CN108101959B

CN108101959B - 一种制备高纯度多肽或其类似物的方法

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Publication number: CN108101959B
Application number: CN201711117190.5A
Authority: CN
Inventors: 李长兵; 庹世川; 杨燕苹; 薛宏祥; 王利春; 王晶翼
Original assignee: Sichuan Kelun Pharmaceutical Research Institute Co Ltd
Current assignee: Sichuan Kelun Pharmaceutical Research Institute Co Ltd
Priority date: 2016-11-24
Filing date: 2017-11-13
Publication date: 2021-07-09
Anticipated expiration: 2037-11-13
Also published as: CN108101959A

Abstract

本发明公开了一种制备高纯度多肽或其类似物的方法，具体步骤如下：采用高效液相色谱法制备纯化AMG416水溶液，收集目的峰馏分，其中，色谱条件为：固定相为C18，流动相A为磷酸盐、甲酸盐或者乙酸盐水溶液，流动相B为甲醇或者乙腈，流动相A与流动相B的体积比为(80～100)：(0～20)。本发明方法可以高效分离纯化AMG416，收率高，得到的产品纯度高，工业应用前景非常好。

Description

一种制备高纯度多肽或其类似物的方法

技术领域

本发明涉及一种制备高纯度多肽或其类似物的方法。

背景技术

继发性甲状旁腺功能亢进(SHPT，简称继发性甲旁亢)，是指在慢性肾功能不全、肾小管酸中毒、维生素D缺乏等情况下，甲状旁腺长期受到低血钙、低血镁或高血磷的刺激而分泌过量的PTH的一种慢性代偿性临床表现，长期的甲状旁腺增生最终导致形成功能自主的腺瘤。目前，治疗继发性甲状旁腺功能亢进的常用药物是安进公司(Amgen)生产的西那卡塞，其自十多年前上市以来增长相当稳定，2014年仅美国本土销售额就高达到10亿美元。

AMG416(又名vecalcetide、etelcalcetide)是安进公司开发的一种新的拟钙剂(Calcimimetic agent)，其结构如下：

AMG416通过静脉给药，用于正接受血液透析治疗的慢性肾脏病(CKD)患者。AMG416结合并激活对甲状旁腺上的钙敏感受体，从而实现甲状旁腺激素(PTH)水平的降低，已完成的Ⅲ期临床证实该药疗效确切，安全性良好，患者依从性更高，轻松击败了目前常用的药物西那卡塞(Mimpara)。因此，如何高效制备纯化得到高纯度AMG416就显得极为重要。

然而，由于AMG416极性较大而且不稳定，对其进行纯化非常困难，采用一些常规的纯化方法进行纯化的收率非常低。CN201080045024、WO2015154031的专利申请中公开说明了AMG416可以使用反相高效液相(RP-HPLC)纯化，但对具体制备用流动相体系、方法未做详细说明。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种制备高纯度多肽或其类似物，尤其是制备高纯度AMG416的方法。

本发明中，AMG416是指结构如下的多肽：

本发明涉及一种制备高纯度多肽或其类似物的方法，其中包括：

步骤(1)：制备多肽或其类似物的水溶液，其中，多肽或其类似物为AMG416或其类似物

步骤(2)：采用色谱分离法制备纯化多肽或其类似物水溶液，收集目的峰，合并后将溶液冻干或进一步操作，得到高纯度多肽或其类似物精制品；

其中，色谱分离法的固定相为C18，流动相A为磷酸盐水溶液、甲酸盐水溶液或者乙酸盐水溶液中的一种或多种，流动相B为甲醇或者乙腈中的一种或多种，流动相A与流动相B的体积比为(80～100)：(0～20)，其中流动相B不为零。

本发明所述的高纯度多肽或其类似物制备方法中，流动相A选自磷酸盐、甲酸盐或者乙酸盐水溶液中的一种或多种，流动相B选自甲醇或者乙腈中的一种或多种；

本发明所述的高纯度多肽或其类似物制备方法中，流动相A与流动相B的体积比优选为(90～100)：(0～10)，其中流动相B不为零；进一步优选为(90～97)：(3～10)。

本发明中流动相A与流动相B的体积比为(80～100)：(0～20)，若流动相A与流动相B的体积比大于上述的范围，则样品可能会吸附在柱子上，无法洗脱下来；若流动相A与流动相B的体积比小于上述的范围，则样品保留时间过短，样品存在被直接洗脱下来的风险，导致无法纯化。因此，本发明中流动相A与流动相B的体积比为(80～100)：(0～20)是合适的，且优选为(90～100)：(0～10)，更优选为(90～97)：(3～10)。

