CN103102395B - 一种醋酸去氨加压素的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药物化学技术领域，公开了一种醋酸去氨加压素的制备方法。本发明所述醋酸去氨加压素的制备方法采用固相合成法合成线性去氨加压素肽树脂，裂解得到线性去氨加压素粗肽，然后通过反相高效液相色谱法纯化线性去氨加压素粗肽后再进行液相氧化，最后转盐得到醋酸去氨加压素。与现有技术相比，本发明所述制备方法结合固相合成和液相氧化的优点，将固相合成、纯化和液相氧化相结合，操作简单、生产成本低、环境污染小、醋酸去氨加压素收率高，适合于醋酸去氨加压素大规模产业化生产，并且制得的醋酸去氨加压素产品质量好，纯度高、杂质含量低，具有可观的经济实用价值和广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于药物化学技术领域，尤其涉及一种醋酸去氨加压素的制备方法。
背景技术
醋酸去氨加压素，英文名为Desmopressin Acetate，分子式为C50H72N14O16S2，分子量为1129.27，为天然精氨盐加压素的结构类似物，系对天然激素的化学结构进行两处改动而得，即1-半胱氨酸脱去氨基和以8-D-精氨酸取代8-L-精氨酸。醋酸去氨主要用于治疗中枢性尿崩症、夜间遗尿及血友病等，也用于肾尿液浓缩功能的测试，也可用作术后止血。其肽序列结构如下：
目前文献报道的醋酸去氨加压素的合成主要两种，第一种是液相合成（U.S.Pat.No.3497491），在碱性条件下一个氨基酸一个氨基酸地偶联，没偶联一个氨基酸都需要进行一步纯化，最后将样品溶液pH值调为6.5-7.0加氧化剂氰化钾氧化形成二硫键得到去氨加压素粗肽。液相合成的方法耗时，操作相当麻烦，收率很低，不利于产业化生产。第二种方法是通过固相合成的方法（CN101372505A；U.S.Pat.No.5200507），用Fmoc-Gly-OH和合适替代度的Sieber Amide树脂，采用氨基酸逐一偶联的方式得到线性去氨加压素树脂，用碘做氧化剂，固相氧化二硫键成环得到去氨加压素的树脂，最后通过裂解的方法将去氨加压素从树脂上切割下来，得到去氨加压素的粗肽，然后经过HPLC纯化，采用阴离子交换法得到醋酸去氨加压素。但是这种固相合成树脂的替代度不能太高，氧化过程不好控制，操作上虽然显得比较简单，但氧化收率低，副反应比较多。纯化比较困难，产品质量不高。
此外，还有一种方法是用固相合成得到线性肽的粗肽，用铁氰化钾做氧化剂，液相氧化得到去氨加压素（US2012094910A1）。但是这种方法因固相合成得到的粗肽较难溶解，当样品浓度较高时，氧化的效率就会比较低，会大大降低收率。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是针对现有技术的缺陷，提供一种操作简单、收率高、产品质量好的醋酸去氨加压素的制备方法。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种醋酸去氨加压素的制备方法，包括以下步骤：
1）固相合成线性去氨加压素肽树脂；
2）线性去氨加压素肽树脂裂解得到线性去氨加压素粗肽；
3）反相高效液相色谱法纯化线性去氨加压素粗肽得到线性去氨加压素精肽；
4）线性去氨加压素精肽经液相氧化得到去氨加压素；
5）去氨加压素经反相高效液相色谱法转盐得到醋酸去氨加压素。
本发明所述制备方法在固相合成线性去氨加压素粗肽后通过反相高效液相色谱法纯化线性去氨加压素粗肽后再进行液相氧化可以去除线性去氨加压素粗肽中的杂质，尤其是一些难溶的杂质，最大程度地提高氧化反应收率，减少氧化时副反应的发生。同时由于去除了杂质，氧化样品浓度相对增加，产生的废液减少，因此降低了废液处理的成本。
其中，本发明所述制备方法步骤1）采用Fmoc/tBu合成策略，以合适替代度的氨基树脂为载体，逐个偶联Fmoc保护基团的氨基酸固相合成得到线性去氨加压素肽树脂。
优选的，所述固相合成为Fmoc-Gly-OH和氨基树脂反应合成Fmoc-Gly-氨基树脂，然后Fmoc-Gly-氨基树脂采用逐一偶联的方式偶联Fmoc保护基团的其他氨基酸得到线性去氨加压素肽树脂。
