CN110950933B

CN110950933B - 一种布美诺肽的固液相合成方法

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Publication number: CN110950933B
Application number: CN201911339658.4A
Authority: CN
Inventors: 陈丰; 诸旻; 陈辉; 顾海东; 金晶
Original assignee: Suzhou University of Science and Technology
Current assignee: Suzhou University of Science and Technology
Priority date: 2019-12-23
Filing date: 2019-12-23
Publication date: 2021-07-16
Anticipated expiration: 2039-12-23
Also published as: CN110950933A

Abstract

本发明公开了一种布美诺肽的固液相合成方法。本发明布美诺肽的固液相合成方法，通过液相法合成AC‑Nle‑Asp‑O‑2‑Phipr二肽片段，在Lys的主链和侧链分别进行偶联延长肽序，得到Fmoc‑His(Boc)‑D‑Phe‑Arg(pbf)‑Trp(Boc)‑Lys(AC‑Nle‑Asp‑O‑2‑Phipr)‑王树脂，切除保护基后主链和侧链进行环化，避免了首尾折叠成环，解决了折叠成环位阻大的问题，并且由于成环位点更接近，已成环的肽对未成环的肽的影响也降低至最小。并且本发明不采用碱进行水解，不会产生相应的杂质。本发明布美诺肽的合成方法合成布美诺肽纯度高、成本低，适合规模化生产的布美诺肽。

Description

一种布美诺肽的固液相合成方法

技术领域

本发明涉及一种布美诺肽的固液相合成方法，属于多肽合成技术领域。

背景技术

布美诺肽，英文名Bremelanotide，最初由亚利桑那大学研究开发，作用靶点为MC3R/MC4R，结构属于肽类似物，用于治疗绝经前女性性欲障碍；Paladin公司于2007年获得该化合物的研发权利，随后进入开发，临床研究集中于北美；2018年3月向美国FDA提交了NDA申请，2019年6月21获FDA批准上市。布美诺肽由7个氨基酸组成，与α-促黑素细胞激素具有相同的核心序列，后者的受体在食欲及性欲唤起中起重要作用。其肽序为AC-Nle-[Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys]cycle-OH，结构式如下：

布美诺肽是由7个氨基酸组成的环肽，其合成的技术难点在于成环。目前布美诺肽的合成技术根据成环方法可分为两类，一类是液相中成环，一类是树脂上成环。在液相中成环容易产生大量分子间偶联产物，生成二肽，三肽等副反应，影响收率；为了抑制副反应的生成，必须降低反应浓度，会产生大量的废水，不利于环保；并且操作比较麻烦。因此，固相成环方法的研究更值得探索。

目前，布美诺肽的合成方法主要为固相合成法。固相成环主要是偶联完主链后脱去保护，肽链首尾相连，但是肽链因空间位阻太大，难以折叠至首尾相连，因而导致效率不高，导致空间位阻大的主要原因包括以下两个方面：（1）肽链上的各种保护基结构，使得肽链具有刚性结构，难以折叠回来成环；（2）成环以后，环肽在树脂上具有了更大的空间结构，使得未成环的肽难以折叠回来成环。专利CN200610086841.4采用逐步合成的方法，肽树脂合成结束后，选择性脱除Asp及Lys的保护基，之后在树脂上成环，最后以HF裂解，因为HF的剧烈腐蚀性而导致该方法无法大规模使用，其实施例公布的精肽收率为30～35％；专利CN200710048824.6同样采用选择性脱保护的方法，但其所选择的的脱保护方法在脱除Asp及Lys侧链保护基的同时也会脱除His的保护基Trt，其实施例公布的粗肽收率为80％；专利CN200910131598.7布美诺肽的固相合成方法中将对羟基苯甲酸连接在RinkAmideResin之后，再采用普通氨基酸原料逐步合成，合成结束后以TFA裂解，在液相条件下成环，但是在进行液相成环时容易发生分子间偶联，产生二聚体，三聚体等多聚物，严重降低合成收率；专利201610070195.6中将HO-(CH2)n-COOH作为连接固相载体与目标肽的linker，在树脂上成环，该方法改造了树脂的linker结构，在羧基端引入长链脂键，克服了空间位阻大的第二个原因，但是难以折叠成环的问题并没有太好的作用，并且在切除脂键的过程中用到了碱性溶液，溶液产生各种降解杂质，影响收率和纯度。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种布美诺肽的固液相合成方法，通过液相法合成AC-Nle-Asp-O-2-Phipr二肽片段，在Lys的主链和侧链分别进行偶联延长肽序，得到Fmoc-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys(AC-Nle-Asp-O-2-Phipr)-王树脂，切除保护基后主链和侧链进行环化，避免了首尾折叠成环，解决了折叠成环位阻大的问题，并且由于成环位点更接近，已成环的肽对未成环的肽的影响也降低至最小。

