EA032597B1 - Способ получения amg 416 - Google Patents
Способ получения amg 416 Download PDFInfo
- Publication number
- EA032597B1 EA032597B1 EA201692001A EA201692001A EA032597B1 EA 032597 B1 EA032597 B1 EA 032597B1 EA 201692001 A EA201692001 A EA 201692001A EA 201692001 A EA201692001 A EA 201692001A EA 032597 B1 EA032597 B1 EA 032597B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- agd
- peptide
- amo
- resin
- solution
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 75
- ANIAZGVDEUQPRI-ZJQCGQFWSA-N etelcalcetide Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@@H](CSSC[C@H](N)C(O)=O)NC(C)=O ANIAZGVDEUQPRI-ZJQCGQFWSA-N 0.000 title abstract description 4
- 229950006502 etelcalcetide Drugs 0.000 title abstract description 4
- 108091022127 etelcalcetide hydrochloride Proteins 0.000 title abstract description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 66
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 55
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 32
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 claims description 21
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 20
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims description 18
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 18
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 14
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 12
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 11
- 238000004821 distillation Methods 0.000 claims description 5
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 5
- 238000010533 azeotropic distillation Methods 0.000 claims description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 abstract description 42
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 abstract description 37
- 208000005770 Secondary Hyperparathyroidism Diseases 0.000 abstract description 3
- 238000001631 haemodialysis Methods 0.000 abstract description 3
- 230000000322 hemodialysis Effects 0.000 abstract description 3
- 229940122985 Peptide agonist Drugs 0.000 abstract description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 abstract description 2
- 208000013725 Chronic Kidney Disease-Mineral and Bone disease Diseases 0.000 abstract 2
- 102000013830 Calcium-Sensing Receptors Human genes 0.000 abstract 1
- 108010050543 Calcium-Sensing Receptors Proteins 0.000 abstract 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 58
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 58
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 39
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 38
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 24
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 24
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 19
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 19
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 19
- -1 for example Substances 0.000 description 18
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 17
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 17
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 17
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 16
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 15
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 14
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 14
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 14
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 13
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 13
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 13
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 13
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 12
- FVAUCKIRQBBSSJ-UHFFFAOYSA-M sodium iodide Chemical compound [Na+].[I-] FVAUCKIRQBBSSJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 239000000463 material Substances 0.000 description 11
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 10
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 9
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 8
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 8
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 7
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 7
- 238000001994 activation Methods 0.000 description 7
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 7
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 7
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 6
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 6
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 5
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108090000445 Parathyroid hormone Proteins 0.000 description 4
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 4
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 4
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 235000009518 sodium iodide Nutrition 0.000 description 4
- DYHSDKLCOJIUFX-UHFFFAOYSA-N tert-butoxycarbonyl anhydride Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)OC(=O)OC(C)(C)C DYHSDKLCOJIUFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZGYICYBLPGRURT-UHFFFAOYSA-N tri(propan-2-yl)silicon Chemical compound CC(C)[Si](C(C)C)C(C)C ZGYICYBLPGRURT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000003982 Parathyroid hormone Human genes 0.000 description 3
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 3
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 3
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 3
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 3
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 3
- 239000000199 parathyroid hormone Substances 0.000 description 3
- 229960001319 parathyroid hormone Drugs 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 3
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 2
- 201000002980 Hyperparathyroidism Diseases 0.000 description 2
- 208000022120 Jeavons syndrome Diseases 0.000 description 2
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N aldrithiol Chemical compound C=1C=CC=NC=1SSC1=CC=CC=N1 HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000003862 amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 2
- 239000002585 base Substances 0.000 description 2
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 2
- 239000012351 deprotecting agent Substances 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N guanidine group Chemical group NC(=N)N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- XTUSEBKMEQERQV-UHFFFAOYSA-N propan-2-ol;hydrate Chemical compound O.CC(C)O XTUSEBKMEQERQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 2
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LDMOEFOXLIZJOW-UHFFFAOYSA-N 1-dodecanesulfonic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCS(O)(=O)=O LDMOEFOXLIZJOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PJUPKRYGDFTMTM-UHFFFAOYSA-N 1-hydroxybenzotriazole;hydrate Chemical compound O.C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 PJUPKRYGDFTMTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JMTMSDXUXJISAY-UHFFFAOYSA-N 2H-benzotriazol-4-ol Chemical compound OC1=CC=CC2=C1N=NN2 JMTMSDXUXJISAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003974 3-carbamimidamidopropyl group Chemical group C(N)(=N)NCCC* 0.000 description 1
- QCQCHGYLTSGIGX-GHXANHINSA-N 4-[[(3ar,5ar,5br,7ar,9s,11ar,11br,13as)-5a,5b,8,8,11a-pentamethyl-3a-[(5-methylpyridine-3-carbonyl)amino]-2-oxo-1-propan-2-yl-4,5,6,7,7a,9,10,11,11b,12,13,13a-dodecahydro-3h-cyclopenta[a]chrysen-9-yl]oxy]-2,2-dimethyl-4-oxobutanoic acid Chemical compound N([C@@]12CC[C@@]3(C)[C@]4(C)CC[C@H]5C(C)(C)[C@@H](OC(=O)CC(C)(C)C(O)=O)CC[C@]5(C)[C@H]4CC[C@@H]3C1=C(C(C2)=O)C(C)C)C(=O)C1=CN=CC(C)=C1 QCQCHGYLTSGIGX-GHXANHINSA-N 0.000 description 1
- OCKGFTQIICXDQW-ZEQRLZLVSA-N 5-[(1r)-1-hydroxy-2-[4-[(2r)-2-hydroxy-2-(4-methyl-1-oxo-3h-2-benzofuran-5-yl)ethyl]piperazin-1-yl]ethyl]-4-methyl-3h-2-benzofuran-1-one Chemical compound C1=C2C(=O)OCC2=C(C)C([C@@H](O)CN2CCN(CC2)C[C@H](O)C2=CC=C3C(=O)OCC3=C2C)=C1 OCKGFTQIICXDQW-ZEQRLZLVSA-N 0.000 description 1
- XVMSFILGAMDHEY-UHFFFAOYSA-N 6-(4-aminophenyl)sulfonylpyridin-3-amine Chemical compound C1=CC(N)=CC=C1S(=O)(=O)C1=CC=C(N)C=N1 XVMSFILGAMDHEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000020084 Bone disease Diseases 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZAFNJMIOTHYJRJ-UHFFFAOYSA-N Diisopropyl ether Chemical compound CC(C)OC(C)C ZAFNJMIOTHYJRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LCGLNKUTAGEVQW-UHFFFAOYSA-N Dimethyl ether Chemical compound COC LCGLNKUTAGEVQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101000992388 Homo sapiens Oxysterol-binding protein-related protein 8 Proteins 0.000 description 1
- 101100354855 Homo sapiens PYDC1 gene Proteins 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N Hydrogen bromide Chemical compound Br CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 description 1
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 description 1
- FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N L-homocysteine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCS FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N Methanesulfonic acid Chemical compound CS(O)(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MXNRLFUSFKVQSK-QMMMGPOBSA-O N(6),N(6),N(6)-trimethyl-L-lysine Chemical compound C[N+](C)(C)CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O MXNRLFUSFKVQSK-QMMMGPOBSA-O 0.000 description 1
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-diisopropylethylamine Substances CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100032151 Oxysterol-binding protein-related protein 8 Human genes 0.000 description 1
- 101150010895 PYC1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100036893 Parathyroid hormone Human genes 0.000 description 1
- 102100022810 Potassium voltage-gated channel subfamily H member 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100039892 Pyrin domain-containing protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 101100178269 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) hob1 gene Proteins 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M Trifluoroacetate Chemical compound [O-]C(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000001241 acetals Chemical class 0.000 description 1
- 229940022663 acetate Drugs 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 239000012296 anti-solvent Substances 0.000 description 1
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QRUDEWIWKLJBPS-UHFFFAOYSA-N benzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N[N][N]C2=C1 QRUDEWIWKLJBPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012964 benzotriazole Substances 0.000 description 1
- 125000001584 benzyloxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC1=CC=CC=C1)* 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000837 carbohydrate group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007810 chemical reaction solvent Substances 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 208000020832 chronic kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 239000012468 concentrated sample Substances 0.000 description 1
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- MQYQOVYIJOLTNX-UHFFFAOYSA-N dichloromethane;n,n-dimethylformamide Chemical compound ClCCl.CN(C)C=O MQYQOVYIJOLTNX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002147 dimethylamino group Chemical group [H]C([H])([H])N(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- MGHPNCMVUAKAIE-UHFFFAOYSA-N diphenylmethanamine Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(N)C1=CC=CC=C1 MGHPNCMVUAKAIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 150000002019 disulfides Chemical class 0.000 description 1
- POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-M dodecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCC([O-])=O POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 229940088679 drug related substance Drugs 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- LCFXLZAXGXOXAP-QPJJXVBHSA-N ethyl (2e)-2-cyano-2-hydroxyiminoacetate Chemical compound CCOC(=O)C(=N\O)\C#N LCFXLZAXGXOXAP-QPJJXVBHSA-N 0.000 description 1
- LCFXLZAXGXOXAP-DAXSKMNVSA-N ethyl (2z)-2-cyano-2-hydroxyiminoacetate Chemical compound CCOC(=O)C(=N/O)\C#N LCFXLZAXGXOXAP-DAXSKMNVSA-N 0.000 description 1
- 125000004494 ethyl ester group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012458 free base Substances 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-M hexadecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000004677 hydrates Chemical class 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-M hydrogensulfate Chemical compound OS([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000001841 imino group Chemical group [H]N=* 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- JMMWKPVZQRWMSS-UHFFFAOYSA-N isopropanol acetate Natural products CC(C)OC(C)=O JMMWKPVZQRWMSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940011051 isopropyl acetate Drugs 0.000 description 1
- GWYFCOCPABKNJV-UHFFFAOYSA-N isovaleric acid Chemical compound CC(C)CC(O)=O GWYFCOCPABKNJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 229940099584 lactobionate Drugs 0.000 description 1
- JYTUSYBCFIZPBE-AMTLMPIISA-N lactobionic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]([C@H](O)CO)O[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O JYTUSYBCFIZPBE-AMTLMPIISA-N 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 229940070765 laurate Drugs 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- 230000003340 mental effect Effects 0.000 description 1
- 125000000325 methylidene group Chemical group [H]C([H])=* 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 125000005487 naphthalate group Chemical group 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940049964 oleate Drugs 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 1
- 125000001181 organosilyl group Chemical group [SiH3]* 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000007030 peptide scission Effects 0.000 description 1
- 125000001151 peptidyl group Chemical group 0.000 description 1
- UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N phenylmethyl ester of formic acid Natural products O=COCC1=CC=CC=C1 UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N phosphoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)COP(O)(O)=O BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 238000004237 preparative chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 239000013557 residual solvent Substances 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000001223 reverse osmosis Methods 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012453 solvate Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 229940095064 tartrate Drugs 0.000 description 1
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N toluene-4-sulfonic acid Chemical compound CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000759 toxicological effect Toxicity 0.000 description 1
- 238000005809 transesterification reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 125000005500 uronium group Chemical group 0.000 description 1
- 229940070710 valerate Drugs 0.000 description 1
- NQPDZGIKBAWPEJ-UHFFFAOYSA-N valeric acid Chemical compound CCCCC(O)=O NQPDZGIKBAWPEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
- 230000036642 wellbeing Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/02—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length in solution
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
- C07K1/1075—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of amino acids or peptide residues
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/18—Drugs for disorders of the endocrine system of the parathyroid hormones
- A61P5/20—Drugs for disorders of the endocrine system of the parathyroid hormones for decreasing, blocking or antagonising the activity of PTH
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)
- Glass Compositions (AREA)
- Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
Предлагается способ получения AMG 416 или его фармацевтически приемлемой соли. AMG 416 представляет собой синтетический, состоящий из восьми аминокислот селективный пептидный агонист кальцийчувствительного рецептора. Он был разработан в качестве внутривенного лечения вторичного гиперпаратиреоза (SHPT) гемодиализных больных с хроническим заболеванием почек - минеральным и костным расстройством (CKD-MBD).
