CN106243214A - 一种美拉诺坦ⅰ的制备方法 - Google Patents

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    • C07K14/68—Melanocyte-stimulating hormone [MSH]
    • C07K14/685—Alpha-melanotropin

Abstract

本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种美拉诺坦Ⅰ的制备方法。本发明提供的方法如下：液相合成法制备三肽片段：Fmoc‑His(Trt)‑D‑Phe‑Arg(Pbf)‑OH，然后将其作为一个单体与肽序中的其他保护氨基酸通过Fmoc固相合成法依序偶联，制备肽树脂，经裂解纯化过程，制备得美拉诺坦Ⅰ精肽产品。本发明能够避免合成过程中第6位His和第7位D‑Phe发生消旋化，产生难以除去的对映异构体杂质，提高了终产品纯度及收率，降低了生产成本，工艺过程稳定，适宜工业化生产。

Description

一种美拉诺坦Ⅰ的制备方法
技术领域
本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种美拉诺坦Ⅰ的制备方法。
背景技术
α-MSH(黑色素细胞刺激激素)是一种能够使黑色素细胞产生黑色素的激素，主要是在脑垂体中产生，此外亦可在皮肤、胃肠道、性腺等外周部位产生，能控制生物体皮肤和毛发的颜色。现大量研究已证实它的受体分子在性唤起、催化黑色素的合成以及降低食欲中起着重要作用，由此可以治疗性功能障碍、刺激皮肤产生黑色素抵抗紫外线灼伤以及肥胖等疾病。
2014年12月22日，Clinuvel公司开发的光损伤保护药Afamelanotide(商品名：Scenesse)获得欧盟批准上市。Afamelanotide为化学合成的人α-MSH类似物。Afamelanotide中文名为美拉诺坦Ⅰ，分子量1646.85，是一种含13个氨基酸的多肽分子，其结构如下：
目前国内外关于美拉诺坦Ⅰ合成工艺的报道均较少：PNAS77(10)：5754-5758中采用Boc法进行固相合成，工艺操作复杂，危险性高，不适宜进行大规模生产；专利CN102816211B公开了一种以Fmoc固相合成法逐一偶联保护氨基酸制备美拉诺坦Ⅰ的方法，该方法合成过程中容易发生第6位氨基酸His和第7位氨基酸D-Phe消旋化，生成对映异构体杂质，且在后续纯化过程中很难除去，导致产品总收率低。
综上所述，目前报道的美拉诺坦Ⅰ合成方法中，Boc固相合成法需要使用高腐蚀性的氢氟酸，生产过程危险系数高；采用Fmoc固相合成法逐一偶联保护氨基酸进行合成，合成过程容易产生对映异构体杂质，并且该杂质难除去，以致总收率偏低，仅有60％，且纯度也仅为83％，不适宜进行工业化生产。
发明内容
为解决上述美拉诺坦Ⅰ合成过程中存在的问题，本发明提供一种美拉诺坦Ⅰ的制备方法：首先采用液相合成法制备三肽片段：Fmoc-His(Trt)-D-Phe-Arg(Pbf)-OH；然后采用Fmoc固相合成法向载体树脂上依次偶联保护氨基酸Fmoc-Val-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、三肽片段、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH，然后进行N端乙酰化反应制得拉诺坦Ⅰ肽树脂，经裂解反应后制得美拉诺坦Ⅰ粗肽，纯化精制后得美拉诺坦Ⅰ精肽。为实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种美拉诺坦Ⅰ的制备方法，包括如下步骤：
(a)液相合成法制备三肽片段：Fmoc-His(Trt)-D-Phe-Arg(Pbf)-OH；
