CN110885360A - 一种固相合成帕瑞肽的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及多肽药物化学合成技术领域，尤其为一种固相合成帕瑞肽的制备方法，包括以下步骤S1，将Fmoc‑Hyp[Boc‑(2‑aminoethyl)carboxyl]‑OH连接到2‑CTC Resin载体上，依照Fmoc固相多肽合成原理和肽序，合成六肽全保护片段H‑Phg‑D‑Trp(Boc)‑Lys(Boc)‑Tyr(Bzl)‑Phe‑Hyp[Boc‑(2‑aminoethyl)carboxyl]‑OH；S2，在液相体系中用缩合试剂将六肽片段进行环化得到环肽片段Cyclo‑[Phg‑D‑Trp(Boc)‑Lys(Boc)‑Tyr(Bzl)‑Phe‑Hyp[Boc‑(2‑aminoethyl)carboxyl]]，设计使用固液相结合的方法合成帕瑞肽，反应条件温和，操作简便，粗品纯度和产率高，消旋少，成本低，环境污染小，适合于工业化生产。

Description

一种固相合成帕瑞肽的制备方法
技术领域
本发明涉及多肽药物化学合成技术领域，具体为一种固相合成帕瑞肽的制备方法。
背景技术
帕瑞肽(Pasireotide)肽序为：Cyclo-[Phg1-D-Trp2-Lys3-Tyr(Bzl)4-Phe5-Hyp(2-aminoethylcarboxyl)6]，分子式：C58H66N10O9,分子量为1047.23，其结构式如下：
Figure BDA0002227197540000011
帕瑞肽是一种生长抑素(Somatostatin，SST)类似物，通过与生长抑素受体(SSTreceptor，SSTR)结合，主要发挥抑制性生物学作用。该多肽为瑞士诺华制药公司研制生产，2012年4月25日，已获欧洲药品管理署(EMA)下属人用药品委员会(CHMP)批准用于治疗无法手术或手术治疗失败的成人库欣病患者。2015年3月15日，中国国家食品药品监督管理总局(CFDA)批准诺华公司的门冬氨酸帕瑞肽注射液中国上市，商品名为Signifor(丝尼芬)。
目前国内关于帕瑞肽合成的情况大致如下：如专利CN103641894A中报道，制备线性保护肽时使用了侧链没有保护的羟脯氨酸，序列偶联氨基酸时会有酰化的副反应，再用Boc-NH-C2H4-NH-COOH与羟脯氨酸的侧链羟基酯化反应没有方法检测，且酯化不完全会影响帕瑞肽的收率与纯度。在专利CN104447962A中使用Fmoc-Lys-OAll连接到2-CTC Resin载体上，合成得到线性肽树脂，环化前脱除OAll需要使用昂贵的四(三苯基磷)钯，操作繁琐且产品容易引人重金属钯，购买特殊氨基酸Fmoc-Lys-OAll，Fmoc-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]-OH成本高且不易大量获得，不利于规模化生产。
综上所述，本发明提出一种固相合成帕瑞肽的制备方法来解决存在的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种固相合成帕瑞肽的制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种固相合成帕瑞肽的制备方法，包括以下步骤：
S1，将Fmoc-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]-OH连接到2-CTC Resin载体上，依照Fmoc固相多肽合成原理和肽序，合成六肽全保护片段H-Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]-OH即：首先，称取2-CTC Resin(1.04mmol/g)于固相多肽合成反应器中，加入DCM溶涨30min，抽掉，称取Fmoc-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]-OH并加入约DMF溶解同时冰水浴降温，加入DIPEA活化10min后将氨基酸活化液加入到反应柱中反应，5min后再向反应器中加入DIPEA继续反应约2h。