Description
Настоящее изобретение относится к области синтеза полипептидов, а более конкретно, к синтезу АМС 416 или его фармацевтически приемлемой соли.
Уровень техники
АМС 416 представляет собой синтетический, состоящий из восьми аминокислот селективный пептидный агонист кальцийчувствительного рецептора. Он был разработан в качестве внутривенного лечения вторичного гиперпаратиреоза (8НРТ) гемодиализных больных с хроническим заболеванием почек минеральным и костным расстройством (СК1)-МВ1)).
Соль гидрохлорида АМС 416 имеет химическую структуру:
Н-ь-Суз-ОН
8—8
Ас-1)-Су8-1)-А1а-1)-Агд-1)-Агд-1)-Агд-1)-А1а-1)-Агд-МН2 · х(НС1) (8Е0 Ш N0:1)
Основная цепь содержит 7 аминокислот, все в Ό-конфигурации. Остаток цистеина боковой цепи находится в Б-конфигурации. Молекулярная формула АМС 416 (свободное основание) представляет собой С38И73У21О1082, и имеет расчетную среднюю молекулярную массу 1048,3 Да.
АМС 416 и способ его получения описаны в Международной Патентной Публикации АО 2011/014707, которая включена в настоящий документ с помощью ссылки для любой цели. Как описано в Международной Патентной публикации АО 2011/014707, АМС 416 может быть собран с помощью твердофазного синтеза из соответствующих Етос-защищенных Ό-аминокислот. После отщепления от смолы, материал может быть обработан Вос-Б-Суз(УРу8)-ОН с образованием дисульфидной связи. Восгруппу затем можно удалить трифторацетатом (ТЕА), и полученный продукт очищают с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с обращенной фазой и выделяют в виде соли ТЕА путем лиофилизации. Соль ТЕА может быть превращена в фармацевтически приемлемую соль путем проведения последующей процедуры солевого обмена. Такие процедуры хорошо известны в данной области техники и включают, например, метод ионного обмена, необязательно с последующей очисткой полученного продукта (например, с помощью жидкостной хроматографии с обращенной фазой или обратного осмоса).
Существует потребность в эффективном способе получения АМС 416 или его фармацевтически приемлемой соли (например, АМС 416 НС1), и, в частности, подходящем для производства в промышленном масштабе.
Сущность изобретения
С точки зрения описанных выше проблем целью настоящего описания является, среди прочего, предложение способа получения АМС 416 или его фармацевтически приемлемой соли.
В первом аспекте изобретения предлагается способ получения АМС 416, причем способ включает обеспечение связанного со смолой пептида, имеющего структуру, выбранную из группы, состоящей из
Етос-Э-Суз(ТгЕ)-Р-А1а-О-Агд(РЬ£)-ϋ-Агд(РЬ£)-ϋАгд (РЬ£)-Р-А1а-Р-Агд (РЬ£) - [Смола] (ЗЕО Ю N0:2) и Ас-ЭСуз(ТгЕ)-О-А1а-Э-Агд(РЬ£)-ϋ-Агд(РЬЕ)-ϋ-Агд(РЬ£)-О-А1а-ЭАгд (РЬ£) - [Смола] (ЗЕО Ю N0:3);
отщепление пептида от твердой подложки; и активацию боковой цепи остатка Э-Суз отщепляемого пептида.
В одном или более воплощениях, связанных с первым аспектом, стадии отщепления и активации происходят в одном сосуде.
Еще в одном или нескольких воплощениях, связанный со смолой пептид вводят в контакт с раствором, содержащим воду, трифторуксусную кислоту, триизопропилсилан и дипиридилдисульфид.
Во втором аспекте предлагается способ получения АМС 416, причем способ включает обеспечение пептида, имеющего структуру Ас-П-Су8(8Ру)-П-А1а-П-Агд-0-Аг§-П-Агд-0-А1а-П-Аг§-УН2 (8ЕР ГО N0:4); и контакт пептида с Б-Суз с получением конъюгированного продукта.
В некоторых воплощениях, связанных со вторым аспектом, пептид вводят в контакт с водным раствором, содержащим Б-Суз и трифторуксусную кислоту.
В некотором следующем воплощении, связанном со вторым аспектом изобретения, способ допол
- 1 032597 нительно включает лиофилизацию конъюгированного продукта.
Еще в некоторых других воплощениях, способ согласно второму аспекту дополнительно включает контакт конъюгированного продукта с водным раствором, содержащим изопропиловый спирт (ΙΡΑ) и соляную кислоту (НС1), в результате чего получают осадок, содержащий ΑΜΘ 416 НС1.
Еще в одном или в нескольких воплощениях, связанных со вторым аспектом, способ дополнительно включает очистку осадка с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Еще в одном третьем аспекте изобретения предлагается способ получения ΑΜΘ 416, причем способ включает обеспечение связанного со смолой пептида, имеющего структуру, выбранную из группы, состоящей из
Етос-Р-Суз(Тг£)-Р-А1а-Р-Агд(РЬ£)-РАгд(РЬ£)-Р-Агд(РЬ£)-Р-А1а-Р-Агд(РЬ£)-[Смола] (ЗЕО ΙΡ N0:2) и
Ас-Р-Суз(Тг£)-Р-А1а-Р-Агд(РЬ£)-Р-Агд(РЬ£)-Ό-Агд(РЬ£)-Р-А1а-РАгд (РЬ£) - [Смола] (ЗЕ<2 ΙΡ N0:3);
отщепление пептида от твердой подложки, то есть, чтобы обеспечить пептид без подложки, и активацию боковой цепи остатка О-Суз пептида без подложки для генерации промежуточного продукта ΑΜΘ 416 8Ру (где 8Ру представляет собой 2-пиридинсульфенил или 8-Руг), растворение промежуточного продукта ΑΜΘ 416 8Ру в водном растворе 0,1% ΤΡΑ (раствор трифторуксусной кислоты), и очистку ΑΜΘ 416 8ру производного с помощью ВЭЖХ.
В некоторых воплощениях, связанных с третьим аспектом изобретения, способ дополнительно включает азеотропную перегонку промежуточного продукта ΑΜΘ 416 8Ру, чтобы тем самым осуществить замену растворителя с получением раствора ΑΜΘ 416 8Ру в новом растворителе, например, в воде и изопропиловом спирте.
Еще в некоторых дополнительных воплощениях, связанных с третьим аспектом, способ дополнительно включает контакт раствора изопропиловый спирт - вода ΑΜΘ 416 8Ру, в некоторых воплощениях в виде его соли трифторуксусной кислоты, с водным раствором, содержащим Б-Суз.
В четвертом аспекте изобретения предлагается способ получения Н-^-Α^β(РЫ)-ОН, то есть подходящего исходного материала для некоторых из представленных здесь способов синтеза.
В некоторых воплощениях, связанных с четвертым аспектом, способ включает превращение Вос-ϋΑγ§-ΟΗ в Вοс-^-Α^β(РЫ)-ОН в присутствии Ыа1 (йодид натрия). Еще в некоторых других воплощениях, йодид натрия присутствует в концентрации, составляющей примерно 5 мол.%.
В некоторых дополнительных воплощениях, связанных с четвертым аспектом, способ дополнительно включает превращение Вοс-^-Α^β(РЫ)-ОН в ^-Α^β(РЫ)-ОН, и кристаллизацию ^-Α^β(РЫ)-ОН в системе растворителей IРΑ/вода.
Дополнительные воплощения способов, описанных в настоящем документе, будут очевидны из приведенных ниже описания, примеров и формулы изобретения. Как можно понять из вышеизложенного и последующего описания, каждый признак, описанный в настоящем документе, и каждая комбинация двух или более из таких признаков, включены в объем настоящего изобретения при условии, что признаки, включенные в такой комбинации, не являются взаимно несовместимыми. Кроме того, любой признак или комбинацию признаков могут быть специально исключены из любого воплощения настоящего изобретения.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 демонстрирует химическую структуру
2ММСР 416 (Ас-ϋСуз(Ь-Суз-ОН)-Р-А1а-О-Агд-О-Агд-О-Агд-О-А1а-О-Агд-ИН2) (ЗЕО ΙΡ
N0:1).
Фиг. 2 демонстрирует химическую структуру смолы
К1пк Απιίάθ
ΆΜ и Ас-Р-Суз(ТгЕ)-Р-А1а-Р-Агд(РЬ£)-Р-Агд(РЬ£)-Р-Агд(РЬ£)-РА1а-Р-Агд(РЬ£)-смола (ЗЕО ΙΡ N0:3).
Фиг. 3 демонстрирует схему реакции, в которой промежуточный продукт
ЗРу (Ас-Р-Суз (ЗРу)-Р-А1а-Р-Агд-Р-Агд-Р-Агд-Р-А1а-Р-Агд-ЦН2) (8Εζ) ΙΡ N0:4) образуется из пептидил-смолы (Ас-Р-Суз(Тг£)-Р-А1а-Р-Агд(РЬ£)-Ό-Агд(РЬ£)-Ό-Агд(РЬ£)-Р-А1а-РАгд (РЬ£) -ΝΗ-смола) (ЗЕ<2 ΙΡ N0: 3).
Фиг. 4 демонстрирует схему реакции, в которой ΤΡΑ соль ΑΜΘ 416 образуется из промежуточного продукта 8Ру (ΑΑ1-7^)).
Фиг. 5 демонстрирует схему реакции, в которой соль НС1, ΑΜΘ 416 образуется из ΤΡΑ соли ΑΜΘ 416.
Фиг. 6 демонстрирует схему реакции, в которой Вοс-^-Α^β(РЫ)-ΟН образуется из Вос-ϋ-ΑΓβ-ΟΗ.
Фиг. 7 демонстрирует схему реакции, в которой ^-Α^β(РЫ)-ОН образуется из Вοс-^-Α^β(РЫ)-ОН.
- 2 032597
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение будет описано более подробно ниже. Однако настоящее описание может быть воплощено во многих различных формах и не должно быть истолковано как ограниченное воплощениями, изложенными в данном документе; скорее, эти воплощения предоставлены для того, чтобы описание было полным и завершенным и полностью передавало его объем специалистам в данной области техники.
Все публикации, патенты и патентные заявки, упомянутые в настоящем документе, либо выше, либо внутри, включены в данное описание в качестве ссылки в полном объеме, если не указано иное. В случае, когда один и тот же термин определяется как в публикации, патенте или в патентной заявке, включенной в настоящий документ с помощью ссылки, так и в настоящем описании, то определение в настоящем описании представляет собой основное определение. Для публикаций, патентов и патентных заявок, упомянутых для описания конкретного типа соединения, пептида, химии и т.д., части, имеющие отношение к таким соединениям, химии и т.д., являются теми частями документа, которые включены в настоящее описание с помощью ссылки.
Заголовки разделов, используемые в данном документе, предназначены только для организационных целей и не должны истолковываться как ограничивающие описываемую проблему.
Если иное не определено в настоящем документе, научные и технические термины, используемые в связи с настоящей заявкой, будут иметь значения, которые обычно понятны специалистами в данной области техники. Кроме того, если иное не требуется по контексту, термины в единственном числе будут включать в себя множественное число и термины во множественном числе будут включать термины в единственном числе.
