CN108101959A - 一种制备高纯度多肽或其类似物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备高纯度多肽或其类似物的方法，具体步骤如下：采用高效液相色谱法制备纯化AMG416水溶液，收集目的峰馏分，其中，色谱条件为：固定相为C18，流动相A为磷酸盐、甲酸盐或者乙酸盐水溶液，流动相B为甲醇或者乙腈，流动相A与流动相B的体积比为(80～100)：(0～20)。本发明方法可以高效分离纯化AMG416，收率高，得到的产品纯度高，工业应用前景非常好。
Description
技术领域
本发明涉及一种制备高纯度多肽或其类似物的方法。
背景技术
继发性甲状旁腺功能亢进(SHPT，简称继发性甲旁亢)，是指在慢性肾功能不全、肾小管酸中毒、维生素D缺乏等情况下，甲状旁腺长期受到低血钙、低血镁或高血磷的刺激而分泌过量的PTH的一种慢性代偿性临床表现，长期的甲状旁腺增生最终导致形成功能自主的腺瘤。目前，治疗继发性甲状旁腺功能亢进的常用药物是安进公司(Amgen)生产的西那卡塞，其自十多年前上市以来增长相当稳定，2014年仅美国本土销售额就高达到10亿美元。
AMG416(又名vecalcetide、etelcalcetide)是安进公司开发的一种新的拟钙剂(Calcimimetic agent)，其结构如下：
AMG416通过静脉给药，用于正接受血液透析治疗的慢性肾脏病(CKD)患者。AMG416结合并激活对甲状旁腺上的钙敏感受体，从而实现甲状旁腺激素(PTH)水平的降低，已完成的Ⅲ期临床证实该药疗效确切，安全性良好，患者依从性更高，轻松击败了目前常用的药物西那卡塞(Mimpara)。因此，如何高效制备纯化得到高纯度AMG416就显得极为重要。
然而，由于AMG416极性较大而且不稳定，对其进行纯化非常困难，采用一些常规的纯化方法进行纯化的收率非常低。CN201080045024、WO2015154031的专利申请中公开说明了AMG416可以使用反相高效液相(RP-HPLC)纯化，但对具体制备用流动相体系、方法未做详细说明。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种制备高纯度多肽或其类似物，尤其是制备高纯度AMG416的方法。
本发明中，AMG416是指结构如下的多肽：
本发明涉及一种制备高纯度多肽或其类似物的方法，其中包括：
步骤(1)：制备多肽或其类似物的水溶液，其中，多肽或其类似物为AMG416或其类似物
步骤(2)：采用色谱分离法制备纯化多肽或其类似物水溶液，收集目的峰，合并后将溶液冻干或进一步操作，得到高纯度多肽或其类似物精制品；
其中，色谱分离法的固定相为C18，流动相A为磷酸盐水溶液、甲酸盐水溶液或者乙酸盐水溶液中的一种或多种，流动相B为甲醇或者乙腈中的一种或多种，流动相A与流动相B的体积比为(80～100)：(0～20)，其中流动相B不为零。
本发明所述的高纯度多肽或其类似物制备方法中，流动相A选自磷酸盐、甲酸盐或者乙酸盐水溶液中的一种或多种，流动相B选自甲醇或者乙腈中的一种或多种；
本发明所述的高纯度多肽或其类似物制备方法中，流动相A与流动相B的体积比优选为(90～100)：(0～10)，其中流动相B不为零；进一步优选为(90～97)：(3～10)。
本发明中流动相A与流动相B的体积比为(80～100)：(0～20)，若流动相A与流动相B的体积比大于上述的范围，则样品可能会吸附在柱子上，无法洗脱下来；若流动相A与流动相B的体积比小于上述的范围，则样品保留时间过短，样品存在被直接洗脱下来的风险，导致无法纯化。因此，本发明中流动相A与流动相B的体积比为(80～100)：(0～20)是合适的，且优选为(90～100)：(0～10)，更优选为(90～97)：(3～10)。