本发明的第一个目的是提供一种固液相结合制备布美诺肽的方法，包括如下步骤：

（1）通过液相合成法合成二肽片段AC-Nle-Asp-O-2-Phipr；

（2）通过固相合成法，在偶联体系中，偶联Fmoc-Lys(R1)-OH到固相载体树脂上，Fmoc-Lys(R1)-树脂；

（3）选择性脱除Lys侧链上的保护基，在Lys侧链上偶联步骤（1）制备得到的二肽片段AC-Nle-Asp-O-2-Phipr；

（4）脱除Lys上的保护基Fmoc，在偶联体系下，依次偶联Trp、Arg、D-Phe和His保护基氨基酸，得到布美诺肽全保护肽树脂；

（5）依次脱除布美诺肽全保护肽树脂中Arg侧链上的保护基O-2-Phipr和His上的保护基Fmoc，在偶联体系下进行环化；

（6）裂解、纯化、冻干后得到布美诺肽。

进一步地，所述Trp、Arg、D-Phe和His保护基氨基酸依次为Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Phe-OH和Fmoc-His(Boc)-OH。

进一步地，所述的固相载体树脂为王树脂，所述王树脂的取代度为0.05-0.90mmol/g。

进一步地，所述的Lys侧链上的保护基R1为IVDde或者Dde。

进一步地，所述的偶联体系包括缩合剂和反应溶剂；所述的缩合剂为DIC、HOBt、PyBOP、HOBt、DIEA、HATU、HOBt、DIEA中的一种或几种；所述的反应溶剂为DMF、DCM、NMP、DMSO中的一种或几种。

进一步地，在步骤（1）中，液相合成法合成二肽片段AC-Nle-Asp-O-2-Phipr具体包括：合成AC-Nle-OSu和H-Asp-O-2-Phipr，将AC-Nle-OSu、H-Asp-O-2-Phipr和Na₂CO₃溶解到到THF和水的混合溶液中，20~30^oC反应10~20小时，制备得到二肽片段AC-Nle-Asp-O-2-Phipr。

进一步地，所述的Lys侧链上的保护基的脱除条件为采用1~5%体积浓度的水合肼/DMF溶液处理4~8min，重复2~3次。

进一步地，所述的Arg侧链上的保护基O-2-Phipr的脱除条件为采用0.8~2%体积浓度的TAF/DMF溶液处理4~8min，重复2~3次。

进一步地，所述的His上的保护基Fmoc的脱除条件为采用DMF:吡啶体积比为3~5:1的混合溶液处理4~8min，重复2~3次。

进一步地，所述的裂解的裂解试剂为TFA、苯甲硫醚、TIS、EDT和H₂O的混合溶剂，其中体积比为：TFA:苯甲硫醚:TIS:EDT:H₂O＝90~95:1~5:1~5:1~5:1~5。

本发明的有益效果是：

本发明的固液相结合制备布美诺肽的方法，通过液相法合成AC-Nle-Asp-O-2-Phipr二肽片段，在Lys的主链和侧链分别进行偶联延长肽序，得到Fmoc-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys(AC-Nle-Asp-O-2-Phipr)-王树脂，切除保护基后主链和侧链进行环化，避免了首尾折叠成环，解决了折叠成环位阻大的问题，并且由于成环位点更接近，已成环的肽对未成环的肽的影响也降低至最小。并且本发明不采用碱进行水解，不会产生相应的杂质。本发明布美诺肽的合成方法合成布美诺肽纯度高、成本低，适合规模化生产的布美诺肽。