Как правило, номенклатура, используемая в связи с ними и методы молекулярной биологии и химии белка, описанные в настоящем документе, являются хорошо известными и широко используются в данной области. Методы и способы настоящей заявки, как правило, осуществляется в соответствии с обычными способами, хорошо известными в данной области и как описано в различных общих и более конкретных ссылках, которые упоминаются и обсуждаются в настоящем описании, если не указано иное. Смотри, например, Ьа871о, Рерйде-Ва8ед Огид Ое81дп: МеЛодз апд Рго1осо18, Нитапа Рге88 (2008); Вепо1!оп, СЬет181гу об Рерйде 8уп!ке818, СКС Ргезз (2005); Ли8иЬе1 е! а1., Сиггеп! Рго1осо18 ш Мо1еси1аг Вю1оду, Огеепе РиЬ118Ыпд А88ос1а1е8 (1992), которые включены в настоящий документ с помощью ссылки для любых целей. Методы очистки осуществляют в соответствии с инструкциями производителя, как это обычно делают в данной области, или как описано в настоящем документе. Терминология, использованная в связи с этим, и лабораторные процедуры и методики аналитической химии, химии органического синтеза и медицинской и фармацевтической химии, описанные в настоящем документе, являются хорошо известными и широко используются в данной области. Стандартные методы могут быть использованы для химического синтеза, химических анализов, фармацевтического препарата, состава и доставки и лечения пациентов.
Следует понимать, что данное изобретение не ограничено конкретной методологией, протоколами и реагентами и т.д., описанными в настоящем документе, и, как таковые, могут варьироваться. Терминология, использованная в настоящем документе, предназначена исключительно для целей описания конкретных воплощений изобретения и не предназначена для ограничения объема раскрытого изобретения, который определяется исключительно формулой изобретения.
Термин примерно, в частности, в отношении данного количества, предназначен для охвата отклонения плюс или минус пять процентов.
I. Общие определения.
Артикли а и ап используются в настоящем документе для обозначения одного или более чем одного (то есть, по меньшей мере, одного) грамматического субъекта статьи, если специально не указано иное. В качестве примера, элемент означает один элемент или более чем один элемент.
Термин АМО 416, также известный как этелькальцетид, ранее известный как велькальцетид или КА1-4169, относится к соединению, имеющему химическое название: Ν-ацетил-О-цистеинил-О-аланилΌ-аргинил-О-аргинил-О-аргинил-О-аланил-О-аргинамид дисульфид с Ь-цистеином, который имеет следующую структурную формулу:
Н-г-Суз-ОН
8—8
Ас-Г)-Су8-Г)-А1а-Г)-Агд-Г)-А1'д-0-Агд-Г)-А1а-Г)-Агд-МН2
Ссылка на АМО 416, или на любое соединение или на фрагмент АМО 416, промежуточный продукт или его предшественник, как описано в настоящем документе, как подразумевается, охватывает их нейтральные незаряженных формы, а также их фармацевтически приемлемые соли, гидраты и сольваты.
Термины АМО 416 гидрохлорид и АМО 416 НС1 являются взаимозаменяемыми и относятся к форме соли гидрохлорида АМО 416, имеющего следующую структурную формулу:
- 3 032597
Н-ь-Су§-ОН
8—8
Ас-о-Су8-о-А1а-п-Аг§-о-Аг§-п-Аг§-п-А1а-о-Аг£-ХГН2 · хНС1
Как правило, х имеет значение 3-5 (например, 3, 4 или 5).
Термин фармацевтически приемлемая соль относится к форме соединения в виде соли, содержащего, по меньшей мере, одну группу, подходящую для образования соли, которая не вызывает какихлибо существенных отрицательных токсикологических эффектов у пациента. Термин фармацевтически приемлемая соль может, в одном аспекте, относятся к относительно нетоксичным, неорганическим или органическим кислотно-аддитивные солям соединений, как представлено в настоящем документе, например, АМО 416, а также фрагментов АМО 416, промежуточных продуктов, предшественников, и тому подобное, обладающих одной или несколькими ионизированными аминогруппами. Типичные соли включают гидробромид, гидрохлорид, сульфат, бисульфат, фосфат, нитрат, ацетат, валерат, олеат, пальмитат, стеарат, лаурат, бензоат, лактат, фосфат, тозилат, цитрат, малеат, фумарат, сукцинат, тартрат, нафтилат, мезилат, глюкогептонат, лактобионат и лаурилсульфонат и тому подобное. (Смотри, например, Вегде е! а1. (1977) РИагтасеи11са1 8а1!з, I. РИагт. 8сг 66:1-19). Дополнительные подходящие фармацевтически приемлемые формы солей можно найти, например, в НапбЬоок о£ РкагтасеиИса1 8а1!з: Ргорегбез, 8е1ее1юп апб Изе, ^'еткепп/йпск:^11ег-УСН'УНСЛ, 2002; Р. Н. 8!аИ1 апб С. О. У ептак, Ебз.
Используемые в настоящем описании термины аминокислота и остаток являются взаимозаменяемыми и, при использовании в контексте пептида или полипептида, относятся как к природным и синтетическим аминокислотам, так и к аналогам аминокислот, миметикам аминокислот и к не встречающимся в природе аминокислотам, которые химически подобны природным аминокислотам. Свободная аминокислота или свободная аминогруппа относится к аминокислоте, пептидному фрагменту или к пептиду, содержащему аминогруппу, которая представлена в форме -ΝΗ2, то есть, не защищена.
Выражение защитная группа или РО, используемое в настоящем документе, относится к временному заместителю или заместителям, которые защищают потенциально реакционноспособную функциональную группу от нежелательных химических преобразований. Примеры таких защитных групп включают сложные эфиры карбоновых кислот, силиловые эфиры спиртов и ацетали и кетали альдегидов и кетонов, соответственно. Смотри, например, Огеепе, Т.^.; Ун1з, Р.О.М. Рго1есбуе Огоирз ίη Огдаше 8упШез1з, 41И еб.;; ^11еу: Хе\\- Уогк, 2007; 1з1бго-ЫоЬе1, Л., е! а1., Атто Ас1б-Рго1ес1тд Огоирз, СИет. Кеу 2009, 109, 2455-2504. Реакционноспособные аминокислоты или пептидные фрагменты, как описано в настоящем документе, часто для удобства содержат одну или несколько защитных групп на функциональных группах, которые не являются мишенью объекта химического превращения. Иллюстративные защитные группы включают, например, карбоксибензил, также обозначается как бензилоксикарбонил (СЬ7 или Ζ), 9-флуоренилметоксикарбонил (Гтос), 2,2,4,6,7-пентаметилдигидробензофуран-5сульфонил (РЫ), трет-бутилоксикарбонил (Вос), тритил (Тп), метиловый эфир (ОМе), 2пиридинсульфенил (8Ру или 8-Руг), амид, и тому подобное. В сокращенных структурах, представленных в настоящем документе, -ΝΗ2 на С-конце обозначает амидную защитную группу (~ С(О)\112), Н на Νконце относится к свободной аминогруппе, и обозначение защитной группы в скобках означает, что защитная группа находится на δ азоте орнитина.
Используемый в настоящем описании термин агент удаления защиты или агент, снимающий защиту могут быть использованы взаимозаменяемо, и представляет собой химический реагент для удаления аминозащищающих агентов, связанных с аминокислотами, и аминозащищающие агенты могут представлять собой хорошо известные в данной области, такие как, но не ограничиваясь этим, Гтос и Вос.
Используемый в настоящем документе термин агент конденсации, конденсирующий агент, активирующий агент, агент, активирующий конденсацию используется в настоящем документе взаимозаменяемо, относятся к химическим реагентам, которые облегчает реакцию аминогруппы из одной аминокислоты с карбоксильной группой из другой аминокислоты с образованием пептидной связи. Иллюстративные конденсирующие агенты хорошо известны в данной области и включают, но не ограничиваются этим, карбодиимиды, такие как Ν,Ν'-диизопропилкарбодиимид (1)1С), дициклогексилкарбодиимид (ИСС), 1 -[бис(диметиламино)метилен]-1 Н-1,2,3-триазол[4,5-Ь]пиридин-3-оксид гексафторфосфат (НАТи), [бензотриазол-1-ил-окси(диметиламино)метилиден]-диметилазаний; тетрафторборат (ТВТи), ^Н№,№-тетраметил-О-( 1 Н-бензотриазол-1 -ил)урония, О-(бензотриазол-1 -ил)-НН№,№-тетраметилурония (НВТи), и Ν,Ν-диизопропилэтиламин (И1РЕА). См., например, Е1-ТаИат, А. Апб А1Ьепсю, Г., Рерббе Соир1тд Кеадеп1з, Моге 1Иап а Ьебег 8оир, СИет. Кеу. 2011, 111, 6557-6602. Такие соединения легко доступны от коммерческих поставщиков.
Используемый в данном описании термин агент отщепления означает химическое вещество, которое может отделить пептид, связанный со смолой, от смолы. Агенты отщепления хорошо известны обычным специалистам в данной области техники и включают раствор кислот, содержащий раствор ТГА и НС1.
- 4 032597
Термин лечение относится к любым признакам успеха в лечении или облегчения поражения, патологии или состояния, включая какие-либо объективные или субъективные параметры, такие как ослабление боли или выраженности симптома; ремиссию; уменьшение признаков или симптомов или то, что делает поражение, патологию или состояние более переносимым для пациента; замедление скорости дегенерации или упадка; то что делает конечную точку дегенерации менее изнурительной; улучшение физического или психического благополучия пациента. Лечение или ослабление признаков или симптомов могут быть основаны на объективных или субъективных параметрах; включая результаты физического осмотра. Например, некоторые методы, представленные а настоящем документе, успешно используют для лечения 8НРТ у гемодиализных пациентов с СКО-ΜΒΌ за счет уменьшения сывороточного интактного паратироидного гормона (1РТН).
Термин эффективное количество, как правило, означает количество, достаточное для уменьшения тяжести и/или частоты симптомов, устранения симптомов и/или их основной причины, предотвращения возникновения симптомов и/или их основной причины, и/или улучшения или устранения повреждений, которые являются следствием или связаны с состоянием заболевания (например, повышенные уровни РТН). Термин терапевтически эффективное количество означает количество, достаточное для устранения болезненного состояния или симптомов, в частности, состояния или симптомов, связанных с болезненным состоянием, или иное предотвращение, препятствие или обращение вспять прогрессии патологического состояния или любого другого нежелательного симптома, связанного каким-либо образом с заболеванием. Полный терапевтический эффект необязательно имеет место при введении одной дозы, и может проявляться только после введения серии доз. Таким образом, терапевтически эффективное количество может быть введено за один или несколько приемов.
Термины терапевтически эффективная доза и терапевтически эффективное количество, используемые в настоящем документе, означают количество, которое вызывает биологическую или медицинскую реакцию в системе тканей, у животного или человека, которой добивается исследователь, врач или другой клиницист, которая включает ослабление или облегчение признаков или симптомов заболевания или расстройства, подлежащего лечению, то есть, количество велькальцетида, которое поддерживает наблюдаемый уровень одного или более желательных биологических или медицинских реакций, например понижение 1РТН.
Термины пептид, полипептид и белок являются взаимозаменяемыми и относятся к полимеру аминокислотных остатков. Термины также применяются к аминокислотным полимерам, в которых один или несколько аминокислотных остатков представляет собой аналог или миметик соответствующей природной аминокислоты, а также к встречающимся в природе полимерам аминокислот. Термины могут также охватывать полимеры аминокислот, которые были модифицированы, например, путем добавления углеводных остатков с образованием гликопротеинов, или путем фосфорилирования. Пептиды, полипептиды и белки могут быть получены с помощью жидкофазного или твердофазного синтеза или с помощью генетически сконструированной или рекомбинантной клетки, и включают молекулы, имеющие аминокислотную последовательность.