其中，所述氨基树脂为Sibera Amide树脂。
进一步的，本发明所述制备方法采用液相氧化合成去氨加压素，避免了因固相氧化树脂的替代度太高容易发生分子间成二硫键的问题，因此本发明所述制备方法氨基树脂的替代度理论上可以比固相氧化的树脂替代度要高，从而节约成本。作为优选，本发明所述制备方法所述氨基树脂的替代度为0.5mmol/g~1.2mmol/g。
进一步的，本发明所述制备方法所述逐一偶联的Fmoc保护基团的其他氨基酸依次为Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Asn（Trt）-OH、Fmoc-Gln（Trt）-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Mpa(Trt)-OH。
其中，上述Fmoc保护基团的氨基酸可以通过商品销售渠道购买，也可利用已商品化的原料按照本领域技术人员已知的方法制备得到。
在某些具体实施方式中，步骤1）所述逐一偶联的方式中每一个氨基酸的偶联方法具体包括以下步骤：
a、洗涤：DMF和DCM交替洗涤2到3次；
b、脱保护：用20%的六氢吡啶/DMF溶液室温处理2-3次，每次5-10min，脱去Fmoc-保护剂，Kaiser试剂检测反应是否完全；
c、洗涤：DMF和DCM交替洗涤2到3次；
d、氨基酸偶联：将Fmoc-保护氨基酸、HOBt、DIC用适量DMF溶解后，加入反应柱中，与树脂混合搅拌2-4h，Kaiser试剂检测反应是否完全。
本发明所述制备方法步骤2）通过裂解剂裂解线性去氨加压素肽树脂，得到线性去氨加压素粗肽。其中，所述裂解的裂解剂为三氟乙酸、三异丙基硅烷、1，2-乙二硫醇与水的混合物。
优选的，所述三氟乙酸、三异丙基硅烷、1，2-乙二硫醇与水的体积比为90-93:1~3:2~6:1~7。更优选为90:3:4:3或91:3:3:3。
本发明所述制备方法步骤3）裂解得到线性去氨加压素粗肽经纯化得到线性去氨加压素精肽，所述纯化优选为反相高效液相色谱纯化。
反相高效液相色谱，英文名reversed phase high performance liquidchromatography，简称，RP-HPLC，是由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系。它正好与由极性固定相和弱极性流动相所组成的液相色谱体系（正相色谱）相反。RP-HPLC是当今液相色谱的最主要的分离模式，几乎可用于所有能溶于极性或弱极性溶剂中的有机物的分离纯化。
本发明所述步骤3）纯化线性去氨加压素粗肽得到线性去氨加压素精肽对纯化要求并不高，只需要除去在色谱图上离目的峰较远的杂质即可，因此纯化时可以增大上样量，从而大大提高纯化效率。
由于本发明所述线性去氨加压素粗肽在酸性流动相中溶解性较好，因此本发明步骤3）所述反相高效液相色谱法的流动相优选为三氟乙酸水溶液、甲酸水溶液或醋酸水溶液，更优选三氟乙酸水溶液。进一步的，所述三氟乙酸的浓度优选为0.05v/v%-2v/v%。
在一些具体实施例中，步骤3）所述反相高效液相色谱法的流动相A相为0.1v/v%三氟乙酸水溶液，流动相B相为0.05v/v%三氟乙酸乙腈溶液。
本发明步骤3）所述反相高效液相色谱法所用的填料可以为十八烷基硅烷键合硅胶（C18）、丁基硅烷键合硅胶（C4）或八烷基硅烷键合硅胶（C8），优选为十八烷基硅烷键合硅胶。
在某一具体实施方式中，本发明步骤3）所述反相高效液相色谱纯化的色谱条件为：以装有十八烷基硅烷键合硅胶（C18，
10μ）的填料，直径100mm的反相色谱柱为固定相，以0.1v/v%三氟乙酸水溶液为流动相A相，以0.05v/v%三氟乙酸乙腈溶液为流动相B相，梯度洗脱
分离线性肽去氨加压素，收集线性肽去氨加压素纯度大于50%的馏分。
本发明所述制备方法步骤4）纯化得到的线性去氨加压素精肽经液相氧化得到去氨加压素，其中所述液相氧化为在pH值7.0-8.0的条件下，线性去氨加压素精肽与氧化剂进行氧化反应得到去氨加压素。
其中，所述液相氧化的氧化剂为双氧水、K3Fe(CN)6或谷胱甘肽氧化巯基。更优选为双氧水。
为了中止氧化反应、防止反应得到的去氨加压素样品变性，本发明所述液相氧化反应在氧化得到去氨加压素后还包括加醋酸调pH值至为酸性的步骤。进一步的，所述pH值为3.0-4.0。
