선형 단편의 고상 펩타이드 합성(단계 I)에 이어 동시적인 측쇄 탈보호 및 시스테인 활성화와 함께 수지로부터 펩타이드 사슬의 절단(단계 II), 이어서 L-Cys와 펩타이드 사슬의 원 위치 콘주게이션(디설파이드 형성)에 의해 조정제 AMG 416을 제공하는 단계(단계 III), 이어서 일부 구현예에서, 즉시 분취용 HPLC 및 동결건조에 의해 정제된 AMG 416 TFA 염을 제공하는 단계(단계 IV)가 포함된다. 단계 IV에는 침전에 의한 후속 염 교환(TFA → HCl), 그리고 일부 구현예에서, 마이크로여과 및 동결건조에 의해 정제된 AMG 416 하이드로클로라이드 염을 제공하는 단계(단계 V)가 뒤따른다.
고상 펩타이드 합성
AMG 416의 7-막 선형 단편은 고상 펩타이드 합성(SPPS)을 포함하는 당분야에 공지된 임의의 방법에 의해 합성될 수 있다. 본원에서 이용되는 용어 "고상 합성" 또는 "고상 펩타이드 합성"은 당업자에게 널리 공지된 방법을 나타내며, 여기서 성장하는 펩타이드 사슬은 고체 지지체에 연결된다. 고상 합성은 전형적으로 하기 단계를 포함한다: (i) 고상 담체에 대한 제1 아미노산(그 아미노기는 차단되거나 "보호됨")의 공유 결합; (ii) 탈보호제를 이용하는 아미노기로부터의 보호기 제거; (iii) 제2 아미노산(그 아미노기가 차단됨)의 카복실을 활성화하고 디펩타이드(그 아미노기가 차단됨)가 수득되도록 제2 아미노산을 고상 담체에 결합된 제1 아미노산에 접촉시킴; (iv) 펩타이드 결합 형성 단계를 반복하여 펩타이드 사슬이 C-말단에서 N-말단으로 연장됨; 및 (v) 아미노기의 보호기를 제거하고, 절단제로 고상 담체로부터 펩타이드 사슬을 분리하여 펩타이드를 산출함.
고상 합성의 적합한 기법은 당분야에 널리 공지되어 있으며, [Merrifield, in Chem . Polypeptides, pp. 335-61 (Katsoyannis and Panayotis eds. 1973); Merrifield, J. Am. Chem . Soc . 85:2149 (1963); Davis et al., Biochem . Intl . 10:394-414 (1985); Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis (1969); U.S. 특허 번호 3,941,763; Finn et al., The Proteinss, 3rd ed., vol. 2, pp. 105-253 (1976); 및 Erickson et al., The Proteins, 3rd ed., vol. 2, pp. 257-527 (1976)]에 기재된 것들이 포함된다. 또한 [Houben-Weyl, Methods of Organic Chemistry. Additional Supplementary Volumes to the 4th Ed., Vol E22A, "Synthesis of Peptides and Peptidomimetics ", Editor-in-Chief M. Goodman. Georg Thieme Verlag: Stuttgard and New York. 2002, pp. 685-877; Chan, W.C., White, P.D., " Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, A Practical Approach". Oxford University Press, (200), p. 9-109]를 참고하라. 고상 합성은 이것이 종종 소형 펩타이드를 제조하는 가장 비용 효율적인 방법 중 하나이므로, 전형적으로 AMG 416과 같은 개별 펩타이드의 바람직한 제조 기법이다.
일부 구현예에서, AMG 416의 주 사슬 선형 단편은 Fmoc-보호 전략 및 예를 들어 Sigma Aldrich에서 이용 가능한 것과 같은 Rink 아미드(RAM) 수지를 채용하는 표준 고상 펩타이드 합성 프로토콜을 이용해서 어셈블리되어 펩타이드 N-말단의 아세틸화와 함께 C-말단 수지-결합된 아미드를 제공한다. 일부 다른 구현예에서, 다른 수지 및 링커가 이용될 수 있다(예로, 트리사이클릭 아미드 링커 수지로도 불리는 Ramage 아미드 AM 수지). 하나의 구현예에서, 주 사슬 선형 단편의 어셈블리는 하기 단계를 포함한다: (i) Fmoc-Rink 아미드 AM 수지와 탈보호제를 혼합하여 Rink 아미드 AM 수지를 수득하는 단계; (ii) Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH를 Rink 아미드 AM 수지와 축합하여 Fmoc-D-Arg(Pbf)-Rink 아미드 AM 수지를 수득하는 단계; (iii) AMG 416의 주 사슬 선형 단편의 각각의 잔여 아미노산 잔기에 대해 C-말단부터 N-말단까지 진행하며(예로, Fmoc-D-Cys(Trt)-OH, Fmoc-D-Ala-OH 및 Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH를 이용함) 단계 (i)에서 Fmoc 탈보호 및 단계 (ii)에서 수지 상의 폴리펩타이드 및 아미노산 간 축합을 반복하여 서열번호 2로 나타내는 폴리펩타이드 수지를 형성하는 단계; 및 (iv) 단계 (i)에서 Fmoc 탈보호 및 N-말단의 아세틸화를 반복하여 서열번호 3으로 나타내는 폴리펩타이드 수지를 형성하는 단계. 도 2를 참고하라.