本发明所述的高纯度多肽或其类似物制备方法中，步骤(1)中制备多肽或其类似物(例如AMG416)水溶液包括将多肽或其类似物(例如AMG416)加水溶解，过滤，得多肽或其类似物(例如AMG416)的水溶液。

本发明所述的高纯度多肽或其类似物制备方法中，步骤(1)中制备多肽或其类似物(例如AMG416)水溶液的制备过程中还包括加入助溶剂和/或pH调节剂，助溶剂包括但不限于DMSO、DMF、THF、ACN、HAc。pH调节剂包括但不限于氨水、乙酸。

本发明所述的高纯度多肽或其类似物制备方法中，所述多肽(例如AMG416)或其类似物可以通过化学合成方法或其他方法制备得到，例如AMG416可以为CN201410526197中公开的化学合成方法合成。

本发明所述的高纯度多肽或其类似物制备方法中，所述固定相为反相C18，例如YMC 5μm C18填料、Daiso 10μm C18填料或者汉邦SP 10μm C18填料。

本发明所述的高纯度多肽或其类似物制备方法中，所述流动相A选自磷酸、甲酸、乙酸的钾盐、胺盐水溶液中的一种或多种；优选为流动相A选自磷酸、甲酸、乙酸的钾盐、伯胺盐或叔胺盐水溶液中的一种或多种；更优选流动相A为磷酸、甲酸、乙酸的铵盐、三乙胺盐水溶液中的一种或多种；更优选流动相A为磷酸铵、甲酸铵、磷酸二氢钾或磷酸三乙胺水溶液中的一种或多种。

本发明所述的高纯度多肽或其类似物制备方法中，所述磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐水溶液的浓度不高于150mmol/L，优选浓度为不高于70mmol/L，更优选浓度为10-50mmol/L。

在本发明中，流动相A的浓度不高于150mmol/L，其目的在于保证样品在色谱柱上有保留。若浓度高于150mmol/L，则样品在色谱柱上保留时间过短，直接被洗脱下来。

本发明所述的高纯度多肽或其类似物制备方法中，所述磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐水溶液的pH为2-8，优选为2-6，进一步优选为3-5。

在本发明中，流动相A的pH为2～8，其目的在于保护色谱柱以及样品在高pH条件下不稳定。若流动相A的pH大于8，则色谱柱被损坏，样品降解；若pH小于2，则不利于样品的纯化。因此，流动相A的pH为2～8是合适的，优选的pH为2-6，进一步优选为3-5。

本发明所述的高纯度多肽或其类似物制备方法中，步骤(2)中洗脱的方式为梯度或者等度洗脱，优选为等度洗脱。

本发明所述的高纯度多肽或其类似物制备方法中，步骤(2)中洗脱的方式为梯度洗脱时，梯度为流动相A为0.1％TFA水溶液，流动相B为甲醇或者乙腈中的一种或多种，其中，流动相B在25min时间内，从5％增加到20％。

本发明所述的高纯度多肽或其类似物制备方法中，步骤(2)中流动相的流速为10～160mL/min，色谱柱直径为20～80mm。

本发明所述的高纯度多肽或其类似物制备方法中，步骤(2)收集目的峰馏分后，还可进一步进行转盐操作(例如盐酸盐或者醋酸盐)后冻干。

本发明所述的高纯度多肽或其类似物制备方法中，步骤(2)中，收集目的峰馏分还可以进一步操作，可以包括：

a：继续采用前述方法进一步制备纯化，和/或；

b：将收集的目的峰馏分冻干，加水溶解，优选过滤，得到溶液，采用反相高效液相色谱法纯化，收集目的峰馏分，冻干，其中，色谱条件为：固定相为C18，流动相A为0.1％TFA水溶液，流动相B为甲醇或者乙腈中的一种或多种，其中，B相在25min时间内，从5％增加到20％。

优选地，在步骤b中，流动相的流速为10～160ml/min，色谱柱直径20～80mm。

一种所述的流动相作为制备高纯度多肽或其类似物的应用。所述的流动相包括流动相A和流动相B，流动相A为磷酸盐水溶液、甲酸盐水溶液或者乙酸盐水溶液中的一种或多种，流动相B为甲醇或者乙腈中的一种或多种，流动相A与流动相B的体积比为(80～100)：(0～20)，其中流动相B不为零。

优选的，流动相A与流动相B的体积比优选为(90～100)：(0～10)，其中流动相B不为零；进一步优选为(90～97)：(3～10)。

优选为流动相A选自磷酸、甲酸、乙酸的钾盐、伯胺盐或叔胺盐水溶液中的一种或多种；更优选流动相A为磷酸、甲酸、乙酸的铵盐、三乙胺盐水溶液中的一种或多种；更优选流动相A为磷酸铵、甲酸铵、磷酸二氢钾或磷酸三乙胺水溶液中的一种或多种。