反应结束后，依次加入DMF，MTBE,DMF交替洗涤2遍，将预先配制好的封闭液DCM/MeOH/DIPEA＝17/2/1(V/V/V)倒入树脂中封闭未反应的功能基团，封闭两次，每次10min，封闭结束后，加入DMF洗涤，并用MTBE收缩树脂，转移至真空干燥箱干燥至恒重，取树脂测得取代度为0.719mmol/g，其次，称取Fmoc-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]-O-CTC Resin于多肽合成反应器中，加入DCM溶涨30min,抽掉，加入适量5％PIP/2％DBU/1％HOBt/DMF溶液脱保护两次，分别为10min,20min，加入DMF,MTBE,DMF交替洗涤2轮，称取Fmoc-Phe-OH,2.03gHOBt于烧杯中，加入DMF溶解，再加入2.62mLDIPEA在冰水浴条件下降温至0～5℃，最后加入5.69gHBTU活化约10min，将活化液倒入反应器中反应，以茚三酮检测判定缩合是否完全，反应结束后，按照脱保护、洗涤、缩合循环进入下一步氨基酸的缩合,缩合的保护氨基酸依次为：Fmoc-Tyr(Bzl)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-D-Trp(Boc)-OH,Fmoc-Phg-OH；最后，将上述所得片段(1-6)肽树脂加入到280mL1％TFA/DCM(V/V)溶液中搅拌10min,将滤液抽至含适量吡啶的抽滤瓶中，重复三次，合并滤液并浓缩，将滤液加入到适量纯水中，有白色固体析出，滤除固体并真空干燥至恒重，得固体，测得ESI-MS；
S2，在液相体系中用缩合试剂将六肽片段进行环化得到环肽片段Cyclo-[Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]]，即：称取全保护六肽片段于烧瓶中并加入适量THF搅拌至溶解，用DIPEA调pH至中性，称取HOBt于烧杯中，加入THF搅拌至溶解，随后加入DIPEA并用冰水浴降温至-5℃，再加入3.66gHBTU，保持-5℃反应1h后自然回至室温反应3h，可通过TLC或者HPLC监控反应进程，反应结束后，减压旋蒸溶剂THF至20％体积，冷却后挤兑到适量的5％磷酸水溶液中，打浆，过滤，滤饼再用5％磷酸水溶液打浆洗涤2遍，饱和碳酸氢钠水溶液洗涤3遍，水洗涤3遍，正庚烷洗涤1遍，过滤并真空干燥得到白色固体，测得ESI-MS；
S3，在液相体系下，用适当比例，浓度TFA/H2O/TIS，条件下酸解脱除环肽片段上Boc保护基，并用冰冻MTBE或乙醚沉降，过滤及干燥得到帕瑞肽粗品Cyclo-[Phg-D-Trp-Lys-Tyr(Bzl)-Phe-Hyp(2-aminoethylcarboxyl)]，即将上述所得全保护环肽Cyclo-[Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]]片段溶于预先冷至0-5℃的100mL95％TFA/2.5％H2O/2.5％TIS溶液中，搅拌至全溶并控制溶液温度不超过15℃，然后将反应升温到25±2℃，搅拌反应30分钟，将切割液加入到冰冻MTBE中，析出固体并过滤，用MTBE洗涤固体3～4遍，将固体转移至真空干燥器中干燥至恒重，称量所得固体重,测得ESI-MS,粗品HPLC纯度，收率。
优选的，所述S1，Fmoc-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]-OH通过DIPEA作用连接到2-CTC Resin载体上,且制得Fmoc-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]-CTC Resin替代度为0.20mmol/g～1.00mmol/g。
优选的，所述S1，合成全保护六肽片段时所使用的保护氨基酸如下：Fmoc-Phe-OH,Fmoc-Tyr(Bzl)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-D-Trp(Boc)-OH,Fmoc-Phg-OH，投料摩尔比为1.5～6倍。
优选的，所述S1，Fmoc-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]-OH氨基酸，其由Z-Hyp-OBzl为起始原料合成。
优选的，所述S2，在制备全保护环肽片段时，液相体系为DMF，DCM或者DMF/DCM；环化缩合试剂使用HBTU/HOBt/DIPEA,反应pH值为6～10。
优选的，所述S3，酸解采用的体积百分比为80％-95％的TFA、体积百分比为1％-5％的H2O、体积百分比为1％-5％的TIS的混合酸解液；沉降所使用的冰冻MTBE或乙醚用量为反应液体积的6～12倍。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明中，通过设计使用固液相结合的方法合成帕瑞肽，该方法合成的粗品纯度≥77％，合成收率≥90％，消旋少且反应条件温和，操作简便，生产周期短，成本较低，环境污染小，便于规模化生产，有广泛的应用前景和较好的经济社会价值。
附图说明
图1为本发明工艺流程结构示意图；
图2为本发明帕瑞肽粗品HPLC图结构示意图；