附图说明

图1为本发明布美诺肽的质谱图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

本发明使用的缩写具有如下含义：

Fmoc：芴甲氧羰基Otbu：叔丁氧基 BOC: 叔丁氧羰基

HOBt:1-羟基苯骈三唑 DIC:N,N-二异丙基碳二亚胺

DMF:N,N-二甲基甲酰胺 TFA:三氟乙酸

PyBop：六氟磷酸苯并三唑-１-基氧基三吡咯烷基磷

Lys：赖氨酸

His：组氨酸

Asp：天冬氨酸

Nle：新亮氨酸

Trp：色氨酸

Arg：精氨酸

Phe：苯丙氨酸

Boc：叔丁氧羰基

Pbf：2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰

DMF：N，N-二甲基甲酰胺Piperdine：六氢吡啶

O-2-Phipr：O-2-苯基异丙基

OAll：羧基烯丙基酯

Dde：1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己亚基)乙基

IVDde：1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己基亚甲基)-3-甲基丁基

TFA：三氟乙酸 HAC：醋酸

PyBop：六氟磷酸苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷基磷

Trt：2-氯三苯基 DCM: 二氯甲烷 THF:四氢呋喃 EDT：乙二硫醇

DIEA：二异丙基乙胺

HATU：2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐

DMSO：二甲基亚砜

HOSu：N-羟基琥珀酰亚胺

实施例1：AC-Nle-OSu活化酯的合成

称取173.21g AC-Nle-OH（1.0mol），138.10g HOSu（1.2mol）加入2000ml DMF中，冰水浴下加入247.59g DCC（1.2mol），反应1小时，升温到室温反应3小时，反应液过滤，母液旋干，加DCM溶解，过滤，冰乙醇重结晶3次，过滤，固体油泵拉干得到240.57g AC-Nle-OSu活化酯，收率89%。

实施例2：H-Asp-O-2-Phipr的合成

称取395.41g Fmoc-Asp(OAll)-OH（1.0mol），加入3000ml 二氯甲烷中，冰浴下滴加用5000ml正己烷溶解的561.16g 2,2,2-三氯亚氨基乙酸2-苯基丙烷-2-基酯（2.0mol），室温反应16小时。冰浴下滴加用2000ml 二氯甲烷溶解的198.65g氯甲酸2-苯基丙烷-2-基酯（1.0mol），室温反应16小时。浓缩溶液。加入2000ml THF溶解，加入60g Pd(PPh₃)4 (0.05mol)和244 mL PhSiH3 (2.0mol），室温反应2小时。浓缩溶液。4000ml 二氯甲烷和1000ml的二异丙基乙胺。室温反应0.5小时。浓缩溶液。冰乙醇重结晶3次，过滤，固体油泵拉干得到201.02g H-Asp-O-2-Phipr，收率80%。

实施例3：AC-Nle-Asp-O-2-Phipr的合成

称取125.76g H-Asp-O-2-Phipr（0.5mol）、135.15g AC-Nle-OSu（0.5mol）和79.50g Na₂CO₃（0.75mol）加入到500ml水和500ml THF的混合溶液中溶解，室温下反应过夜，用10%稀盐酸调节pH到7，旋蒸除去THF，之后调节pH到3。得到大量白色沉淀，过滤。将得到的白色沉淀用冰乙醇重结晶，得到的固体在盐酸二氧六环溶液中搅拌重结晶2小时，得到的固体油泵拉干的到172.55g AC-Nle-Asp-O-2-Phipr，收率85%。

