CN104926927A - 去氨加压素的合成方法 - Google Patents

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戴政清
刘建
马亚平
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Abstract

本发明提供去氨加压素的合成方法，该方法包括：氨基酸单体和Mpa于水中按照PG-Gly-OH、PG-D-Arg-OH、PG-Pro-OH、PG-Cys(Trt)-OH、PG-Asn-OH、PG-Gln-OH、PG-Phe-OH、PG-Tyr-OH和Mpa的顺序依次偶联在脱除保护基的固相载体上，PG为水溶性氨基保护基，随后进行包括氧化、裂解、纯化的步骤。本发明的合成方法无需使用有机溶剂，节约成本且对环境无害，此外，该方法无需对肽序中的部分侧链官能团进行保护，操作简单、成本低、收率高，具有可观的经济实用价值和广泛的应用前景。

Description

去氨加压素的合成方法
技术领域
本发明涉及一种去氨加压素的合成方法。
背景技术
去氨加压素是天然精氨加压素的结构类似物，系对天然激素的化学结构进行两处改动而得，即1-半胱氨酸脱去氨基和以8-D-精氨酸取代8-L-精氨酸。去氨加压素的肽序结构为：Mpa-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-D-Arg-Gly-NH2（其中Mpa与Cys通过二硫键成环）。
去氨加压素主要用于治疗中枢性尿崩症、夜间遗尿及血友病等，也用于肾尿液浓缩功能的测试，还可用作术后止血。
随着Fmoc固相肽合成方法的日益发展和制备工艺的日渐成熟，目前，多肽合成中，固相合成逐渐取代液相合成。对于去氨加压素的合成，主要采用的合成方法是Fmoc固相多肽合成策略，氨基酸单体偶联的相应固相合成在有机溶剂中进行。例如申请号为201210336044.2的中国专利申请和中国专利CN101372505中记载的方法。
在现有技术的固相合成方法中，每一个氨基酸单体的偶联均需在有机溶剂（DMF）中进行，而且，合成过程中还需用有机溶剂多次洗涤产物，也要消耗大量有机溶剂（DMF等）。这不仅生产成本高，还严重污染环境，不利于产业的可持续性发展。
此外，现有技术的Fmoc固相肽合成策略，需要用哌啶（六氢吡啶）的DMF溶液脱除临时保护基团Fmoc，脱除过程中容易产生一些残基，从而导致许多副反应的发生，这就需要在氨基酸单体偶联成肽链时对肽序中的侧链官能团进行保护以避免发生副反应，这也会增加成本。
发明内容
本发明提供一种去氨加压素的合成方法，所述合成方法包括：
1)制备去氨加压素线性肽肽树脂：首先将氨基酸单体PG-Gly-OH和偶联剂与水混合均匀，静置，所得混合物随后在脱除保护基的固相载体上反应，得到PG-Gly-固相载体，然后脱除PG，得到H-Gly-固相载体；重复上述步骤，氨基酸单体和Mpa依次偶联在H-Gly-固相载体上，偶联顺序为依次偶联PG-D-Arg-OH、PG-Pro-OH、PG-Cys(Trt)-OH、PG-Asn-OH、PG-Gln-OH、PG-Phe-OH、PG-Tyr-OH、Mpa，所述PG为水溶性氨基保护基；由此得到式(I)的去氨加压素线性肽肽树脂Mpa-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-D-Arg-Gly-固相载体(I)；
2)制备去氨加压素环肽肽树脂：氧化得自步骤1)的去氨加压素线性肽肽树脂，得到式(II)的去氨加压素环肽肽树脂
3)制备去氨加压素：裂解得自步骤2)的去氨加压素环肽肽树脂，得到式(III)的去氨加压素
在本发明合成方法的一个优选实施方案中，所述PG为水溶性氨基保护基，其包括Pms、Esc、Sps。在本发明合成方法的一个更优选实施方案中，所述PG为Esc。
在本发明合成方法的一个实施方案中，氨基酸与固相载体的摩尔比为1:1-20:1。
在本发明合成方法的一个实施方案中，偶联剂选自EDC·HCl、HONB、DIPEA、TBTU或其混合物。在本发明合成方法的一个优选实施方案中，所述偶联剂为EDC·HCl、HONB和DIPEA的混合物，其与固相载体的摩尔比各自独立地均为1.5:1-8:1。
在本发明合成方法的一个优选实施方案中，水中含有表面活性剂，其选自阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂。在本发明合成方法的一个更优选实施方案中，使用非离子表面活性剂，在本发明合成方法的一个最优选实施方案中，使用聚氧乙烯醚类非离子表面活性剂，其与水的摩尔比为3:2000-30:2000。
在本发明合成方法的一个优选实施方案中，水中除含有表面活性剂外，还含有助溶剂。所述助溶剂优选为DMSO，其与水的摩尔比为25:2000-350:2000。