Вариант пептида или полипептида содержит аминокислотную последовательность, в которой один или несколько аминокислотных остатков вставлены, делетированы и/или заменены в аминокислотной последовательности относительно другой полипептидной последовательности. Варианты включают слитые белки.
Производное пептида или полипептида представляет собой пептид или полипептид, который был химически модифицирован каким-либо способом, отличным от вариантов со вставкой, делецией или заменой, например, посредством конъюгации с другим химическим компонентом. Такая модификация может включать ковалентное присоединение группы к аминогруппе и/или карбокси-концу пептида или полипептида, например, ацетилирование амино-конца и/или амидирование карбокси-конца пептида или полипептида.
Термин аминокислота включает свое обычное значение в данной области. Двадцать природных аминокислот и их сокращенные обозначения используются согласно своему обычному применению. См, 1ттипо1оду-А 8уп1йе5к, 2пб ЕбШоп, (Е. 8. Со1иЬ апб Ό. К. Сгееп, еб§.), 8шаиег ΛδδοοίηΙοδ: 8ипбег1апб, Μ;·ΐ55. (1991), которые включены в настоящий документ в качестве ссылки для любых целей. Стереоизомеры (например, Ό-аминокислоты) 19 стандартных аминокислот (за исключением глицина), неприродные аминокислоты, такие как [альфа]-, [альфа]-дизамещенные аминокислоты, Ν-алкиламинокислоты и другие нестандартные аминокислоты также могут быть подходящими компонентами для полипептидов и включены в выражение аминокислоты. Примеры нестандартных аминокислот включают: гомоцистеин, орнитин, 4-гидроксипролин, [гамма]-карбоксиглутамат, [эпсилон]-М,^№триметиллизин, [эпсилоЩ-Νацетиллизин, О-фосфосерин, Ν-ацетилсерин, Ν-формилметионин, 3-метилгистидин, 5-гидроксилизин, | сигма Ι-Ν-метиларгинин и другие подобные аминокислоты и иминокислоты (например, 4гидроксипролин). В обозначениях полипептида, используемых в настоящем документе, левым направлением является амино-концевое направление и правым направлением является карбокси-концевое направление, в соответствии со стандартным использованием и обозначением.
Термин объект или пациент, используемый в настоящем документе, может относиться к любым
- 5 032597 млекопитающим. В типичном воплощении объект или пациент является человеком.
Термин ц.8. означает добавление количества, достаточного для достижения целевой функции, например, доведение раствора до целевого объема (т.е. 100%).
II. Воплощения изобретения.
В одном или более воплощениях, АМО 416 гидрохлорид получают через последовательность стадий способа следующим образом: иллюстративные стадии включают твердофазный пептидный синтез семичленного линейного фрагмента (стадия I) ЛМО 416, с последующим отщеплением пептидной цепи от смолы с сопутствующей деблокировкой боковой цепи и активацией цистеина (стадия II), за которым следует т-8йи конюгация пептидной цепи с Ь-Су§ (образование дисульфидов) с получением неочищенного АМО 416 (стадия III), а затем в некоторых воплощениях немедленная препаративная ВЭЖХ и лиофилизации с получением очищенной ТТА-соли АМО 416 (стадия IV). За стадией IV следует последующий солевой обмен (ТТА на НС1) путем осаждения, а в некоторых воплощениях, с последующей микрофильтрацией и лиофилизацией с получением очищенного гидрохлорида АМО 416 (стадия V).
Твердофазный пептидный синтез
Семичленный линейный фрагмент АМО 416 может быть синтезирован любым методом, известным в данной области техники, включая твердофазный пептидный синтез (8РР8). Используемый в настоящем документе термин твердофазный синтез или твердофазный пептидный синтез относится к методу, известному обычному специалисту в данной области, в котором растущая пептидная цепь связана с твердой подложкой. Твердофазный синтез, как правило, включает стадии: (1), ковалентного связывания первой аминокислоты (в которой аминогруппа блокирована или защищена) с твердофазной подложкой; (ϊϊ) удаления защитной группы из аминогруппы с использованием деблокирующего агента; (ΐΐΐ) активации карбоксила второй аминокислоты (в которой аминогруппа заблокирована) и контакт второй аминокислоты с первой аминокислотой, связанной с носителем твердой фазы таким образом, чтобы был получен дипептид (в котором аминогруппа заблокирована); (ιν) повтор стадий образования пептидной связи и, таким образом, пептидная цепь протягивается от С-конца к Ν-концу; и (ν) удаление защитной группы с аминогруппы и отделение пептидной цепи от твердофазной подложки с использованием агента отщепления с получением пептида.
Подходящие методы твердофазного синтеза хорошо известны в данной области, и включают в себя те, которые описаны в МетйеШ, т СНет. Ро1урер11бе8, рр. 335-61 (Ка18оуапп18 апб Рапауойз еб8. 1973); МетйеШ, Т Ат. СНет. 8ое. 85:2149 (1963); 1)а\ч8 е1 а1., ВюсНет. Ыб. 10:394-414 (1985); 81е'\еаг1 апб Уоипд, 8о11б РНа8е Рерйбе 8уп1Не818 (1969); и.8. Ра1. Νθ. 3,941,763; Ешп е1 а1., ТНе Рго1ет8, 3гб еб., νо1. 2, рр. 105-253 (1976); апб Епекдоп е1 а1., ТНе Рго1ет8, 3гб еб., νо1. 2, рр. 257-527 (1976). См., также НоиЬепАеу1, Ме1Ноб8 о£ Огдатс СНет181гу. Аббйюпа1 8ирр1етеп1агу Vо1ите8 1о 1Не 41Н Еб., Vо1 Е22А, 8уп1Не818 о£ Рер11бе8 апб Рер11бот1те11С8, Ебйог-т-СЫе£ М. Оообтап. Оеогд ТЫете Уег1ад: 81иИдагб апб Хел Уогк. 2002, рр. 685-877; СНап, ^.С., \С1н1е\ Р.И., Етос 8о11б РНа8е Рерйбе 8уп1Не818, А Ргасйса1 АрргоасН. Ох£огб ЕтоелщНу Рге88, (200), р. 9-109. Твердофазный синтез, как правило, является предпочтительным методом получения индивидуальных пептидов, таких как АМО 416, так как он часто является одним из наиболее экономически эффективных способов получения пептидов небольших размеров.
В некоторых воплощениях, линейный фрагмент основной цепи АМО 416 собран с использованием стандартных протоколов твердофазного пептидного синтеза пептидов с использованием стратегии Етосзащиты и, например, смолы К1пк ат1бе (ВАМ), такой как доступные от 81дта А1бпсН, с получением Сконцевого амида, связанного со смолой, наряду с ацетилированием пептидного Ν-конца. В некоторых других воплощениях могут быть использованы другие смолы и линкеры (например, смола Ватаде ат1бе АМ, также называемая как смола с трициклическими амидными линкерами). В одном воплощении, сборка основной цепи линейного фрагмента включает стадии: (1) смешивание смолы Етос-Вшк ат1бе АМ с деблокирующим агентом с получением смолы Вшк ат1бе АМ; (ϊϊ) конденсации (РЫ)-ОН-ЭАгдЕтос со смолой Вшк ат1бе АМ с получением Етос-В-Агд(РВЕ)-Кшк ат1бе АМ смола; (ΐΐΐ), повтор деблокирования Етос на стадии (1) и конденсации между аминокислотой и полипептидом на смоле на стадии (й) для каждого оставшегося аминокислотного остатка линейного фрагмента основной цепи АМО 416, с наращиванием от С-конца к Ν-концу (например, с использованием Етос-И-Су8(Тг1)-ОН, Етос-ΌА1а-ОН и Етос-В-Агд(РЫ)-ОН) с образованием полипептидной смолы, представленной 8ЕР ГО ΝΟ: 2; и (ιν), повтор деблокирования Етос на стадии (1) и ацетилирование Ν-конца с образованием полипептидной смолы, представленной 8ЕР ГО NΟ: 3. См. фиг. 2.
Етос-О-Суз(Тг£)-О-А1а-О-Агд(РЬ£)-ϋ-Агд(РЬ£)-ϋ-Агд(РЬ£)-ϋА1а-О-Агд(РЬ£)-[Смола] (5Е<2 Ю N0: 2)
Αο-ϋ-Суз(Тг£)-О-А1а-О-Агд(РЬ£)-ϋ-Агд(РЬ£)-ϋ-Агд(РЬ£)-ϋА1а-О-Агд(РЬ£)-[Смола] (5Е<2 Ю N0: 3)
Как правило, отщепление защитной группы Етос достигается с помощью деблокирующего агента,
- 6 032597 такого как пиперидин в ЭМЕ. В одном воплощении конденсацию Етос-защищенной аминокислоты проводят в растворителе, таком как диметилформамид (ЭМЕ) с использованием подходящего конденсирующего агента, такого как карбодиимид, Ν,Ν-диизопропилкарбодиимид (Э1С), необязательно в присутствии добавки, такой, как этил-2-циано-2-(гидроксиимино)ацетат (Охута) для всех аминокислот, кроме цистеина. В случае удлинения пептидной цепи на цистеин, конденсацию, как правило, проводят с использованием Ν,Ν-диизопропилкарбодиимида (Э1С) в присутствии бензотриазольной добавки, такой как гидроксибензотриазол (НОВ!) в системе растворителей, такой как диметилформамид-дихлорметан, (т.е., ΏΜΓ, ОСМ, НОВ!, ШС).
Ацетилирование Ν-конца может быть осуществлено любым методом, известным в данной области техники. В одном воплощении, ацетилирование Ν-конца проводят с использованием, например, уксусного ангидрида (Ас2О) в пиридине и ЭМЕ.
Отщепление от смолы
Пептид может быть отделен от подложки, и защитные группы могут быть удалены из боковых цепей любыми способами, известными в данной области техники. См., например, 8уп!йейс Рерйбез: Α Изег'з Ош4е (О.А. Огап!, е4.), А.Н. Егеетап ап4 Сотрапу, \е\\- Уогк, 1992; ап4 Сйап, А.С., \Пше, Ρ.Ώ. Етос δοϊίά Рйазе РерИс!е 8уп!йез1з, Α Ргас!1са1 Арргоасй, Ох£ог4 итуегзйу Ргезз (2000), р. 64-66 ап4 105109.
В одном воплощении, пептидил-смолу добавляют к коктейлю растворов, содержащему воду (например, деионизированную воду (ΏΙΑ)) трифторуксусную кислоту (ТЕА), триизопропилсилан (Т1Р8) и дипиридилдисульфид (ОРП8). Это позволяет пептиду отделиться от смолы с сопутствующей деблокировкой боковой цепи и активацией цистеина, с получением таким образом ш-зйи конъюгации с Ь-Суз. Получают промежуточный продукт 8Ру из семи аминокислот (АА1-7(8Р¥)). См. фиг. 3. Последовательность промежуточного продукта 8Ру представлена в 8ЕЦ ΙΏ NО: 4.
Αο-ϋ-Суз(ЗРу)-О-А1а-О-Агд-О-Агд-О-Агд-О-А1а-О-Агд-ЫН2 (3Εζ) Ю ΝΟ: 4)
Ιπ-8ΐίιι конъюгация и препаративная ВЭЖХ
Промежуточный продукт 8Ру может быть конъюгирован с Ь-Суз любым способом, известным в данной области техники. В одном воплощении, конъюгацию Ь-Суз осуществляют в водном растворе ТЕА.
Полученный АМО 416 (ТЕА соль) может быть очищен любым способом, известным в данной области техники. В одном воплощении АМО 416 (ТЕА соль) очищают с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Например, в одном из воплощений, очистка и концентрирования АМО 416 (ТЕА соль) включает стадию очистки на ВЭЖХ с обращенной фазой и стадию концентрирования на ВЭЖХ с обращенной фазой. См. фиг. 4.