本发明所述的高纯度多肽或其类似物(例如AMG416)的制备纯化方法与现有技术相比，具有如下有益效果：

(1)本发明优先采用等度洗脱的纯化方式，使用固定配比的流动相，使本发明的技术方案简便，易操作，降低了人力和试剂成本；

(2)本发明经过对流动相的组分以及比例进行优化，使多肽或其类似物(例如AMG416)分子在纯化过程中不易降解，可稳定存在并进行有效制备纯化，减少了多肽或其类似物(例如AMG416)在纯化过程中的损失，大大提高了纯化收率。

(3)由于多肽或其类似物(例如AMG416)极性较大，纯化过程中出峰时间较短，不易与小分子大极性的杂质有效的分离，在本技术方案中流动相采用合适的有机或无机盐水溶液及其比例，使多肽或其类似物(例如AMG416)与各种杂质能有效分离，提高了最终产品的纯度。

综上所述，本发明采用的多肽或其类似物(例如AMG416)制备纯化技术方案，在保证多肽或其类似物(例如AMG416)的分离效果，提高其终产品纯度的同时，优化流动相成分和比例，减少对待制备纯化多肽或其类似物(例如AMG416)样品的结构影响，减低其分解使多肽或其类似物(例如AMG416)尽可能稳定存在于制备纯化所用流动相中，大大提高了终产品的收率。本方法简便易操作，节约流动相使用量，适用于工业化大生产，工业应用前景非常良好。

本发明所述的高纯度多肽或其类似物制备方法中，对起始原料多肽或其类似物(例如AMG416)的纯度并无限制，例如，可以采用纯度为65％-85％的或纯度低于65％的多肽或其类似物(例如AMG416)等。

下面通过具体实施方式对本发明做进一步详细说明，但是并不是对本发明的限制，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

附图说明

图1实施例1中AMG416溶液的色谱图；

图2实施例1中AMG416盐酸盐精肽的色谱图；

图3实施例3中AMG416醋酸盐精肽的色谱图。

具体实施方式

名词解释：

TFA：三氟乙酸；

AMG416：vecalcetide、etelcalcetide，其结构如下：

M：其作为单位时，表示mol/L。

目的峰：主要包含多肽或其类似物(例如AMG416)的峰。

C18：十八烷基键合固定相填料

DMSO：二甲基亚砜；

DMF：N,N-二甲基甲酰胺；

THF：四氢呋喃；

ACN：乙腈；

HAc：乙酸。

实施例1：

色谱条件：采用安捷伦1260制备系统，YMC 5μm C18填料预装的20*250mm制备柱。配制浓度为50mM的磷酸铵水溶液，使用磷酸调节pH＝3.0，作为A相，甲醇作为B相，A相与B相的体积比为97:3，洗脱方式为等度洗脱，流速10ml/min。

取50mg AMG416粗品(粗品的纯度为69％)溶解在1ml纯化水中并过滤上样。收集目的峰，将目的峰馏分合并，得AMG416溶液，其RP-HPLC纯度为99.75％(如图1所示)；将溶液使用离子交换填料色谱柱或者冻干后化学法转盐酸盐，冻干，得31.5mg AMG416盐酸盐精肽，其RP-HPLC纯度99.52％(如图2所示)。计算可知，本方法的重量总收率为63％(重量收率＝冻干品质量/粗品质量*100％，下同)。

表1：AMG416溶液的色谱表

峰	保留时间	峰高	峰面积	峰面积％
					1	10.61	0.26	1.13	0.02
2	10.74	0.47	1.94	0.03
					3	10.94	1.31	5.29	0.08
4	11.13	721.65	6646.37	99.75
					5	11.68	0.46	3.00	0.05
6	14.14	1.14	5.02	0.07

表2：AMG416盐酸盐精肽的色谱表

峰	保留时间	峰高	峰面积	峰面积％
					1	8.76	0.92	9.60	0.15
2	10.81	0.43	1.87	0.03
					3	11.02	1.55	8.64	0.13
4	11.21	706.02	6580.44	99.52
					5	11.74	0.46	2.91	0.04
6	12.34	0.60	2.87	0.04
					7	14.24	1.14	5.76	0.09

实施例2

步骤一：

色谱条件：采用安捷伦1260制备系统，Daiso 10μm C18填料预装的20*250mm制备柱。配制浓度为30mM的甲酸铵水溶液，使用甲酸调节pH＝3.5，作为A相，甲醇为B相，A相与B相的体积比为95:5，洗脱方式为等度洗脱，流速10ml/min。

取50mg AMG416粗品(粗品的纯度为69％)溶解在1ml纯化水中并过滤上样。收集目的峰，将目的馏分合并后将溶液冻干，得AMG416精制品。

步骤二：

采用安捷伦1260制备系统，苏州纳微10μm C18填料预装的20*250mm制备柱。配制0.1％TFA水溶液作为A相，甲醇作为B相。B相在25min时间内，从5％增加到20％，流速10ml/min。

将步骤一得到的AMG416精制品溶解在0.8ml纯化水中并过滤上样。收集目的峰，将纯度＞95％的目的峰合并后冻干得到22.7mg的AMG416精肽，其RP-HPLC纯度为99.92％。计算可知，本方法的重量收率45.4％。

实施例3

色谱条件：采用汉邦DAC80制备系统，汉邦SP 10μm C18填料DAC的80*250mm制备柱。配制浓度为50mM的磷酸铵水溶液，使用磷酸调节pH＝3.0，作为A相，甲醇为B相，A相与B相的体积比为95:5，洗脱方式为等度洗脱，流速160ml/min。

取810mg AMG416粗品(粗品的纯度为69％)溶解在20ml纯化水，使用少量乙酸/氨水调节pH＝6.80，过滤上样。收集目的峰，将目的峰馏分合并，得AMG416溶液，其RP-HPLC纯度为99.39％(如图3所示)，将溶液转醋酸盐，冻干得到572mg的AMG416醋酸盐精肽。计算可知，本方法的重量收率为70.6％。

表3：AMG416醋酸盐精肽的色谱表

峰	保留时间	峰高	峰面积	峰面积％
					1	8.76	0.49	5.58	0.22
2	11.02	0.14	0.72	0.03
					3	11.27	371.08	2494.39	99.39
4	11.78	0.41	2.88	0.12
					5	12.51	0.59	5.64	0.22
6	13.38	0.07	0.51	0.02

实施例4

色谱条件：采用安捷伦1260制备系统，YMC 5μm C18填料预装的20*250mm制备柱。配制浓度为50mM的磷酸铵水溶液，使用磷酸调节pH＝3.0，作为A相，甲醇作为B相，A相与B相的体积比为90:10，洗脱方式为等度洗脱，流速10ml/min。

取50mg AMG416粗品(粗品的纯度为69％)溶解在1ml纯化水中并过滤上样。收集目的峰，将目的峰馏分合并后转盐酸盐，冻干得28.6mg的AMG416盐酸盐精品，其RP-HPLC纯度为99.84％。计算可知，本方法的重量收率为56.2％。

实施例5

色谱条件：采用安捷伦1260制备系统，YMC 5μm C18填料预装的20*250mm制备柱。配制浓度为50mM的磷酸铵水溶液，使用磷酸调节pH＝5.0，作为A相，甲醇作为B相，A相与B相的体积比为95:5，洗脱方式为等度洗脱，流速10ml/min。

取50mg AMG416粗品(粗品的纯度为69％)溶解在1ml纯化水中并过滤上样。收集目的峰，将目的峰馏分合并后转盐酸盐，冻干得25.4mg的AMG416盐酸盐精品，其RP-HPLC纯度为99.37％。计算可知，本方法的重量收率为50.8％。

实施例6

色谱条件：采用安捷伦1260制备系统，YMC 5μm C18填料预装的20*250mm制备柱。配制浓度为10mM的磷酸铵水溶液，使用磷酸调节pH＝3.0，作为A相，甲醇作为B相，A相与B相的体积比为95:5，洗脱方式为等度洗脱，流速10ml/min。

取50mg AMG416粗品(粗品的纯度为69％)溶解在1ml纯化水中并过滤上样。收集目的峰，将目的峰馏分合并后转盐酸盐，冻干得21.9mg的AMG416盐酸盐精品，其RP-HPLC纯度为97.57％。计算可知，本方法的重量收率为43.8％。

实施例7

色谱条件：采用安捷伦1260制备系统，YMC 5μm C18填料预装的20*250mm制备柱。配制浓度为50mM的磷酸二氢钾水溶液，使用磷酸调节pH＝2.98，作为A相，甲醇为B相，A相与B相的体积比为95:5，洗脱方式为等度洗脱，流速10ml/min。

取50mg AMG416粗品(粗品的纯度为69％)溶解在1ml纯化水中并过滤上样。收集目的峰，将目的峰馏分合并后转盐酸盐，冻干得到33.1mg的AMG416盐酸盐精肽，其RP-HPLC纯度为97.86％。计算可知，本方法的重量收率为66.2％。