在本发明合成方法的一个更优选实施方案中，仅在偶联Esc-Cys(Trt)-OH和Mpa(Trt)-OH时，在水中加入助溶剂DMSO。
在本发明合成方法的一个优选实施方案中，固相载体选自Fmoc-Rink-PEG Amide树脂（例如购自天津南开和成科技有限公）、Fmoc-Rink–PEG-Amide AM树脂（例如购自美国SIGMA）、Fmoc-RinkAmide-PEGA树脂（例如购自德国Merck）。在本发明合成方法的一个优选实施方案中，使用Fmoc-Rink-PEG Amide树脂，固相载体的替代度为0.2～1.2mmol/g。
在本发明合成方法的一个优选实施方案中，步骤1)的静置时间为2-10分钟。
在本发明合成方法的一个优选实施方案中，步骤1)的偶联反应时间为1-8小时。
在本发明合成方法的一个优选实施方案中，步骤1)的脱除保护基Esc的步骤进行1-6次，每次反应1-6分钟。
在本发明合成方法的一个优选实施方案中，步骤2)的氧化使用选自如下的氧化剂进行：碘、双氧水。在本发明合成方法的一个更优选实施方案中，步骤2)的氧化使用碘进行，碘与固相载体的摩尔比为1:1-20:1。在本发明合成方法的一个最优选实施方案中，碘以与选自如下溶剂的混合物的形式提供：DMF、甲醇、二氯甲烷混合物，所述溶剂与固相载体的摩尔比为60:1-800:1。
在本发明合成方法的一个优选实施方案中，步骤3)的裂解使用选自如下的裂解液进行：TFA、苯甲硫醚、TIS或其两种或多种的混合物；或者TFA、苯甲硫醚、TIS或其两种或多种与水的混合物。在本发明合成方法的一个更优选实施方案中，裂解液使用TFA和/或TIS与水的混合物，其中TFA、TIS、水的体积比为TFA:TIS:水=90-95:0-5:0-5。应理解，所述体积比为试剂的纯度在95%-100%之间时的体积比，如试剂纯度不在所述纯度范围内，则可根据相应试剂的纯度变化其用量。
在本发明合成方法的一个优选实施方案中，还包括：
4)纯化：对得自步骤3)的去氨加压素进行纯化。
本发明的去氨加压素合成方法采用水中固相合成的方法且使用水溶性氨基保护基保护氨基酸的氨基，无需使用有机溶剂，不仅节约成本，而且对环境无害。
本发明的去氨加压素合成方法无需对肽序中的部分侧链官能团（如Arg、Asn、Gln、Tyr的侧链）进行保护，操作简单、后处理容易、成本低、环保、收率高，具有可观的经济实用价值，同时在多肽药物设计合成领域具有广泛的应用前景。
具体实施方式
本文使用如下缩略语：
除另有说明外，本发明的方法步骤在常温常压下进行。
除另有说明外，本发明提及的原料为本领域已知的常规试剂，均为市售可得的。
本发明提供一种去氨加压素的合成方法，所述合成方法包括：
1)制备去氨加压素线性肽肽树脂：首先将氨基酸单体PG-Gly-OH和偶联剂与水混合均匀，静置，所得混合物随后在脱除保护基的固相载体上反应，得到PG-Gly-固相载体，然后脱除PG，得到H-Gly-固相载体；重复上述步骤，氨基酸单体和Mpa依次偶联在H-Gly-固相载体上，偶联顺序为依次偶联PG-D-Arg-OH、PG-Pro-OH、PG-Cys(Trt)-OH、PG-Asn-OH、PG-Gln-OH、PG-Phe-OH、PG-Tyr-OH、Mpa，所述PG为水溶性氨基保护基；由此得到式(I)的去氨加压素线性肽肽树脂Mpa-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-D-Arg-Gly-固相载体(I)；
2)制备去氨加压素环肽肽树脂：氧化得自步骤1)的去氨加压素线性肽肽树脂，得到式(II)的去氨加压素环肽肽树脂
3)制备去氨加压素：裂解自步骤2)的去氨加压素环肽肽树脂，得到式(III)的去氨加压素
应理解，式(II)和式(III)的结构为示意性的，意指在氧化过程中Mpa与Cys成环。
步骤1)
氨基酸单体为本领域已知的氨基酸单体，可由市场上购得，例如购自北京慧搏安康科技发展有限公司，也可根据现有技术已知的方法制得。具体而言，本发明的氨基酸单体意指构成本发明的去氨加压素的氨基酸单体，具体为甘氨酸（GLy）、精氨酸（Arg）、脯氨酸（Pro）、半胱氨酸（Cys）、天冬酰胺（Asn）、谷氨酰胺（Gln）、苯丙氨酸（Phe）、酪氨酸（Tyr）。优选地，所述PG为水溶性氨基保护基，其包括例如Pms、Sps、Esc，优选例如Esc。氨基由水溶性氨基保护基保护的氨基酸为市售可得的，或可由本领域已知的方法制备。在本发明合成方法的一个实施方案中，使用Esc保护氨基酸单体的氨基，保护方法为：Esc-Osu与氨基裸露的氨基酸单体在有机溶液例如DMF中反应，从而分别得到纯度＞95%的氨基由Esc保护的氨基酸单体：Esc-Gly-OH、Esc-D-Arg-OH、Esc-Pro-OH、Esc-Cys(Trt)-OH、Esc-Asn-OH、Esc-Gln-OH、Esc-Phe-OH、Esc-Tyr-OH。