本发明所述的高纯度多肽或其类似物制备方法中，步骤(1)中制备多肽或其类似物(例如AMG416)水溶液包括将多肽或其类似物(例如AMG416)加水溶解，过滤，得多肽或其类似物(例如AMG416)的水溶液。
本发明所述的高纯度多肽或其类似物制备方法中，步骤(1)中制备多肽或其类似物(例如AMG416)水溶液的制备过程中还包括加入助溶剂和/或pH调节剂，助溶剂包括但不限于DMSO、DMF、THF、ACN、HAc。pH调节剂包括但不限于氨水、乙酸。
本发明所述的高纯度多肽或其类似物制备方法中，所述多肽(例如AMG416)或其类似物可以通过化学合成方法或其他方法制备得到，例如AMG416可以为CN201410526197中公开的化学合成方法合成。
本发明所述的高纯度多肽或其类似物制备方法中，所述固定相为反相C18，例如YMC 5μm C18填料、Daiso 10μm C18填料或者汉邦SP 10μm C18填料。
本发明所述的高纯度多肽或其类似物制备方法中，所述流动相A选自磷酸、甲酸、乙酸的钾盐、胺盐水溶液中的一种或多种；优选为流动相A选自磷酸、甲酸、乙酸的钾盐、伯胺盐或叔胺盐水溶液中的一种或多种；更优选流动相A为磷酸、甲酸、乙酸的铵盐、三乙胺盐水溶液中的一种或多种；更优选流动相A为磷酸铵、甲酸铵、磷酸二氢钾或磷酸三乙胺水溶液中的一种或多种。
本发明所述的高纯度多肽或其类似物制备方法中，所述磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐水溶液的浓度不高于150mmol/L，优选浓度为不高于70mmol/L，更优选浓度为10-50mmol/L。
在本发明中，流动相A的浓度不高于150mmol/L，其目的在于保证样品在色谱柱上有保留。若浓度高于150mmol/L，则样品在色谱柱上保留时间过短，直接被洗脱下来。
本发明所述的高纯度多肽或其类似物制备方法中，所述磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐水溶液的pH为2-8，优选为2-6，进一步优选为3-5。
在本发明中，流动相A的pH为2～8，其目的在于保护色谱柱以及样品在高pH条件下不稳定。若流动相A的pH大于8，则色谱柱被损坏，样品降解；若pH小于2，则不利于样品的纯化。因此，流动相A的pH为2～8是合适的，优选的pH为2-6，进一步优选为3-5。
本发明所述的高纯度多肽或其类似物制备方法中，步骤(2)中洗脱的方式为梯度或者等度洗脱，优选为等度洗脱。
本发明所述的高纯度多肽或其类似物制备方法中，步骤(2)中洗脱的方式为梯度洗脱时，梯度为流动相A为0.1％TFA水溶液，流动相B为甲醇或者乙腈中的一种或多种，其中，流动相B在25min时间内，从5％增加到20％。
本发明所述的高纯度多肽或其类似物制备方法中，步骤(2)中流动相的流速为10～160mL/min，色谱柱直径为20～80mm。
本发明所述的高纯度多肽或其类似物制备方法中，步骤(2)收集目的峰馏分后，还可进一步进行转盐操作(例如盐酸盐或者醋酸盐)后冻干。
本发明所述的高纯度多肽或其类似物制备方法中，步骤(2)中，收集目的峰馏分还可以进一步操作，可以包括：
a：继续采用前述方法进一步制备纯化，和/或；
b：将收集的目的峰馏分冻干，加水溶解，优选过滤，得到溶液，采用反相高效液相色谱法纯化，收集目的峰馏分，冻干，其中，色谱条件为：固定相为C18，流动相A为0.1％TFA水溶液，流动相B为甲醇或者乙腈中的一种或多种，其中，B相在25min时间内，从5％增加到20％。
优选地，在步骤b中，流动相的流速为10～160ml/min，色谱柱直径20～80mm。
一种所述的流动相作为制备高纯度多肽或其类似物的应用。所述的流动相包括流动相A和流动相B，流动相A为磷酸盐水溶液、甲酸盐水溶液或者乙酸盐水溶液中的一种或多种，流动相B为甲醇或者乙腈中的一种或多种，流动相A与流动相B的体积比为(80～100)：(0～20)，其中流动相B不为零。