实施例4：取代度为0.60mmol/g的Fmoc-Lys(Dde)-王树脂的合成

称取取代度为1.0mmol/g的王树脂20g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取5.33g Fmoc-Lys(Dde)-OH(100mmol)、13.51g HOBt(100mmol)用DMF溶解，冰水浴下加入12.62g DIC(100mmol)活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，5分钟后加入1.22g DMAP(10mmol)，反应2小时后，用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，用200ml体积比为1:1的醋酸酐和吡啶封端过夜，甲醇收缩干燥，得到Fmoc-Lys(Dde)-王树脂，检测替代度为0.60mmol/g。

实施例5：取代度为0.90mmol/g的Fmoc-Lys(Dde)-王树脂的合成

称取取代度为1.25mmol/g的王树脂20g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取6.66g Fmoc-Lys(Dde)-OH(125mmol)、16.89g HOBt(125mmol)用DMF溶解，冰水浴下加入15.78g DIC(125mmol)活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，5分钟后加入1.53g DMAP(12.5mmol)，反应2小时后，用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，用200ml体积比为1:1的醋酸酐和吡啶封端过夜，甲醇收缩干燥，得到Fmoc-Lys(Dde)-王树脂，检测替代度为0.90 mmol/g。

实施例6：Fmoc-Lys(Dde)-王树脂中侧链保护基Dde的脱除

称取10.50g（10mmol）取代度为0.60mmol/g的Fmoc-Lys(Dde)-王树脂，加入固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DMF溶胀Fmoc-Lys(Dde)-王树脂30分钟后，用DMF:吡啶体积比为4:1的混合溶液脱去Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，用3%的水合肼的DMF溶液，对树脂进行两次脱除，每次5分钟左右，然后用DCM，DMF分别交替洗涤树脂五次。

实施例7：Fmoc-Lys(Dde)-王树脂中Lys侧链上偶联二肽片段AC-Nle-Asp-O-2-Phipr

称取12.18g AC-Nle-Asp-O-2-Phipr（30mmol）、4.05g HOBt（30mmol）加入体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入3.79g DIC（30mmol）活化后，加入上述装有实施例六树脂的反应柱中，室温下反应2小时后，以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需要再反应1小时，此判断标准适用于后续氨基酸偶联中以茚三酮法检测判断反应终点。

实施例8：Fmoc-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys(AC-Nle-Asp-O-2-Phipr)-王树脂的合成

将实施例7的树脂，用DMF:吡啶体积比为4:1的混合溶液脱去Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，称取15.80g Fmoc-Trp(Boc)-OH（30mmol）、4.05g HOBt（30mmol）加入体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入3.79g DIC（30mmol）活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，室温下反应2小时后，以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需要再反应1小时，此判断标准适用于后续氨基酸偶联中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，依次完成Fmoc-Arg(pbf)-OH，Fmoc-D-Phe-OH，Fmoc-His(Boc)-OH的偶联。

实施例9：Fmoc-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys(AC-Nle-Asp-O-2-Phipr)-王树脂中侧链保护基O-2-Phipr的脱除

用1%的TAF的DCM溶液，对上述实施例8树脂进行两次脱除，每次5分钟左右，然后用DCM，DMF分别交替洗涤树脂五次，得到Fmoc-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys(AC-Nle-Asp-OH)-王树脂。

实施例10：Fmoc-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys(AC-Nle-Asp-OH)-王树脂中侧链保护基Fmoc的脱除

用DMF:吡啶体积比为4:1的混合溶液，对上述实施例9树脂进行两次脱除，每次5分钟左右，然后用DCM，DMF分别交替洗涤树脂五次，得到H-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys(AC-Nle-Asp-OH)-王树脂。

实施例11：AC-Nle-[Asp-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys]cycle-王树脂的合成

依次向实施例10制备得到的得到H-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys(AC-Nle-Asp-OH)-王树脂中加100ml DMF、11.38克HBTU（30mmol）、3.4毫升NMM（30mmol），振荡反应1小时，取少许树脂做茚三酮检测，呈阴性，抽出反应液，再用DMF振荡洗涤树脂3次，甲醇洗涤树脂3次，真空干燥8小时，得到AC-Nle-[Asp-His(Boc)-D-Phe- Arg(pbf)- Trp(Boc)-Lys]cycle-王树脂。