氨基酸与固相载体的摩尔比为1:1-20:1，优选1:1-15:1，更优选1:1-10:1。
偶联剂可为本领域已知的偶联剂，例如可为EDC·HCl、HONB、DIPEA、TBTU或其混合物，其用量可根据本领域的常用量确定。优选使用多种偶联剂，例如使用EDC·HCl、HONB和DIPEA，此情况下，EDC·HCl、HONB和DIPEA可同时加入或不同时加入，优选不同时加入，例如先加入EDC·HCl、HONB，再加入DIPEA。在使用EDC·HCl、HONB和DIPEA的情况下，其与固相载体的摩尔比各自独立地均为1.5:1-8:1，优选2:1-7:1，更优选2.2:1-6.4:1。
水的用量不作特别地限定，只要能够使加入其中的物质完全溶解即可。例如，水与固相载体的摩尔比可为10:1，优选8:1。
优选地，水中可含有表面活性剂，所述表面活性剂可为本领域已知的任何水溶性表面活性剂，例如阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂，优选非离子表面活性剂，更优选聚氧乙烯醚类非离子表面活性剂，例如购自陶氏化学的聚氧乙烯醚类非离子表面活性剂（TritonX），如Triton X-100、Triton X-102、Triton X-114、Triton X-405、TritonX-207、Triton X-705或其中的两种或多种的混合物，但不限于此。表面活性剂的量可根据所用表面活性剂的种类按照本领域的常规用量确定。在本发明合成方法的一个实施方案中，使用Triton X-100作为表面活性剂，其与水的摩尔比可为3:2000至30:2000，优选6:2000至24:2000，更优选9:2000至18:2000。
更优选地，水中除含有表面活性剂外，还可含有助溶剂，所述助溶剂可以是例如DMSO。在本发明的一个实施方案中，助溶剂使用DMSO，
其与水的摩尔比可为25:2000至350:2000，优选30:2000至300:2000，更优选40:2000至275:2000。在本发明合成方法的一个优选实施方案中，仅在偶联Esc-Cys(Trt)-OH和Mpa(Trt)-OH时，在水中加入助溶剂DMSO。
固相载体为本领域已知的固相合成用固相载体，例如，购自天津南开和成科技有限公司的Fmoc-Rink-PEG Amide树脂、购自美国SIGMA的Fmoc-Rink–PEG-Amide AM树脂、购自德国Merck的Fmoc-RinkAmide-PEGA树脂。在本发明合成方法的一个实施方案中，使用Fmoc-Rink-PEG Amide树脂作为固相载体，替代度为0.2～1.2mmol/g，优选0.4～0.8mmol/g，更优选0.5～0.7mmol/g。固相载体的保护基的脱除方法为本领域已知的，具体脱除方法取决于保护基的种类。例如，对于Fmoc-Rink Amide-PEGA树脂，采用如下方法脱去保护基Fmoc：a)将Fmoc-Rink Amide-PEGA树脂置于固相反应柱中，在固相反应柱中加入水，用氮气鼓泡溶胀30-100分钟、优选40-90分钟、更优选50-80分钟，所述水中优选含有表面活性剂；b)在步骤a)的固相反应柱中加入DBLK，随后用水洗涤所述固相反应柱1-10次、优选2-8次、更优选3-6次，得到脱除保护基的固相载体H-Rink Amide-PEGA树脂。所述表面活性剂的定义如上。
氨基酸的保护基的脱除方法取决于保护基的种类。不同种类的氨基酸保护基的脱除方法为本领域已知的。在本发明合成方法的一个实施方案中，使用Esc保护氨基酸单体的氨基，此情况下，例如对于Esc-Gly-固相载体，其保护基Esc的脱除方法为：在Esc-Gly-固相载体加入0.001-0.05M、优选0.015-0.04M、更优选0.02-0.03M的NaOH的无水乙醇/水（体积比为1:1）溶液，得到H-Gly-固相载体。
静置时间可为2-10分钟、优选3-8分钟、更优选4-6分钟。
偶联反应时间可为1-8小时、优选1.5-6小时，更优选1.5-4小时。
优选地，所述脱除保护基Esc的步骤进行1-6次、优选2-5次，每次反应1-6分钟、优选2-5分钟。
步骤2)
所述氧化使用氧化剂进行，所述氧化剂为本领域已知的固相制备环肽肽树脂所用的氧化剂，例如碘、双氧水。氧化方法同样为本领域已知的由线性肽肽树脂氧化为环肽肽树脂的方法，具体方法取决于所选用的氧化剂。例如，在使用碘作为氧化剂的情况下，氧化方法如下：在得自步骤1)的式(I)线性肽肽树脂中加入碘，碘与固相载体的摩尔比为1:1-20:1，优选2:1-15:1，更优选2:1-10:1。碘优选以混合物的形式提供，例如可以碘与DMF的混合物、碘与甲醇的混合物、碘与二氯甲烷的混合物提供，优选以碘的DMF溶液提供，此时，DMF与固相载体的摩尔比可为60:1-800:1，优选65:1-500:1，更优选70:1-200:1。
