CN103265620A - 生长抑素及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生长抑素及其制备方法，该方法包括以下步骤：使固相合成用树在有机碱存在下与Fmoc-Cys(Trt)-OH进行反应以形成Fmoc-Cys(Trt)-树脂；加入脱帽试剂进行脱帽反应；接着加入溶解于溶剂中的保护氨基酸Fmoc-Ser(tBu)-OH、肽偶联剂、酰胺键形成促进剂和有机碱，使物料进行偶联反应，以形成Fmoc-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；循环重复脱帽-偶联步骤，并在每一偶联反应中依次使用形成生长抑素的其它保护氨基酸以最终形成保护的十四肽树脂：Boc-Ala-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；进行脱保护和切肽反应，以使十四肽从树脂上切割下来并脱除保护基，得到还原型生长抑素；将还原型生长抑素与氧化剂反应，得到环化生长抑素。本发明还提供了由该方法获得的生长抑素。本发明方法具有良好的产业化优点。
Description
技术领域
本发明涉及生长抑素原料药的制备工艺，尤其是固相合成工艺以及纯化方法。本发明还涉及一种生长抑素。本发明的生长抑素可用于预防和治疗严重急性食道静脉曲张出血、严重急性胃或十二指肠溃疡出血、急性糜烂性胃炎或出血性胃炎、胰腺外科术后并发症、胆或肠瘘、糖尿病酮症酸中毒等疾病的药物中的应用。本发明的冻干粉针剂具有期望的良好性质。
背景技术
生长抑素(somatostatin)是一种存在于胃黏膜、胰岛、胃肠道神经、垂体后叶和中枢神经系统中的肽激素，其可抑制胃分泌和蠕动，以及在下丘脑/垂体中抑制促生长素的释放。
生长抑素为十四肽，其氨基酸顺序、分子式、分子量如下：
生长抑素是由D细胞分泌的一种环状多肽类激素，主要分布在胃肠道及中枢神经系统，其中胃肠道占70%，主要作用是抑制胃肠道粘膜的增殖、分泌和吸收，抑制胃泌素、胰泌素、胰高血糖素和生长激素的释放，称之为内分泌激素的总开关。Itztu等用免疫组化法发现大肠癌粘膜中存在D细胞，认为大肠粘膜中D细胞对其它激素的分泌可能有局部调节作用，如抑制G细胞中胃泌素mRNA的转录，从而抑制胃泌素的合成及释放。
生长抑素可抑制胃和胰液的分泌、刺激粘液分泌、降低门静脉压力、松弛胆道口括约肌(Oddi括约肌)、刺激单核巨噬细胞系统而减轻内毒素血症、抑制血小板活化因子的释放、直接或间接调节细胞因子链产生细胞保护作用等，可用于消化道出血、食管静脉曲张破裂出血、急性胰腺炎及胰腺术后并发症、胰、胆和肠瘘的治疗。由于生长抑素具有十分广泛的生物学作用，作为一种治疗药物其临床前景十分广阔。
生长抑素可抑制胃泌素和胃酸以及胃蛋白酶的分泌，从而治疗上消化道出血，可以明显减少内脏器官的血流量，而又不引起体循环动脉血压的显著变化，因而在治疗食道静脉曲张出血方面有显著的临床价值。
生长抑素还可以减少胰腺的内分泌和外分泌，用以预防和治疗胰腺外科手术后并发症。
生长抑素作为一种具有多种生理功能的多肽类激素，人们已经成功地将其开发成人用药品，其适应症包括：1．严重急性食道静脉曲张出血；2．严重急性胃或十二指肠溃疡出血，或并发急性糜烂性胃炎或出血性胃炎；3．胰腺外科术后并发症的预防和治疗；4．胰、胆和肠瘘的辅助治疗；5．糖尿病酮症酸中毒的辅助治疗。
另外，Itztu等用免疫组化法发现大肠癌粘膜中存在D细胞，认为可能与肿瘤的发生与发展有关。生长抑素抗肿瘤作用的机理是：生长抑素与癌细胞膜上特异性的生长抑素受体结合，产生直接的抗增殖效应，包括磷酸酪氨酸磷酸酶的激活，抑制cAMP及基因转录，抑制胃泌素、蛙皮素、表皮生长因子等的合成、释放及作用而具有间接的抗增殖作用，还能抑制与肿瘤有关的血管形成。已经有多篇文献报道用生长抑素治疗肝癌和神经内分泌肿瘤如胰岛肿瘤等。
综上所述，生长抑素有非常广泛的应用前景。
CN100336557C(中国专利号ZL200510102990.0，双鹭)公开了一种生长抑素的水溶液制剂、其制备方法及其在制备用于预防和治疗严重急性食道静脉曲张出血、急性胃或十二指肠溃疡出血、急性糜烂性胃炎或出血性胃炎、胰腺外科术后并发症等疾病的药物中的应用。该制剂由生长抑素、药用辅料和水组成。其中生长抑素的规格可以是0.1-1000mg/支，单位制剂体积可以是0.1-500ml。辅料可以选用但不仅限于甘露醇或者聚乙二醇等碳水化合物、各种环糊精、甘氨酸等20种人体氨基酸、低分子右旋糖酐、泊洛沙姆、磷酸盐或者醋酸盐等缓冲盐类等等。该制剂的制备方法包括配液、除菌、分装、压塞和包装等步骤。该水溶液制剂具有稳定性好、制备方便的特点，能很好保持生长抑素的结构和活性，在制备用于预防和治疗严重急性食道静脉曲张出血、严重急性胃或十二指肠溃疡出血、急性糜烂性胃炎或出血性胃炎、胰腺外科术后并发症、胆或肠瘘、糖尿病酮症酸中毒等疾病的药物中应用前景广泛。
CN1508152A(中国专利申请号02155189.8，常州四药)公开了生长抑素(14肽)的固相合成新方法。该方法采用2-氯三苯甲基树脂作固相载体，在该树脂首先连接保护半胱氨酰基(Fmoc-Cys(Trt)-)，采用Fmoc保护氨基酸的程序接肽法完成生长抑素线肽的合成，用三氟醋酸一次脱除线肽侧链保护基团，并切割树脂，得到生长抑素线肽的三氟醋酸。该中间产物在双氧水或二甲基亚砜水溶液中氧化环合，得到生长抑素三氟醋酸盐粗制品。该粗制品经C18键合硅胶中压柱，用甲醇-水梯度洗脱方法分离纯化，得生长抑素三氟醋酸精制产品。该产品用醋酸离子交换树指交换，并冷冻干燥得最终产品。据信该方法制备生长抑素具有产率高，合成快，不易消旋，可分子内选择性氧化环合，纯度好，方法简便等优点，可用于大批量生产制备。
CN1552728A(中国专利申请号03128951.7，上海子能)公开了一种生长抑素多肽的合成方法，将Wang树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，逐个接上氨基酸，用切肽试剂(TFA/EDT/H2O/TIS)进行切肽，加入乙醚沉淀粗肽，在pH7.0-10.0，于15-35℃下，通空气氧化，用C18柱进行分离纯化。据信该方法操作简单，生产成本明显降低，有利于生长抑素的国产化生产。
CN1923851A(中国专利申请号200510029220.8，上海子能)公开了一种固相多肽合成生长抑素的制备方法。该发明的方法包括如下步骤:以三苯甲基树脂、4-甲基三苯甲基树脂或4-甲氧基三苯甲基树脂为起始原料，按固相合成的方法依次连接保护氨基酸，获得保护的十四肽树脂，其间依次脱去FMOC-保护基，脱侧链保护基团、切肽，获得还原型生长抑素，并在PH7-11用空气氧化，获得生长抑素粗品，再经C18(或C8)高压柱分离纯化，制得生长抑素精品。据信该发明的方法，具备规模化生产能力，工艺稳定，原辅材料来源方便，生产周期短，收率高，质量稳定，生产成本低，接肽收率高，避免使用氟化氢等剧毒试剂，三废污染少，每步接肽收率均在99%以上；切肽后收率为：95.4%，纯化收率高于25%以上，总收率为:25%。
CN102952175A(中国专利申请号201110238204.5，上海苏豪)公开了一种固相多肽合成生长抑素的方法，包括如下步骤：以2-氯三苯基醇树脂为起始原料，按照固相合成的方法依次连接具有保护基团的氨基酸，其间依次脱去Fmoc-保护基团，用TBTU及HOBT为缩合剂进行接肽反应，得保护的还原型十四肽树脂后，同步进行脱侧链保护基团及切肽，获得还原型生长抑素，并在pH为7～9的条件下用双氧水氧化，获得生长抑素粗品，再经C18高效液相柱进行分离纯化，再经冷冻干燥后，制得生长抑素精品。据信该发明具备规模化生产能力，工艺稳定，生产成本低，三废减少，副产物少，质量稳定，制备成本低，极具市场竞争力。
本领域技术人员仍然期待的以高产品收率获得具有良好品质的产品。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制备生长抑素的方法，期待该方法可以得到高收率的生长抑素，并且期待所得生长抑素具有良好的品质。本发明人令人惊奇地发现，使用特定的工艺条件制备生长抑素，不但产率高，而且产品品质优良。本发明因此而得以完成。
为此，根据本发明的第一方面，提供了一种固相合成生长抑素的方法，其包括以下步骤：
(a)向经浸泡处理的固相合成用树脂中加入溶解于溶剂中的Fmoc-Cys(Trt)-OH和有机碱，使物料进行反应以形成Fmoc-Cys(Trt)-树脂；
(b)向上一步骤所得的肽偶合树脂(即步骤(a)所得Fmoc-Cys(Trt)-树脂)中加入脱帽试剂，使物料进行反应以脱帽(即脱除Fmoc-保护基)；接着加入溶解于溶剂中的保护氨基酸Fmoc-Ser(tBu)-OH、肽偶联剂、酰胺键形成促进剂和有机碱，使物料进行偶联反应(亦可称为缩合反应)，以形成Fmoc-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；
(c)循环重复步骤(b)，并在每一循环操作的偶联反应中依次使用下列氨基酸以替换保护氨基酸Fmoc-Ser(tBu)-OH：Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Trp-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Boc-Ala-OH，以最终形成保护的十四肽树脂：Boc-Ala-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；
(d)向步骤(c)所得十四肽树脂中加入切割液以同时进行脱保护和切肽反应，以使十四肽从树脂上切割下来并脱除保护基，得到还原型生长抑素；
(e)将步骤(d)所得还原型生长抑素溶解于酸中，加入氧化剂进行氧化反应，得到下式所示生长抑素：
和任选的，