优选的，流动相A与流动相B的体积比优选为(90～100)：(0～10)，其中流动相B不为零；进一步优选为(90～97)：(3～10)。
优选为流动相A选自磷酸、甲酸、乙酸的钾盐、伯胺盐或叔胺盐水溶液中的一种或多种；更优选流动相A为磷酸、甲酸、乙酸的铵盐、三乙胺盐水溶液中的一种或多种；更优选流动相A为磷酸铵、甲酸铵、磷酸二氢钾或磷酸三乙胺水溶液中的一种或多种。
本发明所述的高纯度多肽或其类似物(例如AMG416)的制备纯化方法与现有技术相比，具有如下有益效果：
(1)本发明优先采用等度洗脱的纯化方式，使用固定配比的流动相，使本发明的技术方案简便，易操作，降低了人力和试剂成本；
(2)本发明经过对流动相的组分以及比例进行优化，使多肽或其类似物(例如AMG416)分子在纯化过程中不易降解，可稳定存在并进行有效制备纯化，减少了多肽或其类似物(例如AMG416)在纯化过程中的损失，大大提高了纯化收率。
(3)由于多肽或其类似物(例如AMG416)极性较大，纯化过程中出峰时间较短，不易与小分子大极性的杂质有效的分离，在本技术方案中流动相采用合适的有机或无机盐水溶液及其比例，使多肽或其类似物(例如AMG416)与各种杂质能有效分离，提高了最终产品的纯度。
综上所述，本发明采用的多肽或其类似物(例如AMG416)制备纯化技术方案，在保证多肽或其类似物(例如AMG416)的分离效果，提高其终产品纯度的同时，优化流动相成分和比例，减少对待制备纯化多肽或其类似物(例如AMG416)样品的结构影响，减低其分解使多肽或其类似物(例如AMG416)尽可能稳定存在于制备纯化所用流动相中，大大提高了终产品的收率。本方法简便易操作，节约流动相使用量，适用于工业化大生产，工业应用前景非常良好。
本发明所述的高纯度多肽或其类似物制备方法中，对起始原料多肽或其类似物(例如AMG416)的纯度并无限制，例如，可以采用纯度为65％-85％的或纯度低于65％的多肽或其类似物(例如AMG416)等。
下面通过具体实施方式对本发明做进一步详细说明，但是并不是对本发明的限制，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
附图说明
图1实施例1中AMG416溶液的色谱图；
图2实施例1中AMG416盐酸盐精肽的色谱图；
图3实施例3中AMG416醋酸盐精肽的色谱图。
具体实施方式
名词解释：
TFA：三氟乙酸；
AMG416：vecalcetide、etelcalcetide，其结构如下：
M：其作为单位时，表示mol/L。
目的峰：主要包含多肽或其类似物(例如AMG416)的峰。
C18：十八烷基键合固定相填料
DMSO：二甲基亚砜；
DMF：N,N-二甲基甲酰胺；
THF：四氢呋喃；
ACN：乙腈；
HAc：乙酸。
实施例1：
色谱条件：采用安捷伦1260制备系统，YMC 5μm C18填料预装的20*250mm制备柱。配制浓度为50mM的磷酸铵水溶液，使用磷酸调节pH＝3.0，作为A相，甲醇作为B相，A相与B相的体积比为97:3，洗脱方式为等度洗脱，流速10ml/min。
取50mg AMG416粗品(粗品的纯度为69％)溶解在1ml纯化水中并过滤上样。收集目的峰，将目的峰馏分合并，得AMG416溶液，其RP-HPLC纯度为99.75％(如图1所示)；将溶液使用离子交换填料色谱柱或者冻干后化学法转盐酸盐，冻干，得31.5mg AMG416盐酸盐精肽，其RP-HPLC纯度99.52％(如图2所示)。计算可知，本方法的重量总收率为63％(重量收率＝冻干品质量/粗品质量*100％，下同)。
表1：AMG416溶液的色谱表
| 峰 | 保留时间 | 峰高 | 峰面积 | 峰面积％ |
| 1 | 10.61 | 0.26 | 1.13 | 0.02 |
| 2 | 10.74 | 0.47 | 1.94 | 0.03 |