氧化后优选进行例如洗涤、收缩、和抽干的步骤。所述洗涤、收缩、和抽干的步骤为本领域已知的常规方法。洗涤例如可使用DMF进行，洗涤次数不作特别限定，可以是例如1-20次，优选2-15次，更优选3-10次。收缩可例如使用甲醇进行，收缩数不作特别限定，可以是例如1-20次，优选2-15次，更优选3-10次。
步骤3)
裂解使用裂解液进行，所述裂解液为本领域已知的环肽肽树脂裂解为粗肽的常规裂解液，例如TFA、苯甲硫醚、TIS或其两种或多种的混合物，也可以是TFA、苯甲硫醚、TIS或其两种或多种与水的混合物。在本发明合成方法的一个实施方案中，裂解液使用TFA和/或TIS与水的混合物，其中TFA、TIS、水的体积比为TFA:TIS:水=90-95:0-5:0-5。裂解方法为例如：得自步骤2)的式(II)的成环的去氨加压素环肽肽树脂与裂解液反应使其反应0.5-10小时、优选1-8小时、优选1.5-6小时。裂解优选在不同于上述固相反应柱的其他容器中进行，例如可在烧瓶中进行。
裂解后优选进行例如滤出并洗涤树脂步骤。所述滤出和洗涤树脂的步骤为本领域已知的常规方法。洗涤可例如使用TFA进行，洗涤次数不作特别限定，可以是例如1-20次，优选2-15次，更优选3-10次。此后，还优选包括：将滤液加入冷冻的无水乙醚（5℃以下）中。
本发明的合成方法优选包括：
4)纯化：对得自步骤3)的去氨加压素进行纯化。
纯化方法为本领域已知的粗肽纯化为精肽的方法，例如可使用购自Waters公司的Waters2454RP-HPLC系统纯化，并且优选随后浓缩，在-20至-5℃下、优选-15至-8℃下冻干。
实施例
原料和设备
Fmoc-Rink-PEG Amide树脂，购自天津南开和成科技有限公司。
DMF，购自日本三菱，纯度为99.99%。
DMSO，购自SIGMA，纯度为99.7%。
六氢吡啶，购自SIGMA，纯度为99.5%。。
Triton X-100，购自陶氏化学，纯度为99%。
EDC·HCl，购自北京华迈科生物技术有限责任公司，纯度为99%。
HONB，购自SIGMA，纯度为97%。
DIPEA，购自SIGMA，纯度为99.5%。
氨基酸单体，购自北京慧搏安康科技发展有限公司
Mpa(Trt)-OH，购自吉尔生化（上海）有限公司。
HPLC，购自Waters的Waters2454RP-HPLC系统。
旋转蒸发仪，购自上海爱郎仪器有限公司。
制备氨基由Esc保护的氨基酸单体
Esc-Osu（60mmol，1.2eq）与氨基裸露的氨基酸单体（50mmol，1eq）分别在DMF中（1000mmol，20eq）反应2h，结晶后分别得到纯度为98%的氨基由Esc保护的氨基酸单体：Esc-Gly-OH、Esc-D-Arg-OH、Esc-Pro-OH、Esc-Cys(Trt)-OH、Esc-Asn-OH、Esc-Gln-OH、Esc-Phe-OH、Esc-Tyr-OH。
实施例1
制备H-Rink-PEG Amide树脂
将100g（50mmol，1eq）替代度为0.5mmol/g的Fmoc-Rink-PEGAmide树脂置于固相反应柱（1000ml）中，加入800ml Triton X-100与水的混合物（摩尔比Triton X-100:水=12:2000），氮气鼓泡溶胀60分钟；然后，在固相反应柱中加入DBLK，以脱除Fmoc，接着在上述固相反应柱中加入800ml Triton X-100与水的混合物（摩尔比同上），重复4次，得到H-Rink-PEG Amide树脂。
制备去氨加压素的线性肽树脂
在500ml Triton X-100与水的混合物（摩尔比Triton X-100:水=12:2000）中加入35.9g（150mmol，3eq）Esc-Gly-OH、32.3g（180mmol，3.6eq）HONB、32.4g（180mmol，3.6eq）EDC·HCl，混合均匀，随后于0℃的冰水浴下加入23.3g（180mmol，3.6eq）DIPEA，混合均匀后静置5分钟，将所得混合物加入上述固相反应柱中，反应2小时，得到Esc-Gly-Rink-PEG Amide树脂；然后，在所述固相反应柱中加入500ml0.025M NaOH的无水乙醇/水（体积比1:1）溶液，以脱除Esc保护基，得到H-Gly-Rink-PEG Amide树脂。
重复上述步骤，Esc-D-Arg-OH、Esc-Pro-OH、Esc-Cys(Trt)-OH、Esc-Asn-OH、Esc-Gln-OH、Esc-Phe-OH、Esc-Tyr-OH、Mpa(Trt)-OH依次反应，得到去氨加压素的线性肽树脂：
Mpa-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-D-Arg-Gly-Rink-PEG Amide树脂。