Очищенный и концентрированный образец, содержащий АМО 416 (ТЕА соль) может быть лиофилизован.
Превращение соли
Соль ТЕА может быть превращена в фармацевтически приемлемую соль, такую как гидрохлорид, любыми способами, известными в данной области техники.
В одном воплощении, лиофилизированную ТЕА соль АМО 416 растворяют в водном растворе изопропилового спирта (1РА). Раствор соли ТЕА затем загружают в раствор НС1 для солевого обмена и осаждения соли НС1. Осадок может быть затем восстановлен водой, отфильтрован через микрофильтр (например, фильтр 0,2 мкм) и лиофилизирован для выделения соли НС1 АМО 416. См. фиг. 5.
Очистка промежуточного продукта 8Ру
В альтернативном воплощении промежуточный продукт 8Ру очищают перед конъюгацией с Ь-Суз. Как правило, промежуточные продукты 8Ру, в частности, промежуточные продукты пептид-8Ру, считаются крайне нестабильными, т.е., как полагают, недостаточно стабильными, чтобы выдерживать эффективную очистку, например, с помощью ВЭЖХ. Однако при достижении предлагаемых здесь способов заявителями неожиданно было обнаружено, что промежуточные продукты пептид-8Ру, полученные в соответствии со способами, описанными в настоящем документе, на самом деле достаточно стабильны, чтобы выдержать отдельную стадию очистки. Кроме того, было также обнаружено, что очистка таких промежуточных продуктов перед конъюгацией с Ь-Суз может фактически увеличить эффективность и снизить стоимость изготовления конечного продукта пептидного лекарственного средства.
В иллюстративном воплощении, альтернативный способ осуществляют следующим образом. Метод, описанный ниже и в примере 5, пригоден для очистки промежуточного продукта 8Ру, как это предусмотрено в настоящем документе, где промежуточный продукт остается стабильным, и подходит для конъюгации с тиолсодержащим компонентом, например, посредством образования дисульфидных связей. Например, промежуточный продукт пептид-8Ру растворяют в водном растворе, содержащем не более чем примерно 0,2% ТЕА, например, примерно 0,05-0,15% ТЕА, или примерно 0,1% ТЕА, и затем непосредственно наносят на колонку ВЭЖХ для хроматографической очистки. Затем может проводиться замена растворителей фракций ВЭЖХ, содержащих промежуточный продукт пептид-8Ру, например,
- 7 032597 путем азеотропной перегонки. После замены растворителя промежуточного продукта пептид-8Ру на соответствующий растворитель, такой как смесь вода-изопропанол, добавляют тиолсодержащим фрагмент, такой как Ь-Сук, непосредственно к раствору промежуточного продукта пептид-8Ру для осуществления конъюгации. Полученный в результате конъюгированный продукт, например, в растворе, затем доступен для солевого обмена.
Конкретное воплощение описанного метода очистки заключается в следующем. После исходного отщепления пептида от подложки смолы и выделения промежуточного продукта АА1-7(8Ру), промежуточный продукт растворяли в 0,1% ТЕЛ и ацетонитриле, загружали на колонку ВЭЖХ с неподвижной фазой и очищали, как описано выше. Применение 0,1% раствора ТЕА имеет несколько преимуществ для ВЭЖХ-очистки по сравнению с использованием, например, 0,2% раствора ТЕА. Например, 0,1% ТЕА менее вредна для неподвижной фазы в процессе очистки, чем раствор ТЕА более высокой концентрации. То есть, при использовании такой оптимальной концентрации ТЕА, происходит меньшее разложение неподвижной фазы, что приводит к более длительному сроку годности неподвижной фазы. Кроме того, промежуточный продукт пептид-8Ру (например, АА1-7(8Ру)) менее полярный, в результате чего промежуточный продукт лучше удерживается на неподвижной фазе с обращенной фазой. В результате, в каждом цикле очистки может быть достигнута значительно более высокая нагрузка на неподвижную фазу. В некоторых воплощениях, увеличенная емкость нагрузки увеличивает пропускную способность процесса производства до 1,5-2 раз, или примерно в 1,5 раза.
ВЭЖХ-фракции, содержащие промежуточный продукт 8Ру в виде соли ТЕА затем подвергают азеотропной перегонке с достаточным количеством 1РА для замены растворителя с ацетонитрила и воды на 15% воды в растворе 1РА, подходящем для Ь-Сук конъюгации и солевого обмена. Этот способ особенно предпочтителен, поскольку конъюгацию и солевой обмен можно проводить в одном сосуде, что дополнительно повышает эффективность и возможности реализации производственного процесса.
Производство исходного материала Етос-Э-Агд(РЫ)-ОН
АМС 416 содержит линейную последовательность из 7 аминокислот, 4 из которых представляют собой Ό-аргинин. В настоящем документе раскрыт способ синтеза Етос-Э-Агд(РЫ)-ОН, Етоспроизводного Ό-аргинина, используемого в синтезе АМС 416. Использование исходного материала Етос-Э-Агд(РЫ)-ОН высокого качества может дать дополнительную чистоту неочищенному АМС 416 от стадии I к стадии III, чтобы тем самым увеличить степень очистки на стадии IV. Еще более важно, что использование исходного материала высокого качества и высокой чистоты может обеспечить целевой и предпочтительный элемент контроля для обеспечения целевой чистоты АМС 416. Был разработан новый способ получения И-Агд(РЫ)-ОН и Етос-Э-Агд(РЫ)-ОН высокого качества, который производит более высокий выход, требует меньшего количества отдельных операций, обеспечивает более надежный контроль качества и имеет возможность крупномасштабного производства. В общем, способ получения Етос-Э-Агд(РЫ)-ОН, описанный в настоящем документе, представляет собой значительное увеличение возможности производства АМС 416, сопровождающееся потенциальным ростом качества.
Синтетический путь, который является одним из наиболее кратких синтезов Етос-Э-Агд(РЫ)-ОН, обнаруженных в литературе, и которые могут быть использованы для промышленного масштаба синтеза Етос-Э-Агд (РЫ) -ОН, представлен далее. См., например, Китайский патент № СИ101250172В от 2 мая 2012 года. Синтез начинается путем защиты аминогруппы Ό-Агд с помощью ди-трет-бутилдикарбоната (Вос2О) с получением Вос-Э-Агд-ОН с приблизительно количественным выходом после выделения. На стадии 2 группу гуанидина боковой цепи защищают группой РЫ в присутствии основания, такого как водный раствор гидроксида натрия. Продукт используют непосредственно на следующей стадии в виде раствора ГРА (изопропиловый спирт) без выделения. Стадия 3 включает удаление защитной группы Вос в кислых условиях и выделение соответствующего продукта, И-Агд(РЫ)-ОН, в виде кристаллического промежуточного продукта. Стадия 4 способа включает введение защитной группы Етос на функциональные аминогруппы с получением Етос-Э-Агд(РЫ)-ОН в качестве конечного продукта. Так как продукты обеих стадий, 2 и 4, являются аморфными веществами, то есть, обеспечивают ограниченные возможности удаления примесей, то кристаллический промежуточный продукт И-Агд(РЫ)-ОН (продукт стадии 3) служит в качестве контрольной точки для влияния и обеспечения чистоты конечного продукта.
Получение продукта высокой степени чистоты является серьезной проблемой, когда оно осуществляется, опираясь на способы, описанные в литературе. Множество перекристаллизации, как правило, требуется для удовлетворения требований к чистоте. В качестве примера, И-Агд(РЫ)-ОН перекристаллизовывают семь раз в тройной системе растворителей ЕЮН/ЕЮАс/вода в целях повышения чистоты до целевого уровня. Кроме того, на стадии 2, 20-30% от исходных материалов остаются непрореагировавшими даже в присутствии большого избытка гидроксида натрия и РЫС1, и общий выход (стадия 1-3), как правило, составляет лишь менее 40%.
Усовершенствованный способ, разработанный и описанный в настоящем документе и проиллюстрированный на фиг. 6 и 7, обеспечивает несколько преимуществ по сравнению с известными способами. Иа! вводят в качестве катализатора для превращения Вос-Э-Агд-ОН в Вос-Э-Агд(РЫ)-ОН (стадия 2 на фиг. 6).
Включение иодида натрия является эффективным для значительного улучшения кинетики реакции
- 8 032597 и, как следствие, превращение стадии 2 может быть увеличено более чем на 95%, а аналитический выход может составить до ~ 90%. Кроме того, общее количество примесей также уменьшается.
О-Огп(РЬГ)-ОН и этиловый эфир О-Агд(РВЕ)-ОН являются ключевыми примесями, образующимися на стадии 2 и стадии 3 (фиг. 7), соответственно, и их трудно удалить с помощью кристаллизации, тем самым способствуя необходимости осуществления множества перекристаллизации. Усовершенствованный способ, описанный в настоящем документе, дополнительно включает использование изопропилацетата (1РАс), более стерически затрудненного сложного эфира по сравнению с более часто применяемым ЕЮАс, в качестве растворителя для стадии 3, в которой Вос-О-Агд(РЬГ)-ОН преобразуется в О-Атд(РЬГ)ОН. Использование 1РАс значительно замедляет побочную реакцию переэтерификации, катализируемую сильной кислотой НС1. В результате, содержание соответствующей примеси, эфира И-Атд(РЬГ)-ОН, снижается до менее чем примерно 0,5% (по сравнению с более чем 1% в способе, в котором применяют ЕЮАс). Кроме того, было обнаружено, что изопропиловый спирт (1РА)/вода представляет собой более мощную систему растворителей, что позволяет удаление всех примесей способа с минимизаицей потерь продукта на стадиях кристаллизации. В тестовом прогоне, проводимом в лабораторном масштабе (20 г), чистоту И-Атд(РЬГ)-ОН (промежуточная стадия 3) улучшали до более чем 99,7% с использованием только двух кристаллизации, и общий выход (стадия 1-3) составил приблизительно 70%. Одно воплощение этого усовершенствованного способа описано в примере 6 ниже.
Специалисту в данной области будет понятно, что настоящее изобретение также распространяется на варианты и производные АМС 416. Например, в одном воплощении, способы, представленные в настоящем документе, могут также быть использованы вместе с Ν-ацетил-О-цистеинил-О-аланил-Оаргинил-О-аргинил-О-аргинил-О-аланил-О-аргинамид дисульфидом с Ό-цистеин. В другом воплощении, раскрытые составы также могут быть использованы вместе с Ν-ацетил-Е-цистеинил-Е-аланил-Еаргинил-Е-аргинил-Е-аргинил-Е-аланил-Е-аргинамид дисульфидом с Ό-цистеином и/или Ν-ацетил-Ьцистеинил-Е-аланил-Е-аргинил-Е-аргинил-Е-аргинил-Е-аланил-Е-аргинамид дисульфидом с Ь-цистеином. В другом воплощении, раскрытый состав также может быть использован вместе с Ν-ацетил-Оцистеинил-О-аргинил-О-аланил-О-аргинил-О-аргинил-О-аланил-О-аргинамид дисульфидом с Ь-цистеином, и/или N-ацетил-Э- цистеинил-0 -аргинил-0 -аланил-О-аргинил-О-аргинил-О -аланил-0 -аргинамид дисульфидом с Ώ-цистеином. Кроме того, настоящие способы могут быть использованы для приготовления одного или нескольких соединений, представленных в табл. 1-10 Международной Патент. Публикации № АО 2011/014707. В дополнительных воплощениях, способы, описанные в настоящем документе, также могут быть использованы для получения соединений, описанных в Международной Пат. Публикации № АО 2011/014707.