本发明所述制备方法步骤5）采用反相高效液相色谱法将去氨加压素转盐得到醋酸去氨加压素。其中，步骤5）所述反相高效液相色谱法的A1相为醋酸铵水溶液，流动相A2相为醋酸水溶液，流动相B相为乙腈。本发明所述反相高效液相色谱法先用醋酸铵水溶液做流动相A1相，流动相B相为乙腈洗脱去除磷酸盐，然后再用醋酸水溶液做流动相A2相，流动相B为乙腈洗脱得到醋酸去氨加压素。
作为优选，所述醋酸铵水溶液浓度为0.1v/v%-0.5v/v%。
作为优选，所述醋酸铵水溶液pH为5.0~6.5。
作为优选，所述醋酸水溶液浓度为0.05v/v%-0.2v/v%。
本发明步骤5）所述反相高效液相色谱法所用的填料可以为十八烷基硅烷键合硅胶（C18）、丁基硅烷键合硅胶（C4）或八烷基硅烷键合硅胶（C8），优选为十八烷基硅烷键合硅胶。
在某一具体实施方式中，本发明步骤5）所述反相高效液相色谱转盐的色谱条件为：以装有十八烷基硅烷键合硅胶（C18，
10μ）的填料，直径100mm的反相色谱柱为固定相，以浓度0.2v/v%、pH值5.6的醋酸铵水溶液为流动相A1相，以纯乙腈溶液为流动相B相，以0.1v/v%醋酸水溶液为流动相A2相按照：
为了提高制得的醋酸去氨加压素的纯度，本发明所述制备方法步骤4）还包括去氨加压素纯化步骤。氧化后的去氨加压素经纯化得到去氨加压素精肽。
优选的，所述纯化为反相高效液相色谱纯化。
进一步，所述反相高效液相色谱纯化的流动相A相为0.1v/v%-0.4v/v%磷酸三乙胺水溶液、流动相B为乙腈。
作为优选，所述磷酸三乙胺水溶液pH为6.0~6.8。
在某一具体实施方式中，本发明反相高效液相色谱纯化去氨加压素的色谱条件为：以装有十八烷基硅烷键合硅胶（C18，
10μ）的填料，直径100mm的反相色谱柱为固定相，以浓度0.2v/v%、pH值6.80的磷酸三乙胺水溶液流动相A相，以纯乙腈溶液为流动相B相的反相色谱条件分离
去氨加压素。
本发明所述醋酸去氨加压素的制备方法采用固相合成法合成线性去氨加压素肽树脂，裂解得到线性去氨加压素粗肽，然后通过反相高效液相色谱法纯化线性去氨加压素粗肽后再进行液相氧化，最后转盐得到醋酸去氨加压素。与现有技术相比，本发明所述制备方法结合固相合成和液相氧化的优点，将固相合成、纯化和液相氧化相结合，操作简单、生产成本低、环境污染小、醋酸去氨加压素收率高，适合于醋酸去氨加压素大规模产业化生产，并且制得的醋酸去氨加压素产品质量好，纯度高、杂质含量低，具有可观的经济实用价值和广泛的应用前景。
附图说明
图1示常规固相氧化方法得到去氨加压素的粗肽的色谱图；
图2示本发明所述方法得到去氨加压素的粗肽的色谱图。
具体实施方式
本发明实施例公开了一种醋酸去氨加压素的制备方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。
说明书和权利要求书中所使用的缩写的含义列于下表中：
实施例1：Fmoc-Gly-SieberAmide树脂的制备
在200mL的反应柱中加入20g克Sieber Amide树脂（替代度为1.2mmol/g），加入DMF溶胀30分钟，溶胀完后，用20%六氢吡啶/DMF(V:V)溶液脱除Fmoc保护基团。用DMF洗涤三次，再用DCM洗涤三次，将Fmoc-Gly-OH（50mmol），HOBt（60mmol）用适量的DMF溶解，冰水浴下加入DIC（60mmol），活化3分钟，加入上述的反应柱中，室温下搅拌反应120min。反应完后，真空抽去反应液，用DMF洗涤三次。用Kaiser试剂检测反应，20%的乙酸酐或者吡啶进行封闭2小时。抽掉反应液，DMF洗涤三次，DCM洗涤三次，取少量树脂用甲醇收缩三次，用真空抽干，测树脂替代度为0.90mmol/g。
实施例2：Fmoc-Gly-SieberAmide树脂的制备
在500mL的反应柱中加入100克Sieber Amide树脂（替代度为0.5mmol/g），加入DMF溶胀30分钟，然后再加入N-甲基吡咯烷酮30分钟，溶胀完后，用20%六氢吡啶DMF溶液脱除Fmoc保护基团。用DMF洗涤三次，再用DCM洗涤三次，将Fmoc-Gly-OH（150mmol），HOBt（200mmol）用适量的DMF溶解后，冰水浴下加入和DIC（300mmol）活化3分钟，加入上述的反应柱中，室温下搅拌反应120min。反应完后，真空抽去反应液，用DMF洗涤三次。用Kaiser试剂检测反应，20%的乙酸酐或者吡啶进行封闭2小时。DMF洗涤三次，DCM洗涤三次，取少量树脂用甲醇收缩三次，用真空抽干，测树脂替代度为0.48mmol/g。