(f)对步骤(e)所得生长抑素进行纯化的步骤。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(a)中，所述树脂选自：2-氯三苯基醇树脂、rink amide MBHA树脂、rink amide am树脂、knorr树脂、或其组合。这类树脂是可以从商业途径获得的，例如可以从阿拉丁试剂公司(http://www.aladdin-reagent.com)商业公司购得。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(a)中，所述树脂浸泡处理是照如下方式进行的：取树脂置于反应器中，加入溶剂(例如二氯甲烷、甲醇、乙醇、氯仿、三氟乙酸、DMF、或其组合)振荡并充分浸泡(例如浸泡10～200min)，抽除溶剂(必要时，可再用上述溶剂重复清洗，并除去溶剂)。在一个实施方案中，所述树脂浸泡处理是照如下方式进行的：称取一定量树脂于反应器中，然后加入二氯甲烷，振荡并浸泡60分钟，再加入用二氯甲烷、甲醇、二甲基甲酰胺分别交替清洗两次，抽滤以除去溶剂。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(a)中，所述树脂在经浸泡处理后、进行偶联反应之前，还包括对该树脂进行脱帽处理的步骤。增加该脱帽处理步骤，使树脂得以进一步地活化，有助于增加Fmoc-Gly-树脂的收率。该脱帽处理的步骤可以参照步骤(b)中的方式进行。此外，在该脱帽处理期间或者脱帽处理后，可以使用茚三酮检测法检测脱帽完全程度，如果脱帽不完全，可重得进行脱帽处理。在一个实施方案中，步骤(a)中脱帽试剂是氯化亚砜；在一个实施方案中，步骤(a)中2-氯三苯基醇树脂与氯化亚砜的重量比为1：1～2。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(a)中，所述有机碱例如但不限于：NMM、DIPEA、三甲基吡啶、或其组合。这些试剂可以容易地从一般的商业途径获得特别是一般的化学试剂公司购得，例如可以从北京化学试剂公司购得。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(a)中，所述有机碱与树脂的摩尔比为5～7：1。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(a)中，所述Fmoc-Cys(Trt)-OH与树脂的摩尔比为1～2：1。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(b)中，所述脱帽试剂选自哌啶(亦称为六氢吡啶，PIP)、二乙胺、三乙胺、三氟乙酸。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(b)中，所述脱帽反应是在选自下列的溶剂中进行的：二氯甲烷、二甲基甲酰胺等，优选二甲基甲酰胺。溶剂的用量以根据现有技术公开的方法或者经验容易地确定，例如用足以溶解各种物料的尽量少的溶剂。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(b)中，所述脱帽反应是在25～27%的哌啶/二甲基甲酰胺溶液中进行的，优选是在26%的哌啶/二甲基甲酰胺溶液中进行的。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(b)中，所述脱帽反应是在32～35°C温度下进行的，反应时间为10～50min，例如20～30min，例如约24min。在一个实施方案中，重量浓度为25～27%的PIP溶液与树脂的重量比为5～10：1，例如为6～8：1。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(b)中，还包括在完成脱帽反应后对获得的树脂进行清洗的操作，所述清洗是使用选自下列的溶剂清洗处理1～3次、甲醇、乙醇、氯仿、三氟乙酸、DMF、或其组合，特别是使用DMF、甲醇、二氯甲烷，三者交替清洗2次。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(b)中，还包括在脱帽反应期间或者脱帽反应后采用茚三酮检测法检测脱帽反应进行程度。如果发现脱帽反应不够完全，可以重复进行脱帽反应。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(b)中，所述肽偶联剂例如但不限于：DCC(N,N′-二环己基碳二亚胺，N,N′-Dicyclohexylcarbodiimide)、DIC(N,N’-二异丙基碳二亚胺，N,N'-Diisopropylcarbodiimide)、HATU(英文全称2-(1H-7-Azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyl uronium hexafluorophosphate Methanaminium)、HBTU(英文全称O-Benzotriazole-N,N,N’,N’-tetramethyl-uronium-hexafluoro-phosphate)、HCTU(英文全称1H-Benzotriazolium1-[bis(dimethylamino)methylene]-5chloro-,hexafluorophosphate(1-),3-oxide)、TATU(英文全称O-(7-Azabenzotriazole-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium tetrafluoroborate)、TBTU(英文全称O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium tetrafluoroborate)、或其组合。肽偶联剂可以容易地从商业途径获得的，例如可以从吉尔生化公司、阿拉丁试剂公司、上海庭园生化公司等商业途径购得。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(b)中，所述酰胺键形成促进剂例如但不限于：HOAT、HOBT、6-Cl-HOBt、或其组合。这些试剂可以容易地从商业途径获得的，例如可以从吉尔生化公司、阿拉丁试剂公司、上海庭园生化公司等商业途径购得。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(b)中，所述有机碱例如但不限于：NMM、DIPEA、三甲基吡啶、或其组合。这些试剂可以容易地从一般的商业途径获得特别是一般的化学试剂公司购得，例如可以从北京化学试剂公司购得。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(b)中，用于进行偶联反应的所述溶剂例如但不限于：二氯甲烷、二甲基甲酰胺等。溶剂的用量以根据现有技术公开的方法或者经验容易地确定，例如用足以溶解各种物料的尽量少的溶剂；或者，例如在步骤(b)中进行偶联反应时，通常可以是每摩尔树脂使用5-25L溶剂，例如可以是每摩尔树脂使用10-20L溶剂。在其它偶联反应步骤中亦可使用此比率范围。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(b)中，所述树脂与所述Fmoc-Ser(tBu)-OH的投料比为1：2～5(摩尔比)，优选1：3～4。进一步地，在后续的各个肽偶联反应中，添加于该步骤的氨基酸(Fmoc保护的或未保护的)的量为步骤(b)中树脂量的2～5倍(摩尔倍)，优选3～4倍。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(b)中，所述肽偶联剂的加入量是树脂量的2～5倍(摩尔倍)，优选3～4倍。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(b)中，所述酰胺键形成促进剂的加入量是树脂量的2～5倍(摩尔倍)，优选3～4倍。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(b)中，所述有机碱的加入量是树脂量的5～10倍(摩尔倍)，优选6～8倍。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(b)中，所述溶剂的加入量是树脂量的5～10倍(重量倍)，优选6～8倍。进一步地，在后续的各个肽偶联反应中，添加于该步骤的肽偶联剂、酰胺键形成促进剂、有机碱、溶剂与树脂的重量或摩尔比均具有上述比例关系。需要说明的是，当某类物料(例如酰胺键形成促进剂)以两种或两种以上组合使用时，其在上述投料比中的用量是以投入的全部该类物料计的；其它物料种表示它们的量时，亦有同样含义，除非另有说明。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(b)中，还包括在偶联反应期间或者反应后采用茚三酮检测法检测偶联反应进行程度。如果发现偶联反应不够完全，可以重复进行偶联反应。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(b)中，还包括在完成偶联反应后对获得的Fmoc-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂进行清洗的操作，所述清洗是使用选自下列的溶剂清洗处理1～3次、甲醇、乙醇、氯仿、三氟乙酸、DMF、或其组合，特别是使用DMF、甲醇、二氯甲烷，三者交替清洗2次。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(c)中，第一循环操作使用Fmoc-Thr(tBu)-OH作为保护氨基酸，得到Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(c)中，第二循环操作使用Fmoc-Phe-OH作为保护氨基酸，得到Fmoc-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(c)中，第三循环操作使用Fmoc-Thr(tBu)-OH作为保护氨基酸，得到Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(c)中，第四循环操作使用Fmoc-Lys(Boc)-OH作为保护氨基酸，得到Fmoc-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(c)中，第五循环操作使用Fmoc-Trp-OH作为保护氨基酸，得到Fmoc-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(c)中，第六循环操作使用Fmoc-Phe-OH作为保护氨基酸，得到Fmoc-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(c)中，第七循环操作使用Fmoc-Phe-OH作为保护氨基酸，得到Fmoc-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(c)中，第八循环操作使用Fmoc-Asn(Trt)-OH作为保护氨基酸，得到Fmoc-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(c)中，第九循环操作使用Fmoc-Lys(Boc)-OH作为保护氨基酸，得到Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(c)中，第十循环操作使用Fmoc-Cys(Trt)-OH作为保护氨基酸，得到Fmoc-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(c)中，第十一循环操作使用Fmoc-Gly-OH作为保护氨基酸，得到Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(c)中，第十二循环操作使用Boc-Ala-OH作为保护氨基酸，得到Boc-Ala-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂，约得保护的十四肽树脂。