Fmoc-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-[수지]
(서열번호 2)
Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-[수지]
(서열번호 3)
전형적으로, Fmoc 보호기의 절단은 탈보호제, 예컨대 DMF 중 피페리딘을 이용해서 달성된다. 하나의 구현예에서, Fmoc-보호된 아미노산의 커플링은 용매, 예컨대 디메틸포름아미드(DMF) 중에 적합한 커플링제, 예컨대 카보디이미드 커플링제, N,N-디이소프로필카보디이미드(DIC)를, 선택적으로 시스테인을 제외한 모든 아미노산에 있어서 첨가제, 예컨대 에틸 2-시아노-2-(하이드록시이미노)아세테이트(Oxyma)의 존재 하에 이용하여 수행된다. 시스테인을 이용한 펩타이드 사슬 연장의 경우, 커플링은 전형적으로 용매 시스템, 예컨대 디메틸 포름아미드-디클로로메탄(즉 DMF, DCM, HOBt, DIC) 중 벤조트리아졸 첨가제, 예컨대 하이드록시벤조트리아졸(HOBT)의 존재 하에 N,N-디이소프로필카보디이미드(DIC)를 이용하여 수행된다.
N-말단의 아세틸화는 당분야에 공지된 임의의 방법에 의해 달성될 수 있다. 하나의 구현예에서, N-말단의 아세틸화는, 예를 들어 피리딘 및 DMF 중 아세트산 무수물(Ac2O)을 이용해서 수행된다.
수지로부터의 절단
펩타이드는 지지체로부터 분리될 수 있고, 보호기는 당분야에 공지된 임의의 수단에 의해 측쇄로부터 제거될 수 있다. 예로 [Synthetic Peptides: A User's Guide (G.A. Grant, ed.), W.H. Freeman and Company, New York, 1992; 및 Chan, W.C., White, P.D. "Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, A Practical Approach", Oxford University Press (2000), p. 64-66 및 105-109]를 참고하라.
하나의 구현예에서, 펩티딜-수지는 물(예로, 증류수(DIW)) 트리플루오로아세트산(TFA), 트리이소프로필실란(TIPS) 및 디피리딜디설파이드(DPDS)를 포함하는 칵테일 용액에 첨가된다. 이는 동시적 측쇄 탈보호 및 시스테인 활성화와 함께 펩타이드가 수지로부터 분리될 수 있도록 하여, L-Cys에 대한 원 위치 콘주게이션을 준비한다. 7-아미노산 SPy 중간체 산물(AA1-7( SPy ))이 생산된다. 도 3을 참고하라. SPy 중간체 산물의 서열은 서열번호 4에 제공된다.
Ac-D-Cys(SPy)-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2
(서열번호 4)
원 위치 콘주게이션 및 분취용 HPLC
SPy 중간체 산물은 당분야에 공지된 임의의 방법에 의해 L-Cys에 콘주게이션될 수 있다. 하나의 구현예에서, L-Cys의 콘주게이션은 수성 TFA 중에 수행된다.
생산된 AMG 416(TFA 염)은 당분야에 공지된 임의의 수단에 의해 정제될 수 있다. 하나의 구현예에서, AMG 416(TFA 염)은 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 정제된다. 예를 들어 하나의 구현예에서, AMG 416(TFA 염)의 정제 및 농축은 역상 HPLC 정제 단계 및 역상 HPLC 농축 단계를 포함한다. 도 4를 참고하라.
AMG 416(TFA 염)을 함유하는 정제되고 농축된 샘플은 동결건조될 수 있다.
염 전환
TFA 염은 당분야에 공지된 임의의 수단에 의해 약학적으로 허용 가능한 염, 예컨대 하이드로클로라이드 염으로 전환될 수 있다.
하나의 구현예에서, AMG 416의 동결건조된 TFA 염은 이소프로필 알코올(IPA)의 수성 용액 중에 용해된다. 이어서 TFA 염 용액은 염 교환 및 HCl 염의 침전을 위해 HCl 용액으로 충전된다. 그 뒤 침전물이 물로 재구성되고 마이크로-필터(예로, 0.2 ㎛ 필터)를 통해 여과되고 동결건조되어, AMG416의 HCl 염을 단리할 수 있다. 도 5를 참고하라.
SPy 중간체의 정제
대안적인 구현예에서, SPy 중간체 산물은 L-Cys에 대한 콘주게이션 전에 정제된다. 일반적으로, SPy 중간체 산물, 특히 펩타이드-SPy 중간체는 고도로 불안정한 것으로 간주된다, 즉 HPLC에 의한 것과 같은 효율적인 정제를 견디기에 충분히 안정하지 않은 것으로 여겨진다. 그러나 본원에 기재된 방법에 도달하여, 본 출원인은 예상치 못하게도 본원에 기재된 방법에 따라 제조된 펩타이드-SPy 중간체가 실제로 별도의 정제 단계를 견디기에 충분히 안정함을 발견하였다. 또한, L-Cys에 대한 콘주게이션 전에 이러한 중간체의 정제는 실제로 효율을 증가시키고 최종 펩타이드 약물 산물의 제조 비용을 감소시킬 수 있음을 추가로 발견하였다.
예시적 구현예에서, 대안적 방법은 하기와 같이 수행된다. 아래 및 실시예 5에 기재된 방법은 본원에 제공된 바와 같은 SPy 중간체의 정제를 위해 유용하며, 여기서 중간체는 안정하게 유지되며, 예로 디설파이드 결합 형성을 통해 티올-함유 모이어티에 대한 콘주게이션을 위해 적합하다. 예를 들어, 펩타이드-SPy 중간체는 약 0.2% TFA 이하, 예를 들어 약 0.05% 내지 0.15% TFA, 또는 약 0.1% TFA를 함유하는 수성 용액 중에 용해된 후, 크로마토그래피 정제를 위해 HPLC 컬럼에 직접 적용된다. 그 뒤 펩타이드-SPy 중간체를 함유하는 HPLC 분획의 용매 교환이, 예를 들어 공비 증류에 의해 수행될 수 있다. 펩타이드-SPy 중간체의 적절한 용매, 예컨대 물-이소프로판올의 혼합물 내로의 용매 교환 후, 티올-함유 모이어티, 예컨대 L-Cys이 펩타이드-SPy 중간체 용액으로 직접 첨가되어 콘주게이션을 시행한다. 그 뒤, 예로 용액 중 생성 콘주게이션된 산물을 염 교환을 위해 이용 가능하다.
상기 정제 방법의 특정한 구현예는 하기와 같다. 수지 지지체로부터 펩타이드의 최초 절단 및 AA1-7( SPy ) 중간체 산물의 단리 후, 중간체를 0.1% TFA 및 아세토니트릴 중에 용해하고, 정지상 HPLC 컬럼 상에 로딩하고, 상술된 바와 같이 정제한다. 0.1% TFA 용액의 사용은, 예를 들어 0.2% TFA 용액의 사용과 대비되는 경우, HPLC 정제를 위해 여러 장점을 갖는다. 예를 들어, 0.1% TFA는 더 높은 농도의 TFA 용액에 비해 정제 공정 동안 정지상에 덜 손상을 미친다. 즉, 최적화된 농도의 TFA를 사용함으로써, 정지상이 더 적게 분해되고, 이에 의해 정지상에 있어서 더 긴 수명을 야기한다. 또한, 펩타이드-SPy 중간체(예로, AA1-7( SPy )) 산물은 극성이 더 적어서, 역상 정지상 상에 중간체가 더 잘 보유된다. 그 결과, 각각의 정제 작업 시 정지상 상으로 더 많은 로딩이 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, 증가된 로딩능은 제조 공정의 처리량을 1.5 내지 2-배, 또는 약 1.5-배 증가시킨다.
이어서 TFA 염으로서 SPy 중간체 산물을 함유하는 HPLC 분획은 용매를 아세토니트릴 및 물로부터 L-Cys 콘주게이션 및 염 교환을 위해 적합한 IPA 용액 중 15% 물로 교환하기 충분한 IPA 전하와 함께 공비 증류를 거친다. 상기 방법은 콘주게이션 및 염 교환이 모두 단일 용기에서 수행될 수 있어서 특히 유리하며, 제조 공정의 효율 및 가능성을 추가 개선한다.
Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH 원료의 제조
AMG 416은 4개가 D-아르기닌인 7개 아미노산의 선형 서열을 포함한다. AMG 416의 합성에 이용되는 D-아르기닌의 Fmoc 유도체인 Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH의 합성 방법이 본원에 개시된다. 고품질 Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH 원료의 사용은 단계 I부터 단계 III까지 조정제 AMG 416에 추가 순도를 제공함으로써 단계 IV에서 정제 수율을 증강시킬 수 있다. 보다 중요하게는, 고품질, 고순도 원료의 사용은 바람직하고 유리한 제어 요소를 제공하여 원하는 순도의 AMG 416을 보장할 수 있다. 더 높은 수율을 생성하며, 더 적은 단위 공정을 필요로 하고, 더 강력한 품질 제어를 제공하고, 대규모 제조가 용이한 고품질 D-Arg(Pbf)-OH 및 Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH의 신규한 제조 공정이 개발되었다. 요약하면, 본원에 기재된 Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH의 제조 방법은 품질에서의 잠재적 획득이 수반되는 AMG 416 제조 가능성에서의 유의미한 증가를 나타낸다.
문헌에서 확인되는 Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH의 가장 간단한 합성 중 하나이고 Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH의 상업적 규모 합성을 위해 이용될 수 있는 합성 경로는 하기와 같다. 예로, 2012년 5월 2일의 중국 특허 번호 CN101250172B를 참고하라. 합성은 D-Arg의 아미노기를 디-tert-부틸 디카보네이트(Boc2O)로 보호함으로써 시작되어 단리 후 대략 정량적 수율로 Boc-D-Arg-OH를 산출한다. 단계 2에서, 측쇄 구아니딘기는 염기, 예컨대 수성 나트륨 하이드록사이드의 존재 하에 Pbf 기로 보호된다. 산물은 다음 단계에서 단리 없이 IPA(이소프로필 알코올) 용액으로 직접 사용된다. 단계 3은 산성 조건 하에 Boc 보호기를 제거하고, 결정형 중간체로서 대응하는 산물, D-Arg(Pbf)-OH를 단리하는 것을 포함한다. 공정의 단계 4는 아미노 관능부 상에 Fmoc 보호기를 설치하여 최종 산물로서 Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH를 산출하는 것을 포함한다. 단계 2 및 단계 4의 산물은 모두 무정형 물질이므로, 즉 불순물을 거부하는 제한된 능력을 제공하므로, 결정형 중간체 D-Arg(Pbf)-OH(단계 3 산물)는 최종 산물의 순도에 영향을 미치고 이를 보장하는 제어 지점으로서 작용한다.