实施例3：线性去氨加压素肽树脂的制备
在500mL的反应柱中加入25g实施例1制得的Fmoc-Gly-Sieber Amide树脂（替代度为0.90mmol/g），加入DMF溶胀30分钟，溶胀完后用20%六氢吡啶DMF溶液脱Fmoc保护基10分钟，然后分别用DMF，和DCM洗涤三次。将Fmoc-D-Arg（Pbf）-OH（50mmol），HOBt（75mmol），DIC（100mmol）用适量DMF溶解后加入上述反应柱中，室温下氮气搅拌120分钟。用Kaiser试剂检测反应完后，真空抽去反应液，用DMF洗涤三次，DCM洗涤三次。按照上述偶联Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH的方法，依次偶联Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Cys(Trt)-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH和Mpr(Trt)-OH。最后得到Mpr(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-D-Arg(Pbf)-Gly-Sieber树脂。将得到的线性去氨加压素肽树脂用甲醇收缩三次，真空干燥得到肽树脂58g。
实施例4：线性去氨加压素肽树脂的制备
在500mL的反应柱中加100g实施例2制得的Fmoc-Gly-Sieber Amide树脂（替代度为0.48mmol/g），加入DMF溶胀30分钟，溶胀完后用20%六氢吡啶DMF溶液脱Fmoc保护基10分钟，然后分别用DMF，和DCM洗涤三次。将Fmoc-D-Arg（Pbf）-OH，HOBt，DIC用适量DMF溶解后加入上述反应柱中，室温下氮气搅拌120分钟。用Kaiser试剂检测反应完后，真空抽去反应液，用DMF洗涤三次，DCM洗涤三次。按照上述偶联Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH的方法，依次偶联Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Cys(Trt)-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH和Mpr(Trt)-OH。最后得到Mpr(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-D-Arg(Pbf)-Gly-SieberAmide树脂。将得到的线性去氨加压素肽树脂用甲醇收缩三次，真空干燥得到肽树脂118g。
实施例5：线性去氨加压素肽树脂的制备
在1000mL的反应柱中加200g实施例2制得的Fmoc-Gly-Sieber Amide树脂（替代度为0.48mmol/g），加入DMF溶胀30分钟，溶胀完后用20%六氢吡啶DMF溶液脱Fmoc保护基10分钟，然后分别用DMF，和DCM洗涤三次。将Fmoc-D-Arg（Pbf）-OH，HOBt，DIC用适量DMF溶解后加入上述反应柱中，室温下氮气搅拌120分钟。用Kaiser试剂检测反应完后，真空抽去反应液，用DMF洗涤三次，DCM洗涤三次。按照上述偶联Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH的方法，依次偶联Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Cys(Trt)-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH和Mpr(Trt)-OH。最后得到Mpr(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-D-Arg(Pbf)-Gly-Sieber Amide树脂。将得到的线性去氨加压素肽树脂用甲醇收缩三次，真空干燥得到肽树脂340g。