(b)采用Fmoc固相合成法向载体树脂上依序偶联保护氨基酸及步骤(a)中的三肽片段，并进行N端乙酰化，制备美拉诺坦Ⅰ肽树脂；
(c)美拉诺坦Ⅰ肽树脂经裂解反应制备美拉诺坦Ⅰ粗肽；
(d)美拉诺坦Ⅰ粗肽经纯化过程制备美拉诺坦Ⅰ精肽。
其中步骤(a)中，三肽片段Fmoc-His(Trt)-D-Phe-Arg(Pbf)-OH的制备过程包括以下过程：
(1)制备Fmoc-His(Trt)-OSu：将Fmoc-His(Trt)-OH和HOSu溶于有机溶剂中，然后向其中滴加DCC的有机溶剂溶液，搅拌反应，TLC监测反应终点。反应结束后抽滤，浓缩反应液，向浓缩液中加入5～6倍体积的石油醚，析出白色固体，抽滤，滤饼以乙酸乙酯重新溶解至浓缩后体积，加入5～6倍体积石油醚，析晶，抽滤，真空干燥滤饼，得Fmoc-His(Trt)-OSu；其中Fmoc-His(Trt)-OH和HOSu的摩尔比为1:1.0～1.2；Fmoc-His(Trt)-OH和DCC的摩尔比为1:1.0～1.2；
(2)制备Fmoc-His(Trt)-D-Phe-OH：将H-D-Phe-OH和碳酸钠溶于水中，加入Fmoc-His(Trt)-OSu的有机溶剂溶液，搅拌反应，TLC监测反应终点，反应结束后，过滤，向滤液中加入饱和柠檬酸水溶液调节溶液pH值至2～3，乙酸乙酯萃取，浓缩后加入5～6倍体积石油醚析晶得Fmoc-His(Trt)-D-Phe-OH；其中H-D-Phe-OH和碳酸钠的摩尔比为1：1～2；H-D-Phe-OH和Fmoc-His(Trt)-OSu的摩尔比为1:1.1～1.5；
(3)制备Fmoc-His(Trt)-D-Phe-OSu：将Fmoc-His(Trt)-D-Phe-OH和HOSu溶于有机溶剂中，然后向其中滴加DCC的有机溶剂溶液，搅拌反应，TLC监测反应终点；反应结束后抽滤，浓缩反应液，向浓缩液中加入5～6倍体积的石油醚，析出白色固体，抽滤，滤饼以乙酸乙酯重新溶解至浓缩后体积，加入5～6倍体积石油醚，析晶，抽滤，真空干燥滤饼，得Fmoc-His(Trt)-D-Phe-OSu，其中Fmoc-His(Trt)-D-Phe-OH和HOSu的摩尔比为1:1.0～1.2；Fmoc-His(Trt)-D-Phe-OH和DCC的摩尔比为1:1.0～1.2；
(4)制备Fmoc-His(Trt)-D-Phe-Arg(Pbf)-OH：将H-Arg(Pbf)-OH和碳酸钠溶于水中，加入Fmoc-His(Trt)-D-Phe-OSu的有机溶剂溶液，搅拌反应，TLC监测反应终点，反应结束后，过滤，向滤液中加入饱和柠檬酸水溶液调节溶液pH值至2～3，乙酸乙酯萃取，浓缩后加入5～6倍体积石油醚析晶得Fmoc-His(Trt)-D-Phe-Arg(Pbf)-OH；其中H-Arg(Pbf)-OH和碳酸钠的摩尔比为1：1～2；H-Arg(Pbf)-OH和Fmoc-His(Trt)-D-Phe-OSu的摩尔比为1:1.1～1.5。
其中有机溶剂为四氢呋喃、二氧六环、丙酮中的一种或一种以上的混合液。
步骤(b)中，载体树脂为替代度为0.3-1.0mmol/g的RinkAmide resin或RinkAmideAM resin。
步骤(b)中，美拉诺坦Ⅰ肽树脂的制备过程为：
(1)保护氨基酸Fmoc-Val-OH在缩合试剂的作用下与载体树脂进行偶联反应，制备Fmoc-Val-RinkAmide resin或Fmoc-Val-RinkAmideAM resin；
(2)依次偶联保护氨基酸Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、三肽片段Fmoc-His(Trt)-D-Phe-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH，然后进行N端乙酰化反应，制得美拉诺坦Ⅰ肽树脂。