| 3 | 10.94 | 1.31 | 5.29 | 0.08 |
| 4 | 11.13 | 721.65 | 6646.37 | 99.75 |
| 5 | 11.68 | 0.46 | 3.00 | 0.05 |
| 6 | 14.14 | 1.14 | 5.02 | 0.07 |
表2：AMG416盐酸盐精肽的色谱表
| 峰 | 保留时间 | 峰高 | 峰面积 | 峰面积％ |
| 1 | 8.76 | 0.92 | 9.60 | 0.15 |
| 2 | 10.81 | 0.43 | 1.87 | 0.03 |
| 3 | 11.02 | 1.55 | 8.64 | 0.13 |
| 4 | 11.21 | 706.02 | 6580.44 | 99.52 |
| 5 | 11.74 | 0.46 | 2.91 | 0.04 |
| 6 | 12.34 | 0.60 | 2.87 | 0.04 |
| 7 | 14.24 | 1.14 | 5.76 | 0.09 |
实施例2
步骤一：
色谱条件：采用安捷伦1260制备系统，Daiso 10μm C18填料预装的20*250mm制备柱。配制浓度为30mM的甲酸铵水溶液，使用甲酸调节pH＝3.5，作为A相，甲醇为B相，A相与B相的体积比为95:5，洗脱方式为等度洗脱，流速10ml/min。
取50mg AMG416粗品(粗品的纯度为69％)溶解在1ml纯化水中并过滤上样。收集目的峰，将目的馏分合并后将溶液冻干，得AMG416精制品。
步骤二：
采用安捷伦1260制备系统，苏州纳微10μm C18填料预装的20*250mm制备柱。配制0.1％TFA水溶液作为A相，甲醇作为B相。B相在25min时间内，从5％增加到20％，流速10ml/min。
将步骤一得到的AMG416精制品溶解在0.8ml纯化水中并过滤上样。收集目的峰，将纯度＞95％的目的峰合并后冻干得到22.7mg的AMG416精肽，其RP-HPLC纯度为99.92％。计算可知，本方法的重量收率45.4％。
实施例3
色谱条件：采用汉邦DAC80制备系统，汉邦SP 10μm C18填料DAC的80*250mm制备柱。配制浓度为50mM的磷酸铵水溶液，使用磷酸调节pH＝3.0，作为A相，甲醇为B相，A相与B相的体积比为95:5，洗脱方式为等度洗脱，流速160ml/min。
取810mg AMG416粗品(粗品的纯度为69％)溶解在20ml纯化水，使用少量乙酸/氨水调节pH＝6.80，过滤上样。收集目的峰，将目的峰馏分合并，得AMG416溶液，其RP-HPLC纯度为99.39％(如图3所示)，将溶液转醋酸盐，冻干得到572mg的AMG416醋酸盐精肽。计算可知，本方法的重量收率为70.6％。
表3：AMG416醋酸盐精肽的色谱表
| 峰 | 保留时间 | 峰高 | 峰面积 | 峰面积％ |
| 1 | 8.76 | 0.49 | 5.58 | 0.22 |
| 2 | 11.02 | 0.14 | 0.72 | 0.03 |
| 3 | 11.27 | 371.08 | 2494.39 | 99.39 |
| 4 | 11.78 | 0.41 | 2.88 | 0.12 |
| 5 | 12.51 | 0.59 | 5.64 | 0.22 |
| 6 | 13.38 | 0.07 | 0.51 | 0.02 |
实施例4
色谱条件：采用安捷伦1260制备系统，YMC 5μm C18填料预装的20*250mm制备柱。配制浓度为50mM的磷酸铵水溶液，使用磷酸调节pH＝3.0，作为A相，甲醇作为B相，A相与B相的体积比为90:10，洗脱方式为等度洗脱，流速10ml/min。
取50mg AMG416粗品(粗品的纯度为69％)溶解在1ml纯化水中并过滤上样。收集目的峰，将目的峰馏分合并后转盐酸盐，冻干得28.6mg的AMG416盐酸盐精品，其RP-HPLC纯度为99.84％。计算可知，本方法的重量收率为56.2％。