实施例12：裂解

向实施例11制得的AC-Nle-[Asp-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys]cycle-王树脂中加入其200ml裂解试剂，在25℃条件下反应3h后，抽滤，将滤液加至其10倍体积预冷的乙醚中进行沉淀、离心，再用乙醚将沉淀洗涤四次，真空干燥得到布美诺肽，裂解试剂为TFA、苯甲硫醚、TIS、EDT和H₂O的混合溶剂，其中体积比为：TFA:苯甲硫醚:TIS:EDT:H₂O＝90:5:2:2:1。得到白色布美诺肽固体10.13g，粗肽纯度97.5％，粗肽收率为98.5％。

实施例13：纯化

将上述布美诺肽固体采用1L体积比为95:5的水/乙腈溶解，以0.45μm滤膜过滤备用。内径为100mm的C18制备柱，流动相A为0.1％TFA/水，流动相B为0.1％TFA/乙腈，上样量为500ml/针，流速300ml/min，检测波长210nm。梯度洗脱，峰前和峰后循环进样，得到中控分析纯度大于99.2％的精肽溶液，以醋酸/乙腈/水体系转盐后冻干得布美诺肽精肽8.81g，纯度99.6％，总收率86％。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims

1.一种布美诺肽的固液相合成方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)通过液相合成法合成二肽片段AC-Nle-Asp-O-2-Phipr；

(2)通过固相合成法，在偶联体系中，偶联Fmoc-Lys(R1)-OH到固相载体树脂上，得到Fmoc-Lys(R1)-树脂；所述的Lys侧链上的保护基R1为IVDde或者Dde；

(3)选择性脱除Lys侧链上的保护基，在Lys侧链上偶联步骤(1)制备得到的二肽片段AC-Nle-Asp-O-2-Phipr；

(4)脱除Lys上的保护基Fmoc，在偶联体系下，依次偶联Trp、Arg、D-Phe和His保护基氨基酸，得到布美诺肽全保护肽树脂；

(5)依次脱除布美诺肽全保护肽树脂中Asp侧链上的保护基O-2-Phipr和His上的保护基Fmoc，在偶联体系下进行环化；

(6)裂解、纯化、冻干后得到布美诺肽；

所述的固相载体树脂为王树脂，所述王树脂的取代度为0.05-0.90mmol/g。

2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述Trp、Arg、D-Phe和His保护基氨基酸依次为Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Phe-OH和Fmoc-His(Boc)-OH。

3.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述的偶联体系包括缩合剂和反应溶剂；所述的缩合剂为DIC、HOBt、PyBOP、HOBt、DIEA、HATU、HOBt、DIEA中的一种或几种；所述的反应溶剂为DMF、DCM、NMP、DMSO中的一种或几种。

4.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，在步骤(1)中，液相合成法合成二肽片段AC-Nle-Asp-O-2-Phipr具体包括：合成AC-Nle-OSu和H-Asp-O-2-Phipr，将AC-Nle-OSu、H-Asp-O-2-Phipr和Na₂CO₃溶解到到THF和水的混合溶液中，20～30℃反应10～20小时，制备得到二肽片段AC-Nle-Asp-O-2-Phipr。

5.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述的Lys侧链上的保护基的脱除条件为采用1～5％体积浓度的水合肼/DMF溶液处理4～8min，重复2～3次。

6.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述的Asp侧链上的保护基O-2-Phipr的脱除条件为采用0.8～2％体积浓度的TAF/DMF溶液处理4～8min，重复2～3次。

7.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述的His上的保护基Fmoc的脱除条件为采用DMF:吡啶体积比为3～5:1的混合溶液处理4～8min，重复2～3次。

8.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述的裂解的裂解试剂为TFA、苯甲硫醚、TIS、EDT和H₂O的混合溶剂，其中体积比为：TFA:苯甲硫醚:TIS:EDT:H₂O＝90～95:1～5:1～5:1～5:1～5。