步骤(b)中的反应都是以2-5倍的投料比加入保护氨基酸或三肽片段进行偶联反应，每一个偶联反应均是在缩合试剂的存在下进行的固相接肽反应，每一步偶联反应均以Kaiser试剂检测反应终点，反应完毕后用脱保护试剂脱除Fmoc，再与下一个位点进行偶联反应。
优选的，脱保护试剂为哌啶与DMF体积比1:4组成的混合溶液；缩合试剂为DIC/HOBt、DIC/HOAt、TBTU/HOBt/DIEA、HBTU/HOBt/DIEA、HATU/HOAt/DIEA中的一种。
优选的，N端乙酰化反应为：配制乙酸酐/DIEA/DCM或乙酸酐/吡啶/DCM的混合溶液作为封端试剂，加入到肽树脂反应器中，搅拌反应1-3h；乙酸酐、吡啶、DIEA的用量为合成规模的5-30倍摩尔量，DCM用量为乙酸酐的2倍体积。
步骤(c)中，美拉诺坦Ⅰ粗肽的制备过为：将美拉诺坦Ⅰ肽树脂加入到裂解液中，在15～30℃下，裂解反应2～5h，反应结束，将裂解液过滤到甲基叔丁基醚或乙醚中沉降并洗涤，离心收集沉淀，真空干燥后得美拉诺坦Ⅰ粗肽。
其中裂解液为加入体积比1-5％清除剂的TFA溶液，清除剂为苯甲醚、苯甲硫醚、乙二硫醇、巯基乙醇、苯酚、水中的一种或几种。
相对于现有技术，本发明的有益效果是：液相法制备三肽片段：Fmoc-His(Trt)-D-Phe-Arg(Pbf)-OH，相比于固相合成法，能够避免合成过程中第6位His和第7位D-Phe发生消旋化，产生难以除去的对映异构体杂质，使产品总纯度达到99.5％以上，对映异构体杂质[6-D-His]-美拉诺坦Ⅰ和[7-Phe]-美拉诺坦Ⅰ含量均小于0.1％，总收率大于60％，大大提高了终产品纯度及收率降低了生产成本。
说明书和权利要求书中所使用的缩写含义如下：
Fmoc 9-芴甲氧羰基
RinkAmideAMresin RinkAmideAM树脂
RinkAmideresin RinkAmide树脂
DCM 二氯甲烷
DMF N,N-二甲基甲酰胺
DIEA N,N-二异丙基乙胺
DIC N,N-二异丙基碳二亚胺
HOBt 1-羟基苯并三唑
HOAt N-羟基-7-偶氮苯并三氮唑
HBTU 苯并三唑-1-四甲基六氟磷酸酯
TBTU 苯并三唑四甲基四氟硼酸
TFA 三氟乙酸
HOSu N-羟基琥珀酰亚胺
DCC 二环己基碳二亚胺
BOC 叔丁氧羰基
TIS 三异丙基硅烷
具体实施方式
下面用具体实施例对本发明进行详细说明，但不限定本专利；根据本发明改变原料的投料比，或是反应溶剂或及缩合剂等，均在本发明的保护范围内。
实施例1：Fmoc-His(Trt)-OSu的制备
准确称取Fmoc-His(Trt)-OH929.6g(1.5mol)和HOSu189.9g(1.65mol)溶于2.5L四氢呋喃中，低温(0℃)搅拌。准确称取DCC 340.4g(1.65mol)，溶于1L四氢呋喃中，缓慢滴加到上述溶液中，搅拌反应，TLC监测反应终点。反应完成后，抽滤，浓缩反应液至900-1000mL，向浓缩液中加入5L石油醚，析出白色固体，溶液-20℃静置1h。静置后抽滤，滤饼以1L乙酸乙酯溶解，加入5L石油醚，析晶，抽滤，滤饼真空干燥后，得Fmoc-His(Trt)-OSu 949.4g，纯度99.8％，收率88.3％。
实施例2：Fmoc-His(Trt)-OSu的制备
准确称取Fmoc-His(Trt)-OH743.7g(1.2mol)和HOSu 165.7g(1.44mol)溶于3L二氧六环中，低温(0℃)搅拌。准确称取DCC 297.1g(1.44mol)，溶于1.5L四氢呋喃中，缓慢滴加到上述溶液中，搅拌反应，TLC监测反应终点。反应完成后，抽滤，浓缩反应液至1500mL，向浓缩液中加入7.5L石油醚，析出白色固体，溶液-20℃静置1h。静置后抽滤，滤饼以1.5L乙酸乙酯溶解，加入7.5L石油醚，析晶，抽滤，滤饼真空干燥后，得Fmoc-His(Trt)-OSu 738.0g，纯度99.8％，收率85.8％。