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(b)和步骤(c)中进行偶联反应时，使用的酰胺键形成促进剂是HOBT。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(c)中，在第八循环操作使用Fmoc-Asn(Trt)-OH作为保护氨基酸进行偶联反应的过程中，与Fmoc-Asn(Trt)-OH一起加入适量乳酸进行反应。在一个实施方案中，所述Fmoc-Asn(Trt)-OH与乳酸的摩尔比为1：0.01-0.2，优选1：0.02-0.1。所述的乳酸例如是符合2010年版二部480页收载的“乳酸”的标准的产品。发明人已经出人意料地发现，在该步骤中加入适量乳酸时，可以大大提高该步骤的收率。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(a)、步骤(b)、和步骤(c)中的所述偶联反应是在32-37°C温度下进行的，反应时间为20～200min，例如60～90min。
根据本发明第一方面的方法，其中在各步骤中进行脱帽反应时，是在32～35℃进行的，虽然本发明描述了一些优选的反应时间，然而反应时间可根据茚三酮检测结果而随时作适当调整，例如如果经检测发现反应尚不完全的情况下可适当延长反应，这些操作是本领域技术人员容易控制的；特别是，脱帽时间通常为20～30分钟。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(d)所述切割液中包含TFA、TIS、EDT、H2O。在一个实施方案中，所述切割液中四种组分的体积比为：TFA:TIS:EDT:H2O=50-98:1-10:1-10:1-10。在一个实施方案中，所述切割液中四种组分的体积比为：TFA:TIS:EDT:H2O=90-98:1-5:1-5:1-5。在一个实施方案中，所述切割液中四种组分的体积比为：TFA:TIS:EDT:H2O=94:2:2:2。在一个实施方案中，所述切割液是预先冷却到-20°C至10°C，优选预先冷却至0°C至10°C，优选预先冷却至约5°C。在一个实施方案中，所述切割液中还添加有适量的醋酐。在一个实施方案中，所述切割液中五种组分的体积比为：TFA:TIS:EDT:H2O:醋酐=90-98:1-5:1-5:1-5:0.1-0.5。在一个实施方案中，所述切割液中五种组分的体积比为：TFA:TIS:EDT:H2O:醋酐=95:(1-5):(1-5):(1-5):(0.1-0.5)。在一个实施方案中，所述切割液中五种组分的体积比为：TFA:TIS:EDT:H2O:醋酐=95:(1-3):(1-3):(1-3):(0.1-0.3)。在一个实施方案中，所述切割液中五种组分的体积比为：TFA:TIS:EDT:H2O:醋酐=95:2:2:2:0.2。完全出人意料的是，向切割液中加入适量的醋酐时可以增加十四肽的收率并降低杂肽的量。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(d)中，所述切肽反应是在室温进行的，优选是在20±5°C下进行的。反应时间为1-10小时，优选2-6小时，优选3-5小时。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(d)中，所述切肽反应是将氨基酸的侧链保护基切除同时将十四肽从树脂上切割下来，从而获得十四肽的还原型生长抑素。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(d)中，在完成切肽反应后，除去切割液(例如通过减压的方式)，然后加入乙醚进行沉淀，收集沉淀物，用乙醚洗涤数次，真空干燥，获得还原型生长抑素固体。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(d)是按如下方式进行的：按1g肽树脂约10mL上述切割液比例将肽树脂与切割液混合，室温反应3-5小时后过滤，用适量TFA洗涤树脂3次，合并滤液减压浓缩至初始体积的10%左右，加入预先冷冻的无水乙醚(冷冻至-10℃以下)，按每1g肽树脂所得切肽液加入无水乙醚10-15mL的比例加入浓缩液中，摇匀后在-10℃以下静止沉淀至溶液澄清，过滤，滤饼用冷冻无水乙醚洗涤再次，得还原型生长抑素固体。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(e)的氧化反应是如下进行的：将还原型生长抑素用50%冰醋酸溶解，然后用纯化水稀释至含冰醋酸30%，搅拌均匀后过滤，得滤液；在搅拌下向该滤液中滴加饱和I2(碘，其量为还原型生长抑素的2～2.4摩尔倍)/冰醋酸溶液，至溶液呈红棕色，继续搅拌30min，再加入少量饱和Vc水溶液至红棕色消失；减压浓缩得到经二硫键形成环的生长抑素。
根据本发明第一方面的方法，在经步骤(e)氧化反应获得生长抑素粗品后，还进一步包括对该生长抑素粗品进行纯化的步骤。该纯化步骤在本发明中亦可称为步骤(f)。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(f)的纯化步骤是照如下方式进行的：将生长抑素粗品用醋酸水溶液溶解，过滤，滤液过离子交换柱并用该醋酸水溶液洗脱，收集流出主峰，然后再经过C18柱纯化，收集主峰流出液，冷冻干燥，即得生长抑素精制品，其可以作为生长抑素制剂用的原料药。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(f)中，所述的离子交换柱为阳离子交换柱(例如但不限于Shodex IEC CM-825、Shodex IEC SP-825、Shodex IEC SP-420N、Shodex Asahipak ES-502C7C)或阴离子交换柱(例如国产D201、D231、DK251、731、或290型阴离子交换树脂，美国Amberlite IRA-900型阴离子交换树脂，德国LewatitMP-500型阴离子交换树脂，日本Diaion PA308型阴离子交换树脂，TOSOH TSK–GEL DEAE-5PW、Chrompack IonoSpher A)或其组合使用；优选的离子交换柱为阴离子交换柱。优选的离子交换柱是基质为聚羟基甲基丙烯酸酯的阳离子交换柱，例如Shodex IEC CM-825、Shodex IEC SP-825、Shodex IEC SP-420N，它们可以容易地从商业途径获得，例如得自北京谱朋公司。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(f)中，所述的醋酸水溶液浓度为：2%-20%(v/v)，例如5%。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(f)中，所说的反向柱纯化所用流动相为：含有与含有15%-50%乙腈或甲醇的水溶液；在一个实施方案中，所说的反向柱纯化所用流动相为含20%乙腈的水溶液。在一个实施方案中，所述反向柱是Lichrospher RP-18色谱柱(德国产)。在一个实施方案中，所述反向柱纯化的流速为10ml/min。在一个实施方案中，由于最终纯化步骤中使用到乙腈，因此本发明终产物中可能残余有微量的乙腈，控制乙腈的量是有必要的，通过减压干燥或真空干燥或者冷冻干燥是可以容易地除去乙腈的，或者可以容易地除去乙腈以使乙腈量降低到0.04%以下(可照气相色谱法测定)。本发明后文各实施例所得精制生长抑素中，乙腈含量均低于0.03%。因此，在本发明的一个实施方案中，本发明提供了一种生长抑素，其中乙腈含量低于0.03%。
进一步地，本发明第二方面提供了本发明第一方面任一项所述方法获得的生长抑素。在一个实施方案中，该生长抑素中最大单一杂质小于0.30%，总杂质小于0.50%。
下面对本发明作进一步的描述。
在本发明中，使用的氨基酸如未特别标示其构型时，均指L型氨基酸。
在本发明中，使用到如下的一些Fmoc保护或未保护的氨基酸作为起始原料：Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Trp-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Boc-Ala-OH。在本发明中还使用到2-氯三苯基醇树脂作为载体，其取代量为0.7mmol/g，在标示树脂投料量时均有类似含义；如果直接以摩尔量标示树脂投料量，表示所加入的树脂的取代量，以摩尔(mol)或者毫摩尔(mmol)计。
固相多肽合成中一般需要将α-氨基以及侧链活性基团保护起来。目前使用比较多的α-氨基保护基为：叔丁氧羰基(Boc)和9-芴甲氧羰基(Fmoc)两种。Boc基团需要反复采用50%的三氟乙酸(TFA)来脱除，肽树脂切割一般采用氢氟酸(HF)，对环境以及实验设备都有较高的要求，而Fmoc基团可以使用哌啶轻易地脱除，切割采用TFA，与Boc法相比，具有反应条件温和、合成效率高以及切割条件温和等优点，逐渐取代了Boc基团而成为目前固相多肽合成的首选α-氨基保护基。在本发明中使用经Fmoc保护的氨基酸。
酰胺键形成促进剂例如但不限于：HOAT(CAS No.39968-33-7)、HOBT(1-Hydroxybenzotriazole)、6-Cl-HOBt(6-Chloro-1-Hydroxy-1H-Benzotriazole)、或其组合。
有机碱例如但不限于：NMM、DIPEA、三甲基吡啶、或其组合。
本发明需要解决的技术问题是公开一种固相合成生长抑素的合成方法以及纯化工艺，解决目前现有的技术存在的上述缺陷。
在本发明的上下文中，对脱帽反应或者肽偶联反应进行反应程度检测时，如未另外说明，均是采用如下方式的茚三酮检测法进行：
1、脱帽反应程度检测法：每次用小试管取大约0.5-1mg树脂，用乙醇洗涤后，往试管中依次加入4滴缓冲液(20mg苯酚溶于50m1乙醇+25ml吡啶)，1滴Vc-乙醇溶液(4×10-5mol/L)，2滴茚三酮溶液(500mg茚三酮溶于10m1乙醇，50g/L)，用超声波进行脱氨处理。然后在沸水浴中加热5min，观察树脂及试管中溶液的颜色，进而判断反应的进行程度；若显蓝色则反应完全，若不显蓝色则反应不完全需重新进行此步。