图3为本发明Fmoc-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]-OH的HPLC结构示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例,基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-3，本发明提供一种技术方案：
一种固相合成帕瑞肽的制备方法，包括以下步骤：
S1，将Fmoc-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]-OH连接到2-CTC Resin载体上，依照Fmoc固相多肽合成原理和肽序，合成六肽全保护片段H-Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]-OH即：首先，称取2-CTC Resin(1.04mmol/g)于固相多肽合成反应器中，加入DCM溶涨30min，抽掉，称取Fmoc-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]-OH并加入约DMF溶解同时冰水浴降温，加入DIPEA活化10min后将氨基酸活化液加入到反应柱中反应，5min后再向反应器中加入DIPEA继续反应约2h，反应结束后，依次加入DMF，MeOH,DMF交替洗涤2遍，将预先配制好的封闭液DCM/MeOH/DIPEA＝17/2/1(V/V/V)倒入树脂中封闭未反应的功能基团，封闭两次，每次10min，封闭结束后，加入DMF洗涤，并用MeOH收缩树脂，转移至真空干燥箱干燥至恒重，取树脂测得取代度为0.719mmol/g，其次，称取Fmoc-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]-O-CTC Resin于多肽合成反应器中，加入DCM溶涨30min,抽掉，加入适量5％PIP/1.25％DBU/1％HOBt/DMF溶液脱保护两次，分别为10min,20min，加入DMF,MTBE,DMF交替洗涤2轮，称取Fmoc-Phe-OH,2.03gHOBt于烧杯中，加入DMF溶解，再加入2.62mLDIPEA在冰水浴条件下降温至0～5℃，最后加入5.69gHBTU活化约10min，将活化液倒入反应器中反应，以茚三酮检测判定缩合是否完全，反应结束后，按照脱保护、洗涤、缩合循环进入下一步氨基酸的缩合,缩合的保护氨基酸依次为：Fmoc-Tyr(Bzl)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-D-Trp(Boc)-OH,Fmoc-Phg-OH；最后，将上述所得片段(1-6)肽树脂加入到280mL1％TFA/DCM(V/V)溶液中搅拌10min,将滤液抽至含适量吡啶的抽滤瓶中，重复三次，合并滤液并浓缩，将滤液加入到适量纯水中，有白色固体析出，滤除固体并真空干燥至恒重，得固体，测得ESI-MS；
S2，在液相体系中用缩合试剂将六肽片段进行环化得到环肽片段Cyclo-[Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]]，即：称取全保护六肽片段于烧瓶中并加入适量THF搅拌至溶解，用DIPEA调pH至中性，称取HOBt于烧杯中，加入THF搅拌至溶解，随后加入DIPEA并用冰水浴降温至-5℃，再加入3.66gHBTU，保持-5℃反应1h后自然回至室温反应3h，可通过TLC或者HPLC监控反应进程，反应结束后，减压旋蒸溶剂THF至20％体积，冷却后挤兑到适量的5％磷酸水溶液中，打浆，过滤，滤饼再用5％磷酸水溶液打浆洗涤2遍，饱和碳酸氢钠水溶液洗涤3遍，水洗涤3遍，正庚烷洗涤1遍，过滤并真空干燥得到白色固体，测得ESI-MS；
S3，在液相体系下，用适当比例，浓度TFA/H2O/TIS，条件下酸解脱除环肽片段上Boc保护基，并用冰冻MTBE或乙醚沉降，过滤及干燥得到帕瑞肽粗品Cyclo-[Phg-D-Trp-Lys-Tyr(Bzl)-Phe-Hyp(2-aminoethylcarboxyl)]，即将上述所得全保护环肽Cyclo-[Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]]片段溶于预先冷至0-5℃的100mL95％TFA/2.5％H2O/2.5％TIS溶液中，搅拌至全溶并控制溶液温度不超过15℃，然后将反应升温到25±2℃，搅拌反应30分钟，将切割液加入到冰冻MTBE中，析出固体并过滤，用MTBE洗涤固体3～4遍，将固体转移至真空干燥器中干燥至恒重，称量所得固体重,测得ESI-MS,粗品HPLC纯度，收率。