实施例3：Fmoc-His(Trt)-D-Phe-OH的制备
准确称取H-D-Phe-OH 99.1g(0.6mol)和碳酸钠122.4g(1.2mol)溶于1.2L水中，低温(0℃)下缓慢加入实施例2中所得Fmoc-His(Trt)-OSu 645.1g(0.9mol)的四氢呋喃溶液2.5L，搅拌反应，TLC监测反应终点。反应完全后，过滤，低温(0℃)下向滤液中加入饱和柠檬酸水溶液，调节溶液pH值至2～3，析出白色固体，抽滤，滤饼用水洗涤3次，干燥后用1.5L乙酸乙酯重新溶解，加入7L石油醚析晶，过滤，抽干，真空干燥得Fmoc-His(Trt)-D-Phe-OH399.9g，纯度99.8％，收率86.9％。
实施例4：Fmoc-His(Trt)-D-Phe-OH的制备
准确称取H-D-Phe-OH 165.2g(1.0mol)和碳酸钠116.6g(1.1mol)溶于2L水中，低温(0℃)下缓慢加入实施例1中所得Fmoc-His(Trt)-OSu 788.5g(1.1mol)的四氢呋喃溶液4L，搅拌反应，TLC监测反应终点。反应完全后，过滤，低温(0℃)下向滤液中加入饱和柠檬酸水溶液，调节溶液pH值至2～3，析出白色固体，抽滤，滤饼用水洗涤3次，干燥后用2L乙酸乙酯重新溶解，加入10L石油醚析晶，过滤，抽干，真空干燥得Fmoc-His(Trt)-D-Phe-OH671.0g，纯度99.8％，收率87.5％。
实施例5：Fmoc-His(Trt)-D-Phe-OSu的制备
准确称取实施例4中所得Fmoc-His(Trt)-D-Phe-OH 536.8g(0.7mol)和HOSu96.7g(0.84mol)溶于1800mL二氧六环中，低温(0℃)搅拌。准确称取DCC 173.3g(0.84mol)，溶于500mL四氢呋喃中，缓慢滴加到上述溶液中，搅拌反应，TLC监测反应终点。反应完成后，抽滤，浓缩反应液至700-800mL，向浓缩液中加入4L石油醚，析出白色固体，溶液-20℃静置1h。静置后抽滤，滤饼以700mL乙酸乙酯溶解，加入3.5L石油醚，析晶，抽滤，滤饼真空干燥后，得Fmoc-His(Trt)-D-Phe-OSu 532.1g，纯度99.8％，收率86.5％。
实施例6：Fmoc-His(Trt)-D-Phe-OSu的制备
准确称取实施例3中所得Fmoc-His(Trt)-D-Phe-OH 306.8g(0.4mol)和HOSu50.6g(0.44mol)溶于1200mL四氢呋喃中，低温(0℃)搅拌。准确称取DCC 90.8g(0.44mol)，溶于300mL四氢呋喃中，缓慢滴加到上述溶液中，搅拌反应，TLC监测反应终点。反应完成后，抽滤，浓缩反应液至400～500mL，向浓缩液中加入2.5L石油醚，析出白色固体，溶液-20℃静置1h。静置后抽滤，滤饼以400mL乙酸乙酯溶解，加入2L石油醚，析晶，抽滤，滤饼真空干燥后，得Fmoc-His(Trt)-D-Phe-OSu 310.0g，纯度99.8％，收率89.7％。
实施例7：Fmoc-His(Trt)-D-Phe-Arg(Pbf)-OH的制备
准确称取H-Arg(Pbf)-OH 92.5g(0.2mol)和碳酸钠42.4g(0.4mol)溶于400mL水中，低温(0℃)下缓慢加入实施例6中所得Fmoc-His(Trt)-D-Phe-OSu 259.2g(0.3mol)的四氢呋喃溶液1L，搅拌反应，TLC监测反应终点。反应完全后，过滤，低温(0℃)下向滤液中加入饱和柠檬酸水溶液，调节溶液pH值至2～3，析出白色固体，抽滤，滤饼用水洗涤3次，干燥后用1L乙酸乙酯重新溶解，加入5L石油醚析晶，过滤，抽干，真空干燥得Fmoc-His(Trt)-D-Phe-Arg(Pbf)-OH 206.4g，纯度99.8％，收率87.8％。