2、肽偶联反应程度检测试剂：(1)1g茚三酮，溶于10-50ml无水乙醇；(2)3.2g苯酚，溶于1-20ml无水乙醇；(3)0.4ml KCN储液(0.01M KCN)，溶于19.6ml吡啶。
3、肽偶联反应程度检测方法(在本发明中亦称为KT检测)：在待检测的经肽偶联反应的树脂中，将上述三种试剂按1：1：1比例依次各滴加2滴，通过颜色观察来判断反应是否完全，此法灵敏度达到99%以上。若溶液及树脂为黄色，则表明树脂上无残留-NH2；若溶液及树脂为紫色、淡蓝色或蓝色，则表明树脂上仍有残留的-NH2，颜色越深，表明残留的-NH2越多，肽的耦联反应越不完全，需延长反应时间。
按照本发明，所说的依次连接具有保护基团的氨基酸，获得保护十四肽树脂，其间依次脱去Fmoc保护基团的方法，包括如下步骤：
步骤(1)：制备Fmoc-Cys(Trt)-树脂；
步骤(2)：制备Fmoc-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；
步骤(3)：制备Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；
步骤(4)：制备Fmoc-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；
步骤(5)：制备Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；
步骤(6)：制备Fmoc-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；
步骤(7)：制备Fmoc-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；
步骤(8)：制备Fmoc-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；
步骤(9)：制备Fmoc-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；
步骤(10)：制备Fmoc-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；
步骤(11)：制备Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；
步骤(12)：制备Fmoc-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；
步骤(13)：制备Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；
步骤(14)：制备Boc-Ala-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂。
在本发明方法的一个实施方案中，以上步骤(1)中制备Fmoc-Cys(Trt)-树脂包括以下步骤：
将2-氯三苯基醇树脂(100-150目，0.7mmol/g)，加入DCM，室温搅拌溶胀0.5～1小时(再加入用二氯甲烷、甲醇、二甲基甲酰胺分别交替清洗两次，抽滤以除去溶剂)；搅拌下，加入氯化亚砜，再于室温搅拌反应2～3小时以脱帽，抽干，用DCM洗涤，抽干；
2-氯三苯基醇树脂与氯化亚砜的重量比为1：1～2；
加入DMF，再加入用DMF溶解的Fmoc-Cys(Trt)-OH和DIPEA，于32～38℃反应1.0～1.5小时，再加甲醇，32～37℃反应30～90分钟，抽干，树脂用甲醇洗涤一次，用DMF洗洗，抽干；
DMF中，Fmoc-Cys(Trt)-OH：2-氯三苯基醇树脂=1～2：1，摩尔比；
DIPEA：2-氯三苯基醇树脂=5～7：1，摩尔比。
在本发明方法的一个实施方案中，以上步骤(2)中制备Fmoc-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂包括以下步骤：
在步骤(1)的Fmoc-Cys(Trt)-树脂中，加入重量浓度为25.5～26.5%PIP的DMF溶液，32～35℃脱帽反应22～24分钟，抽干，用DMF洗涤，抽干，加入用DMF溶解的Fmoc-Ser(tBu)-OH、TBTU、HOBT和NMM的混合物，32-37℃缩合反应1.0～1.5小时，抽干，用DMF洗涤，抽干，获得Fmoc-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；
各个组分的用量，以2-氯三苯基醇树脂为基准，为：重量浓度为25.5～26.5%的PIP：2-氯三苯基醇树脂=6～8：1(重量比)；Fmoc-Ser(tBu)-OH：2-氯三苯基醇树脂=3～4：1(摩尔)；DMF：2-氯三苯基醇树脂的重量比6～8：1；TBTU：2-氯三苯基醇树脂的摩尔比3～4：1；HOBT：2-氯三苯基醇树脂的摩尔比3～4：1；NMM：2-氯三苯基醇树脂的摩尔比6～8：1。
在本发明方法的一个实施方案中，以上步骤(3)中制备Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂包括以下步骤：
在步骤(2)的Fmoc-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入重量浓度为25.5～26.5%PIP的DMF溶液，32～35℃脱帽22～24分钟，抽干，分别用甲醇和DMF洗涤，抽干；
加入用DMF溶解的Fmoc-Thr(tBu)-OH、TBTU、HOBT和NMM的混合物，32-37℃缩合反应1.0～1.5小时，抽干，用DMF洗涤，抽干，获得Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂。
在本发明方法的一个实施方案中，以上步骤(4)中制备Fmoc-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂包括以下步骤：
在步骤(3)的Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入25.5～26.5%PIP的DMF溶液，32～35℃脱帽反应22～24分钟，抽干，用甲醇洗涤一次，用DMF洗五次，抽干；
加入用DMF溶解的Fmoc-Phe-OH、TBTU、HOBT和NMM的混合物，32-37℃缩合反应1.0～1.5小时，抽干，用DMF洗涤二次，抽干，获得Fmoc-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂。
在本发明方法的一个实施方案中，以上步骤(5)中制备Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂包括以下步骤：
在步骤(4)的Fmoc-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入25.5～26.5%PIP的DMF溶液，32～35℃脱帽反应22～24分钟，抽干，用甲醇洗涤一次，用DMF洗五次，抽干；
加入用DMF溶解的Fmoc-Thr(tBu)-OH、TBTU、HOBT和NMM的混合物，32-37℃缩合反应1.0～1.5小时，抽干，用DMF洗涤二次，抽干，获得Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂。
在本发明方法的一个实施方案中，以上步骤(6)中制备Fmoc-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂包括以下步骤：
在步骤(5)的Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入25.5～26.5%PIP的DMF溶液，32～35℃脱帽反应22～24分钟，抽干，用甲醇洗涤一次，用DMF洗五次，抽干；
加入用7L的DMF溶解的Fmoc-Lys(Boc)-OH、TBTU、HOBT和NMM的混合物，32～37℃缩合反应1.0～1.5小时，抽干，用DMF洗涤二次，抽干，获得Fmoc-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂。
在本发明方法的一个实施方案中，以上步骤(7)中制备Fmoc-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂包括以下步骤：
在步骤(6)的Fmoc-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入25.5～26.5%PIP的DMF溶液，32～35℃脱帽反应22～24分钟，抽干，用甲醇洗涤一次，用DMF洗五次，抽干；
加入用DMF溶解的Fmoc-Trp-OH、TBTU、HOBT和NMM的混合物，32～37℃缩合反应1.0～1.5小时，抽干，用DMF洗涤二次，抽干，获得Fmoc-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂。
在本发明方法的一个实施方案中，以上步骤(8)中制备Fmoc-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂包括以下步骤：
在步骤(7)的Fmoc-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入25.5～26.5%PIP的DMF溶液，32～35℃脱帽反应22～24分钟，抽干，用甲醇洗涤一次，用DMF洗五次，抽干；
加入用DMF溶解的Fmoc-Phe-OH、TBTU、HOBT和NMM的混合物，32～37℃缩合反应1.0～1.5小时，抽干，用DMF洗涤二次，抽干，获得Fmoc-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂。
在本发明方法的一个实施方案中，以上步骤(9)中制备Fmoc-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂包括以下步骤：
在步骤(8)的Fmoc-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入25.5～26.5%PIP的DMF溶液，32～35℃脱帽反应22～24分钟，抽干，用甲醇洗涤一次，用DMF洗五次，抽干；
加入用DMF试剂溶解的Fmoc-Phe-OH、TBTU、HOBT和NMM的混合物，32～37℃缩合反应1.0～1.5小时，抽干，用DMF洗涤二次，抽干，获得Fmoc-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂。