实施例5
色谱条件：采用安捷伦1260制备系统，YMC 5μm C18填料预装的20*250mm制备柱。配制浓度为50mM的磷酸铵水溶液，使用磷酸调节pH＝5.0，作为A相，甲醇作为B相，A相与B相的体积比为95:5，洗脱方式为等度洗脱，流速10ml/min。
取50mg AMG416粗品(粗品的纯度为69％)溶解在1ml纯化水中并过滤上样。收集目的峰，将目的峰馏分合并后转盐酸盐，冻干得25.4mg的AMG416盐酸盐精品，其RP-HPLC纯度为99.37％。计算可知，本方法的重量收率为50.8％。
实施例6
色谱条件：采用安捷伦1260制备系统，YMC 5μm C18填料预装的20*250mm制备柱。配制浓度为10mM的磷酸铵水溶液，使用磷酸调节pH＝3.0，作为A相，甲醇作为B相，A相与B相的体积比为95:5，洗脱方式为等度洗脱，流速10ml/min。
取50mg AMG416粗品(粗品的纯度为69％)溶解在1ml纯化水中并过滤上样。收集目的峰，将目的峰馏分合并后转盐酸盐，冻干得21.9mg的AMG416盐酸盐精品，其RP-HPLC纯度为97.57％。计算可知，本方法的重量收率为43.8％。
实施例7
色谱条件：采用安捷伦1260制备系统，YMC 5μm C18填料预装的20*250mm制备柱。配制浓度为50mM的磷酸二氢钾水溶液，使用磷酸调节pH＝2.98，作为A相，甲醇为B相，A相与B相的体积比为95:5，洗脱方式为等度洗脱，流速10ml/min。
取50mg AMG416粗品(粗品的纯度为69％)溶解在1ml纯化水中并过滤上样。收集目的峰，将目的峰馏分合并后转盐酸盐，冻干得到33.1mg的AMG416盐酸盐精肽，其RP-HPLC纯度为97.86％。计算可知，本方法的重量收率为66.2％。
实施例8
色谱条件：采用安捷伦1260制备系统，YMC 5μm C18填料预装的20*250mm制备柱。磷酸三乙胺水溶液作为A相(配制浓度为0.1％(v/v)三乙胺水溶液，使用磷酸调节pH＝3.0)，甲醇为B相，A相与B相的体积比为95:5，洗脱方式为等度洗脱，流速10ml/min。
取50mg AMG416粗品(粗品的纯度为69％)溶解在1ml纯化水中并过滤上样。收集目的峰，将目的峰馏分合并后转盐酸盐，冻干得到27.8mg AMG416盐酸盐精肽，其RP-HPLC纯度为98.50％。计算可知，本方法的重量收率为55.6％。
实验结果说明，本发明方法可以制备得到高纯度的AMG416产品，而且收率高。实施例9：
色谱条件：采用安捷伦1260制备系统，YMC 5μm C18填料预装的20*250mm制备柱。配制浓度为150mM的磷酸铵水溶液，使用磷酸调节pH＝3.0，作为A相，甲醇作为B相，A相与B相的体积比为97:3，洗脱方式为等度洗脱，流速10ml/min。
取50mg AMG416粗品(粗品的纯度为69％)溶解在1ml纯化水中并过滤上样。样品直接被洗脱下来，纯化效果差或无纯化效果，将目的峰馏分合并后转盐酸盐，冻干得到40.3mgAMG416盐酸盐精肽，其RP-HPLC纯度为69.3％。
实施例10：
色谱条件：采用安捷伦1260制备系统，YMC 5μm C18填料预装的20*250mm制备柱。配制浓度为50mM的磷酸铵水溶液，使用磷酸调节pH＝3.0，作为A相，甲醇作为B相，A相与B相的体积比为75:25，洗脱方式为等度洗脱，流速10ml/min。
取50mg AMG416粗品(粗品的纯度为69％)溶解在1ml纯化水中并过滤上样。样品上样后直接被洗脱下来，纯化效果差或无纯化效果。将目的峰馏分合并后转盐酸盐，冻干得到39.2mg AMG416盐酸盐精肽，其RP-HPLC纯度为69.1％。
实施例11：
色谱条件：采用安捷伦1260制备系统，YMC 5μm C18填料预装的20*250mm制备柱。配制浓度为50mM的磷酸铵水溶液，使用磷酸调节pH＝3.0，作为A相，甲醇作为B相，A相与B相的体积比为99:1，洗脱方式为等度洗脱，流速10ml/min。