实施例8：Fmoc-His(Trt)-D-Phe-Arg(Pbf)-OH的制备
准确称取H-Arg(Pbf)-OH 231.3g(0.5mol)和碳酸钠58.3g(0.55mol)溶于1L水中，低温(0℃)下缓慢加入实施例5中所得Fmoc-His(Trt)-D-Phe-OSu 475.2g(0.55mol)的四氢呋喃溶液2.5L，搅拌反应，TLC监测反应终点。反应完全后，过滤，低温(0℃)下向滤液中加入饱和柠檬酸水溶液，调节溶液pH值至2～3，析出白色固体，抽滤，滤饼用水洗涤3次，干燥后用3L乙酸乙酯重新溶解，加入15L石油醚析晶，过滤，抽干，真空干燥得Fmoc-His(Trt)-D-Phe-Arg(Pbf)-OH 508.9g，纯度99.8％，收率86.6％。
实施例9：Fmoc-Val-RinkAmide resin的制备
准确称取RinkAmideresin 55.6g(树脂初始替代度为0.90mmol/g，合成规模为50mmol)置于合成柱中，用500mL DMF洗涤两次，加入500mL DCM溶胀30min；抽滤掉DCM后，加入Fmoc-Val-OH/DIC/HOBt的混合溶液[称取Fmoc-Val-OH 33.9g(100mmol)和14.9g(110mmol)HOBt置于溶解瓶中，加入250ml DMF溶液搅拌溶解，低温(0℃)下加入17.0ml(110mmol)DIC，活化5min]，搅拌反应3h，抽掉反应液，用500mL DMF洗涤3次，然后再用DCM、甲醇各洗涤3次，真空干燥后得Fmoc-Val-Rink Amide resin 60.9g。
实施例10：Fmoc-Val-RinkAmideAM resin的制备
准确称取Rink AmideAM resin108.7g(树脂初始替代度为0.92mmol/g，合成规模为100mmol)置于合成柱中，用900mL DMF洗涤两次，加入900mL DCM溶胀30min；抽滤掉DCM后，加入Fmoc-Val-OH/DIC/HOBt的混合溶液[称取Fmoc-Val-OH 101.8g(300mmol)和44.6(330mmol)HOBt置于溶解瓶中，加入900ml DMF溶液搅拌溶解，低温(0℃)下加入51.1ml(330mmol)DIC，活化5min]，搅拌反应4h，抽掉反应液，用900mL DMF洗涤3次，然后再用DCM、甲醇各洗涤3次，真空干燥后得Fmoc-Val-RinkAmideAM resin 118.9g。
实施例11：美拉诺坦Ⅰ肽树脂的制备
将实施例9中的Fmoc-Val-RinkAmide resin 60.9g(合成规模50mmol)置于合成柱中，加入500mL DCM溶胀30min；抽滤掉DCM后，500mLDMF洗涤2次，加入20％哌啶/DMF溶液500mL脱保护2次，分别反应10min和10min；然后用DMF洗涤6次，每次500mL；称取Fmoc-Pro-OH 33.7g(100mmol)、HOAt14.9g(110mmol)用1LDMF溶解，低温(0℃)中预冷15-20min，然后加入DIC 17.0ml(110mmol)活化5min，将溶液加入到树脂中，反应2h，反应终点以Kaiser试剂检测结果为准，反应达终点后，抽掉反应液，用DMF洗涤6次，每次500mL；随后再脱保护。如此反复循环操作，依次偶联Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-His(Trt)-D-Phe-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Ser(OtBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(OtBu)-OH，配制1600mL乙酰化试剂(400ml乙酸酐、350ml吡啶和850ml DMF混合溶液)，加入到反应柱中，反应1h，反应结束，树脂用DMF、DCM和甲醇分别洗涤3次，每次500mL，真空干燥得美拉诺坦Ⅰ肽树脂195.5g