实施例8

色谱条件：采用安捷伦1260制备系统，YMC 5μm C18填料预装的20*250mm制备柱。磷酸三乙胺水溶液作为A相(配制浓度为0.1％(v/v)三乙胺水溶液，使用磷酸调节pH＝3.0)，甲醇为B相，A相与B相的体积比为95:5，洗脱方式为等度洗脱，流速10ml/min。

取50mg AMG416粗品(粗品的纯度为69％)溶解在1ml纯化水中并过滤上样。收集目的峰，将目的峰馏分合并后转盐酸盐，冻干得到27.8mg AMG416盐酸盐精肽，其RP-HPLC纯度为98.50％。计算可知，本方法的重量收率为55.6％。

实验结果说明，本发明方法可以制备得到高纯度的AMG416产品，而且收率高。实施例9：

色谱条件：采用安捷伦1260制备系统，YMC 5μm C18填料预装的20*250mm制备柱。配制浓度为150mM的磷酸铵水溶液，使用磷酸调节pH＝3.0，作为A相，甲醇作为B相，A相与B相的体积比为97:3，洗脱方式为等度洗脱，流速10ml/min。

取50mg AMG416粗品(粗品的纯度为69％)溶解在1ml纯化水中并过滤上样。样品直接被洗脱下来，纯化效果差或无纯化效果，将目的峰馏分合并后转盐酸盐，冻干得到40.3mgAMG416盐酸盐精肽，其RP-HPLC纯度为69.3％。

实施例10：

色谱条件：采用安捷伦1260制备系统，YMC 5μm C18填料预装的20*250mm制备柱。配制浓度为50mM的磷酸铵水溶液，使用磷酸调节pH＝3.0，作为A相，甲醇作为B相，A相与B相的体积比为75:25，洗脱方式为等度洗脱，流速10ml/min。

取50mg AMG416粗品(粗品的纯度为69％)溶解在1ml纯化水中并过滤上样。样品上样后直接被洗脱下来，纯化效果差或无纯化效果。将目的峰馏分合并后转盐酸盐，冻干得到39.2mg AMG416盐酸盐精肽，其RP-HPLC纯度为69.1％。

实施例11：

色谱条件：采用安捷伦1260制备系统，YMC 5μm C18填料预装的20*250mm制备柱。配制浓度为50mM的磷酸铵水溶液，使用磷酸调节pH＝3.0，作为A相，甲醇作为B相，A相与B相的体积比为99:1，洗脱方式为等度洗脱，流速10ml/min。

取50mg AMG416粗品(粗品的纯度为69％)溶解在1ml纯化水中并过滤上样。样品上样后样品无法被洗脱下来。随后调整A相与B相的体积比为97:3，收集目的峰馏分合并后转盐酸盐，冻干得到39.6mg AMG416盐酸盐精肽，其RP-HPLC纯度为99.47％。综上，本发明方法可以有效制备纯化AMG416，获得高纯度的AMG416产品，而且收率高，工业应用前景良好。

Claims

1.一种制备高纯度多肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：制备多肽的水溶液，采用色谱分离法制备纯化多肽水溶液，收集目的峰，合并后将溶液冻干或进一步操作，得到高纯度多肽精制品；

所述多肽为AMG416；

其中，色谱分离法的固定相为C18，流动相A为磷酸盐水溶液，所述磷酸盐水溶液的pH为2-6，流动相B为甲醇，流动相A与流动相B的体积比为(90～97)：(3～10)，所述磷酸盐水溶液的浓度为30-50mmol/L，流动相的流速为10～160mL/min，色谱柱直径为20～80mm。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述多肽加水溶解后过滤，得多肽的水溶液；其中所述多肽通过化学合成多肽方法制备得到。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述流动相A选自磷酸的钾盐、胺盐水溶液中的一种或多种。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述流动相A为磷酸的钾盐、伯胺盐或叔胺盐水溶液中的一种或多种。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述流动相A为磷酸的铵盐、三乙胺盐水溶液中的一种或多种。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述流动相A为磷酸铵、磷酸二氢钾或磷酸三乙胺水溶液中的一种或多种。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述磷酸盐水溶液的pH为3-5。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：该方法中的洗脱方式选自梯度洗脱或等度洗脱。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：该方法中的洗脱方式为等度洗脱。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：收集目的峰馏分后，转盐后冻干，或者直接冻干。

11.权利要求1-10任一项所述的方法在制备高纯度多肽的应用，所述多肽为AMG416。