实施例6：线性肽的制备
将实施例3得到的58g线性肽树脂加入到1L烧瓶中，加入配置好的裂解液（TFA：TIS：EDT：H2O=90:3:4:3，V:V），室温反应2小时，滤掉树脂，树脂用100mLTFA洗涤，合并滤液，滤液加入到6L乙醚中，静置2小时，离心，得到去氨加压素粗肽24.1克，HPLC纯度为74.8%。
实施例7：线性肽的制备
将实施例4得到的118g线性肽树脂加入到2L烧瓶中，加入配置好的裂解液（TFA：TIS：EDT：H2O=91:3:3:3，V:V），室温反应2小时，滤掉树脂，树脂用100mLTFA洗涤，合并滤液，滤液加入到6L乙醚中，静置2小时，离心，得到去氨加压素粗肽48.3克，HPLC纯度为79.6%。
实施例8：线性肽的纯化
将实施例6中得到的24.1g粗肽线性去氨加压素用研钵研碎，至粉末，加30mL冰醋酸，10mL的纯乙腈和60mL的纯水，超声仪中超声至粗肽全部溶解，用0.45μm微孔滤膜过滤，收集滤液，待上制备柱纯化。制备以装有十八烷基硅烷键合硅胶（C18，
10μ）的填料，直径100mm的反相色谱柱为固定相，以0.1v/v%三氟乙酸水溶液为流动相A相，以0.05v/v%三氟乙酸乙腈溶液为流动相B相的反相色谱条件梯度洗脱 
分离线性肽去氨加压素。将收集到的馏分线性肽去氨加压素纯度大于50%的馏分混合，检测线性肽的精肽纯度为90%去氨加压素。
实施例9：线性肽的纯化
将实施例7中得到的48.3g粗肽线性去氨加压素用研钵研碎，至粉末，加50mL冰醋酸，20mL的纯乙腈和100mL的纯水，超声仪中超声至粗肽全部溶解，用0.45μm微孔滤膜过滤，收集滤液，待上制备柱纯化。制备以装有十八烷基硅烷键合硅胶（C18，
10μ）的填料，直径100mm的反相色谱柱为固定相，以0.1v/v%三氟乙酸水溶液为流动相A相，以0.05v/v%三氟乙酸乙腈溶液为流动相B相的反相色谱条件梯度洗脱
分离线性肽去氨加压素。将收集到的馏分线性肽去氨加压素纯度大于50%的馏分混合得到纯度为92%去氨加压素。
实施例10：醋酸去氨加压素的氧化
取实施例8中得到的纯度为90%的线性肽醋酸去氨加压素样品10g，用纯水稀释至10L，用氨水调pH值7.20，缓慢加入4mLH2O2，搅拌反应至线性肽反应完全，用醋酸调pH值至3.0-4.0中止氧化反应。氧化后用HPLC检测氧化肽的色谱纯度为87%。
实施例11：醋酸去氨加压素的氧化
取实施例9中得到的纯度为92%的线性肽醋酸去氨加压素样品20g，用纯水稀释至20L，用氨水调pH值7.50，缓慢加入7mLH2O2，搅拌反应至线性肽反应完全，用醋酸调pH值至3.0-4.0中止氧化反应。氧化后用HPLC检测氧化肽的色谱纯度为88.5%。
实施例12：醋酸去氨加压素的氧化
取实施例9中得到的纯度为92%的线性肽醋酸去氨加压素样品20g，用纯水稀释至20L，用氨水调pH值8.00，加入约10gK3Fe(CN)6，搅拌反应，中间用HPLC检测未反应的线性肽残留情况，待线性肽完全反应后，用醋酸调pH值至3.0-4.0中止氧化反应。氧化后用HPLC检测氧化肽的色谱纯度为92.5%。
实施例13：醋酸去氨加压素的制备
将实施例10中的得到的去氨加压素粗肽，以装有十八烷基硅烷键合硅胶（C18，
10μ）的填料，直径100mm的反相色谱柱为固定相，以浓度0.2v/v%，pH值6.0的磷酸三乙胺水溶液为流动相A相，以纯乙腈溶液为流动相B相的反相色谱条件分离
环肽去氨加压素。得到纯度大于99%的去氨加压素溶液，加入适量醋酸，待转醋酸盐。
反相色谱转醋酸盐，以装有十八烷基硅烷键合硅胶（C18，
10μ）的填料，直径100mm的反相色谱柱为固定相，以浓度0.2v/v%，pH值5.6的醋酸铵水溶液为流动相A1相，以纯乙腈溶液为流动相B相，以0.1v/v%醋酸水溶液为A2相按照：
将去氨加压素转为醋酸盐，得到纯度大于99.5%的醋酸去氨加压素溶液，经浓缩，冻干得到醋酸去氨加压素9.7g，检测精肽色谱纯度为99.8%，精肽纯化收率为97%，精肽总收率为52%。
实施例14：醋酸去氨加压素的制备