Примеры
Следующие примеры, включающие проведенные эксперименты и достигнутые результаты, представлены исключительно в иллюстративных целях и не должны истолковываться как ограничивающие объем прилагаемой формулы изобретения.
Пример 1А. Синтез линейного фрагмента основной цепи.
Синтез линейного фрагмента основной цепи представлен на фиг. 2. Смолу Ктик Аш14е АМ (Етос2,4-диметокси-4'(карбоксиметилокси)-бензгидриламин, связанный со смолой Лтйюте111у1) (1 кг) добавляли в ВМЕ (5,8 л/кг) и раствор перемешивали при 22°С. Смолу фильтровали и взвесь промывали. Образец тестировали на остаточный Етос (УФ-тест) и остаточный пиперидин (рН). Были проведены колориметрические тесты Кайзера и/или ΤΝΒ8, чтобы гарантировать, что было проведено удаление защитной группы Етос.
Первые шесть конденсаций аминокислотных производных проводили согласно той же процедуре предварительной активации, конденсации и промывки. 1,6 экв защищенной Етос аминокислоты добавляли в ЭМЕ. 8,9 л/кг при 22°С. Затем добавляли Охута (2,45 экв). Раствор охлаждали до 21°С и добавляли И1С (2,13 экв), и давали пройти реакции. Предварительно активированный раствор объединяли со смолой и давали пройти реакции. Добавляли И1С (1,07 экв) и давали пройти реакции при 22°С. Образец тестировали на неполную конденсацию с использованием колориметрических тестов Кайзера и/или ΤΝΒ8. Материал промывали с последующим удалением защитной группы Етос и последующей промывкой. Образец тестировали на остаточный Етос (УФ-тест) и остаточный пиперидин (рН). Проводили колориметрические тесты Кайзера и/или ΤΝΒ8 для гарантии удаления защитной группы Етос.
Етос-О-Су8(Тй)-ОН 1,6 экв добавляли к 1:1,7 ИМЕЮСМ раствора, 12 л/кг, с последующим добавлением НОВ1.Н2О (2,45 экв). Раствор охлаждали до 20°С и добавляли И1С (2,13 экв), и давали пройти реакции. Предварительно активированный раствор объединяли со смолой и реакции давали пройти при 22°С. И1С 1,07 экв загружали в реакцию 8РР8, где отношение ИЕМ/ОСМ составило примерно 1:1. Реакцию давали пройти при 22°С. Образец тестировали на неполную конденсацию с помощью колориметрических тестов Кайзера и/или ΤΝΕ8.
Материал промывали с последующим удалением защитной группы Етос и последующей промывкой. Образец испытывали на остаточный Етос (УФ-тест) и остаточный пиперидин (рН). Проводили колориметрические тесты Кайзера и/или ΤΝΕ8 для гарантии удаления защитной группы Етос.
ЭМЕ (0 л/кг); Уксусный ангидрид (1,06 л/кг) и пиридин (1,06 л/кг) добавляли к раствору, и полу- 9 032597 ченный раствор перемешивали для предварительной активации. Раствор предварительной активации объединяли со смолой и перемешивали при 22°С. Материал фильтровали и промывали. Образец тестировали на неполное кэппирование с использованием колориметрических тестов Кайзера и/или ΤΝΒ8. Материал промывали как суспензию. Смолу сушили в атмосфере азота без перемешивания. Отбирали образец сухой смолы и тестировали на ЬОЭ и остаточный растворитель. См., фиг. 2.
Пример 1В. Синтез линейного фрагмента основной цепи.
Синтез линейного фрагмента основной цепи ЛМО 416 представлен на фиг. 2. Пептидную цепь наращивали от С-конца к Ν-концу на смоле К1пк АМ атЫе, 1 аминокислота за один цикл. Каждый цикл состоял из 2 стадий реакции: 1) отщепление Етос от Ν-конца; 2) конденсация следующей Етосзащищенной аминокислоты или конечное ацетилирование.
Начало 8РР8: смолу Клик АМ атЫе (1 моль) переносили в реактор 8РР8 и промывали Ν,Ν'диметилформамидом (ЭМЕ).
Отщепление Етос: смолу из предыдущей стадии суспендировали в растворе 20% пиперидина в ΌΜΕ в течение, по меньшей мере, 10 мин. Полноту отщепления Етос отслеживали с помощью измерения ультрафиолетового (УФ) поглощения. После завершения отщепления Етос смолу промывали поочередно с помощью ЭМЕА и изопропанола (1РА) до тех пор, пока не будет достигнуто нейтральное рН.
Конденсация Етос-аминокислот: после стадии отщепления Етос осуществляли реакцию конденсации путем смешивания смолы с раствором Етос-защищенного производного аминокислоты (>1,2 моль) и активирующих реагентов (>1,8 моль) (Ν,Ν'-диизопропилкарбодиимид (Э1С) и этил(гидроксиимино)цианоацетат (Охута)) в ЭМЕА. Для конденсации Етос-О-Су8(Тй)-ОН, ΌΙΟ и гидрат 1-гидроксибензотриазола (НОВ!) использовали в качестве активирующих агентов, и смесь ΌΜΕ и дихлорметана (ЭСМ) использовали в качестве реакционного растворителя. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Для отслеживания полноты конденсации осуществляли колориметрические тесты Кайзера и ΤΝΒ8. Требовалось получение отрицательных результаты обоих тестов, Кайзера и ΤΝΒ8, прежде чем процесс переводили на следующий цикл. После каждой стадии конденсации и кэппирования смолу поочередно промывали ΌΜΕ и 1РА.
Конечное ацетилирование: после конечного снятия защиты Етос, Ν-концевую аминогруппу пептида ацетилировали с использованием уксусного ангидрида и пиридина в ЭМЕ. Тесты Кайзера и ΤΝΒ8 проводили для контроля завершения ацетилирования. Если ацетилирование была неполным, то такую же процедуру ацетилирования повторяли до тех пор, пока не получали отрицательные результаты обоих тестов, Кайзера и ΤΝΒ8.
И, наконец, защищенный пептидный остов лекарственного вещества на смоле (АМО 416-смола) выделяли фильтрацией, промывали ЭМЕ, 1РА и ацетонитрилом (АСИ) и сушили при пониженном давлении.
Пример 2А. Отщепление линейного фрагмента основной цепи от смолы.
Раствор коктейля получали смешиванием ΏΙ\ν (0,16 л/кг); ΤЕΑ (5,64 л/кг); ΤΙΓ8 (0,46 экв) и ОРЭ8. (6,41 экв) при комнатной температуре, а затем охлаждением раствора до 0±2°С. Пептид на смоле добавляли к раствору коктейля при 0±2°С, и раствор нагревали до 25°С и давали реакции пройти. Смолу удаляли фильтрацией и промывали. Раствор выдерживали при температуре -10°С и добавляли 6,8:1 раствор IРΕ:ΜеСN (24,5 л/кг) при температуре -10°С в течение некоторого времени для контроля температуры и осаждения. Реакция протекала, и промежуточный продукт АМО 416 8Ру фильтровали при температуре 5°С и промывали. Промежуточный продукт 8Ру сушили при 20°С под полным вакуумом. См. фиг. 3.
Пример 2В. Отщепление линейного фрагмента основной цепи от смолы.
Раствор отщепления получали в реакторе путем смешивания ΤΕΆ, Н2О и триизопропилсилана (ПР8) в приблизительном соотношении 96,9:2,6:0,5 (об/об/об). К раствору отщепления, ЭРЭ8 (>1,2 моль) добавляли в качестве активирующего реагента сульфгидрильную группу Ό-цистеина. АМО 416смолу (1 моль) загружали в реактор, и реакционную смесь перемешивали в течение >1 часа при комнатной температуре. Смолу отфильтровывали. Фильтрат и промывочные растворы переносили в другой реактор и охлаждали. Холодную смесь анти-растворителя диизопропилового эфира (1РЕ) и ΑСN затем загружали в раствор для осаждения АМО 416-8Ру. Суспензию фильтровали через фильтр-осушитель, и фильтрат АМО 416-8Ру затем промывали с помощью ΑСN и 1РЕ и сушили при температуре приблизительно 20°С при пониженном давлении на фильтре-осушителе.
Пример 3. Ιη-8ίΙιι конъюгация с Ь-цистеином/препаративная ВЭЖХ.
Промежуточный продукт АМО 416 8Ру (1 моль) добавляли к 0,2% раствору ΤЕΑ. Ь-цистеин (>1,1 моль) добавляли к раствору, и давали реакции пройти при комнатной температуре в течение, по меньшей мере, 15 мин.
Очистку неочищенного продукта АМО 416 проводили с помощью препаративной хроматографии с использованием С18 силикагеля в качестве неподвижной фазы и с использованием ΑСN/Н2О в качестве подвижной фазы и ЕЕА в качестве модификатора. Неочищенный раствор АМО 416 из Стадии III загружали на колонку и использовали метод линейного градиента для стадии очистки. Элюирование отслеживали с помощью УФ-поглощения при 230 нм. После каждой загрузки колонку промывали 80% ΑСN в
- 10 032597 воде (об/об) до получения стабильного базового уровня УФ. Фракции хранили при 5°С, проводили забор образцов и затем собирали фракции, имеющие требуемую чистоту (определенную с помощью ВЭЖХ). Объединенные пулы из прогона очистки концентрировали путем осуществления прогона концентрирования с использованием той же колонки ВЭЖХ. Фракции хранили при 5°С. Фракции с целой чистотой (определенной с помощью ВЭЖХ) лиофилизировали для выделения ΤΡΑ соли ЛМО 416. См. фиг. 4.
Пример 4. Солевой обмен.
ТРА соль АМО 416 добавляли к раствору 15% воды в ΙΡΑ (об/об) 10 л/кг при 10°С до тех пор, пока не наблюдали полного растворения. Раствор добавляли к раствору 12М водной НС1, 0,27 л/кг и ΙΡΑ 49,4 л/кг в течение 3 ч с помощью подслойного добавления, что приводило к непосредственному осаждению соли АМО 416 4,5 НС1. Загрузку выдерживали в течение 3 ч и отбирали пробы для анализа.
Материал фильтровали и взвесь промывали 96 мас.% ΙΡΑ, 10 л/кг. Фильтрат ресуспендировали в течение 4 ч в 10 л/кг 96 мас.% ΙΡΑ. Материал фильтровали и далее суспензию промывали 96% ΙΡΑ, 10 л/кг, а затем ΙΡΑ 10 л/кг. Материал сушили при полном вакууме при 25°С. Сухой фильтрат растворяли в воде 8 л/кг, и смесь концентрировали с помощью перегонки для удаления остаточного ΙΡΑ и достижения целевой концентрации. Температуру раствора поддерживали ниже 25°С на протяжении перегонки. См. фиг. 5.
Пример 5. Очистка промежуточного продукта 8Ρу и получение ΑΜΟ 416 НС1.
Здесь описан альтернативный способ получения НС1 соли ΑΜΟ 416. Как описано выше в примере 2, промежуточный продукт 8Ρу сушили при 20°С при полном вакууме после отщепления от смолы, осаждения и фильтрации. Осадок растворяли в 0,1% водном растворе ΤΡΑ и наносили на колонку С-18 для очистки ВЭЖХ. Колонку прогоняли при <60 бар, и температура раствора составляла все это время 1525°С.В качестве элюентов выступали 0,1% ΤΡΑ в ацетонитриле и 0,1% ΤΡΑ в воде. Фракции хранили при 5°С, их отбирали и затем фракции объединяли. Объединенные пулы из двух прогонов разводили и осуществляли прогон концентрирования/очистки с использованием той же колонки ВЭЖХ для уменьшения общего объема и удаления дополнительных примесей. Фракции хранили при 5°С.