制备去氨加压素环肽肽树脂
在上述固相反应柱中加入碘101.6g（400mmol，8eq）与500mlDMF（6414mmol，128.3eq）的混合物，反应1h，然后加入800mlDMF洗涤，重复3次，随后加入800ml甲醇收缩，重复3次，抽干后得到去氨加压素环肽肽树脂197g。
制备去氨加压素
将制得的上述去氨加压素环肽肽树脂全部加入至2000ml单口烧瓶中，然后在所述单口烧瓶中加入2000ml的TFA:TIS:H2O=95:0:5（体积比）的裂解液，反应3小时，滤除树脂，用TFA洗涤树脂3次（50ml/次），合并滤液并将其加入至20000ml冷冻的无水乙醚（0℃）中，析出白色固体，将所述白色固体离心、用无水乙醚洗涤3次（10000ml/次）、真空干燥，得到呈白色固体的去氨加压素48.93g，收率91.5%，HPLC纯度81.54%。
纯化
将上述得到的去氨加压素的溶于20000ml水中，通过Waters2454RP-HPLC系统（波长220nm；色谱柱为100×500mm反相C18柱；流动相：A相为0.3体积%TFA/99.7体积%乙腈，B相为100体积%乙腈；梯度：B%：24%～54%，流速：6毫升/分钟）纯化，收集目的峰馏分，经旋转蒸发仪器浓缩后，于-10℃条件下冻干得到去氨加压素精肽34.28g，收率64.13%，HPLC纯度98.57%。
实施例2
制备H-Rink-PEG Amide树脂
与实施例1中的方法相同，不同之处在于使用83.3g（50mmol，1eq）替代度为0.6mmol/g的Fmoc-Rink-PEG Amide树脂。
制备去氨加压素的线性肽树脂
与实施例1中的方法相同，不同之处在于由Esc保护的氨基酸单体和Mpa(Trt)-OH的用量各自均为23.9g（100mmol，2eq）；HONB、EDC·HCl、DIPEA的用量分别为21.5g（120mmol，2.4eq）、21.6g（120mmol）、15.5g（120mmol，2.4eq）。
制备去氨加压素环肽肽树脂
在得自上一步骤的固相反应柱中加入碘76.2g（300mmol，6eq）与400mlDMF（5188mmol，103.8eq）的混合物，反应2h，然后加入800mlDMF洗涤，重复3次，随后加入800ml甲醇收缩，重复3次，抽干后得到去氨加压素环肽肽树脂175g。
制备去氨加压素
将制得的去氨加压素环肽肽树脂全部加入至2000ml单口烧瓶中，然后在所述单口烧瓶中加入1750ml的TFA:TIS:H2O=95:5:5（体积比）的裂解液，反应2.5小时，滤除树脂，用TFA洗涤树脂3次（50ml/次），合并滤液并将其加入至15000ml冷冻的无水乙醚（0℃）中，析出白色固体，将所述白色固体离心、用无水乙醚洗涤3次（10000ml/次）、真空干燥，得到呈白色固体的去氨加压素49.03g，收率91.7%，HPLC纯度78.45%。
纯化
与实施例1中的方法相同。得到去氨加压素精肽33.62g，收率62.90%，HPLC纯度99.47%。
实施例3
制备H-Rink-PEG Amide树脂
与实施例1中的方法相同，不同之处在于使用71.4g（50mmol，1eq）替代度为0.7mmol/g的Fmoc-Rink-PEG Amide树脂。
制备去氨加压素的线性肽树脂
与实施例1中的方法相同，不同之处在于由Esc保护的氨基酸单体和Mpa(Trt)-OH的用量各自均为59.8g（250mmol，5eq）；HONB、EDC·HCl、DIPEA的用量分别为53.8g（300mmol，6eq）、54.0g（300mmol，6eq）、38.8g（300mmol，6eq）。
制备去氨加压素环肽肽树脂
在得自上一步骤的固相反应柱中加入碘50.8g（200mmol，4eq）与300mlDMF（3891mmol，77.8eq）的混合物，反应3h，然后加入800mlDMF洗涤，重复3次，随后加入800ml甲醇收缩，重复3次，抽干后得到去氨加压素环肽肽树脂158g。
制备去氨加压素
将制得的去氨加压素环肽肽树脂全部加入至2000ml单口烧瓶中，然后在所述单口烧瓶中加入1600ml的TFA:TIS:H2O=94:3:3（体积比）的裂解液，反应2小时，滤除树脂，用TFA洗涤树脂3次（50ml/次），合并滤液并将其加入至15000ml冷冻无水乙醚（0℃）中，析出白色固体，将所述白色固体离心、用无水乙醚洗涤3次（10000ml/次）、真空干燥，得到呈白色固体的去氨加压素46.55g，收率87.1%，HPLC纯度80.25%。
纯化
与实施例1中的方法相同。得到去氨加压素精肽32.56g，收率60.92%，HPLC纯度98.94%。
实施例4
制备H-Rink-PEG Amide树脂
与实施例1的方法相同。
制备去氨加压素的线性肽树脂
阶段I：制备H-Pro-D-Arg-Gly-Rink-PEG Amide树脂
在500ml Triton X-100与水的混合物（摩尔比Triton X-100:水=12:2000）中加入35.9g（150mmol，3eq）Esc-Gly-OH、32.3g（180mmol，3.6eq）HONB、32.4g（180mmol，3.6eq）EDC·HCl，混合均匀，随后于0℃的冰水浴下加入23.3g（180mmol，3.6eq）DIPEA，混合均匀后静置5分钟，将所得混合物加入上述固相反应柱中，反应2小时，得到Esc-Gly-Rink Amide-PEGA树脂；然后，在所述固相反应柱中加入500ml0.025M NaOH的无水乙醇/水（体积比1:1）溶液，以脱除Esc保护基，得到H-Gly-Rink-PEG Amide树脂。
重复上述步骤，Esc-D-Arg-OH、Esc-Pro-OH依次反应，得到H-Pro-D-Arg-Gly-Rink-PEG Amide树脂。
阶段II：制备H-Pro-Cys(Trt)-Pro-D-Arg-Gly-Rink-PEG Amide树脂
在500mlDMSO、Triton X-100与水的混合物（摩尔比DMSO：TritonX-100:水=50:12:2000）中加入79.1g（150mmol，3eq）Esc-Cys(Trt)-OH、32.3g（180mmol，3.6eq）HOBN，32.4g（180mmol，3.6eq）EDC·HCl，混合均匀，随后于0℃的冰水浴下加入23.3g（180mmol，3.6eq）DIPEA，混合均匀后静置5分钟，将所得混合物加入上述固相反应柱中，反应2小时，得到Esc-Cys(Trt)-D-Arg-Gly-Rink-PEG Amide树脂；然后，在所述固相反应柱中加入500ml0.025M NaOH的无水乙醇/水（体积比1:1）溶液，以脱除Esc保护基，得到H-Cys(Trt)-Pro-D-Arg-Gly-Rink-PEGAmide树脂。
阶段III：制备去氨加压素线性肽肽树脂
按照阶段I的方法，Esc-Asn-OH、Esc-Gln-OH、Esc-Phe-OH、Esc-Tyr-OH依次反应；然后按照阶段II的方法，Mpa(Trt)-OH反应，得到去氨加压素线性肽肽树脂：
Mpa-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-D-Arg-Gly-Rink-PEG Amide树脂。
制备去氨加压素环肽肽树脂
在上述固相反应柱中加入碘101.6g（400mmol，8eq）与500mlDMF（6414mmol，128.3eq）的混合物，反应1h，然后加入800mlDMF洗涤，重复3次，随后加入800ml甲醇收缩，重复3次，抽干后得到去氨加压素环肽肽树脂193g。
制备去氨加压素
将制得的去氨加压素环肽肽树脂全部加入至2000ml单口烧瓶中，然后在所述单口烧瓶中加入1950ml的TFA:TIS:H2O=95:0:5（体积比）的裂解液，反应3小时，滤除树脂，用TFA洗涤树脂3次（50ml/次），合并滤液并将其加入至20000ml冷冻的无水乙醚（0℃）中，析出白色固体，将所述白色固体离心、用无水乙醚洗涤3次（10000ml/次）、真空干燥，得到呈白色固体的去氨加压素52.73g，收率98.6%，HPLC纯度88.74%。
纯化
与实施例1的方法相同。得到去氨加压素精肽38.71g，收率72.36%，HPLC纯度98.84%。
实施例5
制备H-Rink-PEG Amide树脂
与实施例2的方法相同。
制备去氨加压素的线性肽树脂
阶段I：制备H-Pro-D-Arg-Gly-Rink-PEG Amide树脂
在500ml Triton X-100与水的混合物（摩尔比Triton X-100:水=12:2000）中加入23.9g（100mmol，2eq）Esc-Gly-OH、21.5g（120mmol，2.4eq）HONB、21.6g（120mmol，2.4eq）EDC·HCl，混合均匀，随后于0℃的冰水浴下加入15.5g（120mmol，2.4eq）DIPEA，混合均匀后静置5分钟，将所得混合物加入上述固相反应柱中，反应2小时，得到Esc-Gly-Rink-PEG Amide树脂；然后，在所述固相反应柱中加入500ml0.025M NaOH的无水乙醇/水（体积比1:1）溶液，以脱除Esc保护基，得到H-Gly-Rink-PEG Amide树脂。
重复上述步骤，Esc-D-Arg-OH、Esc-Pro-OH依次反应，得到H-Pro-D-Arg-Gly-Rink-PEG Amide树脂。
阶段II：制备H-Pro-Cys(Trt)-Pro-D-Arg-Gly-Rink-PEG Amide树脂
在500mlDMSO、Triton X-100与水的混合物（摩尔比DMSO:Triton X-100:水=150:12:2000）中加入52.7g（100mmol，2eq）Esc-Cys(Trt)-OH、21.5g（120mmol，2.4eq）HOBN，21.6g（120mmol，2.4eq）EDC·HCl，混合均匀，随后于0℃的冰水浴下加入15.5g（120mmol，2.4eq）DIPEA，混合均匀后静置5分钟，将所得混合物加入上述固相反应柱中，反应4小时，得到Esc-Cys(Trt)-D-Arg-Gly-Rink-PEG Amide树脂；然后，在所述固相反应柱中加入500ml0.025M NaOH的无水乙醇/水（体积比1:1）溶液，以脱除Esc保护基，得到H-Cys(Trt)-Pro-D-Arg-Gly-Rink-PEG Amide树脂。
阶段III：制备去氨加压素线性肽肽树脂
按照阶段I的方法，Esc-Asn-OH、Esc-Gln-OH、Esc-Phe-OH、Esc-Tyr-OH依次反应；然后按照阶段II的方法，Mpa(Trt)-OH反应，得到去氨加压素线性肽肽树脂：
Mpa-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-D-Arg-Gly-Rink-PEG Amide树脂。
制备去氨加压素环肽肽树脂
在上述固相反应柱中加入碘76.2g（300mmol，6eq）与400mlDMF（5188mmol，103.8eq）的混合物，反应2h，然后加入800mlDMF洗涤，重复3次，随后加入800ml甲醇收缩，重复3次，抽干后得到去氨加压素环肽肽树脂178g。
制备去氨加压素
将制得的上述去氨加压素环肽肽树脂全部加入至2000ml单口烧瓶中，然后在所述单口烧瓶中加入1800ml的TFA:TIS:H2O=95:5:5（体积比）的裂解液，反应2.5小时，滤除树脂，用TFA洗涤树脂3次（50ml/次），合并滤液并将其加入至15000ml冷冻的无水乙醚（0℃）中，析出白色固体，将所述白色固体离心、用无水乙醚洗涤3次（10000ml/次）、真空干燥，得到呈白色固体的去氨加压素51.26g，收率95.8%，HPLC纯度84.26%。
纯化
与实施例1的方法相同。得到去氨加压素精肽36.53g，收率68.2%，HPLC纯度99.01%。
实施例6
制备H-Rink-PEG Amide树脂
与实施例3中方法相同。
制备去氨加压素的线性肽树脂
阶段I：制备H-Pro-D-Arg-Gly-Rink-PEG Amide树脂
在500ml Triton X与水的混合物（摩尔比Triton X-100:水=12:2000）中加入59.8g（250mmol，5eq）Esc-Gly-OH、53.8g（300mmol，6eq）HONB、54.0g（300mmol，6eq）EDC·HCl，混合均匀，随后于0℃的冰水浴下加入38.8g（300mmol，6eq）DIPEA，混合均匀后静置5分钟，将所得混合物加入上述固相反应柱中，反应1.5小时，得到Esc-Gly-Rink-PEG Amide树脂；然后，在所述固相反应柱中加入500ml0.025M NaOH的无水乙醇/水（体积比1:1）溶液，以脱除Esc保护基，得到H-Gly-Rink-PEG Amide树脂。
重复上述步骤，Esc-D-Arg-OH、Esc-Pro-OH依次反应，得到H-Pro-D-Arg-Gly-Rink-PEG Amide树脂。
阶段II：制备H-Cys(Trt)-Pro-D-Arg-Gly-Rink-PEG Amide树脂
在500mlDMSO、Triton X与水的混合物（摩尔比DMSO:Triton X-100:水=250:12:2000）中加入131.8g（250mmol，5eq）Esc-Cys(Trt)-OH、53.8g（300mmol，6eq））HOBN，54g（300mmol，6eq））EDC·HCl，混合均匀，随后于0℃的冰水浴下加入38.8g（300mmol，6eq））DIPEA，混合均匀后静置5分钟，将所得混合物加入上述固相反应柱中，反应1.5小时，得到Esc-Cys(Trt)-D-Arg-Gly-Rink-PEG Amide树脂；然后，在所述固相反应柱中加入500ml0.025M NaOH的无水乙醇/水（体积比1:1）溶液，以脱除Esc保护基，得到H-Cys(Trt)-Pro-D-Arg-Gly-Rink-PEG Amide树脂。
阶段III：制备去氨加压素线性肽肽树脂
按照阶段I的方法，Esc-Asn-OH、Esc-Gln-OH、Esc-Phe-OH、Esc-Tyr-OH依次反应；然后按照阶段II的方法，Mpa(Trt)-OH反应，得到去氨加压素线性肽肽树脂：
Mpa-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-D-Arg-Gly-Rink-PEG Amide树脂。
制备去氨加压素环肽肽树脂