将实施例11中的得到的去氨加压素粗肽，以装有十八烷基硅烷键合硅胶（C18，
10μ）的填料，直径100mm的反相色谱柱为固定相，以浓度0.2v/v%，pH值6.50的磷酸三乙胺水溶液为流动相A相，以纯乙腈溶液为流动相B相的反相色谱条件分离
环肽去氨加压素。得到纯度大于99%的去氨加压素溶液，加入适量醋酸，待转醋酸盐。
反相色谱转醋酸盐，以装有十八烷基硅烷键合硅胶（C18，
10μ）的填料，直径100mm的反相色谱柱为固定相，以浓度0.2v/v%，pH值6.0的醋酸铵水溶液为流动相A1相，以纯乙腈溶液为流动相B相，以0.1v/v%醋酸水溶液为A2相按照：
将去氨加压素转为醋酸盐，得到纯度大于99.5%的醋酸去氨加压素溶液，经浓缩，冻干得到醋酸去氨加压素19g，精肽色谱纯度为99.7％，精肽纯度收率为95%，精肽总收率为51%。
实施例15：醋酸去氨加压素的制备
将实施例11中的得到的去氨加压素粗肽，以装有八烷基硅烷键合硅胶（C8，10μ）的填料，直径100mm的反相色谱柱为固定相，以浓度0.2v/v%，pH值6.80的磷酸三乙胺水溶液为流动相A相，以纯乙腈溶液为流动相B相的反相色谱条件分离
环肽去氨加压素。得到纯度大于99%的去氨加压素溶液，加入适量醋酸，待转醋酸盐。
反相色谱转醋酸盐，以装有十八烷基硅烷键合硅胶（C18，10μ）的填料，直径100mm的反相色谱柱为固定相，以浓度0.2v/v%，pH值5.6的醋酸铵水溶液为流动相A1相，以纯乙腈溶液为流动相B相，以0.1v/v%醋酸水溶液为A2相按照：
将去氨加压素转为醋酸盐，得到纯度大于99.5%的醋酸去氨加压素溶液，经浓缩，冻干得到醋酸去氨加压素18g，精肽色谱纯度为99.5％，精肽纯度收率为80%，精肽总收率为47%。
实施例16：醋酸去氨加压素的制备
取实施例12中的得到的去氨加压素粗肽约30g，以装有十八烷基硅烷键合硅胶（C18，
10μ）的填料，直径100mm的反相色谱柱为固定相，以浓度0.2v/v%，pH值6.80的磷酸三乙胺水溶液为流动相A相，以纯乙腈溶液为流动相B相的反相色谱条件分离
环肽去氨加压素。得到纯度大于99%的去氨加压素溶液，待转醋酸盐。
反相色谱转醋酸盐，以装有十八烷基硅烷键合硅胶（C18，
10μ）的填料，直径100mm的反相色谱柱为固定相，以浓度0.2v/v％，pH值6.0的醋酸铵水溶液为流动相A1相，以纯乙腈溶液为流动相B相，以0.1v/v%醋酸水溶液为A2相按照：
将去氨加压素转为醋酸盐，得到纯度大于99.5%的醋酸去氨加压素溶液，经浓缩，冻干得到醋酸去氨加压素28g，精肽色谱纯度为99.7％，精肽纯化收率为93.3%，精肽总收率为48.8%。
实施例17：固相氧化和液相氧化的收率比较
取实施例5中的线性去氨加压素肽树脂10g加入反应柱中，用常规固相氧化方法氧化得到去氨加压素的粗肽，按照实施例13的方法纯化得到精肽1.8g，收率为36%。
取实施例5中的线性去氨加压素肽树脂10g加入反应柱中，用高效液相色谱纯化后，再用实施例11中所述的方法氧化，按照实施例13的方法纯化得到精肽2.44g，收率为48.8%。
实施例18：固相氧化和液相氧化的精肽纯度比较
取实施例5中的线性去氨加压素肽树脂10g加入反应柱中，用常规固相氧化方法氧化得到去氨加压素的粗肽，按照实例13的方法纯化得到精肽，高效液相色谱法检测纯度98.5%。
取实施例5中的线性去氨加压素肽树脂10g加入反应柱中，用高效液相色谱纯化后，再用实施例11中所述的方法氧化，按照实施例13的方法纯化得到精肽纯化得到精肽，高效液相色谱法检测2.44g纯度99.85%。
两种方法得到的精肽色谱图如图1和图2，统计结果见表1和表2。
表1常规固相氧化方法得到去氨加压素的粗肽的色谱图结果
| 峰编号 | 保留时间(min) | 峰高 | 面积 | 面积百分比% |
| 1 | 6.58 | 5.045 | 1.735 | 0.48 |
| 2 | 7.15 | 7.883 | 2.349 | 0.65 |
| 3 | 7.74 | 1282.231 | 356.067 | 98.50 |
| 4 | 8.25 | 3.311 | 1.157 | 0.32 |
| 5 | 8.79 | 1.576 | 0.542 | 0.15 |