实施例12：美拉诺坦Ⅰ肽树脂的制备
将实施例10中的Fmoc-Val-RinkAmide resin 118.9g(合成规模100mmol)置于合成柱中，加入900mL DCM溶胀30min；抽滤掉DCM后，900mL DMF洗涤2次，加入20％哌啶/DMF溶液900mL脱保护2次，分别反应10min和10min；然后用DMF洗涤6次，每次900mL；称取Fmoc-Pro-OH 101.2g(300mmol)、HOBt44.6g(330mmol)用1LDMF溶解，低温(0℃)中预冷15-20min，然后加入DIC 51.1ml(330mmol)活化5min，将溶液加入到树脂中，反应2h，反应终点以Kaiser试剂检测结果为准，反应达终点后，抽掉反应液，用DMF洗涤6次，每次900mL；随后再脱保护。如此反复循环操作，依次偶联Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-His(Trt)-D-Phe-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Ser(OtBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(OtBu)-OH，配制800mL乙酰化试剂(200ml乙酸酐、175ml吡啶和425ml DMF混合溶液)，加入到反应柱中，反应1h，反应结束，树脂用DMF、DCM和甲醇分别洗涤3次，每次900mL，真空干燥得美拉诺坦Ⅰ肽树脂385.6g。
实施例13：美拉诺坦Ⅰ粗肽的制备
将实施例11得到的195.5g美拉诺坦Ⅰ肽树脂(50mmol)，加入到预冷的1.5L裂解液(体积配比为TFA/TIS/苯酚/苯甲硫醚/H2O＝85/2.5/2.5/5/5)中，室温下搅拌反应3h；裂解反应结束，过滤树脂，100mlTFA洗涤树脂2次，合并滤液和洗液，旋蒸浓缩至1L，浓缩液倒入10L预冷的叔丁基甲醚中，析出白色沉淀，静置1h后，过滤，叔丁基甲醚洗涤6次，真空干燥得美拉诺坦Ⅰ粗肽85.6g，收率104.0％，纯度80.5％。
实施例14：美拉诺坦Ⅰ粗肽纯化精制
将实施例13中的美拉诺坦Ⅰ粗肽85.6g，采用内径为100mm的C18制备柱，流动相A为0.1％TFA/水，流动相B为0.1％TFA/乙腈，上样量为10g/针，流速300ml/min，检测波长210nm，梯度洗脱，峰前和峰后循环进样，得到中控分析纯度为98.5％以上的精肽溶液；以醋酸/乙腈/水体系转盐后冻干得美拉诺坦Ⅰ50.3g，纯度99.5％，对映异构体杂质[6-D-His]-美拉诺坦Ⅰ含量为0.07％，[7-Phe]-美拉诺坦Ⅰ含量为0.01％，总收率为61.1％。
实施例15：美拉诺坦Ⅰ粗肽的制备
将实施例12得到的385.6g美拉诺坦Ⅰ肽树脂(100mmol)，加入到冷冻的3L裂解液(体积配比为TFA/TIS/苯酚/苯甲硫醚/H2O＝85/2.5/2.5/5/5)中，室温下搅拌反应4h；裂解反应结束，过滤树脂，300mlTFA洗涤树脂2次，合并滤液和洗液，旋蒸浓缩至2L，浓缩液倒入20L预冷叔丁基甲醚中，析出白色沉淀；静置1h后，过滤，叔丁基甲醚洗涤6次，真空干燥得美拉诺坦Ⅰ粗肽176.4g，收率107.1％，纯度80.3％。
实施例16：美拉诺坦Ⅰ粗肽纯化精制
将实施例15中的美拉诺坦Ⅰ粗肽176.4g，采用内径为100mm的C18制备柱，流动相A为0.1％TFA/水，流动相B为0.1％TFA/乙腈，上样量为10g/针，流速300ml/min，检测波长210nm，梯度洗脱，峰前和峰后循环进样，得到中控分析纯度为98.5％以上的精肽溶液；以醋酸/乙腈/水体系转盐后冻干得美拉诺坦Ⅰ108.2g，纯度99.6％，对映异构体杂质[6-D-His]-美拉诺坦Ⅰ含量为0.02％，[7-Phe]-美拉诺坦Ⅰ含量为0.03％，总收率为65.7％。