문헌에 보고된 공정에 의존하는 경우, 고순도 산물을 수득하는 것은 심각한 난제이다. 전형적으로 다회 재결정화가 순도 요건에 부합하기 위해 요구된다. 하나의 예로서, D-Arg(Pbf)-OH는 순도를 원하는 수준으로 업그레이드하기 위해 EtOH/EtOAc/물 3원 용매 시스템 중에서 여러 번 재결정화된다. 또한 단계 2에서, 원료의 20-30%는 매우 과량의 나트륨 하이드록사이드 및 PbfCl의 존재 하에서도 반응하지 않은 채로 남아있으며, 전반적 수율(단계 1 내지 3)은 전형적으로 40% 미만에 불과하다.
개발되고 본원에 기재되며 도 6 및 7에 예시된 개선된 공정은 공지된 공정에 비해 몇몇 장점을 제공한다. NaI는 Boc-D-Arg-OH를 Boc-D-Arg(Pbf)-OH로 전환하기 위한 촉매로서 도입된다(도 6에서의 단계 2를 참고하라). 나트륨 요오다이드의 도입은 반응 역학을 유의미하게 개선하는데 효과적이며, 그 결과 단계 2의 전환이 95% 초과로 증가될 수 있고, 검정 수율이 ~90%까지 개선될 수 있다. 또한, 불순물의 총량도 감소된다.
D-Orn(Pbf)-OH 및 D-Arg(Pbf)-OH의 에틸 에스테르는 단계 2 및 단계 3에서 각각 형성되는 주요 불순물이며(도 7), 결정화를 통해 제거하기 어려우므로 다회 재결정화에 대한 필요성에 기여한다. 본원에 기재된 개선된 공정은 Boc-D-Arg(Pbf)-OH가 D-Arg(Pbf)-OH로 전환되는 단계 3에 대한 용매로서 보다 일반적으로 사용되는 EtOAc와 비교되는 경우 입체적으로 더 장애를 받는 에스테르인 이소프로필 아세테이트(IPAc)의 사용을 추가로 포함한다. IPAc의 사용은 강산, HCl에 의해 촉매되는 부반응인 에스테르 교환반응을 유의미하게 지연시킨다. 그 결과, 대응하는 불순물, D-Arg(Pbf)-OH의 에스테르의 함량이 약 0.5% 미만으로 감소된다(EtOAc를 채용하는 공정에서의 1.0% 초과 대비). 추가적으로, 이소프로필 알코올(IPA)/물은 모든 공정 불순물의 제거를 허용하지만 결정화 단계에서 산물 손실을 최소화하는 보다 강력한 용매 시스템인 것으로 나타났다. 실험실 규모(20 g)로 수행된 시험 작업에서, D-Arg(Pbf)-OH(단계 3 중간체)의 순도는 2회 결정화만으로 99.7% 초과로 개선되었고, 전반적 수율(단계 1 내지 3)은 대략 70%였다. 상기 개선된 공정의 하나의 구현예가 아래에서 실시예 6에 기재된다.
당분야 숙련가는 본 개시가 AMG 416의 변이체 및 유도체에도 연장됨을 쉽게 이해할 것이다. 예를 들어 하나의 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 또한 D-시스테인을 갖는 N-아세틸-D-시스테이닐-D-알라닐-D-아르기닐-D-아르기닐-D-아르기닐-D-알라닐-D-아르긴아미드 디설파이드와 이용될 수 있다. 또 하나의 구현예에서, 개시된 제형물은 또한 D-시스테인을 포함하는 N-아세틸-L-시스테이닐-L-알라닐-L-아르기닐-L-아르기닐-L-아르기닐-L-알라닐-L-아르긴아미드 디설파이드 및/또는 L-시스테인을 포함하는 N-아세틸-L-시스테이닐-L-알라닐-L-아르기닐-L-아르기닐-L-아르기닐-L-알라닐-L-아르긴아미드 디설파이드와 이용될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 개시된 제형물은 또한 L-시스테인을 포함하는 N-아세틸-D-시스테이닐-D-아르기닐-D-알라닐-D-아르기닐-D-아르기닐-D-알라닐-D-아르긴아미드 디설파이드, 및/또는 D-시스테인을 포함하는 N-아세틸-D-시스테이닐-D-아르기닐-D-알라닐-D-아르기닐-D-아르기닐-D-알라닐-D-아르긴아미드 디설파이드와 이용될 수 있다. 추가적으로, 본 방법은 국제 특허 공개 번호 WO 2011/014707의 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 표 7, 표 8, 표 9 및/또는 표 10에 제공된 하나 이상의 화합물을 제조하기 위해 채용될 수 있다. 추가 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 국제 특허 공개 번호 WO 2011/014707에 기재된 화합물을 제조하기 위해 이용될 수 있다.
실시예
수행된 실험 및 달성된 결과를 포함하여 하기 실시예는 단지 예시적 목적을 위해 제공되며, 첨부된 청구범위의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다.