| 总计 | 1299.774 | 361.488 | 100.00 |
表2本发明所述方法得到去氨加压素的粗肽的色谱图结果
| 峰编号 | 保留时间(min) | 峰高 | 面积 | 面积百分比% |
| 1 | 7.14 | 1.748 | 0.358 | 0.12 |
| 2 | 7.73 | 1182.657 | 307.245 | 99.85 |
| 3 | 8.30 | 0.952 | 0.102 | 0.03 |
| 总计 | 1185.357 | 307.705 | 100.00 |
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (15)
1.一种醋酸去氨加压素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）固相合成线性去氨加压素肽树脂；
2）线性去氨加压素肽树脂裂解得到线性去氨加压素粗肽；
3）反相高效液相色谱法纯化线性去氨加压素粗肽得到线性去氨加压素精肽；
4）线性去氨加压素精肽经液相氧化得到去氨加压素，所述液相氧化为在pH值7.0-8.0的条件下，线性去氨加压素精肽与氧化剂进行氧化反应，之后加醋酸调pH值至为酸性；
5）去氨加压素经反相高效液相色谱法转盐得到醋酸去氨加压素。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤1）所述固相合成为Fmoc-Gly-OH和氨基树脂反应合成Fmoc-Gly-氨基树脂，然后Fmoc-Gly-氨基树脂采用逐一偶联的方式偶联Fmoc保护基团的其他氨基酸得到线性去氨加压素肽树脂。
3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述氨基树脂为SiberaAmide树脂。
4.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述Fmoc保护基团的其他氨基酸依次为Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Asn（Trt）-OH、Fmoc-Gln（Trt）-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Mpa(Trt)-OH。
5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤2）所述裂解的裂解剂为三氟乙酸、三异丙基硅烷、1，2-乙二硫醇与水的混合物。
6.根据权利要求5所述制备方法，其特征在于，所述三氟乙酸、三异丙基硅烷、1，2-乙二硫醇与水的体积比为90-93:1～3:2～6:1～7。
7.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤3）所述反相高效液相色谱法的流动相为三氟乙酸水溶液、甲酸水溶液或醋酸水溶液。
8.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述步骤5）所述反相高效液相色谱法的流动相A1相为醋酸铵水溶液，流动相A2相为醋酸水溶液，流动相B相为乙腈。
9.根据权利要求8所述制备方法，其特征在于，所述醋酸铵水溶液浓度为0.1v/v%-0.5v/v%。
10.根据权利要求8所述制备方法，其特征在于，所述醋酸铵水溶液pH为5.0～6.5。
11.根据权利要求8所述制备方法，其特征在于，所述醋酸水溶液浓度为0.05v/v%-0.2v/v%。
12.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤4）还包括去氨加压素纯化步骤。
13.根据权利要求12所述制备方法，其特征在于，所述纯化为反相高效液相色谱法纯化。
14.根据权利要求13所述制备方法，其特征在于，所述反相高效液相色谱法的流动相A为0.1v/v%-0.4v/v%磷酸三乙胺水溶液、流动相B为乙腈。
15.根据权利要求14所述制备方法，其特征在于，所述磷酸三乙胺水溶液pH为6.0～6.8。
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