Фракции, содержащие промежуточный продукт ΑΜΟ 416 8Ρу, подвергали азеотропной перегонке для замены растворителя с 0,1% ΤΡΑ на 15% воду в растворе ΙΡΑ, загружая ΙΡΑ по мере необходимости. К полученному в результате промежуточному продукту ΑΜΟ 416 8Ρу в растворе ΙΡΑ затем добавляют Ь-цистеин 1,15 экв, и реакции давали пройти при комнатной температуре для осуществления конъюгации и образования ΤΡΑ соли ΑΜΟ 416, как описано выше в примере 4. Раствор ΑΜΟ 416 ΤΡΑ добавляли к раствору 12М водного раствора НС1, 0,27 л/кг и ΙΡΑ 49,4 л/кг в течение 3 ч посредством подслойного добавления, что приводило к непосредственному осаждению соли ΑΜΟ 416 4,5 НС1.
Загрузку выдерживают в течение 3 ч и отбирали пробы для анализа.
Материал фильтровали, и взвесь промывали 96 мас.% ΙΡΑ, 10 л/кг. Затем фильтрат ресуспендировали в течение 4 ч в 10 л/кг 96% масс.% ΙΡΑ. Материал фильтровали и далее суспензию промывали 96% ΙΡΑ, 10 л/кг, а затем ΙΡΑ 10 л/кг. Материал сушили при полном вакууме при 25°С. Сухой фильтрат растворяли в воде 8 л/кг, и загрузку концентрировали с помощью перегонки для удаления остаточного ΙΡΑ и достижения целевой концентрации. Температуру раствора поддерживали ниже 25°С на протяжении перегонки.
Приер 6. Синтез Н-^-Α^д(ΡЬΓ)-ОН.
Синтез линейного фрагмента основной цепи, как описано в примере 1, требует использования Ртοс-^-Α^д(ΡЬ£)-ОН для добавления субъединиц Ό-аргинина, которые составляют до 4 из 7 остатков в линейном фрагменте. Усовершенствованный и более эффективный способ синтеза Ртос-^-Α^д(ΡЬΓ)-ОН описан ниже.
Синтез начинали с защиты аминогруппы Э-Лгд с помощью ди-трет-бутилдикарбоната (Вос2О) с получением Вос-^-Α^д-ОН с приблизительно количественным выходом после выделения с помощью кристаллизации по стандартной методике, описанной в литературе. Гуанидиновую группу боковой цепи аргинина защищали группой Ρ6Γ с помощью добавления в течение одного часа (0-5°С) раствора ацетон/ΙΉΤ 10/1 Ρ6Γ-Ο (1,3 экв) в присутствии водного раствора ЫаОН (4,3 экв)/NаI (5% моль) в качестве основы, с получением Вос-^-Α^д(ΡЬΓ)-ОН (85-90% выход анализируемого вещества) см. фиг. 6. Вос^-Α^д(ΡЬΓ)-ОН в растворе IΡΑс обрабатывали с помощью 4,8 экв. концентрированной НС1 при 20°С в течение приблизительно 6 ч. По окончании реакции органический слой отбрасывали и неочищенный продукт отделяли от водного слоя путем доведения рН до 5 с помощью ЫаОН, после чего наблюдали образование белой суспензии. См. фиг. 7. Когда надосадочная жидкость имела концентрацию приблизительно 3 мг/мл при 20°С, то ее фильтровали при комнатной температуре, и полученный фильтрат промывали водой и сушили под вакуумом. Общий выход анализа после этой стадии составил примерно 8085%. Чистота Н-^-Α^д(ΡЬΓ)-ОН была увеличена до >98,5% с помощью первой перекристаллизации из 3/1 вода/ΙΡΑ (об/об). Когда надосадочная жидкость имела концентрацию примерно 7 мг/мл, ее фильтровали и сушили в вакууме. После этой стадии общий выход анализируемого вещества составил примерно 75%. (Обычно на этой стадии наблюдают примерно 10% потерь продукта). Осуществляли вторую стадию перекристаллизации из 4/1 вода/ΙΡΑ (об/об). Фильтрацию проводили, когда концентрация надосадочной жидкости составила примерно 3,7 мг/мл. Вторая перекристаллизация увеличила чистоту Β-Ο-ΑΓ^/ΡόΓ)
- 11 032597
ОН примерно до 99,84 процентов беспримесности (ЬСЛР) с помощью ВЭЖХ с беспримесностью более 0,2 ЬСЛР. Типичный выход этой стадии составлял примерно 93% с потерями продукта примерно 5%. НЭ-Лгд-(РЬГ)-ОН затем вступал в реакцию с РтосО8и в соответствии со стандартными протоколами и продукт Ртос-О-Лтд(РЬ£)-ОН выделяли с помощью стандартной процедуры, описанной в литературе.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> Βθζθκιθγ, Легоеп
Сйеп, УФпд
Сгоскебб, КФскагЭ
Сгозз1еу, Κ^νίη
Си.1, Зйепд
Ниапд, ЬФапд
Лопез, З1ап
Ьоэдег, Азйег
Капдапабйап, КгФзйпакитаг <120> Способ получения АМС 416 <130> 041925-0488.ΜΘ00 <140> Νο6 уеб аззФдпеЭ <141> ЕНеЭ Неге«1бй <150> ИЗ 61/974,899 <151> 2014-04-03 <160> 4 <170> Рабепб1п νе^зίоη 3.4 <210> 1 <211> 7 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический пептид <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (1)..(1) <223> Хаа = Б-Суз <220>
<221> Пост-трансляционная модификация <222> (1)..(1) <223> Ν-концевое ацетилирование <220>
<221> ДИСУЛЬФИД <222> (1)..(1) <223> Суз-Суз дисульфидная связь с Суз <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (2), (6) <223> Хаа = Б-А1а <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (3), (4), (5), (7)
- 12 032597 <223> Хаа = Б-Агд <220>
<221> Пост-трансляционная модификация <222> (7) <223> С-концевое амидирование <400> 1
Хаа Хаа Хаа Хаа Хаа Хаа Хаа
| 1 | 5 | |
| <210> | 2 | |
| <211> | 7 | |
| <212> | Белок | |
| <213> | Искусственная | последовательность |
| <220> | ||
| <223> | Синтетический | пептид |
| <220> | ||
| <221> | ВАРИАНТ | |
| <222> | (1)..(1) | |
| <223> | Хаа = Б-Суз(ВгВ) | |
| <220> | ||
| <221> | Пост-трансляционная модификация | |
| <222> | (1)..(1) | |
| <223> | прикрепленный | к Бтос |
| <220> | ||
| <221> | ВАРИАНТ | |
| <222> | (2), (6) | |
| <223> | Хаа = Б-А1а | |
| <220> | ||
| <221> | ВАРИАНТ | |
| <222> | (3), (4), (5), | (7) |
| <223> | Хаа = Б-Агд(РЕЬ) | |
| <220> | ||
| <221> | Пост-трансляционная модификация | |
| <222> | (7) | |
| <223> | прикрепленный | к смоле |
| <400> | 2 | |
| Хаа Хаа Хаа Хаа Хаа | Хаа Хаа | |
| 1 | 5 | |
| <210> | 3 | |
| <211> | 7 | |
| <212> | Белок | |
| <213> | Искусственная | последовательность |
| <220> | ||
| <223> | Синтетический | пептид |
| <220> | ||
| <221> | ВАРИАНТ | |
| <222> | (1)..(1) | |
| <223> | Хаа = Б-Суз(ТгВ) | |
| <220> | ||
| <221> | Пост-трансляционная модификация |
- 13 032597 <222> (1)..(1) <223> Ν-концевое ацетилирование <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (2), (6) <223> Хаа = Б-А1а <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (3), (4), (5), (7) <223> Хаа = Б-Агд(РЫ) <220>
<221> Пост-трансляционная модификация <222> (7) <223> прикрепленный к смоле <400> 3
Хаа Хаа Хаа Хаа Хаа Хаа Хаа
5 <210> 4 <211> 7 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический пептид <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (1)..(1) <223> Хаа = Б-Суз(БРу) <220>
<221> Пост-трансляционная модификация <222> (1)..(1) <223> Ν-концевое ацетилирование <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (2), (6) <223> Хаа = Б-А1а <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (3), (4), (5), (7) <223> Хаа = Б-Агд <220>
<221> Пост-трансляционная модификация <222> (7) <223> С-концевое амидирование <400> 4
Хаа Хаа Хаа Хаа Хаа Хаа Хаа
5
- 14 032597
Claims (12)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Способ получения АМО 416, включающий обеспечение пептида, имеющего структуру Ас-П-Су8(БРу)-П-А1а-П-Агд-О-Агд-П-Агд-П-А1а-П-АгдΝΗ2 (БЕр ΙΌ N0: 4); и контакт пептида с ^-Су8 с получением конъюгированного продукта.
- 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что контакт включает контакт пептида с водным раствором, содержащим ^-Су8 и трифторуксусную кислоту.
- 3. Способ по п.1, дополнительно включающий лиофилизацию конъюгированного продукта.
- 4. Способ по п.3, дополнительно включающий контакт конъюгированного продукта с водным раствором, содержащим изопропиловый спирт и НС1, с получением в результате осадка, содержащего АМО 416 НС1 (БЕр ΙΌ N0: 1).
- 5. Способ по п.4, дополнительно включающий очистку осадка с помощью ВЭЖХ.
- 6. Способ приготовления АМО 416, включающий обеспечение пептида, имеющего структуру Ас-П-Су8(БРу)-П-А1а-П-Агд-О-Агд-П-Агд-П-А1а-П-АгдΝΗ2 (БЕР ΙΌ N0: 4), в растворе трифторуксусной кислоты;очистку пептида с помощью ВЭЖХ;осуществление замены растворителя путем азеотропной перегонки и контакт пептида с ^-Су8 с получением конъюгированного продукта.
- 7. Способ по п.6, отличающийся тем, что пептид контактирует с водным раствором ^-Су8 и воды в изопропиловом спирте (1РА).
- 8. Способ по п.7, дополнительно включающий контакт конъюгированного продукта с водным раствором, содержащим изопропиловый спирт и НС1, с получением в результате осадка, содержащего АМО 416 НС1 (БЕР ΙΌ N0: 1).
- 9. Способ по п.2, где контакт осуществляется при комнатной температуре в течение примерно 15 мин.
- 10. Способ по п.4, дополнительно включающий промывку осадка, содержащего АМО 416 НС1 (БЕР ΙΌ N0:1), изопропиловым спиртом.
- 11. Способ по п.10, дополнительно включающий растворение промытого изопропиловым спиртом осадка, содержащего АМО 416 НС1 (БЕР ΙΌ N0:1), в воде с получением растворенного осадка.