在上述固相反应柱中加入碘50.8g（200mmol，4eq）与300mlDMF（3891mmol，77.8eq）的混合物，反应3h，然后加入800mlDMF洗涤，重复3次，随后加入800ml甲醇收缩，重复3次，抽干后得到去氨加压素环肽肽树脂159g。
制备去氨加压素
将上述得到的去氨加压素环肽肽树脂全部加入至2000ml单口烧瓶中，然后在所述单口烧瓶中加入1600ml的TFA:TIS:H2O=95:0:5（体积比）的裂解液，反应3小时，滤除树脂，用TFA洗涤树脂3次（50ml/次），合并滤液并将其加入至20000ml冷冻的无水乙醚（0℃）中，析出白色固体，将所述白色固体离心、用无水乙醚洗涤3次（10000ml/次）、真空干燥，得到呈白色固体的去氨加压素50.33g，收率94.1%，HPLC纯度86.57%。
纯化
与实施例1的方法相同。得到去氨加压素精肽37.09g，收率69.3%，HPLC纯度98.64%。

Claims (9)

1.一种去氨加压素的合成方法，所述合成方法包括：
1)制备去氨加压素线性肽肽树脂：首先将氨基酸单体PG-Gly-OH和偶联剂与水混合均匀，静置，所得混合物随后在脱除保护基的固相载体上反应，得到PG-Gly-固相载体，然后脱除PG，得到H-Gly-固相载体；重复上述步骤，氨基酸单体和Mpa依次偶联在H-Gly-固相载体上，偶联顺序为依次偶联PG-D-Arg-OH、PG-Pro-OH、PG-Cys(Trt)-OH、PG-Asn-OH、PG-Gln-OH、PG-Phe-OH、PG-Tyr-OH、Mpa，所述PG为水溶性氨基保护基；由此得到式(I)的去氨加压素线性肽肽树脂Mpa-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-D-Arg-Gly-固相载体(I)；
2)制备去氨加压素环肽肽树脂：氧化得自步骤1)的去氨加压素线性肽肽树脂，得到式(II)的去氨加压素环肽肽树脂
3)制备去氨加压素：裂解自步骤2)的去氨加压素环肽肽树脂，得到式(III)的去氨加压素
步骤1)中，优选地，所述静置的时间为2-10分钟，同样优选地，所述偶联反应的时间为1-8小时，同样优选地，所述脱除保护基Esc的步骤进行1-6次，每次反应1-6分钟，
优选地，所述合成方法还包括：
4)纯化：对得自步骤3)的去氨加压素进行纯化。
2.权利要求1所述的合成方法，其中，所述氨基酸单体的氨基由水溶性氨基保护基保护，所述水溶性氨基保护基包括Pms、Sps、Esc，所述水溶性氨基保护基优选Esc。
3.权利要求1或2所述的合成方法，其中，氨基酸与固相载体的摩尔比为1:1-20:1。
4.权利要求1-3之一所述的合成方法，其中，所述偶联剂选自EDC·HCl、HONB、DIPEA、TBTU或其混合物，优选地，所述偶联剂为EDC·HCl、HONB和DIPEA的混合物，其与固相载体的摩尔比各自独立地均为1.5:1-8:1。
5.权利要求1-4之一所述的合成方法，其中，步骤(a)所述的水中含有表面活性剂，其选自阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂；优选使用非离子表面活性剂，更优选使用聚氧乙烯醚类非离子表面活性剂，其与水的摩尔比为3:2000至30:2000；优选地，水中除含有表面活性剂外，还含有助溶剂，所述助溶剂优选为DMSO，其与水的摩尔比为25:2000至350:2000。
6.权利要求1-5之一所述的合成方法，其中，仅在偶联Esc-Cys(Trt)-OH和Mpa(Trt)-OH时，在水中加入助溶剂，所述助溶剂优选为DMSO，其与水的摩尔比为25:2000至350:2000。
7.权利要求1-6之一所述的合成方法，其中，所述固相载体选自Fmoc-Rink-PEG Amide树脂、Fmoc-Rink–PEG-Amide AM树脂、Fmoc-Rink Amide-PEGA树脂；优选地，固相载体的替代度为0.2～1.2mmol/g。
8.权利要求1-7之一所述的合成方法，其中，步骤2)的氧化使用选自如下的氧化剂进行：碘、双氧水，步骤2)的氧化优选使用碘进行，碘与固相载体的摩尔比为1:1-20:1；更优选地，碘以与选自如下溶剂的混合物的形式提供：DMF、甲醇、二氯甲烷混合物，所述溶剂与固相载体的摩尔比为60:1-800:1。
9.权利要求1-8之一所述的合成方法，其中，步骤3)的裂解使用选自如下的裂解液进行：TFA、苯甲硫醚、TIS或其两种或多种的混合物；或者TFA、苯甲硫醚、TIS或其两种或多种与水的混合物，裂解液优选使用TFA和/或TIS与水的混合物，其中TFA、TIS、水的体积比为TFA:TIS:水=90-95:0-5:0-5。
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