Claims (8)

1.一种美拉诺坦Ⅰ的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)液相合成法制备三肽片段：Fmoc-His(Trt)-D-Phe-Arg(Pbf)-OH；
(b)采用Fmoc固相合成法向载体树脂上依序偶联保护氨基酸及步骤(a)中的三肽片段，并进行N端乙酰化，制备美拉诺坦Ⅰ肽树脂；
(c)美拉诺坦Ⅰ肽树脂经裂解反应制备美拉诺坦Ⅰ粗肽；
(d)美拉诺坦Ⅰ粗肽经纯化过程制备美拉诺坦Ⅰ精肽。
2.根据权利要求1所述的.一种美拉诺坦Ⅰ的制备方法，其特征在于，步骤(a)中，三肽片段的制备过程为：
(1)合成Fmoc-His(Trt)-OSu：Fmoc-His(Trt)-OH与HOSu在有机溶剂中，以DCC为活化剂，反应制备Fmoc-His(Trt)-OSu；所述Fmoc-His(Trt)-OH和HOSu的摩尔比为1:1.0～1.2；所述Fmoc-His(Trt)-OH和DCC的摩尔比为1:1.0～1.2；
(2)合成Fmoc-His(Trt)-D-Phe-OH：H-D-Phe-OH和Fmoc-His(Trt)-OSu在碳酸钠溶液中反应，制备Fmoc-His(Trt)-D-Phe-OH；所述H-D-Phe-OH和碳酸钠的摩尔比为1：1～2；所H-D-Phe-OH和Fmoc-His(Trt)-OSu的摩尔比为1:1.1～1.5；
(3)合成Fmoc-His(Trt)-D-Phe-OSu：Fmoc-His(Trt)-D-Phe-OH与HOSu在有机溶剂中，以DCC为活化剂，反应制备Fmoc-His(Trt)-D-Phe-OSu；所述Fmoc-His(Trt)-D-Phe-OH和HOSu的摩尔比为1:1.0～1.2；所述Fmoc-His(Trt)-D-Phe-OH和DCC的摩尔比为1:1.0～1.2；
(4)Fmoc-His(Trt)-D-Phe-Arg(Pbf)-OH的制备：H-Arg(Pbf)-OH和Fmoc-His(Trt)-D-Phe-OSu在碳酸钠溶液中反应，制备Fmoc-His(Trt)-D-Phe-Arg(Pbf)-OH；所述H-Arg(Pbf)-OH和碳酸钠的摩尔比为1：1～2；所述H-Arg(Pbf)-OH和Fmoc-His(Trt)-D-Phe-OSu的摩尔比为1:1.1～1.5。
3.根据权利要求2所述的一种美拉诺坦Ⅰ的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为四氢呋喃、二氧六环、丙酮中的一种或一种以上的混合液。
4.根据权利要求1所述的一种美拉诺坦Ⅰ的制备方法，其特征在于，步骤(b)中，所述美拉诺坦Ⅰ肽树脂的制备过程为：
(1)保护氨基酸Fmoc-Val-OH在缩合试剂的作用下与载体树脂进行偶联反应，制备Fmoc-Val-Rink Amide resin或Fmoc-Val-Rink Amide AM resin；
(2)依次偶联保护氨基酸Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-His(Trt)-D-Phe-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH，然后进行N端乙酰化反应，制得美拉诺坦Ⅰ肽树脂。
5.根据权利要求4所述的一种美拉诺坦Ⅰ的制备方法，其特征在于，所述Rink Amideresin或Rink Amide AM resin树脂的替代度为0.3-1.0mmol/g。
6.根据权利要求4所述的一种美拉诺坦Ⅰ的制备方法，其特征在于，所述缩合试剂为DIC/HOBt、DIC/HOAt、TBTU/HOBt/DIEA、HBTU/HOBt/DIEA中的一种。
7.根据权利要求1所述的一种美拉诺坦Ⅰ的制备方法，其特征在于，步骤(c)中，美拉诺坦Ⅰ粗肽的制备过为：将美拉诺坦Ⅰ肽树脂加入到裂解液中，在15～30℃下，裂解反应2～5h，反应结束，将裂解液过滤到甲基叔丁基醚或乙醚中沉降并洗涤，离心收集沉淀，真空干燥后得美拉诺坦Ⅰ粗肽。
8.根据权利要求7所述的一种美拉诺坦Ⅰ的制备方法，其特征在于，所述裂解液为加入体积比1-5％清除剂的TFA溶液；所述清除剂为苯甲醚、苯甲硫醚、乙二硫醇、巯基乙醇、苯酚、水中的一种或几种。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107652355A (zh) * 2017-10-26 2018-02-02 陕西慧康生物科技有限责任公司 亮肤肽的液相合成方法
CN108070021A (zh) * 2017-12-27 2018-05-25 中南民族大学 可组装成高度有序纳米纤维的小分子肽及组装构建高度有序纳米纤维的方法
CN108640975A (zh) * 2018-03-17 2018-10-12 中国海洋大学 一种n端乙酰化抗菌肽的合成方法
CN111808169A (zh) * 2020-04-29 2020-10-23 杭州固拓生物科技有限公司 一种美拉诺坦i的固相合成法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1196184B1 (en) * 1999-06-29 2005-04-20 Palatin Technologies, Inc. Compositions for treatment of sexual dysfunction
CN102816211A (zh) * 2012-09-10 2012-12-12 南京工业大学 一种制备美那诺坦的方法
CN105330726A (zh) * 2015-11-05 2016-02-17 江苏诺泰生物制药股份有限公司 一种亮丙瑞林的合成法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1196184B1 (en) * 1999-06-29 2005-04-20 Palatin Technologies, Inc. Compositions for treatment of sexual dysfunction
CN102816211A (zh) * 2012-09-10 2012-12-12 南京工业大学 一种制备美那诺坦的方法
CN105330726A (zh) * 2015-11-05 2016-02-17 江苏诺泰生物制药股份有限公司 一种亮丙瑞林的合成法

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107652355A (zh) * 2017-10-26 2018-02-02 陕西慧康生物科技有限责任公司 亮肤肽的液相合成方法
CN107652355B (zh) * 2017-10-26 2021-06-04 陕西慧康生物科技有限责任公司 亮肤肽的液相合成方法
CN108070021A (zh) * 2017-12-27 2018-05-25 中南民族大学 可组装成高度有序纳米纤维的小分子肽及组装构建高度有序纳米纤维的方法
CN108640975A (zh) * 2018-03-17 2018-10-12 中国海洋大学 一种n端乙酰化抗菌肽的合成方法
CN111808169A (zh) * 2020-04-29 2020-10-23 杭州固拓生物科技有限公司 一种美拉诺坦i的固相合成法

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