- 12. Способ по п.11, дополнительно включающий концентрирование растворенного осадка путем дистилляции.η2ν^νη оАс-0-Су8(Г-Су8-ОН)-0-А1а-0-Агд-0-Агд-0-Агд-0-А1а-0-Агд-МН2
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201461974899P | 2014-04-03 | 2014-04-03 | |
| PCT/US2015/024347 WO2015154031A1 (en) | 2014-04-03 | 2015-04-03 | Method for preparing amg 416 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA201692001A1 EA201692001A1 (ru) | 2017-02-28 |
| EA032597B1 true EA032597B1 (ru) | 2019-06-28 |
Family
ID=54241346
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201692001A EA032597B1 (ru) | 2014-04-03 | 2015-04-03 | Способ получения amg 416 |
Country Status (27)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US10407464B2 (ru) |
| EP (3) | EP4219526A3 (ru) |
| JP (1) | JP6710158B2 (ru) |
| KR (1) | KR102397271B1 (ru) |
| CN (1) | CN106795201A (ru) |
| AU (1) | AU2015240527B2 (ru) |
| BR (1) | BR112016022868A2 (ru) |
| CA (1) | CA2944194C (ru) |
| CL (1) | CL2016002513A1 (ru) |
| CY (1) | CY1123100T1 (ru) |
| DK (1) | DK3126373T3 (ru) |
| EA (1) | EA032597B1 (ru) |
| ES (2) | ES2786225T3 (ru) |
| HR (1) | HRP20200527T1 (ru) |
| HU (1) | HUE048489T2 (ru) |
| IL (1) | IL248059B2 (ru) |
| LT (1) | LT3126373T (ru) |
| MA (2) | MA52906A (ru) |
| ME (1) | ME03781B (ru) |
| MX (1) | MX2016012965A (ru) |
| PL (1) | PL3126373T3 (ru) |
| PT (1) | PT3126373T (ru) |
| RS (1) | RS60187B1 (ru) |
| SG (1) | SG11201608176VA (ru) |
| SI (1) | SI3126373T1 (ru) |
| WO (1) | WO2015154031A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA201606844B (ru) |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SI3013318T1 (sl) | 2013-06-28 | 2017-11-30 | Amgen Inc. | Stabilna tekoča oblika amg 416 (velkalcetid) |
| CN106795201A (zh) | 2014-04-03 | 2017-05-31 | 美国安进公司 | 用于制备amg416的方法 |
| CN106928320B (zh) * | 2015-12-31 | 2021-01-15 | 深圳翰宇药业股份有限公司 | 一种合成Etelcalcetide的方法 |
| CN106928321B (zh) * | 2015-12-31 | 2019-07-26 | 深圳翰宇药业股份有限公司 | 一种合成Etelcalcetide的方法 |
| US11117946B2 (en) | 2016-03-23 | 2021-09-14 | Bachem Holding Ag | Method for preparing glucagon-like peptides |
| US10858390B2 (en) | 2016-09-02 | 2020-12-08 | Cem Corporation | Use of excess carbodiimide for peptide synthesis at elevated temperatures |
| CN108101959B (zh) * | 2016-11-24 | 2021-07-09 | 四川科伦药物研究院有限公司 | 一种制备高纯度多肽或其类似物的方法 |
| CN106928171B (zh) * | 2017-05-03 | 2019-08-13 | 成都郑源生化科技有限公司 | Fmoc-Arg（Pbf）-OH的合成方法 |
| TW201915009A (zh) * | 2017-10-03 | 2019-04-16 | 中化合成生技股份有限公司 | 合成依特卡肽（Ｅｔｅｌｃａｌｃｅｔｉｄｅ）或其鹽類之方法 |
| CN110498835B (zh) * | 2018-05-17 | 2021-06-08 | 深圳翰宇药业股份有限公司 | 一种合成etelcalcetide的方法 |
| CN109280078B (zh) * | 2018-10-30 | 2019-06-25 | 成都诺和晟泰生物科技有限公司 | 一种制备维拉卡肽的方法 |
| CN112062811B (zh) * | 2019-06-10 | 2022-03-25 | 深圳翰宇药业股份有限公司 | 一种维拉卡肽的合成方法 |
| US20220298206A1 (en) * | 2019-08-26 | 2022-09-22 | Auro Peptides Ltd | An improved process for the preparation of Etelcalcetide Hydrochloride |
| EP3875466A1 (en) * | 2020-03-05 | 2021-09-08 | Fresenius Kabi iPSUM S.r.l. | Process for the synthesis of etelcalcetide |
| KR20230019120A (ko) | 2020-06-03 | 2023-02-07 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 고난도 서열의 효율적 펩티드 축합법 |
| CN111925415A (zh) * | 2020-08-10 | 2020-11-13 | 海南中和药业股份有限公司 | 一种维拉卡肽杂质的制备方法 |
| TWI792442B (zh) * | 2021-07-23 | 2023-02-11 | 建誼生技股份有限公司 | 依特卡肽鹽酸鹽之製造方法 |
| CN114524860A (zh) * | 2021-12-29 | 2022-05-24 | 深圳翰宇药业股份有限公司 | 一种Etelcalcetide的合成方法及其应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011014707A2 (en) * | 2009-07-29 | 2011-02-03 | Kai Pharmaceuticals, Inc. | Therapeutic agents for reducing parathyroid hormone levels |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3941763A (en) | 1975-03-28 | 1976-03-02 | American Home Products Corporation | PGlu-D-Met-Trp-Ser-Tyr-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 and intermediates |
| EP0339695A3 (en) | 1988-04-29 | 1990-05-30 | Stichting Voor De Technische Wetenschappen | A process for preparing an antigenic or immunogenic conjugate as well as the use of such conjugates |
| SE9603465D0 (sv) | 1996-09-23 | 1996-09-23 | Astra Ab | New compounds |
| NO311807B1 (no) | 1999-03-04 | 2002-01-28 | Bionor Immuno As | HIV-peptider, antigener, vaksinepreparater, immunoassay- testsett og en metode for påvisning av antistoffer fremkalt av HIV |
| JP5473925B2 (ja) | 2007-10-27 | 2014-04-16 | コーデン ファーマ コロラド インコーポレイテッド | 固相および溶液相の組み合わせ技法を使用するインスリン分泌性ペプチドの合成 |
| CN101250172B (zh) | 2008-03-07 | 2012-05-02 | 上海瀚鸿化工科技有限公司 | 精氨酸双保护制备工艺 |
| US8742028B2 (en) | 2009-05-06 | 2014-06-03 | Mallinckrodt Llc | Solid support for Fmoc-solid phase synthesis of peptide acids |
| EP2560491A1 (en) * | 2010-04-21 | 2013-02-27 | Signature Therapeutics, Inc. | Peripheral opioid agonists and peripheral opioid antagonists |
| CA2814012A1 (en) * | 2010-09-08 | 2012-03-15 | Fazel Shabanpoor | Modified relaxin polypeptides |
| WO2013042129A1 (en) | 2011-09-23 | 2013-03-28 | Natco Pharma Limited | Improved process for preparation of bivalirudin |
| SI3013318T1 (sl) | 2013-06-28 | 2017-11-30 | Amgen Inc. | Stabilna tekoča oblika amg 416 (velkalcetid) |
| CN106795201A (zh) | 2014-04-03 | 2017-05-31 | 美国安进公司 | 用于制备amg416的方法 |
| CN105504012A (zh) * | 2014-09-30 | 2016-04-20 | 深圳翰宇药业股份有限公司 | 一种多肽的制备方法 |
| CN107434820A (zh) * | 2017-08-07 | 2017-12-05 | 南京工业大学 | 一种维拉卡肽的合成方法 |
-
2015
- 2015-04-03 CN CN201580029560.2A patent/CN106795201A/zh active Pending
- 2015-04-03 ES ES15773570T patent/ES2786225T3/es active Active
- 2015-04-03 SG SG11201608176VA patent/SG11201608176VA/en unknown
- 2015-04-03 PL PL15773570T patent/PL3126373T3/pl unknown
- 2015-04-03 PT PT157735705T patent/PT3126373T/pt unknown
- 2015-04-03 LT LTEP15773570.5T patent/LT3126373T/lt unknown
- 2015-04-03 MA MA052906A patent/MA52906A/fr unknown
- 2015-04-03 KR KR1020167030590A patent/KR102397271B1/ko active IP Right Grant
- 2015-04-03 HU HUE15773570A patent/HUE048489T2/hu unknown
- 2015-04-03 CA CA2944194A patent/CA2944194C/en active Active
- 2015-04-03 RS RS20200448A patent/RS60187B1/sr unknown
- 2015-04-03 MA MA39628A patent/MA39628B1/fr unknown
- 2015-04-03 DK DK15773570.5T patent/DK3126373T3/da active
- 2015-04-03 ES ES20160369T patent/ES2943671T3/es active Active
- 2015-04-03 SI SI201531173T patent/SI3126373T1/sl unknown
- 2015-04-03 US US15/300,209 patent/US10407464B2/en active Active
- 2015-04-03 EP EP23150870.6A patent/EP4219526A3/en active Pending
- 2015-04-03 IL IL248059A patent/IL248059B2/en unknown
- 2015-04-03 ME MEP-2020-83A patent/ME03781B/me unknown
- 2015-04-03 AU AU2015240527A patent/AU2015240527B2/en active Active
- 2015-04-03 EA EA201692001A patent/EA032597B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2015-04-03 JP JP2016560462A patent/JP6710158B2/ja active Active
- 2015-04-03 BR BR112016022868-5A patent/BR112016022868A2/pt active Search and Examination
- 2015-04-03 WO PCT/US2015/024347 patent/WO2015154031A1/en active Application Filing
- 2015-04-03 EP EP20160369.3A patent/EP3708576B1/en active Active
- 2015-04-03 MX MX2016012965A patent/MX2016012965A/es active IP Right Grant
- 2015-04-03 EP EP15773570.5A patent/EP3126373B1/en active Active
-
2016
- 2016-10-03 CL CL2016002513A patent/CL2016002513A1/es unknown
- 2016-10-05 ZA ZA2016/06844A patent/ZA201606844B/en unknown
-
2019
- 2019-08-05 US US16/532,344 patent/US11377474B2/en active Active
-
2020
- 2020-04-01 HR HRP20200527TT patent/HRP20200527T1/hr unknown
- 2020-04-29 CY CY20201100391T patent/CY1123100T1/el unknown
-
2022
- 2022-06-28 US US17/852,263 patent/US20230099078A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011014707A2 (en) * | 2009-07-29 | 2011-02-03 | Kai Pharmaceuticals, Inc. | Therapeutic agents for reducing parathyroid hormone levels |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Anaspec. Amino Acid Cartridges / Fmoc-D-Amino Acid Cartridges for ABI Synthesizers [online] 2013 [retrieved 10 July 2015]. Available on the internet: <URL: http://search.anaspec.com/?page=1&keywords=Fmoc&refine=y&Productcategories=Amino+Acid+Cartridges+%2F+Fmoc-D-Amino+Acid+Cartridges+for+ABI+Synthesizers+%281+mmol%29 >. Especially pg 1. * |
| CASTELL et al. The Removal of S-Cysteine Protection by Means of 2-Pyridine Sulfenyl Chloride and the Subsequent Formation of Disulfide Bonds. Preliminary communication. Helvetic Chimica Acta 31 October 1979 Vol 62 No 7 Pages 2507-2510. Especially abstract, pg 2507 para 3-4, pg 2508 scheme1, pg 2508 para 5. * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EA032597B1 (ru) | Способ получения amg 416 | |
| JP4405594B2 (ja) | 改良型固相ペプチド合成及びかかる合成において利用するための試薬 | |
| JP5850458B2 (ja) | デガレリックスの製造方法 | |
| JP5908478B2 (ja) | ｈ「Ｇｌｙ２」ＧＬＰ−２の固相合成 | |
| JP2008543884A (ja) | ビバリルジンの生成方法 | |
| EP3160985B1 (en) | Process for the production of d-arginyl-2,6-dimethyl-l-tyrosyl-l-lysyl-l-phenylalaninamide | |
| EP3160984B1 (en) | Process for preparing d-arginyl-2,6-dimethyl-l-tyrosyl-l-lysyl-l-phenylalaninamide | |
| Müller et al. | Synthesis of N‐carboxyalkyl and N‐aminoalkyl functionalized dipeptide building units for the assembly of backbone cyclic peptides | |
| JP2016113481A (ja) | ピロール・イミダゾールからなるポリアミドの製造方法 | |
| JP3992143B2 (ja) | 新規生理活性ペプチド | |
| JPH07316193A (ja) | ペプチド誘導体およびその用途 | |
| JP2001270897A (ja) | 生理活性ペプチド | |
| JPH10330399A (ja) | 神経伝達ポリペプチド | |
| JPS6168499A (ja) | 新規ペプチド |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM |