CN102206266A

CN102206266A - 普兰林肽的制备方法

Info

Publication number: CN102206266A
Application number: CN2010101453918A
Authority: CN
Inventors: 东圆珍; 张喜全; 冯军; 朱裕辉; 路建光
Original assignee: Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry; Jiangsu Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Shanghai Faith Biotechnology Co Ltd; Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry
Priority date: 2010-03-31
Filing date: 2010-03-31
Publication date: 2011-10-05
Anticipated expiration: 2030-03-31
Also published as: CN102206266B

Abstract

本发明提供一种普兰林肽的制备方法，其特征是用碘对树脂肽进行氧化，形成分子内的二硫键。

Description

普兰林肽的制备方法

技术领域

本发明涉及多肽的制备方法，具体涉及普兰林肽的制备方法，特别是以固相合成法合成普兰林肽的方法，还包括二硫键的形成工艺和纯化。

背景技术

胰淀素是由胰腺β细胞分泌的内源性激素，参与餐后对血糖的控制。研究表明，人类胰淀素第22-27、23-27及20-29位氨基酸序列均能形成β-折叠，使胰淀素聚集成纤丝而沉积，进而产生胰岛β细胞毒性作用，引发或加重糖尿病。普兰林肽(Pramlintide)是一种人工合成的胰淀素类似物，它将胰淀素25位的丙氨酸、28位和29位的丝氨酸用脯氨酸代替，充分保留了胰淀素的生理作用，改变了人胰淀素不可溶及易于聚集的物理性质，避免了淀粉样沉积的形成，且不会诱导B细胞凋亡。普兰林肽最早由美国Amylin公司研制，2005年3月获得FDA批准，适用于使用胰岛素但血糖控制不佳患者的辅助治疗，于餐前即刻由腹部或大腿部皮下注射。

普兰林肽氨基酸序列：

分子式：C₁₇₁H₂₆₇N₅₁O₅₃S₂

分子量：3949.37

普兰林肽结构中含有一对二硫键，是由2位和7位的半胱氨酸的巯基连接而成，其对活性有着重要的影响，同时也是合成中的难点，影响产物的产率以及后续的分离纯化步骤。在合成时一般需考虑以下因素：(1)半胱氨酸残基侧链巯基保护基的选择；(2)氧化体系以及氧化方法的选择。美国专利US5686411中有合成普兰林肽及其类似物的报道，该专利中使用的是Boc(叔丁氧羰)法合成，然后以三氟乙酸铊除去Cys的保护基团Acm(乙氨甲基)，同时氧化Cys的巯基形成二硫键。该专利中所使用的环化剂三氟乙酸铊毒性较大，应用受到局限。CN1837232中公开了奥曲肽中二硫键的形成方法，其中所使用的是空气氧化法；也有文献报道使用二甲基亚砜(DMSO)氧化法。但是上述两种方法均有不足之处：空气氧化法耗时，一般需要48小时，氧化效率比较低，且氧化反应需在肽浓度极低(0.2mg/ml)的条件下进行，这使得反应体积增大，后处理不便；而DMSO氧化法虽然提高了氧化效率，但是仍存在反应体积大的问题，所以有必要选择简单高效的氧化方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种普兰林肽的制备方法，其特征是用碘对树脂肽进行氧化，形成分子内的二硫键。

本发明的制备方法，具体步骤如下：

(1)制备树脂肽；

(2)向树脂肽中加入碘溶液，进行氧化；

(3)用裂解试剂裂解，得到普兰林肽。

本发明的制备方法，优选的步骤如下：

(1)制备树脂肽；

(2)向得到的树脂肽中加入碘溶液，在4～37℃下反应1～10小时，进行氧化，其中反应体系中树脂肽浓度为1-10mmol/L，碘浓度为树脂肽浓度的1-10倍；

(3)用裂解试剂裂解，得到普兰林肽。

上述制备方法中：

其中，本发明所称的树脂肽是指在氨基型树脂上连接有如下氨基酸序列的肽链，其中肽链的C端与氨基型树脂键合：

Lys-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr-Cys-Ala-Thr-Gln-Arg-Leu-Ala-Asn-Phe-Leu-Val-His-Ser-Ser-Asn-Asn-Phe-Gly-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Asn-Thr-Tyr(C端)

树脂肽的合成方式采用C端至N端的组装顺序，可采用Fmoc(9-芴亚甲氧羰)法、Boc(叔丁氧羰)法、Moz(对甲氧基苄氧羰)法，优选Fmoc法。

用于合成树脂肽的树脂为氨基型树脂，包括Knorr Resin、BHA Resin、MBHA Resin，优选MBHA Resin。

偶联反应中，使用的氨基酸需对活性侧链进行保护。对于Fmoc法而言，其中Fmoc-Cys-OH侧链巯基保护基团为乙氨甲基(Acm)或三苯甲基(Trt)，优选三苯甲基(Trt)；Fmoc-Tyr-OH、Fmoc-Thr-OH、Fmoc-Ser-OH或其它羟基基团可以使用叔丁基(tBu)、苯甲基(Bzl)进行保护，优选叔丁基(tBu)进行保护；Fmoc-Asn-OH、Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Lys-OH或其它氨基基团可以使用三苯甲基(Trt)、叔丁氧羰(Boc)、9-芴亚甲氧羰(Fmoc)保护，优选三苯甲基(Trt)进行保护；Fmoc-Arg-OH侧链胍基可以使用叔丁氧羰(Boc)、N′-[(2，3-二氢-2，2，4，6，7-五甲基苯并呋喃-5-基)磺酰基](pbf)保护，优选pbf；Fmoc-His-OH侧链咪唑基可以使用三苯甲基(Trt)、9-芴亚甲氧羰(Fmoc)保护，优选三苯甲基(Trt)。对于Boc法而言，其中Fmoc-Cys-OH侧链巯基保护基团为乙氨甲基(Acm)或三苯甲基(Trt)；Fmoc-Tyr-OH、Fmoc-Thr-OH、Fmoc-Ser-OH或其它羟基基团可以使用叔丁基(tBu)、苯甲基(Bzl)进行保护，优选叔丁基(tBu)进行保护；Fmoc-Asn-OH、Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Lys-OH或者其它氨基基团可以使用三苯甲基(Trt)、夹氧杂蒽基(Xan)保护，优选三苯甲基(Trt)进行保护；Fmoc-Arg-OH侧链胍基可以使用苄氧羰基(Z)、N′-[(2，3-二氢-2，2，4，6，7-五甲基苯并呋喃-5-基)磺酰基](pbf)保护，优选pbf；Fmoc-His-OH侧链咪唑基可以使用三苯甲基(Trt)、9-芴亚甲氧羰(Bom)保护，优选三苯甲基(Trt)。

偶联反应的缩合剂可以是碳二亚胺型、苯并三唑鎓盐型、吡啶并三唑鎓盐型或磷酸酯型，优选碳二亚胺型，更优选二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基脲(DIC)或N-二甲氨基丙基-N-乙基碳二亚胺(EDC)，最优选采用DCC、DIC或EDC与N-羟基化合物添加剂的复合缩合剂。其中N-羟基化合物添加剂是HOSu(N-羟基丁二酰亚胺)、HONb(N-羟基5-降冰片烯-2，3-二羟基亚胺)、HOBt(1-羟基苯并三氮唑)或HOAt(1-羟基-7偶氮苯并三氮唑)。

在上述树脂肽的氧化步骤中，反应体系中树脂肽浓度优选为1～5mmol/L，更优选为1～3mmol/L。

其中，反应体系中碘浓度优选为树脂肽浓度的3～10倍，更优选为6～10倍。

其中，配制碘溶液的溶剂为甲醇、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、乙醇、二氯甲烷(DCM)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)中的一种或一种以上的混合溶剂，优选甲醇、N，N-二甲基甲酰胺，更优选甲醇。

其中，反应温度优选为15～25℃。

其中，反应时间优选为3～4小时。

在上述的裂解步骤中，裂解试剂可以使用：TFA(三氟乙酸)/DCM(二氯甲烷)＝85/15、TFA(三氟乙酸)/EDT(乙二硫醇)/水＝95/3/2、TFA/茴香硫醚/EDT/苯酚/水＝85/5/5/3/2或TFA/茴香硫醚/EDT/苯酚/水/TIS＝82/3/5/5/4/1(以上均为体积比)。其中优选TFA(三氟乙酸)/EDT(乙二硫醇)/水＝95/3/2、TFA/茴香硫醚/EDT/苯酚/水/TIS＝82/3/5/5/4/1，更优选TFA/茴香硫醚/EDT/苯酚/水/TIS＝82/3/5/5/4/1(以上均为体积比)。

本发明提供的普兰林肽的制备方法，氧化率高，在90％以上，更优选96％以上。

本发明提供的制备方法还可以进一步包括纯化过程，所述的纯化过程可以使用本领域所公知的反相层析进行。

本发明提供的普兰林肽的制备方法，克服了现有技术的不足，简单高效，氧化效率、氧化率高。另外，反应中树脂肽浓度不会过低，克服了现有技术中树脂肽浓度极低，造成反应体积大、后处理不便的问题，且副反应少，易于后续的分离纯化，适合工业化生产。

附图说明

图1：普兰林肽的MALDI-TOF-MS分析图谱。

具体实施方式

下面以具体实施例来详细说明本发明，但本发明并不局限于这些实施例。

实施例1：树脂肽的制备

本发明中使用【 Isolation and identification of cyclic imide and deamidationproducts in heat stressed pramlintide in

(1)树脂的溶胀

称取Amide Rink MBHA树脂(购于上海吉尔生化有限公司)(0.41mmol/g)0.7396g置于多肽合成仪的反应器中，加入10mlDMF混合1小时，使树脂充分溶胀。

(2)脱除Fmoc保护基

加入25％PIP(哌啶)的DMF溶液10ml，混合30min后，用DMF洗涤，洗涤结束后即可进行偶联反应。

(3)偶联反应

混合反应器中加入Fmoc-Tyr(tBU)-OH 0.5478g，0.4mol/L HOBt(DMF)溶液3ml，0.4mol/L DIC(DMF)溶液3ml和DMF 3ml进行反应，反应温度为室温，以茚三酮反应检测反应进程，确定氨基酸偶联时间。

(4)肽链的延长

偶联反应结束后，用10ml DMF洗涤，加入25％PIP的DMF溶液10ml，进行脱保护30min，反应结束后用DMF洗涤。洗涤好的树脂即可按照上述方法继续进行下一个氨基酸的偶联反应，如此循环，直至合成第37个氨基酸偶联完成。其中酪氨酸(Tyr)侧链羟基选用OtBU保护；苏氨酸(Thr)侧链羟基选用叔丁基(tBU)保护；天冬酰胺(Asn)侧链氨基选用三苯甲基(Trt)保护；丝氨酸(Ser)侧链羟基选用叔丁基(tBU)保护，组氨酸(His)侧链咪唑基选用三苯甲基(Trt)保护；精氨酸(Arg)侧链胍基选用N′-[(2，3-二氢-2，2，4，6，7-五甲基苯并呋喃-5-基)磺酰基](pbf)保护，谷氨酰胺(Gln)侧链酰胺选用三苯甲基(Trt)保护；半胱氨酸(Cys)侧链巯基选用三苯甲基(Trt)保护；赖氨酸(Lys)侧链氨基选用叔丁氧羰(Boc)保护。

按照上述方法得到的树脂的取代值(SD)为0.15mmol/g。上述的取代值采用以下公式计算：

反应后树脂的取代值(SD)＝初始SD*树脂用量(g)*收率(％)/反应后树脂重量，其中收率的计算公式为：收率(％)＝树脂的理论增量/实际增量*100％。

实施例2

真空干燥按照上述方法得到的树脂肽，称重1.0g，加入含0.05mol/L碘的甲醇溶液9ml，后加入甲醇21ml，使得树脂肽浓度为5mmol/L，树脂肽与碘摩尔比为1∶3，室温搅拌反应3小时，甲醇洗涤树脂肽，真空干燥后，取样裂解，检测其氧化率，氧化率97％。

实施例3

真空干燥按照上述方法得到的树脂肽，称重0.8g，加入含0.05mol/L碘的甲醇溶液12ml，后加入甲醇18ml，使得树脂肽浓度为4mmol/L，树脂肽与碘摩尔比为1∶5，室温搅拌反应3小时，甲醇洗涤树脂肽，真空干燥后，取样裂解，检测其氧化率，氧化率为95％。

实施例4

真空干燥按照上述方法得到的树脂肽，称重1.0g，加入含0.05mol/L碘的甲醇溶液30ml，使得树脂肽浓度为5mmol/L，树脂肽与碘摩尔比为1∶10，室温搅拌反应4小时，甲醇洗涤树脂肽，真空干燥后，取样裂解，检测其氧化率，氧化率为96％。

实施例5

真空干燥按照上述方法得到的树脂肽，称重0.2g，加入含0.05mol/L碘的DMF溶液3.6ml，再加入DMF 11.4ml，使得树脂肽浓度为2mmol/L，树脂肽与碘摩尔比为1∶6，25℃反应2小时，甲醇洗涤树脂肽，真空干燥后，取样裂解，检测其氧化率，氧化率为96％。

实施例6

真空干燥按照上述方法得到的树脂肽，称重0.5g，加入含0.05mol/L碘的DMF溶液12ml，再加入DMF 13ml，使得树脂肽浓度为3mmol/L，树脂肽与碘摩尔比为1∶8，20℃反应2小时，甲醇洗涤树脂肽，真空干燥后，取样裂解，检测其氧化率，氧化率为90％。

实施例7

真空干燥按照上述方法得到的树脂肽，称重0.5g，加入含0.05mol/L碘的DMF溶液4.5ml，再加入DMF 70.5ml，使得树脂肽浓度为1mmol/L，树脂肽与碘摩尔比为1∶3，20℃反应2小时，甲醇洗涤树脂肽，真空干燥后，取样裂解，检测其氧化率，氧化率为92％。

实施例8氧化率的评价

本发明评价氧化率采用反相高效液相色谱法(HPLC)，具体检测方法为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以0.05％的三氟醋酸水溶液为流动相A，以0.05％的三氟醋酸-乙腈溶液为流动相B，进行梯度洗脱，梯度变化为在35min内流动相B由10％提高到80％；柱温37℃；流速为每分钟1ml；检测波长为210nm，进样量为5μg。

实施例9裂解方法

本发明的裂解方法如下：称量氧化好的树脂肽，加入裂解试剂，室温搅拌反应，试剂配比为TFA/茴香硫醚/EDT苯酚/水/TIS＝82/3/5/5/4/1(体积比)，裂解结束后，用石英漏斗进行抽滤，树脂加少量TFA洗涤，合并抽滤液，向裂解抽滤液中，按10倍量加入乙醚，沉淀多肽，离心，弃上清，沉淀再加乙醚洗涤离心6次，真空干燥。

实施例10普兰林肽分离纯化以及结构鉴定

取普兰林肽粗品，加水制成约100mg/ml的溶液，用制备型HPLC进行反相层析。层析条件如下：

层析柱：C18OBD(10μm)；1.9×150mm

柱体积(CV)：42.5ml

流速：10.0ml/min

梯度液组成A：0.1％TFA溶液

B：0.1％TFA的乙腈溶液

检测波长：280nm

收集样品，用分析型HPLC分析，合并纯度在98％以上的组分，然后进行减压蒸馏除去乙腈后，冷冻干燥即得纯化的普兰林肽。MALDI-TOF-MS分析表明其分子量为3949，与理论相符；使用Edman降解法对纯化的样品进行N-端测序(测试仪器型号：ABI491A，AB公司)，测定结果为：KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY，与理论相符。

Claims

1.一种普兰林肽的制备方法，其特征是用碘对树脂肽进行氧化，形成分子内的二硫键。

2.根据权利要求1所述的方法，其具体步骤如下：

(1)制备树脂肽；

(2)向树脂肽中加入碘溶液，进行氧化；

(3)用裂解试剂裂解，得到普兰林肽。

3.根据权利要求1所述的方法，其步骤如下：

(1)制备树脂肽；

(3)用裂解试剂裂解，得到普兰林肽。

4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其中树脂肽是在氨基型树脂上连接有如下氨基酸序列的肽链，其中肽链的C端与氨基型树脂键合：

Lys-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr-Cys-Ala-Thr-Gln-Arg-Leu-Ala-Asn-Phe-Leu-Val-His-Ser-Ser-Asn-Asn-Phe-Gly-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Asn-Thr-Tyr。

5.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其中树脂肽浓度为1～5mmol/L。

6.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其中碘浓度为树脂肽浓度的3～10倍。

7.根据权利要求6所述的方法，其中碘浓度为树脂肽浓度的6～10倍。

8.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其中反应温度为15～25℃。

9.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其中反应时间为3～4小时。

10.根据权利要求2或3所述的方法，其中裂解试剂为：TFA/DCM＝85/15、TFA/EDT/水＝95/3/2、TFA/茴香硫醚/EDT/苯酚/水＝85/5/5/3/2或TFA/茴香硫醚/EDT/苯酚/水/TIS＝82/3/5/5/4/1。