在本发明方法的一个实施方案中，以上步骤(10)中制备Fmoc-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂包括以下步骤：
在步骤(9)的Fmoc-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入25.5～26.5%PIP的DMF溶液，32～35℃脱帽反应22～24分钟，抽干，用甲醇洗涤一次，用DMF洗五次，抽干；
加入用DMF溶解的Fmoc-Asn(Trt)-OH、TBTU、HOBT和NMM以及乳酸(Fmoc-Asn(Trt)-OH与乳酸的摩尔比为1：0.01-0.2，优选1：0.02-0.1)的混合物，32～37℃缩合反应1.0～1.5小时，抽干，用DMF洗涤二次，抽干，获得Fmoc-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂。
在本发明方法的一个实施方案中，以上步骤(11)中制备Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂包括以下步骤：
在步骤(10)的Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入25.5～26.5%PIP的DMF溶液，32-35℃脱帽反应22～24分钟，抽干，用甲醇洗涤一次，用DMF洗五次，抽干；
加入用DMF试剂溶解的Fmoc-Lys(Boc)-OH、TBTU、HOBT和NMM的混合物，32～37℃缩合反应1.0～1.5小时，抽干，用DMF洗涤二次，抽干，获得Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂。
在本发明方法的一个实施方案中，以上步骤(12)中制备Fmoc-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂包括以下步骤：
在步骤(11)的Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入25.5～26.5%PIP的DMF溶液，32～35℃脱帽反应22～24分钟，抽干，用甲醇洗涤一次，用DMF洗五次，抽干；
加入用DMF试剂溶解的Fmoc-Cys(Trt)-OH、TBTU、HOBT和NMM的混合物，32～37℃缩合反应1.0～1.5小时，抽干，用DMF洗涤二次，抽干，获得Fmoc-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂。
在本发明方法的一个实施方案中，以上步骤(13)中制备Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂包括以下步骤：
在步骤(12)的Fmoc-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入25.5～26.5%PIP的DMF溶液，32～35℃脱帽反应22～24分钟，抽干，用甲醇洗涤一次，用DMF洗五次，抽干；
加入用DMF溶解的Fmoc-Gly-OH、TBTU、HOBT和NMM的混合物，32～37℃缩合反应1.0～1.5个时，抽干，用DMF洗涤二次，抽干，获得Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂。
在本发明方法的一个实施方案中，以上步骤(14)中制备Boc-Ala-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂包括以下步骤：
在步骤(13)的Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入25.5～26.5%PIP的DMF溶液，32～35℃脱帽反应22～24分钟，抽干，用甲醇洗涤一次，用DMF洗五次，抽干；
加入用DMF溶解的Boc-Ala-OH、TBTU、HOBT和NMM的混合物，32～37℃缩合反应1.0～1.5小时，抽干，用DMF洗涤二次，抽干，获得Boc-Ala-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂，约得保护的十四肽树脂。
在以上步骤(2)～(14)中，各个组分的用量，以2-氯三苯基醇树脂为基准，为：重量浓度为25.5～26.5%的PIP：2-氯三苯基醇树脂=6～8：1(重量比)；具有保护基团的氨基酸：2-氯三苯基醇树脂=3～4：1(摩尔比)；DMF与2-氯三苯基醇树脂的重量比6～8：1；TBTU与2-氯三苯基醇树脂的摩尔比3～4：1；HOBT与2-氯三苯基醇树脂的摩尔比3～4：1；NMM与2-氯三苯基醇树脂的摩尔比6～8：1。
在本发明中，任一实施方案可以与其它实施方案组合，只要这种组合不会出现矛盾。
在本发明中，测定氨基酸与树脂之间的偶联率可以采用重量法和比色法两种方法测定。特别是，如未另外说明，本发明上下文中测定氨基酸(特别是第一个氨基酸)与树脂之间的偶联率采用如下步骤所示比色法进行：
采用比色法的根据是脱保护的氨基酸暴露出来的氨基基团可以和专门的检测试剂发生颜色反应，这个反应是定量的，颜色的深浅和氨基基团的数量成正比。颜色的深浅可以用分光光度计测量，据此可以计算出来偶联率的数值。
例如，以检测连接了十个氨基酸的树脂为例说明偶联率的测定方法：准确称取2-4毫克的连接了第十个氨基酸的树脂(即Fmoc-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂)，放入EP管中，加入2-3滴冰乙酸和1毫升甲醇，洗涤后用1毫升甲醇洗涤3次。然后冻干，准确称重。加入偶联率检验专用试剂250微升，同时制空白。沸水浴反应5min，其间振荡2-3次。取出来后立即加入2.8毫升乙醇至总体积为3毫升。充分摇匀，然后用乙醇扫基线，在570nm处测定样品和空白的吸光度。按照下列公式计算：
(-NH2mmol/g)=[(样品一空白)×体积(ml)×l06]/(15000×样品重量)
偶联率=1-[(-NH2mmo1/g)/(l000×理论交换当量)]
联接了其它氨基酸的树脂亦可用类似方法测定。
本发明设计的技术路线具有以下特点：操作简单化，适合大规模生产，原料得到方便，收率高，成本低，生产周期短，质量稳定，所得样品符合国家药典中规定的生长抑素原料药的各项检测标准。极具有市场竞争力。
在本发明中，使用到的一些试剂或原材料，它们的名称、来源等信息列举如下：
实施例与前述过程中所采用的原料列表如下：
| No | 原料及试剂名 | 来源 |
| 1 | 2-氯三苯基醇树脂 | 天津和成公司 |
| 2 | Boc-Ala-OH | 四川三高生化公司 |
| 3 | Fmoc-Asn(Trt)-OH | 四川三高生化公司 |
| 4 | Fmoc-Cys(Trt)-OH | 四川三高生化公司 |
| 5 | Fmoc-Gly-OH | 四川三高生化公司 |
| 6 | Fmoc-Lys(Boc)-OH | 四川三高生化公司 |
| 7 | Fmoc-Phe-OH | 四川三高生化公司 |
| 8 | Fmoc-Ser(tBu)-OH | 四川三高生化公司 |
| 9 | Fmoc-Thr(tBu)-OH | 四川三高生化公司 |
| 10 | Fmoc-Trp-OH | 四川三高生化公司 |
| 11 | HOBT(1-羟基苯并三氮唑) | 四川三高生化公司 |
| 12 | TBTU(O-苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲四氟硼酸盐) | 吉尔生化 |
| 13 | 二甲基甲酰胺(DMF) | 上海金锦乐实业公司 |
| 14 | 3-巯基丙酸(3-Map) | 上海海曲化工公司 |
| 15 | 三氟乙酸(TFA) | 上海金锦乐实业公司 |
| 16 | N-甲基吗啡啉(NMM，d=0.9168) | 上海科帆化工公司 |
| 17 | 二乙丙基乙基胺(DIPEA，d=0.742) | 国药集团化学试剂公司 |
| 18 | 氯化亚砜(d=1.638) | 国药集团化学试剂公司 |
| 19 | 三异丙基硅烷(TIS，无色液体) | 吉尔生化 |
| 20 | 乙腈 | 美国Merck公司 |
| 21 | 甲醇(MeOH) | 上海振兴化工一厂 |
| 22 | 六氢吡啶(PIP，又称为哌啶) | 上海金锦乐实业公司 |
| 23 | Rink-amidMBHA resin(0.84mmol/g) | 吉尔生化 |
| 24 | HBTU(苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐) | 吉尔生化 |
| 25 | DIPEA(N,N-二异丙基乙基胺，亦称为DIEA) | 上海达瑞精公司 |
| 26 | 吡啶 | 成都市科龙化工厂 |
| 27 | 醋酐 | 上海晶纯试剂公司 |
| 28 | DCM(二氯甲烷) | 无锡化工试剂厂 |
| 29 | DMF(二甲基甲酰胺，又称为N,N’-二甲基甲酰胺) | 无锡化工试剂厂 |
| 30 | PIP(哌啶，又称为六氢吡啶) | 宜兴市第二化学厂 |
| 31 | TFA(三氟乙酸) | 上海达瑞公司 |
| 32 | EDT(1,2-乙二硫醇，无色液体) | 吉尔生化 |
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明，而不是限制本发明。在下面的例子中。下文制备步骤为了举例的目的，并基于各举例的可比较性而作了某些具体描述，本领域技术人员根据已有知识完全可以从中概括得到本发明主张的保护范围。
实施例1：制备生长抑素
(1)制备Fmoc-Cys(Trt)-树脂
称取2.22kg的2-氯三苯基醇树脂(100-150目，0.7mmol/g)，加入50L多肽合成仪，加入14L的DCM，室温搅拌溶胀l小时。搅拌下，30分钟内通过恒压漏斗缓慢滴加3.6kg氯化亚砜(d=1.638)，再于室温搅拌反应3小时。
抽干，用72L的DCM分6次洗涤，每次用12L的DCM，搅拌15分钟后抽干。
加入7L的DMF，再加入用7L的DMF溶解的Fmoc-Cys(Trt)-OH(加入量是树脂量的1.5倍(摩尔))，DIPEA1.187kg，于35±3℃反应1.5小时。再加甲醇2.5L，34.5±2.5℃反应30分钟。抽干，树脂用甲醇洗涤一次，用DMF洗五次，抽干。操作中进行KT检测，显黄色；若不黄色，则需延长反应时间。
(2)制备Fmoc-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂
在步骤(1)的Fmoc-Cys(Trt)-树脂中，加入重量浓度为25%PIP的DMF溶液14.5kg，33.5±1.5℃脱帽反应24分钟，抽干，用DMF洗涤，抽干。取少量树脂(1～3mg)利用茚三酮反应检测，显蓝色；若不显蓝色，则延长脱帽反应时间(下面的操作均进行此检测步骤)；
加入用7L的DMF溶解的Fmoc-Ser(tBu)-OH2.4kg、TBTU2.01kg，HOBT0.85kg和NMM926g的混合物，34.5±2.5℃缩合反应1.5小时，抽干，分别用DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂。反应中用KT检测，显黄色；若不黄色，则需延长反应时间(下面的操作均进行此检测步骤)。
(3)制备Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂
在步骤(2)的Fmoc-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入重量浓度为25%PIP的DMF溶液14.5kg，33.5±1.5℃脱帽反应24分钟，抽干，用甲醇洗涤一次，用DMF洗五次，抽干。
加入用7L的DMF溶解的Fmoc-Thr(tBu)-OH2.49kg、TBTU2.01kg、HOBT0.85kg和NMM926g的混合物，34.5±2.5℃缩合反应1.5小时，抽干，用DMF洗涤二次，抽干，获得Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂。
(4)制备Fmoc-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂
在步骤(3)的Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入重量浓度为25%PIP的DMF溶液14.5kg，33.5±1.5℃脱帽反应24分钟，抽干，用甲醇洗涤一次，用DMF洗五次，抽干。
加入用7L的DMF溶解的Fmoc-Phe-OH2.42kg、TBTU2.01kg、HOBT0.85kg和NMM926g的混合物，34.5±2.5℃缩合反应1.5小时，抽干，用DMF洗涤二次，抽干，获得Fmoc-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂。
(5)制备Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂
在步骤(4)的Fmoc-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入重量浓度为25%PIP的DMF溶液14.5kg，33.5±1.5℃脱帽反应24分钟，抽干，用甲醇洗涤一次，用DMF洗五次，抽干。
加入用7L的DMF溶解的Fmoc-Thr(tBu)-OH2.49kg TBTU2.01kg、HOBT0.85kg和NMM926g的混合物，34.5±2.5℃缩合反应1.5小时，抽干，用DMF洗涤二次，抽干，获得Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂。
(6)制备Fmoc-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂
在步骤(5)的Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入重量浓度为25%PIP的DMF溶液14.5kg，33.5±1.5℃脱帽反应24分钟，抽干，用甲醇洗涤一次，用DMF洗五次，抽干。
加入用7L的DMF溶解的Fmoc-Lys(Boc)-OH2.93kg、TBTU2.01kg、HOBT0.85kg和NMM926g的混合物，34.5±2.5℃缩合反应1.5小时，抽干，用DMF洗涤二次，抽干，获得Fmoc-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂。
(7)制备Fmoc-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂
在步骤(6)的Fmoc-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入重量浓度为25%PIP的DMF溶液14.5kg,33.5±1.5℃脱帽反应24分钟，抽干，用甲醇洗涤一次，用DMF洗五次，抽干。
加入用7L的DMF溶解的Fmoc-Trp-OH2.66kg、TBTU2.01kg、HOBT0.85kg和NMM926g的混合物，34.5±2.5℃缩合反应1.5小时，抽干，用DMF洗涤二次，抽干，获得Fmoc-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂。
(8)制备Fmoc-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂
在步骤(7)的Fmoc-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入重量浓度为25%PIP的DMF溶液14.5kg,33.5±1.5℃脱帽反应24分钟，抽干，用甲醇洗涤一次，用DMF洗五次，抽干。
加入用7L的DMF溶解的Fmoc-Phe-OH2.42kg、TBTU2.01kg、HOBT0.85kg和NMM926g的混合物，34.5±2.5℃缩合反应1.5小时，抽干，用DMF洗涤二次，抽干，获得Fmoc-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂。
(9)制备Fmoc-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树
脂
在步骤(8)的Fmoc-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入重量浓度为25%PIP的DMF溶液14.5kg,33.5±1.5℃脱帽反应24分钟，抽干，用甲醇洗涤一次，用DMF洗五次，抽干。
加入用DMF7L试剂溶解的Fmoc-Phe-OH2.42kg、TBTU2.01kg、HOBT0.85kg和NMM926g的混合物，34.5±2.5℃缩合反应1.5小时，抽干，用DMF洗涤二次，抽干，获得Fmoc-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)树脂。
(10)制备Fmoc-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-C
ys(Trt)-树脂
在步骤(9)的Fmoc-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入25%PIP的DMF溶液14.5kg,33.5±1.5℃脱帽反应24分钟，抽干，用甲醇洗涤一次，用DMF洗五次，抽干。
加入用7L的DMF溶解的Fmoc-Asn(Trt)-OH3.73kg、TBTU2.01kg、HOBT0.85kg和NMM926g以及乳酸(Fmoc-Asn(Trt)-OH与乳酸的摩尔比为1：0.05)的混合物，34.5±2.5℃缩合反应1.5小时，抽干，用DMF洗涤二次，抽干，获得Fmoc-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)树脂。
本步骤所得肽偶合树脂Fmoc-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)树脂，经检测，偶联率达0.92。该Fmoc-Gly-树脂用于后续的反应步骤。
在一个补充的试验步骤中，重复以上步骤(10)，不同的是在缩合反应中Fmoc-Asn(Trt)-OH与乳酸的摩尔比为1：0.02，得到肽偶合树脂，经检测，偶联率达0.91。在一个补充的试验步骤中，重复以上步骤(10)，不同的是在缩合反应中Fmoc-Asn(Trt)-OH与乳酸的摩尔比为1：0.1，得到肽偶合树脂，经检测，偶联率达0.93。在一个补充的试验步骤中，重复以上步骤(10)，不同的是在缩合反应中Fmoc-Asn(Trt)-OH与乳酸的摩尔比为1：0.08，得到肽偶合树脂，经检测，偶联率达0.90。在一个补充的试验步骤中，重复以上步骤(10)，不同的是在缩合反应中不加乳酸(该缩合反应与CN102952175A中的[0115]至[0117]段中的操作相同)，得到肽偶合树脂，经检测，偶联率达0.71。在一个补充的试验步骤中，重复以上步骤(10)，不同的是在缩合反应中Fmoc-Asn(Trt)-OH与乳酸的摩尔比为1：0.01，得到肽偶合树脂，经检测，偶联率达0.74。在一个补充的试验步骤中，重复以上步骤(10)，不同的是在缩合反应中Fmoc-Asn(Trt)-OH与乳酸的摩尔比为1：0.15，得到肽偶合树脂，经检测，偶联率达0.81。在一个补充的试验步骤中，重复以上步骤(10)，不同的是在缩合反应中Fmoc-Asn(Trt)-OH与乳酸的摩尔比为1：0.25，得到肽偶合树脂，经检测，偶联率达0.41。在一个补充的试验步骤中，照CN1508152A(中国专利申请号02155189.8，常州四药)说明书实施例9的方法进行操作，得到肽偶合树脂，经检测，偶联率达0.69。在一个补充的试验步骤中，照CN1552728A(中国专利申请号03128951.7，上海子能)说明书[0105]至[0106]段的方法进行操作，得到肽偶合树脂，经检测，偶联率达0.63。在一个补充的试验步骤中，照CN1923851A(中国专利申请号200510029220.8，上海子能)说明书第11/12页1-7行的方法制备Fmoc-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)树脂，得到肽偶合树脂，经检测，偶联率达0.66。从以上补充试验可见，在缩合反应中加入适量的乳酸对于提高偶联率是有益的，特别是Fmoc-Asn(Trt)-OH与乳酸的摩尔比为1：0.02～0.1范围内是有益的。本步骤之前或者之后的其它各步骤的缩合反应的偶联率均在0.82～0.85之间，经试验发现在这些缩合反应中添加乳酸不能有效地提高偶联率。
(11)制备Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-S
er(tBu)-Cys(Trt)-树脂
在步骤(10)的Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入重量浓度为25%PIP的DMF溶液14.5kg，33.5±1.5℃脱帽反应24分钟，抽干，用甲醇洗涤一次，用DMF洗五次，抽干。