上述步骤中，制得的Fmoc-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]-CTC树脂替代度范围为0.20mmo/g～1.00mmol/g,优先选择0.70mmol/g～0.90mmol/g；3合成全保护六肽时所用的保护氨基酸为：Fmoc-Phe-OH,Fmoc-Tyr(Bzl)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-D-Trp(Boc)-OH,Fmoc-Phg-OH，投料摩尔比为1.5～6倍，优先选择1.5倍；在液相体系中将六肽片段进行环化时采用的缩合试剂为：DIC/Y,EDC.HCl/Y,HBTU/Y/Z,HATU/Y/Z,HCTU/Y/Z,TBTU/Y/Z,PyBOP/Y/Z,PyAOP/Y/Z；其中Y＝HOBt或HOAt或Cl-HOBt,Z＝DIPEA或NMM或TMP，优先选择HBTU/HOBt/DIPEA，液相体系为DMF，DCM或者DMF/DCM，优先选择DMF，反应pH值为6～10，优先选择PH＝9～10；酸解采用的体积百分比为80％-95％的TFA、体积百分比为1％-5％的H2O和体积百分比为1％-5％的TIS的混合酸解液，优先选择95％TFA/2.5％H2O/2.5％TIS；沉降所使用的冰冻MTBE或乙醚用量为反应液体积的6～12倍，优先选择8～10倍。
具体实施例：
参考图2：帕瑞肽粗品HPLC图：保留时间RT＝8.156min,纯度77.08％。
参考图3：Fmoc-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]-OH的HPLC图，保留时间RT＝27.362min,纯度98.7.％。
文中使用的缩写或英文全称的含义列于下表：
Figure BDA0002227197540000071
Figure BDA0002227197540000081
Figure BDA0002227197540000091
实施例1：
步骤1：全保护六肽H-Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]-OH的合成：
称取33.5g 2-CTC Resin(1.04mmol/g)于固相多肽合成反应器中，加入DCM溶涨30min，抽掉。称取28.2g Fmoc-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]-OH并加入约135mLDMF溶解同时冰水浴降温，加入6.07mLDIPEA活化10min后将氨基酸活化液加入到反应柱中反应，5min后再向反应器中加入12.14mLDIPEA继续反应约2h。反应结束后，依次加入DMF，MTBE,DMF交替洗涤2遍，将预先配制好的封闭液DCM/MeOH/DIPEA＝17/2/1(V/V/V)倒入树脂中封闭未反应的功能基团，封闭两次，每次10min。封闭结束后，加入DMF洗涤，并用MTBE收缩树脂，转移至真空干燥箱干燥至恒重，取树脂测得取代度为0.719mmol/g。
称取13.9g(10mmol)Fmoc-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]-O-CTC Resin于多肽合成反应器中，加入DCM溶涨30min,抽掉，加入适量5％PIP/2％DBU/1％HOBt/DMF溶液脱保护两次，分别为10min,20min。加入DMF,MeOH,DMF交替洗涤2轮。称取5.81gFmoc-Phe-OH,2.03gHOBt于烧杯中，加入DMF溶解，再加入2.62mLDIPEA在冰水浴条件下降温至0～5℃，最后加入5.69gHBTU活化约10min，将活化液倒入反应器中反应，以茚三酮检测判定缩合是否完全。反应结束后，按照脱保护、洗涤、缩合循环进入下一步氨基酸的缩合,缩合的保护氨基酸依次为：Fmoc-Tyr(Bzl)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-D-Trp(Boc)-OH,Fmoc-Phg-OH，将上述所得27.98g片段(1-6)肽树脂加入到280mL1％TFA/DCM(V/V)溶液中搅拌10min,将滤液抽至含适量吡啶的抽滤瓶中，重复三次，合并滤液并浓缩，将滤液加入到适量纯水中，有白色固体析出，滤除固体并真空干燥至恒重，得固体13.67g，测得ESI-MS：[M+H]+＝1366.90。
步骤2：环肽片段Cyclo-[Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]]的合成：
称取11g全保护六肽片段于烧瓶中并加入适量THF搅拌至溶解，用DIPEA调pH至中性。称取1.087gHOBt于烧杯中，加入THF搅拌至溶解，随后加入6mLDIPEA并用冰水浴降温至-5℃，再加入3.66gHBTU，保持-5℃反应1h后自然回至室温反应3h，可通过TLC或者HPLC监控反应进程，反应结束后，减压旋蒸溶剂THF至20％体积，冷却后挤兑到适量的5％磷酸水溶液中，打浆，过滤，滤饼再用5％磷酸水溶液打浆洗涤2遍，饱和碳酸氢钠水溶液洗涤3遍，水洗涤3遍，正庚烷洗涤1遍，过滤并真空干燥得到10.38g白色固体，测得ESI-MS：[M+H]+＝1349.95。
步骤3：裂解脱除侧链保护得到帕瑞肽粗品：
将上述所得10g全保护环肽Cyclo-[Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]]片段溶于预先冷至0-5℃的100mL95％TFA/2.5％H2O/2.5％TIS溶液中，搅拌至全溶并控制溶液温度不超过15℃，然后将反应升温到25±2℃，搅拌反应30分钟。将切割液加入到1000mL冰冻MTBE中，析出固体并过滤，用MTBE洗涤固体3～4遍，将固体转移至真空干燥器中干燥至恒重，称量所得固体重为7.32g,测得ESI-MS：[M+H]+＝1047.98,粗品HPLC纯度为77.08％，收率为94.36％。
实施例二：
步骤1：全保护六肽H-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]-Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-OH的合成：
称取20g 2-CTC Resin(1.04mmol/g)于固相多肽合成反应器中，加入DCM溶涨30min，抽掉。称取12.08g Fmoc-Phe-OH并加入约80mLDMF溶解同时冰水浴降温，加入3.62mLDIPEA活化10min后将氨基酸活化液加入到反应柱中反应，5min后再向反应器中加入7.246mLDIPEA继续反应约2h，反应结束后，依次加入DMF，MeOH,DMF交替洗涤2遍，将预先配制好的封闭液DCM/MeOH/DIPEA＝17/2/1(V/V/V)倒入树脂中封闭未反应的功能基团，封闭两次，每次10min。封闭结束后，加入DMF洗涤，并用MeOH收缩树脂，转移至真空干燥箱干燥至恒重，取树脂测得取代度为0.84mmol/g。
称取11.9g(10mmol)Fmoc-Phe-O-CTC Resin于多肽合成反应器中，加入DCM溶涨30min,抽掉。加入适量5％PIP/1.25％DBU/1％HOBt/DMF溶液脱保护两次，分别为10min,20min。加入DMF,MeOH,DMF交替洗涤2轮。称取7.40gFmoc-Tyr(Bzl)-OH,2.03gHOBt于烧杯中，加入DMF溶解，再加入2.62mLDIPEA在冰水浴条件下降温至0～5℃，最后加入5.69gHBTU活化约10min，将活化液倒入反应器中反应，以茚三酮检测判定缩合是否完全。反应结束后，按照脱保护、洗涤、缩合循环进入下一步氨基酸的缩合,缩合的保护氨基酸依次为Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-D-Trp(Boc)-OH,Fmoc-Phg-OH,Fmoc-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]-OH。
将上述所得24.97g片段(1-6)肽树脂加入到280mL1％TFA/DCM(V/V)溶液中搅拌10min,将滤液抽至含适量吡啶的抽滤瓶中，重复三次，合并滤液并浓缩，将滤液加入到适量纯水中，有白色固体析出，滤除固体并真空干燥至恒重，得固体12.89g，测得ESI-MS：[M+H]+＝1366.90。
步骤2：环肽片段Cyclo-[Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]-Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe]的合成：
称取12g全保护六肽片段于烧瓶中并加入适量THF搅拌至溶解，用DIPEA调pH至中性。称取1.186gHOBt于烧杯中，加入THF搅拌至溶解，随后加入6.545mLDIPEA并用冰水浴降温至-5℃，再加入3.993gHBTU，保持-5℃反应1h后自然回至室温反应3h，可通过TLC或者HPLC监控反应进程。反应结束后，减压旋蒸溶剂THF至20％体积，冷却后挤兑到适量的5％磷酸水溶液中，打浆，过滤，滤饼再用5％磷酸水溶液打浆洗涤2遍，饱和碳酸氢钠水溶液洗涤3遍，水洗涤3遍，正庚烷洗涤1遍，过滤并真空干燥得到10.98g白色固体，测得ESI-MS：[M+H]+＝1349.95。
步骤3：裂解脱除侧链保护得到帕瑞肽粗品：
将上述所得5g全保护环肽Cyclo-[Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]-Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe]片段溶于预先冷至0-5℃的50mL95％TFA/2.5％H2O/2.5％TIS溶液中，搅拌至全溶并控制溶液温度不超过15℃，然后将反应升温到25±2℃，搅拌反应30分钟。将切割液加入到500mL冰冻MTBE中，析出固体并过滤，用MTBE洗涤固体3～4遍，将固体转移至真空干燥器中干燥至恒重，称量所得固体重为3.49g,测得ESI-MS：[M+H]+＝1047.98,粗品HPLC纯度为76.2％，收率为90％。
实施例三：
步骤1：全保护六肽H-Tyr(Bzl)-Phe-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]-Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-OH的合成：
称取20g 2-CTC Resin(1.04mmol/g)于固相多肽合成反应器中，加入DCM溶涨30min，抽掉。称取11.694g Fmoc-Lys(Boc)-OH并加入约80mLDMF溶解同时冰水浴降温，加入3.62mLDIPEA活化10min后将氨基酸活化液加入到反应柱中反应，5min后再向反应器中加入7.246mLDIPEA继续反应约2h。反应结束后，依次加入DMF，MeOH,DMF交替洗涤2遍，将预先配制好的封闭液DCM/MeOH/DIPEA＝17/2/1(V/V/V)倒入树脂中封闭未反应的功能基团，封闭两次，每次10min。封闭结束后，加入DMF洗涤，并用MeOH收缩树脂，转移至真空干燥箱干燥至恒重，取树脂测得取代度为0.70mmol/g。
称取14.28g(10mmol)Fmoc-Lys(Boc)-OH-O-CTC Resin于多肽合成反应器中，加入DCM溶涨30min,抽掉，加入适量5％PIP/1.25％DBU/1％HOBt/DMF溶液脱保护两次，分别为10min,20min，加入DMF,MeOH,DMF交替洗涤2轮，称取7.90gFmoc-D-Trp(Boc)-OH,2.03gHOBt于烧杯中，加入DMF溶解，再加入2.62mLDIPEA在冰水浴条件下降温至0～5℃，最后加入5.69gHBTU活化约10min，将活化液倒入反应器中反应，以茚三酮检测判定缩合是否完全，反应结束后，按照脱保护、洗涤、缩合循环进入下一步氨基酸的缩合,缩合的保护氨基酸依次为Fmoc-Phg-OH,Fmoc-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]-OH,Fmoc-Phe-OH,Fmoc-Tyr(Bzl)-OH。
将上述所得26.2g片段(1-6)肽树脂加入到262mL1％TFA/DCM(V/V)溶液中搅拌10min,将滤液抽至含适量吡啶的抽滤瓶中，重复三次，合并滤液并浓缩，将滤液加入到适量纯水中，有白色固体析出，滤除固体并真空干燥至恒重，得固体12.93g，测得ESI-MS：[M+H]+＝1366.90。
步骤2：环肽片段Cyclo-[Tyr(Bzl)-Phe-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]-Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)]的合成：
称取10g全保护六肽片段于烧瓶中并加入适量THF搅拌至溶解，用DIPEA调pH至中性。称取0.988gHOBt于烧杯中，加入THF搅拌至溶解，随后加入5.45mLDIPEA并用冰水浴降温至-5℃，再加入3.33gHBTU，保持-5℃反应1h后自然回至室温反应3h，可通过TLC或者HPLC监控反应进程。反应结束后，减压旋蒸溶剂THF至20％体积，冷却后挤兑到适量的5％磷酸水溶液中，打浆，过滤，滤饼再用5％磷酸水溶液打浆洗涤2遍，饱和碳酸氢钠水溶液洗涤3遍，水洗涤3遍，正庚烷洗涤1遍，过滤并真空干燥得到9.18g白色固体，测得ESI-MS：[M+H]+＝1349.95。
步骤3：裂解脱除侧链保护得到帕瑞肽粗品：
将上述所得5g全保护环肽Cyclo-[Tyr(Bzl)-Phe-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]-Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)]片段溶于预先冷至0-5℃的50mL95％TFA/2.5％H2O/2.5％TIS溶液中，搅拌至全溶并控制溶液温度不超过15℃，然后将反应升温到25±2℃，搅拌反应30分钟，将切割液加入到500mL冰冻MTBE中，析出固体并过滤，用MTBE洗涤固体3～4遍，将固体转移至真空干燥器中干燥至恒重，称量所得固体重为3.61g,测得ESI-MS：[M+H]+＝1047.98,粗品HPLC纯度为76.7％，收率为93.07％。