실시예 1A
주 사슬 선형 단편의 합성
주 사슬 선형 단편의 합성을 도 2에 나타낸다. Rink 아미드 AM 수지(아미노메틸 수지에 연결된 Fmoc 2,4-디메톡시-4'(카복시메틸옥시)-벤질하이드릴아민)(1 kg)을 DMF(5.8 L/kg)에 첨가하고, 용액을 22℃에서 진탕하였다. 수지를 여과하고 슬러리 세척하였다. 샘플을 잔여 Fmoc(UV 시험) 및 잔여 피페리딘(pH)에 대해 시험하였다. Kaiser 및/또는 TNBS 컬러 시험을 수행하여 Fmoc 탈보호가 수행되었음을 확인하였다.
최초의 6회 아미노산 유도체 커플링은 사전-활성화, 커플링 및 세척에 대해 동일한 절차를 따랐다. 1.6 eq의 보호된 Fmoc 아미노산을 22℃에서 DMF, 8.9 L/kg에 첨가하였다. 이어서 Oxyma(2.45 eq)를 첨가하였다. 용액을 21℃로 냉각하고, DIC(2.13 eq)를 첨가하고, 반응이 진행하도록 두었다. 사전-활성화된 용액을 수지와 조합하고 반응이 진행하도록 두었다. DIC(1.07 eq)를 첨가하고, 반응이 22℃에서 진행하도록 두었다. 샘플을 Kaiser 및/또는 TNBS 컬러 시험을 이용해서 불완전 커플링에 대해 시험하였다. 물질을 세척한 뒤 Fmoc 탈보호 및 추가 세척하였다. 샘플을 잔여 Fmoc(UV 시험) 및 잔여 피페리딘(pH)에 대해 시험하였다. Kaiser 및/또는 TNBS 컬러 시험을 수행하여 Fmoc 탈보호가 일어났음을 확인하였다.
Fmoc-D-Cys(Trt)-OH 1.6 eq을 1:1.7 DMF:DCM 용액, 12 L/kg에 첨가한 뒤 HOBt.H2O(2.45 eq)를 첨가하였다. 용액을 20℃로 냉각하고 DIC(2.13 eq)를 첨가하고, 반응이 진행하도록 두었다. 사전-활성화된 용액을 수지와 조합하고 반응이 22℃에서 진행하도록 두었다. DIC 1.07 eq을 SPPS 반응에 충전하였고, 여기서 DMF/DCM 비는 약 1:1이었다. 반응이 22℃에서 진행하도록 두었다. 샘플을 Kaiser 및/또는 TNBS 컬러 시험을 이용해서 불완전 커플링에 대해 시험하였다.
물질을 세척한 뒤 Fmoc 탈보호 및 추가 세척하였다. 샘플을 잔여 Fmoc(UV 시험) 및 잔여 피페리딘(pH)에 대해 시험하였다. Kaiser 및/또는 TNBS 컬러 시험을 수행하여 Fmoc 탈보호가 일어났음을 확인하였다.
DMF(0 L/kg); 아세트산 무수물(1.06 L/kg) 및 피리딘(1.06 L/kg)을 용액에 첨가하고, 용액을 사전-활성화를 위해 진탕하였다. 사전-활성화 용액을 수지와 조합하고 22℃에서 진탕하였다. 물질을 여과하고 세척하였다. 샘플을 Kaiser 및/또는 TNBS 컬러 시험을 이용해서 불완전 캡핑에 대해 시험하였다. 물질을 슬러리 세척하였다. 수지를 진탕 없이 질소 하에 건조하였다. 건조 수지의 샘플을 취해서 LOD 및 잔여 용매에 대해 시험하였다. 도 2를 참고하라.
실시예 1B
주 사슬 선형 단편의 합성
AMG 416의 주 사슬 선형 단편의 합성을 도 2에 나타낸다. 펩타이드 사슬은 사이클 당 1개 아미노산씩 Rink AM 아미드 수지 상에서 C-말단에서부터 N-말단까지 구축되었다. 각 사이클은 2개의 반응 단계로 구성된다: 1) N-말단으로부터의 Fmoc 절단; 2) 다음 Fmoc-보호된 아미노산의 커플링 또는 최종 아세틸화.
SPPS의 개시: Rink AM 아미드 수지(1.0 mole)를 SPPS 반응기 내로 옮기고 N,N'-디메틸포름아미드(DMF)로 세척하였다.
Fmoc 절단: 이전 단계로부터의 수지를 적어도 10 분 동안 DMF 중 20% 피페리딘 용액 중에 현탁하였다. Fmoc 절단의 종료를 자외선(UV) 흡광 측정에 의해 모니터링하였다. Fmoc 절단의 종료 후, 중성 pH가 달성될 때까지 수지를 DMF 및 이소프로판올(IPA)로 교대 세척하였다.