取50mg AMG416粗品(粗品的纯度为69％)溶解在1ml纯化水中并过滤上样。样品上样后样品无法被洗脱下来。随后调整A相与B相的体积比为97:3，收集目的峰馏分合并后转盐酸盐，冻干得到39.6mg AMG416盐酸盐精肽，其RP-HPLC纯度为99.47％。综上，本发明方法可以有效制备纯化AMG416，获得高纯度的AMG416产品，而且收率高，工业应用前景良好。
Claims (11)
1.一种制备高纯度多肽或其类似物的方法，其特征在于，包括如下步骤：制备多肽或其类似物的水溶液，采用色谱分离法制备纯化多肽或其类似物水溶液，收集目的峰，合并后将溶液冻干或进一步操作，得到高纯度多肽或其类似物精制品；
其中，色谱分离法的固定相为C18，流动相A为磷酸盐水溶液、甲酸盐水溶液或者乙酸盐水溶液中的一种或多种，流动相B为甲醇或者乙腈中的一种或多种，流动相A与流动相B的体积比为(80～100)：(0～20),其中流动相B不为零，流动相的流速为10～160mL/min,色谱柱直径为20～80mm。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于：所述多肽或其类似物为AMG416或其类似物。
3.根据权利要求1-2所述的方法，其特征在于：所述多肽或其类似物加水溶解后过滤，得多肽或其类似物的水溶液；其中所述多肽或其类似物通过化学合成多肽方法制备得到。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于：所述流动相A选自磷酸、甲酸、乙酸的钾盐、胺盐水溶液中的一种或多种；优选流动相A为磷酸、甲酸、乙酸的钾盐、伯胺盐或叔胺盐水溶液中的一种或多种；更优选流动相A为磷酸、甲酸、乙酸的铵盐、三乙胺盐水溶液中的一种或多种。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于：所述磷酸盐水溶液、甲酸盐水溶液、乙酸盐水溶液的浓度不高于150mmol/L，优选浓度不高于70mmol/L，更优选浓度为10-50mmol/L。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于：所述磷酸盐水溶液、甲酸盐水溶液、乙酸盐水溶液的pH为2-8，优选为2-6，进一步优选为3-5。
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于：该方法中的洗脱方式选自梯度洗脱或等度洗脱，优选等度洗脱。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于：流动相A与流动相B的体积比为(90～100)：(0～10)，其中流动相B不为零，更优选(90～97)：(3～10)。
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于：收集目的峰馏分后，转盐后冻干，或者直接冻干。
10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于：收集目的峰馏分后还可进一步制备纯化，包括：
a：重复权利要求1-9中任一所述方法；和/或
b：将收集的目的峰馏分冻干，加水溶解，过滤得溶液，采用反相高效液相色谱法纯化，收集目的峰馏分，冻干，其中，反相高效液相色谱条件为：固定相为C18，流动相A为0.1％TFA水溶液，流动相B为甲醇或者乙腈中的一种或多种，B相的体积含量在25min时间内从5％增加到20％。
11.权利要求1-10任一项所述的流动相作为制备高纯度多肽或其类似物的应用。
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