实例：原料Fmoc-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]的合成路线如下：
Figure BDA0002227197540000141
称量Z-Hyp-OBzl(76.98g，216.61mmoL，1.0eq)溶解在600mL无水DCM中，溶清后加入CDI(45.66g，281.6mmoL，1.3eq)于反应瓶中，N2保护下常温25℃下反应，TLC监控反应。3小时后原料完全转化为活性中间体。称量N-Boc-Ethylenediamine(69.41g,433.22mmoL,2.0eq)缓慢加入到上述反应瓶中，反应TLC监控。3小时后，反应完全，补加300mL DCM,再加入300mL水洗涤有机层，分层，有机层再用5％磷酸水溶液洗涤3遍，水洗涤1遍，饱和碳酸氢钠水溶液洗涤3遍，水洗涤3遍，饱和食盐水洗涤1遍，无水硫酸镁干燥，过滤，滤液减压旋蒸得到Z-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]-OBzl粗品：129.06g，纯度97.5％，将上述所得的110g Z-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]-OBzl溶解在650ml甲醇溶液中，氮气置换3次，加入适量的10％湿钯炭，氮气置换3次，氢气置换3次，在25℃氢化2小时，过滤漏斗加硅藻土过滤钯炭，滤液旋干得到H-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]-OH粗品:64g。将上述所得的H-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]-OH(62.9g，198.21mmoL，1.0eq)溶解在碳酸氢钠水溶液(49.95g，3.0eq，1260mL水)，搅拌溶解10分钟，再加入500mL THF搅拌溶解30分钟，溶清后冰水浴冷却至2-5℃备用。再称取Fmoc-OSu(80.23g，237.85mmoL，1.2eq)溶解在650mL THF中，缓慢加入到上述溶液中，保持反应PH＝8～9，反应用TLC监控。反应完成后，加入PE萃取3次，再用1N盐酸溶液调节PH＝5～6，加入适量的乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯层再用5％磷酸水溶液洗涤3次，水洗涤2次，饱和食盐水洗涤1次，有机层用无水硫酸镁干燥，过滤，旋干溶剂得到Fmoc-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]-OH粗品：99.46g，纯度93.8％，将粗品用乙酸乙酯/石油醚重结晶一次得到89.51g，纯度98.7％。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种固相合成帕瑞肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，将Fmoc-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]-OH连接到2-CTC Resin载体上，依照Fmoc固相多肽合成原理和肽序，合成六肽全保护片段H-Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]-OH即：首先，称取2-CTC Resin(1.04mmol/g)于固相多肽合成反应器中，加入DCM溶涨30min，抽掉，称取Fmoc-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]-OH并加入约DMF溶解同时冰水浴降温，加入DIPEA活化10min后将氨基酸活化液加入到反应柱中反应，5min后再向反应器中加入DIPEA继续反应约2h，反应结束后，依次加入DMF，MTBE,DMF交替洗涤2遍，将预先配制好的封闭液DCM/MeOH/DIPEA＝17/2/1(V/V/V)倒入树脂中封闭未反应的功能基团，封闭两次，每次10min，封闭结束后，加入DMF洗涤，并用MTBE收缩树脂，转移至真空干燥箱干燥至恒重，取树脂测得取代度为0.719mmol/g，其次，称取Fmoc-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]-O-CTC Resin于多肽合成反应器中，加入DCM溶涨30min,抽掉，加入适量5％PIP/2％DBU/1％HOBt/DMF溶液脱保护两次，分别为10min,20min，加入DMF,MeOH,DMF交替洗涤2轮，称取Fmoc-Phe-OH,2.03gHOBt于烧杯中，加入DMF溶解，再加入2.62mLDIPEA在冰水浴条件下降温至0～5℃，最后加入5.69gHBTU活化约10min，将活化液倒入反应器中反应，以茚三酮检测判定缩合是否完全，反应结束后，按照脱保护、洗涤、缩合循环进入下一步氨基酸的缩合,缩合的保护氨基酸依次为：Fmoc-Tyr(Bzl)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-D-Trp(Boc)-OH,Fmoc-Phg-OH；最后，将上述所得片段(1-6)肽树脂加入到280mL1％TFA/DCM(V/V)溶液中搅拌10min,将滤液抽至含适量吡啶的抽滤瓶中，重复三次，合并滤液并浓缩，将滤液加入到适量纯水中，有白色固体析出，滤除固体并真空干燥至恒重，得固体，测得ESI-MS；
S2，在液相体系中用缩合试剂将六肽片段进行环化得到环肽片段Cyclo-[Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]]，即：称取全保护六肽片段于烧瓶中并加入适量THF搅拌至溶解，用DIPEA调pH至中性，称取HOBt于烧杯中，加入THF搅拌至溶解，随后加入DIPEA并用冰水浴降温至-5℃，再加入3.66gHBTU，保持-5℃反应1h后自然回至室温反应3h，可通过TLC或者HPLC监控反应进程，反应结束后，减压旋蒸溶剂THF至20％体积，冷却后挤兑到适量的5％磷酸水溶液中，打浆，过滤，滤饼再用5％磷酸水溶液打浆洗涤2遍，饱和碳酸氢钠水溶液洗涤3遍，水洗涤3遍，正庚烷洗涤1遍，过滤并真空干燥得到白色固体，测得ESI-MS；
S3，在液相体系下，用适当比例，浓度TFA/H2O/TIS，条件下酸解脱除环肽片段上Boc保护基，并用冰冻MTBE或乙醚沉降，过滤及干燥得到帕瑞肽粗品Cyclo-[Phg-D-Trp-Lys-Tyr(Bzl)-Phe-Hyp(2-aminoethylcarboxyl)]，即将上述所得全保护环肽Cyclo-[Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxy l]]片段溶于预先冷至0-5℃的100mL95％TFA/2.5％H2O/2.5％TIS溶液中，搅拌至全溶并控制溶液温度不超过15℃，然后将反应升温到25±2℃，搅拌反应30分钟，将切割液加入到冰冻MTBE中，析出固体并过滤，用MTBE洗涤固体3～4遍，将固体转移至真空干燥器中干燥至恒重，称量所得固体重,测得ESI-MS,粗品HPLC纯度，收率。
2.根据权利要求1所述的一种固相合成帕瑞肽的制备方法，其特征在于，所述S1，Fmoc-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]-OH通过DIPEA作用连接到2-CTC Resin载体上,且制得Fmoc-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]-CTC Resin替代度为0.20mmol/g～1.00mmol/g。
3.根据权利要求1所述的一种固相合成帕瑞肽的制备方法，其特征在于，所述S1，合成全保护六肽片段时所使用的保护氨基酸如下：Fmoc-Phe-OH,Fmoc-Tyr(Bzl)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-D-Trp(Boc)-OH,Fmoc-Phg-OH，投料摩尔比为1.5～6倍。
4.根据权利要求1所述的一种固相合成帕瑞肽的制备方法，其特征在于，所述S1，Fmoc-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]-OH氨基酸，其由Z-Hyp-OBzl为起始原料合成。
5.根据权利要求1所述的一种固相合成帕瑞肽的制备方法，其特征在于，所述S2，在制备全保护环肽片段时，液相体系为DMF，DCM或者DMF/DCM；环化缩合试剂使用HBTU/HOBt/DIPEA,反应pH值为6～10。
6.根据权利要求1所述的一种固相合成帕瑞肽的制备方法，其特征在于，所述S1，Fmoc脱保护由5％-10％piperidine/1-3％DBU/1-3％HOBt/DMF中2次处理完成(一次10-20Min,1次20-40min)。
7.根据权利要求1所述的一种固相合成帕瑞肽的制备方法，其特征在于，所述S3，酸解采用的体积百分比为80％-95％的TFA、体积百分比为1％-5％的H2O、体积百分比为1％-5％的TIS的混合酸解液；沉降所使用的冰冻MTBE或乙醚用量为反应液体积的6～12倍。
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