Fmoc -아미노산 커플링: Fmoc 절단 단계 후, 수지를 DMF 중 Fmoc-보호된 아미노산 유도체(> 1.2 mole) 및 활성화 시약(> 1.8 moles)(N,N'-디이소프로필카보디이미드(DIC) 및 에틸(하이드록시이미노)-시아노아세테이트(Oxyma))의 용액과 혼합하여 커플링 반응을 수행하였다. Fmoc-D-Cys(Trt)-OH의 커플링을 위해, DIC 및 1-하이드록시벤조트리아졸 수화물(HOBt)을 활성화제로 사용하였고, DMF 및 디클로로메탄(DCM)의 혼합물을 반응 용매로서 채용하였다. 반응 혼합물을 하룻밤 동안 상온에서 교반하였다. Kaiser 및 TNBS 시험을 수행하여 커플링의 종료를 모니터링하였다. 공정을 다음 사이클로 진행하기 전에 Kaiser 및 TNBS 시험 둘 다로부터의 음성 결과가 필요하였다. 각각의 커플링 및 캡핑 단계 후, 수지를 DMF 및 IPA로 교대 세척하였다.
최종 아세틸화 : 최종 Fmoc-탈보호 후, 펩타이드의 N-말단 아미노기를 DMF 중 아세트산 무수물 및 피리딘을 사용해서 아세틸화하였다. Kaiser 및 TNBS 시험을 수행하여 아세틸화의 종료를 확인하였다. 아세틸화과 불완전한 경우, Kaiser 및 TNBS 시험 둘 다로부터 음성 결과가 수득될 때까지 동일한 아세틸화 절차를 반복하였다.
마지막으로, 수지(AMG 416-수지) 상 약물 성분의 보호 펩타이드 골격을 여과에 의해 단리하고, DMF, IPA 및 아세토니트릴(ACN)로 세척하고, 감압 하에 건조하였다.
실시예 2A
수지로부터 주 사슬 선형 단편의 절단
실온에서 DIW(0.16 L/kg); TFA(5.64 L/kg); TIPS(0.46 eq), 및 DPDS,(6.41 eq)를 조합한 뒤 용액을 0±2℃로 냉각하여 칵테일 용액을 제조하였다. 수지 상 펩타이드를 0±2℃에서 칵테일 용액에 첨가하고, 용액을 25℃로 가열하고, 반응이 진행하도록 두었다. 수지를 여과에 의해 제거하고 세척하였다. 용액을 -10℃에서 유지하고, -10℃에서 IPE:MeCN(24.5 L/kg)의 6.8:1 용액을 경시적으로 첨가하여 온도 및 침전을 제어하였다. 반응이 진행하도록 두고 AMG 416 SPy 중간체 산물을 -5℃에서 여과하고 세척하였다. SPy 중간체 산물을 완전 진공 하에 20℃에서 건조하였다. 도 3을 참고하라.
실시예 2B
수지로부터 주 사슬 선형 단편의 절단
TFA, H2O, 및 트리이소프로필실란(TIPS)을 96.9:2.6:0.5(v/v/v)의 근사 비로 혼합하여 절단 용액을 반응기에서 제조하였다. 절단 용액에, DPDS(> 1.2 moles)를 D-시스테인의 설프하이드릴기의 활성화 시약으로서 첨가하였다. AMG 416-수지(1.0 mole)를 반응기에 충전하고, 반응 혼합물을 실온에서 >1 h 동안 교반하였다. 수지를 여과 제거하였다. 여액 및 세척 용액을 또 다른 반응기 내로 옮기고 냉각하였다. 이어서 디이소프로필 에테르(IPE) 및 ACN의 저온 항-용매 혼합물을 용액으로 충전하여 AMG 416-SPy를 침전시켰다. 현탁액을 필터-건조기를 통해 여과하고, 이후 AMG 416-SPy의 필터 케이크를 ACN 및 IPE로 세척하고 필터 건조기 상에서 감압 하에 대략 20℃에서 건조하였다.
실시예 3
L-Cys에 대한 원 위치 콘주게이션/분취용 HPLC
AMG 416 SPy 중간체(1.0 mole)를 0.2% TFA 용액에 첨가하였다. L-시스테인(> 1.1 moles)을 용액으로 첨가하고, 반응이 적어도 15 분 동안 실온에서 진행하도록 두었다.
이동상으로서 ACN/H2O를 그리고 개질제로서 TFA를 이용하여 C18 실리카 겔 고정상을 이용해서 분취용 크로마토그래피에 의해 조정제 AMG 416의 정제를 수행하였다. 단계 III으로부터의 조정제 AMG 416 용액을 컬럼 상에 로딩하였고, 선형 구배 방법을 정제 단계를 위해 이용하였다. 용출을 230 nm에서 UV 흡광도에 의해 모니터링하였다. 각각의 로딩 후, 안정한 UV 기준선이 달성될 때까지 컬럼을 수중 80% ACN(v/v)로 플러싱하였다. 분획을 5℃에 저장하고, 이들을 샘플링한 뒤 원하는 순도(HPLC에 의해 결정됨)를 갖는 분획을 풀링하였다. 정제 수행으로부터 조합된 풀을 동일한 HPLC 컬럼을 이용하는 농축 작업을 수행함으로써 농축하였다. 분획을 5℃에 저장하였다. 원하는 순도(HPLC에 의해 결정됨)를 갖는 분획을 동결건조하여 AMG 416 TFA 염을 단리하였다. 도 4를 참고하라.