加入用DMF7L试剂溶解的Fmoc-Lys(Boc)-OH2.93kg、TBTU2.01kg、HOBT0.85kg和NMM926g的混合物，34.5±2.5℃缩合反应1.5小时，抽干，用DMF洗涤二次，抽干，获得Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂。
(12)制备Fmoc-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-T
hr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂
在步骤(11)的Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入重量浓度为25%PIP的DMF溶液14.5kg，33.5±1.5℃脱帽反应24分钟，抽干，用甲醇洗涤一次，用DMF洗五次，抽干。
加入用7L的DMF试剂溶解的Fmoc-Cys(Trt)-OH3.66kg、TBTU2.01kg、HOBT0.85kg和NMM926g的混合物，34.5±2.5℃缩合反应1.5小时，抽干，用DMF洗涤二次，抽干，获得Fmoc-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂。
(13)制备Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-P
he-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂
在步骤(12)的Fmoc-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入重量浓度为25%PIP的DMF溶液14.5kg,33.5±1.5℃脱帽反应24分钟，抽干，用甲醇洗涤一次，用DMF洗五次，抽干。
加入用7L的DMF溶解的Fmoc-Gly-OH1.86kg、TBTU2.01kg、HOBT0.85kg和NMM926g的混合物，34.5±2.5℃缩合反应1.5小时，抽干，用DMF洗涤二次，抽干，获得Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂。
(14)制备Boc-Ala-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)
-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂
在步骤(13)的Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入重量浓度为25%PIP的DMF溶液14.5kg，33.5±1.5℃脱帽反应24分钟，抽干，用甲醇洗涤一次，用DMF洗五次，抽干。
加入用7L的DMF溶解的Boc-Ala-OH1.18kg、TBTU2.01kg、HOBT0.85kg和NMM926g的混合物，34.5±2.5℃缩合反应1.5小时，抽干，用DMF洗涤二次，抽干，获得Boc-Ala-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂，得保护的十四肽树脂6.65kg。
(15)制备Ala-Gly-Cys(SH)-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys(SH)-O
H
在步骤(14)的Boc-Ala-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂(1kg)中，加入预冷至5±2℃的10L切肽试剂(TFA:TIS:EDT:H2O:醋酐=95:2:2:2:0.2，体积比)，室温反应4.0小时；滤取反应液，用适量TFA洗涤树脂3次，合并滤液减压浓缩至初始体积的10%左右，加入预先冷冻的无水乙醚(冷冻至-10℃以下)，按每1g肽树脂所得切肽液加入无水乙醚12mL的比例加入浓缩液中，摇匀后在-10℃以下静止沉淀至溶液澄清，过滤，滤饼用冷冻无水乙醚洗涤再次，P2O5真空干燥，获得切肽后的还原型生长抑素。测定其氨基酸比值，分别为：门冬氨酸0.99，甘氨酸1.03，丙氨酸0.97，苯丙氨酸3.08，丝氨酸0.95，苏氨酸1.91，半胱氨酸1.97，赖氨酸2.06，表明8种氨基酸比值与药典规定相符。
在一个补充的试验步骤中，重复以上步骤(15)，不同的是切肽试剂为TFA:TIS:EDT:H2O:醋酐=95:1:3:3:0.1(体积比)，所得还原型生长抑素其氨基酸比值，均在药典规定范围内。在一个补充的试验步骤中，重复以上步骤(15)，不同的是切肽试剂为TFA:TIS:EDT:H2O:醋酐=95:3:1:1:0.3(体积比)，所得还原型生长抑素其氨基酸比值，均在药典规定范围内。在一个补充的试验步骤中，重复以上步骤(15)，不同的是切肽试剂中未添加醋酐，所得还原型生长抑素其氨基酸比值，结果显示以下三种氨基酸未在药典规定范围内：半胱氨酸<1.4(为1.22)、丝氨酸<0.7(为0.53)、苏氨酸<1.4(为1.16)；造成此结果的可能原因是切肽时会从肽链的中间切断，肽链中的一部分(接近树脂的三个氨基酸半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸)未切下来，切下的有相当一分部是十一肽，从而造成切下的十四肽相对量较少，而杂肽例如十一肽较多，造成上述三个氨基酸比值偏低；虽然这种包括较多杂肽的还原型生长抑素可通过后续工艺例如可通过后续的纯化工艺除去，但是显然会增加后续的处理难度和工艺成本。在一个补充的试验步骤中，重复以上步骤(15)，不同的是切肽试剂为TFA:TIS:EDT:H2O:醋酐=95:2:2:2:0.05(体积比)，所得还原型生长抑素其氨基酸比值，结果显示以下三种氨基酸未在药典规定范围内：半胱氨酸<1.4(为1.27)、丝氨酸<0.7(为0.59)、苏氨酸<1.4(为1.36)；表明醋酐量较少时切肽效果不理想。在一个补充的试验步骤中，重复以上步骤(15)，不同的是切肽试剂为TFA:TIS:EDT:H2O:醋酐=95:2:2:2:1(体积比)，所得还原型生长抑素其氨基酸比值，结果显示8种氨基酸比值均不符合药典规定；表明醋酐量过多时切肽效果不理想。在一个补充的试验步骤中，照CN102952175A说明书[0130]至[0131]段中的操作进行切肽，结果显示以下三种氨基酸未在药典规定范围内：半胱氨酸<1.4(为1.24)、丝氨酸<0.7(为0.61)、苏氨酸<1.4(为1.32)。在一个补充的试验步骤中，照CN1508152A(中国专利申请号02155189.8，常州四药)说明书实施例13的方法进行切肽，结果显示以下三种氨基酸未在药典规定范围内：半胱氨酸<1.4(为1.29)、丝氨酸<0.7(为0.62)、苏氨酸<1.4(为1.24)。在一个补充的试验步骤中，照CN1552728A(中国专利申请号03128951.7，上海子能)说明书[0116]段的方法进行切肽，结果显示以下三种氨基酸未在药典规定范围内：半胱氨酸<1.4(为1.31)、丝氨酸<0.7(为0.60)、苏氨酸<1.4(为1.26)。在一个补充的试验步骤中，照CN1923851A(中国专利申请号200510029220.8，上海子能)说明书第12/12页10-16行的方法进行切肽，结果显示以下三种氨基酸未在药典规定范围内：半胱氨酸<1.4(为1.26)、丝氨酸<0.7(为0.67)、苏氨酸<1.4(为1.32)。
从以上补充试验可见，在切肽反应中加入适量的醋酐对于降低杂肽含量是有益的，特别是切割液中五种组分的体积比为：TFA:TIS:EDT:H2O:醋酐=95:(1-3):(1-3):(1-3):(0.1-0.3)范围内是有益的。
本发明涉及的氨基酸比值测定方法为(其可用于测定还原型生长抑素或者生长抑素)：取本品，加6mol/L盐酸溶液，于110℃小解24小时后，照氨基酸分析方法测定；以门冬氨酸、丙氨酸、赖氨酸、甘氨酸和苯丙氨酸摩尔数总和的八分之一作为1，计算各氨基酸的相对比值。通常而言(例如中国药典2010版收载的生长抑素中有相同规定，在本发文中可称为药典规定)，对于生长抑素(不论是还原型还是氧化型)，其中各氨基酸的相对比值为：门冬氨酸0.90-1.10，甘氨酸0.90-1.10，丙氨酸0.90-1.10，苯丙氨酸2.7-3.3，丝氨酸0.7-1.05，苏氨酸1.4-2.1，半胱氨酸1.4-2.1，赖氨酸1.8-2.2。
(16)氧化环合制备
将上一步骤所得还原型生长抑素用6倍量的50%冰醋酸溶解，然后用纯化水稀释至含冰醋酸30%，搅拌均匀后过滤，得滤液；在搅拌下向该滤液中滴加饱和I2(碘，其量为还原型生长抑素的2.2摩尔倍)/冰醋酸溶液，至溶液呈红棕色，继续搅拌30min，再加入少量饱和Vc水溶液至红棕色消失；减压浓缩、P2O5真空干燥，得到经二硫键形成环的生长抑素。
(17)精制纯化
将上一步骤所得生长抑素粗品溶于5%醋酸(可缩写为HAc)，用离子交换色谱系统(Shodex IEC SP-420N，北京谱朋公司)，经5%HAc洗脱分离后，收集生长抑素主峰流分。然后将主峰流分通过反向色谱柱用等度洗脱。
反向色谱洗脱条件如下：色谱仪：岛津-高效液相色谱仪；色谱柱：Lichrospher RP-18色谱柱；流动相：20%CH3CN/H2O；流速：10ml/min；紫外检测波长：280nm。
将收集所得主峰流动相浓缩后，用冷冻干燥机冻干，冷冻干燥后得生长抑素精制品。计算总收率为29.43%。
本实施例获得的生长抑素精制品，其经生长抑素原料药2010年版药典记载的标准测定，完全符合该标准的规定。例如其按无水、无醋酸物计，含生长抑素(C76H104N18O1 9S2)为99.95%；按无水、无醋酸物计，比旋度为-42.4°；经氨基酸比值测定，结果：门冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸均在0.95～1.05之间，苏氨酸、半胱氨酸、赖氨酸均在1.92～3.06之间，苯丙氨酸在2.9-3.1范围内。有关物质：最大单一杂质小于0.25%，总杂质小于0.45%，表明本发明产物具有良好的纯度。
在一个补充的试验步骤中，照CN102952175A说明书[0087]至[0134]段的方法制备生长抑素，结果最大单一杂质0.65%，总杂质1.35%。在一个补充的试验步骤中，照CN1508152A说明书实施例1至实施例16的方法制备生长抑素，结果最大单一杂质0.87%，总杂质1.95%。
实施例2：制备生长抑素
照实施例1的方法进行，不同的仅是改用rink amide MBHA树脂。
结果显示，在步骤(10)中偶联率大于0.90；步骤(10)中氨基酸比值与药典规定相符；17个步骤总收率大于28%；终产物的含量、比旋度、氨基酸比值均符合药典规定；最大单一杂质小于0.30%，总杂质小于0.50%。
实施例3：制备生长抑素
照实施例1的方法进行，不同的仅是将各步骤中的TBTU替换为HATU，NMM替换为DIPEA。结果显示，在步骤(10)中偶联率大于0.90；步骤(10)中氨基酸比值与药典规定相符；17个步骤总收率大于28%；终产物的含量、比旋度、氨基酸比值均符合药典规定；最大单一杂质小于0.30%，总杂质小于0.50%。
实施例4：制备生长抑素
照实施例1的方法进行，不同的仅是在步骤(2)～(14)中，以2-氯三苯基醇树脂为基准，各组分的量改为：重量浓度为25%的PIP：2-氯三苯基醇树脂=8：1(重量比)；具有保护基团的氨基酸：2-氯三苯基醇树脂=3：1(摩尔比)；DMF与2-氯三苯基醇树脂的重量比8：1；TBTU与2-氯三苯基醇树脂的摩尔比3：1；HOBT与2-氯三苯基醇树脂的摩尔比4：1；NMM与2-氯三苯基醇树脂的摩尔比6：1。结果显示，在步骤(10)中偶联率大于0.90；步骤(10)中氨基酸比值与药典规定相符；17个步骤总收率大于28%；终产物的含量、比旋度、氨基酸比值均符合药典规定；最大单一杂质小于0.30%，总杂质小于0.50%。
实施例5：制备生长抑素
照实施例1的方法进行，不同的仅是在步骤(2)～(14)中，以2-氯三苯基醇树脂为基准，各组分的量改为：重量浓度为27%的PIP：2-氯三苯基醇树脂=6：1(重量比)；具有保护基团的氨基酸：2-氯三苯基醇树脂=4：1(摩尔比)；DMF与2-氯三苯基醇树脂的重量比6：1；TBTU与2-氯三苯基醇树脂的摩尔比4：1；HOBT与2-氯三苯基醇树脂的摩尔比3：1；NMM与2-氯三苯基醇树脂的摩尔比8：1。结果显示，在步骤(10)中偶联率大于0.90；步骤(10)中氨基酸比值与药典规定相符；17个步骤总收率大于28%；终产物的含量、比旋度、氨基酸比值均符合药典规定；最大单一杂质小于0.30%，总杂质小于0.50%。
Claims (10)
1.制备生长抑素的方法，其包括以下步骤：
(a)向经浸泡处理的固相合成用树脂中加入溶解于溶剂中的Fmoc-Cys(Trt)-OH和有机碱，使物料进行反应以形成Fmoc-Cys(Trt)-树脂；
(b)向上一步骤所得的肽偶合树脂中加入脱帽试剂，使物料进行反应以脱帽；接着加入溶解于溶剂中的保护氨基酸Fmoc-Ser(tBu)-OH、肽偶联剂、酰胺键形成促进剂和有机碱，使物料进行偶联反应(亦可称为缩合反应)，以形成Fmoc-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；
(c)循环重复步骤(b)，并在每一循环操作的偶联反应中依次使用下列氨基酸以替换保护氨基酸Fmoc-Ser(tBu)-OH：Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Trp-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Boc-Ala-OH，以最终形成保护的十四肽树脂：Boc-Ala-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；
(d)向步骤(c)所得十四肽树脂中加入切割液以同时进行脱保护和切肽反应，以使十四肽从树脂上切割下来并脱除保护基，得到还原型生长抑素；
(e)将步骤(d)所得还原型生长抑素溶解于酸中，加入氧化剂进行氧化反应，得到下式所示生长抑素：
(f)对步骤(e)所得生长抑素进行纯化的步骤。
2.根据权利要求1的方法，其中步骤(a)中，
所述树脂选自：2-氯三苯基醇树脂、rink amide MBHA树脂、rink amide am树脂、knorr树脂、或其组合；
所述树脂浸泡处理是照如下方式进行的：取树脂置于反应器中，加入溶剂(例如二氯甲烷、甲醇、乙醇、氯仿、三氟乙酸、DMF、或其组合)振荡并充分浸泡，抽除溶剂；
所述树脂在经浸泡处理后、进行偶联反应之前，还包括对该树脂进行脱帽处理的步骤；在一个实施方案中，步骤(a)中脱帽试剂是氯化亚砜；在一个实施方案中，步骤(a)中2-氯三苯基醇树脂与氯化亚砜的重量比为1：1～2；和/或
所述有机碱例如但不限于：NMM、DIPEA、三甲基吡啶、或其组合；在一个实施方案中，所述有机碱与树脂的摩尔比为5～7：1；；在一个实施方案中，所述Fmoc-Cys(Trt)-OH与树脂的摩尔比为1～2：1。
3.根据权利要求1至2的方法，其中步骤(b)中，
所述脱帽试剂选自哌啶、二乙胺、三乙胺、三氟乙酸；
所述脱帽反应是在选自下列的溶剂中进行的：二氯甲烷、二甲基甲酰胺；
所述脱帽反应是在25～27%的哌啶/二甲基甲酰胺溶液中进行的，优选是在26%的哌啶/二甲基甲酰胺溶液中进行的；
所述脱帽反应是在32～35°C温度下进行的，反应时间为10～50min；
还包括在完成脱帽反应后对获得的树脂进行清洗的操作，所述清洗是使用选自下列的溶剂清洗处理1～3次、甲醇、乙醇、氯仿、三氟乙酸、DMF、或其组合；和/或
还包括在脱帽反应期间或者脱帽反应后采用茚三酮检测法检测脱帽反应进行程度。
4.根据权利要求1至3的方法，其中步骤(b)中，
所述肽偶联剂选自：DCC、DIC、HATU)、HBTU、HCTU、TATU、TBTU、或其组合；
所述酰胺键形成促进剂例如但不限于：HOAT、HOBT、6-Cl-HOBt、或其组合；
所述有机碱例如但不限于：NMM、DIPEA、三甲基吡啶、或其组合；
用于进行偶联反应的所述溶剂例如但不限于：二氯甲烷、二甲基甲酰胺等；
所述树脂与所述Fmoc-Ser(tBu)-OH的投料比为1：2～5(摩尔比)，优选1：3～4；
所述肽偶联剂的加入量是树脂量的2～5倍(摩尔倍)，优选3～4倍；
所述酰胺键形成促进剂的加入量是树脂量的2～5倍(摩尔倍)，优选3～4倍；
所述有机碱的加入量是树脂量的5～10倍(摩尔倍)，优选6～8倍；和/或
所述溶剂的加入量是树脂量的5～10倍(重量倍)，优选6～8倍。
5.根据权利要求1至4的方法，其中步骤(c)中，
第一循环操作使用Fmoc-Thr(tBu)-OH作为保护氨基酸，得到Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；
第二循环操作使用Fmoc-Phe-OH作为保护氨基酸，得到Fmoc-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；
第三循环操作使用Fmoc-Thr(tBu)-OH作为保护氨基酸，得到Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；
第四循环操作使用Fmoc-Lys(Boc)-OH作为保护氨基酸，得到Fmoc-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；
第五循环操作使用Fmoc-Trp-OH作为保护氨基酸，得到Fmoc-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；
第六循环操作使用Fmoc-Phe-OH作为保护氨基酸，得到Fmoc-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；
第七循环操作使用Fmoc-Phe-OH作为保护氨基酸，得到Fmoc-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；
第八循环操作使用Fmoc-Asn(Trt)-OH作为保护氨基酸，得到Fmoc-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；
第九循环操作使用Fmoc-Lys(Boc)-OH作为保护氨基酸，得到Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；
第十循环操作使用Fmoc-Cys(Trt)-OH作为保护氨基酸，得到Fmoc-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；
第十一循环操作使用Fmoc-Gly-OH作为保护氨基酸，得到Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；和/或
第十二循环操作使用Boc-Ala-OH作为保护氨基酸，得到Boc-Ala-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂，约得保护的十四肽树脂。
6.根据权利要求1至5的方法，其中在第八循环操作使用Fmoc-Asn(Trt)-OH作为保护氨基酸进行偶联反应的过程中，与Fmoc-Asn(Trt)-OH一起加入适量乳酸进行反应；在一个实施方案中，所述Fmoc-Asn(Trt)-OH与乳酸的摩尔比为1：0.01-0.2，优选1：0.02-0.1。
7.根据权利要求1至6的方法，其中，
步骤(a)、步骤(b)、和步骤(c)中的所述偶联反应是在32-37°C温度下进行的，反应时间为20～200min，例如60～90min；和/或
其中在各步骤中进行脱帽反应时，是在32～35℃进行的。
8.根据权利要求1至7的方法，其中步骤(d)中，
所述切割液中包含TFA、TIS、EDT、H2O；
所述切割液中四种组分的体积比为：TFA:TIS:EDT:H2O=90-98:1-5:1-5:1-5；
所述切割液中五种组分的体积比为：TFA:TIS:EDT:H2O:醋酐=90-98:1-5:1-5:1-5:0.1-0.5；
所述切肽反应是在室温进行的，优选是在20±5°C下进行的；和/或
在完成切肽反应后，除去切割液，然后加入乙醚进行沉淀，收集沉淀物，用乙醚洗涤，干燥，获得还原型生长抑素固体；
9.根据权利要求1至8的方法，其中步骤(e)中
所述氧化反应是如下进行的：将还原型生长抑素用50%冰醋酸溶解，然后用纯化水稀释至含冰醋酸30%，搅拌均匀后过滤，得滤液；在搅拌下向该滤液中滴加饱和I2/冰醋酸溶液，至溶液呈红棕色，继续搅拌30min，再加入少量饱和Vc水溶液至红棕色消失；减压浓缩得到经二硫键形成环的生长抑素；
在经步骤(e)氧化反应获得生长抑素粗品后，还进一步包括对该生长抑素粗品进行纯化的步骤；进一步地，所述纯化步骤是照如下方式进行的：将生长抑素粗品用醋酸水溶液溶解，过滤，滤液过离子交换柱并用该醋酸水溶液洗脱，收集流出主峰，然后再经过C18柱纯化，收集主峰流出液，冷冻干燥，即得生长抑素精制品。
10.权利要求1至9任一项所述方法获得的生长抑素，例如其中最大单一杂质小于0.30%，总杂质小于0.50%。
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