실시예 4
염 전환
완전 용해가 관찰될 때까지 AMG 416 TFA 염을 10℃에서 IPA(v/v) 10 L/kg 중 15% 물의 용액에 첨가하였다. 용액을 표면하 첨가를 통해 3 시간에 걸쳐 12M 수성 HCl, 0.27 L/kg 및 IPA 49.4 L/kg의 용액에 첨가하여 AMG 416 4.5 HCl 염의 직접 침전을 일으켰다. 배치를 3 시간 동안 숙성시키고 분석을 위해 샘플링하였다.
물질을 여과하고 96 wt% IPA, 10 L/kg으로 슬러리 세척하였다. 이어서 케이크를 10 L/kg의 96% wt% IPA 중에 4 시간 동안 재-슬러리화하였다. 물질을 여과하고, 96% IPA, 10 L/kg으로 이어서 IPA 10 L/kg으로 추가 슬러리 세척하였다. 25℃에서 완전 진공 하에 물질을 건조하였다. 건조 케이크를 물 8 L/kg 중에 용해시키고 배치를 증류를 통해 농축하여 잔여 IPA를 제거하고 원하는 농도를 달성하였다. 용액 온도를 증류 전반에 걸쳐 25℃ 미만으로 유지하였다. 도 5를 참고하라.
실시예 5
SPy 중간체의 정제 및 AMG 416 HCl의 생산
AMG 416 HCl 염의 제조를 위한 대안적 방법이 여기에 기재된다. 상기 실시예 2에 기재된 바와 같이, SPy 중간체 산물을 수지로부터의 절단, 침전 및 여과 후 완전 진공 하에 20℃에서 건조하였다. 이어서 침전물을 0.1% TFA 수성 용액 중에 용해시키고 HPLC 정제를 위해 C-18 컬럼 상에 로딩하였다. 컬럼을 <60 bar에서 작동시켰고, 용액 온도는 전반에 걸쳐 15-25℃였다. 용출액은 아세토니트릴 중 0.1% TFA 및 수중 0.1% TFA였다. 분획을 5℃에 저장하고, 이들을 샘플링한 뒤 분획을 풀링하였다. 2회 수행에서 조합된 풀을 희석하고, 동일한 HPLC 컬럼을 이용해서 농축/정제 작업을 수행하여 전체 부피를 감소시키고 추가 불순물을 제거하였다. 분획을 5℃에 저장하였다.
AMG 416 SPy 중간체를 함유하는 분획을 공비 증류를 거쳐 용매를 0.1% TFA에서부터 IPA 용액 중 15% 물로 변화시키고 필요에 따라 IPA를 충전하였다. 이어서 IPA 용액 중 생성 AMG 416 SPy 중간체에 L-시스테인 1.15 eq을 첨가하고, 콘주게이션이 일어나고 실시예 4에 상술된 바와 같이 AMG 416 TFA 염을 형성하도록 반응이 실온에서 진행하도록 두었다. AMG 416 TFA 용액을 표면하 첨가를 통해 3 시간에 걸쳐 12M 수성 HCl, 0.27 L/kg 및 IPA 49.4 L/kg의 용액에 첨가하여 AMG 416 4.5 HCl 염의 직접 침전을 일으켰다. 배치를 3 시간 동안 숙성시키고 분석을 위해 샘플링하였다.
물질을 여과하고, 96 wt% IPA, 10 L/kg으로 슬러리 세척하였다. 이어서 케이크를 10 L/kg의 96% wt% IPA 중에서 4 시간 동안 재-슬러리화하였다. 물질을 여과하고, 96% IPA, 10 L/kg에 이어 IPA 10 L/kg으로 추가 슬러리 세척하였다. 물질을 25℃에서 완전 진공 하에 건조하였다. 건조 케이크를 물 8 L/kg 중에 용해시키고 배치를 증류를 통해 농축하여 잔여 IPA를 제거하고 원하는 농도를 달성하였다. 용액 온도를 증류 전반에 걸쳐 25℃ 미만으로 유지하였다.
실시예 6
H-D-Arg(Pbf)-OH의 합성
실시예 1에 기재된 바와 같은 주 사슬 선형 단편의 합성은 D-아르기닌 서브유닛의 첨가를 위해 Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH의 사용을 필요로 하며, 이는 선형 단편에서 7개 잔기 중 4개를 구성한다. Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH를 합성하기 위한 개선되고 보다 효율적인 방법이 아래에 기재된다.
합성은 디-tert-부틸 디카보네이트(Boc2O)에 의해 D-Arg의 아미노기의 보호로 시작되어 문헌에 보고된 표준 절차 하에 결정화에 의한 단리 후 대략 정량적 수율로 Boc-D-Arg-OH를 산출한다. 아르기닌 측쇄 구아니딘기는 염기로서 수성 NaOH(4.3 eq)/NaI(5% mol)의 존재 하에 Pbf-Cl(1.3 eq)의 10/1 아세톤/THF 용액의 1 시간 첨가(0-5℃)에 의해 Pbf 기로 보호되어 Boc-D-Arg(Pbf)-OH(85-90% 검정 수율)을 생산하였다. 도 6을 참고하라. IPAc 용액 중 Boc-D-Arg(Pbf)-OH를 대략 6 h 동안 20℃에서 4.8 eq의 농축 HCl로 처리하였다. 반응 후, 유기층을 폐기하고 NaOH를 이용해서 pH를 5로 조정함으로써 조정제 산물을 수성층으로부터 단리한 후 백색 현탁액이 관찰되었다. 도 7을 참고하라. 상청액이 20℃에서 대략 3 mg/mL의 농도를 가지면, 상청액을 실온에서 여과하고 생성 케이크를 물로 세척하고 진공 하에 건조하였다. 상기 단계 후 전반적 검정 수율은 약 80-85%였다. H-D-Arg(Pbf)-OH의 순도는 3/1 물/IPA(v/v)로부터의 첫 번째 재-결정화에 의해 >98.5%로 증가되었다. 상청액이 약 7 mg/mL의 농도를 가지면, 이를 여과하고 진공 하에 건조하였다. 상기 단계 후, 전반적 검정 수율은 약 75%였다. (전형적으로 약 10%의 산물 손실이 상기 단계에서 관찰된다). 4/1 물/IPA(v/v)로부터의 두 번째 재-결정화 단계를 수행하였다. 상청액 농도가 약 3.7 mg/mL이면 여과를 수행하였다. 두 번째 재결정화는 H-D-Arg(Pbf)-OH의 순도를 HPLC에 의해 약 99.84 면적 퍼센트 순도(LCAP)로 증가시켰고 불순물은 0.2 LCAP 이하였다. 상기 단계의 전형적 수율은 약 93%이며, 약 5%의 산물 손실을 갖는다. 이어서 H-D-Arg(Pbf)-OH를 표준 프로토콜에 따라 FmocOSu와 반응시켰고, 산물 Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH를 문헌에서의 표준 절차를 이용해서 단리하였다.
<110> AMGEN INC. <120> METHOD FOR PREPARING AMG 416 <130> 2016-FPA-7750 <150> US 61/974,899 <151> 2014-04-03 <160> 4 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> Xaa = D-Cys <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> N-terminal acetylation <220> <221> DISULFID <222> (1) <223> Cys-Cys disulfide bond to Cys <220> <221> VARIANT <222> (2) <223> Xaa = D-Ala <220> <221> VARIANT <222> (3)..(5) <223> Xaa = D-Arg <220> <221> VARIANT <222> (6) <223> Xaa = D-Ala <220> <221> VARIANT <222> (7) <223> Xaa = D-Arg <220> <221> MOD_RES <222> (7) <223> C-terminal amidation <400> 1 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> Xaa = D-Cys(trt) <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> attached to Fmoc <220> <221> VARIANT <222> (2) <223> Xaa = D-Ala <220> <221> VARIANT <222> (3)..(5) <223> Xaa = D-Arg(Pfb) <220> <221> VARIANT <222> (6) <223> Xaa = D-Ala <220> <221> VARIANT <222> (7) <223> Xaa = D-Arg(Pfb) <220> <221> MOD_RES <222> (7) <223> attached to resin <400> 2 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> Xaa = D-Cys(Trt) <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> N-terminal acetylation <220> <221> VARIANT <222> (2) <223> Xaa = D-Ala <220> <221> VARIANT <222> (3)..(5) <223> Xaa = D-Arg(Pbf) <220> <221> VARIANT <222> (6) <223> Xaa = D-Ala <220> <221> VARIANT <222> (7) <223> Xaa = D-Arg(Pbf) <220> <221> MOD_RES <222> (7) <223> attached to resin <400> 3 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> Xaa = D-Cys(SPy) <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> N-terminal acetylation <220> <221> VARIANT <222> (2) <223> Xaa = D-Ala <220> <221> VARIANT <222> (3)..(5) <223> Xaa = D-Arg <220> <221> VARIANT <222> (6) <223> Xaa = D-Ala <220> <221> VARIANT <222> (7) <223> Xaa = D-Arg <220> <221> MOD_RES <222> (7) <223> C-terminal amidation <400> 4 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5

Claims (13)

  1. Ac-D-Cys(SPy)-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2(서열번호 4)의 구조를 갖는 펩타이드를 L-Cys과 접촉시켜 식 (I)의 콘주게이션된 산물을 생산하는 단계를 포함하는 식 (I)로 표시되는 AMG 416의 제조 방법:
    Figure 112021114953369-pct00011
    .
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 접촉은 상기 펩타이드를 L-Cys 및 트리플루오로아세트산을 포함하는 수성 용액에 용해시키는 단계를 포함하는 방법.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 콘주게이션된 산물을 동결건조하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 콘주게이션된 산물을 IPA 및 HCl을 포함하는 수성 용액과 접촉시켜 AMG 416 HCl(서열번호 1)을 포함하는 침전물을 생산하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  5. 청구항 4에 있어서,
    HPLC에 의해 상기 침전물을 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  6. 청구항 1에 있어서,
    TFA 용액 중의 펩타이드를 HPLC에 의해 정제하는 단계; 및
    상기 정제된 펩타이드에 대해 공비 증류에 의해 용매 교환을 수행하는 단계;를 추가로 포함하고,
    상기 콘주게이션된 산물을 생산하기 위한 상기 접촉은 정제 후에 일어나는 방법.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 펩타이드는 IPA 중 L-Cys 및 물의 수성 용액과 접촉하는 방법.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 콘주게이션된 산물을 IPA 및 HCl을 포함하는 수성 용액과 접촉시켜 AMG 416 HCl(서열번호 1)을 포함하는 침전물을 생산하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
KR1020167030590A 2014-04-03 2015-04-03 Amg 416의 제조 방법 KR102397271B1 (ko)

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